ワクチン用担体タンパク質
本発明は、特に、多糖体ワクチンを含む抗原ワクチン用の改良された担体タンパク質を提供する。本発明の一態様は、破傷風毒素断片Ｃを有利に使用するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖体ワクチンを含む抗原ワクチン用の改良された担体タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖体を担体タンパク質に結合（conjugation）すると、その多糖体の免疫原性を効果的により強くすることができる。破傷風トキソイドは、この担体としての能力から、何十年間も使用されており、少なくとも過去の使用に関してはその安全プロフィールが確立されている。
【０００３】
破傷風毒素の構造遺伝子は、クローン化され、配列決定がなされている。Fairweather et al., J.Bacteriol.165: 21-27 (1986)；Fairweather et al., Nuci.Acid Res. 14: 7809-7812 (1986).これらの研究では、破傷風毒素の構造が１３１５個のアミノ酸を含む１５０ｋＤのタンパク質であることが確認されている。自然型破傷風毒素の結合タンパク質を構成する断片Ｃは、この毒素がパパインで切断されて生じる５２ｋＤのポリペプチドであり、Ｃ末端の４５１アミノ酸に相当する。図１を参照されたい。
【０００４】
破傷風トキソイドは、２〜３箇所の万能Ｔ細胞エピトープを含むことが発見されている。Demotz et al., J. Immunol 142: 394-402 (1989).この特徴のために、破傷風トキソイドはヒトにおいて非常に有効である。このトキソイドの断片Ｃは、毒性でないことが示されている。この断片も、初回免疫刺激を受けたドナーによって認識される万能免疫原性Ｔ細胞エピトープのうちの少なくとも１箇所を含む。Valmori et al., J. Immunol 149:717-21 (1992);Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19: 2237(1989).
【０００５】
様々な細菌感染をターゲットとする莢膜多糖体（ＣＰ）結合型ワクチン（conjugate vaccin）が現在開発及び臨床評価の最中にある。多数のＣＰ血清型を合体させて単一の注射に含めることが、現在研究中である。しかし、ＣＰ結合型ワクチンを合体させて単一の多価注射にすることは、異なる成分間での競合をもたらし、個々のコンジュゲートの免疫原性に有害な影響を及ぼす。Fattom et al., Vaccine 17:126-33 (1999).
【０００６】
破傷風トキソイドの多糖体ワクチンへの使用は増加している。そこで、ワクチン接種を受けた集団が、破傷風に過度に曝され、集団全体に耐性及び／又は過敏性を引き起こす危険が伴うという懸念が浮上している。たとえば、免疫原性用量の担体を注射した後、ハプテン−担体コンジュゲートで免疫感作すると、抗ハプテン抗体応答が選択的に抑制される。担体によって誘発されるこのエピトープ抑制は、担体特異的Ｔ細胞の誘導と関連付けることができ、この誘導が、抗ハプテン応答を選択的に抑制し得るはずである。エピトープ抑制は、担体エピトープに特異的なクローンの増殖及びハプテンと担体エピトープとの抗原競合によって誘発され得る。Schutze et al., J. Immunol. 37:2635-40 (1989).ヒトでは、担体タンパク質に対する事前の免疫が、合成結合型ワクチンに対する血清学的応答をモジュレートすることが実証されている。Di John et al., Lancet 2 (8677):1415-8 (1989). Barrington et al., (Infect. & Immun. 61: 432-8, 1993)は、ワクチン成分での予備免疫による、ｂ型インフルエンザ菌結合型ワクチンに対する抗体応答のエピトープ抑制を認めたことを示している。より最近では、Burrage et al., (Infect. & Immun. 70: 4946-54, 2002)が、破傷風担体タンパク質での予備免疫による、髄膜炎菌Ｃ結合型ワクチンに対する抗体応答のある種のエピトープ抑制を示している。マウスでは、破傷風トキソイドでの高用量の担体初回抗原刺激後に、肺炎球菌及び髄膜炎菌多糖体−破傷風コンジュゲートの抗体応答に対するエピトープ抑制が認められている（Peeters et al. Infect & Immun 59: 3504-10, 1991）.これらの潜在的な有害な成果のために、破傷風トキソイドは、もはやこれまでのように投与すべきではなく、したがって改良された担体が求められている。
【非特許文献１】Fairweather et al., J.Bacteriol.165: 21-27 (1986)
【非特許文献２】Fairweather et al., Nuci.Acid Res. 14: 7809-7812 (1986).
【非特許文献３】Demotz et al., J. Immunol 142: 394-402 (1989).
【非特許文献４】Valmori et al., J. Immunol 149:717-21 (1992)
【非特許文献５】Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19: 2237(1989).
【非特許文献６】Fattom et al., Vaccine 17:126-33 (1999).
【非特許文献７】Schutze et al., J. Immunol. 37:2635-40 (1989).
【非特許文献８】Di John et al., Lancet 2 (8677):1415-8 (1989).
【非特許文献９】Barrington et al., (Infect. & Immun. 61: 432-8, 1993)
【非特許文献１０】Burrage et al., (Infect. & Immun. 70: 4946-54, 2002)
【非特許文献１１】Peeters et al. Infect & Immun 59: 3504-10, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の慣行に伴う有害な成果の多くを回避するために、本発明は、破傷風トキソイドの断片Ｃを主体とした担体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、破傷風トキソイドの断片Ｃを利用する免疫原性結合型ワクチンの製造法が提供される。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原が提供される。本明細書では、「目標病原体」とは、細菌又は真菌の病原体など、哺乳動物又は鳥の免疫系によって認識される多糖体エピトープを含む外来病原体を指す。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によれば、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原を含むワクチンが提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物又は鳥において目標病原体に対する免疫応答を惹起させる方法であって、哺乳動物又は鳥に、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原を含む有効量のワクチンを接種するステップを含む方法が提供される。この方法は、ニワトリ、シチメンチョウ、エミュー、ダチョウ、及び他の商業上重要な鳥などの鳥類で実施することができる。この方法は、げっ歯類、ウマ、ウシ、他の商業上重要な群れをなす哺乳動物、イヌ、ネコ、他の伴侶動物、ヒトなどの哺乳動物で実施することが好ましい。特に、この方法は、ヒトで実施することができる。
【００１２】
本発明のさらに別の態様では、目標病原体による哺乳動物又は鳥の後続の感染を予防する方法であって、哺乳動物又は鳥に、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原を含む有効量のワクチンを接種するステップを含む方法が提供される。この方法は、ニワトリ、シチメンチョウ、エミュー、ダチョウ、及び他の商業上重要な鳥などの鳥類で実施することができる。この方法は、げっ歯類、ウマ、ウシ、他の商業上重要な群れをなす哺乳動物、イヌ、ネコ、他の伴侶動物、ヒトなどの哺乳動物で実施することが好ましい。特に、この方法は、ヒトで実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
「ＴＴｃ」と呼ばれることの多い破傷風毒素の断片Ｃは、本明細書で初めて開示するが、細菌又は真菌感染に対する防御のために、莢膜多糖体ワクチンなどの多糖体の担体タンパク質として使用することができる。断片Ｃは、抗原に結合させると、その抗原の免疫原性を増大させることができるが、これは、断片Ｃへの結合によって、抗原が免疫応答を惹起する能力が増強されるということである。この増強はしばしば、担体効果と呼ばれており、その本質は、多糖体をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換することにある。多糖体ＴＴｃコンジュゲートで免疫感作した哺乳動物では破傷風毒素抗体が明らかに中和されなくなり、その結果その自然型破傷風トキソイドの認識が縮小化され、さらに担体能力は明らかに保たれるために、ＴＴｃは、破傷風トキソイドの魅力的な代替物となる。
【００１４】
本明細書で示すデータは、ＴＴｃ及び組換え型ＴＴｃ（ｒＴＴｃ）が、多糖体の担体として使用でき、多糖体に特異的なＩｇＧ抗体に関して破傷風トキソイドと等価な免疫応答を惹起し得ることを実証している。図２を参照されたい。これらの抗体は、細菌を死滅させる能力を尺度とする機能活性が高くなっている。
【００１５】
断片Ｃ（ＴＴｃ）は、図１に示すように、アミノ酸位置がほぼ８６５〜１３１５のカルボキシル末端部分を指す。したがって、本発明においては、断片Ｃは、その領域を破傷風トキソイド分子全体の残りの少なくとも一部分から分離することと関係があり、これは、トキソイドをパパイン又は他のプロテアーゼで消化して、又は断片の組換え発現によって行うことができる。断片Ｃの組換え発現は、米国特許第５４４３９６６号で開示されている。したがって、断片Ｃに結合させた抗原を含むワクチンは、非断片Ｃ（すなわち、図１のＢ断片）領域の少なくとも１部分を欠くことになる。
【００１６】
当然、ＴＴｃ配列に対して様々な付加、除去、及び置換を行って、分子の担体能力に有害な影響を与えることなく変異体を得ることができる。たとえば、保存的及び半保存的なアミノ酸置換を行うことができる。好例となる保存的アミノ酸置換には、アラニンからセリンへ、アルギニンからリシンへ、アスパラギンからグルタミン若しくはヒスチジンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ、システインからセリンへ、グルタミンからアスパラギンへ、グルタミン酸からアスパラギン酸へ、グリシンからプロリンへ、ヒスチジンからアスパラギン若しくはグルタミンへ、イソロイシンからロイシン若しくはバリンへ、ロイシンからバリン若しくはイソロイシンへ；ロイシンからアルギニン、グルタミン、若しくはグルタミン酸へ；メチオニンからロイシン若しくはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、若しくはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ、スレオニンからセリンへ、トリプトファンからチロシンへ、チロシンからトリプトファン若しくはフェニルアラニンへ、バリンからイソロイシン若しくはロイシンへの変更が含まれるがこの限りでない。タンパク質工学分野の技術者ならば承知されていようが、本明細書で言及する保存的及び半保存的突然変異は、ＴＴｃの認識された抗原性／免疫原性領域の外側の領域に対して行うことが好ましい。様々な目的のための突然変異（たとえば、タンパク質の精製を容易にするためのポリペプチド「タグ」の付加）に適する領域には、Ｃ末端領域及びＮ末端領域が含まれる。
【００１７】
変異体は、ゲノム若しくはｃＤＮＡクローニング法を使用する組換え技術によって生成することができる。部位特異的及び領域指向性突然変異誘発技術を使用することができる。CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY vol. 1, ch. 8 （Ausubel et al., eds., J. Wiley & Sons 1989 & Supp. 1990-93）; PROTEIN ENGINEERING (Oxender & Fox eds., A. Liss, Inc. 1987)を参照されたい。さらに、リンカースキャニング法及びＰＣＲ法を突然変異誘発に使用することができる。PCR TECHNOLOGY (Erlich ed., Stockton Press 1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vols. 1 & 2（上掲）を参照されたい。上記技術のいずれかと共に使用するためのタンパク質の配列決定、構造モデリングの各手法は、PROTEIN ENGINEERING, loc. cit.及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vols. 1 & 2上掲で開示されている。所望であれば、コンビナトリアル化学、バイオパニング、及び／又はファージディスプレイの使用によって、断片Ｃに対する他の変化を添えることができる。
【００１８】
断片Ｃのペプチド模倣物は、Saragovi et al., Science 253: 792-95 (1991)及び他の論文に概略が述べられている手法によって生成することができる。模倣物は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。たとえば、BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., (Chapman and Hall, New York, 1993)中のJohnson et al., "Peptide Turn Mimetics"を参照されたい。ペプチド模倣物の使用の基礎をなす原理は、タンパク質のペプチド主鎖が、抗体及び抗原のもののように、主としてアミノ酸側鎖を分子の相互作用が促進される向きに配向させるために存在することである。本発明によるペプチド模倣物担体は、宿主に投与されたとき、免疫応答を惹起する助けとなるはずである。
【００１９】
断片Ｃは、現在実践されている方法によって、細菌や真菌の莢膜多糖体などの多糖体に結合させることができる。たとえば、多糖体は、弱塩基性条件下での処理によって脱アシル化し、次いで、シアノ水素化ホウ素アニオンなどの還元剤を用いる還元アミノ化によって断片Ｃに結合させることができる。ＥＰ０６５８１１８Ｂ１を参照されたい。以下で述べる実施例にあるもの、及びＷＯ００１０５９９Ａ２、米国特許出願公開第２００１／００１４３３２Ａ１号で開示されているものなど、他の結合手法も当業者に利用可能である。別の結合手法は、二遺伝子（ｂｉｇｅｎｉｃ）スペーサーを使用するMarburg et al., (J.Am.Chem.Soc., 108, 5282 1986)に記載されており、米国特許第４６９５６２４号、同第４８３０８５２号、同第４８８２３１７号、及び最後の３特許の方法を改良したものである米国特許第５６２３０５７号でも開示されている。
【００２０】
ワクチンの型及び特異性を規定することになる多糖体供給源は、細菌及び真菌を含む広範な種類の供給源から得ることができる。好例となる細菌には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸの各群を含む髄膜炎菌；Ａ、Ｂ、及びＣの各群を含む連鎖球菌；１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３の各型を含む肺炎球菌；５型及び８型を含む黄色ブドウ球菌；ｂ型を含むインフルエンザ菌；結核菌；カンピロバクター種；腸管組織侵入性大腸菌分離株；チフス菌；コレラ菌；フレクスナー赤痢菌；ブルセラ種；野兎病菌；及びペスト菌が含まれる。特に、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、及び黄色ブドウ球菌の抗原を、ＴＴｃとの結合に利用することができる。好例となる真菌には、特に、カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、及び黒色アスペルギルスが含まれる。標準の炭水化物化学を使用すると、自然型ＣＰの１つ又は複数の特性を有する合成多糖体がワクチンとして使用できる。
【００２１】
変異体を含めて、断片Ｃは、現在の破傷風トキソイドとほぼ同じ方法で担体として使用することができる。コンジュゲート用の薬剤として許容される製剤は、UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY (USP 24 NF 19); REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES; HANDBOOK ON PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (2d ed., Wade and Weller eds., 1994)に記載されているように、水溶液、塩類を含む非毒性の医薬添加剤、保存剤、緩衝剤などを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性溶媒には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウムやリンガーデキストロースなどの非経口賦形剤などが含まれる。静脈内賦形剤には、液体及び栄養の補給剤が含まれる。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性気体が含まれる。結合組成物の種々の成分のｐＨ及び正確な濃度は、当業界の定型的な技術に従って調節する。GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (9th ed.)を参照されたい。さらに、１種又は複数のアジュバントをワクチン組成物に加えることができる。ミョウバン（水酸化アルミニウム）が、使用が一般に受け入れられているアジュバントの一例であるが、ワクチン業界の技術者には他のアジュバントも知られている。
【００２２】
多糖体結合型ワクチンの部分としての断片Ｃは、通常、１回量で（幼児及び成人）、又は一次免疫感作のため（乳児の投与計画）及び一定期間にわたる複数回の追加免疫として多数回に分けて投与される。ある特定の患者のための特定の用量レベル、したがって治療有効量は、年齢、体重、及び性別に応じて変わり得る。ほとんどのワクチンでそうであるとはいえ、標準化した値を定めて、一集団の集まり又は亜集団全体に有効な一般化された投与量を明らかにすることができる。一般に、約５〜約１００μｇ、好ましくは約１０〜５０μｇを含有するワクチンが、若い哺乳動物において病原性のグラム陰性若しくはグラム陽性生物の莢膜多糖体に対して有効なレベルの抗体を誘発するのに適し、力価決定などによってさらに規定することができる。連続的に与えられる数回の少ない用量は、１回の注射として与えられる同量のコンジュゲートに優るはずであることが予想される。
【００２３】
本発明を以下の実施例によってさらに述べていくが、実施例は本発明を例示するものであり、本発明をいかようにも限定しない。
【実施例１】
【００２４】
ｒＴＴｃコンジュゲートの調製
髄膜炎菌Ｃ（ＧＣＭＰ）、Ｙ（ＧＹＭＰ）、及びＷ（ＧＷＭＰ）の各多糖体の調製：
髄膜炎菌Ｃ、Ｙ、及びＷの各多糖体を、グルコース及び酵母抽出物を含有する発酵ブロスから精製した。
【００２５】
脱Ｏ−アセチル化（ｄＯＡ）ＧＣＭＰは、米国特許第５４２５９４６号に記載のとおりに調製した。
【００２６】
脱Ｏ−アセチル化ＧＹＭＰは、以下のように調製した。
【００２７】
３００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いるＵＦによる多糖体の捕捉：
精密濾過にかけた、細胞を含まない発酵透過物約１３Ｌを、Ｂｉｏｍａｘ３００Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を使用するＵＦによって約１リットルに濃縮する。濃縮された未透過物を、１Ｍ ＮａＣｌに対して１２回、次いで脱イオン水に対して１０回ダイアフィルター（Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）にかける。これをさらに濃縮して約０．２Ｌにし、収集する。
【００２８】
多糖体の塩基による加水分解：
３００Ｋ未透過物の溶液（約５ｍｇＰＳ／ｍＬ）のＮａＯＨ最終濃度を２Ｎに調整し、８０℃にセットしたオーブンに１６〜１８時間入れておいた。反応混合物が冷めて５０℃を下回った後、１０Ｌの脱イオン水に希釈した。３０ｋＤａのＭＷＣＯ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜によって濃縮した後、濃縮された未透過物水を、１Ｍ ＮａＣｌに対して１２回、次いで脱イオン水に対して１０回ダイアフィルターにかけた。これをさらに濃縮して約０．２Ｌにし、収集した。
【００２９】
ｄＯＡ ＧＹＭＰの酸による加水分解：
未透過物の溶液をテフロン製反応器に移し、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を加えて、最終濃度を０．１Ｎとした。６Ｎ ＨＣｌを使用して反応混合物をｐＨ５に調整し、７０℃にセットした水浴に入れた。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを使用するＳＥＣ ＭＡＬＬＳによって測定した多糖体の分子量が目標の約１０〜２０ｋＤａに到達するまで、これを６５ｒｐｍで振盪した。
【００３０】
断片化されたｄＯＡ多糖体の再Ｎアセチル化：
６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて溶液のｐＨを８に調整し、次いで室温で無水酢酸を滴下して、無水酢酸の最終濃度を０．８Ｍとした。ＳＮ ＮａＯＨを使用して、反応混合物のｐＨを７〜９の間に保った。反応が完了した後、反応混合物のｐＨを１３まで上げ、混合物をさらに１．５時間攪拌した。次いで、反応ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いてｐＨ８に調整した。反応混合物を４Ｌの１Ｍ ＮａＣｌ中に注ぎ、Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を使用して約１Ｌに濃縮し、透過物を収集した。１００Ｋ最終透過物を、Ｂｉｏｍａｘ５Ｋ ＰｅｌＩｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を使用するＵＦによって約１リットルに濃縮する。濃縮された未透過物を、脱イオン水に対して１０回ダイアフィルターにかけ、約０．２Ｌに濃縮し、収集する。次いで、断片化された多糖体を過ヨウ素酸ナトリウムで活性化して、そのシアル酸残基中にアルデヒド基を生成した。
【００３１】
次いで、酸化させた多糖体を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する還元アミノ化によって、破傷風トキソイド（Ｓｅｒｕｍ Ｓｔａｔｅｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク国コペンハーゲン）又は組換え型（大腸菌）の破傷風毒素Ｃ断片（ｒＴＴｃ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米インディアナ州インディアナポリス）に結合させた。Ｒｏｃｈｅの組換え型の破傷風毒素Ｃ断片と、パパインでの消化後に後破傷風毒素から単離されたＣ断片（ＴＴｃ）（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、米カリフォルニア州Ｃａｍｐｂｅｌｌ）とを生化学的に比較すると、両方のタンパク質が同一であったことが示された（同じアミノ酸組成、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦによる測定で同じＭＷ、且つ同じＨＰＬＣによる溶離プロフィール）。図２を参照されたい。
【００３２】
これらコンジュゲートの物理化学的性質の一部を以下の表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）の臨床上最も重要な３種の血清型（Ｉａ、ＩＩＩ、及びＶ）の多糖体を、還元アミノ化によって破傷風トキソイド及びｒＴＴｃに結合させた。米国特許第５９９３８２５号を参照されたい。表２でその特性の一部を述べる。
【００３５】
【表２】
【００３６】
上記多糖体を破傷風Ｃ断片に結合させる、還元アミノ化以外の別の方法は、特許出願ＷＯ００１０５９９Ａ２に記載されている。この方法は、まず、部分的又は完全に脱Ｎ−アセチル化された多糖体を再Ｎ−アクリロイル化した後、活性化された多糖体を、担体タンパク質にｐＨ９〜１０で直接に結合させるものである。この化学現象は、タンパク質上の第一級アミノ基（リシニル残基のｕ−ＮＨ２）の多糖体上の不飽和Ｎ−アクリロイル基へのＭｉｃｈａｅｌ付加である。
【実施例２】
【００３７】
ｒＴＴｃコンジュゲートの前臨床評価
髄膜炎菌コンジュゲートの効力−免疫感作スケジュール：０日目、２８日目、及び４２日目に、４〜６週齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ雌性マウスを、ＴＴ（破傷風トキソイド）若しくはｒＴＴｃに結合させてある多糖体２μｇで皮下から免疫感作した。０日目、２８日目、及び５２日目に動物から採血した。破傷風結合型ワクチンと同様にして調製した、Ｃ、Ｙ、又はＷそれぞれの多糖体のヒト血清アルブミンコンジュゲートをコート用抗体として使用するＥＬＩＳＡによって、多糖体に特異的なＩｇＧを測定した。破傷風トキソイドをコート用抗体として用いるＥＬＩＳＡによって、コンジュゲートに対して産生された破傷風毒素抗体を測定した。抗体−補体が関与する抗血清の死滅作用は、補体供給源として乳飲みウサギ血清を使用する血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）によって測定した。
【００３８】
これらコンジュゲートに対する効力（多糖体特異的なＩｇＧ及び血清の殺菌活性）は、ＧＣＭＰのＴＴｃ、ｒＴＴｃ、及びＴＴコンジュゲート間の比較を図３に、ＴＴ又はｒＴＴｃに結合したＧＹＭＰ、ＧＷＭＰ、及びＧＣＭＰの各コンジュゲートに対する対応する免疫応答を図４に示す。
【００３９】
図３及び図４に示すように、髄膜炎菌ｒＴＴｃコンジュゲートは、その対応するＴＴ構築物と比較しても有意な効力の差を示さない。さらに、一連のＥＬＩＳＡによって抗破傷風応答及び抗破傷風Ｃ断片（ＴＴｃ）の測定も行った。ＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートに対する抗血清での有意な抗破傷風応答は、ＴＴｃ及びｒＴＴｃのＧＣＭＰコンジュゲートで産生された血清では、表３に示すように基本的に消滅した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
（ａ）破傷風についての二重抗原ＥＬＩＳＡ、（ｂ）間接破傷風ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ(Rristiansen et al., APMIS 105:843-53 (1997))、（ｃ）間接組換え型破傷風毒素断片Ｃ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの３種の検定を使用した。分析物を、４〜８℃で終夜インキュベートした。検定ａ及びｂのプレートは、炭酸緩衝液ｐＨ９．６で１：１００００に希釈した破傷風トキソイド−ロット５７ＳＳＩでコートし、４〜８℃で終夜インキュベートした。検定ｃのプレートでは、再形成した０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中組換え型破傷風毒素断片Ｃ（ｒＴＴｃ）−ロット８５１６１８３２、Ｒｏｃｈｅ−を炭酸緩衝液ｐＨ９．６で１μｇ／ｍｌに希釈したもので行い、室温で２時間インキュベートした。各コートの１枚のプレートに、サンプル及び基準物質の同じ前希釈物を適用した。インキュベートは、４〜８℃で終夜行った。
【００４２】
検出に向け、検定ａ）ではビオチン−ＴＴ／ＨＲＰ−ストレプトアビジン系を使用し、検定ｂ）及びｃ）ではＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）１：５０００を使用した。色素原Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で基質として使用し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。４９２ｎｍのＯＤ（光学密度）を読み取った。基準線法を使用してデータの分析を行った。
【００４３】
二重抗原ＥＬＩＳＡのデータに基づき、抗−ｒＴＴｃ ＭＡｂを使用して、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡデータを標準化した。ｒＴＴｃに対するＭＡｂは、可溶性トキソイドだけでなく、コートされた自然型破傷風トキソイド及び断片Ｃを同程度に認識する。このことは、ｒＴＴｃに対して産生された抗体が３つの型のＥＬＩＳＡによって測定できることを示唆している。
【００４４】
表３に示したデータは、ＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートに対する抗血清では非常に有意な抗破傷風ＩｇＧ応答が測定されたが、ＴＴｃ及びｒＴＴｃのＧＣＭＰコンジュゲートに対して産生された血清では、この応答が事実上存在しなかったことを示している。
【００４５】
ＴＴ又はｒＴＴｃを担体タンパク質として使用するＧＢＳコンジュゲートの、防御免疫応答を惹起する能力を試験した。本明細書に記載のとおりに調製した一価のＩａ、ＩＩＩ、及びＶ型コンジュゲートの有効性を、Madoff et al. Infec. & Immun.60:4989-94 (1992)の新生マウスモデルで評価した。動物（ＣＤ１雌性マウス）に混合３価ワクチンミックスを接種した。０日目及び２１日目に、各動物に、それぞれのコンジュゲート型多糖体を１ｐｇ与えた。ワクチンは、水酸化アルミニウム（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク）に吸着させた。２１日目にマウスを受精させた。生後４８時間の新生マウスに、Ｉａ型ＧＢＳ（０９０）、ＩＩＩ型ＧＢＳ（Ｍ７８１）、又はＶ型ＧＢＳ（ＣＪ１１１）を負荷した。個々の各コンジュゲートによって誘発された、ＧＢＳの型に特異的な多糖体ＩｇＧを図５に示す。このデータは、Ｉａ型及びＩＩＩ型のｒＴＴｃコンジュゲートは、同様に誘発されるにしても、多糖体特異的なＩｇＧの力価がその対応するＴＴ対象物よりも良好とまではいかず、とはいえＶ型ｒＴＴｃコンジュゲートは、その対応するＴＴよりも有意に高くＶ型特異的なＩｇＧを誘発することを示している。
【００４６】
新生マウス負荷の結果として生じる有効性は、抗体代用物のレベルとかなりの相関があり、すなわち、Ｖ−ＴＴ（約６５％）よりもＶ−ｒＴＴｃコンジュゲート（約８５％の有効性）によって与えられたＶ型負荷に対する防御の方が有意に良好であるが、Ｉａ型及びＩＩＩ型のＧＢＳ生物体による負荷に対しては同様の防御が提供され、対応するｒＴＴｃ又はＴＴコンジュゲートのどちらでも、Ｉａに対してはほぼ１００％、ＩＩＩに対しては９０〜９５％の有効性であった。図６を参照されたい。マウスのモデルでは、Ｖ型の負荷は、多糖体コンジュゲートによる以下の免疫感作を克服するのが最も難しく、したがって、Ｖ型多糖体用の担体タンパク質としての破傷風断片Ｃが、完全破傷風分子よりも明らかに適切な担体タンパク質であることは意義深く、特筆すべきである。
【００４７】
ＧＢＳのＴＴ及びｒＴＴｃコンジュゲートによって生じた抗破傷風応答、並びに（凝集を測定する）Ｌｆ単位で測定した残りのＴＴ活性を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
この研究は、タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬであり、期待濃度が、ＴＴについては４Ｌｆ／ｍＬ、ｒＴＴｃについては１０Ｌｆ／ｍＬに設定されているという仮定に基づく。
【００５０】
表４のデータは、ｒＴＴｃコンジュゲートによって誘発された血清での抗破傷風ＩｇＧ応答が、対応するＴＴコンジュゲートによって誘発された応答と比べて劇的に低減していることを示している。さらに、Ｃ断片のＧＢＳ多糖体への結合後に保持される破傷風毒素Ｂ細胞エピトープの数が、対応するＴＴコンジュゲートで保持される同じＢ細胞エピトープと比べると実質的に０まで低減している。したがって、表３及び表４に示したデータは、破傷風を担体タンパク質として含有する多糖体結合型ワクチンに対する抗体応答の、担体によって誘発される潜在的なエピトープ抑制を克服する本発明の別の利点を裏づけ、実証している。
【００５１】
説明部分、特定の実施例、及びデータは、好例となる実施形態を示すものであるが、実例として示しており、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、本明細書に含まれる議論、開示、及びデータから当業者に明らかとなり、したがって本発明の一部であると考える。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】破傷風毒素の略図である。
【図２】自然型ＴＴｃ及び組換え型ＴＴｃのプロフィール及び分子量を示す図である。
【図３】ＧＣＭＰコンジュゲートでの断片Ｃ、組換え型断片Ｃ、及び破傷風トキソイドの比較を示すグラフである。
【図４】髄膜炎菌コンジュゲートでの組換え型断片Ｃと破傷風トキソイドの比較を示すグラフである。
【図５】破傷風トキソイド又は組換え型断片ＣとのＧＢＳＰコンジュゲートによって誘発される、型に特異的なＩｇＧを示すグラフである。
【図６】新生マウスモデルにおけるＧＢＳＰコンジュゲートの有効性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖体ワクチンを含む抗原ワクチン用の改良された担体タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖体を担体タンパク質に結合（conjugation）すると、その多糖体の免疫原性を効果的により強くすることができる。破傷風トキソイドは、この担体としての能力から、何十年間も使用されており、少なくとも過去の使用に関してはその安全プロフィールが確立されている。
【０００３】
破傷風毒素の構造遺伝子は、クローン化され、配列決定がなされている。Fairweather et al., J.Bacteriol.165: 21-27 (1986)；Fairweather et al., Nuci.Acid Res. 14: 7809-7812 (1986).これらの研究では、破傷風毒素の構造が１３１５個のアミノ酸を含む１５０ｋＤのタンパク質であることが確認されている。自然型破傷風毒素の結合タンパク質を構成する断片Ｃは、この毒素がパパインで切断されて生じる５２ｋＤのポリペプチドであり、Ｃ末端の４５１アミノ酸に相当する。図１を参照されたい。
【０００４】
破傷風トキソイドは、２〜３箇所の万能Ｔ細胞エピトープを含むことが発見されている。Demotz et al., J. Immunol 142: 394-402 (1989).この特徴のために、破傷風トキソイドはヒトにおいて非常に有効である。このトキソイドの断片Ｃは、毒性でないことが示されている。この断片も、初回免疫刺激を受けたドナーによって認識される万能免疫原性Ｔ細胞エピトープのうちの少なくとも１箇所を含む。Valmori et al., J. Immunol 149:717-21 (1992);Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19: 2237(1989).
【０００５】
様々な細菌感染をターゲットとする莢膜多糖体（ＣＰ）結合型ワクチン（conjugate vaccin）が現在開発及び臨床評価の最中にある。多数のＣＰ血清型を合体させて単一の注射に含めることが、現在研究中である。しかし、ＣＰ結合型ワクチンを合体させて単一の多価注射にすることは、異なる成分間での競合をもたらし、個々のコンジュゲートの免疫原性に有害な影響を及ぼす。Fattom et al., Vaccine 17:126-33 (1999).
【０００６】
破傷風トキソイドの多糖体ワクチンへの使用は増加している。そこで、ワクチン接種を受けた集団が、破傷風に過度に曝され、集団全体に耐性及び／又は過敏性を引き起こす危険が伴うという懸念が浮上している。たとえば、免疫原性用量の担体を注射した後、ハプテン−担体コンジュゲートで免疫感作すると、抗ハプテン抗体応答が選択的に抑制される。担体によって誘発されるこのエピトープ抑制は、担体特異的Ｔ細胞の誘導と関連付けることができ、この誘導が、抗ハプテン応答を選択的に抑制し得るはずである。エピトープ抑制は、担体エピトープに特異的なクローンの増殖及びハプテンと担体エピトープとの抗原競合によって誘発され得る。Schutze et al., J. Immunol. 37:2635-40 (1989).ヒトでは、担体タンパク質に対する事前の免疫が、合成結合型ワクチンに対する血清学的応答をモジュレートすることが実証されている。Di John et al., Lancet 2 (8677):1415-8 (1989). Barrington et al., (Infect. & Immun. 61: 432-8, 1993)は、ワクチン成分での予備免疫による、ｂ型インフルエンザ菌結合型ワクチンに対する抗体応答のエピトープ抑制を認めたことを示している。より最近では、Burrage et al., (Infect. & Immun. 70: 4946-54, 2002)が、破傷風担体タンパク質での予備免疫による、髄膜炎菌Ｃ結合型ワクチンに対する抗体応答のある種のエピトープ抑制を示している。マウスでは、破傷風トキソイドでの高用量の担体初回抗原刺激後に、肺炎球菌及び髄膜炎菌多糖体−破傷風コンジュゲートの抗体応答に対するエピトープ抑制が認められている（Peeters et al. Infect & Immun 59: 3504-10, 1991）.これらの潜在的な有害な成果のために、破傷風トキソイドは、もはやこれまでのように投与すべきではなく、したがって改良された担体が求められている。
【非特許文献１】Fairweather et al., J.Bacteriol.165: 21-27 (1986)
【非特許文献２】Fairweather et al., Nuci.Acid Res. 14: 7809-7812 (1986).
【非特許文献３】Demotz et al., J. Immunol 142: 394-402 (1989).
【非特許文献４】Valmori et al., J. Immunol 149:717-21 (1992)
【非特許文献５】Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19: 2237(1989).
【非特許文献６】Fattom et al., Vaccine 17:126-33 (1999).
【非特許文献７】Schutze et al., J. Immunol. 37:2635-40 (1989).
【非特許文献８】Di John et al., Lancet 2 (8677):1415-8 (1989).
【非特許文献９】Barrington et al., (Infect. & Immun. 61: 432-8, 1993)
【非特許文献１０】Burrage et al., (Infect. & Immun. 70: 4946-54, 2002)
【非特許文献１１】Peeters et al. Infect & Immun 59: 3504-10, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の慣行に伴う有害な成果の多くを回避するために、本発明は、破傷風トキソイドの断片Ｃを主体とした担体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、破傷風トキソイドの断片Ｃを利用する免疫原性結合型ワクチンの製造法が提供される。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原が提供される。本明細書では、「目標病原体」とは、細菌又は真菌の病原体など、哺乳動物又は鳥の免疫系によって認識される多糖体エピトープを含む外来病原体を指す。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によれば、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原を含むワクチンが提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物又は鳥において目標病原体に対する免疫応答を惹起させる方法であって、哺乳動物又は鳥に、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原を含む有効量のワクチンを接種するステップを含む方法が提供される。この方法は、ニワトリ、シチメンチョウ、エミュー、ダチョウ、及び他の商業上重要な鳥などの鳥類で実施することができる。この方法は、げっ歯類、ウマ、ウシ、他の商業上重要な群れをなす哺乳動物、イヌ、ネコ、他の伴侶動物、ヒトなどの哺乳動物で実施することが好ましい。特に、この方法は、ヒトで実施することができる。
【００１２】
本発明のさらに別の態様では、目標病原体による哺乳動物又は鳥の後続の感染を予防する方法であって、哺乳動物又は鳥に、破傷風トキソイド断片Ｃタンパク質部分に共有結合した、少なくとも１種の目標病原体由来の１箇所又は複数の多糖体部分を含むコンジュゲート抗原を含む有効量のワクチンを接種するステップを含む方法が提供される。この方法は、ニワトリ、シチメンチョウ、エミュー、ダチョウ、及び他の商業上重要な鳥などの鳥類で実施することができる。この方法は、げっ歯類、ウマ、ウシ、他の商業上重要な群れをなす哺乳動物、イヌ、ネコ、他の伴侶動物、ヒトなどの哺乳動物で実施することが好ましい。特に、この方法は、ヒトで実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
「ＴＴｃ」と呼ばれることの多い破傷風毒素の断片Ｃは、本明細書で初めて開示するが、細菌又は真菌感染に対する防御のために、莢膜多糖体ワクチンなどの多糖体の担体タンパク質として使用することができる。断片Ｃは、抗原に結合させると、その抗原の免疫原性を増大させることができるが、これは、断片Ｃへの結合によって、抗原が免疫応答を惹起する能力が増強されるということである。この増強はしばしば、担体効果と呼ばれており、その本質は、多糖体をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換することにある。多糖体ＴＴｃコンジュゲートで免疫感作した哺乳動物では破傷風毒素抗体が明らかに中和されなくなり、その結果その自然型破傷風トキソイドの認識が縮小化され、さらに担体能力は明らかに保たれるために、ＴＴｃは、破傷風トキソイドの魅力的な代替物となる。
【００１４】
本明細書で示すデータは、ＴＴｃ及び組換え型ＴＴｃ（ｒＴＴｃ）が、多糖体の担体として使用でき、多糖体に特異的なＩｇＧ抗体に関して破傷風トキソイドと等価な免疫応答を惹起し得ることを実証している。図２を参照されたい。これらの抗体は、細菌を死滅させる能力を尺度とする機能活性が高くなっている。
【００１５】
断片Ｃ（ＴＴｃ）は、図１に示すように、アミノ酸位置がほぼ８６５〜１３１５のカルボキシル末端部分を指す。したがって、本発明においては、断片Ｃは、その領域を破傷風トキソイド分子全体の残りの少なくとも一部分から分離することと関係があり、これは、トキソイドをパパイン又は他のプロテアーゼで消化して、又は断片の組換え発現によって行うことができる。断片Ｃの組換え発現は、米国特許第５４４３９６６号で開示されている。したがって、断片Ｃに結合させた抗原を含むワクチンは、非断片Ｃ（すなわち、図１のＢ断片）領域の少なくとも１部分を欠くことになる。
【００１６】
当然、ＴＴｃ配列に対して様々な付加、除去、及び置換を行って、分子の担体能力に有害な影響を与えることなく変異体を得ることができる。たとえば、保存的及び半保存的なアミノ酸置換を行うことができる。好例となる保存的アミノ酸置換には、アラニンからセリンへ、アルギニンからリシンへ、アスパラギンからグルタミン若しくはヒスチジンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ、システインからセリンへ、グルタミンからアスパラギンへ、グルタミン酸からアスパラギン酸へ、グリシンからプロリンへ、ヒスチジンからアスパラギン若しくはグルタミンへ、イソロイシンからロイシン若しくはバリンへ、ロイシンからバリン若しくはイソロイシンへ；ロイシンからアルギニン、グルタミン、若しくはグルタミン酸へ；メチオニンからロイシン若しくはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、若しくはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ、スレオニンからセリンへ、トリプトファンからチロシンへ、チロシンからトリプトファン若しくはフェニルアラニンへ、バリンからイソロイシン若しくはロイシンへの変更が含まれるがこの限りでない。タンパク質工学分野の技術者ならば承知されていようが、本明細書で言及する保存的及び半保存的突然変異は、ＴＴｃの認識された抗原性／免疫原性領域の外側の領域に対して行うことが好ましい。様々な目的のための突然変異（たとえば、タンパク質の精製を容易にするためのポリペプチド「タグ」の付加）に適する領域には、Ｃ末端領域及びＮ末端領域が含まれる。
【００１７】
変異体は、ゲノム若しくはｃＤＮＡクローニング法を使用する組換え技術によって生成することができる。部位特異的及び領域指向性突然変異誘発技術を使用することができる。CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY vol. 1, ch. 8 （Ausubel et al., eds., J. Wiley & Sons 1989 & Supp. 1990-93）; PROTEIN ENGINEERING (Oxender & Fox eds., A. Liss, Inc. 1987)を参照されたい。さらに、リンカースキャニング法及びＰＣＲ法を突然変異誘発に使用することができる。PCR TECHNOLOGY (Erlich ed., Stockton Press 1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vols. 1 & 2（上掲）を参照されたい。上記技術のいずれかと共に使用するためのタンパク質の配列決定、構造モデリングの各手法は、PROTEIN ENGINEERING, loc. cit.及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vols. 1 & 2上掲で開示されている。所望であれば、コンビナトリアル化学、バイオパニング、及び／又はファージディスプレイの使用によって、断片Ｃに対する他の変化を添えることができる。
【００１８】
断片Ｃのペプチド模倣物は、Saragovi et al., Science 253: 792-95 (1991)及び他の論文に概略が述べられている手法によって生成することができる。模倣物は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。たとえば、BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., (Chapman and Hall, New York, 1993)中のJohnson et al., "Peptide Turn Mimetics"を参照されたい。ペプチド模倣物の使用の基礎をなす原理は、タンパク質のペプチド主鎖が、抗体及び抗原のもののように、主としてアミノ酸側鎖を分子の相互作用が促進される向きに配向させるために存在することである。本発明によるペプチド模倣物担体は、宿主に投与されたとき、免疫応答を惹起する助けとなるはずである。
【００１９】
断片Ｃは、現在実践されている方法によって、細菌や真菌の莢膜多糖体などの多糖体に結合させることができる。たとえば、多糖体は、弱塩基性条件下での処理によって脱アシル化し、次いで、シアノ水素化ホウ素アニオンなどの還元剤を用いる還元アミノ化によって断片Ｃに結合させることができる。ＥＰ０６５８１１８Ｂ１を参照されたい。以下で述べる実施例にあるもの、及びＷＯ００１０５９９Ａ２、米国特許出願公開第２００１／００１４３３２Ａ１号で開示されているものなど、他の結合手法も当業者に利用可能である。別の結合手法は、二遺伝子（ｂｉｇｅｎｉｃ）スペーサーを使用するMarburg et al., (J.Am.Chem.Soc., 108, 5282 1986)に記載されており、米国特許第４６９５６２４号、同第４８３０８５２号、同第４８８２３１７号、及び最後の３特許の方法を改良したものである米国特許第５６２３０５７号でも開示されている。
【００２０】
ワクチンの型及び特異性を規定することになる多糖体供給源は、細菌及び真菌を含む広範な種類の供給源から得ることができる。好例となる細菌には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸの各群を含む髄膜炎菌；Ａ、Ｂ、及びＣの各群を含む連鎖球菌；１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３の各型を含む肺炎球菌；５型及び８型を含む黄色ブドウ球菌；ｂ型を含むインフルエンザ菌；結核菌；カンピロバクター種；腸管組織侵入性大腸菌分離株；チフス菌；コレラ菌；フレクスナー赤痢菌；ブルセラ種；野兎病菌；及びペスト菌が含まれる。特に、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、及び黄色ブドウ球菌の抗原を、ＴＴｃとの結合に利用することができる。好例となる真菌には、特に、カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、及び黒色アスペルギルスが含まれる。標準の炭水化物化学を使用すると、自然型ＣＰの１つ又は複数の特性を有する合成多糖体がワクチンとして使用できる。
【００２１】
変異体を含めて、断片Ｃは、現在の破傷風トキソイドとほぼ同じ方法で担体として使用することができる。コンジュゲート用の薬剤として許容される製剤は、UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY (USP 24 NF 19); REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES; HANDBOOK ON PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (2d ed., Wade and Weller eds., 1994)に記載されているように、水溶液、塩類を含む非毒性の医薬添加剤、保存剤、緩衝剤などを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性溶媒には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウムやリンガーデキストロースなどの非経口賦形剤などが含まれる。静脈内賦形剤には、液体及び栄養の補給剤が含まれる。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性気体が含まれる。結合組成物の種々の成分のｐＨ及び正確な濃度は、当業界の定型的な技術に従って調節する。GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (9th ed.)を参照されたい。さらに、１種又は複数のアジュバントをワクチン組成物に加えることができる。ミョウバン（水酸化アルミニウム）が、使用が一般に受け入れられているアジュバントの一例であるが、ワクチン業界の技術者には他のアジュバントも知られている。
【００２２】
多糖体結合型ワクチンの部分としての断片Ｃは、通常、１回量で（幼児及び成人）、又は一次免疫感作のため（乳児の投与計画）及び一定期間にわたる複数回の追加免疫として多数回に分けて投与される。ある特定の患者のための特定の用量レベル、したがって治療有効量は、年齢、体重、及び性別に応じて変わり得る。ほとんどのワクチンでそうであるとはいえ、標準化した値を定めて、一集団の集まり又は亜集団全体に有効な一般化された投与量を明らかにすることができる。一般に、約５〜約１００μｇ、好ましくは約１０〜５０μｇを含有するワクチンが、若い哺乳動物において病原性のグラム陰性若しくはグラム陽性生物の莢膜多糖体に対して有効なレベルの抗体を誘発するのに適し、力価決定などによってさらに規定することができる。連続的に与えられる数回の少ない用量は、１回の注射として与えられる同量のコンジュゲートに優るはずであることが予想される。
【００２３】
本発明を以下の実施例によってさらに述べていくが、実施例は本発明を例示するものであり、本発明をいかようにも限定しない。
【実施例１】
【００２４】
ｒＴＴｃコンジュゲートの調製
髄膜炎菌Ｃ（ＧＣＭＰ）、Ｙ（ＧＹＭＰ）、及びＷ（ＧＷＭＰ）の各多糖体の調製：
髄膜炎菌Ｃ、Ｙ、及びＷの各多糖体を、グルコース及び酵母抽出物を含有する発酵ブロスから精製した。
【００２５】
脱Ｏ−アセチル化（ｄＯＡ）ＧＣＭＰは、米国特許第５４２５９４６号に記載のとおりに調製した。
【００２６】
脱Ｏ−アセチル化ＧＹＭＰは、以下のように調製した。
【００２７】
３００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いるＵＦによる多糖体の捕捉：
精密濾過にかけた、細胞を含まない発酵透過物約１３Ｌを、Ｂｉｏｍａｘ３００Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を使用するＵＦによって約１リットルに濃縮する。濃縮された未透過物を、１Ｍ ＮａＣｌに対して１２回、次いで脱イオン水に対して１０回ダイアフィルター（Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）にかける。これをさらに濃縮して約０．２Ｌにし、収集する。
【００２８】
多糖体の塩基による加水分解：
３００Ｋ未透過物の溶液（約５ｍｇＰＳ／ｍＬ）のＮａＯＨ最終濃度を２Ｎに調整し、８０℃にセットしたオーブンに１６〜１８時間入れておいた。反応混合物が冷めて５０℃を下回った後、１０Ｌの脱イオン水に希釈した。３０ｋＤａのＭＷＣＯ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜によって濃縮した後、濃縮された未透過物水を、１Ｍ ＮａＣｌに対して１２回、次いで脱イオン水に対して１０回ダイアフィルターにかけた。これをさらに濃縮して約０．２Ｌにし、収集した。
【００２９】
ｄＯＡ ＧＹＭＰの酸による加水分解：
未透過物の溶液をテフロン製反応器に移し、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を加えて、最終濃度を０．１Ｎとした。６Ｎ ＨＣｌを使用して反応混合物をｐＨ５に調整し、７０℃にセットした水浴に入れた。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを使用するＳＥＣ ＭＡＬＬＳによって測定した多糖体の分子量が目標の約１０〜２０ｋＤａに到達するまで、これを６５ｒｐｍで振盪した。
【００３０】
断片化されたｄＯＡ多糖体の再Ｎアセチル化：
６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて溶液のｐＨを８に調整し、次いで室温で無水酢酸を滴下して、無水酢酸の最終濃度を０．８Ｍとした。ＳＮ ＮａＯＨを使用して、反応混合物のｐＨを７〜９の間に保った。反応が完了した後、反応混合物のｐＨを１３まで上げ、混合物をさらに１．５時間攪拌した。次いで、反応ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いてｐＨ８に調整した。反応混合物を４Ｌの１Ｍ ＮａＣｌ中に注ぎ、Ｂｉｏｍａｘ１００Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を使用して約１Ｌに濃縮し、透過物を収集した。１００Ｋ最終透過物を、Ｂｉｏｍａｘ５Ｋ ＰｅｌＩｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を使用するＵＦによって約１リットルに濃縮する。濃縮された未透過物を、脱イオン水に対して１０回ダイアフィルターにかけ、約０．２Ｌに濃縮し、収集する。次いで、断片化された多糖体を過ヨウ素酸ナトリウムで活性化して、そのシアル酸残基中にアルデヒド基を生成した。
【００３１】
次いで、酸化させた多糖体を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する還元アミノ化によって、破傷風トキソイド（Ｓｅｒｕｍ Ｓｔａｔｅｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク国コペンハーゲン）又は組換え型（大腸菌）の破傷風毒素Ｃ断片（ｒＴＴｃ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米インディアナ州インディアナポリス）に結合させた。Ｒｏｃｈｅの組換え型の破傷風毒素Ｃ断片と、パパインでの消化後に後破傷風毒素から単離されたＣ断片（ＴＴｃ）（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、米カリフォルニア州Ｃａｍｐｂｅｌｌ）とを生化学的に比較すると、両方のタンパク質が同一であったことが示された（同じアミノ酸組成、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦによる測定で同じＭＷ、且つ同じＨＰＬＣによる溶離プロフィール）。図２を参照されたい。
【００３２】
これらコンジュゲートの物理化学的性質の一部を以下の表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）の臨床上最も重要な３種の血清型（Ｉａ、ＩＩＩ、及びＶ）の多糖体を、還元アミノ化によって破傷風トキソイド及びｒＴＴｃに結合させた。米国特許第５９９３８２５号を参照されたい。表２でその特性の一部を述べる。
【００３５】
【表２】
【００３６】
上記多糖体を破傷風Ｃ断片に結合させる、還元アミノ化以外の別の方法は、特許出願ＷＯ００１０５９９Ａ２に記載されている。この方法は、まず、部分的又は完全に脱Ｎ−アセチル化された多糖体を再Ｎ−アクリロイル化した後、活性化された多糖体を、担体タンパク質にｐＨ９〜１０で直接に結合させるものである。この化学現象は、タンパク質上の第一級アミノ基（リシニル残基のｕ−ＮＨ２）の多糖体上の不飽和Ｎ−アクリロイル基へのＭｉｃｈａｅｌ付加である。
【実施例２】
【００３７】
ｒＴＴｃコンジュゲートの前臨床評価
髄膜炎菌コンジュゲートの効力−免疫感作スケジュール：０日目、２８日目、及び４２日目に、４〜６週齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ雌性マウスを、ＴＴ（破傷風トキソイド）若しくはｒＴＴｃに結合させてある多糖体２μｇで皮下から免疫感作した。０日目、２８日目、及び５２日目に動物から採血した。破傷風結合型ワクチンと同様にして調製した、Ｃ、Ｙ、又はＷそれぞれの多糖体のヒト血清アルブミンコンジュゲートをコート用抗体として使用するＥＬＩＳＡによって、多糖体に特異的なＩｇＧを測定した。破傷風トキソイドをコート用抗体として用いるＥＬＩＳＡによって、コンジュゲートに対して産生された破傷風毒素抗体を測定した。抗体−補体が関与する抗血清の死滅作用は、補体供給源として乳飲みウサギ血清を使用する血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）によって測定した。
【００３８】
これらコンジュゲートに対する効力（多糖体特異的なＩｇＧ及び血清の殺菌活性）は、ＧＣＭＰのＴＴｃ、ｒＴＴｃ、及びＴＴコンジュゲート間の比較を図３に、ＴＴ又はｒＴＴｃに結合したＧＹＭＰ、ＧＷＭＰ、及びＧＣＭＰの各コンジュゲートに対する対応する免疫応答を図４に示す。
【００３９】
図３及び図４に示すように、髄膜炎菌ｒＴＴｃコンジュゲートは、その対応するＴＴ構築物と比較しても有意な効力の差を示さない。さらに、一連のＥＬＩＳＡによって抗破傷風応答及び抗破傷風Ｃ断片（ＴＴｃ）の測定も行った。ＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートに対する抗血清での有意な抗破傷風応答は、ＴＴｃ及びｒＴＴｃのＧＣＭＰコンジュゲートで産生された血清では、表３に示すように基本的に消滅した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
（ａ）破傷風についての二重抗原ＥＬＩＳＡ、（ｂ）間接破傷風ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ(Rristiansen et al., APMIS 105:843-53 (1997))、（ｃ）間接組換え型破傷風毒素断片Ｃ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの３種の検定を使用した。分析物を、４〜８℃で終夜インキュベートした。検定ａ及びｂのプレートは、炭酸緩衝液ｐＨ９．６で１：１００００に希釈した破傷風トキソイド−ロット５７ＳＳＩでコートし、４〜８℃で終夜インキュベートした。検定ｃのプレートでは、再形成した０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中組換え型破傷風毒素断片Ｃ（ｒＴＴｃ）−ロット８５１６１８３２、Ｒｏｃｈｅ−を炭酸緩衝液ｐＨ９．６で１μｇ／ｍｌに希釈したもので行い、室温で２時間インキュベートした。各コートの１枚のプレートに、サンプル及び基準物質の同じ前希釈物を適用した。インキュベートは、４〜８℃で終夜行った。
【００４２】
検出に向け、検定ａ）ではビオチン−ＴＴ／ＨＲＰ−ストレプトアビジン系を使用し、検定ｂ）及びｃ）ではＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）１：５０００を使用した。色素原Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で基質として使用し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。４９２ｎｍのＯＤ（光学密度）を読み取った。基準線法を使用してデータの分析を行った。
【００４３】
二重抗原ＥＬＩＳＡのデータに基づき、抗−ｒＴＴｃ ＭＡｂを使用して、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡデータを標準化した。ｒＴＴｃに対するＭＡｂは、可溶性トキソイドだけでなく、コートされた自然型破傷風トキソイド及び断片Ｃを同程度に認識する。このことは、ｒＴＴｃに対して産生された抗体が３つの型のＥＬＩＳＡによって測定できることを示唆している。
【００４４】
表３に示したデータは、ＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートに対する抗血清では非常に有意な抗破傷風ＩｇＧ応答が測定されたが、ＴＴｃ及びｒＴＴｃのＧＣＭＰコンジュゲートに対して産生された血清では、この応答が事実上存在しなかったことを示している。
【００４５】
ＴＴ又はｒＴＴｃを担体タンパク質として使用するＧＢＳコンジュゲートの、防御免疫応答を惹起する能力を試験した。本明細書に記載のとおりに調製した一価のＩａ、ＩＩＩ、及びＶ型コンジュゲートの有効性を、Madoff et al. Infec. & Immun.60:4989-94 (1992)の新生マウスモデルで評価した。動物（ＣＤ１雌性マウス）に混合３価ワクチンミックスを接種した。０日目及び２１日目に、各動物に、それぞれのコンジュゲート型多糖体を１ｐｇ与えた。ワクチンは、水酸化アルミニウム（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク）に吸着させた。２１日目にマウスを受精させた。生後４８時間の新生マウスに、Ｉａ型ＧＢＳ（０９０）、ＩＩＩ型ＧＢＳ（Ｍ７８１）、又はＶ型ＧＢＳ（ＣＪ１１１）を負荷した。個々の各コンジュゲートによって誘発された、ＧＢＳの型に特異的な多糖体ＩｇＧを図５に示す。このデータは、Ｉａ型及びＩＩＩ型のｒＴＴｃコンジュゲートは、同様に誘発されるにしても、多糖体特異的なＩｇＧの力価がその対応するＴＴ対象物よりも良好とまではいかず、とはいえＶ型ｒＴＴｃコンジュゲートは、その対応するＴＴよりも有意に高くＶ型特異的なＩｇＧを誘発することを示している。
【００４６】
新生マウス負荷の結果として生じる有効性は、抗体代用物のレベルとかなりの相関があり、すなわち、Ｖ−ＴＴ（約６５％）よりもＶ−ｒＴＴｃコンジュゲート（約８５％の有効性）によって与えられたＶ型負荷に対する防御の方が有意に良好であるが、Ｉａ型及びＩＩＩ型のＧＢＳ生物体による負荷に対しては同様の防御が提供され、対応するｒＴＴｃ又はＴＴコンジュゲートのどちらでも、Ｉａに対してはほぼ１００％、ＩＩＩに対しては９０〜９５％の有効性であった。図６を参照されたい。マウスのモデルでは、Ｖ型の負荷は、多糖体コンジュゲートによる以下の免疫感作を克服するのが最も難しく、したがって、Ｖ型多糖体用の担体タンパク質としての破傷風断片Ｃが、完全破傷風分子よりも明らかに適切な担体タンパク質であることは意義深く、特筆すべきである。
【００４７】
ＧＢＳのＴＴ及びｒＴＴｃコンジュゲートによって生じた抗破傷風応答、並びに（凝集を測定する）Ｌｆ単位で測定した残りのＴＴ活性を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
この研究は、タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬであり、期待濃度が、ＴＴについては４Ｌｆ／ｍＬ、ｒＴＴｃについては１０Ｌｆ／ｍＬに設定されているという仮定に基づく。
【００５０】
表４のデータは、ｒＴＴｃコンジュゲートによって誘発された血清での抗破傷風ＩｇＧ応答が、対応するＴＴコンジュゲートによって誘発された応答と比べて劇的に低減していることを示している。さらに、Ｃ断片のＧＢＳ多糖体への結合後に保持される破傷風毒素Ｂ細胞エピトープの数が、対応するＴＴコンジュゲートで保持される同じＢ細胞エピトープと比べると実質的に０まで低減している。したがって、表３及び表４に示したデータは、破傷風を担体タンパク質として含有する多糖体結合型ワクチンに対する抗体応答の、担体によって誘発される潜在的なエピトープ抑制を克服する本発明の別の利点を裏づけ、実証している。
【００５１】
説明部分、特定の実施例、及びデータは、好例となる実施形態を示すものであるが、実例として示しており、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、本明細書に含まれる議論、開示、及びデータから当業者に明らかとなり、したがって本発明の一部であると考える。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】破傷風毒素の略図である。
【図２】自然型ＴＴｃ及び組換え型ＴＴｃのプロフィール及び分子量を示す図である。
【図３】ＧＣＭＰコンジュゲートでの断片Ｃ、組換え型断片Ｃ、及び破傷風トキソイドの比較を示すグラフである。
【図４】髄膜炎菌コンジュゲートでの組換え型断片Ｃと破傷風トキソイドの比較を示すグラフである。
【図５】破傷風トキソイド又は組換え型断片ＣとのＧＢＳＰコンジュゲートによって誘発される、型に特異的なＩｇＧを示すグラフである。
【図６】新生マウスモデルにおけるＧＢＳＰコンジュゲートの有効性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物抗原の免疫原性を増大させる方法であって、
前記抗原を破傷風毒素断片Ｃに結合させて、結合型ワクチンを得るステップを含み、前記結合型ワクチンを患者に投与して、前記断片Ｃが前記抗原の効力を増大させる方法。
【請求項２】
抗原が細菌由来の莢膜多糖体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌が、髄膜炎菌のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸ群；連鎖球菌のＡ、Ｂ、及びＣ群；肺炎球菌の１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３型；黄色ブドウ球菌の５型及び８型；ｂ型インフルエンザ菌からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗原が真菌由来の莢膜多糖体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
真菌が、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコックス・ネオフォルマンスからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
感染に対して患者を免疫感作する方法であって、前記患者に、断片Ｃに結合させてある抗原を含むワクチンを有効量投与するステップを含む方法。
【請求項７】
抗原が細菌由来の莢膜多糖体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細菌が、髄膜炎菌のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸ群；連鎖球菌のＡ、Ｂ、及びＣ群；肺炎球菌の１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３型；黄色ブドウ球菌の５型及び８型；ｂ型インフルエンザ菌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗原が真菌由来の莢膜多糖体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
真菌が、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコックス・ネオフォルマンスからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
断片Ｃに結合させてある抗原を含む結合型ワクチン。
【請求項１２】
抗原が細菌由来の莢膜多糖体である、請求項１１に記載の結合型ワクチン。
【請求項１３】
細菌が、髄膜炎菌のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸ群；連鎖球菌のＡ、Ｂ、及びＣ群；肺炎球菌の１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３型；黄色ブドウ球菌の５型及び８型；ｂ型インフルエンザ菌からなる群から選択される、請求項１２に記載の結合型ワクチン。
【請求項１４】
抗原が真菌由来の莢膜多糖体である、請求項１１に記載の結合型ワクチン。
【請求項１５】
真菌が、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコックス・ネオフォルマンスからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
炭水化物抗原の免疫原性を増大させる方法であって、
前記抗原を破傷風毒素断片Ｃに結合させて、結合型ワクチンを得るステップを含み、前記結合型ワクチンを患者に投与して、前記断片Ｃが前記抗原の効力を増大させる方法。
【請求項２】
抗原が細菌由来の莢膜多糖体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌が、髄膜炎菌のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸ群；連鎖球菌のＡ、Ｂ、及びＣ群；肺炎球菌の１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３型；黄色ブドウ球菌の５型及び８型；ｂ型インフルエンザ菌からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗原が真菌由来の莢膜多糖体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
真菌が、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコックス・ネオフォルマンスからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
感染に対して患者を免疫感作する方法であって、前記患者に、断片Ｃに結合させてある抗原を含むワクチンを有効量投与するステップを含む方法。
【請求項７】
抗原が細菌由来の莢膜多糖体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細菌が、髄膜炎菌のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸ群；連鎖球菌のＡ、Ｂ、及びＣ群；肺炎球菌の１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３型；黄色ブドウ球菌の５型及び８型；ｂ型インフルエンザ菌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗原が真菌由来の莢膜多糖体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
真菌が、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコックス・ネオフォルマンスからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
断片Ｃに結合させてある抗原を含む結合型ワクチン。
【請求項１２】
抗原が細菌由来の莢膜多糖体である、請求項１１に記載の結合型ワクチン。
【請求項１３】
細菌が、髄膜炎菌のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、及びＸ群；連鎖球菌のＡ、Ｂ、及びＣ群；肺炎球菌の１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、９、１４、１８Ｆ、１９Ｆ、及び２３型；黄色ブドウ球菌の５型及び８型；ｂ型インフルエンザ菌からなる群から選択される、請求項１２に記載の結合型ワクチン。
【請求項１４】
抗原が真菌由来の莢膜多糖体である、請求項１１に記載の結合型ワクチン。
【請求項１５】
真菌が、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコックス・ネオフォルマンスからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５２４６２１（Ｐ２００７−５２４６２１Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７５５１（Ｐ２００６−５１７５５１）
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２００２６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００３４６
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０５４７４９２４）バクスター ヘルスケア エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２００２６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００３４６
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０５４７４９２４）バクスター ヘルスケア エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
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