ワクチン組成物及びその使用方法
イン・ビボでのワクチン接種及び抗体（例えば、モノクローナル抗体）産生のための１又は２以上の抗原の効果的な送達のために、及び、ＰＡＰＣ（プロフェッショナル抗原提示細胞）又はＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞（例えば、腫瘍細胞）へのペプチド、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡの効果的な送達のために、ナノ粒子に基づくワクチン、組成物、キット、及び、方法が使用される。例えば、抗原は、被験体（例として哺乳類）において、関心遺伝子の発現、及び、発現タンパク質への強く特異的な免疫反応の誘導に結び付くＤＮＡであってもよい。また、抗原は、プロセシングされ提示される免疫原性ペプチド又はポリペプチドであってもよい。一つの態様において、ここで記載されるように、イン・ビボでの抗原送達のためのナノ粒子を利用する方法は、少なくとも一つの抗原又はＴヘルパーエピトープ（例えばＰＡＤＲＥ）コンジュゲート荷電性デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ誘導化デンドリマー）にコンジュゲートする少なくとも一つの抗原性ペプチド又はポリペプチドをエンコードするＤＮＡから組成されるワクチンの注入を含む。もし陰性に荷電していなければプラスミドは化学的にＰＡＤＲＥデンドリマーに連結する一方、陰性に荷電したプラスミドは自然に陽性に荷電したＰＡＤＲＥ誘導化デンドリマーに結合する。代わりに、陰荷電性デンドリマーが使用されてもよい。ここに記載された組成物、キット、ワクチン及び方法は予防的及び処置的応用の両方、即ち、生体における病気又は疾患の処置と同様に、生体における病気又は疾患の開始を防止する予防薬として使用可能である。ここに記載されたワクチンは、いかなる感染性病原又はがんに対する免疫反応を備えるために使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に化学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、被験体で免疫応答を誘導するためのワクチン、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本出願は、２００９年４月１日に出願された米国仮特許出願第６１／１６５，７３２号の優先権を主張する。出願人は、本明細書でこの特許出願の優先権を主張し、全体の内容が引用により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
背景
ワクチンの使用による微生物感染及び発病過程の予防は、最も効果的で理想的な病気との闘いのための一つの手段と考えられている。感染又は発病に先立って、宿主動物の免疫応答を刺激する方法で、抗原、又は、免疫原が生体に導入される。しかしながら、伝統的なワクチン戦略は、多数の病原体又はがんに対する防御の備えに効果的ではなかった。伝統的ワクチン戦略によって、１００以上の病原体に対してわずかに約２０の有効なワクチンが作製されたに過ぎない。高い細胞障害性Tリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導するワクチンの中で一部は、弱い免疫原性により、低い目標反応割合、免疫回避メカニズム、及び、ディセプティブ・インプリンティング（偽装刷り込み）をしばしば示す。現在のワクチン送達の方法は、強い“危険信号”を誘発せず、負の制御として作用する阻害反応を開始し、ノンプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ抗原を送達するため、防御的免疫応答誘導との観点では、低い成功割合である。例えば、高いＣＴＬ反応を備える場合であっても、現在のがんワクチンは、低い目標反応割合（２．６％）しか示さない。これらは、弱い免疫原性及び免疫回避メカニズムを含む多数の不利益を伴う。さらに、（樹状細胞に基づく、及び、Ｇ−ｖａｘに基づく）最も有望ながんワクチンは、極めて高価であり、これらのワクチンの調製（例えば、患者毎の個別化、及び、ＧＭＰ基準での製造）が含まれる。
【０００４】
遺伝子ワクチン又は遺伝子免疫は、抗原作製のための哺乳類宿主への遺伝子材料接種関与の、がんワクチンを含むワクチンへの可能なアプローチとして考えられる。送達された関心抗原をエンコードする哺乳類発現ベクターは、イン・ビボでの発現と、それに続く抗原特異的反応に結び付く。その上、関心タンパク質の発現可能な場において、遺伝子は細胞膜を通過できず細胞の核に到達できない陰荷電性ポリマーである。遺伝子ワクチンは、自然なエピトープの完全なスペクトルの発生と、イン・ビトロで発現された組換えタンパク質の投与と比較してイン・ビボでのタンパク質の自然な配位構造の達成と、抗体と細胞性免疫の誘導と、及び、抗原作製のためのコスト的で一般的なワクチン投与ステップの除外とを含む多数の利点を与える。しかしながら、遺伝子ワクチンは、自己抗原の寛容破壊と、イン・ビボでの細胞及び核への低い核酸送達と、特定のタイプの細胞に対する特異性の欠如と、及び、弱い免疫応答と、多くの欠点を伴う。
【０００５】
同様に、他の型のワクチンは欠点を伴う。例えば、遺伝子のウイルス送達は、ウイルスベクターに対する強い免疫応答に結びつき、安全性上の問題を伴う。抗原として使用するための微生物からの蛋白精製とペプチド製造は、高価で時間を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、副作用がないか又は弱く、コスト的に効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするワクチンはない。そこで、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とし、安全でコスト効果的で、使用が容易で、強く特異的な細胞性及び抗体反応を引き出すワクチンについて大きな需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
本明細書記載の発明は、抗原に対して強力で特異的な免疫応答をもたらす前記抗原か、該抗原をエンコードする核酸かをイン・ビボでプロフェッショナルＡＰＣ（ＰＡＰＣ）に送達するためのナノ粒子を利用した組成物、キット及び方法と、プラットフォームとである。また、本明細書記載の発明は、ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するためと、核酸、ペプチド又はタンパク質を細胞（例えば、ＭＨＣクラスＩＩを発現する腫瘍細胞）に送達するためとのナノ粒子を利用した組成物、キット及び方法と、プラットフォームとである。現在のワクチン戦略の主要な利益は、ワクチン戦略が制御性Ｔ細胞を含む抑制性細胞を誘導することである。抗原をＰＡＰＣに標的送達することが、抑制因子機構の活性化、特に、制御性Ｔ細胞の活性化を低減又は阻害することが知られている。前記組成物、キット及び方法は、ＭＨＣ標的で免疫原性のペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ、ＨＡ）を、特定の細胞に核酸、ペプチド又はポリペプチドを標的送達のための運搬体としての荷電性（例えば、陽荷電性）多分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭその他のデンドリマー）と組み合わせて使用することを含み、遺伝子又はタンパク質のワクチン接種のための新規ナノ粒子を利用した方法をもたらす。本明細書記載の典型的なワクチンは、Ｔヘルパーペプチド（例えば、前記ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）と、少なくとも１つのポリペプチド抗原か、該少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸かと、任意のポリＩ−ＣとのようなＭＨＣ標的で免疫原性のペプチドにコンジュゲートした荷電性（例えば、陽荷電性）多分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭその他のデンドリマー）を含む。本明細書記載の前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡその他のものを含む陰荷電性生体分子に効率的に結合する。Ｔヘルパーペプチド（例えば、前記ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）にコンジュゲートした荷電性（例えば、陽荷電性）多分枝ポリマーデンドリマーは、ＰＡＰＣに特定の抗原を送達するために増大された有効性を有するワクチンを提供する。本明細書記載の実験では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＰＡＤＲＥを介してＰＡＰＣを標的にするためにＰＡＤＲＥを第１番目に使用することが示される。本明細書記載の実験は、前記ＭＨＣクラスＩＩに結合することが期待されるユニークな特徴の異なる標的ペプチド２つを効率的に使用することを記載する。したがって、本明細書記載の前記ワクチン、方法及び組成物は、全てのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む。本明細書記載の前記ワクチン、キット及び組成物は、イン・ビボでのＰＡＰＣへの特異的かつ効率的なトランスフェクションと、自家ＰＡＰＣの成熟、つまり強力で特異的な免疫応答をしばしばもたらす生来の普遍的なヘルパーＴ活性とを提供する。
【０００８】
デンドリマーは理想的なＤＮＡ送達候補であり、前記デンドリマーは、サイズ及び形状（積荷−空間）にわたる構造的な制御を提供し、生体適合性（無毒性で非免疫原性）であり、重要なスキャフォールド特性を有し、特異的な標的原子団のためのよく定義された表面を調節可能な官能基を有し、細胞接着と、細胞質又は核へのエンドサイト−シス及び送達とのための能力を有し、許容可能な生体分解性（体内で安全に分解するための能力）を有し、簡単で都合の良い製造性（臨床グレード）の合成と関係付けられる。本明細書記載の実験では、前記ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド又はポリペプチドにコンジュゲートした陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、ヒト及びマウスの両方で抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にし、ヘルパーＴ細胞を活性化するペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ又はインフルエンザＨＡ）を含む。前記ＰＡＤＲＥペプチドは主要な機能２つを有する。前記ＰＡＤＲＥペプチドはＰＡＰＣ上に存在する前記ＭＨＣクラスＩＩに結合するようにＰＡＰＣにＤＮＡを送り届け、前記ＰＡＤＲＥペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の発生と、抗体応答に必要とされるクラススイッチとを促進するヘルパーＴ細胞を刺激する。この新規ナノ構築物は、遺伝子及びペプチドの送達及びワクチン接種のためのユニークな特徴を有する。また、本明細書記載の実験は、ＰＡＤＲＥにコンジュゲートした陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー（ＰＡＭＡＭデンドリマー）が、治療上の設定で５０％までＣ５７ＢＬマウスで確立され、高い侵襲性のＢ１６／ＬＵ８メラノーマ腫瘍の成長を遅延し、サイズを減少させること、及び、Ｂ１６／ＯＶＡの予防上の設定で腫瘍の１００％根絶を示すこと、ワクチン接種ために用いられる遺伝子産物に対する強力な免疫応答を誘導すること、マウス及びヒトの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方で２倍又は３倍までのトランスフェクション効率を示すこと、ＧＦＰをエンコードするプラスミドを、流入領域リンパ節に由来するイン・ビボで送達すること、及び、ヒトＢ細胞、Ｔ細胞及びマウスのマクロファージにｓｉＲＮＡを効率的に送達することを示す。
【０００９】
本明細書記載の組成物及びワクチンは、組成物及びワクチンが、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞、ＰＡＰＣの全て又はほとんど全てを標的とするとき、ワクチン接種のために目的に合わせた理想的なプラットフォームである。Ｔ細胞の活性化の抑制又は促進をする（ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、Ｆｏｘｐ３及びこれらの推定の共刺激性受容体を含むが、これらに限定されない）共阻害性で共刺激性の非常に重要な分子を発現する。これらの経路に含まれる分子の発現の標的化操作は、がん、感染性疾患のための免疫療法／ワクチン接種、又は、中毒症又は不妊症のためか、被験体において疾患を誘導する薬剤を中和するためかと、自己免疫の管理のためとのワクチン接種のような他の新規ワクチンアプローチのために用いることが可能である。本明細書に記載されているようなワクチンを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に標的送達することが、非常により強力な免疫応答を生じ、抑制因子／フィードバック機構を減少し、ワクチン投与量を少なくすることで毒性を防止することによって、従来のワクチン接種戦略に関係する感作に解決策を提供する。
【００１０】
したがって、本明細書記載の発明は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記ワクチンでは、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることが可能である。本実施態様は、薬学的に許容可能な担体及び／又は油中水型エマルジョンを含むことが可能である。１つの実施態様では、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）、例えば、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープである。また、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることが可能である。前記核酸は発現ベクターであることが可能であり、前記少なくとも１つの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能である。
【００１１】
また、本明細書記載の発明は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。１つの実施態様では、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートしている。前記ワクチンは、第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含むことが可能であって、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることが可能である。前記ワクチンは、薬学的に許容可能な担体及び／又は油中水型エマルジョンをさらに含むことが可能である。前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープ、例えば、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープであることが可能である。もう１つの実施態様では、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡである。前記ペプチド又はポリペプチドの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能である。
【００１２】
さらに、本明細書記載の発明は、抗原を哺乳類に送達し、該哺乳類で前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生を誘導する方法である。前記方法は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記組成物はＭＨＣクラスＩＩで仲介されるヘルパーＴ細胞の活性化を誘導するために有効量の組成物であり、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原か、該少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸かとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸か、又は、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸か、又は、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、前記組成物を前記哺乳類に投与することが、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらす。ある実施態様では、前記哺乳類はがんを有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原はがん抗原であり、前記組成物は前記がんに対するワクチンである。典型的に、前記組成物を投与することは前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じない。もう１つの実施態様では、前記哺乳類は感染性疾患を有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原は感染性病原体由来であり、前記組成物は典型的に前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じない前記感染性病原体に対するワクチンである。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、ポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されること、及び／又は、薬学的に許容可能な担体、及び／又は、油中水型エマルジョンを含むことが可能である。
【００１３】
本方法の１つの実施態様では、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥエピトープ、例えば、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープである。また、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートされることが可能である。前記組成物は第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含むことが可能であり、該第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。
【００１４】
抗体を産生し、採取するための１つの実施態様では、前記哺乳類は、げっ歯類又はウサギであることが可能であり、前記モノクローナル抗体は前記哺乳類から採取される。本実施態様では、前記モノクローナル抗体は、前記哺乳類から前記抗体を採取するステップと、前記抗体のタイターを測定するステップと、前記哺乳類から脾臓を摘出するステップと、ミエローマとの融合を実行するステップとによって調製される。前記抗体はヒト化されることが可能である。
【００１５】
さらに、本明細書記載の発明は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物であって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることが可能であり、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられるであることが可能である。
【００１６】
その上さらに、本明細書記載の発明は、ｓｉＲＮＡをプロフェッショナル抗原提示細胞に送達する方法であって、該方法は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートする少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を提供するステップと、哺乳類の被験体に前記組成物を投与するステップとを含み、前記組成物を提供するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、前記投与するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートしている前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に結合し、前記ｓｉＲＮＡが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に入る条件下で前記組成物を投与する。前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能であり、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられるであることが可能である。１つの実施態様では、前記ｓｉＲＮＡは、前記プロフェッショナル抗原提示細胞でＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１の発現を妨げる。
【００１７】
その上さらに、本明細書記載の発明は、哺乳類において、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞（リンパ腫又はリンパ腫の一部分）の増殖を抑制するか、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するかの方法である。本方法は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドをコンジュゲートし、タンパク質をエンコードする核酸によって結合した少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーにおいて、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞に特異的に結合し、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸又は該核酸によってエンコードされるタンパク質との組み合わせが、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞の増殖の抑制か、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスの誘導かをするように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、結合される。前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、例えばＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能である。しかし、適切な陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー及びＴヘルパーペプチドのいずれかが用いられることが可能である。
【００１８】
本明細書に記載されているような核酸を細胞に送達するための方法は、少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を細胞に接触させるステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープが前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。本方法では、前記ペプチド又はタンパク質は前記細胞内で典型的に発現される。適切な陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー及びＴヘルパーペプチドのいずれかが用いられることが可能であるが、前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、例えばＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能である。
【００１９】
本明細書に記載されているような核酸を細胞に送達するための組成物は、少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含み、該少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能である。しかし、適切な陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー及びＴヘルパーペプチドのいずれかが用いられることが可能である。
【００２０】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者の一般的な理解と同一の意味を有する。
【００２１】
本明細書において、「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のような２以上のヌクレオチドの鎖、及び化学的に改変されたヌクレオチドを意味する。「精製された」核酸分子は、核酸が天然に存在する細胞又は生命体の他の核酸配列から実質的に分離された核酸分子である （例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％夾雑物を含まない）。前記用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換え核酸分子、プラスミド、ウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノム（全遺伝情報）を含む。精製された核酸の例は、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で製造される核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理で形成される核酸、組換え核酸、化学的に合成される核酸分子を含む。「組換え」核酸分子は、例えば、化学合成によって、又は、分離された核酸セグメントの遺伝子工学技術による操作によって、分離した別の２つの配列セグメントの人工的組み合わせで製造される核酸分子である。
【００２２】
ペプチド、オリゴペプチド、又はタンパク質のアミノ酸残基の引用において、「アミノ酸（置換）基」、「アミノ酸」、及び「（置換）基」の用語は相互代替的に使用され、本明細書において、アミノ酸又は少なくとも一つの他のアミノ酸若しくはアミノ酸様化合物にアミド結合又はアミド様結合で共有結合したアミノ酸様化合物を意味する。
【００２３】
本明細書において、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、例えば、長さ、及び、糖鎖付加やリン酸化のような翻訳後の修飾にかかわらず、アミノ酸のいかなるペプチド連結鎖を意味する同義語として使用される。
【００２４】
核酸分子、ポリペプチド、又は感染性病原体の引用において、「自然の（ｎａｔｉｖｅ）」は自然に存在する（例えば、野生型）核酸、ポリペプチド、又は感染性病原体である。
【００２５】
本明細書において「抗原」又は「免疫原」は抗体によって特異的に認識され、結合する分子を意味する。
【００２６】
エピトープ（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）の引用においては、生物活性によって適当なＭＨＣ分子へ結合し、ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）反応の刺激に対して有用なペプチドの場合に標的抗原又は抗原様分子に対するＴヘルパー反応及びＣＴＬ反応を誘導する能力を意味する。
【００２７】
「特異的結合」及び「特異的に結合する」の用語は、酵素／基質、受容体／アゴニスト、抗体／抗原等の対となる種の間で起こり、共有的若しくは非共有的相互作用、又は、共有的若しくは非共有的相互作用の組み合わせで介在される結合である。２つの種の相互作用が非共有結合複合体を作る場合、発生する結合は、典型的に、静電気的、水素結合、又は疎水結合の結果である。従って、「特異的結合」は、抗体／抗原、酵素／基質相互作用の特徴を有する結合複合体を作る２者間相互作用存在の一対の種の間で起こる。特に、特異的結合は、一対の中の１つのメンバーが特定の種と結合し、相応のメンバーが属する化合物ファミリーの中の他のいかなる種とも結合しないことによって特徴化される。
【００２８】
本明細書において、「Ｐａｎ−ＤＲエピトープ」、「Ｐａｎ−ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ」、「ＰＡＤＲＥ」及び「ＰＡＤＲＥペプチド」は、最も一般的な１２のＤＲアレル（ＤＲ１、２ｗ２ｂ、２ｗ２ａ、３、４ｗ４、４ｗ１４、５、７、５２ａ、５２ｂ、５２ｃ及び５３）中の少なくとも約７つのＤＲアレルと高親和性で結合できる約４及び約２０の間の置換基のペプチドを意味する。「高親和性」は本明細書において２００ｎｍ未満のＩＣ５０％での結合と定義される。例えば、高親和結合は、３１００ｎＭ未満のＩＣ５０％での結合を含む。クラスＩＩＭＨＣとの結合に対して、１０００ｎｍの結合親和性閾値は典型的であり、１００ｎｍ未満の結合親和性は一般的に高親和結合と一般的に考えられる。ＰＡＤＲＥペプチドの構築と使用は、米国特許５７３６１４２号公報に詳細に記載され、本明細書に引用として取り込まれる。
【００２９】
「Ｔヘルパーペプチド」は本明細書においてＴヘルパー細胞のＴ細胞受容体によって認識されるペプチドである。例えば、本明細書記載のＰＡＤＲＥペプチドはＴヘルパーペプチドである。
【００３０】
本明細書で使用される用語「デンドリマー」は、荷電（例えば、陽荷電、陰荷電）し、高分枝の、概して球形のポリマー高分子である。陽荷電性高分枝のポリマーデンドリマーの例として、ＰＡＭＡＭデンドリマーがある。「ＰＡＭＡＭデンドリマー」及び「ポリアミドアミンデンドリマー」の用語によって、分枝点に３級アミンが存在し、構造的な層の間の結合がアミド置換基によって作られるデンドリマーの型を意味する。
【００３１】
「ＰＡＭＡＭデンドリマー」及び「ポリアミドアミンデンドリマー」の用語によって、分枝点に３級アミンが存在し、構造的な層の間の結合がアミド置換基によって作られるデンドリマーの型を意味する。ＰＡＭＡＭデンドリマーはその表面に多数の陽荷電を示す。
【００３２】
用語「誘導体化デンドリマー」は、その表面に１以上の置換基を有するデンドリマーを意味する。
【００３３】
「ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー」又は「ＰＡＤＲＥデンドリマー」は、荷電（例えば陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭデンドリマー）表面の置換基にＰＡＤＲＥペプチドが共有結合したナノ構築物である。
【００３４】
用語「コンジュゲートされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」は、１分子又は化学物質の物理的又は化学的に他の分子又は化学物質への結合又は接着を意味する。コンジュゲートの例は、共有的連結及び静電気的な複合体形成を含む。用語「複合体形成した」、「との複合体」、及び、「コンジュゲートされた」は本明細書において相互代替的に使用される。
【００３５】
本明細書において、語句「配列相同性」は、サブユニットの一致を最大化するように整列した、即ち、ギャップと挿入を考慮し、２つの配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）の相同位置の同定サブユニットのパーセンテージを意味する。「配列相同性」は、配列分析ソフトウェア（例えば、カリフォルニア州サンディエゴ、Ａｃｃｅｌｒｙｓの配列分析ソフトウェア）によって測定できる。
【００３６】
語句「単離した」又は「生物学的に純粋な」は、自然な状態において一般的に付随する構成要素が実質的にない物質である。
【００３７】
本明細書において、「ナノ粒子」は、ナノメーターで計測される大きさの微視的な粒子を意味する。例えば、ナノ粒子は、概ね総直径２−５００ｎｍの範囲のＰＡＤＲＥデンドリマーコンジュゲート体、又は、核酸若しくはアミノ酸物質といくつかのＰＡＤＲＥデンドリマーコンジュゲート体とを組み合わせた粒子である。
【００３８】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体を含み、該抗体は、溶解又は結合形態で、公知の技術、例えば、これに限定されない酵素的開裂、ペプチド合成、又は組換え技術によって提供される当該抗体の断片、領域、及び誘導体と同様に標識可能なものを意味する。
【００３９】
本明細書において、用語「アジュバント」は、体液性及び／又は細胞性免疫応答を亢進するように調製するいかなる物質を意味する。
【００４０】
本明細書において、用語「表示された（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）」又は「表面に暴露された」は同義語と考え、ナノ粒子（例えばＰＡＤＲＥデンドリマー）のような構造の外表面に存在する（例えば、免疫サイト認識に到達可能な抗原又は他の分子である）抗原又は他の分子である。
【００４１】
用語「多価の」は、１以上の複製又は抗原の型又は分子がナノ粒子上に表示されることを意味する。
【００４２】
本明細書において、「ワクチン」は予防的及び治療的なワクチンの全てを包含する。ワクチン組成物は、本明細書において、イン・ビボで生物学的に互換的な形態での被験体への投与に適する。本発明における「イン・ビボでの生物学的に互換的な投与に適した形態」の表現は、治療効果が毒性作用を上廻る投与物質の形態を意味する。当該化合物はいずれの動物（例えばヒト）に投与されても良い。本発明のある実施態様において、哺乳類（例えば、げっ歯類又はウサギ）に特定の抗原に対するモノクローナル抗体を製造するためにワクチンが投与される。
【００４３】
「免疫応答」の語句によって、抗原又は複数の抗原に対する抗体、及び／又は、免疫細胞介在応答の誘導が意味される。免疫応答の誘導は、抗原投与生体の免疫原性の体質、化学組成、及び、抗原の構造、並びに、抗原投与の方法及び期間を含む多くの要因に依存する。免疫応答は多くの様相を有し、その一部は免疫システムの細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、及び、プラズマ細胞）によって示される。免疫システムの細胞は、抗原若しくは免疫系の他の細胞との相互作用、サイトカインの放出及びこれらのサイトカインとの反応性を通して関与しても良い。免疫応答は一般的に、体液性及び細胞性の２つの主要なカテゴリーに分けられる。体液性免疫応答の構成要因として、抗原に特異的な抗体の産生を含む。細胞介在の要因としては抗原に対して遅発型過剰感受性で細胞障害性エフェクター細胞の産生を含む。
【００４４】
語句「治療的有効量」及び「有効的な投与量」は、治療的（臨床的）に望ましい結果を生むために十分な量を意味し、結果の正確な性質は、処置される障害の性質に依存して変動する。例えば、処置される障害はがんであり、その結果は、がん性腫瘍を含むがん細胞の排除が可能である。本発明における、組成物及びワクチンは１日当たり１回以上から１週間投与当たり１回以上の投与が可能である。当業者は、これに限定されない病気又は障害の重篤性、過去の処置、全体的な健康及び／又は被験体の年齢、罹患疾患を含む被験体への効果的な処置に必要な投与量及びタイミングに影響する要因を理解するであろう。さらに、本発明の組成物又はワクチンの治療的に有効な量での処置は、１回の処置又は連続処置を含む場合がある。
【００４５】
本明細書において、用語「処置」は、本発明における又は本発明の方法によって同定される、治療剤の患者への投与若しくは適用、又は、病気、病気の症状を持つ、若しくは病気の素因を持つ患者から単離された組織若しくは細胞系列への、治療剤の、病気、病気の症状、病気の素因を、治す、癒す、緩和する、和らげる、変化する、救う、改善する、好転する若しくは作用する目的での、適用若しくは投与と定義される。
【００４６】
用語「患者」、「披験体」、「個体」は、本明細書において相互代替的に使用され、ヒト患者が望ましい処置を受ける哺乳類披験体を意味する。ある事例においては、本発明の方法は、非ヒト霊長類と同様に、マウス、ラット、及びハムスターに限定されないげっ歯類を含み、動物実験、獣医学的応用、動物疾患モデルの展開での使用を認める。
【００４７】
本発明と同様の又は同等のワクチン、組成物、キット及び方法は、本発明の実施又は試験として使用できるが、好適なワクチン、組成物、キット及び方法は以下に記載される。本明細書記載の全ての出版物、特許出願、及び、特許は、引用によって全体として本明細書に取り込まれる。矛盾する場合は、本明細書が定義を含めて調整する。以下に議論する特定の実施態様は例証するためのものであり、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】プラスミドと混合、又は、標的ＡＰＣ（抗原提示細胞）に対するペプチド若しくはポリペプチド抗原と連結したＰＡＤＲＥ−デンドリマーの概要図である。
【図２】イン・ビトロでの、赤色蛍光色素でタグ付けした短い核酸配列とＰＡＤＲＥ−デンドリマーとの複合体の送達を示すヒトＢ細胞の解析の一連のドット・プロット・サイトメトリーの分析図である。
【図３】イン・ビボにおけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーのＤＮＡ送達を表す写真である。
【図４】ＧＦＰ又はＯＶＡをエンコードするプラスミド皮下投与で免疫されたＣ５７ＢＬマウスの血清での、ＥＬＩＳＡ（左図）又はＦＬＩＳＡ（右図）で評価された腫瘍に対する効果を示すグラフである。
【図５】Ｂ１６メラノーマ細胞（上段）又はＴＳＡ（下段）が移植されたマウスにおけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーの腫瘍に対する治療効果を示すグラフである。
【図６】ヒトＢ細胞（上段図）とヒト末梢単核球細胞（ＰＢＭＣ）（下段図）にいて、デンドリマー−ＰＡＤＲＥとＧＦＰプラスミド（５μｇ）との複合体を共培養したＧＦＰ発現のフロー・サイトメトリーヒストグラムである。
【図７】イン・ビトロでのタンパク質、アルブミン−ＦＩＴＣのＰＤＤ（ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー）によるヒトＢ細胞への送達を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。右側の写真はＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体添加後1時間のＢ細胞によるアルブミン取り込みの蛍光写真である。
【図８】リンパ節でのイン・ビボＤＣ（樹状細胞）標的を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。左図は、実験操作の時間概念図を表し、右図は、ＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入部位に接するリンパ節に対するフロー・サイトメトリー・ドット・プロットを表す。
【図９】ＤＲＨＡ（デンドリマーＨＡ）、異なったＴヘルパーエピトープで修飾されたデンドリマーのＤＣ（樹状細胞）へのＧＦＰトランスフェクションの促進を表すグラフを示す。
【図１０】赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとの複合ＰＡＤＲＥ−デンドリマーでトランスフェクトされたヒトＢ細胞の顕微鏡写真である。
【図１１】赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとデンドリマー複合体（左図）、及び、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとＰＡＤＲＥ−デンドリマーとの複合体でトランスフェクトされた（右図）、ヒヒ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の顕微鏡写真である。
【図１２】プラスミドをエンコードするデンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトしたヒヒ末梢血単核球（左図）、及び、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトした細胞（右図）の顕微鏡写真を表す。
【図１３】ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのプラスミド（ＤＲＰ−ｏｖａプラスミド）複合体のワクチン接種とイン・ビボ電気穿孔法（ＥＰ−ｏｖａプラスミド）との比較を表すグラフである。
【図１４】ＰＤＤ／プラスミド−ＰＣＡＲＤ抗原の２つで免疫したマウスの高タイター抗体反応誘発を示すイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの写真である（左図：抗原をエンコードするプラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞、右図：対照プラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞）。
【図１５】ＰＤＤ／プラスミドの２つで免疫されたマウスの高タイター抗体反応誘導を表すイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートのグラフと写真である。
【図１６】ＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで１回免疫し、更にＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで２回免疫することにより抗体反応を誘導した免疫マウスの血清イン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの写真である。
【図１７】Ｇ５デンドリマー、コンジュゲート体、及び、ペプチドのＵＶ−可視スペクトルを表すグラフである。
【図１８】ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡ プラスミドの予防的ワクチン接種のＢ１６／ＯＶＡ腫瘍に対する効果を示すグラフである。
【００４９】
図１は、プラスミドと混合、又は、標的ＡＰＣ（抗原提示細胞）に対するペプチド若しくはポリペプチド抗原と連結したＰＡＤＲＥ−デンドリマーを示す一対の概要図である。図１は、本明細書に記載されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーがいかなる関心抗原又はいかなる関心抗原をエンコードする核酸を取り込むことが可能なプラットフォームを提供することを表す。本明細書におけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれるようにデザインされた生来の免疫力の活性化剤である。
【００５０】
図２は、イン・ビトロでの、赤色蛍光色素でタグ付けした短い核酸配列とＰＡＤＲＥ−デンドリマーとの複合体の送達を示すヒトＢ細胞の解析についての一連のドット・プロット・サイトメトリー画像である。該核酸は、哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド送達最適化の評価促進のためのＲＮＡｉ解析での使用のためにデザインされた赤色蛍光標識ｄｓＲＮＡである。細胞は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／多ヌクレオチド複合体又は対照と共に、培地を除去し、新鮮な培地を添加し、4時間共培養された。画像は、精製ヒトＢ細胞へのＡｌｅｘａ Ｆｕｏｒ標識ｄｓＲＮＡオリゴマーの送達を示す。第４カラムの最下段の画像は、約９．２％の細胞でのオリゴ送達を示す。
【００５１】
図３は、イン・ビボにおけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーのＤＮＡ送達を表す一連の写真である。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−プラスミド複合体が皮膚（全５μｇプラスミド）及び角膜（１μｇ／角膜）に注入された。麻酔されたマウスの肝臓のステレオ蛍光顕微鏡画像が撮影された。左の画像は皮膚でのＧＦＰ発現が、右の画像は角膜でのＧＦＰ発現を示す。
【００５２】
図４は、確立された腫瘍の処置を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬマウスが、ＧＦＰ（１回）又はＯＶＡ（２回）をエンコードするプラスミドの皮下投与で免疫された。３匹の血清が採取され、ＥＬＩＳＡ（左図）又はＦＬＩＳＡ（右図）が実施された。
【００５３】
図５は、確立された腫瘍のＰＡＤＲＥ−デンドリマー治療についての一対のグラフを示す。Ｂ１６メラノーマ細胞（上段）又はＴＳＡ（下段）が移植されたマウスが、腫瘍移植後２日目又は３日目にワクチン接種され、１週間後に追加免疫された。
【００５４】
図６は、ヒト末梢単核球細胞（ＰＢＭＣ）（下段図）、ヒトＢ細胞（上段図）のデンドリマー−ＰＡＤＲＥとＧＦＰプラスミド（５μｇ）との複合体を共培養したＧＦＰ発現の一連のフロー・サイトメトリーヒストグラムである。デンドリマー／ＧＦＰ複合体が対照（左ヒストグラム）として使用された。
【００５５】
図７は、イン・ビトロでのタンパク質、アルブミン−ＦＩＴＣのＰＤＤ（ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー）によるヒトＢ細胞への送達を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。左画像は、精製ヒトＢ細胞へのＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ送達を表す。ヒト精製Ｂ細胞が採取され、ＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣと共培養された。左ヒストグラムはヒトＢ細胞に添加後のＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ送達を示す。上段のヒストグラムはＢ細胞単独を、中段のヒストグラムはデンドリマー／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体を、下段のヒストグラムはヒトＢ細胞添加ＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体の結果を表す。右写真はＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体添加後1時間のＢ細胞によるアルブミン取り込みの蛍光写真の画像である。
【００５６】
図８は、リンパ節でのイン・ビボＤＣ（樹状細胞）標的を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。左画像は、注入、リンパ節摘出、及び解析の時間概念図を表し、右画像図は、ＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入部位に接するリンパ節細胞から得られるナイーブのリンパ節に対するデータ解析の一対のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットを表す。これらの画像は、リンパ節近接の注入部位のマウスＤＣ及びＢ細胞のイン・ビボＰＡＤＲＥ−デンドリマーの効果を表す。リンパ細胞はＣＤ１１ｃ（ＤＣマーカー）、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ２０（Ｂ細胞マーカー）で染色した。右上段のヒストグラムは、デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入がＤＣの約６％にＧＦＰを発現する結果を、下段ドットプロットは明確にＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド注入がＤＣ＞７０％でＧＦＰを発現する結果を示す。
【００５７】
図９は、ＤＲＨＡ（デンドリマーＨＡ）、異なったＴヘルパーエピトープで修飾されたデンドリマーを表す一対のグラフを示し、イン・ビボ標的リンパ節がＤＲＨＡによりＤＣ（樹状細胞）へのＧＦＰトランスフェクションを促進することを表す。本実験は、Ｂａｌｂ／ｃマウスがＩａｄ制限ＨＡペプチドコンジュゲートデンドリマーと連動して使用される点が相違するが、図８と同様である。ＤＲＨＡ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入部位に接するリンパ節、及び、ナイーブなリンパ節が、ＤＲＨＡ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入後５日目に摘出された。チャートは、ＤＣに対してＣＤ１１ｃ（ＤＣマーカー）で染色後のリンパ節細胞から得られたデータのフロー・サイトメトリー解析結果を表す。上段の図は、既に示した処置マウスの流入領域リンパ節に認められるＧＦＰ陽性ＤＣ数を表す。下段の図は、ＤＣ中のＧＦＰ蛍光強度の平均を表す。これらの結果は、ＤＲＨＡがイン・ビボでトランスフェクトされたＤＣ数を増加するだけではなく、細胞に入るプラスミド分子の数の増加を明確に示す。
【００５８】
図１０は、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーオリゴとの複合ＰＡＤＲＥ−デンドリマーでトランスフェクトされたヒトＢ細胞の顕微鏡写真である。
【００５９】
図１１は、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとのデンドリマー複合体でトランスフェクトされた（左図）、及び、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとのＰＡＤＲＥ−デンドリマー複合体でトランスフェクトされた（右図）、ヒヒ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の一対の顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡写真は、ＰＤＤ／ｄｓＲＮＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ又は対照複合体をヒヒ末梢血単核球に対して添加後2時間に撮影された。画像は、サル末梢血単核球へのＰＤＤを介した多ヌクレオチドの標的送達の高い効果を表す。
【００６０】
図１２は、プラスミドをエンコードするデンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトしたヒヒ末梢血単核球（左図）、及び、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトした細胞（右図）の一対の顕微鏡写真を表す。プラスミドをエンコードするデンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトしたヒヒ末梢血単核球（左図）、及び、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトした細胞（右図）。蛍光写真画像は、ヒヒＰＢＭＣにＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド又は対照複合体を添加後１日に撮影された。本画像は、プラスミドの標的送達の高い効果とＰＤＤを介したプラスミドによってエンコードされた遺伝子発現を表す。
【００６１】
図１３は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのプラスミド（ＤＲＰ−ｏｖａプラスミド）複合体のＤＮＡワクチン単回接種がプラスミドのイン・ビボ電気穿孔法（ＥＰ−ｏｖａプラスミド）に優ることを表す結果のグラフである。
【００６２】
図１４は、ＰＤＤ／プラスミド−ＰＣＡＲＤ抗原の２つで免疫したマウスの高タイター抗体反応誘発を示す免疫マウス血清を使用するイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの一対の写真である。マルチウェルプレートは、抗原をエンコードするプラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞（左図）及び対照プラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞（右図）を含んでいる。
【００６３】
図１５は、ＰＤＤ／プラスミドの２つで免疫したマウスの高タイター抗体反応誘導を表す免疫マウス血清を使用するイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートのグラフと一連の写真である。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのＧＦＰ又はｏｖａをエンコードするプラスミド複合体で１回免疫した、又は、ＰＡＤＲＥ-デンドリマーのＣＣＲ５、ｖｇＰＣＲ、ＣａｔｈＬ、若しくはｐ２をエンコードするプラスミドとの複合体で２回免疫したイン−セル・ウエスタン・ＦＬＩＳＡの結果を表す。
【００６４】
図１６は、ＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで１回免疫し、更にＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで２回免疫することにより抗体反応を誘導した免疫マウスの血清を使用したマウス、イン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの一対の写真である。これらの結果は、ＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲでの単回免疫が、追加免疫で高められる抗体反応に結びつくことを示す。
【００６５】
図１７は、Ｇ５デンドリマー、コンジュゲート体、及び、ペプチドのＵＶ−可視スペクトルを表すグラフである。
【００６６】
図１８は、本明細書で（ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡ プラスミド）と記載されるワクチン接種の予防的な設定でＢ１６／ＯＶＡ腫瘍の撲滅を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な説明
本明細書に、イン・ビボでのワクチン接種及び抗体（例えば、モノクローナル抗体）製造のための１又は２以上の抗原の効果的な送達を目的に、及び、ＰＡＰＣ（プロフェッショナル抗原提示細胞）又はＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞（例えば、腫瘍細胞）へのペプチドか、タンパク質か、ｓｉＲＮＡか、ＲＮＡ又はＤＮＡかの効果的な送達を目的に、ナノ粒子に基づくワクチンと、組成物と、キットと、及び、方法とが記載されている。典型的なワクチン又は組成物において、荷電（例えば陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマーは、ＭＨＣ標的で、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）のような免疫原性ペプチドにコンジュゲートされ、披験体における特定の抗原に対する免疫応答を誘導するための少なくとも１つの分子にコンジュゲート又は結合される。前記分子は、細菌性、真菌性、原生動物、若しくはウイルス起源のタンパク質若しくはペプチド、又は、これらの抗原、炭化水素、若しくはペプチド様炭化水素由来のフラグメントであっても良い。該分子は、自己免疫疾患処置のための自己抗原を含んでも良い。さらに、抗原性分子は、少なくとも１つの抗原をエンコードする哺乳類のプラスミドを含む１以上の核酸であっても良い。例えば、抗原は、披験体（例えば哺乳類）において、１以上の免疫原性ペプチドを発現して、該発現タンパク質に対する強く特異的な免疫応答の誘導に結びつく１以上の核酸であっても良い。別の例として、抗原は、プロセシングされて提示される免疫原性のペプチド又はポリペプチドであっても良い。荷電（例えば、陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマーは２以上の異なる抗原にコンジュゲートされることが可能であり、同様に、各々異なる抗原をエンコードする２以上の核酸とコンジュゲートすることが可能である。本明細書において、ワクチン又は他の組成物は、一つの型の抗原をコンジュゲートした複数の荷電（例えば、陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、特定の抗原の５つの複製をコンジュゲートした５つのデンドリマー）、又は、異なる抗原の複数にコンジュゲートされた荷電（例えば、陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、５つの異なる抗原に対する５つのデンドリマー）を含むことができる。該デンドリマーは、デンドリマー（陽性）と抗原（陰性）との反対の電荷に基づき、抗原（核酸又はタンパク質）との複合体（コンジュゲート）を作る。又は、コンジュゲートは共有的な化学結合の場合がある。
【００６８】
１つの実施態様として、本明細書に記載されるように、イン・ビボで抗原を送達するためのナノ粒子に基づく方法は、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡ等のようなエピトープ）のようなＭＨＣ標的又は免疫原性ペプチドとコンジュゲートし、荷電（例えば陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー（ＰＤＤ））に対して、結合する抗原、又は、コンジュゲートするポリペプチド又は抗原性ペプチド若しくはポリペプチドをエンコードするＤＮＡプラスミドによって組成されるワクチンの注入を含む。陰性に荷電したプラスミドは、自然に、陽性に荷電したＰＡＤＲＥ−デントリマーに結合する、一方、ペプチド又はポリペプチド抗原は、もし陰性に荷電していないならば、化学的にＰＡＤＲＥ−デンドリマーに連結される。別の実施態様において、デンドリマーは、陽荷電性のタンパク質及びペプチドと結合するために陰性に荷電している。表面に暴露された抗原又は抗原をエンコードする核酸は、いかなる好適な公知の手段によって、デンドリマーにコンジュゲートされても良い。コンジュゲート方法は、自然のイオン的、非イオン的、静電気的結合又は共有結合のどれであっても良い化学的な複合体形成を含む。本明細書において、Ｔヘルパーエピトープにコンジュゲートされたデンドリマーは、多価であることが可能であり、抗原の１以上の複製若しくは型、又は核酸を表面に提示できる。多価の、又は、凝集した抗原（又は抗原をエンコードする核酸）の存在は、披験体の免疫応答を高める。抗原又は核酸の型の１以上の複製は、２以上の分離したリンカー若しくはスペーサー、又は共通のリンカー若しくはスペーサーを介してデンドリマーに接着できる。本明細書の組成物、キット及びワクチンは予防的及び処置的の両方の適応を有する。即ち、披験体の病気又は疾患の発症を防止する予防薬として使用できる。いかなる感染病原体又はがんに対する免疫応答を備えるために、本明細書記載のワクチンが使用可能である。
【００６９】
本明細書において、治療剤は単核球、特にＢ細胞を標的として使用でき、同時発生慢性リンパ球性白血病及び多発性骨髄腫に使用できる。本明細書において、ナノ粒子（例えば、ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー）と治療剤（医薬品）との組み合わせが複数の形態、例えば、治療剤とナノ粒子の混合物で使用できる。本明細書に記載するナノ粒子の組み合わせ（例えば、ＰＡＤＲＥ-誘導体化デンドリマー）及び治療剤（例えば、医薬）は、例えば、治療剤とナノ粒子との混合物、複合体形成のための静電的結合、治療剤のナノ粒子への化学的コンジュゲート等、いくつかの形態で使用しても良い。治療薬の例として、毒素、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、（例えば、腫瘍抑制遺伝子、自殺遺伝子（例えば、ＴＫ）、又は、腫瘍の増殖及び／又は生存を遮断又は変化させるいかなる遺伝子をエンコードする）プラスミド、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、抗体、メルファラン、プレドニゾン、サリドマイド（ＭＰＴ）、ベルケード（登録商標）（ボルテゾミブ）（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レナリドミド、及び、デキサメタゾン、又は、これらの組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００７０】
同様に、本明細書記載の組成物及び方法は、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞を含む免疫細胞に治療薬が到達する（送達される）自己免疫疾患の治療に使用されても良い。本明細書記載の組成物は、陰荷電性で本明細書に記載のナノ粒子との複合体を生成するポリＩ．Ｃ．（しかし、これに限定されない）のようなアジュバントとともに使用されても良い。
【００７１】
下記の好ましい実施態様は、これらの組成物, ワクチン、キット及び方法の適用を表す。それにもかかわらず、これらの実施態様の記載から下記の記載に基づいて発明の他の側面が作られ、及び／又は、実践する場合がある。
【００７２】
生物学的方法
ここで、従来の分子生物学的技術を含む方法を記載する。このような技術はＳａｍｂｒｏｏｋら著「分子クローニング：研究室マニュアル 第三版、１−３巻」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．、２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌら著「分子生物学の現在のプロトコール」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．１９９２年（定期出版物））のような方法論の文献や専門書に詳細に記載され公知である。免疫学的技術は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｗ．Ａｌｔ著「免疫学の進歩、第９３巻」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、２００７）、Ｇａｒｙ Ｃ Ｈｏｗａｒｄ 及びＭａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｋａｓｅｒ編集「抗体の作製と使用 実践的ハンドブック」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌ、ロンドン、英国）、Ｇａｂｒｉｅｌ Ｖｉｒｅｌｌａ著「医学免疫学 第６版」（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、英国、２００７年）、及び、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ著「抗体、研究室マニュアル」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．、１９８８）のような文献や専門書に詳細に記載され公知である。遺伝子導入、及び遺伝子治療の従来の方法は本発明に適用されても良い。例えば、Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ「遺伝子治療：原理と応用」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９９）、及びＰ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ著「遺伝子治療プロトコール（分子医学の方法）」（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９７年）を参照のこと。ワクチン製造の方法とワクチン投与は、例えば、Ａｎｄｒｅｗ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｍａｒｔｉｎ Ｐ．Ｃｒａｎａｇｅ 及びＭｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｈｕｄｓｏｎ著「ワクチン・プロトコール（分子医学の方法）第２版」（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３年）、Ｍａｎｍｏｈａｎ Ｓｉｎｇｈ著「ワクチン、アジュバント及び送達システム 第１版」（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２００７年）、Ａｒｖｉｎ Ａ．Ｍ．及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｈ．Ｂ．著、Ｖｉｏｌｏｇｙ、３４４:２４０-２４９、２００６年、Ｒ．Ｍｏｒｅｎｗｅｉｓｅｒ著、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｓｕｐｐｌ．１: Ｓ１０３−Ｓ１１０, ２００５年のような文献に詳細に記載され公知である。ＰＡＭＡＭデンドリマーと同様にワクチンの構築と使用は、例えば、Ａｒａｓｈｋｉａら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ４０ （１）:４４−５２, ２０１０年； Ｖｅｌｄｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６:５３６６-５３７３, ２００１年； 及び、Ｓ．Ｃｈａｕｈａｎ、Ｎ．Ｋ．Ｊａｉｎ、Ｐ．Ｖ．Ｄｉｗａｎ（２００９年）「マウスにおけるＰＡＭＡＭデンドリマーの前臨床及び行動毒プロフィール」（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ａ、数学、物理学、工学科学（オンライン出版日２００９年１２月３日）に記載されている。
【００７３】
核酸、ペプチド、ポリペプチドとのコンジュゲート体 デンドリマーの合成
デンドリマーは濃密なＤＮＡの骨格（ｓｃｈａｆｆｏｌｄ）として作用し、完全に陽荷電したデンドリマーは陰荷電性のＤＮＡ又はＲＮＡとの強い電気的相互作用の発生に対して好ましい。例えば、デンドリマー／Ｔヘルパーエピトープ／ＤＮＡ複合生成物は、調整可能なＮ／Ｐ比率（アミンに対するリン酸、又は、荷電比率）に依存する正味の荷電を有する。本明細書において、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞（ＰＡＰＣ）に特異的に結合するように、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド、及び、抗原、核酸又はｓｉＲＮＡがデンドリマーの外表面にコンジュゲートされていることを特徴とし、該Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）及び、抗原、抗原をエンコードする核酸又はｓｉＲＮＡをコンジュゲートするデンドリマーが記載される。一つの実施態様において、デンドリマーは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５個等）のＰＡＤＲＥペプチド、及び、ペプチド又はポリペプチド抗原にコンジュゲートされている。本実施態様において、デンドリマーは、典型的には、複数のペプチド又はポリペプチド抗原とコンジュゲート又は結合している。いくつかの抗原（例えば、複数の同一抗原）とのコンジュゲート又は結合は、抗原がハプテン関連の大きさの問題により効果的な免疫応答を誘導できない小さい抗原（特に、小ペプチド又は糖質）の場合に、特に有用である。本明細書に記載のデンドリマー／Ｔヘルパーエピトープ／核酸コンジュゲート体が抗原の多くの複製を含むことは、抗原の免疫原性を向上できる。もう一つの実施態様において、デンドリマーは、ＰＡＤＲＥペプチドとコンジュゲートし、抗原をエンコードする核酸と結合する。さらにもう一つの実施態様において、デンドリマーは、ＰＡＤＲＥペプチドとコンジュゲートし、関心遺伝子に対するｓｉＲＮＡを結合する。これらの実施態様において、いかなる有用な方法によってデンドリマーが調製され、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド及びインフルエンザＨＡのようなエピトープ）をコンジュゲート、及び、核酸（例えば、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡ）と結合できる。デンドリマーを製造し、使用する方法は、例えば、引用文献として両方が本明細書に取り込まれるＺｈａｎｇ Ｊ−Ｔら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００４、４、５７５-５７８、並びに、米国特許４２１６１７１号公報及び５７９５５８２号公報の文献に記載され周知である。Ｄ．Ａ．Ｔｏｍａｌｉａ、Ａ．Ｍ．Ｎａｙｌｏｒ，及び、Ｗ．Ａ．Ｇｏｄｄａｒｄ ＩＩＩ「星型デンドリマー：サイズ、形、表面科学、トポロジー、及び、柔軟性の原子から大分子までの分子レベルの調節」Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ２９ （１９９０年）、 １３８-１７５を参照のこと。本明細書記載の実験において、ＰＡＭＡＭ−デンドリマーが使用された。しかしながら、いかなる適正な陽荷電性高分枝ポリマーデンドリマーを使用できる。付加的な陽荷電性高分枝ポリマーデンドリマーは、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー又はより一般的に表面に１級アミノ基を有する他のいかなるデンドリマーを含む。
【００７４】
本明細書に記載されているＰＡＤＲＥ−デンドリマー （ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー）は、適正な方法によって調製される。例えば、米国特許５７３６１４２号公報を参照のこと。米国特許５７３６１４２号公報に記載されたＰＡＤＲＥペプチドを製造するために、Ｊａｄｅｔｚｋｙらが最初に記載した戦略（ＥＭＢＯ Ｊ ９：１７９７−１０８３、１９９０年）、即ち、１３置換基のポリアミンに挿入されるＭＨＣに結合するために重要な側鎖を含むアンカー置換基が使用された。ＰＡＤＲＥペプチドは、例えば、米国特許５７３６１４２号公報に記載された方法に従って調製可能、又は購入可能（例えば、Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｎｔ、ＣＡ）である。相対的に小さいサイズのため、ＰＡＤＲＥペプチドは溶液又は固体支持体上で従来法に従って合成可能である。種々の自動合成装置が商業的に利用可能であり、公知のプロトコールに従って使用可能である。それに代わって、組換えＤＮＡ技術が、Ｔヘルパーエピトープをエンコードする配列の発現ベクターへの挿入、変換、又は、適切な宿主細胞へのトランスフェクト、発現のための適性条件下での培養のために使用されても良い。これらの操作は、本明細書に引用文献として取り込まれるＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（上記）に記載され、公知技術である。本明細書に記載のように、ＰＡＤＲＥペプチドは、Ｎ−及びＣ−末端置換基への改変を含んでも良い。当業者によって良く理解されているように、Ｎ−及びＣ−末端は、例えば、結合、安定性、生物学的利用性、連結容易性のような物理的又は化学的性質を変更するために改変されても良い。本明細書に記載されるようにＰＡＤＲＥペプチドは、希望とする特性、例えば、非改変ペプチドの実質的な全生物活性を維持しつつ、改良された薬理学的特性を与えるために、いかなる数の方法で改変されても良い。
【００７５】
本明細書に記載の実験において、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体は、ＰＡＤＲＥペプチドの−ＣＯＯＨ末端とデンドリマーのアミノ基の一つとの単純なアミド結合によって製造された。ＰＡＤＲＥペプチド（Ａｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｈａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＯＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、Ａｃ＝アセチル基； Ｄ−Ａｌａ＝Ｄ−アラニン； Ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン； Ａｈｘ＝アミノヘキサン酸）は、Ａｎａｓｐｅｃ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）より、アミノ末端の保護と反応回避のためにアセチル誘導体を購入した。購入されたペプチドは９５％以上の純度であった。アミド結合反応はＤＭＦ溶液中で標準的な条件で行われた（図１、下段概要図参照）。大半のアミノ基を遊離状態に保ちデンドリマーの大きな陽荷電性生成のためにデンドリマー１個当たり２−３個のペプチドの結合を求め、各々のデンドリマー表面へ結合するＰＡＤＲＥエピトープの数を調節するために、反応では２：１のペプチド／デンドリマー比が使用された。典型的な実施態様において、本明細書で記載されている複数のＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体は、０、１、２、３個等が結合したＰＡＤＲＥ（又は他のペプチド）を含むデンドリマーが頒布されるであろう。相対的母集団は、ポワッソン分布に従うものと記載される。ＰＡＤＲＥ、ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）は、もっとも普及した１６の中の１５のＨＬＡ−ＤＲ分子（Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５９： １−１４（１９９８）； Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１： ７５１−７６１（１９９４））に対して高い又は中等の親和性（ＩＣ５０＜１０００ｎＭ）で結合する。しかしながら、大半のヒトでＭＨＣクラスＩＩに結合しＣＤ４ヘルパーＴ細胞を活性化可能な他のペプチドがデンドリマーを標識するために使用されても良い。ペプチドの例として、これに限定されないが、テタヌス毒素（ＩＴ）ペプチド８３０-８４３； Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９： ２２３７-２２４２（１９８９））に記載された普遍的エピトープ； 及び、大半のヒト、及び、多くのマウスのＭＨＣクラスＩＩと反応する下記ペプチドを含む。
【００７６】
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ａＫＹＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ａＫＦＶＡＡＹＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ａＫＸＶＡＡＹＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ａＫＹＶＡＡＹＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ａＫＦＶＡＡＨＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ａＫＸＶＡＡＨＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ａＫＹＶＡＡＨＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ａＫＦＶＡＡＮＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ａＫＸＶＡＡＮＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ａＫＹＶＡＡＮＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＡＫＹＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＡＫＦＶＡＡＹＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＡＫＸＶＡＡＹＴＬＫＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＡＫＹＶＡＡＹＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＡＫＦＶＡＡＨＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＡＫＸＶＡＡＨＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＡＫＹＶＡＡＨＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＡＫＦＶＡＡＮＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ＡＫＸＶＡＡＮＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、及びＡＫＹＶＡＡＮＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ａ＝Ｄ−アラニン、＝シクロヘキシルアラニン）。他の使用可能なエピトープのもう一つの例は、マウスＢａｌｂ／ｃ ＭＨＣクラスＩＩ ＩａＤに結合するＨＡペプチド配列ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）（プロウイルスＰＲ８ウイルスＨＡ由来）である。
【００７７】
製造物を少なくとも２４時間純水に対して透析することにより精製し、真空下乾燥した。集めた製造物は、透明な油状であり、１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴分析法）、ＵＶ−Ｖｉｓ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で、その特性を分析した。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体のＮＭＲスペクトルは、デントリマープロトンに一致する大きなピークと、ペプチドプロトンについての小さなピークの集合を示した。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトルは、デンドリマー単独で観察されるピークよりも約３０００ ｍ／ｚ高いピークを示した。その超過分の質量は、約２個のペプチドエピトープに一致する。コンジュゲート体のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、トリプトファンの吸収波長領域に明確な吸収を示す。
【００７８】
ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体とのプラスミドＤＮＡの複合化は、生理的ｐＨのＰＢＳ緩衝水溶液中で、２つの成分を混合することにより行われた。Ｎ／Ｐ（アミン対リン酸）比の典型的な値は、１０：１である。ＤＮＡの完全な複合化を分析するためにゲル電気泳動法が使用される。生理的ｐＨ値においてアミノ基（−ＮＨ２）は水素化され、デントリマーの高い陽荷電性を与え、陰荷電性のＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への送達に特に適している。水溶液において、陽荷電性のデンドリマーと陰荷電性の核酸は、比較的容易に細胞膜を透過及び通過可能な凝縮物又はナノ粒子を生じさせる。
【００７９】
ＰＡＤＲＥ以外のＴヘルパーエピトープとコンジュゲートするデンドリマーは、上記のＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマーと同様の方法で典型的に調製される。例えば、ペプチドの酸末端は、活性化試薬としてのカルボジイミドを使用するアミド化の一つによって、公知の合成方法によってデンドリマー表面上のアミノ基と共有結合することができる。もう一つの例として、アミン終末デンドリマーへのこれらペプチドの結合は、２つの合成経路によって実施できる。ペプチドエピトープのアミノ末端はアセチル化によって保護される。第一の経路は、標準的なアミド化化学による結合達成のために、システイン基のカルボン酸を使用する。第二の経路は、システインのチオール基（もしペプチドに存在する場合、それ以外は付加されても良い）の利点によって、マレイミドの前処理によりデンドリマー表面に結合するアルケン基と結合する。両経路は、エピトープ結合デンドリマーの機能化を与える。数個（ｓｅｖｅｒａｌ）までのペプチドエピトープ（例えば、２、３、４、５、６個等）／デンドリマーは、ＤＮＡ送達剤としての標的性を高め、ワクチン化の目的に対しての特性を改善するだろう。しかしながら、生理的ｐＨ値での水素化によるデンドリマーの大きな陽荷電性の獲得のために多くの未反応アミノ置換基の放置は重要である。本明細書に記載のように、デンドリマーは、いかなるＴヘルパーエピトープともコンジュゲート可能である。付加的なＴヘルパーエピトープの一つの例は、インフルエンザＨＡである。
【００８０】
一般的に、ジェネレーション−５（Ｇ５）のデンドリマーが、本明細書における組成物、キット及び方法に使用される。しかしながら、他のデンドリマー（表１参照）が使用可能である。
【表１】
【００８１】
荷電されたポリマー担体ワクチン及び組成物
本明細書に記載のワクチンは、少なくとも１つのＭＨＣ標的及び免疫原性ペプチドと、及び、少なくとも１つの核酸か又は少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原が、荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）の外部表面にコンジュゲートされ、前記ＭＨＣ標的及び前記免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）が特異的にＰＡＰＣに結合するように、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド及びインフルエンザＨＡのようなエピトープ）のようなＭＨＣ標的で免疫原性のペプチド、及び、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原か、又は少なくとも１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸かを、コンジュゲート又は結合したデンドリマーのような、少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体を含む。前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのデンドリマーと及び少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原か又は前記少なくとも１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸の組み合わせは、ヘルパーＴ細胞の活性化を仲介するＭＨＣクラスＩＩの誘導を含む、少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導することができる。さらに、ワクチンは油中水型乳剤を含む場合がある。ワクチンを前記哺乳類に投与することは、抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらす。デンドリマー上か又はデンドリマー内に示された本明細書に記載されている抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）又は抗原類（ａｎｔｉｇｅｎｓ）は、さまざまな病原体の状態によって惹起された疾患に対する免疫応答を誘導する。１つの実施態様では、前記抗原は病原性細菌、真菌、又はウイルス性生物、レンサ球菌種、カンジダ種、ブルセラ種、サルモネラ種、シゲラ種、シュードモナス種、ボルデテラ種、クロストリジウム種、ノーウォークウイルス、炭疽菌、結核菌、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、クラミジア種、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス種、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、肝炎ウイルス、マラリア原虫種、トリコモナス種、性感染症病原体、ウイルス性脳炎病原体、原虫疾患病原体、真菌疾患病原体、細菌疾患病原体、がん細胞、又はこれらの混合物に由来する場合があるがこれらに限られない。
【００８２】
前記少なくとも１つのデンドリマーはさらにポリイノシンポリシチジン酸（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））へコンジュゲートされることができ、前記ワクチン又は組成物はさらに薬学的に許容可能な担体を含むことができる。１つの実施態様では、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を各々有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープのように、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープがＰａｎ−ＤＲエピトープである。もう１つの実施態様では、前記ＴヘルパーエピトープはインフルエンザＨＡである。前記Ｔヘルパーエピトープは、しかし、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の活性化をする又はＴヘルパー細胞の活性化に寄与するいずれかのエピトープであることができる。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のＴヘルパーエピトープ活性化はＣＤ８Ｔ細胞の増殖及び刺激と、Ｂ細胞による抗体産生とが必要とされ、その両方が感染性病原体又はがんに対する防御免疫応答の誘導に必要不可欠である。前記デンドリマーが抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされるある実施態様では、前記核酸は一般的に発現ベクターである。前記発現ベクターは、前記抗原をエンコードする遺伝子と、クローニング部位と、ポリアデニル化配列と、選択可能なマーカーと及び細菌の複製開始点とに操作可能に連結された真核細胞プロモーターを含むのが典型的である。一般的に、前記抗原は、がん抗原か又は感染性病原体からの抗原かが典型的である。前記少なくとも１つのデンドリマーは一般的にＧ５デンドリマーである。同様に、前記デンドリマーがペプチド又はポリペプチド抗原にコンジュゲートされる実施態様では、前記抗原は、一般的にがん抗原か又は感染性病原体からの抗原かであり、前記少なくとも１つのデンドリマーはＧ５デンドリマーである。いくつかの実施態様では、アジュバントが前記ワクチン又は組成物に取り込まれる場合がある。
【００８３】
デンドリマーはＤＮＡ（及びＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＲＮＡｉ等を含むその他の核酸）を細胞内へ送るのに有効な担体である。しかし、ワクチン送達プラットフォームとして、デンドリマーは従来複数の理由のため欠陥があった。最初に、デンドリマーはアジュバント活性を欠如している；これらは自然免疫の有効な刺激を欠如しており、これらは「危険信号」を生成しない。また、デンドリマーは弱いＡＰＣの標的しか提供せず、一般的に、これらは弱い獲得免疫の刺激しか提供しない。特に低い免疫原性又は「自己」抗原若しくは免疫系が寛容を獲得した「自己」抗原と高い相同性を有する抗原を扱う際に、ＰＡＰＣを特異的に標的にし、「危険信号」を誘導し、注入部位にプロフェッショナル単核球を動員し、かつ、安全な強いアジュバント入りワクチン送達システムが非常に所望される。弱い抗原又は低い免疫原性を有するそれらは、無及び低レベルの特異的な免疫応答か、抗体応答か、又は細胞に仲介される免疫応答かをもたらす。本明細書に記載される前記ワクチンプラットフォームは、ＤＮＡ又はペプチド又はポリペプチド抗原と複合体化された（コンジュゲートされた）生分解性ナノ粒子である。前記プラットフォームは、そのＭＨＣクラスＩＩリガンドを介してＰＡＰＣを標的にし、結合し、及び高陽荷電性外膜により前記細胞膜を透過し、大量産生のためのスケールアップが安全かつ容易であり、及び分子上の修飾性により強力なアジュバントとして作用する。典型的な実施態様では、前記少なくとも１つのデンドリマーは、多分枝ポリマー高分子であり、その増強された可溶性のため理想的な添加剤であるＧ５ ＰＡＭＡＭデンドリマーである。Ｇ５は、特に、細胞内への前記ＤＮＡの送達に理想的である。本明細書に記載される典型的なワクチンは、前記注入部位への単核球の動員をもたらす一過性危険信号を誘導する油中水型乳剤を含む。ＤＮＡを取り上げ、これらの細胞は、所属リンパ節に移動し、抗原を提示するであろう。前記ＭＨＣクラスＩＩ分子の側面（ｆｌａｎｋ）に結合する、例えば、ＰＡＤＲＥのような普遍的なＴヘルパーアゴニストの包含は、ＰＡＰＣへのデンドリマー複合体とヘルパーＴ細胞のオプソニン化をもたらす。この変化は不活性及び弱いデンドリマーを前記発現した関心抗原の強い免疫エンハンサーに変える。またアジュバント活性と持効性効果の両方を有する疎水性担体、すなわち、油性乳剤（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０）を含むことは、抗原の遅延性放出をもたらす。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むことは、さらに関心抗原に対する免疫応答の誘導を増大する。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は正味の陰荷電を有するため、それは都合よくデンドリマーに結合し、免疫応答の強さを増大するアジュバントである。これらの特徴は強い「危険信号」として作用し、注入部位へさらに単核球（ＡＰＣを含む）を動員する。併せて、これらの特徴は自然免疫を刺激し、有効な免疫応答の誘導のために必要とされる炎症誘発性サイトカイン環境の増大された発現をもたらす。
【００８４】
ワクチンの１つの実施態様では、前記ＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥエピトープであり、及び前記デンドリマーはＰＡＤＲＥで誘導体化されている。ＰＡＤＲＥは前記ＭＨＣクラスＩＩの大部分と結合する人工的に設計されたペプチドであり、そして、デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥで誘導体化されたデンドリマー）とコンジュゲートされたＰＡＤＲＥペプチドは、結果として生じる複合体又は高レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現するＰＡＰＣのためのリガンドのコンジュゲート体を作製する。この複合体は、従って、ＭＨＣクラスＩＩ又はＰＡＰＣを発現する細胞に高い親和性を有する普遍的に標的付けられたワクチン送達システムになる。ＰＡＤＲＥもまたＴヘルパー細胞を活性化し、炎症誘発性サイトカインの環境をもたらし、そして、前記注入部位へその他の免疫細胞を動員する。デンドリマー、ＰＡＤＲＥを組み合わせることで、さらに「危険信号」を誘導することによる前記抗原の取り込みが増大する。ＰＡＤＲＥで誘導体化されたデンドリマーは現在既知のワクチンに対し複数の利点を提供する。最初に、Ｇ５デンドリマーは、結合し細胞膜非常に効果的に入り、前記タンパク質の強い発現をもたらす高荷電生分解性分子である。第二に、ＰＡＤＲＥは、多くのマウス及びヒトＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する普遍的なＴヘルパーエピトープである。それは合成の非天然Ｔヘルパーエピトープ［ＡＫｃｈｘＡＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：２６）（ｃｈｘＡ＝シクロヘキシルアラニン）］である。前記デンドリマーの表面に融合する際に、ＰＡＤＲＥは主に全てのＰＡＰＣを含むＭＨＣクラスＩＩを有する細胞を結合し、活性化するであろう。複数のＰＡＤＲＥエピトープ（例えば、２、３、４、５個等）が各デンドリマーに不着することができる。前記付着は、その免疫原性性質が生じる前記ペプチド結合する性質を維持する適切なスペーサーとともになされる。リンカー又はスペーサー分子は、本明細書に記載される前記デンドリマーコンジュゲート体と抗原又はその他の分子をコンジュゲートするのに用いられる場合がある。スペーサーは、ＡＡＡ、ＫＫ、ＧＳ、ＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：２７）、ＲＳ、又はＡＡＹを含むアミノ酸の組み合わせのいずれかの場合がある。本明細書で用いられるところの、「リンカー」又は「スペーサー」という用語は前記デンドリマーと例えば前記ＭＨＣクラスＩＩリガンドか、ＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープか、ポリペプチドか、又は前記デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）及び前記表面に曝露された分子にコンジュゲートされるか又は結合されるかの治療剤のような前記表面に曝露された分子との間に挿入する化学官能基を意味する。好ましくは、リンカーが１つの末端で前記表面分子に、及びそれらのその他の末端で前記ナノ粒子（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）にコンジュゲートされる。連結は同種又は異種２官能基剤、すなわち、ＳＰＤＰ、ＤＳＳ、ＳＩＡＢのいずれかに、行われる場合がある。連結方法はｄｅ Ｊｏｎｇｈらの国際出願ＤＫ００／００５３１（ＷＯ０１／２２９９５）号公報で開示されており、各内容は引用により全体として本明細書に取り込まれる。
【００８５】
第三に、前記ワクチンもまた油中水型乳剤を含む実施態様において、前記油中水型乳剤は前記注入部位への前記単核球の動員をもたらす一過性の「危険信号」を誘導する。ＤＮＡを拾うこれらの細胞は、領域リンパ節に移動し、抗原を提示するであろう。さらに、免疫応答誘導をさらに増大するために、合成２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は前記デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）に結合する場合がある。ＰｏＩｙ（Ｉ：Ｃ）は、正味の陰荷電を有し、従って、デンドリマーへ都合よく結合され得るトル様受容体３（ＴＬＲ−３）作動薬である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、アジュバントであり、その正味の陰荷電により、前記デンドリマーへ結合し、前記免疫応答の強さを増大するであろう。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のデンドリマーへの結合は、それが前記注入の頻度と及び注入間のインターバルを減らすため、前記モノクローナル抗体の産生（以下に記載される）において、特に有用である。
【００８６】
本明細書に記載されている抗原をエンコードする核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡか、ｍｉｃｒｏＲＮＡか、ｓｉＲＮＡか、ｓｈＲＮＡか又は合成化学的に改変されたＲＮＡ）の形態か又はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡと、ゲノムＤＮＡと、及び合成ＤＮＡ）の形態である場合がある。前記ＤＮＡは２本鎖か又は１本鎖かである場合があり、１本鎖の場合、コード（センス）鎖か又は非コード（アンチセンス）鎖である場合がある。１つの実施態様では、核酸は、不死化されたか、又は原発腫瘍の細胞株から、単離又は増幅されたＲＮＡ分子であることができる。
【００８７】
上記に記載されているように、１つの実施態様では、免疫応答の誘導のためのワクチンは、前記結果として生じる複合体が前記抗原に対する免疫応答を誘導するコンジュゲートされた少なくとも１つのＴヘルパーエピトープ、及び、抗原をエンコードする核酸を有する少なくとも１つのデンドリマーを含む。これらの組成物及び方法は、例えば、ウイルスベクターか又はイン・ビボ電気穿孔法の使用を必要とするその他の遺伝子免疫法と比較して、非常に安全で、簡単で、速い。液性又は細胞免疫応答の誘導のための前記ＤＮＡの使用は、複数の利点を有する。最初に、ＤＮＡの使用は、天然にプロセシングされたエピトープの完全なスペクトルを提供する。また、Ｔヘルパーエピトープ及び抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされたデンドリマーは、全ヒトＭＨＣ（ＡＫＡ、ＨＬＡ）の９５％を超えるＡＰＣを標的とする普遍的なワクチンの送達を提供し、精製が課題のタンパク質の精製の必要性を除去する。かかるタンパク質は、多タンパク質複合体の一部であることができ、膜タンパク質であることが可能であり、不正確に折りたたまれており、不溶性であることができる。本明細書に記載されている、前記デンドリマーコンジュゲート体は、タンパク質のグリコシル化又は翻訳後修飾を必要とせず、それらはタンパク質構造又は折りたたみの干渉にタグ付けし、劇的なコスト及び時間の節約を提供する。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーが、マウス、ヒヒ及びヒトからのＰＢＭＣへ核酸を標的づけし送達するという事実は、このプラットフォームをマウスから非ヒト霊長類、及びヒトへの急速なトランスレーショナルリサーチの理想的な候補にする。
【００８８】
また上記に記載されたように、もう１つの実施態様では、免疫応答の誘導のためのワクチンは、油中水型乳剤及び、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと及び前記ペプチド若しくはポリペプチド抗原とが前記デンドリマーの外部表面にコンジュゲートされ、前記ペプチド若しくはポリペプチド抗原に対する免疫原性を誘導することができる少なくとも１つのＴヘルパーペプチド（例えば、前記ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）及びペプチド若しくはポリペプチド抗原にそれとコンジュゲートされた少なくとも１つのデンドリマーを含む。弱い抗原性を有するペプチド又はポリペプチドが、本明細書に記載されているＴヘルパーエピトープ／デンドリマー複合体にコンジュゲートされた（複合体化された）ときに、強い免疫応答を誘導する。正味の陰荷電を有するポリペプチド及びペプチドは、例えば、共有結合によるコンジュゲートの必要なくＰＡＤＲＥ−デンドリマーと複合化する場合がある。例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのような油中水型乳剤は、さらにアジュバント活性及び持効性の効果をもたらす。
【００８９】
上述のように、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、予防上及び治療上の用途の両方を有する； これらは、被験体における疾患又は症状の発症を防ぐための予防として用いられこともでき、疾患又は症状を有する被験体を治療するために用いられる場合もある。本明細書に記載のワクチンは、感染性病原体又はがんのいずれかに対する免疫応答を備え付けるために用いられることもできる。感染性病原体の例は、例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、デングウイルス、ロタウイルス、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＺＶ、及びＥＢＶのようなウイルスを含み、熱帯マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫及びサルマラリア原虫といったマラリア原因病原体を含む病原性病原体；大形リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、エチオピアリーシュマニア、メキシコリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、幼児リーシュマニアシノニムシャーガスリーシュマニア（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍｓｙｎ．Ｌ．ｃｈａｇａｓ）といったリーシュマニア原因病原体を含む病原性病原体；炭疽菌、百日咳菌、肺炎球菌、及び髄膜炎菌含む病原性細菌などを含むがこれらに限られない。本明細書に記載されている実験において、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、マウスにおける確立したメラノーマ腫瘍を根絶させた。しかし、本明細書に記載されているＴヘルパーエピトープ及び抗原又は抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされた前記デンドリマーは、いかなるがんに対する特定の免疫応答を備え付けるために用いられる場合がある。追加のがんの例は、ＨＰＶ誘導子宮頸がん（例えば、抗原（ＴＡＡ）に関連したＥ７／Ｅ７腫瘍又はこれらの抗原をエンコードするプラスミドが、本明細書に記載されている前記Ｔヘルパーエピトープ／デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ−デンドリマー）と複合体化することができる）、ヒトメラノーマ（例えば、ＴＲＰ−Ｉ、ＴＲＰ−２、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ−Ｉ、ＭＡＧＥ−３及び／又はｐ５３は、ＴＡＡとして用いられ、本明細書に記載されている前記Ｔヘルパーエピトープ／デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ−デンドリマー）と複合体化できる）、及び前立腺がん（例えば、ＴＳＡは、ＴＡＡとして用いられ、本明細書に記載される前記Ｔヘルパーエピトープ／デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ−デンドリマー）と複合体化される場合がある）を含む。同様に、肺腫瘍、乳房腫瘍、及び白血病について、いずれか適切なＴＡＡが用いることが可能であり、多くが記載されている。かかるＴＡＡの多くは、さまざまながん（例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０）の間で共通である。かかる抗原をエンコードするＴＡＡ又はプラスミドの混合物は、本明細書に記載されている普遍的な、多重使用がんワクチンを作製するために用いられる場合がある。本明細書に記載されている１つのワクチンの例において、ＣＤ４エピトープ／デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）は、１種類より多い抗原又は１種類より多い前記抗原をエンコードするプラスミドと複合体化される場合がある。代替的に、１つの抗原か又は１つの抗原をエンコードする１つのプラスミドと各々複合体化された複数のワクチンは、さまざまな病原体又はさまざまながんの１つのワクチンとして混合され用いられる場合がある。
【００９０】
哺乳類への抗原送達方法及び免疫応答誘導
哺乳類（例えば、ヒト）へ抗原を送達する方法と、及び前記哺乳類における免疫応答の誘導のための前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生を誘導する方法とが本明細書に記載されている。典型的な方法は、少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチドかつ免疫原性のペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）がＰＡＰＣに特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び前記少なくとも１つの核酸、又は少なくとも１つのペプチド抗原若しくはポリペプチド抗原が、前記少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）の前記外部表面へコンジュゲートされることを特徴とし、ＭＨＣ標的ペプチド及び免疫原性ペプチド（例えば、ＴヘルパーペプチドＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡ等）及び少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原又は前記少なくとも１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸をコンジュゲートした少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）を含む組成物の前記哺乳類への投与のステップを含み、前記少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチド及び免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）、少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えばデンドリマー）、及び前記少なくとも１つの核酸又は少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原の組み合わせが、前記抗原に対する免疫応答を誘導することができる。前記方法において、前記組成物は、ＭＨＣクラスＩＩを介するヘルパーＴ細胞の活性化を誘導するために有効な量で投与され、モノクローナル抗体の産生、及び前記哺乳類の前記抗原に対する免疫応答をもたらす。組成物は、さらに油中水型乳剤を含む場合がある。前記少なくとも１つのデンドリマーは、さらに、典型的には、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）にコンジュゲートされ、前記組成物はさらに典型的に薬学的に許容可能な担体を含む。前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープは、例えば、前記配列番号：１のアミノ酸配列を各々有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープのような、Ｐａｎ−ＤＲエピトープが可能である。代替的に、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープは、例えば、インフルエンザＨＡのような、Ｐａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥエピトープ）以外が可能である。一般的に、前記少なくとも１つのデンドリマーは、Ｇ５デンドリマーである。
【００９１】
１つの実施態様では、前記哺乳類はがん抗原を有し、前記抗原はがんであり、抗原及び前記組成物は前記がんに対するワクチンである。もう１つの実施態様では、前記哺乳類は感染性疾患を有し、前記抗原は感染性病原体からの抗原であり、前記組成物は、前記感染性病原体に対するワクチンである。かかる実施態様において、前記組成物の投与は、一般的に、前記哺乳類において局所的な副作用をもたらさない。前記組成物（例えば、ワクチン）を前記哺乳類の外側で処方することと、及び、例えば、前記哺乳類におけるがん抗原又は感染性病原体からの抗原のような抗原に対する免疫応答を刺激するために十分な量で、前記哺乳類に前記組成物を投与することとによって、かかる方法は一般的に行われる。本明細書に記載されている前記組成物、ワクチン及び方法は、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等）のような動物の適切ないかなる被験体に利用することができる。がん又は感染性疾患に苦しんでいるか、又はがん又は感染性疾患の発症の危険にさらされているヒトの患者が典型的な被験体である。
【００９２】
ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するための組成物及び方法
またｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するための組成物及び方法が本明細書に記載されている。典型的な実施態様において、ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するため組成物は、少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチドと、免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーペプチド）と、及びｓｉＲＮＡがコンジュゲートされた少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）を含む。前記少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチドと、及び免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）と、及び前記ｓｉＲＮＡとは、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープがＰＡＰＣへ特異的に結合するように、前記少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）の前記外部表面にコンジュゲートされる。前記ｓｉＲＮＡは、関心遺伝子のいずれか（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＤ−２８、ＣＴＬＡ−４）に（特異的に）向けることができる。前記組成物は、さらに油中水型乳剤を含むことが可能である。
【００９３】
ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達する典型的な方法は、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがＰＡＰＣに特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、及び前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが、前記デンドリマーの前記外部表面にコンジュゲートされることを特徴とする、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド、及び少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートした少なくとも１つのデンドリマーを含む組成物を提供し； 前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートした少なくとも１つのデンドリマーがＰＡＰＣに結合し、前記ｓｉＲＮＡが前記ＰＡＰＣに入り前記ＰＡＰＣ内で発現する条件で、哺乳類被験体へ前記組成物を投与するステップを含む。前記組成物は、さらに油中水型乳剤を含むことができる。前記方法において、前記ｓｉＲＮＡは、前記関心遺伝子の発現を抑制するために、いかなる（特異的な）関心遺伝子（例えば、ＦｏｘＰ３）に対して向かわせることができる。１つの例において、ＦｏｘＰ３に対して向けられたｓｉＲＮＡは、免疫応答を抑制し、免疫応答の負の制御として作用する細胞である、制御性Ｔ細胞の誘導をもたらす分子である、ＦｏｘＰ３の発現を抑制するために用いられる。この実施態様は、制御性Ｔ細胞が免疫療法及び介入を抑制している場合に、がん治療のための特定の使用を見出すことができる。制御性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩを発現し、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はその他のＣＤ４エピトープ−デンドリマーを介して標的化することができる。その他の例は、Ｔ細胞上の、Ｔ細胞へ抑制性シグナルを伝達するＣＴＬＡ−４である。ＣＴＬＡ−４に特異的なｓｉＲＮＡがＰＡＤＲＥ−デンドリマーと複合体化するようなある実施態様では、前記複合体は、ＣＤ４Ｔ細胞を含むＭＨＣクラスＩＩ発現細胞を標的化し、前記ＣＴＬＡ−４発現を抑制する。前記ＣＴＬＡ−４の発現が低いほど、前記病原体又はがんに対する免疫応答が高くなり、ＰＡＰＣの中へ送達された際は、（病原体、がんに対する免疫応答を増大するために、又は、宿主がワクチン接種される場合に）免疫応答を抑制するか，又は、例えば乾癬のような自己免疫疾患の治療のためのＢ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−Ｉ（Ｔ細胞活性化に必要なシグナル２誘導因子）を含む免疫応答を増大する分子の発現を防止又は低下する。
【００９４】
典型的な実施態様において、本明細書に記載される組成物は、共抑制及び共刺激分子及びそれらの仮想共刺激受容体（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２８ＣＴＬＡ−４）に特異的なｓｉＲＮＡを含む。配列−特異的ｓｉＲＮＡは、標的核酸分子に結合し、その発現を抑制する。ｓｉＲＮＡは、異常細胞、異常細胞増殖、及び感染性疾患病原体により惹起される腫瘍を含む腫瘍の治療に有効である。ｓｉＲＮＡの送達のための組成物及びその治療方法が提供される。
【００９５】
リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス分子を構築し使用する方法は、当業者に知られている（例えば、Ｉｓａｋａ Ｙ．、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ｖｏｌ．９： １３２−１３６，２００７；Ｓｉｏｕｄ Ｍ．ａｎｄ Ｉｖｅｒｓｅｎ Ｐ．Ｏ．、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ｖｏｌ．６：６４７−６５３，２００５；Ｍｏｕｌｄｙ Ｓｉｏｕｄ著、Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２ｎｄ ｅｄ．、２００４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。「アンチセンス」核酸は、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的、又はｍＲＮＡ配列と相補的であるように、タンパク質をエンコードする「センス」核酸と相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。前記アンチセンス核酸は、関心遺伝子の全てのコード鎖か、又はその一部のみと相補的であることができる。もう１つの実施態様では、前記アンチセンス核酸分子は、関心遺伝子をエンコードするヌクレオチド配列（例えば、５’及び３’非翻訳領域）のコード鎖の「非コード領域」をアンチセンスする。アンチセンス剤は、例えば、約８ないし約８０の核酸塩基（すなわち約８ないし約８０のヌクレオチド）、例えば、約８ないし約５０の核酸塩基、又は約１２ないし約３０の核酸塩基を含むことができる。アンチセンス化合物は、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を調節するリボザイム、外部誘導配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及びその他の短い触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物は、前記標的遺伝子（すなわち、関心遺伝子）における配列と相補的である少なくとも８個の連続した核酸塩基の伸長を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイゼーション可能であるその標的核酸配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、前記標的への前記オリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常機能を阻害し利用性喪失をもたらし、そして、例えば、イン・ビボアッセイか、又は治療的処置の場合における生理的条件と、アッセイが行われる場合の条件下でのイン・ビトロアッセイのような、特異的結合が所望される条件で、標的でない配列に対する前記オリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な相補性の程度の場合に、特異的にハイブリダイゼーション可能である。
【００９６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、また、低分子干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡとして本明細書に言及され、又は２本鎖低分子干渉性ＲＮＡはｄｓ ｓｉＲＮＡとして本明細書に言及される）が動物および植物細胞において相同的なｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導する非常に有効なプロセスである（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１２：２２５−２３２（２００２）；Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：４８５−４９０（２００１））。哺乳動物細胞において、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の二重鎖（Ｃｈｉｕｅｔａｌ、ＭｏＩ．細胞、１０：５４９−５６１（２００２）； Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１））、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有するＤＮＡの鋳型を用いてイン・ビボで発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、機能的小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、若しくはその他のｄｓＲＮＡ（Ｚｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、９：１３２７−１３３３（２００２）； Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６：９４８−９５８（２００２）； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：５００−５０５（２００２）；Ｐａｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：５０５−５０８（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：４４０−４４８（２００２）；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（９）：６０４７−６０５２（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓら，ＲＮＡ、８：８４２−８５０（２００２）；Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（６）：５５１５−５５２０（２００２））によって引き起こすことができる。
【００９７】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、各鎖に例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドなど約１６乃至３０の長さを典型的に含み、前記鎖の１つがｍＲＮＡにおける標的領域に対して実質的に同一、例えば少なくとも８０％（またはそれを超える、例えば８５％、９０％、９５％、または１００％）同一であって、例えば３、２、１または０のミスマッチヌクレオチドを有し、もう片方の鎖は第１の鎖と同一又は実質的に同一である。各鎖もまた、例えば、ｄＴｄＴｄＴのような１、２、３、４個、又はそれ以上のオーバーハングヌクレオチド１個又は２個以上のオーバーハング（すなわち、非相補的）ヌクレオチドを有する場合がある。
【００９８】
前記ｄｓＲＮＡ分子は化学的に合成でき、又はＤＮＡの鋳型からイン・ビトロで転写でき、又は例えば、ｓｈＲＮＡからイン・ビボで転写できる。前記ｄｓＲＮＡ分子は、当業者に知られている方法のいずれかを用いて設計できる；多数のアルゴリズムが当業者に知られており、例えば、Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３ （２４）：３１９１−７（１９９９）を参照のこと、及び多くはインターネット上で利用可能である。
【００９９】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、典型的には、選択されたｓｉＲＮＡと同一ヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムに意味のある相補配列を有さない。かかる陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることにより設計することができる；相同性検索は、前記陰性対照が、適切なゲノムにおいて、他の遺伝子のいずれに対しても相同性を欠失していることを確認するために行うことができる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡは、配列に１個又は２個以上の塩基ミスマッチを導入することによって設計することができる。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼへの耐性を前記ｓｉＲＮＡに作るために、修飾ヌクレオチド（例えば、２Ｆ−ＲＮＡ）を用いて生成できる。
【０１００】
抗体作製のための方法及びキット
治療又は予防を目的として被験体へ投与することができる抗体を作製するための組成物と、キットと、及び方法とが、本明細書に記載される。細胞内へのＤＮＡ送達の現在の方法は非効率的であり、複雑であり、及び免疫応答をほとんど誘導しない。しかしながら、本明細書に記載される前記組成物及び方法は、関心抗原の急速及び高い発現を示す強い抗体応答をもたらす。本明細書に記載されるデンドリマー／Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート体（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）は、抗体を作製する方法において、ペプチド又はポリペプチド又は核酸（例えば、ＤＮＡ）と複合体化（コンジュゲート体化）可能である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のデンドリマーへの結合は、頻度及び注入インターバルを減らすため、前記モノクローナル抗体の産生に特に有用である。以下に記載される実験において、ＤＮＡとの複合体化ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの単回注入後、強い液性応答と同様に角膜及び皮膚へのＧＦＰの送達及び発現が示された。現在の薬剤の５０％は精製が最も難しい膜タンパク質標的を標的にしている。本明細書に記載される組成物、キット、及び方法は、それらを精製することなく、かかる難精製タンパク質を標的にするための手段を提供する。
【０１０１】
ポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清に含まれる不均一な抗体分子の集団である。本明細書に記載される組成物、キット、及び方法を用いて生成することができる抗体は、従って、ポリクローナル抗体、さらに、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ発現ライブラリを用いて生成された分子を含む。特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるデンドリマー／Ｔヘルパーエピトープコンジュゲート体及び標準ハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５，１９７５； Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１、１９７６； Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２、１９７６； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１； Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと）。特に、例えばＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５、及び米国特許４３７６１１０号公報； ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２、１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６、１９８３），及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６、１９８３）などで記載される培養継続細胞株による抗体分子産生を提供する技術のいずれかによって、モノクローナル抗体を得ることができる。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれか、及びそのサブクラスのいずれかを含む免疫グロブリンクラスである。本明細書に記載されるｍＡｂを産生するハイブリドーマは、イン・ビトロ又はイン・ビボで培養される場合がある。イン・ビボでのｍＡｂの高タイター生成能力に対して、本明細書に記載されている組成物、キット、及び方法は、ｍＡｂ産生で特に有用である。
【０１０２】
抗原又はタンパク質をエンコードする核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡ）は、ｉ）単調で及び／又は高価な及び／又は適時のタンパク質精製ステップの除去、ｉｉ）従来のタンパク質精製から生じるタンパク質非天然型の感作を打ち消す宿主の細胞機構によるイン・ビボでのタンパク質の天然型の発現、及びｉｉ）タンパク質又は抗原の自然／天然型を標的とする治療用モノクローナル抗体作製のための理想的な方法、の利点を提供するため、デンドリマー／Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）が、タンパク質又は抗原をエンコードする核酸と複合化（コンジュゲート化、又は結合）する本明細書記載の組成物、キット、及び方法は、タンパク質又は抗原の精製の必要性を否定する。
【０１０３】
特定の抗原に対するヒト抗体は、例えばマウスのような動物においてヒト抗体を産生するための公知の技術の適用によって作製できる。例えば、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ、Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４ （１９９６）：８４５−８５１； Ｈｅｉｊｎｅｎ、Ｉ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９７（１９９６）：３３１−３３８； Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８５６−８５９； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８１２−８１３； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１９９６）：８２６； 及び米国特許第５５４５８０６； ５５６９８２５； ５８７７３９７； ５９３９５９８； ６０７５１８１； ６０９１００１； ６１１４５９８； 及び６１３０３１４号公報を参照のこと。例えば米国特許第５５３０１０１、５５８５０８９、５６９３７６１、及び５６９３７６２号公報に記載されているように、特定の抗原に対するヒト型又はヒト化抗体は、公知の方法の適用により非ヒト抗体から作製可能である。
【０１０４】
一度生成されると、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらによって上記に記載されているように標準的な方法又はその他の適切な方法によるウエスタンブロット、免疫沈降分析によって特定の抗原認識についてテスト可能である。抗血清は、一連の注入により産生可能であり、少なくとも３回の追加免疫注入を含む一連の注入が好ましい。
【０１０５】
特定のエピトープを認識し、及び特定のエピトープと結合する抗体断片が、公知技術により生成可能である。例えば、かかる断片は、前記抗体分子のペプシン消化により生成可能なＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元により生成可能なＦａｂ断片を含むがこれらに限られない。代替的に、急速な及び容易な所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の同定を可能にするための、Ｆａｂ発現ライブラリが構築可能である（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５、１９８９）。
【０１０６】
哺乳類へ抗原を送達し、哺乳類で抗体取得を目的とする抗原に対するモノクローナル抗体産生を誘導する典型的な方法は、少なくとも一つのＴヘルパーペプチドが特異的にＰＡＰＣに結合し、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド、少なくとも一つのデンドリマー、及び、核酸又はペプチド若しくはポリペプチド抗原が抗原に対する免疫応答を誘導可能であるように、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド及び核酸又はペプチド若しくはポリペプチド抗原が少なくとも一つのデンドリマーの外部表面にコンジュゲート化されることを特徴とし、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド及びペプチド若しくはポリペプヂド抗原又は抗原をエンコードする核酸をコンジュゲートした少なくとも一つのデンドリマーを含む組成物の投与を含む。本方法において、前記組成物は、ＭＨＣクラスＩＩを介するヘルパーＴ細胞活性化の誘導に有効な量で投与され、前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらす。マウスにおける抗体産生の方法において、上記に記載されているように、前記マウスは、抗原で免疫後、１匹又は２匹以上のマウスから抗体が採取され、高タイターについてスクリーニングされる。高タイターのマウスが選択され、このマウスから脾臓が摘出される。そして骨髄腫との融合が行われ、最もよく結合するクローンについてのスクリーニングが行われる。
【０１０７】
また本明細書に記載されているキットは、タンパク質精製の必要性を除去する抗原への抗体（例えば、モノクローナル抗体）を作製するためのものである。典型的なキットは、本明細書に記載されている複数のデンドリマー／Ｔヘルパーペプチド複合体（コンジュゲート体）（例えば、ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー、インフルエンザＨＡコンジュゲートデンドリマー等）と、及び典型的にｐＨが７．４の生理緩衝液とを含む容器を含む。緩衝液又は培地の１つの例において、該緩衝液又は培地は、ＨＥＰＥＳ及び重炭酸ナトリウムで緩衝され、並びに、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、及び１０％未満のウシ血清アルブミン又は、エンドトキシンレベルが１．０ＥＵ／ｍｌ未満である、塩化カルシウム１００ｍｇ／ｌを有するインスリン及び／又はトランスフェリンを含む個体血清タンパク質で補充されたイーグル最小必須培地を含む。本実施態様において、前記キットの使用者は、１００−２００μｇ／ｍｌの前記緩衝液で、１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド）を希釈し、穏やかに震とうしながら、前記組成物（Ｔヘルパー−デンドリマー）を前記希釈されたプラスミドＤＮＡに加える。典型的な実施態様において、ＴプラスミドＤＮＡ中のヘルパー−デンドリマーの割合は１０：１で使用され（Ｎ：Ｐ）、概ねＤＮＡプラスミド１（重量）に対して組成物が７（重量）である。１つの実施態様では、以下の条件が続く。室温で１０分間インキュベーション後、前記プラスミド−ＤＮＡ／組成物１０−２０μｇを含む前記混合物１００μｌが、マウスに皮下注射される。１４日後の同様の追加免疫、モノクローナル抗体についての、一次スクリーニング、融合及び最終スクリーニングの標準的な方法が続く。核酸に加えて、本明細書に記載されている前記組成物及びキットは、タンパク質又は抗原とコンジュゲートされる場合がある。かかる実施態様において、タンパク質中の前記組成物についての１０：１の同一割合が、典型的に前記複合体形成をもたらす。本明細書に記載されているキットに含まれる取扱説明書は、適切な割合、緩衝液の作製、及び最適化並びに必要な際のトラブルシューティングのプロトコールを記載する。本明細書に記載されている、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体を有するプラスミドＤＮＡ又はタンパク質／抗原の複合体化は、一般的に、ＰＢＳを含む生理緩衝液の生理学的ｐＨで緩衝された水溶液中の２つの成分を混合することによってなされる。典型的なＮ／Ｐ（アミン対リン酸）比は１０：１である。ゲル電気泳動又はその他の適切なアッセイは、前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーへの前記ＤＮＡの完全な複合体化を示すために使用可能である。
【０１０８】
本明細書で記載されているキットは、関心抗原をエンコードするベクター又はプラスミドのいずれかとともに用いられることができる。本明細書に記載されている、前記デンドリマー／Ｔヘルパーエピトープ複合体（コンジュゲート体）の使用前準備のための説明資料が一般的に含まれる。前記説明資料は典型的に書面の又は印刷された資料であることを含むが、それらはこれに限定されない。かかる説明書を保存することができる及びエンドユーザーへそれらを伝えることができる媒体のいずれもが、ここでの前記キット及び方法に包含される。かかる媒体は電子記録媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）等を含むが、これらに限られない。かかる媒体は、かかる説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含む場合がある。
【０１０９】
細胞へ核酸を送達するための組成物及び方法
本明細書に記載されている実験において、ＧＦＰをエンコードする遺伝子の送達は、ＭＨＣクラスＩＩ細胞（ＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞）へ特異的に送達され、前記遺伝子の発現が観察された。従って、本明細書に記載されている前記組成物及び方法は、いかなる遺伝子治療応用での使用を見出しても良い。細胞を核酸へ送達するための組成物は、典型的に、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド、及びペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸をコンジュゲートさせた少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーを含み、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記細胞へ特異的に結合し、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド、少なくとも一つの陽荷電性高分枝ポリマーデンドリマー、及び、核酸が細胞に取り込まれるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び前記核酸が、少なくとも１つの前記陽荷電性多分枝高分子デンドリマーの外部表面へコンジュゲートされることを特徴とする。細胞へ核酸を送達する方法は、典型的に、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及びペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸にコンジュゲートさせた少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーを含む組成物を細胞に接触させることを含み、前記組成物は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド、及びペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸をコンジュゲートさせた少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーを含み、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記細胞へ特異的に結合して、前記核酸の組み合わせが前記細胞によって内部に取り込まれるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び前記核酸が前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーの前記外部表面へコンジュゲートされることを特徴とする。典型的な実施態様において、前記ペプチド又はタンパク質は前記細胞内に発現する。
【０１１０】
組成物の投与
本明細書に記載されている前記ワクチン及び組成物は、哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト）へいかなる適切な処方で投与されても良い。例えば、ｓｉＲＮＡへコンジュゲートされたＰＡＤＲＥ−デンドリマーを含む組成物又は、核酸、又はペプチド若しくはポリペプチド抗原へ複合体化されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーを含むワクチンが、例えば薬学的に許容可能な担体又は生理食塩水又は緩衝塩類溶液のような希釈剤中で処方されても良い。適切な担体及び希釈剤は、投与の様式及び経路と、標準的な薬務とにもとづいて選択することが可能である。典型的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤と、医薬品の処方とは、レミントンの薬学と、この分野の標準的な教科書と、ＵＰＳ／ＮＦとで知ることができる。別の物質が、前記組成物を安定化及び／又は保護するために組成物に添加される場合がある。
【０１１１】
本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、いずれかの従来技術により哺乳類へ投与されても良い。かかる投与は、典型的に、非経口（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、又は髄腔内注入）だろう。前記組成物は、直接的に標的部位に投与される場合もある。前記組成物は、単回ボーラス投与か、複数回注射か、持続投与（例えば、腹膜透析、ポンプ注入による静注）かで投与されても良い。非経口投与のために、前記組成物は、パイロジェンを含まない殺菌された剤形で処方されることが好ましい。治療用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、既にがんで苦しんでいる、又は前記関心病原体（例えば、ウイルス）に感染した個体に投与される。予防用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、がん又は感染性疾患（すなわち、関心病原体に感染している（例えば、ウイルス））の発症の危険にさらされている（例えば、遺伝的に罹患しやすい、又は環境的に曝露された）個体に投与される。
【０１１２】
治療用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、既にがんで苦しんでいる、又は前記関心病原体（例えば、ウイルス）に感染した個体に投与される。予防用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、がん又は感染性疾患（すなわち、関心病原体に感染している（例えば、ウイルス））の発症の危険にさらされている（例えば、遺伝的に罹患しやすい、又は環境的に曝露された）個体に投与される。
【０１１３】
有効な用量
本明細書に記載の前記ワクチン及び組成物は哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト）へ有効な量、つまり、処置された哺乳類において望ましい結果（例えば、哺乳類におけるがんの予防又は除去、感染性疾患等に対する防御）を提供できる量で投与されるのが好ましい。かかる治療的有効量は以下で記載されるように決定可能である。
【０１１４】
本明細書に記載のワクチン及び組成物の毒性及び治療有効性用量は、ＬＤ５０（集団の５０％に対する至死用量）を決定するために細胞培養又は実験動物のいずれかを用いる標準的な薬学的手順で決定可能である。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。また、毒性の副作用を示す組成物が用いられる場合があるが、かかる副作用のダメージの可能性を最小化する送達システムの設計に注意を払うべきである。好ましい組成物の投与量は、ほとんど又は全く毒性がないＥＤ５０を含む範囲内であることが好ましい。投与量は、用いる剤形及び利用する投与経路に依存して、この範囲内で変わる場合がある。
【０１１５】
本明細書に記載されている組成物及びワクチンの治療学的有効量は、最初の免疫（治療又は予防投与）において、７０ｋｇの患者（例えば、０．１４μｇから３５７μｇのプラスミドＤＮＡ又はタンパク質及び０．８６μｇから２１４２．８５μｇの前記Ｔヘルパー−デンドリマー）に対して、前記抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされるか又は結合されるかのＴヘルパーエピトープ／デンドリマーの複合体が一般的に１μｇから約２５，０００μｇまでの（例えば、１、１００、５００、２０００、２５００、１０，０００、１５，０００、２５，０００μｇ）範囲であり、そして、前記患者の血液中の特定のＣＴＬ活性及び／又は抗体応答を測定による前記患者の応答及び状態に依存して、週から月単位の追加免疫計画に従って、約１μｇから約２，５００μｇの前記複合体（ワクチン）の追加免疫がなされる。１つの実施態様では、１３３倍以上多い用量のデンドリマーの１５日間投与が、毒性なく哺乳類に投与される場合がある（Ａｂｈａｙ Ｓｉｎｇｈ Ｃｈａｕｈａｎら、２００９ Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ａ，４６６，ｐｐ１５３５−１５５０．２００９を参照のこと）。
【０１１６】
現在がん又は感染性疾患に苦しんでいる及び／又はがん又は感染性疾患と診断された被験体の治療のために、投与は、疾患の最初の兆候の時か、又は腫瘍の検出又は外科的摘出時か、又は急性感染の場合には診断後すぐに開始することが好ましい。これは、少なくとも症状が実質的に弱められるまで、及びその後一時期の間、追加免疫がなされる。慢性感染症において、負荷用量とそれに続く追加免疫が必要とされる場合がある。予防使用のために、個体ががんへの素因に気付いたらすぐに、又は感染性疾患への曝露の予想の前に投与を開始しても良い。
【０１１７】
医学及び獣医学の当業者に周知であるように、いずれかの被験体への投与量は、前記被験体の大きさ、身体表面領域、年齢、投与される特定の組成物、時間及び投与経路、健康所見、及びその他の同時に投与される薬剤を含む因子の多くに依存する。例えばＰＡＭＡＭのようなデンドリマーは臨床試験と同様に前臨床試験でテストされた。最近、ＦＤＡは「ファーストトラック」をＶｉｖａＧｅｌ（登録商標）（Ｓｔａｒｐｈａｒｍａ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に付与し、既に第３相臨床試験にある。角膜におけるデンドリマーの治療使用は公知であり、デンドリマーは角膜遺伝子送達に用いられている。角膜の用途におけるデンドリマーの使用例は、角膜の新血管形成の治療、光線力学療法、及び角膜等価物としての再生医学を含む。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、ヒトに４０年以上の間、「天然の」インターフェロンの誘導因子として投与されてきた。複数の最近の臨床試験は、安全性及び増強した免疫原性のために異なった用量及び投与経路が試されてきた；一般的な安全性及び増強した免疫原性は繰り返し報告され、確立されている。
【０１１８】
実施例
本発明は、以下の特定の実施例によってさらに例示される。前記実施例は例示のみのために提供され、何等、本発明の技術的範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１１９】
確立されたメラノーマ腫瘍の遺伝子ワクチン接種療法のためのアジュバント／標的ナノ粒子を利用したプラットフォーム
裸のＤＮＡを用いる遺伝子ワクチン接種は、抗原を作製するために天然型で用いられる。しかし、イン・ビボでのトランスフェクション効率が低いこと、有効な送達がないこと、及び、従来の因子ワクチン接種アプローチの特異性が低いことが、抗原の効率を非常に制限する。これらの制限を克服するために、１）イン・ビボでＰＡＰＣの特異的で効率的なトランスフェクションを可能にし、２）自家ＰＡＰＣの成熟、つまり強力な免疫応答をもたらす「危険信号」を提供し、３）発生した免疫応答をさらに高めるヘルパーＴ細胞を活性化する、抗腫瘍ＤＮＡワクチン接種のための新規で柔軟なプラットフォームが開発され、本明細書に記載される。
【０１２０】
本明細書記載の新規のデンドリマーを利用するナノ粒子が、２つの反応物、ジェネレーション５のアミノ末端型ＰＡＭＡＭデンドリマーと、標的／免疫増強ペプチド、すなわち普遍的なＴヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ）とのコンジュゲートによって典型的に調製される。以下に記載のデータは、ｉ）Ｃ５７ＢＬマウスで確立され、高い侵襲性のＢ１６／ＬＵ８メラノーマ腫瘍を５０％の腫瘍サイズに減少する目的の抗腫瘍効果を達成し、ワクチン接種で用いられた前記遺伝子の生産物に対する強力な免疫応答を誘導し、２倍ないし３倍まで、マウス及びヒトの両方の抗原提示細胞（ＡＰＣ）でトランスフェクション効率を増大するための本プラットフォームを示した。さらに、ＰＡＤＲＥデンドリマーにコンジュゲートしたＧＦＰをエンコードするプラスミドを用いるイン・ビボ実験は、ＧＦＰが流入領域リンパ節で産生されることを示した。
【０１２１】
材料及び方法
ＰＡＤＲＥ誘導体化ＰＡＭＡＭデンドリマーが、以下の改変とともに上述のように製造された。前記ＰＡＤＲＥデンドリマー／ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの複合体は、適切なＮ／Ｐ比で１０分間室温でインキュベーションすることによって製造された。かかる複合体は、イン・ビトロ研究のために初代のＰＭＢＣ又は脾臓細胞に添加されたか、又はワクチン接種の目的のために皮下に注射された。図１は、ジェネレーション５のＰＡＭＡＭデンドリマー（へのコンジュゲート）のＰＡＤＲＥ修飾を示す。
【０１２２】
複数の核酸を結合するための高い陽荷電性表面を維持するために、１つのデンドリマー分子は、その表面にコンジュゲートした２つのＰＡＤＲＥペプチドを典型的に有するため、それが正味の陽荷電性を保持するであろう。ＰＡＤＲＥを前記デンドリマーに付加することは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の特異的な標的化と、強力なＣＤ４支援とをもたらす。前記ＰＡＤＲＥ誘導体化ＰＡＭＡＭデンドリマーは、抗原をエンコードするプラスミドの送り届けだけでなく、自然及び適応免疫を刺激し、「危険信号」として作用する。
【０１２３】
エンドトキシン無しのＭａｘｉＰｒｅｐ試薬が、（ＰＣＤＮＡ３．１中のｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＭＡＸ、ＧＦＰ、ＴＲＰ−２、Ｐ２、ＰＣＡＲＤ及びＯＶＡを含む）さまざまなプラスミドを作製するために用いられた。蛍光色素免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）と、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）とが標準的な方法によって実行された。簡潔には、トランスフェクションされたｃｏｓ−７細胞は、（９６ウェルプレートでウェル１つあたり０．０２×１０６個）播種され、細胞は固定され、透過処理された。上昇した液性応答を測定するために、希釈された血清は前記ウェルに添加され、第２番目のＩＲＤｙｅ ８００ＣＷでタグ化された抗マウスＩｇＧが抗体応答を測定するために用いられた。
【０１２４】
前記デンドリマー／ＤＮＡの複合体を調製するために、エンドトキシン無しのＰＢＳ中に調製されたＤＮＡ１μｇ／μＬが、さまざまな割合でデンドリマー又はデンドリマー−ＰＡＤＲＥと複合体形成された。室温で１０分間インキュベーション後、前記複合体は、細胞培養物に添加されるか、又は皮下、皮内又は角膜間質腔（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ ｃａｖｉｔｙ）に注射された。
【０１２５】
Ｂ１６−ＬＵ８メラノーマ腫瘍を有するマウス、５群の雌性Ｃ５７ＢＬマウスにワクチン接種のために、Ｂ１６−Ｆ１０細胞（０．０２×１０６個）が皮下に移植された。異なる群が、ｉ）非処理か、ｉｉ）ＰＣＤＮＡ３．１（対照ベクター）単独か、ｉｉｉ）デンドリマー単独で複合体形成されたＴＲＰ−２か、ｉｖ）ＰＡＤＲＥ−デンドリマーで複合体形成されたＴＲＰ−２かを腫瘍移植後２日目及び１０日目に受けた。腫瘍測定は１週間に２回実行された。
【０１２６】
結果
調製されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーが特徴付けられた。ペプチド−デンドリマーコンジュゲート体は、前記ペプチドの−ＣＯＯＨ末端と前記デンドリマーのアミノ基との間で単純にアミドカップリングすることによって作製された。２：１のペプチド／デンドリマーの感作割合が反応で用いられ、前記デンドリマーの大きな陽電荷を作るための多くの遊離のアミノ基を保持するために、デンドリマー１個あたりペプチド数個のみを付着する。産物は、純水に対する透析によって少なくとも２４時間精製され、その後真空で乾燥された。回収された産物、精油は、１Ｈ ＮＭＲ、ＵＶ−Ｖｉｓ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けられた。ＮＭＲは、前記デンドリマーの陽電子に対応する大きなピークと、ペプチドの陽電子についての一連の小さなピークとを示す。前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ｍ／ｚ比で前記デンドリマーについて観察されたピークよりも高い約３，０００ユニットのピークを示す。過剰な質量は約２個のペプチドエピトープに対応する（図１７）。
【０１２７】
データは２つのＰＡＤＲＥの平均が各デンドリマーに存在すると証明した（図１７）。複数の核酸を自家ＡＰＣにイン・ビトロ送達することが示された。ヒトの初代の末梢単核球細胞をイン・ビトロで送達／トランスフェクションすることは、１：５及び１：１０の感作比で最もよく達成された。図２は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー（にコンジュゲートした）と複合体形成した、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒでタグ化されたｓｉＲＮＡがＢ細胞と４時間インキュベーションされた際の純化されたヒトＢ細胞にＰＡＤＲＥ−デンドリマーを介するｓｉＲＮＡ送達（〜％８６）を示す。細胞はＣＤ１９／ＦＩＴＣで染色され、赤色チャンネル（ＰＥ）はｓｉＲＮＡ ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ．ｍａｎを有する細胞を示す。
【０１２８】
図３に関して、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのイン・ビボのＤＮＡ送達が示された。ＧＦＰ又はＴＲＰ−２をエンコードするプラスミドは単独で注射されるか、又はＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はデンドリマー（即ち、ＰＡＤＲＥと複合体形成されていないデンドリマー）と複合体形成された。画像は、注射後２４時間及び１６時間の皮膚（左）及び角膜（右）でのＧＦＰの発現を示す。ＧＦＰの効率的な発現が、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー複合体の注射後２４時間及び１６時間の皮膚及び角膜の両方で示された。イン・ビボでリンパ節の標的化が実証された。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド複合体（全５μｇのプラスミド）が皮下に注射された後８日目、隣接のリンパ節が除去され、ＧＦＰ−ＤＮＡ単独で注射されたマウスのリンパ節と比較された。蛍光顕微鏡画像が、免疫後８日目に網目状のリンパ節（ｍｅｓｈｅｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）で撮られた。注射部位に隣接する前記リンパ節での抗原の発現が見られたが、対照リンパ節での抗原の発現は見られなかった。
【０１２９】
イン・ビボでリンパ節の標的化が実証された。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド複合体（全５μｇのプラスミド）が皮下に注射された後８日目、隣接のリンパ節が摘出され、ＧＦＰ−ＤＮＡ単独で注射されたマウスのリンパ節と比較された。蛍光顕微鏡画像が、免疫後８日目に網目状のリンパ節（ｍｅｓｈｅｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）で撮られた。注射部位に隣接する前記リンパ節での抗原の発現が見られたが、対照リンパ節での抗原の発現は見られなかった。
【０１３０】
図４に示されるように、特異的な免疫応答がＰＡＤＲＥ−デンドリマー／プラスミド複合体を投与した後に上昇された。強い液性応答が、プラスミド／ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの複合体での１回（ＧＦＰ）又は２回（ＯＶＡ）の免疫で観察された。
【０１３１】
図５に示されるデータは、確立された腫瘍のＰＡＤＲＥ−デンドリマー療法を示す。Ｂ１６メラノーマは、侵襲性のマウス腫瘍モデルであることが知られる。Ｂ１６メラノーマ細胞（上）又はＴＳＡ（下）を移植されたマウスが、腫瘍移植後２又は３日目にワクチン接種され、１週間後に追加免疫が続いて行われた。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーを投与することが、特に、ＰＡＤＲＥ結合に対して高い親和性を有するＣ５７ＢＬ（Ｉａｂ）で防御免疫応答をもたらしたことを追跡腫瘍測定が明確に実証した。またＣ５７ＢＬはヘルパーＴ細胞の誘導を介してＰＡＤＲＥに強く応答した。
【０１３２】
図５に関して、結果は、高い侵襲性で確立されたＢ１６／ＬＵ８腫瘍の腫瘍サイズを５０％減少する目的の抗腫瘍効果を示した。この侵襲性モデルは、他の全てが失敗してもプラットフォームの能力を示すために意図的に選択された。腫瘍成長の遅延と、腫瘍サイズの減少とは前例のないことである。さらに、腫瘍移植後２２日目、腫瘍又は触診可能な腫瘍が全ての対照群と顕著に異なる試験群（即ち、本明細書に記載されているようなワクチンを受け取っている動物）で全く検出されなかった。本ワクチン接種（ワクチン投与）で用いられたＤＮＡ量は、通常用いられる量（２０μｇ及び全２回の免疫）と比較して非常に少なかった。図５では、下段の図は、ＰＡＤＲＥが適切に結合していないＢａｌｂ／ｃマウスを用いる陰性対照であり、Ｂａｌｂ／ｃ ＴＳＡ腫瘍モデルでの類似の実験では全く有効性を示さない。これは、ＭＨＣクラスＩＩを介する送達システムの特異性を明らかに示す。
【０１３３】
これらのデータは、本明細書記載の標的用アジュバントナノ粒子プラットフォームが、遺伝子送達と、エンコードされた抗原の強力な発現と、抗原提示と、防御免疫応答の誘導とをもたらすことを明らかに実証する。したがって、本明細書記載のＰＡＤＲＥ−デンドリマーのナノ粒子は、ｉ）タンパク質なしの（モノクローナル）抗体の製造と、ｉｉ）悪性腫瘍と、虚偽のインプリンティングを有する感染性疾患との免疫学的治療／予防と、ｉｉｉ）免疫を利用した治療介入の多くのためのｓｉＲＮＡ送達とのための新規で強力なアジュバント／標的用送達ツール及びプラットフォームである。
【実施例２】
【０１３４】
イン・ビトロでの標的送達及びトランスフェクションの効率
図６に関して、イン・ビトロでのＰＢＭＣの標的送達は７７％のＢ細胞トランスフェクション効率をもたらす。健康な提供者由来のヒトＰＢＭＣが入手された。ＰＢＭＣは、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地１ｍＬあたり６百万個の細胞で培養された。ＧＦＰをエンコードするプラスミド５μｇは、生理緩衝液、ＰＢＳ１００μＬで希釈され、ＰＢＳ５０μＬ中のＰＡＤＲＥ−デンドリマー５μｇは、振とうながらＤＮＡに添加された。室温で１０分間インキュベーション後、ＧＦＰプラスミド及びＰＡＤＲＥ−デンドリマーの混合物／複合体が、その後、ＰＢＭＣに添加された。３７°Ｃ／５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベーション２４時間後、ＰＢＭＣはＣＤ１９ ＰＥで染色され、細胞はフローサイトメトリーで解析された。ＧＦＰの発現が全ＰＢＭＣの４３％で観察された一方、Ｂ細胞にゲートされたとき、Ｂ細胞の７７％がＧＦＰを発現した。対照群、デンドリマーとＧＦＰプラスミドの同じの割合をインキュベーションしたＰＢＭＣは、総ＰＢＭＣ又はＢ細胞に対して約１１％と７％のＧＦＰの発現を示した。培地のみでのＰＢＭＣと比較するとき、主要な生存率変化は全く観察されなかった。これは、さまざまな実験の代表例である。これらの実験は、ｉ）ＰＢＭＣと、特に、ＭＨＣクラスＩＩを発現している細胞（Ｂ細胞）とへのＧＦＰプラスミド送達、及び、ｉｉ）ＰＢＭＣと、特に、Ｂ細胞とによるＧＦＰの発現を実証する。
【実施例３】
【０１３５】
イン・ビボでマウス樹状細胞（ＤＣ）と、イン・ビトロでヒトＢ細胞とへのペプチド／タンパク質の送達
ＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣは純化されたヒトＢ細胞に送達された（図７）。図８に関して、この図は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの標的化の、イン・ビボでのマウス樹状細胞（ＤＣ）の効率と、注射及びリンパ節解析の時系列とを示す。この実験の結果は、ｉ）（図７）ＰＡＤＲＥ−デンドリマーと混合されたタンパク質、アルブミン−ＦＩＴＣは２時間未満でヒトＢ細胞中に送達され、ｉｉ）（図８）皮下注射後５日目、デンドリマーにコンジュゲートしたエピトープ、ＰＡＤＲＥは、リンパ節のＢ細胞と樹状細胞（ＤＣ）とにイン・ビボで送達され（前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、リンパ節／Ｂ細胞／樹状細胞（ＤＣ）への複合体の送達を可視化するためにＧＦＰ−プラスミドに複合体形成された。）、ｉｉｉ）（図９）皮下注射後５日目、デンドリマーにコンジュゲートしたエピトープ、インフルエンザのＨＡヘルパーエピトープはリンパ節の樹状細胞（ＤＣ）にイン・ビボで送達される（前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、リンパ節の樹状細胞（ＤＣ）への複合体の送達を可視化するためにＧＦＰ−プラスミドに複合体形成された。）ことを示す。これらのデータは、さまざまな実験で、ＧＦＰプラスミドと複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はＨＡ−デンドリマーそれぞれの皮下注射後３日目に摘出されたリンパ節のいくつかでの代表例である。これらの結果は、ＦＩＴＣのＦＩＴＣ可視化を介して、リンパ節細胞のＢ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＦＩＴＣコンジュゲートタンパク質の送達と、デンドリマーにコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ及びＨＡヘルパーのエピトープの２つのペプチドの送達との例を証明し、該２つのペプチドでは、ＧＦＰプラスミドが複合体（ＧＦＰをエンコードするプラスミドを伴うペプチド連結デンドリマー複合体）の可視化と解析を促進するために前記ペプチド−デンドリマーと複合体形成された。樹状細胞（ＤＣ）の特異的なイン・ビトロ及びイン・ビボのトランスフェクションは、ナノ粒子（ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰをエンコードするプラスミド）、対、対照の注射後５日目の隣接のリンパ節で標的化及び増幅する樹状細胞（ＤＣ）のイン・ビボのフローサイトメトリーデータによって示された（ＧＦＰの発現７８％、対、〜７％）。ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー（ＰＤＤ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現したＭＨＣクラスＩＩに結合する高い親和性を有するＰＡＤＲＥのオプソニン効果の補助によって送達を増大する。同様に、ＨＡ−デンドリマー（ＤＲＨＡ）／ＧＦＰ−プラスミドは、皮下に注射されたとき、隣接のリンパ節にイン・ビボで送達される（図９）。マウスで特筆すべきことは、ＰＡＤＲＥがＩＡｂ（Ｃ５７ＢＬマウス）の前記ＭＨＣクラスＩＩに結合する一方（図８）、選択されたＨＡエピトープがＩＡｄ（Ｂａｌｂ／ｃマウス）のＭＨＣクラスＩＩに結合する（図９）ことである。異なる２つのエピトープを用いて、異なる２つのマウスの系統において、類似の結果となるイン・ビボ送達を実行できることが示された。ヒトＰＢＭＣ（図６）、純化されたヒトＢ細胞（図６）及びＣ５７ＢＬマウスの脾臓細胞でＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミドによってＧＦＰの発現をもたらす抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的送達と、ヒトＢ細胞（図１０）及びサルＰＭＢＣ（図１１）へのＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ｄｓＲＮＡの送達とは、本明細書記載の組成物によるＰＡＰＣへのペプチド送達の追加のイン・ビトロの証拠である。ユニークな特徴は前記ＭＨＣクラスＩＩに結合する異なる２つの標的ペプチドの使用が、本明細書記載の実験で示されたように働くため、本明細書記載のワクチン、方法及び組成物は、全てのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを包含する。また、図９に関して、インフルエンザＨＡヘルパーエピトープにコンジュゲートしたデンドリマー（ＨＤＤ）が調製された。ＨＤＤはｂａｌｂ／ｃマウスで用いられる場合がある。マウスに注射されたとき、ＨＤＤは、隣接のリンパ節で樹状細胞（ＤＣ）を標的とする。
【実施例４】
【０１３６】
ヒトＢ細胞及び非ヒト霊長類ＰＢＭＣへのｓｉＲＮＡのＰＡＤＲＥ−デンドリマー送達及び非ヒト霊長類ＰＢＭＣへのプラスミドのＰＡＤＲＥ−デンドリマー送達
図１０に関して、ｄｓｓｉＲＮＡに複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー（対照ｓｉＲＮＡ）は、イン・ビトロの標的送達を示した。０．１μｇのｄｓＲＮＡは１００μＬのＰＢＳ中に希釈され、２０μＬ中の０．７μｇのＰＡＤＲＥ−デンドリマーが、振とうしながらＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒでタグ化されたｄｓＲＮＡに添加された。室温で１０分間インキュベーション後の複合体が、２４ウェルのプレート中の（１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ中の）１００万個の純化されたＢ細胞に添加された。３７°Ｃ／５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベーション約１時間後、細胞は洗浄され、ウェルに（新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１ｍＬ中に）戻され、赤色チャンネルの蛍光顕微鏡下で解析された。明視野及び赤色チャンネル下での細胞の重ね合わせ画像は、ヒトＢ細胞によるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒでタグ化されたｄｓＲＮＡの取り込みを実証する（図１０）。細胞がＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）で染色され、フローサイトメトリーによって解析されたとき（図２）、細胞は３７°Ｃ／５％ＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベーションされた。図２に示されるように、対照のデンドリマー／ｄｓＲＮＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの約６％に対して、Ｂ細胞の８０％よりも多くが、（ＲＮＡにタグ化された）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒに陽性である。これらの結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーによるＰＡＰＣへの核酸の強力な送達を明らかに実証する。
【０１３７】
ヒヒ（ｐａｐｉｏ ｈａｍａｄｒｙａｓ）由来の１つの試料と、カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の異なる２つの試料とのＰＢＭＣがテストされた。図１１に示される蛍光顕微鏡画像は、ｓｉＲＮＡ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒで複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はデンドリマーそれぞれの添加後２時間に撮られた代表例である。同様に、ＧＦＰ−プラスミドで複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はデンドリマーは前記ＰＢＭＣに添加され、インキュベーション後２４時間で解析された（図１２）。結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは核酸をサルのＰＢＭＣに２時間未満で送達する一方、デンドリマーは穏やかな送達のみを示すことを示す。これらの結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは非ヒト霊長類で作用することを強く示唆する。
【実施例５】
【０１３８】
ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのナノ粒子及びＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴ（商標）プラットフォームの組成物
本明細書記載のＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、全ての細胞へのＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴの非特異的な送達とは反対のＰＡＰＣの特異的な標的化を提供する。前記ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴ（商標）プラットフォームは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合するために非特異的な生来のアジュバント活性又はいずれかのリガンドを用いる電気穿孔法を介してＤＮＡを細胞に送達する７０４ポリマーを含む。従来、イン・ビボの電気穿孔法は、最も良いウイルス遺伝子を使用しない免疫方法として知られる。本明細書記載のＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、前記ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴ（商標）のプラットフォームによって提供されないヘルパーＴ細胞の誘導を提供する。上記の実験では、前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは治療上の腫瘍モデルで有効であることが示された一方、ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴのものはイン・ビボ腫瘍モデルで有効であることが示されなかった。本明細書記載の前記実験では、強力な対照として、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーはイン・ビボ電気穿孔法と比較された（図１３）。反対に、ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴは裸のＤＮＡとの比較のみを示した。本明細書記載の前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの単回免疫が、液性応答を上昇するためのイン・ビボ電気穿孔法と比較された。本実験を実行するために、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、室温で５μｇの前記プラスミドと混合され、１０分後、混合物はマウスに皮下注射された。ＯＶＡをエンコードするプラスミドにコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ−デンドリマーで免疫されたマウスと、対照マウスとは、単回のワクチン接種２８日後にＯＶＡを発現する５０ｋ Ｂ１６Ｆ１０で感作された。イン・ビトロでの電気穿孔法を介してプラスミドを受け取っているマウスでは４０％であり、ＤＮＡのみを受け取った対照群では０％であったが、プラスミドにコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ−デンドリマーを受け取ったマウス全てが腫瘍移植後２５日目で保護（Ｐｒｏｔｅｃｔ）された。図１３に示されるように、結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／プラスミド（ＤＲＰ−ｏｖａ）での単回のＤＮＡワクチン接種は、抗ｏｖａ抗体の液性応答を誘導するためのプラスミド（ＥＰ−ｏｖａ）のイン・ビボ電気穿孔法（ＥＰ）の送達よりも優れていることを示す。
【実施例６】
【０１３９】
マウスで強い液性応答を誘導するＰＡＤＲＥ−デンドリマー
図１４−１６に示されるように、プラスミドと複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーはマウスで強い液性応答をもたらす。
【実施例７】
【０１４０】
ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡプラスミドワクチンによる予防上の設定でのＢ１６／ＯＶＡの根絶
ケージあたり５匹の群の雌６週齢のＣ５７ＢＬマウスが、ｉ）免疫なし、ｉｉ）Ｄｅｒｍａ Ｖａｘ電気穿孔装置を用いる「イン・ビボ電気穿孔法」を介する２０μｇのＯＶＡ−プラスミドの２回の免疫か、ｉｉｉ）ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡ−プラスミドの２回の免疫（各２０μｇ）かを受けた。免疫は２週間の間隔で実行された。免疫後１０日目、全てのマウスは、右側腹部にＰＢＳ１００μＬ中のＢ１６／ＯＶＡ腫瘍細胞５０，０００個の皮下注射（移植）を受けた。腫瘍の測定は１週間に２回実施され、毎週のデータはプロットされ、図１８に示される。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／２０μｇのＯＶＡ−プラスミドでの２回のワクチン接種は、免疫されたマウス全てでＢ１６／ＯＶＡ腫瘍の完全な根絶をもたらす一方、非処理では１００％、及び、「イン・ビボ電気穿孔法」を介してワクチン接種されたマウスの６０％が腫瘍を持ったままであった。体重の１５％よりも大きな腫瘍を有する、腫瘍を持ったマウスの全ては屠殺された。
【０１４１】
その他の実施態様
いずれかの改良が、前記組成物、キット及び方法ステップの一部又は全部で行われる場合がある。本明細書で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む参考文献の全ては、引用により本明細書に取り込まれる。本明細書で提供される例又は例示的な用語（例えば、「のような」）のいずれか及び全てを用いることは、本発明を例示することを意図し、他に要求がない場合には、本発明の技術的範囲を限定することを示すものではない。例えば、本明細書記載の実験は、Ｂ１６メラノーマの根絶と、ＧＦＰ、ＯＶＡ、ＰＣＡＲＤ、ＣＣＲ５、ｖｇＰＣＲ、ｍｕＰＡＲ、ＣａｔｈＬ又はｐ２の抗原への強い液性応答の誘導とを含むけれども、本明細書記載のワクチン、組成物及び方法は、がんの追加のタイプを予防又は根絶するステップ、及び、免疫応答、つまり興味のある抗原（例えば、感染性病原体由来の抗原）いずれかに対する免疫を誘導するステップを含む、他の治療上及び予防上の適用の多くで使用することを発見することが可能である。もう１つの例では、本明細書記載の前記ワクチン、組成物及び方法は、抗原ではないタンパク質又はペプチドを細胞に送達するために用いられることが可能である。この例は、ペプチド又はタンパク質を細胞に送達するための典型的な組成物は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び少なくとも１つのペプチド又はタンパク質をコンジュゲートした少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含み、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのペプチド又はタンパク質とは、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。本発明又は好ましい実施態様の性質又は利益に関する本明細書の説明のいずれも限定することを意図せず、添付された請求項は、かかる説明によって制限されるとみなされるべきではない。より一般的には、明細書中の用語は、本発明の実行に必須とされるものと同じく、請求項に記載されていない構成要素のいずれかを示すものと解釈されるべきではない。本発明は、準拠法によって許されているように、本明細書に添付された請求項に記載の対象の改変及び均等物の全てを含む。さらに、本明細書で他に示されるか、又は明らかに文脈と矛盾したりしない場合には、全ての変形における上記構成要素のいずれの組合せも本発明に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に化学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、被験体で免疫応答を誘導するためのワクチン、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本出願は、２００９年４月１日に出願された米国仮特許出願第６１／１６５，７３２号の優先権を主張する。出願人は、本明細書でこの特許出願の優先権を主張し、全体の内容が引用により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
背景
ワクチンの使用による微生物感染及び発病過程の予防は、最も効果的で理想的な病気との闘いのための一つの手段と考えられている。感染又は発病に先立って、宿主動物の免疫応答を刺激する方法で、抗原、又は、免疫原が生体に導入される。しかしながら、伝統的なワクチン戦略は、多数の病原体又はがんに対する防御の備えに効果的ではなかった。伝統的ワクチン戦略によって、１００以上の病原体に対してわずかに約２０の有効なワクチンが作製されたに過ぎない。高い細胞障害性Tリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導するワクチンの中で一部は、弱い免疫原性により、低い目標反応割合、免疫回避メカニズム、及び、ディセプティブ・インプリンティング（偽装刷り込み）をしばしば示す。現在のワクチン送達の方法は、強い“危険信号”を誘発せず、負の制御として作用する阻害反応を開始し、ノンプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ抗原を送達するため、防御的免疫応答誘導との観点では、低い成功割合である。例えば、高いＣＴＬ反応を備える場合であっても、現在のがんワクチンは、低い目標反応割合（２．６％）しか示さない。これらは、弱い免疫原性及び免疫回避メカニズムを含む多数の不利益を伴う。さらに、（樹状細胞に基づく、及び、Ｇ−ｖａｘに基づく）最も有望ながんワクチンは、極めて高価であり、これらのワクチンの調製（例えば、患者毎の個別化、及び、ＧＭＰ基準での製造）が含まれる。
【０００４】
遺伝子ワクチン又は遺伝子免疫は、抗原作製のための哺乳類宿主への遺伝子材料接種関与の、がんワクチンを含むワクチンへの可能なアプローチとして考えられる。送達された関心抗原をエンコードする哺乳類発現ベクターは、イン・ビボでの発現と、それに続く抗原特異的反応に結び付く。その上、関心タンパク質の発現可能な場において、遺伝子は細胞膜を通過できず細胞の核に到達できない陰荷電性ポリマーである。遺伝子ワクチンは、自然なエピトープの完全なスペクトルの発生と、イン・ビトロで発現された組換えタンパク質の投与と比較してイン・ビボでのタンパク質の自然な配位構造の達成と、抗体と細胞性免疫の誘導と、及び、抗原作製のためのコスト的で一般的なワクチン投与ステップの除外とを含む多数の利点を与える。しかしながら、遺伝子ワクチンは、自己抗原の寛容破壊と、イン・ビボでの細胞及び核への低い核酸送達と、特定のタイプの細胞に対する特異性の欠如と、及び、弱い免疫応答と、多くの欠点を伴う。
【０００５】
同様に、他の型のワクチンは欠点を伴う。例えば、遺伝子のウイルス送達は、ウイルスベクターに対する強い免疫応答に結びつき、安全性上の問題を伴う。抗原として使用するための微生物からの蛋白精製とペプチド製造は、高価で時間を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、副作用がないか又は弱く、コスト的に効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするワクチンはない。そこで、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とし、安全でコスト効果的で、使用が容易で、強く特異的な細胞性及び抗体反応を引き出すワクチンについて大きな需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
本明細書記載の発明は、抗原に対して強力で特異的な免疫応答をもたらす前記抗原か、該抗原をエンコードする核酸かをイン・ビボでプロフェッショナルＡＰＣ（ＰＡＰＣ）に送達するためのナノ粒子を利用した組成物、キット及び方法と、プラットフォームとである。また、本明細書記載の発明は、ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するためと、核酸、ペプチド又はタンパク質を細胞（例えば、ＭＨＣクラスＩＩを発現する腫瘍細胞）に送達するためとのナノ粒子を利用した組成物、キット及び方法と、プラットフォームとである。現在のワクチン戦略の主要な利益は、ワクチン戦略が制御性Ｔ細胞を含む抑制性細胞を誘導することである。抗原をＰＡＰＣに標的送達することが、抑制因子機構の活性化、特に、制御性Ｔ細胞の活性化を低減又は阻害することが知られている。前記組成物、キット及び方法は、ＭＨＣ標的で免疫原性のペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ、ＨＡ）を、特定の細胞に核酸、ペプチド又はポリペプチドを標的送達のための運搬体としての荷電性（例えば、陽荷電性）多分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭその他のデンドリマー）と組み合わせて使用することを含み、遺伝子又はタンパク質のワクチン接種のための新規ナノ粒子を利用した方法をもたらす。本明細書記載の典型的なワクチンは、Ｔヘルパーペプチド（例えば、前記ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）と、少なくとも１つのポリペプチド抗原か、該少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸かと、任意のポリＩ−ＣとのようなＭＨＣ標的で免疫原性のペプチドにコンジュゲートした荷電性（例えば、陽荷電性）多分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭその他のデンドリマー）を含む。本明細書記載の前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡその他のものを含む陰荷電性生体分子に効率的に結合する。Ｔヘルパーペプチド（例えば、前記ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）にコンジュゲートした荷電性（例えば、陽荷電性）多分枝ポリマーデンドリマーは、ＰＡＰＣに特定の抗原を送達するために増大された有効性を有するワクチンを提供する。本明細書記載の実験では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＰＡＤＲＥを介してＰＡＰＣを標的にするためにＰＡＤＲＥを第１番目に使用することが示される。本明細書記載の実験は、前記ＭＨＣクラスＩＩに結合することが期待されるユニークな特徴の異なる標的ペプチド２つを効率的に使用することを記載する。したがって、本明細書記載の前記ワクチン、方法及び組成物は、全てのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む。本明細書記載の前記ワクチン、キット及び組成物は、イン・ビボでのＰＡＰＣへの特異的かつ効率的なトランスフェクションと、自家ＰＡＰＣの成熟、つまり強力で特異的な免疫応答をしばしばもたらす生来の普遍的なヘルパーＴ活性とを提供する。
【０００８】
デンドリマーは理想的なＤＮＡ送達候補であり、前記デンドリマーは、サイズ及び形状（積荷−空間）にわたる構造的な制御を提供し、生体適合性（無毒性で非免疫原性）であり、重要なスキャフォールド特性を有し、特異的な標的原子団のためのよく定義された表面を調節可能な官能基を有し、細胞接着と、細胞質又は核へのエンドサイト−シス及び送達とのための能力を有し、許容可能な生体分解性（体内で安全に分解するための能力）を有し、簡単で都合の良い製造性（臨床グレード）の合成と関係付けられる。本明細書記載の実験では、前記ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド又はポリペプチドにコンジュゲートした陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、ヒト及びマウスの両方で抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にし、ヘルパーＴ細胞を活性化するペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ又はインフルエンザＨＡ）を含む。前記ＰＡＤＲＥペプチドは主要な機能２つを有する。前記ＰＡＤＲＥペプチドはＰＡＰＣ上に存在する前記ＭＨＣクラスＩＩに結合するようにＰＡＰＣにＤＮＡを送り届け、前記ＰＡＤＲＥペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の発生と、抗体応答に必要とされるクラススイッチとを促進するヘルパーＴ細胞を刺激する。この新規ナノ構築物は、遺伝子及びペプチドの送達及びワクチン接種のためのユニークな特徴を有する。また、本明細書記載の実験は、ＰＡＤＲＥにコンジュゲートした陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー（ＰＡＭＡＭデンドリマー）が、治療上の設定で５０％までＣ５７ＢＬマウスで確立され、高い侵襲性のＢ１６／ＬＵ８メラノーマ腫瘍の成長を遅延し、サイズを減少させること、及び、Ｂ１６／ＯＶＡの予防上の設定で腫瘍の１００％根絶を示すこと、ワクチン接種ために用いられる遺伝子産物に対する強力な免疫応答を誘導すること、マウス及びヒトの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方で２倍又は３倍までのトランスフェクション効率を示すこと、ＧＦＰをエンコードするプラスミドを、流入領域リンパ節に由来するイン・ビボで送達すること、及び、ヒトＢ細胞、Ｔ細胞及びマウスのマクロファージにｓｉＲＮＡを効率的に送達することを示す。
【０００９】
本明細書記載の組成物及びワクチンは、組成物及びワクチンが、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞、ＰＡＰＣの全て又はほとんど全てを標的とするとき、ワクチン接種のために目的に合わせた理想的なプラットフォームである。Ｔ細胞の活性化の抑制又は促進をする（ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、Ｆｏｘｐ３及びこれらの推定の共刺激性受容体を含むが、これらに限定されない）共阻害性で共刺激性の非常に重要な分子を発現する。これらの経路に含まれる分子の発現の標的化操作は、がん、感染性疾患のための免疫療法／ワクチン接種、又は、中毒症又は不妊症のためか、被験体において疾患を誘導する薬剤を中和するためかと、自己免疫の管理のためとのワクチン接種のような他の新規ワクチンアプローチのために用いることが可能である。本明細書に記載されているようなワクチンを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に標的送達することが、非常により強力な免疫応答を生じ、抑制因子／フィードバック機構を減少し、ワクチン投与量を少なくすることで毒性を防止することによって、従来のワクチン接種戦略に関係する感作に解決策を提供する。
【００１０】
したがって、本明細書記載の発明は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記ワクチンでは、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることが可能である。本実施態様は、薬学的に許容可能な担体及び／又は油中水型エマルジョンを含むことが可能である。１つの実施態様では、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）、例えば、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープである。また、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることが可能である。前記核酸は発現ベクターであることが可能であり、前記少なくとも１つの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能である。
【００１１】
また、本明細書記載の発明は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。１つの実施態様では、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートしている。前記ワクチンは、第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含むことが可能であって、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることが可能である。前記ワクチンは、薬学的に許容可能な担体及び／又は油中水型エマルジョンをさらに含むことが可能である。前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープ、例えば、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープであることが可能である。もう１つの実施態様では、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡである。前記ペプチド又はポリペプチドの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能である。
【００１２】
さらに、本明細書記載の発明は、抗原を哺乳類に送達し、該哺乳類で前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生を誘導する方法である。前記方法は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記組成物はＭＨＣクラスＩＩで仲介されるヘルパーＴ細胞の活性化を誘導するために有効量の組成物であり、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原か、該少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸かとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸か、又は、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸か、又は、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、前記組成物を前記哺乳類に投与することが、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらす。ある実施態様では、前記哺乳類はがんを有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原はがん抗原であり、前記組成物は前記がんに対するワクチンである。典型的に、前記組成物を投与することは前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じない。もう１つの実施態様では、前記哺乳類は感染性疾患を有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原は感染性病原体由来であり、前記組成物は典型的に前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じない前記感染性病原体に対するワクチンである。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、ポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されること、及び／又は、薬学的に許容可能な担体、及び／又は、油中水型エマルジョンを含むことが可能である。
【００１３】
本方法の１つの実施態様では、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥエピトープ、例えば、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープである。また、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能である。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートされることが可能である。前記組成物は第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含むことが可能であり、該第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。
【００１４】
抗体を産生し、採取するための１つの実施態様では、前記哺乳類は、げっ歯類又はウサギであることが可能であり、前記モノクローナル抗体は前記哺乳類から採取される。本実施態様では、前記モノクローナル抗体は、前記哺乳類から前記抗体を採取するステップと、前記抗体のタイターを測定するステップと、前記哺乳類から脾臓を摘出するステップと、ミエローマとの融合を実行するステップとによって調製される。前記抗体はヒト化されることが可能である。
【００１５】
さらに、本明細書記載の発明は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物であって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることが可能であり、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられるであることが可能である。
【００１６】
その上さらに、本明細書記載の発明は、ｓｉＲＮＡをプロフェッショナル抗原提示細胞に送達する方法であって、該方法は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートする少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を提供するステップと、哺乳類の被験体に前記組成物を投与するステップとを含み、前記組成物を提供するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、前記投与するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートしている前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に結合し、前記ｓｉＲＮＡが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に入る条件下で前記組成物を投与する。前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能であり、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられるであることが可能である。１つの実施態様では、前記ｓｉＲＮＡは、前記プロフェッショナル抗原提示細胞でＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１の発現を妨げる。
【００１７】
その上さらに、本明細書記載の発明は、哺乳類において、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞（リンパ腫又はリンパ腫の一部分）の増殖を抑制するか、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するかの方法である。本方法は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドをコンジュゲートし、タンパク質をエンコードする核酸によって結合した少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーにおいて、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞に特異的に結合し、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸又は該核酸によってエンコードされるタンパク質との組み合わせが、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞の増殖の抑制か、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスの誘導かをするように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、結合される。前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、例えばＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能である。しかし、適切な陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー及びＴヘルパーペプチドのいずれかが用いられることが可能である。
【００１８】
本明細書に記載されているような核酸を細胞に送達するための方法は、少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を細胞に接触させるステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープが前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。本方法では、前記ペプチド又はタンパク質は前記細胞内で典型的に発現される。適切な陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー及びＴヘルパーペプチドのいずれかが用いられることが可能であるが、前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、例えばＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能である。
【００１９】
本明細書に記載されているような核酸を細胞に送達するための組成物は、少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含み、該少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることが可能であり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは、例えばＰＡＤＲＥであることが可能である。しかし、適切な陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマー及びＴヘルパーペプチドのいずれかが用いられることが可能である。
【００２０】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者の一般的な理解と同一の意味を有する。
【００２１】
本明細書において、「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のような２以上のヌクレオチドの鎖、及び化学的に改変されたヌクレオチドを意味する。「精製された」核酸分子は、核酸が天然に存在する細胞又は生命体の他の核酸配列から実質的に分離された核酸分子である （例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％夾雑物を含まない）。前記用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換え核酸分子、プラスミド、ウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノム（全遺伝情報）を含む。精製された核酸の例は、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で製造される核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理で形成される核酸、組換え核酸、化学的に合成される核酸分子を含む。「組換え」核酸分子は、例えば、化学合成によって、又は、分離された核酸セグメントの遺伝子工学技術による操作によって、分離した別の２つの配列セグメントの人工的組み合わせで製造される核酸分子である。
【００２２】
ペプチド、オリゴペプチド、又はタンパク質のアミノ酸残基の引用において、「アミノ酸（置換）基」、「アミノ酸」、及び「（置換）基」の用語は相互代替的に使用され、本明細書において、アミノ酸又は少なくとも一つの他のアミノ酸若しくはアミノ酸様化合物にアミド結合又はアミド様結合で共有結合したアミノ酸様化合物を意味する。
【００２３】
本明細書において、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、例えば、長さ、及び、糖鎖付加やリン酸化のような翻訳後の修飾にかかわらず、アミノ酸のいかなるペプチド連結鎖を意味する同義語として使用される。
【００２４】
核酸分子、ポリペプチド、又は感染性病原体の引用において、「自然の（ｎａｔｉｖｅ）」は自然に存在する（例えば、野生型）核酸、ポリペプチド、又は感染性病原体である。
【００２５】
本明細書において「抗原」又は「免疫原」は抗体によって特異的に認識され、結合する分子を意味する。
【００２６】
エピトープ（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）の引用においては、生物活性によって適当なＭＨＣ分子へ結合し、ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）反応の刺激に対して有用なペプチドの場合に標的抗原又は抗原様分子に対するＴヘルパー反応及びＣＴＬ反応を誘導する能力を意味する。
【００２７】
「特異的結合」及び「特異的に結合する」の用語は、酵素／基質、受容体／アゴニスト、抗体／抗原等の対となる種の間で起こり、共有的若しくは非共有的相互作用、又は、共有的若しくは非共有的相互作用の組み合わせで介在される結合である。２つの種の相互作用が非共有結合複合体を作る場合、発生する結合は、典型的に、静電気的、水素結合、又は疎水結合の結果である。従って、「特異的結合」は、抗体／抗原、酵素／基質相互作用の特徴を有する結合複合体を作る２者間相互作用存在の一対の種の間で起こる。特に、特異的結合は、一対の中の１つのメンバーが特定の種と結合し、相応のメンバーが属する化合物ファミリーの中の他のいかなる種とも結合しないことによって特徴化される。
【００２８】
本明細書において、「Ｐａｎ−ＤＲエピトープ」、「Ｐａｎ−ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ」、「ＰＡＤＲＥ」及び「ＰＡＤＲＥペプチド」は、最も一般的な１２のＤＲアレル（ＤＲ１、２ｗ２ｂ、２ｗ２ａ、３、４ｗ４、４ｗ１４、５、７、５２ａ、５２ｂ、５２ｃ及び５３）中の少なくとも約７つのＤＲアレルと高親和性で結合できる約４及び約２０の間の置換基のペプチドを意味する。「高親和性」は本明細書において２００ｎｍ未満のＩＣ５０％での結合と定義される。例えば、高親和結合は、３１００ｎＭ未満のＩＣ５０％での結合を含む。クラスＩＩＭＨＣとの結合に対して、１０００ｎｍの結合親和性閾値は典型的であり、１００ｎｍ未満の結合親和性は一般的に高親和結合と一般的に考えられる。ＰＡＤＲＥペプチドの構築と使用は、米国特許５７３６１４２号公報に詳細に記載され、本明細書に引用として取り込まれる。
【００２９】
「Ｔヘルパーペプチド」は本明細書においてＴヘルパー細胞のＴ細胞受容体によって認識されるペプチドである。例えば、本明細書記載のＰＡＤＲＥペプチドはＴヘルパーペプチドである。
【００３０】
本明細書で使用される用語「デンドリマー」は、荷電（例えば、陽荷電、陰荷電）し、高分枝の、概して球形のポリマー高分子である。陽荷電性高分枝のポリマーデンドリマーの例として、ＰＡＭＡＭデンドリマーがある。「ＰＡＭＡＭデンドリマー」及び「ポリアミドアミンデンドリマー」の用語によって、分枝点に３級アミンが存在し、構造的な層の間の結合がアミド置換基によって作られるデンドリマーの型を意味する。
【００３１】
「ＰＡＭＡＭデンドリマー」及び「ポリアミドアミンデンドリマー」の用語によって、分枝点に３級アミンが存在し、構造的な層の間の結合がアミド置換基によって作られるデンドリマーの型を意味する。ＰＡＭＡＭデンドリマーはその表面に多数の陽荷電を示す。
【００３２】
用語「誘導体化デンドリマー」は、その表面に１以上の置換基を有するデンドリマーを意味する。
【００３３】
「ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー」又は「ＰＡＤＲＥデンドリマー」は、荷電（例えば陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭデンドリマー）表面の置換基にＰＡＤＲＥペプチドが共有結合したナノ構築物である。
【００３４】
用語「コンジュゲートされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」は、１分子又は化学物質の物理的又は化学的に他の分子又は化学物質への結合又は接着を意味する。コンジュゲートの例は、共有的連結及び静電気的な複合体形成を含む。用語「複合体形成した」、「との複合体」、及び、「コンジュゲートされた」は本明細書において相互代替的に使用される。
【００３５】
本明細書において、語句「配列相同性」は、サブユニットの一致を最大化するように整列した、即ち、ギャップと挿入を考慮し、２つの配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）の相同位置の同定サブユニットのパーセンテージを意味する。「配列相同性」は、配列分析ソフトウェア（例えば、カリフォルニア州サンディエゴ、Ａｃｃｅｌｒｙｓの配列分析ソフトウェア）によって測定できる。
【００３６】
語句「単離した」又は「生物学的に純粋な」は、自然な状態において一般的に付随する構成要素が実質的にない物質である。
【００３７】
本明細書において、「ナノ粒子」は、ナノメーターで計測される大きさの微視的な粒子を意味する。例えば、ナノ粒子は、概ね総直径２−５００ｎｍの範囲のＰＡＤＲＥデンドリマーコンジュゲート体、又は、核酸若しくはアミノ酸物質といくつかのＰＡＤＲＥデンドリマーコンジュゲート体とを組み合わせた粒子である。
【００３８】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体を含み、該抗体は、溶解又は結合形態で、公知の技術、例えば、これに限定されない酵素的開裂、ペプチド合成、又は組換え技術によって提供される当該抗体の断片、領域、及び誘導体と同様に標識可能なものを意味する。
【００３９】
本明細書において、用語「アジュバント」は、体液性及び／又は細胞性免疫応答を亢進するように調製するいかなる物質を意味する。
【００４０】
本明細書において、用語「表示された（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）」又は「表面に暴露された」は同義語と考え、ナノ粒子（例えばＰＡＤＲＥデンドリマー）のような構造の外表面に存在する（例えば、免疫サイト認識に到達可能な抗原又は他の分子である）抗原又は他の分子である。
【００４１】
用語「多価の」は、１以上の複製又は抗原の型又は分子がナノ粒子上に表示されることを意味する。
【００４２】
本明細書において、「ワクチン」は予防的及び治療的なワクチンの全てを包含する。ワクチン組成物は、本明細書において、イン・ビボで生物学的に互換的な形態での被験体への投与に適する。本発明における「イン・ビボでの生物学的に互換的な投与に適した形態」の表現は、治療効果が毒性作用を上廻る投与物質の形態を意味する。当該化合物はいずれの動物（例えばヒト）に投与されても良い。本発明のある実施態様において、哺乳類（例えば、げっ歯類又はウサギ）に特定の抗原に対するモノクローナル抗体を製造するためにワクチンが投与される。
【００４３】
「免疫応答」の語句によって、抗原又は複数の抗原に対する抗体、及び／又は、免疫細胞介在応答の誘導が意味される。免疫応答の誘導は、抗原投与生体の免疫原性の体質、化学組成、及び、抗原の構造、並びに、抗原投与の方法及び期間を含む多くの要因に依存する。免疫応答は多くの様相を有し、その一部は免疫システムの細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、及び、プラズマ細胞）によって示される。免疫システムの細胞は、抗原若しくは免疫系の他の細胞との相互作用、サイトカインの放出及びこれらのサイトカインとの反応性を通して関与しても良い。免疫応答は一般的に、体液性及び細胞性の２つの主要なカテゴリーに分けられる。体液性免疫応答の構成要因として、抗原に特異的な抗体の産生を含む。細胞介在の要因としては抗原に対して遅発型過剰感受性で細胞障害性エフェクター細胞の産生を含む。
【００４４】
語句「治療的有効量」及び「有効的な投与量」は、治療的（臨床的）に望ましい結果を生むために十分な量を意味し、結果の正確な性質は、処置される障害の性質に依存して変動する。例えば、処置される障害はがんであり、その結果は、がん性腫瘍を含むがん細胞の排除が可能である。本発明における、組成物及びワクチンは１日当たり１回以上から１週間投与当たり１回以上の投与が可能である。当業者は、これに限定されない病気又は障害の重篤性、過去の処置、全体的な健康及び／又は被験体の年齢、罹患疾患を含む被験体への効果的な処置に必要な投与量及びタイミングに影響する要因を理解するであろう。さらに、本発明の組成物又はワクチンの治療的に有効な量での処置は、１回の処置又は連続処置を含む場合がある。
【００４５】
本明細書において、用語「処置」は、本発明における又は本発明の方法によって同定される、治療剤の患者への投与若しくは適用、又は、病気、病気の症状を持つ、若しくは病気の素因を持つ患者から単離された組織若しくは細胞系列への、治療剤の、病気、病気の症状、病気の素因を、治す、癒す、緩和する、和らげる、変化する、救う、改善する、好転する若しくは作用する目的での、適用若しくは投与と定義される。
【００４６】
用語「患者」、「披験体」、「個体」は、本明細書において相互代替的に使用され、ヒト患者が望ましい処置を受ける哺乳類披験体を意味する。ある事例においては、本発明の方法は、非ヒト霊長類と同様に、マウス、ラット、及びハムスターに限定されないげっ歯類を含み、動物実験、獣医学的応用、動物疾患モデルの展開での使用を認める。
【００４７】
本発明と同様の又は同等のワクチン、組成物、キット及び方法は、本発明の実施又は試験として使用できるが、好適なワクチン、組成物、キット及び方法は以下に記載される。本明細書記載の全ての出版物、特許出願、及び、特許は、引用によって全体として本明細書に取り込まれる。矛盾する場合は、本明細書が定義を含めて調整する。以下に議論する特定の実施態様は例証するためのものであり、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】プラスミドと混合、又は、標的ＡＰＣ（抗原提示細胞）に対するペプチド若しくはポリペプチド抗原と連結したＰＡＤＲＥ−デンドリマーの概要図である。
【図２】イン・ビトロでの、赤色蛍光色素でタグ付けした短い核酸配列とＰＡＤＲＥ−デンドリマーとの複合体の送達を示すヒトＢ細胞の解析の一連のドット・プロット・サイトメトリーの分析図である。
【図３】イン・ビボにおけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーのＤＮＡ送達を表す写真である。
【図４】ＧＦＰ又はＯＶＡをエンコードするプラスミド皮下投与で免疫されたＣ５７ＢＬマウスの血清での、ＥＬＩＳＡ（左図）又はＦＬＩＳＡ（右図）で評価された腫瘍に対する効果を示すグラフである。
【図５】Ｂ１６メラノーマ細胞（上段）又はＴＳＡ（下段）が移植されたマウスにおけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーの腫瘍に対する治療効果を示すグラフである。
【図６】ヒトＢ細胞（上段図）とヒト末梢単核球細胞（ＰＢＭＣ）（下段図）にいて、デンドリマー−ＰＡＤＲＥとＧＦＰプラスミド（５μｇ）との複合体を共培養したＧＦＰ発現のフロー・サイトメトリーヒストグラムである。
【図７】イン・ビトロでのタンパク質、アルブミン−ＦＩＴＣのＰＤＤ（ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー）によるヒトＢ細胞への送達を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。右側の写真はＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体添加後1時間のＢ細胞によるアルブミン取り込みの蛍光写真である。
【図８】リンパ節でのイン・ビボＤＣ（樹状細胞）標的を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。左図は、実験操作の時間概念図を表し、右図は、ＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入部位に接するリンパ節に対するフロー・サイトメトリー・ドット・プロットを表す。
【図９】ＤＲＨＡ（デンドリマーＨＡ）、異なったＴヘルパーエピトープで修飾されたデンドリマーのＤＣ（樹状細胞）へのＧＦＰトランスフェクションの促進を表すグラフを示す。
【図１０】赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとの複合ＰＡＤＲＥ−デンドリマーでトランスフェクトされたヒトＢ細胞の顕微鏡写真である。
【図１１】赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとデンドリマー複合体（左図）、及び、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとＰＡＤＲＥ−デンドリマーとの複合体でトランスフェクトされた（右図）、ヒヒ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の顕微鏡写真である。
【図１２】プラスミドをエンコードするデンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトしたヒヒ末梢血単核球（左図）、及び、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトした細胞（右図）の顕微鏡写真を表す。
【図１３】ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのプラスミド（ＤＲＰ−ｏｖａプラスミド）複合体のワクチン接種とイン・ビボ電気穿孔法（ＥＰ−ｏｖａプラスミド）との比較を表すグラフである。
【図１４】ＰＤＤ／プラスミド−ＰＣＡＲＤ抗原の２つで免疫したマウスの高タイター抗体反応誘発を示すイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの写真である（左図：抗原をエンコードするプラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞、右図：対照プラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞）。
【図１５】ＰＤＤ／プラスミドの２つで免疫されたマウスの高タイター抗体反応誘導を表すイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートのグラフと写真である。
【図１６】ＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで１回免疫し、更にＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで２回免疫することにより抗体反応を誘導した免疫マウスの血清イン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの写真である。
【図１７】Ｇ５デンドリマー、コンジュゲート体、及び、ペプチドのＵＶ−可視スペクトルを表すグラフである。
【図１８】ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡ プラスミドの予防的ワクチン接種のＢ１６／ＯＶＡ腫瘍に対する効果を示すグラフである。
【００４９】
図１は、プラスミドと混合、又は、標的ＡＰＣ（抗原提示細胞）に対するペプチド若しくはポリペプチド抗原と連結したＰＡＤＲＥ−デンドリマーを示す一対の概要図である。図１は、本明細書に記載されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーがいかなる関心抗原又はいかなる関心抗原をエンコードする核酸を取り込むことが可能なプラットフォームを提供することを表す。本明細書におけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれるようにデザインされた生来の免疫力の活性化剤である。
【００５０】
図２は、イン・ビトロでの、赤色蛍光色素でタグ付けした短い核酸配列とＰＡＤＲＥ−デンドリマーとの複合体の送達を示すヒトＢ細胞の解析についての一連のドット・プロット・サイトメトリー画像である。該核酸は、哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド送達最適化の評価促進のためのＲＮＡｉ解析での使用のためにデザインされた赤色蛍光標識ｄｓＲＮＡである。細胞は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／多ヌクレオチド複合体又は対照と共に、培地を除去し、新鮮な培地を添加し、4時間共培養された。画像は、精製ヒトＢ細胞へのＡｌｅｘａ Ｆｕｏｒ標識ｄｓＲＮＡオリゴマーの送達を示す。第４カラムの最下段の画像は、約９．２％の細胞でのオリゴ送達を示す。
【００５１】
図３は、イン・ビボにおけるＰＡＤＲＥ−デンドリマーのＤＮＡ送達を表す一連の写真である。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−プラスミド複合体が皮膚（全５μｇプラスミド）及び角膜（１μｇ／角膜）に注入された。麻酔されたマウスの肝臓のステレオ蛍光顕微鏡画像が撮影された。左の画像は皮膚でのＧＦＰ発現が、右の画像は角膜でのＧＦＰ発現を示す。
【００５２】
図４は、確立された腫瘍の処置を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬマウスが、ＧＦＰ（１回）又はＯＶＡ（２回）をエンコードするプラスミドの皮下投与で免疫された。３匹の血清が採取され、ＥＬＩＳＡ（左図）又はＦＬＩＳＡ（右図）が実施された。
【００５３】
図５は、確立された腫瘍のＰＡＤＲＥ−デンドリマー治療についての一対のグラフを示す。Ｂ１６メラノーマ細胞（上段）又はＴＳＡ（下段）が移植されたマウスが、腫瘍移植後２日目又は３日目にワクチン接種され、１週間後に追加免疫された。
【００５４】
図６は、ヒト末梢単核球細胞（ＰＢＭＣ）（下段図）、ヒトＢ細胞（上段図）のデンドリマー−ＰＡＤＲＥとＧＦＰプラスミド（５μｇ）との複合体を共培養したＧＦＰ発現の一連のフロー・サイトメトリーヒストグラムである。デンドリマー／ＧＦＰ複合体が対照（左ヒストグラム）として使用された。
【００５５】
図７は、イン・ビトロでのタンパク質、アルブミン−ＦＩＴＣのＰＤＤ（ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー）によるヒトＢ細胞への送達を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。左画像は、精製ヒトＢ細胞へのＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ送達を表す。ヒト精製Ｂ細胞が採取され、ＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣと共培養された。左ヒストグラムはヒトＢ細胞に添加後のＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ送達を示す。上段のヒストグラムはＢ細胞単独を、中段のヒストグラムはデンドリマー／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体を、下段のヒストグラムはヒトＢ細胞添加ＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体の結果を表す。右写真はＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣ複合体添加後1時間のＢ細胞によるアルブミン取り込みの蛍光写真の画像である。
【００５６】
図８は、リンパ節でのイン・ビボＤＣ（樹状細胞）標的を示す一連のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットである。左画像は、注入、リンパ節摘出、及び解析の時間概念図を表し、右画像図は、ＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入部位に接するリンパ節細胞から得られるナイーブのリンパ節に対するデータ解析の一対のフロー・サイトメトリー・ドット・プロットを表す。これらの画像は、リンパ節近接の注入部位のマウスＤＣ及びＢ細胞のイン・ビボＰＡＤＲＥ−デンドリマーの効果を表す。リンパ細胞はＣＤ１１ｃ（ＤＣマーカー）、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ２０（Ｂ細胞マーカー）で染色した。右上段のヒストグラムは、デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入がＤＣの約６％にＧＦＰを発現する結果を、下段ドットプロットは明確にＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド注入がＤＣ＞７０％でＧＦＰを発現する結果を示す。
【００５７】
図９は、ＤＲＨＡ（デンドリマーＨＡ）、異なったＴヘルパーエピトープで修飾されたデンドリマーを表す一対のグラフを示し、イン・ビボ標的リンパ節がＤＲＨＡによりＤＣ（樹状細胞）へのＧＦＰトランスフェクションを促進することを表す。本実験は、Ｂａｌｂ／ｃマウスがＩａｄ制限ＨＡペプチドコンジュゲートデンドリマーと連動して使用される点が相違するが、図８と同様である。ＤＲＨＡ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入部位に接するリンパ節、及び、ナイーブなリンパ節が、ＤＲＨＡ／ＧＦＰ−プラスミド又はデンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド注入後５日目に摘出された。チャートは、ＤＣに対してＣＤ１１ｃ（ＤＣマーカー）で染色後のリンパ節細胞から得られたデータのフロー・サイトメトリー解析結果を表す。上段の図は、既に示した処置マウスの流入領域リンパ節に認められるＧＦＰ陽性ＤＣ数を表す。下段の図は、ＤＣ中のＧＦＰ蛍光強度の平均を表す。これらの結果は、ＤＲＨＡがイン・ビボでトランスフェクトされたＤＣ数を増加するだけではなく、細胞に入るプラスミド分子の数の増加を明確に示す。
【００５８】
図１０は、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーオリゴとの複合ＰＡＤＲＥ−デンドリマーでトランスフェクトされたヒトＢ細胞の顕微鏡写真である。
【００５９】
図１１は、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとのデンドリマー複合体でトランスフェクトされた（左図）、及び、赤色（Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ）標識ｄｓＲＮＡオリゴマーとのＰＡＤＲＥ−デンドリマー複合体でトランスフェクトされた（右図）、ヒヒ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の一対の顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡写真は、ＰＤＤ／ｄｓＲＮＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｕｏｒ又は対照複合体をヒヒ末梢血単核球に対して添加後2時間に撮影された。画像は、サル末梢血単核球へのＰＤＤを介した多ヌクレオチドの標的送達の高い効果を表す。
【００６０】
図１２は、プラスミドをエンコードするデンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトしたヒヒ末梢血単核球（左図）、及び、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトした細胞（右図）の一対の顕微鏡写真を表す。プラスミドをエンコードするデンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトしたヒヒ末梢血単核球（左図）、及び、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー−ＧＦＰ複合体をトランスフェクトした細胞（右図）。蛍光写真画像は、ヒヒＰＢＭＣにＰＤＤ／ＧＦＰ−プラスミド又は対照複合体を添加後１日に撮影された。本画像は、プラスミドの標的送達の高い効果とＰＤＤを介したプラスミドによってエンコードされた遺伝子発現を表す。
【００６１】
図１３は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのプラスミド（ＤＲＰ−ｏｖａプラスミド）複合体のＤＮＡワクチン単回接種がプラスミドのイン・ビボ電気穿孔法（ＥＰ−ｏｖａプラスミド）に優ることを表す結果のグラフである。
【００６２】
図１４は、ＰＤＤ／プラスミド−ＰＣＡＲＤ抗原の２つで免疫したマウスの高タイター抗体反応誘発を示す免疫マウス血清を使用するイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの一対の写真である。マルチウェルプレートは、抗原をエンコードするプラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞（左図）及び対照プラスミドをトランスフェクトしたｃｏｓ−７細胞（右図）を含んでいる。
【００６３】
図１５は、ＰＤＤ／プラスミドの２つで免疫したマウスの高タイター抗体反応誘導を表す免疫マウス血清を使用するイン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートのグラフと一連の写真である。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのＧＦＰ又はｏｖａをエンコードするプラスミド複合体で１回免疫した、又は、ＰＡＤＲＥ-デンドリマーのＣＣＲ５、ｖｇＰＣＲ、ＣａｔｈＬ、若しくはｐ２をエンコードするプラスミドとの複合体で２回免疫したイン−セル・ウエスタン・ＦＬＩＳＡの結果を表す。
【００６４】
図１６は、ＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで１回免疫し、更にＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲで２回免疫することにより抗体反応を誘導した免疫マウスの血清を使用したマウス、イン−セル・ウエスタン・アッセイのマルチウェルプレートの一対の写真である。これらの結果は、ＰＤＤ／プラスミド−ＶｇＰＣＲでの単回免疫が、追加免疫で高められる抗体反応に結びつくことを示す。
【００６５】
図１７は、Ｇ５デンドリマー、コンジュゲート体、及び、ペプチドのＵＶ−可視スペクトルを表すグラフである。
【００６６】
図１８は、本明細書で（ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡ プラスミド）と記載されるワクチン接種の予防的な設定でＢ１６／ＯＶＡ腫瘍の撲滅を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な説明
本明細書に、イン・ビボでのワクチン接種及び抗体（例えば、モノクローナル抗体）製造のための１又は２以上の抗原の効果的な送達を目的に、及び、ＰＡＰＣ（プロフェッショナル抗原提示細胞）又はＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞（例えば、腫瘍細胞）へのペプチドか、タンパク質か、ｓｉＲＮＡか、ＲＮＡ又はＤＮＡかの効果的な送達を目的に、ナノ粒子に基づくワクチンと、組成物と、キットと、及び、方法とが記載されている。典型的なワクチン又は組成物において、荷電（例えば陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマーは、ＭＨＣ標的で、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）のような免疫原性ペプチドにコンジュゲートされ、披験体における特定の抗原に対する免疫応答を誘導するための少なくとも１つの分子にコンジュゲート又は結合される。前記分子は、細菌性、真菌性、原生動物、若しくはウイルス起源のタンパク質若しくはペプチド、又は、これらの抗原、炭化水素、若しくはペプチド様炭化水素由来のフラグメントであっても良い。該分子は、自己免疫疾患処置のための自己抗原を含んでも良い。さらに、抗原性分子は、少なくとも１つの抗原をエンコードする哺乳類のプラスミドを含む１以上の核酸であっても良い。例えば、抗原は、披験体（例えば哺乳類）において、１以上の免疫原性ペプチドを発現して、該発現タンパク質に対する強く特異的な免疫応答の誘導に結びつく１以上の核酸であっても良い。別の例として、抗原は、プロセシングされて提示される免疫原性のペプチド又はポリペプチドであっても良い。荷電（例えば、陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマーは２以上の異なる抗原にコンジュゲートされることが可能であり、同様に、各々異なる抗原をエンコードする２以上の核酸とコンジュゲートすることが可能である。本明細書において、ワクチン又は他の組成物は、一つの型の抗原をコンジュゲートした複数の荷電（例えば、陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、特定の抗原の５つの複製をコンジュゲートした５つのデンドリマー）、又は、異なる抗原の複数にコンジュゲートされた荷電（例えば、陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、５つの異なる抗原に対する５つのデンドリマー）を含むことができる。該デンドリマーは、デンドリマー（陽性）と抗原（陰性）との反対の電荷に基づき、抗原（核酸又はタンパク質）との複合体（コンジュゲート）を作る。又は、コンジュゲートは共有的な化学結合の場合がある。
【００６８】
１つの実施態様として、本明細書に記載されるように、イン・ビボで抗原を送達するためのナノ粒子に基づく方法は、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡ等のようなエピトープ）のようなＭＨＣ標的又は免疫原性ペプチドとコンジュゲートし、荷電（例えば陽荷電）性高分枝ポリマーデンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー（ＰＤＤ））に対して、結合する抗原、又は、コンジュゲートするポリペプチド又は抗原性ペプチド若しくはポリペプチドをエンコードするＤＮＡプラスミドによって組成されるワクチンの注入を含む。陰性に荷電したプラスミドは、自然に、陽性に荷電したＰＡＤＲＥ−デントリマーに結合する、一方、ペプチド又はポリペプチド抗原は、もし陰性に荷電していないならば、化学的にＰＡＤＲＥ−デンドリマーに連結される。別の実施態様において、デンドリマーは、陽荷電性のタンパク質及びペプチドと結合するために陰性に荷電している。表面に暴露された抗原又は抗原をエンコードする核酸は、いかなる好適な公知の手段によって、デンドリマーにコンジュゲートされても良い。コンジュゲート方法は、自然のイオン的、非イオン的、静電気的結合又は共有結合のどれであっても良い化学的な複合体形成を含む。本明細書において、Ｔヘルパーエピトープにコンジュゲートされたデンドリマーは、多価であることが可能であり、抗原の１以上の複製若しくは型、又は核酸を表面に提示できる。多価の、又は、凝集した抗原（又は抗原をエンコードする核酸）の存在は、披験体の免疫応答を高める。抗原又は核酸の型の１以上の複製は、２以上の分離したリンカー若しくはスペーサー、又は共通のリンカー若しくはスペーサーを介してデンドリマーに接着できる。本明細書の組成物、キット及びワクチンは予防的及び処置的の両方の適応を有する。即ち、披験体の病気又は疾患の発症を防止する予防薬として使用できる。いかなる感染病原体又はがんに対する免疫応答を備えるために、本明細書記載のワクチンが使用可能である。
【００６９】
本明細書において、治療剤は単核球、特にＢ細胞を標的として使用でき、同時発生慢性リンパ球性白血病及び多発性骨髄腫に使用できる。本明細書において、ナノ粒子（例えば、ＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマー）と治療剤（医薬品）との組み合わせが複数の形態、例えば、治療剤とナノ粒子の混合物で使用できる。本明細書に記載するナノ粒子の組み合わせ（例えば、ＰＡＤＲＥ-誘導体化デンドリマー）及び治療剤（例えば、医薬）は、例えば、治療剤とナノ粒子との混合物、複合体形成のための静電的結合、治療剤のナノ粒子への化学的コンジュゲート等、いくつかの形態で使用しても良い。治療薬の例として、毒素、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、（例えば、腫瘍抑制遺伝子、自殺遺伝子（例えば、ＴＫ）、又は、腫瘍の増殖及び／又は生存を遮断又は変化させるいかなる遺伝子をエンコードする）プラスミド、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、抗体、メルファラン、プレドニゾン、サリドマイド（ＭＰＴ）、ベルケード（登録商標）（ボルテゾミブ）（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レナリドミド、及び、デキサメタゾン、又は、これらの組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００７０】
同様に、本明細書記載の組成物及び方法は、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞を含む免疫細胞に治療薬が到達する（送達される）自己免疫疾患の治療に使用されても良い。本明細書記載の組成物は、陰荷電性で本明細書に記載のナノ粒子との複合体を生成するポリＩ．Ｃ．（しかし、これに限定されない）のようなアジュバントとともに使用されても良い。
【００７１】
下記の好ましい実施態様は、これらの組成物, ワクチン、キット及び方法の適用を表す。それにもかかわらず、これらの実施態様の記載から下記の記載に基づいて発明の他の側面が作られ、及び／又は、実践する場合がある。
【００７２】
生物学的方法
ここで、従来の分子生物学的技術を含む方法を記載する。このような技術はＳａｍｂｒｏｏｋら著「分子クローニング：研究室マニュアル 第三版、１−３巻」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．、２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌら著「分子生物学の現在のプロトコール」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．１９９２年（定期出版物））のような方法論の文献や専門書に詳細に記載され公知である。免疫学的技術は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｗ．Ａｌｔ著「免疫学の進歩、第９３巻」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、２００７）、Ｇａｒｙ Ｃ Ｈｏｗａｒｄ 及びＭａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｋａｓｅｒ編集「抗体の作製と使用 実践的ハンドブック」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌ、ロンドン、英国）、Ｇａｂｒｉｅｌ Ｖｉｒｅｌｌａ著「医学免疫学 第６版」（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、英国、２００７年）、及び、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ著「抗体、研究室マニュアル」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．、１９８８）のような文献や専門書に詳細に記載され公知である。遺伝子導入、及び遺伝子治療の従来の方法は本発明に適用されても良い。例えば、Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ「遺伝子治療：原理と応用」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９９）、及びＰ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ著「遺伝子治療プロトコール（分子医学の方法）」（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９７年）を参照のこと。ワクチン製造の方法とワクチン投与は、例えば、Ａｎｄｒｅｗ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｍａｒｔｉｎ Ｐ．Ｃｒａｎａｇｅ 及びＭｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｈｕｄｓｏｎ著「ワクチン・プロトコール（分子医学の方法）第２版」（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３年）、Ｍａｎｍｏｈａｎ Ｓｉｎｇｈ著「ワクチン、アジュバント及び送達システム 第１版」（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２００７年）、Ａｒｖｉｎ Ａ．Ｍ．及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｈ．Ｂ．著、Ｖｉｏｌｏｇｙ、３４４:２４０-２４９、２００６年、Ｒ．Ｍｏｒｅｎｗｅｉｓｅｒ著、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｓｕｐｐｌ．１: Ｓ１０３−Ｓ１１０, ２００５年のような文献に詳細に記載され公知である。ＰＡＭＡＭデンドリマーと同様にワクチンの構築と使用は、例えば、Ａｒａｓｈｋｉａら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ４０ （１）:４４−５２, ２０１０年； Ｖｅｌｄｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６:５３６６-５３７３, ２００１年； 及び、Ｓ．Ｃｈａｕｈａｎ、Ｎ．Ｋ．Ｊａｉｎ、Ｐ．Ｖ．Ｄｉｗａｎ（２００９年）「マウスにおけるＰＡＭＡＭデンドリマーの前臨床及び行動毒プロフィール」（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ａ、数学、物理学、工学科学（オンライン出版日２００９年１２月３日）に記載されている。
【００７３】
核酸、ペプチド、ポリペプチドとのコンジュゲート体 デンドリマーの合成
デンドリマーは濃密なＤＮＡの骨格（ｓｃｈａｆｆｏｌｄ）として作用し、完全に陽荷電したデンドリマーは陰荷電性のＤＮＡ又はＲＮＡとの強い電気的相互作用の発生に対して好ましい。例えば、デンドリマー／Ｔヘルパーエピトープ／ＤＮＡ複合生成物は、調整可能なＮ／Ｐ比率（アミンに対するリン酸、又は、荷電比率）に依存する正味の荷電を有する。本明細書において、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞（ＰＡＰＣ）に特異的に結合するように、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド、及び、抗原、核酸又はｓｉＲＮＡがデンドリマーの外表面にコンジュゲートされていることを特徴とし、該Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）及び、抗原、抗原をエンコードする核酸又はｓｉＲＮＡをコンジュゲートするデンドリマーが記載される。一つの実施態様において、デンドリマーは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５個等）のＰＡＤＲＥペプチド、及び、ペプチド又はポリペプチド抗原にコンジュゲートされている。本実施態様において、デンドリマーは、典型的には、複数のペプチド又はポリペプチド抗原とコンジュゲート又は結合している。いくつかの抗原（例えば、複数の同一抗原）とのコンジュゲート又は結合は、抗原がハプテン関連の大きさの問題により効果的な免疫応答を誘導できない小さい抗原（特に、小ペプチド又は糖質）の場合に、特に有用である。本明細書に記載のデンドリマー／Ｔヘルパーエピトープ／核酸コンジュゲート体が抗原の多くの複製を含むことは、抗原の免疫原性を向上できる。もう一つの実施態様において、デンドリマーは、ＰＡＤＲＥペプチドとコンジュゲートし、抗原をエンコードする核酸と結合する。さらにもう一つの実施態様において、デンドリマーは、ＰＡＤＲＥペプチドとコンジュゲートし、関心遺伝子に対するｓｉＲＮＡを結合する。これらの実施態様において、いかなる有用な方法によってデンドリマーが調製され、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド及びインフルエンザＨＡのようなエピトープ）をコンジュゲート、及び、核酸（例えば、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡ）と結合できる。デンドリマーを製造し、使用する方法は、例えば、引用文献として両方が本明細書に取り込まれるＺｈａｎｇ Ｊ−Ｔら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００４、４、５７５-５７８、並びに、米国特許４２１６１７１号公報及び５７９５５８２号公報の文献に記載され周知である。Ｄ．Ａ．Ｔｏｍａｌｉａ、Ａ．Ｍ．Ｎａｙｌｏｒ，及び、Ｗ．Ａ．Ｇｏｄｄａｒｄ ＩＩＩ「星型デンドリマー：サイズ、形、表面科学、トポロジー、及び、柔軟性の原子から大分子までの分子レベルの調節」Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ２９ （１９９０年）、 １３８-１７５を参照のこと。本明細書記載の実験において、ＰＡＭＡＭ−デンドリマーが使用された。しかしながら、いかなる適正な陽荷電性高分枝ポリマーデンドリマーを使用できる。付加的な陽荷電性高分枝ポリマーデンドリマーは、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー又はより一般的に表面に１級アミノ基を有する他のいかなるデンドリマーを含む。
【００７４】
本明細書に記載されているＰＡＤＲＥ−デンドリマー （ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー）は、適正な方法によって調製される。例えば、米国特許５７３６１４２号公報を参照のこと。米国特許５７３６１４２号公報に記載されたＰＡＤＲＥペプチドを製造するために、Ｊａｄｅｔｚｋｙらが最初に記載した戦略（ＥＭＢＯ Ｊ ９：１７９７−１０８３、１９９０年）、即ち、１３置換基のポリアミンに挿入されるＭＨＣに結合するために重要な側鎖を含むアンカー置換基が使用された。ＰＡＤＲＥペプチドは、例えば、米国特許５７３６１４２号公報に記載された方法に従って調製可能、又は購入可能（例えば、Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｎｔ、ＣＡ）である。相対的に小さいサイズのため、ＰＡＤＲＥペプチドは溶液又は固体支持体上で従来法に従って合成可能である。種々の自動合成装置が商業的に利用可能であり、公知のプロトコールに従って使用可能である。それに代わって、組換えＤＮＡ技術が、Ｔヘルパーエピトープをエンコードする配列の発現ベクターへの挿入、変換、又は、適切な宿主細胞へのトランスフェクト、発現のための適性条件下での培養のために使用されても良い。これらの操作は、本明細書に引用文献として取り込まれるＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（上記）に記載され、公知技術である。本明細書に記載のように、ＰＡＤＲＥペプチドは、Ｎ−及びＣ−末端置換基への改変を含んでも良い。当業者によって良く理解されているように、Ｎ−及びＣ−末端は、例えば、結合、安定性、生物学的利用性、連結容易性のような物理的又は化学的性質を変更するために改変されても良い。本明細書に記載されるようにＰＡＤＲＥペプチドは、希望とする特性、例えば、非改変ペプチドの実質的な全生物活性を維持しつつ、改良された薬理学的特性を与えるために、いかなる数の方法で改変されても良い。
【００７５】
本明細書に記載の実験において、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体は、ＰＡＤＲＥペプチドの−ＣＯＯＨ末端とデンドリマーのアミノ基の一つとの単純なアミド結合によって製造された。ＰＡＤＲＥペプチド（Ａｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｈａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＯＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、Ａｃ＝アセチル基； Ｄ−Ａｌａ＝Ｄ−アラニン； Ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン； Ａｈｘ＝アミノヘキサン酸）は、Ａｎａｓｐｅｃ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）より、アミノ末端の保護と反応回避のためにアセチル誘導体を購入した。購入されたペプチドは９５％以上の純度であった。アミド結合反応はＤＭＦ溶液中で標準的な条件で行われた（図１、下段概要図参照）。大半のアミノ基を遊離状態に保ちデンドリマーの大きな陽荷電性生成のためにデンドリマー１個当たり２−３個のペプチドの結合を求め、各々のデンドリマー表面へ結合するＰＡＤＲＥエピトープの数を調節するために、反応では２：１のペプチド／デンドリマー比が使用された。典型的な実施態様において、本明細書で記載されている複数のＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体は、０、１、２、３個等が結合したＰＡＤＲＥ（又は他のペプチド）を含むデンドリマーが頒布されるであろう。相対的母集団は、ポワッソン分布に従うものと記載される。ＰＡＤＲＥ、ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）は、もっとも普及した１６の中の１５のＨＬＡ−ＤＲ分子（Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５９： １−１４（１９９８）； Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１： ７５１−７６１（１９９４））に対して高い又は中等の親和性（ＩＣ５０＜１０００ｎＭ）で結合する。しかしながら、大半のヒトでＭＨＣクラスＩＩに結合しＣＤ４ヘルパーＴ細胞を活性化可能な他のペプチドがデンドリマーを標識するために使用されても良い。ペプチドの例として、これに限定されないが、テタヌス毒素（ＩＴ）ペプチド８３０-８４３； Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９： ２２３７-２２４２（１９８９））に記載された普遍的エピトープ； 及び、大半のヒト、及び、多くのマウスのＭＨＣクラスＩＩと反応する下記ペプチドを含む。
【００７６】
ａＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ａＫＹＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ａＫＦＶＡＡＹＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ａＫＸＶＡＡＹＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ａＫＹＶＡＡＹＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ａＫＦＶＡＡＨＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ａＫＸＶＡＡＨＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ａＫＹＶＡＡＨＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ａＫＦＶＡＡＮＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ａＫＸＶＡＡＮＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ａＫＹＶＡＡＮＴＬＫＡＡａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＡＫＹＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＡＫＦＶＡＡＹＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＡＫＸＶＡＡＹＴＬＫＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ＡＫＹＶＡＡＹＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＡＫＦＶＡＡＨＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＡＫＸＶＡＡＨＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＡＫＹＶＡＡＨＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＡＫＦＶＡＡＮＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ＡＫＸＶＡＡＮＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、及びＡＫＹＶＡＡＮＴＬＫＡＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ａ＝Ｄ−アラニン、＝シクロヘキシルアラニン）。他の使用可能なエピトープのもう一つの例は、マウスＢａｌｂ／ｃ ＭＨＣクラスＩＩ ＩａＤに結合するＨＡペプチド配列ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）（プロウイルスＰＲ８ウイルスＨＡ由来）である。
【００７７】
製造物を少なくとも２４時間純水に対して透析することにより精製し、真空下乾燥した。集めた製造物は、透明な油状であり、１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴分析法）、ＵＶ−Ｖｉｓ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で、その特性を分析した。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体のＮＭＲスペクトルは、デントリマープロトンに一致する大きなピークと、ペプチドプロトンについての小さなピークの集合を示した。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトルは、デンドリマー単独で観察されるピークよりも約３０００ ｍ／ｚ高いピークを示した。その超過分の質量は、約２個のペプチドエピトープに一致する。コンジュゲート体のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、トリプトファンの吸収波長領域に明確な吸収を示す。
【００７８】
ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体とのプラスミドＤＮＡの複合化は、生理的ｐＨのＰＢＳ緩衝水溶液中で、２つの成分を混合することにより行われた。Ｎ／Ｐ（アミン対リン酸）比の典型的な値は、１０：１である。ＤＮＡの完全な複合化を分析するためにゲル電気泳動法が使用される。生理的ｐＨ値においてアミノ基（−ＮＨ２）は水素化され、デントリマーの高い陽荷電性を与え、陰荷電性のＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への送達に特に適している。水溶液において、陽荷電性のデンドリマーと陰荷電性の核酸は、比較的容易に細胞膜を透過及び通過可能な凝縮物又はナノ粒子を生じさせる。
【００７９】
ＰＡＤＲＥ以外のＴヘルパーエピトープとコンジュゲートするデンドリマーは、上記のＰＡＤＲＥ−誘導体化デンドリマーと同様の方法で典型的に調製される。例えば、ペプチドの酸末端は、活性化試薬としてのカルボジイミドを使用するアミド化の一つによって、公知の合成方法によってデンドリマー表面上のアミノ基と共有結合することができる。もう一つの例として、アミン終末デンドリマーへのこれらペプチドの結合は、２つの合成経路によって実施できる。ペプチドエピトープのアミノ末端はアセチル化によって保護される。第一の経路は、標準的なアミド化化学による結合達成のために、システイン基のカルボン酸を使用する。第二の経路は、システインのチオール基（もしペプチドに存在する場合、それ以外は付加されても良い）の利点によって、マレイミドの前処理によりデンドリマー表面に結合するアルケン基と結合する。両経路は、エピトープ結合デンドリマーの機能化を与える。数個（ｓｅｖｅｒａｌ）までのペプチドエピトープ（例えば、２、３、４、５、６個等）／デンドリマーは、ＤＮＡ送達剤としての標的性を高め、ワクチン化の目的に対しての特性を改善するだろう。しかしながら、生理的ｐＨ値での水素化によるデンドリマーの大きな陽荷電性の獲得のために多くの未反応アミノ置換基の放置は重要である。本明細書に記載のように、デンドリマーは、いかなるＴヘルパーエピトープともコンジュゲート可能である。付加的なＴヘルパーエピトープの一つの例は、インフルエンザＨＡである。
【００８０】
一般的に、ジェネレーション−５（Ｇ５）のデンドリマーが、本明細書における組成物、キット及び方法に使用される。しかしながら、他のデンドリマー（表１参照）が使用可能である。
【表１】
【００８１】
荷電されたポリマー担体ワクチン及び組成物
本明細書に記載のワクチンは、少なくとも１つのＭＨＣ標的及び免疫原性ペプチドと、及び、少なくとも１つの核酸か又は少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原が、荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）の外部表面にコンジュゲートされ、前記ＭＨＣ標的及び前記免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）が特異的にＰＡＰＣに結合するように、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥペプチド及びインフルエンザＨＡのようなエピトープ）のようなＭＨＣ標的で免疫原性のペプチド、及び、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原か、又は少なくとも１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸かを、コンジュゲート又は結合したデンドリマーのような、少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体を含む。前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのデンドリマーと及び少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原か又は前記少なくとも１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸の組み合わせは、ヘルパーＴ細胞の活性化を仲介するＭＨＣクラスＩＩの誘導を含む、少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導することができる。さらに、ワクチンは油中水型乳剤を含む場合がある。ワクチンを前記哺乳類に投与することは、抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらす。デンドリマー上か又はデンドリマー内に示された本明細書に記載されている抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）又は抗原類（ａｎｔｉｇｅｎｓ）は、さまざまな病原体の状態によって惹起された疾患に対する免疫応答を誘導する。１つの実施態様では、前記抗原は病原性細菌、真菌、又はウイルス性生物、レンサ球菌種、カンジダ種、ブルセラ種、サルモネラ種、シゲラ種、シュードモナス種、ボルデテラ種、クロストリジウム種、ノーウォークウイルス、炭疽菌、結核菌、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、クラミジア種、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス種、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、肝炎ウイルス、マラリア原虫種、トリコモナス種、性感染症病原体、ウイルス性脳炎病原体、原虫疾患病原体、真菌疾患病原体、細菌疾患病原体、がん細胞、又はこれらの混合物に由来する場合があるがこれらに限られない。
【００８２】
前記少なくとも１つのデンドリマーはさらにポリイノシンポリシチジン酸（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））へコンジュゲートされることができ、前記ワクチン又は組成物はさらに薬学的に許容可能な担体を含むことができる。１つの実施態様では、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を各々有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープのように、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープがＰａｎ−ＤＲエピトープである。もう１つの実施態様では、前記ＴヘルパーエピトープはインフルエンザＨＡである。前記Ｔヘルパーエピトープは、しかし、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の活性化をする又はＴヘルパー細胞の活性化に寄与するいずれかのエピトープであることができる。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のＴヘルパーエピトープ活性化はＣＤ８Ｔ細胞の増殖及び刺激と、Ｂ細胞による抗体産生とが必要とされ、その両方が感染性病原体又はがんに対する防御免疫応答の誘導に必要不可欠である。前記デンドリマーが抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされるある実施態様では、前記核酸は一般的に発現ベクターである。前記発現ベクターは、前記抗原をエンコードする遺伝子と、クローニング部位と、ポリアデニル化配列と、選択可能なマーカーと及び細菌の複製開始点とに操作可能に連結された真核細胞プロモーターを含むのが典型的である。一般的に、前記抗原は、がん抗原か又は感染性病原体からの抗原かが典型的である。前記少なくとも１つのデンドリマーは一般的にＧ５デンドリマーである。同様に、前記デンドリマーがペプチド又はポリペプチド抗原にコンジュゲートされる実施態様では、前記抗原は、一般的にがん抗原か又は感染性病原体からの抗原かであり、前記少なくとも１つのデンドリマーはＧ５デンドリマーである。いくつかの実施態様では、アジュバントが前記ワクチン又は組成物に取り込まれる場合がある。
【００８３】
デンドリマーはＤＮＡ（及びＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＲＮＡｉ等を含むその他の核酸）を細胞内へ送るのに有効な担体である。しかし、ワクチン送達プラットフォームとして、デンドリマーは従来複数の理由のため欠陥があった。最初に、デンドリマーはアジュバント活性を欠如している；これらは自然免疫の有効な刺激を欠如しており、これらは「危険信号」を生成しない。また、デンドリマーは弱いＡＰＣの標的しか提供せず、一般的に、これらは弱い獲得免疫の刺激しか提供しない。特に低い免疫原性又は「自己」抗原若しくは免疫系が寛容を獲得した「自己」抗原と高い相同性を有する抗原を扱う際に、ＰＡＰＣを特異的に標的にし、「危険信号」を誘導し、注入部位にプロフェッショナル単核球を動員し、かつ、安全な強いアジュバント入りワクチン送達システムが非常に所望される。弱い抗原又は低い免疫原性を有するそれらは、無及び低レベルの特異的な免疫応答か、抗体応答か、又は細胞に仲介される免疫応答かをもたらす。本明細書に記載される前記ワクチンプラットフォームは、ＤＮＡ又はペプチド又はポリペプチド抗原と複合体化された（コンジュゲートされた）生分解性ナノ粒子である。前記プラットフォームは、そのＭＨＣクラスＩＩリガンドを介してＰＡＰＣを標的にし、結合し、及び高陽荷電性外膜により前記細胞膜を透過し、大量産生のためのスケールアップが安全かつ容易であり、及び分子上の修飾性により強力なアジュバントとして作用する。典型的な実施態様では、前記少なくとも１つのデンドリマーは、多分枝ポリマー高分子であり、その増強された可溶性のため理想的な添加剤であるＧ５ ＰＡＭＡＭデンドリマーである。Ｇ５は、特に、細胞内への前記ＤＮＡの送達に理想的である。本明細書に記載される典型的なワクチンは、前記注入部位への単核球の動員をもたらす一過性危険信号を誘導する油中水型乳剤を含む。ＤＮＡを取り上げ、これらの細胞は、所属リンパ節に移動し、抗原を提示するであろう。前記ＭＨＣクラスＩＩ分子の側面（ｆｌａｎｋ）に結合する、例えば、ＰＡＤＲＥのような普遍的なＴヘルパーアゴニストの包含は、ＰＡＰＣへのデンドリマー複合体とヘルパーＴ細胞のオプソニン化をもたらす。この変化は不活性及び弱いデンドリマーを前記発現した関心抗原の強い免疫エンハンサーに変える。またアジュバント活性と持効性効果の両方を有する疎水性担体、すなわち、油性乳剤（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０）を含むことは、抗原の遅延性放出をもたらす。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むことは、さらに関心抗原に対する免疫応答の誘導を増大する。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は正味の陰荷電を有するため、それは都合よくデンドリマーに結合し、免疫応答の強さを増大するアジュバントである。これらの特徴は強い「危険信号」として作用し、注入部位へさらに単核球（ＡＰＣを含む）を動員する。併せて、これらの特徴は自然免疫を刺激し、有効な免疫応答の誘導のために必要とされる炎症誘発性サイトカイン環境の増大された発現をもたらす。
【００８４】
ワクチンの１つの実施態様では、前記ＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥエピトープであり、及び前記デンドリマーはＰＡＤＲＥで誘導体化されている。ＰＡＤＲＥは前記ＭＨＣクラスＩＩの大部分と結合する人工的に設計されたペプチドであり、そして、デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥで誘導体化されたデンドリマー）とコンジュゲートされたＰＡＤＲＥペプチドは、結果として生じる複合体又は高レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現するＰＡＰＣのためのリガンドのコンジュゲート体を作製する。この複合体は、従って、ＭＨＣクラスＩＩ又はＰＡＰＣを発現する細胞に高い親和性を有する普遍的に標的付けられたワクチン送達システムになる。ＰＡＤＲＥもまたＴヘルパー細胞を活性化し、炎症誘発性サイトカインの環境をもたらし、そして、前記注入部位へその他の免疫細胞を動員する。デンドリマー、ＰＡＤＲＥを組み合わせることで、さらに「危険信号」を誘導することによる前記抗原の取り込みが増大する。ＰＡＤＲＥで誘導体化されたデンドリマーは現在既知のワクチンに対し複数の利点を提供する。最初に、Ｇ５デンドリマーは、結合し細胞膜非常に効果的に入り、前記タンパク質の強い発現をもたらす高荷電生分解性分子である。第二に、ＰＡＤＲＥは、多くのマウス及びヒトＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する普遍的なＴヘルパーエピトープである。それは合成の非天然Ｔヘルパーエピトープ［ＡＫｃｈｘＡＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：２６）（ｃｈｘＡ＝シクロヘキシルアラニン）］である。前記デンドリマーの表面に融合する際に、ＰＡＤＲＥは主に全てのＰＡＰＣを含むＭＨＣクラスＩＩを有する細胞を結合し、活性化するであろう。複数のＰＡＤＲＥエピトープ（例えば、２、３、４、５個等）が各デンドリマーに不着することができる。前記付着は、その免疫原性性質が生じる前記ペプチド結合する性質を維持する適切なスペーサーとともになされる。リンカー又はスペーサー分子は、本明細書に記載される前記デンドリマーコンジュゲート体と抗原又はその他の分子をコンジュゲートするのに用いられる場合がある。スペーサーは、ＡＡＡ、ＫＫ、ＧＳ、ＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：２７）、ＲＳ、又はＡＡＹを含むアミノ酸の組み合わせのいずれかの場合がある。本明細書で用いられるところの、「リンカー」又は「スペーサー」という用語は前記デンドリマーと例えば前記ＭＨＣクラスＩＩリガンドか、ＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープか、ポリペプチドか、又は前記デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）及び前記表面に曝露された分子にコンジュゲートされるか又は結合されるかの治療剤のような前記表面に曝露された分子との間に挿入する化学官能基を意味する。好ましくは、リンカーが１つの末端で前記表面分子に、及びそれらのその他の末端で前記ナノ粒子（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）にコンジュゲートされる。連結は同種又は異種２官能基剤、すなわち、ＳＰＤＰ、ＤＳＳ、ＳＩＡＢのいずれかに、行われる場合がある。連結方法はｄｅ Ｊｏｎｇｈらの国際出願ＤＫ００／００５３１（ＷＯ０１／２２９９５）号公報で開示されており、各内容は引用により全体として本明細書に取り込まれる。
【００８５】
第三に、前記ワクチンもまた油中水型乳剤を含む実施態様において、前記油中水型乳剤は前記注入部位への前記単核球の動員をもたらす一過性の「危険信号」を誘導する。ＤＮＡを拾うこれらの細胞は、領域リンパ節に移動し、抗原を提示するであろう。さらに、免疫応答誘導をさらに増大するために、合成２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は前記デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）に結合する場合がある。ＰｏＩｙ（Ｉ：Ｃ）は、正味の陰荷電を有し、従って、デンドリマーへ都合よく結合され得るトル様受容体３（ＴＬＲ−３）作動薬である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、アジュバントであり、その正味の陰荷電により、前記デンドリマーへ結合し、前記免疫応答の強さを増大するであろう。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のデンドリマーへの結合は、それが前記注入の頻度と及び注入間のインターバルを減らすため、前記モノクローナル抗体の産生（以下に記載される）において、特に有用である。
【００８６】
本明細書に記載されている抗原をエンコードする核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡか、ｍｉｃｒｏＲＮＡか、ｓｉＲＮＡか、ｓｈＲＮＡか又は合成化学的に改変されたＲＮＡ）の形態か又はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡと、ゲノムＤＮＡと、及び合成ＤＮＡ）の形態である場合がある。前記ＤＮＡは２本鎖か又は１本鎖かである場合があり、１本鎖の場合、コード（センス）鎖か又は非コード（アンチセンス）鎖である場合がある。１つの実施態様では、核酸は、不死化されたか、又は原発腫瘍の細胞株から、単離又は増幅されたＲＮＡ分子であることができる。
【００８７】
上記に記載されているように、１つの実施態様では、免疫応答の誘導のためのワクチンは、前記結果として生じる複合体が前記抗原に対する免疫応答を誘導するコンジュゲートされた少なくとも１つのＴヘルパーエピトープ、及び、抗原をエンコードする核酸を有する少なくとも１つのデンドリマーを含む。これらの組成物及び方法は、例えば、ウイルスベクターか又はイン・ビボ電気穿孔法の使用を必要とするその他の遺伝子免疫法と比較して、非常に安全で、簡単で、速い。液性又は細胞免疫応答の誘導のための前記ＤＮＡの使用は、複数の利点を有する。最初に、ＤＮＡの使用は、天然にプロセシングされたエピトープの完全なスペクトルを提供する。また、Ｔヘルパーエピトープ及び抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされたデンドリマーは、全ヒトＭＨＣ（ＡＫＡ、ＨＬＡ）の９５％を超えるＡＰＣを標的とする普遍的なワクチンの送達を提供し、精製が課題のタンパク質の精製の必要性を除去する。かかるタンパク質は、多タンパク質複合体の一部であることができ、膜タンパク質であることが可能であり、不正確に折りたたまれており、不溶性であることができる。本明細書に記載されている、前記デンドリマーコンジュゲート体は、タンパク質のグリコシル化又は翻訳後修飾を必要とせず、それらはタンパク質構造又は折りたたみの干渉にタグ付けし、劇的なコスト及び時間の節約を提供する。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーが、マウス、ヒヒ及びヒトからのＰＢＭＣへ核酸を標的づけし送達するという事実は、このプラットフォームをマウスから非ヒト霊長類、及びヒトへの急速なトランスレーショナルリサーチの理想的な候補にする。
【００８８】
また上記に記載されたように、もう１つの実施態様では、免疫応答の誘導のためのワクチンは、油中水型乳剤及び、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと及び前記ペプチド若しくはポリペプチド抗原とが前記デンドリマーの外部表面にコンジュゲートされ、前記ペプチド若しくはポリペプチド抗原に対する免疫原性を誘導することができる少なくとも１つのＴヘルパーペプチド（例えば、前記ＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡのようなエピトープ）及びペプチド若しくはポリペプチド抗原にそれとコンジュゲートされた少なくとも１つのデンドリマーを含む。弱い抗原性を有するペプチド又はポリペプチドが、本明細書に記載されているＴヘルパーエピトープ／デンドリマー複合体にコンジュゲートされた（複合体化された）ときに、強い免疫応答を誘導する。正味の陰荷電を有するポリペプチド及びペプチドは、例えば、共有結合によるコンジュゲートの必要なくＰＡＤＲＥ−デンドリマーと複合化する場合がある。例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのような油中水型乳剤は、さらにアジュバント活性及び持効性の効果をもたらす。
【００８９】
上述のように、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、予防上及び治療上の用途の両方を有する； これらは、被験体における疾患又は症状の発症を防ぐための予防として用いられこともでき、疾患又は症状を有する被験体を治療するために用いられる場合もある。本明細書に記載のワクチンは、感染性病原体又はがんのいずれかに対する免疫応答を備え付けるために用いられることもできる。感染性病原体の例は、例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、デングウイルス、ロタウイルス、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＺＶ、及びＥＢＶのようなウイルスを含み、熱帯マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫及びサルマラリア原虫といったマラリア原因病原体を含む病原性病原体；大形リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、エチオピアリーシュマニア、メキシコリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、幼児リーシュマニアシノニムシャーガスリーシュマニア（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍｓｙｎ．Ｌ．ｃｈａｇａｓ）といったリーシュマニア原因病原体を含む病原性病原体；炭疽菌、百日咳菌、肺炎球菌、及び髄膜炎菌含む病原性細菌などを含むがこれらに限られない。本明細書に記載されている実験において、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、マウスにおける確立したメラノーマ腫瘍を根絶させた。しかし、本明細書に記載されているＴヘルパーエピトープ及び抗原又は抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされた前記デンドリマーは、いかなるがんに対する特定の免疫応答を備え付けるために用いられる場合がある。追加のがんの例は、ＨＰＶ誘導子宮頸がん（例えば、抗原（ＴＡＡ）に関連したＥ７／Ｅ７腫瘍又はこれらの抗原をエンコードするプラスミドが、本明細書に記載されている前記Ｔヘルパーエピトープ／デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ−デンドリマー）と複合体化することができる）、ヒトメラノーマ（例えば、ＴＲＰ−Ｉ、ＴＲＰ−２、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ−Ｉ、ＭＡＧＥ−３及び／又はｐ５３は、ＴＡＡとして用いられ、本明細書に記載されている前記Ｔヘルパーエピトープ／デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ−デンドリマー）と複合体化できる）、及び前立腺がん（例えば、ＴＳＡは、ＴＡＡとして用いられ、本明細書に記載される前記Ｔヘルパーエピトープ／デンドリマー（例えばＰＡＤＲＥ−デンドリマー）と複合体化される場合がある）を含む。同様に、肺腫瘍、乳房腫瘍、及び白血病について、いずれか適切なＴＡＡが用いることが可能であり、多くが記載されている。かかるＴＡＡの多くは、さまざまながん（例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０）の間で共通である。かかる抗原をエンコードするＴＡＡ又はプラスミドの混合物は、本明細書に記載されている普遍的な、多重使用がんワクチンを作製するために用いられる場合がある。本明細書に記載されている１つのワクチンの例において、ＣＤ４エピトープ／デンドリマー（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）は、１種類より多い抗原又は１種類より多い前記抗原をエンコードするプラスミドと複合体化される場合がある。代替的に、１つの抗原か又は１つの抗原をエンコードする１つのプラスミドと各々複合体化された複数のワクチンは、さまざまな病原体又はさまざまながんの１つのワクチンとして混合され用いられる場合がある。
【００９０】
哺乳類への抗原送達方法及び免疫応答誘導
哺乳類（例えば、ヒト）へ抗原を送達する方法と、及び前記哺乳類における免疫応答の誘導のための前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生を誘導する方法とが本明細書に記載されている。典型的な方法は、少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチドかつ免疫原性のペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）がＰＡＰＣに特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び前記少なくとも１つの核酸、又は少なくとも１つのペプチド抗原若しくはポリペプチド抗原が、前記少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）の前記外部表面へコンジュゲートされることを特徴とし、ＭＨＣ標的ペプチド及び免疫原性ペプチド（例えば、ＴヘルパーペプチドＰＡＤＲＥペプチド又はインフルエンザＨＡ等）及び少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原又は前記少なくとも１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸をコンジュゲートした少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）を含む組成物の前記哺乳類への投与のステップを含み、前記少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチド及び免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）、少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えばデンドリマー）、及び前記少なくとも１つの核酸又は少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチド抗原の組み合わせが、前記抗原に対する免疫応答を誘導することができる。前記方法において、前記組成物は、ＭＨＣクラスＩＩを介するヘルパーＴ細胞の活性化を誘導するために有効な量で投与され、モノクローナル抗体の産生、及び前記哺乳類の前記抗原に対する免疫応答をもたらす。組成物は、さらに油中水型乳剤を含む場合がある。前記少なくとも１つのデンドリマーは、さらに、典型的には、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）にコンジュゲートされ、前記組成物はさらに典型的に薬学的に許容可能な担体を含む。前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープは、例えば、前記配列番号：１のアミノ酸配列を各々有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープのような、Ｐａｎ−ＤＲエピトープが可能である。代替的に、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープは、例えば、インフルエンザＨＡのような、Ｐａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥエピトープ）以外が可能である。一般的に、前記少なくとも１つのデンドリマーは、Ｇ５デンドリマーである。
【００９１】
１つの実施態様では、前記哺乳類はがん抗原を有し、前記抗原はがんであり、抗原及び前記組成物は前記がんに対するワクチンである。もう１つの実施態様では、前記哺乳類は感染性疾患を有し、前記抗原は感染性病原体からの抗原であり、前記組成物は、前記感染性病原体に対するワクチンである。かかる実施態様において、前記組成物の投与は、一般的に、前記哺乳類において局所的な副作用をもたらさない。前記組成物（例えば、ワクチン）を前記哺乳類の外側で処方することと、及び、例えば、前記哺乳類におけるがん抗原又は感染性病原体からの抗原のような抗原に対する免疫応答を刺激するために十分な量で、前記哺乳類に前記組成物を投与することとによって、かかる方法は一般的に行われる。本明細書に記載されている前記組成物、ワクチン及び方法は、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等）のような動物の適切ないかなる被験体に利用することができる。がん又は感染性疾患に苦しんでいるか、又はがん又は感染性疾患の発症の危険にさらされているヒトの患者が典型的な被験体である。
【００９２】
ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するための組成物及び方法
またｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するための組成物及び方法が本明細書に記載されている。典型的な実施態様において、ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達するため組成物は、少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチドと、免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーペプチド）と、及びｓｉＲＮＡがコンジュゲートされた少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）を含む。前記少なくとも１つのＭＨＣ標的ペプチドと、及び免疫原性ペプチド（例えば、Ｔヘルパーエピトープ）と、及び前記ｓｉＲＮＡとは、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープがＰＡＰＣへ特異的に結合するように、前記少なくとも１つの荷電性（例えば、陽荷電性）ポリマー担体（例えば、デンドリマー）の前記外部表面にコンジュゲートされる。前記ｓｉＲＮＡは、関心遺伝子のいずれか（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＤ−２８、ＣＴＬＡ−４）に（特異的に）向けることができる。前記組成物は、さらに油中水型乳剤を含むことが可能である。
【００９３】
ｓｉＲＮＡをＰＡＰＣに送達する典型的な方法は、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがＰＡＰＣに特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、及び前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが、前記デンドリマーの前記外部表面にコンジュゲートされることを特徴とする、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド、及び少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートした少なくとも１つのデンドリマーを含む組成物を提供し； 前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートした少なくとも１つのデンドリマーがＰＡＰＣに結合し、前記ｓｉＲＮＡが前記ＰＡＰＣに入り前記ＰＡＰＣ内で発現する条件で、哺乳類被験体へ前記組成物を投与するステップを含む。前記組成物は、さらに油中水型乳剤を含むことができる。前記方法において、前記ｓｉＲＮＡは、前記関心遺伝子の発現を抑制するために、いかなる（特異的な）関心遺伝子（例えば、ＦｏｘＰ３）に対して向かわせることができる。１つの例において、ＦｏｘＰ３に対して向けられたｓｉＲＮＡは、免疫応答を抑制し、免疫応答の負の制御として作用する細胞である、制御性Ｔ細胞の誘導をもたらす分子である、ＦｏｘＰ３の発現を抑制するために用いられる。この実施態様は、制御性Ｔ細胞が免疫療法及び介入を抑制している場合に、がん治療のための特定の使用を見出すことができる。制御性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩを発現し、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はその他のＣＤ４エピトープ−デンドリマーを介して標的化することができる。その他の例は、Ｔ細胞上の、Ｔ細胞へ抑制性シグナルを伝達するＣＴＬＡ−４である。ＣＴＬＡ−４に特異的なｓｉＲＮＡがＰＡＤＲＥ−デンドリマーと複合体化するようなある実施態様では、前記複合体は、ＣＤ４Ｔ細胞を含むＭＨＣクラスＩＩ発現細胞を標的化し、前記ＣＴＬＡ−４発現を抑制する。前記ＣＴＬＡ−４の発現が低いほど、前記病原体又はがんに対する免疫応答が高くなり、ＰＡＰＣの中へ送達された際は、（病原体、がんに対する免疫応答を増大するために、又は、宿主がワクチン接種される場合に）免疫応答を抑制するか，又は、例えば乾癬のような自己免疫疾患の治療のためのＢ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−Ｉ（Ｔ細胞活性化に必要なシグナル２誘導因子）を含む免疫応答を増大する分子の発現を防止又は低下する。
【００９４】
典型的な実施態様において、本明細書に記載される組成物は、共抑制及び共刺激分子及びそれらの仮想共刺激受容体（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２８ＣＴＬＡ−４）に特異的なｓｉＲＮＡを含む。配列−特異的ｓｉＲＮＡは、標的核酸分子に結合し、その発現を抑制する。ｓｉＲＮＡは、異常細胞、異常細胞増殖、及び感染性疾患病原体により惹起される腫瘍を含む腫瘍の治療に有効である。ｓｉＲＮＡの送達のための組成物及びその治療方法が提供される。
【００９５】
リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス分子を構築し使用する方法は、当業者に知られている（例えば、Ｉｓａｋａ Ｙ．、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ｖｏｌ．９： １３２−１３６，２００７；Ｓｉｏｕｄ Ｍ．ａｎｄ Ｉｖｅｒｓｅｎ Ｐ．Ｏ．、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ｖｏｌ．６：６４７−６５３，２００５；Ｍｏｕｌｄｙ Ｓｉｏｕｄ著、Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２ｎｄ ｅｄ．、２００４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。「アンチセンス」核酸は、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的、又はｍＲＮＡ配列と相補的であるように、タンパク質をエンコードする「センス」核酸と相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。前記アンチセンス核酸は、関心遺伝子の全てのコード鎖か、又はその一部のみと相補的であることができる。もう１つの実施態様では、前記アンチセンス核酸分子は、関心遺伝子をエンコードするヌクレオチド配列（例えば、５’及び３’非翻訳領域）のコード鎖の「非コード領域」をアンチセンスする。アンチセンス剤は、例えば、約８ないし約８０の核酸塩基（すなわち約８ないし約８０のヌクレオチド）、例えば、約８ないし約５０の核酸塩基、又は約１２ないし約３０の核酸塩基を含むことができる。アンチセンス化合物は、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を調節するリボザイム、外部誘導配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及びその他の短い触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物は、前記標的遺伝子（すなわち、関心遺伝子）における配列と相補的である少なくとも８個の連続した核酸塩基の伸長を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイゼーション可能であるその標的核酸配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、前記標的への前記オリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常機能を阻害し利用性喪失をもたらし、そして、例えば、イン・ビボアッセイか、又は治療的処置の場合における生理的条件と、アッセイが行われる場合の条件下でのイン・ビトロアッセイのような、特異的結合が所望される条件で、標的でない配列に対する前記オリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な相補性の程度の場合に、特異的にハイブリダイゼーション可能である。
【００９６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、また、低分子干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡとして本明細書に言及され、又は２本鎖低分子干渉性ＲＮＡはｄｓ ｓｉＲＮＡとして本明細書に言及される）が動物および植物細胞において相同的なｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導する非常に有効なプロセスである（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１２：２２５−２３２（２００２）；Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：４８５−４９０（２００１））。哺乳動物細胞において、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の二重鎖（Ｃｈｉｕｅｔａｌ、ＭｏＩ．細胞、１０：５４９−５６１（２００２）； Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１））、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有するＤＮＡの鋳型を用いてイン・ビボで発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、機能的小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、若しくはその他のｄｓＲＮＡ（Ｚｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、９：１３２７−１３３３（２００２）； Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６：９４８−９５８（２００２）； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：５００−５０５（２００２）；Ｐａｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：５０５−５０８（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：４４０−４４８（２００２）；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（９）：６０４７−６０５２（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓら，ＲＮＡ、８：８４２−８５０（２００２）；Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（６）：５５１５−５５２０（２００２））によって引き起こすことができる。
【００９７】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、各鎖に例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドなど約１６乃至３０の長さを典型的に含み、前記鎖の１つがｍＲＮＡにおける標的領域に対して実質的に同一、例えば少なくとも８０％（またはそれを超える、例えば８５％、９０％、９５％、または１００％）同一であって、例えば３、２、１または０のミスマッチヌクレオチドを有し、もう片方の鎖は第１の鎖と同一又は実質的に同一である。各鎖もまた、例えば、ｄＴｄＴｄＴのような１、２、３、４個、又はそれ以上のオーバーハングヌクレオチド１個又は２個以上のオーバーハング（すなわち、非相補的）ヌクレオチドを有する場合がある。
【００９８】
前記ｄｓＲＮＡ分子は化学的に合成でき、又はＤＮＡの鋳型からイン・ビトロで転写でき、又は例えば、ｓｈＲＮＡからイン・ビボで転写できる。前記ｄｓＲＮＡ分子は、当業者に知られている方法のいずれかを用いて設計できる；多数のアルゴリズムが当業者に知られており、例えば、Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３ （２４）：３１９１−７（１９９９）を参照のこと、及び多くはインターネット上で利用可能である。
【００９９】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、典型的には、選択されたｓｉＲＮＡと同一ヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムに意味のある相補配列を有さない。かかる陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることにより設計することができる；相同性検索は、前記陰性対照が、適切なゲノムにおいて、他の遺伝子のいずれに対しても相同性を欠失していることを確認するために行うことができる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡは、配列に１個又は２個以上の塩基ミスマッチを導入することによって設計することができる。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼへの耐性を前記ｓｉＲＮＡに作るために、修飾ヌクレオチド（例えば、２Ｆ−ＲＮＡ）を用いて生成できる。
【０１００】
抗体作製のための方法及びキット
治療又は予防を目的として被験体へ投与することができる抗体を作製するための組成物と、キットと、及び方法とが、本明細書に記載される。細胞内へのＤＮＡ送達の現在の方法は非効率的であり、複雑であり、及び免疫応答をほとんど誘導しない。しかしながら、本明細書に記載される前記組成物及び方法は、関心抗原の急速及び高い発現を示す強い抗体応答をもたらす。本明細書に記載されるデンドリマー／Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート体（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）は、抗体を作製する方法において、ペプチド又はポリペプチド又は核酸（例えば、ＤＮＡ）と複合体化（コンジュゲート体化）可能である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のデンドリマーへの結合は、頻度及び注入インターバルを減らすため、前記モノクローナル抗体の産生に特に有用である。以下に記載される実験において、ＤＮＡとの複合体化ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの単回注入後、強い液性応答と同様に角膜及び皮膚へのＧＦＰの送達及び発現が示された。現在の薬剤の５０％は精製が最も難しい膜タンパク質標的を標的にしている。本明細書に記載される組成物、キット、及び方法は、それらを精製することなく、かかる難精製タンパク質を標的にするための手段を提供する。
【０１０１】
ポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清に含まれる不均一な抗体分子の集団である。本明細書に記載される組成物、キット、及び方法を用いて生成することができる抗体は、従って、ポリクローナル抗体、さらに、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ発現ライブラリを用いて生成された分子を含む。特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるデンドリマー／Ｔヘルパーエピトープコンジュゲート体及び標準ハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５，１９７５； Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１、１９７６； Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２、１９７６； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１； Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと）。特に、例えばＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５、及び米国特許４３７６１１０号公報； ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２、１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６、１９８３），及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６、１９８３）などで記載される培養継続細胞株による抗体分子産生を提供する技術のいずれかによって、モノクローナル抗体を得ることができる。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれか、及びそのサブクラスのいずれかを含む免疫グロブリンクラスである。本明細書に記載されるｍＡｂを産生するハイブリドーマは、イン・ビトロ又はイン・ビボで培養される場合がある。イン・ビボでのｍＡｂの高タイター生成能力に対して、本明細書に記載されている組成物、キット、及び方法は、ｍＡｂ産生で特に有用である。
【０１０２】
抗原又はタンパク質をエンコードする核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡ）は、ｉ）単調で及び／又は高価な及び／又は適時のタンパク質精製ステップの除去、ｉｉ）従来のタンパク質精製から生じるタンパク質非天然型の感作を打ち消す宿主の細胞機構によるイン・ビボでのタンパク質の天然型の発現、及びｉｉ）タンパク質又は抗原の自然／天然型を標的とする治療用モノクローナル抗体作製のための理想的な方法、の利点を提供するため、デンドリマー／Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー）が、タンパク質又は抗原をエンコードする核酸と複合化（コンジュゲート化、又は結合）する本明細書記載の組成物、キット、及び方法は、タンパク質又は抗原の精製の必要性を否定する。
【０１０３】
特定の抗原に対するヒト抗体は、例えばマウスのような動物においてヒト抗体を産生するための公知の技術の適用によって作製できる。例えば、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ、Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４ （１９９６）：８４５−８５１； Ｈｅｉｊｎｅｎ、Ｉ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９７（１９９６）：３３１−３３８； Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８５６−８５９； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８１２−８１３； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１９９６）：８２６； 及び米国特許第５５４５８０６； ５５６９８２５； ５８７７３９７； ５９３９５９８； ６０７５１８１； ６０９１００１； ６１１４５９８； 及び６１３０３１４号公報を参照のこと。例えば米国特許第５５３０１０１、５５８５０８９、５６９３７６１、及び５６９３７６２号公報に記載されているように、特定の抗原に対するヒト型又はヒト化抗体は、公知の方法の適用により非ヒト抗体から作製可能である。
【０１０４】
一度生成されると、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらによって上記に記載されているように標準的な方法又はその他の適切な方法によるウエスタンブロット、免疫沈降分析によって特定の抗原認識についてテスト可能である。抗血清は、一連の注入により産生可能であり、少なくとも３回の追加免疫注入を含む一連の注入が好ましい。
【０１０５】
特定のエピトープを認識し、及び特定のエピトープと結合する抗体断片が、公知技術により生成可能である。例えば、かかる断片は、前記抗体分子のペプシン消化により生成可能なＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元により生成可能なＦａｂ断片を含むがこれらに限られない。代替的に、急速な及び容易な所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の同定を可能にするための、Ｆａｂ発現ライブラリが構築可能である（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５、１９８９）。
【０１０６】
哺乳類へ抗原を送達し、哺乳類で抗体取得を目的とする抗原に対するモノクローナル抗体産生を誘導する典型的な方法は、少なくとも一つのＴヘルパーペプチドが特異的にＰＡＰＣに結合し、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド、少なくとも一つのデンドリマー、及び、核酸又はペプチド若しくはポリペプチド抗原が抗原に対する免疫応答を誘導可能であるように、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド及び核酸又はペプチド若しくはポリペプチド抗原が少なくとも一つのデンドリマーの外部表面にコンジュゲート化されることを特徴とし、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド及びペプチド若しくはポリペプヂド抗原又は抗原をエンコードする核酸をコンジュゲートした少なくとも一つのデンドリマーを含む組成物の投与を含む。本方法において、前記組成物は、ＭＨＣクラスＩＩを介するヘルパーＴ細胞活性化の誘導に有効な量で投与され、前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらす。マウスにおける抗体産生の方法において、上記に記載されているように、前記マウスは、抗原で免疫後、１匹又は２匹以上のマウスから抗体が採取され、高タイターについてスクリーニングされる。高タイターのマウスが選択され、このマウスから脾臓が摘出される。そして骨髄腫との融合が行われ、最もよく結合するクローンについてのスクリーニングが行われる。
【０１０７】
また本明細書に記載されているキットは、タンパク質精製の必要性を除去する抗原への抗体（例えば、モノクローナル抗体）を作製するためのものである。典型的なキットは、本明細書に記載されている複数のデンドリマー／Ｔヘルパーペプチド複合体（コンジュゲート体）（例えば、ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー、インフルエンザＨＡコンジュゲートデンドリマー等）と、及び典型的にｐＨが７．４の生理緩衝液とを含む容器を含む。緩衝液又は培地の１つの例において、該緩衝液又は培地は、ＨＥＰＥＳ及び重炭酸ナトリウムで緩衝され、並びに、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、及び１０％未満のウシ血清アルブミン又は、エンドトキシンレベルが１．０ＥＵ／ｍｌ未満である、塩化カルシウム１００ｍｇ／ｌを有するインスリン及び／又はトランスフェリンを含む個体血清タンパク質で補充されたイーグル最小必須培地を含む。本実施態様において、前記キットの使用者は、１００−２００μｇ／ｍｌの前記緩衝液で、１つの抗原をエンコードする少なくとも１つの核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド）を希釈し、穏やかに震とうしながら、前記組成物（Ｔヘルパー−デンドリマー）を前記希釈されたプラスミドＤＮＡに加える。典型的な実施態様において、ＴプラスミドＤＮＡ中のヘルパー−デンドリマーの割合は１０：１で使用され（Ｎ：Ｐ）、概ねＤＮＡプラスミド１（重量）に対して組成物が７（重量）である。１つの実施態様では、以下の条件が続く。室温で１０分間インキュベーション後、前記プラスミド−ＤＮＡ／組成物１０−２０μｇを含む前記混合物１００μｌが、マウスに皮下注射される。１４日後の同様の追加免疫、モノクローナル抗体についての、一次スクリーニング、融合及び最終スクリーニングの標準的な方法が続く。核酸に加えて、本明細書に記載されている前記組成物及びキットは、タンパク質又は抗原とコンジュゲートされる場合がある。かかる実施態様において、タンパク質中の前記組成物についての１０：１の同一割合が、典型的に前記複合体形成をもたらす。本明細書に記載されているキットに含まれる取扱説明書は、適切な割合、緩衝液の作製、及び最適化並びに必要な際のトラブルシューティングのプロトコールを記載する。本明細書に記載されている、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体を有するプラスミドＤＮＡ又はタンパク質／抗原の複合体化は、一般的に、ＰＢＳを含む生理緩衝液の生理学的ｐＨで緩衝された水溶液中の２つの成分を混合することによってなされる。典型的なＮ／Ｐ（アミン対リン酸）比は１０：１である。ゲル電気泳動又はその他の適切なアッセイは、前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーへの前記ＤＮＡの完全な複合体化を示すために使用可能である。
【０１０８】
本明細書で記載されているキットは、関心抗原をエンコードするベクター又はプラスミドのいずれかとともに用いられることができる。本明細書に記載されている、前記デンドリマー／Ｔヘルパーエピトープ複合体（コンジュゲート体）の使用前準備のための説明資料が一般的に含まれる。前記説明資料は典型的に書面の又は印刷された資料であることを含むが、それらはこれに限定されない。かかる説明書を保存することができる及びエンドユーザーへそれらを伝えることができる媒体のいずれもが、ここでの前記キット及び方法に包含される。かかる媒体は電子記録媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）等を含むが、これらに限られない。かかる媒体は、かかる説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含む場合がある。
【０１０９】
細胞へ核酸を送達するための組成物及び方法
本明細書に記載されている実験において、ＧＦＰをエンコードする遺伝子の送達は、ＭＨＣクラスＩＩ細胞（ＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞）へ特異的に送達され、前記遺伝子の発現が観察された。従って、本明細書に記載されている前記組成物及び方法は、いかなる遺伝子治療応用での使用を見出しても良い。細胞を核酸へ送達するための組成物は、典型的に、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド、及びペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸をコンジュゲートさせた少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーを含み、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記細胞へ特異的に結合し、少なくとも一つのＴヘルパーペプチド、少なくとも一つの陽荷電性高分枝ポリマーデンドリマー、及び、核酸が細胞に取り込まれるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び前記核酸が、少なくとも１つの前記陽荷電性多分枝高分子デンドリマーの外部表面へコンジュゲートされることを特徴とする。細胞へ核酸を送達する方法は、典型的に、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及びペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸にコンジュゲートさせた少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーを含む組成物を細胞に接触させることを含み、前記組成物は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド、及びペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸をコンジュゲートさせた少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーを含み、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記細胞へ特異的に結合して、前記核酸の組み合わせが前記細胞によって内部に取り込まれるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び前記核酸が前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝高分子デンドリマーの前記外部表面へコンジュゲートされることを特徴とする。典型的な実施態様において、前記ペプチド又はタンパク質は前記細胞内に発現する。
【０１１０】
組成物の投与
本明細書に記載されている前記ワクチン及び組成物は、哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト）へいかなる適切な処方で投与されても良い。例えば、ｓｉＲＮＡへコンジュゲートされたＰＡＤＲＥ−デンドリマーを含む組成物又は、核酸、又はペプチド若しくはポリペプチド抗原へ複合体化されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーを含むワクチンが、例えば薬学的に許容可能な担体又は生理食塩水又は緩衝塩類溶液のような希釈剤中で処方されても良い。適切な担体及び希釈剤は、投与の様式及び経路と、標準的な薬務とにもとづいて選択することが可能である。典型的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤と、医薬品の処方とは、レミントンの薬学と、この分野の標準的な教科書と、ＵＰＳ／ＮＦとで知ることができる。別の物質が、前記組成物を安定化及び／又は保護するために組成物に添加される場合がある。
【０１１１】
本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、いずれかの従来技術により哺乳類へ投与されても良い。かかる投与は、典型的に、非経口（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、又は髄腔内注入）だろう。前記組成物は、直接的に標的部位に投与される場合もある。前記組成物は、単回ボーラス投与か、複数回注射か、持続投与（例えば、腹膜透析、ポンプ注入による静注）かで投与されても良い。非経口投与のために、前記組成物は、パイロジェンを含まない殺菌された剤形で処方されることが好ましい。治療用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、既にがんで苦しんでいる、又は前記関心病原体（例えば、ウイルス）に感染した個体に投与される。予防用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、がん又は感染性疾患（すなわち、関心病原体に感染している（例えば、ウイルス））の発症の危険にさらされている（例えば、遺伝的に罹患しやすい、又は環境的に曝露された）個体に投与される。
【０１１２】
治療用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、既にがんで苦しんでいる、又は前記関心病原体（例えば、ウイルス）に感染した個体に投与される。予防用途において、本明細書に記載されている前記組成物及びワクチンは、がん又は感染性疾患（すなわち、関心病原体に感染している（例えば、ウイルス））の発症の危険にさらされている（例えば、遺伝的に罹患しやすい、又は環境的に曝露された）個体に投与される。
【０１１３】
有効な用量
本明細書に記載の前記ワクチン及び組成物は哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト）へ有効な量、つまり、処置された哺乳類において望ましい結果（例えば、哺乳類におけるがんの予防又は除去、感染性疾患等に対する防御）を提供できる量で投与されるのが好ましい。かかる治療的有効量は以下で記載されるように決定可能である。
【０１１４】
本明細書に記載のワクチン及び組成物の毒性及び治療有効性用量は、ＬＤ５０（集団の５０％に対する至死用量）を決定するために細胞培養又は実験動物のいずれかを用いる標準的な薬学的手順で決定可能である。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。また、毒性の副作用を示す組成物が用いられる場合があるが、かかる副作用のダメージの可能性を最小化する送達システムの設計に注意を払うべきである。好ましい組成物の投与量は、ほとんど又は全く毒性がないＥＤ５０を含む範囲内であることが好ましい。投与量は、用いる剤形及び利用する投与経路に依存して、この範囲内で変わる場合がある。
【０１１５】
本明細書に記載されている組成物及びワクチンの治療学的有効量は、最初の免疫（治療又は予防投与）において、７０ｋｇの患者（例えば、０．１４μｇから３５７μｇのプラスミドＤＮＡ又はタンパク質及び０．８６μｇから２１４２．８５μｇの前記Ｔヘルパー−デンドリマー）に対して、前記抗原をエンコードする核酸にコンジュゲートされるか又は結合されるかのＴヘルパーエピトープ／デンドリマーの複合体が一般的に１μｇから約２５，０００μｇまでの（例えば、１、１００、５００、２０００、２５００、１０，０００、１５，０００、２５，０００μｇ）範囲であり、そして、前記患者の血液中の特定のＣＴＬ活性及び／又は抗体応答を測定による前記患者の応答及び状態に依存して、週から月単位の追加免疫計画に従って、約１μｇから約２，５００μｇの前記複合体（ワクチン）の追加免疫がなされる。１つの実施態様では、１３３倍以上多い用量のデンドリマーの１５日間投与が、毒性なく哺乳類に投与される場合がある（Ａｂｈａｙ Ｓｉｎｇｈ Ｃｈａｕｈａｎら、２００９ Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ａ，４６６，ｐｐ１５３５−１５５０．２００９を参照のこと）。
【０１１６】
現在がん又は感染性疾患に苦しんでいる及び／又はがん又は感染性疾患と診断された被験体の治療のために、投与は、疾患の最初の兆候の時か、又は腫瘍の検出又は外科的摘出時か、又は急性感染の場合には診断後すぐに開始することが好ましい。これは、少なくとも症状が実質的に弱められるまで、及びその後一時期の間、追加免疫がなされる。慢性感染症において、負荷用量とそれに続く追加免疫が必要とされる場合がある。予防使用のために、個体ががんへの素因に気付いたらすぐに、又は感染性疾患への曝露の予想の前に投与を開始しても良い。
【０１１７】
医学及び獣医学の当業者に周知であるように、いずれかの被験体への投与量は、前記被験体の大きさ、身体表面領域、年齢、投与される特定の組成物、時間及び投与経路、健康所見、及びその他の同時に投与される薬剤を含む因子の多くに依存する。例えばＰＡＭＡＭのようなデンドリマーは臨床試験と同様に前臨床試験でテストされた。最近、ＦＤＡは「ファーストトラック」をＶｉｖａＧｅｌ（登録商標）（Ｓｔａｒｐｈａｒｍａ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に付与し、既に第３相臨床試験にある。角膜におけるデンドリマーの治療使用は公知であり、デンドリマーは角膜遺伝子送達に用いられている。角膜の用途におけるデンドリマーの使用例は、角膜の新血管形成の治療、光線力学療法、及び角膜等価物としての再生医学を含む。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、ヒトに４０年以上の間、「天然の」インターフェロンの誘導因子として投与されてきた。複数の最近の臨床試験は、安全性及び増強した免疫原性のために異なった用量及び投与経路が試されてきた；一般的な安全性及び増強した免疫原性は繰り返し報告され、確立されている。
【０１１８】
実施例
本発明は、以下の特定の実施例によってさらに例示される。前記実施例は例示のみのために提供され、何等、本発明の技術的範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１１９】
確立されたメラノーマ腫瘍の遺伝子ワクチン接種療法のためのアジュバント／標的ナノ粒子を利用したプラットフォーム
裸のＤＮＡを用いる遺伝子ワクチン接種は、抗原を作製するために天然型で用いられる。しかし、イン・ビボでのトランスフェクション効率が低いこと、有効な送達がないこと、及び、従来の因子ワクチン接種アプローチの特異性が低いことが、抗原の効率を非常に制限する。これらの制限を克服するために、１）イン・ビボでＰＡＰＣの特異的で効率的なトランスフェクションを可能にし、２）自家ＰＡＰＣの成熟、つまり強力な免疫応答をもたらす「危険信号」を提供し、３）発生した免疫応答をさらに高めるヘルパーＴ細胞を活性化する、抗腫瘍ＤＮＡワクチン接種のための新規で柔軟なプラットフォームが開発され、本明細書に記載される。
【０１２０】
本明細書記載の新規のデンドリマーを利用するナノ粒子が、２つの反応物、ジェネレーション５のアミノ末端型ＰＡＭＡＭデンドリマーと、標的／免疫増強ペプチド、すなわち普遍的なＴヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ）とのコンジュゲートによって典型的に調製される。以下に記載のデータは、ｉ）Ｃ５７ＢＬマウスで確立され、高い侵襲性のＢ１６／ＬＵ８メラノーマ腫瘍を５０％の腫瘍サイズに減少する目的の抗腫瘍効果を達成し、ワクチン接種で用いられた前記遺伝子の生産物に対する強力な免疫応答を誘導し、２倍ないし３倍まで、マウス及びヒトの両方の抗原提示細胞（ＡＰＣ）でトランスフェクション効率を増大するための本プラットフォームを示した。さらに、ＰＡＤＲＥデンドリマーにコンジュゲートしたＧＦＰをエンコードするプラスミドを用いるイン・ビボ実験は、ＧＦＰが流入領域リンパ節で産生されることを示した。
【０１２１】
材料及び方法
ＰＡＤＲＥ誘導体化ＰＡＭＡＭデンドリマーが、以下の改変とともに上述のように製造された。前記ＰＡＤＲＥデンドリマー／ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの複合体は、適切なＮ／Ｐ比で１０分間室温でインキュベーションすることによって製造された。かかる複合体は、イン・ビトロ研究のために初代のＰＭＢＣ又は脾臓細胞に添加されたか、又はワクチン接種の目的のために皮下に注射された。図１は、ジェネレーション５のＰＡＭＡＭデンドリマー（へのコンジュゲート）のＰＡＤＲＥ修飾を示す。
【０１２２】
複数の核酸を結合するための高い陽荷電性表面を維持するために、１つのデンドリマー分子は、その表面にコンジュゲートした２つのＰＡＤＲＥペプチドを典型的に有するため、それが正味の陽荷電性を保持するであろう。ＰＡＤＲＥを前記デンドリマーに付加することは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の特異的な標的化と、強力なＣＤ４支援とをもたらす。前記ＰＡＤＲＥ誘導体化ＰＡＭＡＭデンドリマーは、抗原をエンコードするプラスミドの送り届けだけでなく、自然及び適応免疫を刺激し、「危険信号」として作用する。
【０１２３】
エンドトキシン無しのＭａｘｉＰｒｅｐ試薬が、（ＰＣＤＮＡ３．１中のｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＭＡＸ、ＧＦＰ、ＴＲＰ−２、Ｐ２、ＰＣＡＲＤ及びＯＶＡを含む）さまざまなプラスミドを作製するために用いられた。蛍光色素免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）と、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）とが標準的な方法によって実行された。簡潔には、トランスフェクションされたｃｏｓ−７細胞は、（９６ウェルプレートでウェル１つあたり０．０２×１０６個）播種され、細胞は固定され、透過処理された。上昇した液性応答を測定するために、希釈された血清は前記ウェルに添加され、第２番目のＩＲＤｙｅ ８００ＣＷでタグ化された抗マウスＩｇＧが抗体応答を測定するために用いられた。
【０１２４】
前記デンドリマー／ＤＮＡの複合体を調製するために、エンドトキシン無しのＰＢＳ中に調製されたＤＮＡ１μｇ／μＬが、さまざまな割合でデンドリマー又はデンドリマー−ＰＡＤＲＥと複合体形成された。室温で１０分間インキュベーション後、前記複合体は、細胞培養物に添加されるか、又は皮下、皮内又は角膜間質腔（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ ｃａｖｉｔｙ）に注射された。
【０１２５】
Ｂ１６−ＬＵ８メラノーマ腫瘍を有するマウス、５群の雌性Ｃ５７ＢＬマウスにワクチン接種のために、Ｂ１６−Ｆ１０細胞（０．０２×１０６個）が皮下に移植された。異なる群が、ｉ）非処理か、ｉｉ）ＰＣＤＮＡ３．１（対照ベクター）単独か、ｉｉｉ）デンドリマー単独で複合体形成されたＴＲＰ−２か、ｉｖ）ＰＡＤＲＥ−デンドリマーで複合体形成されたＴＲＰ−２かを腫瘍移植後２日目及び１０日目に受けた。腫瘍測定は１週間に２回実行された。
【０１２６】
結果
調製されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーが特徴付けられた。ペプチド−デンドリマーコンジュゲート体は、前記ペプチドの−ＣＯＯＨ末端と前記デンドリマーのアミノ基との間で単純にアミドカップリングすることによって作製された。２：１のペプチド／デンドリマーの感作割合が反応で用いられ、前記デンドリマーの大きな陽電荷を作るための多くの遊離のアミノ基を保持するために、デンドリマー１個あたりペプチド数個のみを付着する。産物は、純水に対する透析によって少なくとも２４時間精製され、その後真空で乾燥された。回収された産物、精油は、１Ｈ ＮＭＲ、ＵＶ−Ｖｉｓ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けられた。ＮＭＲは、前記デンドリマーの陽電子に対応する大きなピークと、ペプチドの陽電子についての一連の小さなピークとを示す。前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーコンジュゲート体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ｍ／ｚ比で前記デンドリマーについて観察されたピークよりも高い約３，０００ユニットのピークを示す。過剰な質量は約２個のペプチドエピトープに対応する（図１７）。
【０１２７】
データは２つのＰＡＤＲＥの平均が各デンドリマーに存在すると証明した（図１７）。複数の核酸を自家ＡＰＣにイン・ビトロ送達することが示された。ヒトの初代の末梢単核球細胞をイン・ビトロで送達／トランスフェクションすることは、１：５及び１：１０の感作比で最もよく達成された。図２は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー（にコンジュゲートした）と複合体形成した、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒでタグ化されたｓｉＲＮＡがＢ細胞と４時間インキュベーションされた際の純化されたヒトＢ細胞にＰＡＤＲＥ−デンドリマーを介するｓｉＲＮＡ送達（〜％８６）を示す。細胞はＣＤ１９／ＦＩＴＣで染色され、赤色チャンネル（ＰＥ）はｓｉＲＮＡ ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ．ｍａｎを有する細胞を示す。
【０１２８】
図３に関して、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのイン・ビボのＤＮＡ送達が示された。ＧＦＰ又はＴＲＰ−２をエンコードするプラスミドは単独で注射されるか、又はＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はデンドリマー（即ち、ＰＡＤＲＥと複合体形成されていないデンドリマー）と複合体形成された。画像は、注射後２４時間及び１６時間の皮膚（左）及び角膜（右）でのＧＦＰの発現を示す。ＧＦＰの効率的な発現が、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー複合体の注射後２４時間及び１６時間の皮膚及び角膜の両方で示された。イン・ビボでリンパ節の標的化が実証された。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド複合体（全５μｇのプラスミド）が皮下に注射された後８日目、隣接のリンパ節が除去され、ＧＦＰ−ＤＮＡ単独で注射されたマウスのリンパ節と比較された。蛍光顕微鏡画像が、免疫後８日目に網目状のリンパ節（ｍｅｓｈｅｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）で撮られた。注射部位に隣接する前記リンパ節での抗原の発現が見られたが、対照リンパ節での抗原の発現は見られなかった。
【０１２９】
イン・ビボでリンパ節の標的化が実証された。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミド複合体（全５μｇのプラスミド）が皮下に注射された後８日目、隣接のリンパ節が摘出され、ＧＦＰ−ＤＮＡ単独で注射されたマウスのリンパ節と比較された。蛍光顕微鏡画像が、免疫後８日目に網目状のリンパ節（ｍｅｓｈｅｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）で撮られた。注射部位に隣接する前記リンパ節での抗原の発現が見られたが、対照リンパ節での抗原の発現は見られなかった。
【０１３０】
図４に示されるように、特異的な免疫応答がＰＡＤＲＥ−デンドリマー／プラスミド複合体を投与した後に上昇された。強い液性応答が、プラスミド／ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの複合体での１回（ＧＦＰ）又は２回（ＯＶＡ）の免疫で観察された。
【０１３１】
図５に示されるデータは、確立された腫瘍のＰＡＤＲＥ−デンドリマー療法を示す。Ｂ１６メラノーマは、侵襲性のマウス腫瘍モデルであることが知られる。Ｂ１６メラノーマ細胞（上）又はＴＳＡ（下）を移植されたマウスが、腫瘍移植後２又は３日目にワクチン接種され、１週間後に追加免疫が続いて行われた。ＰＡＤＲＥ−デンドリマーを投与することが、特に、ＰＡＤＲＥ結合に対して高い親和性を有するＣ５７ＢＬ（Ｉａｂ）で防御免疫応答をもたらしたことを追跡腫瘍測定が明確に実証した。またＣ５７ＢＬはヘルパーＴ細胞の誘導を介してＰＡＤＲＥに強く応答した。
【０１３２】
図５に関して、結果は、高い侵襲性で確立されたＢ１６／ＬＵ８腫瘍の腫瘍サイズを５０％減少する目的の抗腫瘍効果を示した。この侵襲性モデルは、他の全てが失敗してもプラットフォームの能力を示すために意図的に選択された。腫瘍成長の遅延と、腫瘍サイズの減少とは前例のないことである。さらに、腫瘍移植後２２日目、腫瘍又は触診可能な腫瘍が全ての対照群と顕著に異なる試験群（即ち、本明細書に記載されているようなワクチンを受け取っている動物）で全く検出されなかった。本ワクチン接種（ワクチン投与）で用いられたＤＮＡ量は、通常用いられる量（２０μｇ及び全２回の免疫）と比較して非常に少なかった。図５では、下段の図は、ＰＡＤＲＥが適切に結合していないＢａｌｂ／ｃマウスを用いる陰性対照であり、Ｂａｌｂ／ｃ ＴＳＡ腫瘍モデルでの類似の実験では全く有効性を示さない。これは、ＭＨＣクラスＩＩを介する送達システムの特異性を明らかに示す。
【０１３３】
これらのデータは、本明細書記載の標的用アジュバントナノ粒子プラットフォームが、遺伝子送達と、エンコードされた抗原の強力な発現と、抗原提示と、防御免疫応答の誘導とをもたらすことを明らかに実証する。したがって、本明細書記載のＰＡＤＲＥ−デンドリマーのナノ粒子は、ｉ）タンパク質なしの（モノクローナル）抗体の製造と、ｉｉ）悪性腫瘍と、虚偽のインプリンティングを有する感染性疾患との免疫学的治療／予防と、ｉｉｉ）免疫を利用した治療介入の多くのためのｓｉＲＮＡ送達とのための新規で強力なアジュバント／標的用送達ツール及びプラットフォームである。
【実施例２】
【０１３４】
イン・ビトロでの標的送達及びトランスフェクションの効率
図６に関して、イン・ビトロでのＰＢＭＣの標的送達は７７％のＢ細胞トランスフェクション効率をもたらす。健康な提供者由来のヒトＰＢＭＣが入手された。ＰＢＭＣは、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地１ｍＬあたり６百万個の細胞で培養された。ＧＦＰをエンコードするプラスミド５μｇは、生理緩衝液、ＰＢＳ１００μＬで希釈され、ＰＢＳ５０μＬ中のＰＡＤＲＥ−デンドリマー５μｇは、振とうながらＤＮＡに添加された。室温で１０分間インキュベーション後、ＧＦＰプラスミド及びＰＡＤＲＥ−デンドリマーの混合物／複合体が、その後、ＰＢＭＣに添加された。３７°Ｃ／５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベーション２４時間後、ＰＢＭＣはＣＤ１９ ＰＥで染色され、細胞はフローサイトメトリーで解析された。ＧＦＰの発現が全ＰＢＭＣの４３％で観察された一方、Ｂ細胞にゲートされたとき、Ｂ細胞の７７％がＧＦＰを発現した。対照群、デンドリマーとＧＦＰプラスミドの同じの割合をインキュベーションしたＰＢＭＣは、総ＰＢＭＣ又はＢ細胞に対して約１１％と７％のＧＦＰの発現を示した。培地のみでのＰＢＭＣと比較するとき、主要な生存率変化は全く観察されなかった。これは、さまざまな実験の代表例である。これらの実験は、ｉ）ＰＢＭＣと、特に、ＭＨＣクラスＩＩを発現している細胞（Ｂ細胞）とへのＧＦＰプラスミド送達、及び、ｉｉ）ＰＢＭＣと、特に、Ｂ細胞とによるＧＦＰの発現を実証する。
【実施例３】
【０１３５】
イン・ビボでマウス樹状細胞（ＤＣ）と、イン・ビトロでヒトＢ細胞とへのペプチド／タンパク質の送達
ＰＤＤ／アルブミン−ＦＩＴＣは純化されたヒトＢ細胞に送達された（図７）。図８に関して、この図は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの標的化の、イン・ビボでのマウス樹状細胞（ＤＣ）の効率と、注射及びリンパ節解析の時系列とを示す。この実験の結果は、ｉ）（図７）ＰＡＤＲＥ−デンドリマーと混合されたタンパク質、アルブミン−ＦＩＴＣは２時間未満でヒトＢ細胞中に送達され、ｉｉ）（図８）皮下注射後５日目、デンドリマーにコンジュゲートしたエピトープ、ＰＡＤＲＥは、リンパ節のＢ細胞と樹状細胞（ＤＣ）とにイン・ビボで送達され（前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、リンパ節／Ｂ細胞／樹状細胞（ＤＣ）への複合体の送達を可視化するためにＧＦＰ−プラスミドに複合体形成された。）、ｉｉｉ）（図９）皮下注射後５日目、デンドリマーにコンジュゲートしたエピトープ、インフルエンザのＨＡヘルパーエピトープはリンパ節の樹状細胞（ＤＣ）にイン・ビボで送達される（前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、リンパ節の樹状細胞（ＤＣ）への複合体の送達を可視化するためにＧＦＰ−プラスミドに複合体形成された。）ことを示す。これらのデータは、さまざまな実験で、ＧＦＰプラスミドと複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はＨＡ−デンドリマーそれぞれの皮下注射後３日目に摘出されたリンパ節のいくつかでの代表例である。これらの結果は、ＦＩＴＣのＦＩＴＣ可視化を介して、リンパ節細胞のＢ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＦＩＴＣコンジュゲートタンパク質の送達と、デンドリマーにコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ及びＨＡヘルパーのエピトープの２つのペプチドの送達との例を証明し、該２つのペプチドでは、ＧＦＰプラスミドが複合体（ＧＦＰをエンコードするプラスミドを伴うペプチド連結デンドリマー複合体）の可視化と解析を促進するために前記ペプチド−デンドリマーと複合体形成された。樹状細胞（ＤＣ）の特異的なイン・ビトロ及びイン・ビボのトランスフェクションは、ナノ粒子（ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰをエンコードするプラスミド）、対、対照の注射後５日目の隣接のリンパ節で標的化及び増幅する樹状細胞（ＤＣ）のイン・ビボのフローサイトメトリーデータによって示された（ＧＦＰの発現７８％、対、〜７％）。ＰＡＤＲＥ誘導体化デンドリマー（ＰＤＤ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現したＭＨＣクラスＩＩに結合する高い親和性を有するＰＡＤＲＥのオプソニン効果の補助によって送達を増大する。同様に、ＨＡ−デンドリマー（ＤＲＨＡ）／ＧＦＰ−プラスミドは、皮下に注射されたとき、隣接のリンパ節にイン・ビボで送達される（図９）。マウスで特筆すべきことは、ＰＡＤＲＥがＩＡｂ（Ｃ５７ＢＬマウス）の前記ＭＨＣクラスＩＩに結合する一方（図８）、選択されたＨＡエピトープがＩＡｄ（Ｂａｌｂ／ｃマウス）のＭＨＣクラスＩＩに結合する（図９）ことである。異なる２つのエピトープを用いて、異なる２つのマウスの系統において、類似の結果となるイン・ビボ送達を実行できることが示された。ヒトＰＢＭＣ（図６）、純化されたヒトＢ細胞（図６）及びＣ５７ＢＬマウスの脾臓細胞でＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＧＦＰ−プラスミドによってＧＦＰの発現をもたらす抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的送達と、ヒトＢ細胞（図１０）及びサルＰＭＢＣ（図１１）へのＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ｄｓＲＮＡの送達とは、本明細書記載の組成物によるＰＡＰＣへのペプチド送達の追加のイン・ビトロの証拠である。ユニークな特徴は前記ＭＨＣクラスＩＩに結合する異なる２つの標的ペプチドの使用が、本明細書記載の実験で示されたように働くため、本明細書記載のワクチン、方法及び組成物は、全てのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを包含する。また、図９に関して、インフルエンザＨＡヘルパーエピトープにコンジュゲートしたデンドリマー（ＨＤＤ）が調製された。ＨＤＤはｂａｌｂ／ｃマウスで用いられる場合がある。マウスに注射されたとき、ＨＤＤは、隣接のリンパ節で樹状細胞（ＤＣ）を標的とする。
【実施例４】
【０１３６】
ヒトＢ細胞及び非ヒト霊長類ＰＢＭＣへのｓｉＲＮＡのＰＡＤＲＥ−デンドリマー送達及び非ヒト霊長類ＰＢＭＣへのプラスミドのＰＡＤＲＥ−デンドリマー送達
図１０に関して、ｄｓｓｉＲＮＡに複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー（対照ｓｉＲＮＡ）は、イン・ビトロの標的送達を示した。０．１μｇのｄｓＲＮＡは１００μＬのＰＢＳ中に希釈され、２０μＬ中の０．７μｇのＰＡＤＲＥ−デンドリマーが、振とうしながらＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒでタグ化されたｄｓＲＮＡに添加された。室温で１０分間インキュベーション後の複合体が、２４ウェルのプレート中の（１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ中の）１００万個の純化されたＢ細胞に添加された。３７°Ｃ／５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベーション約１時間後、細胞は洗浄され、ウェルに（新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１ｍＬ中に）戻され、赤色チャンネルの蛍光顕微鏡下で解析された。明視野及び赤色チャンネル下での細胞の重ね合わせ画像は、ヒトＢ細胞によるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒでタグ化されたｄｓＲＮＡの取り込みを実証する（図１０）。細胞がＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）で染色され、フローサイトメトリーによって解析されたとき（図２）、細胞は３７°Ｃ／５％ＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベーションされた。図２に示されるように、対照のデンドリマー／ｄｓＲＮＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの約６％に対して、Ｂ細胞の８０％よりも多くが、（ＲＮＡにタグ化された）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒに陽性である。これらの結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーによるＰＡＰＣへの核酸の強力な送達を明らかに実証する。
【０１３７】
ヒヒ（ｐａｐｉｏ ｈａｍａｄｒｙａｓ）由来の１つの試料と、カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の異なる２つの試料とのＰＢＭＣがテストされた。図１１に示される蛍光顕微鏡画像は、ｓｉＲＮＡ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒで複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はデンドリマーそれぞれの添加後２時間に撮られた代表例である。同様に、ＧＦＰ−プラスミドで複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマー又はデンドリマーは前記ＰＢＭＣに添加され、インキュベーション後２４時間で解析された（図１２）。結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは核酸をサルのＰＢＭＣに２時間未満で送達する一方、デンドリマーは穏やかな送達のみを示すことを示す。これらの結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは非ヒト霊長類で作用することを強く示唆する。
【実施例５】
【０１３８】
ＰＡＤＲＥ−デンドリマーのナノ粒子及びＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴ（商標）プラットフォームの組成物
本明細書記載のＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、全ての細胞へのＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴの非特異的な送達とは反対のＰＡＰＣの特異的な標的化を提供する。前記ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴ（商標）プラットフォームは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合するために非特異的な生来のアジュバント活性又はいずれかのリガンドを用いる電気穿孔法を介してＤＮＡを細胞に送達する７０４ポリマーを含む。従来、イン・ビボの電気穿孔法は、最も良いウイルス遺伝子を使用しない免疫方法として知られる。本明細書記載のＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、前記ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴ（商標）のプラットフォームによって提供されないヘルパーＴ細胞の誘導を提供する。上記の実験では、前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは治療上の腫瘍モデルで有効であることが示された一方、ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴのものはイン・ビボ腫瘍モデルで有効であることが示されなかった。本明細書記載の前記実験では、強力な対照として、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーはイン・ビボ電気穿孔法と比較された（図１３）。反対に、ＩＮ−ＣＥＬＬ−ＡＲＴは裸のＤＮＡとの比較のみを示した。本明細書記載の前記ＰＡＤＲＥ−デンドリマーの単回免疫が、液性応答を上昇するためのイン・ビボ電気穿孔法と比較された。本実験を実行するために、ＰＡＤＲＥ−デンドリマーは、室温で５μｇの前記プラスミドと混合され、１０分後、混合物はマウスに皮下注射された。ＯＶＡをエンコードするプラスミドにコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ−デンドリマーで免疫されたマウスと、対照マウスとは、単回のワクチン接種２８日後にＯＶＡを発現する５０ｋ Ｂ１６Ｆ１０で感作された。イン・ビトロでの電気穿孔法を介してプラスミドを受け取っているマウスでは４０％であり、ＤＮＡのみを受け取った対照群では０％であったが、プラスミドにコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ−デンドリマーを受け取ったマウス全てが腫瘍移植後２５日目で保護（Ｐｒｏｔｅｃｔ）された。図１３に示されるように、結果は、ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／プラスミド（ＤＲＰ−ｏｖａ）での単回のＤＮＡワクチン接種は、抗ｏｖａ抗体の液性応答を誘導するためのプラスミド（ＥＰ−ｏｖａ）のイン・ビボ電気穿孔法（ＥＰ）の送達よりも優れていることを示す。
【実施例６】
【０１３９】
マウスで強い液性応答を誘導するＰＡＤＲＥ−デンドリマー
図１４−１６に示されるように、プラスミドと複合体形成されたＰＡＤＲＥ−デンドリマーはマウスで強い液性応答をもたらす。
【実施例７】
【０１４０】
ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡプラスミドワクチンによる予防上の設定でのＢ１６／ＯＶＡの根絶
ケージあたり５匹の群の雌６週齢のＣ５７ＢＬマウスが、ｉ）免疫なし、ｉｉ）Ｄｅｒｍａ Ｖａｘ電気穿孔装置を用いる「イン・ビボ電気穿孔法」を介する２０μｇのＯＶＡ−プラスミドの２回の免疫か、ｉｉｉ）ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／ＯＶＡ−プラスミドの２回の免疫（各２０μｇ）かを受けた。免疫は２週間の間隔で実行された。免疫後１０日目、全てのマウスは、右側腹部にＰＢＳ１００μＬ中のＢ１６／ＯＶＡ腫瘍細胞５０，０００個の皮下注射（移植）を受けた。腫瘍の測定は１週間に２回実施され、毎週のデータはプロットされ、図１８に示される。ＰＡＤＲＥ−デンドリマー／２０μｇのＯＶＡ−プラスミドでの２回のワクチン接種は、免疫されたマウス全てでＢ１６／ＯＶＡ腫瘍の完全な根絶をもたらす一方、非処理では１００％、及び、「イン・ビボ電気穿孔法」を介してワクチン接種されたマウスの６０％が腫瘍を持ったままであった。体重の１５％よりも大きな腫瘍を有する、腫瘍を持ったマウスの全ては屠殺された。
【０１４１】
その他の実施態様
いずれかの改良が、前記組成物、キット及び方法ステップの一部又は全部で行われる場合がある。本明細書で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む参考文献の全ては、引用により本明細書に取り込まれる。本明細書で提供される例又は例示的な用語（例えば、「のような」）のいずれか及び全てを用いることは、本発明を例示することを意図し、他に要求がない場合には、本発明の技術的範囲を限定することを示すものではない。例えば、本明細書記載の実験は、Ｂ１６メラノーマの根絶と、ＧＦＰ、ＯＶＡ、ＰＣＡＲＤ、ＣＣＲ５、ｖｇＰＣＲ、ｍｕＰＡＲ、ＣａｔｈＬ又はｐ２の抗原への強い液性応答の誘導とを含むけれども、本明細書記載のワクチン、組成物及び方法は、がんの追加のタイプを予防又は根絶するステップ、及び、免疫応答、つまり興味のある抗原（例えば、感染性病原体由来の抗原）いずれかに対する免疫を誘導するステップを含む、他の治療上及び予防上の適用の多くで使用することを発見することが可能である。もう１つの例では、本明細書記載の前記ワクチン、組成物及び方法は、抗原ではないタンパク質又はペプチドを細胞に送達するために用いられることが可能である。この例は、ペプチド又はタンパク質を細胞に送達するための典型的な組成物は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチド及び少なくとも１つのペプチド又はタンパク質をコンジュゲートした少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含み、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのペプチド又はタンパク質とは、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされる。本発明又は好ましい実施態様の性質又は利益に関する本明細書の説明のいずれも限定することを意図せず、添付された請求項は、かかる説明によって制限されるとみなされるべきではない。より一般的には、明細書中の用語は、本発明の実行に必須とされるものと同じく、請求項に記載されていない構成要素のいずれかを示すものと解釈されるべきではない。本発明は、準拠法によって許されているように、本明細書に添付された請求項に記載の対象の改変及び均等物の全てを含む。さらに、本明細書で他に示されるか、又は明らかに文脈と矛盾したりしない場合には、全ての変形における上記構成要素のいずれの組合せも本発明に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、ワクチン。
【請求項２】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
薬学的に許容可能な担体及び油中水型エマルジョンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープであることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記核酸は発現ベクターであり、前記少なくとも１つの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、ワクチン。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含むワクチンであって、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
油中水型エマルジョンをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープであることを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ペプチド又はポリペプチドの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項２０】
抗原を哺乳類に送達し、該哺乳類で前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生を誘導する方法であって、該方法は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記組成物はＭＨＣクラスＩＩで仲介されるヘルパーＴ細胞の活性化を誘導するために有効量の組成物であり、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原か、該少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸かとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸か、又は、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原かとの組み合わせが、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸か、又は、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原かとが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、前記組成物を前記哺乳類に投与することが、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらすことを特徴とする、方法。
【請求項２１】
前記哺乳類はがんを有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原はがん抗原であり、前記組成物は前記がんに対するワクチンであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物を投与することは前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じないことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類は感染性疾患を有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原は感染性病原体由来であり、前記組成物は前記感染性病原体に対するワクチンであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物を投与することは前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じないことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は油中水型エマルジョンをさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥエピトープであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物は第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含み、該第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳類は、げっ歯類又はウサギであり、前記モノクローナル抗体は前記哺乳類から採取されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体は、前記哺乳類から前記抗体を採取するステップと、前記抗体のタイターを測定するステップと、前記哺乳類から脾臓を摘出するステップと、ミエローマとの融合を実行するステップとによって調製されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体はヒト化されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物であって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、組成物。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであり、前記ｓｉＲＮＡは、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられることを特徴とする、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ｓｉＲＮＡをプロフェッショナル抗原提示細胞に送達する方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートする少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）哺乳類の被験体に前記組成物を投与するステップとを含み、
前記組成物を提供するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、
前記投与するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートしている前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に結合し、前記ｓｉＲＮＡが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に入る条件下で前記組成物を投与することを特徴とする、方法。
【請求項４０】
前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｓｉＲＮＡは、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｓｉＲＮＡは、前記プロフェッショナル抗原提示細胞でＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１の発現を妨げることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類において、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞の増殖を抑制するか、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するかの方法であって、該方法は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドをコンジュゲートし、タンパク質をエンコードする核酸によって結合した少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーにおいて、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞に特異的に結合し、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸又は該核酸によってエンコードされるタンパク質との組み合わせが、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞の増殖の抑制か、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスの誘導かをするように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、結合されることを特徴とする、方法。
【請求項４４】
前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞は、リンパ腫又はリンパ腫の一部分であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
核酸を細胞に送達するための方法であって、該方法は、少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を細胞に接触させるステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープが前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、方法。
【請求項４７】
前記ペプチド又はタンパク質は前記細胞内で発現されることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
核酸を細胞に送達するための組成物であって、該組成物は少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含み、該少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、組成物。
【請求項５０】
前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項４６に記載の組成物。
【請求項１】
少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、ワクチン。
【請求項２】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
薬学的に許容可能な担体及び油中水型エマルジョンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープであることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記核酸は発現ベクターであり、前記少なくとも１つの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含むワクチンであって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、ワクチン。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含むワクチンであって、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
油中水型エマルジョンをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰａｎ−ＤＲエピトープであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰａｎ−ＤＲエピトープであることを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ペプチド又はポリペプチドの抗原は、がん抗原か、感染性病原体由来の抗原かであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項２０】
抗原を哺乳類に送達し、該哺乳類で前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生を誘導する方法であって、該方法は、少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記組成物はＭＨＣクラスＩＩで仲介されるヘルパーＴ細胞の活性化を誘導するために有効量の組成物であり、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原か、該少なくとも１つの抗原をエンコードする核酸かとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸か、又は、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原かとの組み合わせが、前記少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸か、又は、少なくとも１つのペプチド若しくはポリペプチドの抗原かとが前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、前記組成物を前記哺乳類に投与することが、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原に対するモノクローナル抗体の産生をもたらすことを特徴とする、方法。
【請求項２１】
前記哺乳類はがんを有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原はがん抗原であり、前記組成物は前記がんに対するワクチンであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物を投与することは前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じないことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類は感染性疾患を有し、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原は感染性病原体由来であり、前記組成物は前記感染性病原体に対するワクチンであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物を投与することは前記哺乳類で局所的な有害応答を全く生じないことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはポリイノシン−ポリシチジン酸に結合されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は油中水型エマルジョンをさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥエピトープであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＰＡＤＲＥエピトープであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはインフルエンザＨＡであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、前記少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原をさらにコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物は第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーをさらに含み、該第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドの抗原と異なる第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原との組み合わせが、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原に対する免疫応答を誘導できるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記第２のペプチド又はポリペプチドの抗原とが前記第２の荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳類は、げっ歯類又はウサギであり、前記モノクローナル抗体は前記哺乳類から採取されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体は、前記哺乳類から前記抗体を採取するステップと、前記抗体のタイターを測定するステップと、前記哺乳類から脾臓を摘出するステップと、ミエローマとの融合を実行するステップとによって調製されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体はヒト化されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物であって、前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、組成物。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであり、前記ｓｉＲＮＡは、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられることを特徴とする、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ｓｉＲＮＡをプロフェッショナル抗原提示細胞に送達する方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートする少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）哺乳類の被験体に前記組成物を投与するステップとを含み、
前記組成物を提供するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的に結合するように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとが前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、
前記投与するステップでは、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡとをコンジュゲートしている前記少なくとも１つの荷電性多分枝ポリマーデンドリマーが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に結合し、前記ｓｉＲＮＡが前記プロフェッショナル抗原提示細胞に入る条件下で前記組成物を投与することを特徴とする、方法。
【請求項４０】
前記荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｓｉＲＮＡは、ＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１に対して向けられることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｓｉＲＮＡは、前記プロフェッショナル抗原提示細胞でＣＴＬＡ−４、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２８、ＩＤＯ又はアルギナーゼ１の発現を妨げることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類において、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞の増殖を抑制するか、ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するかの方法であって、該方法は、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドをコンジュゲートし、タンパク質をエンコードする核酸によって結合した少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーにおいて、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞に特異的に結合し、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸又は該核酸によってエンコードされるタンパク質との組み合わせが、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞の増殖の抑制か、前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞のアポトーシスの誘導かをするように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされ、結合されることを特徴とする、方法。
【請求項４４】
前記ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍細胞は、リンパ腫又はリンパ腫の一部分であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
核酸を細胞に送達するための方法であって、該方法は、少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含む組成物を細胞に接触させるステップを含み、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープが前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーエピトープと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、方法。
【請求項４７】
前記ペプチド又はタンパク質は前記細胞内で発現されることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
核酸を細胞に送達するための組成物であって、該組成物は少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーを含み、該少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーは、少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、ペプチド又はタンパク質をエンコードする少なくとも１つの核酸とをコンジュゲートし、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドは前記細胞に特異的に結合して、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーと、前記核酸との組み合わせが前記細胞によって吸収されるように、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドと、前記核酸とが前記少なくとも１つの陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーの外表面にコンジュゲートされることを特徴とする、組成物。
【請求項５０】
前記陽荷電性多分枝ポリマーデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、前記少なくとも１つのＴヘルパーペプチドはＰＡＤＲＥであることを特徴とする、請求項４６に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５２２８０２（Ｐ２０１２−５２２８０２Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３７２３（Ｐ２０１２−５０３７２３）
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２９６９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５０４６
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（３０６０３６６６８）ユニバーシティ オブ マイアミ (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２９６９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５０４６
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（３０６０３６６６８）ユニバーシティ オブ マイアミ (10)
【Ｆターム（参考）】
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