ワクチン
この発明はC型肝炎ウイルス（HCV）感染症ならびにこれに関連する症候および疾患の治療および予防に有用な方法および組成物に関する。特に、この発明はHCVタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン、および本発明のワクチンを投与することを含むHCVに感染した個体の治療方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ならびにそれに関連する症候および疾患の治療および予防に有用な方法および組成物に関する。特に、本発明は、ＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチン、ならびに、本発明のワクチンの投与を含む、ＨＣＶに感染した個体の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、輸血後および市中獲得型非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因として近年確認された。約１億７千万人がＨＣＶに慢性的に感染しており、有病率は１〜１０％である。有病率が１．８％の米国における医療費は２０億ドルであると推定される。４０〜６０％の肝疾患はＨＣＶによるものであり、３０％の英国移植患者はＨＣＶ感染のためである。ＨＣＶは、初め無症状の感染であり、患者の９０％以上が慢性疾患を発症する。この疾患過程は、典型的に、慢性活動性肝炎（７０％）、線維症、肝硬変（４０％）から肝細胞癌（６０％）に移行する。感染から肝硬変までの期間の中央値は２０年であり、肝細胞癌までは、２０年である（Ｌａｕｅｒ Ｇ．およびＷａｌｋｅｒ Ｂ． ２００１， Ｎ． Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ ３４５， ４１， Ｃｏｈｅｎ Ｊ． ２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５ （５４２４） ２６）。
【０００３】
ＨＣＶの治療を改善することが強く求められる。現在、利用可能な小分子複製阻害剤は存在しない。リボビリンとＰＥＧ化インターフェロンからなる現在の最良の標準治療が、ＨＣＶ感染治療の主軸を表している。しかし、現行の治療法が持続的な効果を達成する能力は依然として最適以下である（６ヶ月までの間、全体で５０％有効率だが、遺伝子型１ｂの場合、有効率はそれより低い（２７％））。この治療はまた、不快な副作用も伴う。これにより、特に、治療を始めて６ヶ月が過ぎると、有効率が急激に下降する。
【０００４】
いくつかの研究から、個々のＨＶＣタンパク質は正常なマウス（ＤＮＡによる免疫を受けたものを含む）において免疫原性であることがわかっている。数種のＨＣＶワクチンが、予防または治療のいずれかを目的として現在臨床試験中である。最も進んでいるのは、Ｅ１またはＥ２エンベロープタンパク質を用いたＣｈｉｒｏｎおよびＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓによるものでフェーズ２にある。Ｔｒａｎｓｖａｘによるエピトープワクチンもフェーズ２にある。また、各種の送達系（ＤＮＡを含む）による、コアおよび非構造抗原由来の配列を用いる数種のワクチンが、前臨床開発段階にある。
【０００５】
ＨＣＶはフラビウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは長さが９．４ ｋｂで、１つのオープンリーディングフレームを有する。ＨＣＶゲノムは、単一のポリタンパク質として翻訳され、これが、宿主およびウイルスプロテアーゼによりプロセシングされて、構造タンパク質（コア、エンベロープＥ１およびＥ２、ならびにｐ７）と、様々な酵素活性を有する６つの非構造タンパク質を産生する。１ｂ遺伝子型の一例であるＨＣＶ Ｊ４Ｌ６分離物のゲノムは、登録番号ＡＦ０５４２４７（Ｙａｎａｇｉ， Ｍ．， Ｓｔ Ｃｌａｉｒｅ，Ｍ．， Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．， Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｕ．， Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．およびＢｕｋｈ，Ｊ． “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ ａｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４４ （１）， １６１−１７２ （１９９８））として見出されているが、これを図１に示す。
【０００６】
エンベロープタンパク質によって、標的細胞の認識、これへの結合および進入が可能になる。ウイルス複製に関与する主要な非構造タンパク質としては、ＮＳ２（Ｚｎ依存性メタロプロテイナーゼ）、ＮＳ３（セリンプロテアーゼ／ヘリカーゼ）、ＮＳ４Ａ（プロテアーゼ補因子）、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ（ＲＮＡポリメラーゼ）が挙げられる（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ ＢおよびＬｏｈｍａｎｎ Ｖ． ２０００． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ． Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８１， １６３１）。
【０００７】
ＨＣＶポリタンパク質の構造は、次のように示すことができる（数字は、各タンパク質の第１アミノ酸の位置を示す；Ｊ４Ｌ６分離物の完全ポリタンパク質は、長さが３０１０アミノ酸である）。
【化１】
【０００８】
ウイルスの突然変異率は高く、保存および非保存領域のヌクレオチド配列に基づき、少なくとも６つの主要遺伝子型が明らかにされている。しかし、単一の患者から単離したＨＣＶは、常に近縁のゲノムもしくは準種の混合物として提示されるため、さらなる不均質性が存在する。
【０００９】
ＨＣＶゲノムは高度の遺伝子多様性を示し、これは、６つの主要な遺伝子型（１ａ、１ｂ、２、３、４、５および６）に分類される。遺伝子型１ａ、１ｂ、２および３は、欧州、北および南アメリカ、アジア、中国、日本およびオーストラリアで最も優勢である。遺伝子型４および５はアフリカで、また遺伝子型６は東南アジアでそれぞれ優勢である。
【００１０】
ＨＣＶ感染の治療法の改善と共に、多数のＨＣＶ遺伝子型を治療できる多様な能力の治療法も強く求められている。本発明の第１の態様では、様々な遺伝子型に対する保護が多様な新規ワクチン製剤を提供する。
【００１１】
１種以上のＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＨＣＶワクチンが記載されている。Ｎ３をコードするプラスミドＤＮＡまたはセムリキフォレストウイルスベクターを含むワクチンがＢｒｉｎｓｔｅｒらにより記載されている（２００２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８３， ３６９−３８１）。ＮＳ５ＢをコードするポリヌクレオチドワクチンがＷＯ９９／５１７８１に開示されている。ＨＣＶ Ｅ１、Ｅ１＋Ｅ２融合物、ＮＳ５Ａ およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードするコドン最適化遺伝子、ならびに、それを含むワクチンが、ＷＯ９７／４７３５８に記載されている。ＷＯ ０１／０４１４９は、コア、ＮＳ３、ＮＳ４もしくはＮＳ５Ａに由来する、ＨＣＶエピトープのモザイクをコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドを開示している。ワクチンに有用な融合タンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含む）、ならびにこのような融合タンパク質をコードするＤＮＡがＷＯ ０１／３０８１２に記載されている；随意に、上記融合タンパク質はコアタンパク質の断片を含むと言われている。ＷＯ ０３／０３１５８８には、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードするアデノウイルスベクターが記載され、これは、ワクチンとしての使用に適している。
【００１２】
「非処理の」コアタンパク質と非構造タンパク質を含むポリペプチドを含むワクチンがＷＯ ９６／３７６０６に記載されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＨＣＶタンパク質であるコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチドワクチンの提供に関する。本発明のポリヌクレオチドワクチンは、ＮＳ４Ａ ＨＣＶタンパク質および／またはＮＳ５Ａタンパク質をコードしない。また、本発明のポリヌクレオチドワクチンは、コア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂ ＨＣＶタンパク質をコードし、それ以外のＨＣＶタンパク質はコードしないのが好ましい。本発明はまた、医療における、および、ＨＣＶ感染の治療または予防のための医薬品の製造における、前記抗原をコードするポリヌクレオチドワクチンの使用を提供する。
【００１４】
本発明のワクチンに使用するポリヌクレオチド配列は、好ましくは、ＤＮＡ配列である。
【００１５】
ＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、様々な組合せまたは立体配置のものでありうる。例えば、タンパク質は、個々のタンパク質、もしくは融合タンパク質として発現されてもよい。融合物（ＤＮＡまたはタンパク質レベルのいずれでもよい）の例として、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂのアミノ酸配列を含む、もしくはコードする単一ポリペプチドまたはポリヌクレオチドからなる二重融合物（ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ）、ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂのアミノ酸配列を含む、もしくはコードする三重融合物、あるいは、本発明の４つの抗原すべての融合物（ｍＣｏｒｅ−ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ）が挙げられる。
【００１６】
本発明の好ましい融合物は、ＮＳ４ＢとＮＳ５Ｂ（ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＢまたはＮＳ５Ｂ−ＮＳ４Ｂ）；ならびに、コアとＮＳ３（ＮＳ３−コアまたはコア−ＮＳ３）の二重融合物をコードするポリヌクレオチドである。好ましい三重融合物は、ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００１７】
単一の抗原または融合タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、単一のまたは複数の発現ベクター中に存在することができる。各抗原をコードするポリヌクレオチドが、同じ発現ベクターまたはプラスミド中に存在することが好ましい。これに関連して、ＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単一発現カセットに存在するか、もしくはシリーズ発現カセットに複数存在してもよい。
【００１８】
他のＨＣＶタンパク質の発現を最適化するために、ＨＣＶコアタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの他のＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットの下流にある発現カセットに存在するのが好ましい。ＨＣＶコアタンパク質は、ＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットの下流にある発現カセットに存在するのが好ましい。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドワクチンによりコードされるポリペプチドは、全長アミノ酸配列を含むか、あるいは、このポリペプチドは、全長タンパク質より短くてもよく、その際、該ポリペプチドは、短くなった遺伝子の発現産物が、全長タンパク質と交差反応する免疫応答を生じさせることを可能にするのに十分な比率の全長ポリヌクレオチド配列を含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本来の配列の領域が欠失した切断型ＨＣＶタンパク質であるＨＣＶタンパク質の断片をコードすることができ、その際、最終断片は、本来の全長アミノ酸配列の９０％以下を含むが、本来の配列の７０％以下もしくは５０％以下であってもよい。別の言い方をすれば、長さが少なくとも８、例えば、８〜１０アミノ酸、あるいは長さが最高２０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０もしくは２００アミノ酸までの断片をコードするポリヌクレオチドは、コードされたオリゴまたはポリペプチドがＨＣＶ抗原性を示す限り、本発明の範囲内にあると考えられる。特に、しかし、限定するわけではないが、本発明のこの態様は、ポリヌクレオチドが完全なＨＣＶタンパク質配列の断片をコードし、該タンパク質の１以上の別々のエピトープを呈示しうる場合の状況も含む。
【００２０】
本発明の好ましいワクチンでは、ＨＣＶポリペプチドの少なくとも１つ、好ましいすべてを（末端）切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または突然変異により不活性化させる。例えば、ＮＳ３のヘリカーゼおよびプロテアーゼ活性は、遺伝子の突然変異により低減または破壊するのが好ましい。発現させたポリペプチドのＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性は、突然変異により低減または破壊するのが好ましい。発現させたポリペプチドのＮＳ４Ｂ活性は、突然変異により低減または破壊するのが好ましい。発現させたポリペプチドのコアタンパク質の活性は、切断または突然変異により低減または破壊するのが好ましい。この意味での突然変異には、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する付加、欠失、置換もしくは転位事象が含まれる。これ以外にも、全長配列を２つ以上の別々の部分に発現させてもよい。
【００２１】
ＨＣＶポリペプチドＮＳ３およびＮＳ５Ｂの機能構造および酵素機能については当分野で記載されている。
【００２２】
ＮＳ５Ｂは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして記載されている（Ｑｉｎら、２００１， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ３３， ｐｐ ７２８−７３７；Ｌｏｈｍａｎｎら、２０００， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ；Ｌｏｈｍａｎｎら、１９９７， Ｎｏｖ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８４１６−８４２８；Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、２０００， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２０（１）， ６９−８３）。ＮＳ５Ｂポリペプチドは、４つの機能性モチーフＡ、Ｂ、ＣおよびＤを有するものとして記載されている。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドワクチンによりコードされるＮＳ５Ｂポリペプチドを突然変異させることにより、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を低減または除去するのが好ましい。好ましくは、上記ポリペプチドを突然変異させることにより、ＮＳ５ＢのモチーフＡを破壊するが、例えば、２６３９位のアスパラギン酸（Ｄ）をグリシン（Ｇ）に置換する；または２６４４位のアスパラギン酸（Ｄ）をグリシン（Ｇ）に置換するなどがある。ワクチンポリヌクレオチドによりコードされるＮＳ５Ｂポリペプチドは、これら両方のアスパラギン酸突然変異を含むのが好ましい。
【００２４】
好ましくは、コードされたＮＳ５Ｂポリペプチドは、そのモチーフＣでの破壊を含む。例えば、非変異アスパラギン酸残基であるＤ２７３７をＨ、ＮまたはＥに置換する突然変異によってＮＳ５Ｂの完全な不活性化が起こる。
【００２５】
好ましくは、本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ５Ｂは、モチーフＡ突然変異を含むが、随意にモチーフＣ突然変異を含んでもよい。モチーフＡでの好ましい突然変異には、アスパラギン酸（Ｄ）２６３９のグリシンへの置換、およびアスパラギン酸（Ｄ）２６４４のグリシンへの置換が含まれる。後述の実施例１に記載するように、さらに別のコンセンサス突然変異が存在してもよい。
【００２６】
ＮＳ３は、プロテアーゼとヘリカーゼ活性の両方を持つものとして記載されている。本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ３ポリペプチドを突然変異させることにより、ＮＳ３のプロテアーゼおよびヘリカーゼ活性の両方を破壊するのが好ましい。ＮＳ３のプロテアーゼ活性は、Ｈ−１０８３、Ｄ−１１０７およびＳ−１１６５の「触媒三つ組（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）」に結合していることがわかっている。本発明のワクチンによりコードされるＮＳ３は、触媒三つ組残基に突然変異を含むのが好ましく、最も好ましくは、ＮＳ３はセリン１１６５からバリンへの単一の点突然変異を含む（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ．， Ｐｅｓｓｉ， ａ およびＳｔｅｉｎｋｕｈｌｅｒ Ｃ． １９９８． Ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｚｉｎｃ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ． Ａｎｔｉ− Ｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ３， １−１８）。
【００２７】
ＮＳ３の構造および機能は次のように表すことができる：
【化２】
【００２８】
ＮＳ３のヘリカーゼ活性については、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの４つの重要なモチーフが確認されている。本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ３は、これらモチーフの少なくとも１つに対する破壊的突然変異を含むのが好ましい。アスパラギン酸１３１６からグルタミンへの置換が存在するのが最も好ましい（Ｐａｏｌｉｎｉ， Ｃ， Ｌａｈｍ Ａ， Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ ＲおよびＧａｌｌｉｎａｒｉ Ｐ ２０００， Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｌｉｃａｓｅ． Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ８１， １６４９）。これらの最も好ましいＮＳ３突然変異、Ｓ−１１６５ＶもしくはＤ１３１６Ｑのいずれも、公知または予測されるＴ細胞エピトープ内に存在しない。
【００２９】
最も好ましくは、本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ３ポリペプチドは、セリン（Ｓ）１１６５からバリン（Ｖ）およびアスパラギン酸（Ｄ）１３１６からグルタミン（Ｑ）への突然変異を含む。加えて、後述の実施例１に記載するように、１以上のコンセンサス突然変異が存在してもよい。
【００３０】
ＨＣＶコアタンパク質の生物学的機能は複雑であり、個々の点突然変異と相関しない（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ Ｊ． ２０００． Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ｊ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ７， ２−４）。コアがリンホトキシンβ受容体と直接的に相互作用し、ＮＦκＢおよびＰＫＲ経路とも相互作用することができ、かつ細胞の生存およびアポトーシスにも影響を与えることができることが証明されている。コアを発現する組換えワクシニア構築物が、ｉｎ ｖｉｖｏでコアをより有毒にするワクシニアに対する細胞応答を阻害することが見出された。
【００３１】
感染中にコアタンパク質は宿主細胞のプロテアーゼによってウイルスポリタンパク質から２ヶ所で切断される。第１の切断は１９１位で生じ、Ｅ１のＮ末端を生成する。第２の切断が生じる残基は正確に位置付けられておらず、１７４〜１９１位のアミノ酸に存在し、それによって約１７アミノ酸の長さの短いコアペプチド配列を遊離させる（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ Ｊ． （２０００） Ｊ． Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ． ７， ２−１４； ＹａｓｕｉＫ， Ｌａｕ ＪＹＮ， Ｍｉｚｏｋａｍｉ Ｍ．，ら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９８． ７２ ６０４８−６０５５）。
【００３２】
本発明のワクチンに使用するコアポリペプチドは全長あるいは切断型の形態のいずれかである。コアポリペプチドは全長であってもよいが、その配列を再配列することによりコアタンパク質のあらゆる活性を破壊(又は阻害)する。コアポリペプチドを少なくとも２つの断片に分割してもよく、コアアミノ酸６６〜１９１とそれに続くアミノ酸１〜６５からなるポリペプチド、あるいはコアアミノ酸１０５〜１９１とそれに続くコアアミノ酸１〜１０４からなるポリペプチドを形成することが最も好ましい。
【００３３】
同一の細胞における他のＨＣＶタンパク質の産生に与えるコアの負の作用を最小にするために、使用されるコアタンパク質が切断型タンパク質であることが最も好ましい。本発明の好適な態様では、コードされるコアタンパク質は、他のＨＣＶタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断される。最も好ましくは、産生されるタンパク質の配列がコアの第２切断から生じる天然の遊離Ｃ末端ペプチド配列を欠くように；より好ましくはこのタンパク質が少なくとも最後の１０アミノ酸を欠くように、好ましくは少なくとも最後の１５アミノ酸を欠くように、より好ましくは最後の２０アミノ酸を欠くように、より好ましくは最後の２６アミノ酸を欠くように、そして最も好ましくは最後の４０アミノ酸を欠くように、コアタンパク質がカルボキシ末端から切断される。本発明における使用に適したコアをコードする最も好適なポリヌクレオチドは、１〜１７１位、１〜１６５位、１〜１５１位のアミノ酸を含有する切断型コアをコードするものである。本発明の使用に適したコアをコードするポリヌクレオチドが、１〜１５１位のアミノ酸の切断型コアタンパク質をコードするものであるのが最も好ましい。実施例１で説明するような１以上のコンセンサス突然変異が存在してもよい。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされる好ましいＮＳ４Ｂポリペプチドは、ＨＣＶ分離物と遺伝子型の間で超可変の領域を除去するようなＮ末端切断を含む。好ましくは、ＮＳ４Ｂポリペプチドは、Ｎ末端から３０〜１００アミノ酸、さらに好ましくは４０〜８０アミノ酸の欠失、最も好ましくは最初のＮ末端の４８アミノ酸の欠失を含む（Ｊ４Ｌ６分離物の場合、これは、アミノ酸１７６０までの切断に相当し、これは、ＮＳ４Ｂの最初の４８アミノ酸の消失である；その他のＨＣＶ分離物における同等の切断も本発明に含まれる）。さらに、ＮＳ４Ｂ配列を２つ以上の断片に分割し、野生型分子に認められるものとは違う順序で配置したＮＳ４Ｂの配列を有するポリペプチドに発現させてもよい。
【００３５】
本発明のワクチンに存在するポリヌクレオチドは、ＨＣＶウイルスに認められる天然ヌクレオチド配列を含んでもよいが、ヌクレオチド配列のコドンは、哺乳動物細胞での発現のために最適化されているものが好ましい。
【００３６】
コドンの最適化に加えて、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをコードする本発明のポリヌクレオチドでのコドン使用頻度を変更することにより、希有コドンが濃縮クラスターに現れるのではなく、反対に、ポリヌクレオチド配列全体にわたって比較的均等な間隔をおいて存在するか、あるいはコドン最適化遺伝子から排除されるようにする。
【００３７】
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、これらを用いて、３文字の「コドン」を綴るが、このコドンは、生物の遺伝子においてコードされたタンパク質のアミノ酸を表すものである。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直鎖状配列をこれら遺伝子によりコードされたタンパク質中のアミノの直鎖状配列に翻訳する。コードは高度に縮重しており、６１個のコドンが２０個の天然アミノ酸をコードし、３個のコドンが「停止」シグナルを表す。従って、ほとんどのアミノ酸は２個以上のコドンによりコードされる。実際には、数個が、４個以上の異なるコドンによりコードされる。
【００３８】
所与のアミノ酸をコードするのに１個以上のコドンが利用可能である場合には、生物のコドン使用頻度パターンは極めて非ランダムである。種によってコドン選択に偏りがあり、さらにコドンの使用は、単一の種においても、高および低レベルで発現する遺伝子間では著しく異なる可能性がある。この偏りは、ウイルス、植物、細菌および哺乳動物細胞で異なり、いくつかの種は、他の種よりランダムコドン選択から離れた強い偏りを示す。例えば、ヒトおよびその他の哺乳動物は、特定の細菌またはウイルスと比較してあまり強く偏っていない。これらの理由から、大腸菌に発現させた哺乳動物遺伝子、または哺乳動物細胞に発現させたウイルス遺伝子は、効率的な発現にとって不適切なコドン分布を有する。しかし、大腸菌発現に適したコドン使用頻度パターンを有する遺伝子をヒトに効率的に発現させることもできる。発現を起こそうとする宿主に稀に観察されるように、異種ＤＮＡ配列にコドンのクラスターが存在すると、その宿主での異種発現レベルが低いことが推定される。
【００３９】
宿主に希有なものから宿主が優先するものへコドンを変えて（「コドン最適化」）、異種発現レベルを増強するいくつかの例があり、例えば、ＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は、哺乳動物コドン使用頻度パターンについて最適化され、これは、哺乳動物（Ｃｏｓ−１）細胞培養物における野生型ＨＰＶ配列に対する発現レベルを増強することがわかっている（Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９９． ７３， ４９７２−４９８２）。この研究では、哺乳動物と比べてＢＰＶで２倍以上の頻度で生じた（使用頻度比＞２）すべてのＢＰＶコドンと、使用頻度比が＞１．５のほとんどのコドンを、優先的に用いられる哺乳動物コドンで保存的に置換した。ＷＯ９７／３１１１５、ＷＯ９７／４８３７０およびＷＯ９８／３４６４０（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）において、ＨＩＶ遺伝子またはそのセグメントのコドン最適化により、最適化を意図した宿主哺乳動物においてコドン最適化した配列をＤＮＡワクチンとして用いると、タンパク質発現が増大し、免疫原性が向上することがわかっている。これらの文献では、各ウイルスコドンを、意図する宿主の最適コドンで保存的に置換するため、配列は、全体が最適化コドンから構成される（ただし、これが、不要な制限部位、イントロンスプライス部位などを導入する場合を除く）。
【００４０】
「コドン使用頻度パターン」という用語は、上記のヌクレオチド配列、遺伝子もしくは遺伝子のクラス（例えば、高度に発現した哺乳動物遺伝子）におけるすべてのコドンについての平均頻度を意味する。哺乳動物（ヒトを含む）についてのコドン使用頻度パターンを文献にみいだすことができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６、２４：２１４−２１５参照）。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドでは、コドン使用頻度パターンは、ＨＣＶの典型的なものから、標的生物、例えば、大腸菌または哺乳動物、特にヒトのコドン出現偏りをより忠実に表すものに変更するのが好ましい。「コドン使用頻度係数」すなわちコドン適合指数（Ｓｈａｒｐ ＰＭ． Ｌｉ ＷＨ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １５（３）：１２８１−９５， １９８７）は、所与のポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが、標的種のパターンにどれくらい密に類似しているかの尺度である。６１個のコドンの各々についてのコドン出現頻度（選択したクラスの遺伝子について１０００コドン当たりの出現数として表される）を２０個の天然アミノ酸の各々について標準化して、各アミノ酸について最も使用頻度の高いコドンの値を１に設定し、これより少ない共通コドンの頻度が、０〜１の間になるように比例的に定められる。すなわち、６１個のコドンの各々が、標的種の高度発現遺伝子について１以下の値を割り当てられる。これを優先値（Ｗ）と呼ぶ。その種の高度発現遺伝子に対する特定のポリヌクレオチドのコドン使用頻度係数を算出するため、特定のポリヌクレオチドの各コドンについて定めた値を記録し、これらすべての値の相乗平均を求める（コドンの総数でこれらの値の自然対数の和を割り算し、真数（ａｎｔｉ−ｌｏｇ）を求める）。係数は０から１の間の値になり、係数が高いほど、そのポリヌクレオチドにおいて使用頻度の高いコドンが多い。ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度係数が１の場合には、全コドンが、標的種の高度発現遺伝子について「最も使用頻度の高い」コドンである。
【００４２】
本発明は、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢもしくはＮＳ５Ｂアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが、高度に発現した哺乳動物遺伝子のものに類似している、上記ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。上記ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高度に発現したヒト遺伝子のものに類似しているのが望ましい。
【００４３】
ＨＣＶコア（１−１９１）をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図２に示す。Ｓ１１６５ＶおよびＤ１３１６Ｑポリペプチド突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図３に示す。ポリペプチドのＮ末端１−４８切断を含むＨＣＶ ＮＳ４Ｂをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを図４に示す。Ｄ２６３９ＧおよびＤ２６４４Ｇポリペプチド突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ５Ｂをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図５に示す。
【００４４】
従って、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢもしくはＮＳ５Ｂアミノ酸配列を一緒にコードする複数のコドンを含み、本発明のワクチンを形成する合成遺伝子であって、上記アミノ酸配列をコードするのに用いられる可能なコドンの選択を最適哺乳動物コドン使用頻度に類似するように変更することにより、上記合成遺伝子におけるコドン使用頻度が、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子のそれより、高度に発現した哺乳動物遺伝子の使用頻度に密に類似するようにする、上記合成遺伝子が提供される。コドン使用頻度パターンは、高度に発現したヒト遺伝子のものと実質的に同じであるのが好ましい。「天然の」ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂ配列のコドン使用頻度については分析がなされている。ＨＣＶタンパク質のコドン使用頻度係数は、コア（０．４８７）、ＮＳ３（０．４８２）、ＮＳ４Ｂ（０．４８１）およびＮＳ５Ｂ（０．４５９）である。本発明のポリヌクレオチドは、一般に、高度に発現したヒト遺伝子について、０．５以上、好ましくは０．６以上、最も好ましくは０．７以上であるが、１以下のコドン使用頻度係数（すでに定義した通り）を有する。ポリヌクレオチドはまた、高度に発現した大腸菌遺伝子について０．５以上、好ましくは０．６以上、最も好ましくは０．７以上のコドン使用頻度係数を有する。
【００４５】
コドン最適化のほかにも、合成遺伝子を突然変異させることにより、希有コドンのクラスターの出現を排除する。これは２つの方法のいずれかにより達成することができる。これを達成する好ましい方法は、遺伝子配列から希有コドンを排除するものである。希有コドンを定義する一つの方法によれば、希有コドンは、標的生物の高度発現遺伝子において、特定のアミノ酸に用いられるコドンの＜２０％を占めるコドン、好ましくは、特定のアミノ酸について＜１０％を占めるコドンである。あるいは、標的生物の高度発現遺伝子において、相対同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）値が＜０．３、または好ましくは＜０．２のコドンとして希有コドンを定義することもできる。ＲＳＣＵ値は、観察されたコドン数を、該アミノ酸の全コドンが同等に高頻度で用いられた場合に予想される数で割って得られる数値である。希有コドンの適切な定義は当業者に明らかであろう。
【００４６】
あるいは、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂポリヌクレオチドを最適化することにより、濃縮領域に存在する希有の非最適コドンのクラスター形成を防止する。従って、個々の希有コドン、例えば、ＲＳＣＵが＜０．４（さらに好ましくは＜０．３）がポリヌクレオチド全体に均等な間隔をおいて存在するように、ポリヌクレオチドを最適化する。
【００４７】
ウエスタンブロットで評価されるように、コドンが最適化された突然変異コア、ＮＳ３およびＮＳ５Ｂの発現レベルは野生型と比べて増加することが示されている。切断型のコドン最適化ＮＳ４ＢはＮＳ５Ｂとの融合物として発現し、この融合物は十分に発現する。
【００４８】
本発明のワクチンは、ＨＣＶポリペプチドの個々の発現を指令するベクターを含む。あるいは、ＨＣＶポリペプチドを１以上の融合タンパク質として発現させてもよい。
【００４９】
本発明の好ましいワクチンは、タンパク質またはポリヌクレオチドレベルのいずれかで四重融合物を含み、そのような融合物として以下のものが挙げられる：
ＨＣＶ組合せ１： ＨＣＶ５００
【化３】
【００５０】
ＨＣＶ組合せ２： ＨＣＶ５１０
【化４】
【００５１】
ＨＣＶ組合せ３： ＨＣＶ５２０
【化５】
【００５２】
ＨＣＶ組合せ４： ＨＣＶ５３０
【化６】
【００５３】
ＨＣＶ組合せ５： ＨＣＶ５０１
【化７】
【００５４】
ＨＣＶ組合せ６： ＨＣＶ５０２
【化８】
【００５５】
ＨＣＶ組合せ７：
【化９】
【００５６】
他の好適な融合物はHCV組合せ１、２および３に類似しているが、ここで、コアタンパク質は切断型コアタンパク質、典型的にはコア1−151である。本発明の別の好ましいワクチンを以下に挙げるが、これらは、同じプラスミド内の様々な発現カセットに存在するポリヌクレオチド二重および三重融合物を含み、各カセットは、プロモーターユニット（例：ＨＣＭＶ ＩＥ）の独立した制御下にある（矢印で示す）。
【００５７】
このような二重プロモーター構築物は、同じ細胞内で４つのタンパク質抗原の発現を２つの別個のタンパク質として駆動する（矢印で示す）。
【化１０】
【００５８】
好適な構築物はHCV組合せ7、9、11、または12である。特に好適なものは7と11である。
【００５９】
本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドワクチンは場合によりコアタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まない。例えば、本発明のこの態様における好適なポリヌクレオチドは下記のものを含む。
【化１１】
【００６０】
上記ＨＣＶ組合せ８〜１９について、用いた用語、例えば、（コアＮＳ３）＋（ＮＳ４Ｂ５Ｂ）は、各々が個別のプロモーターにより独立に制御される２つの発現カセット、この例の場合、コアＮＳ３二重融合タンパク質をコードする１つの発現カセットと、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ二重融合タンパク質をコードする別のカセットを含むポリヌクレオチドベクターの開示を意味する。各ＨＣＶ組合せ８〜１９も同様に解釈すべきである。
【００６１】
前記ＨＣＶ組合せ１〜１９は、ＨＣＶタンパク質、ポリタンパク質融合物、もしくはポリヌクレオチドの相対配向を開示する。また、前記ＨＣＶ組合せ１〜１９のすべては、構成タンパク質の活性を除去するのに好ましい突然変異または切断の各々と一緒に開示されることが具体的に記載される。例えば、組合せ１〜１９の好ましい変異体（別途記載のない限り）は、コア（１−１９１（生物学的活性を不能にする2以上の断片への分割配列を除く）または好ましくは、その切断型１−１５１または１−１６５もしくは１−１７１で存在するコア）；ＮＳ３ １０２７−１６５７（ヘリカーゼ（アスパラギン酸１３１６からグルタミン）およびプロテアーゼ（セリン１１６５からバリン）活性を不活性化するための突然変異；ポリメラーゼ活性を不活性化させるためのＮＳ５Ｂ ２４２０−３０１０（アスパラギン酸２６３９からグリシンおよびアスパラギン酸２６４４からグリシンへの突然変異、モチーフＡ）；ならびに、ＮＳ４Ｂ １７１２−１９７２（随意に１７６０−１９７２に切断して、Ｎ−末端高度可変断片を除去する）を含む。
【００６２】
本発明は、前述したような新規のＤＮＡワクチンとポリペプチドを提供する。また、本発明により、記載したポリペプチドの類似体、ならびにそれらを含むＤＮＡワクチンが提供される。
【００６３】
用語「類似体」とは、本発明の別のポリペプチドと同じアミノ酸をコードするが、遺伝子コードの重複性を通して、異なるヌクレオチド配列を有するが、同じコドン使用頻度パターンを維持する、例えば、同じコドン使用頻度係数、または他方のポリヌクレオチドのそれの０．１以内、好ましくは、０．０５以内のコドン使用頻度係数を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００６４】
ＨＣＶポリヌクレオチド配列は、様々なＨＣＶ遺伝子型、株もしくは分離物のいずれに由来するものでもよい。ＨＣＶ分離物は、１以上のサブタイプを含む以下の６つの主要遺伝子型：ＨＣＶ １（１ａ、１ｂもしくは１ｃ）、ＨＣＶ ２（２ａ、２ｂもしくは２ｃ）、ＨＣＶ ３（３ａ、３ｂ、１０ａ）、ＨＣＶ ４（４ａ）、ＨＣＶ ５（５ａ）ならびにＨＣＶ ６（６ａ， ６ｂ， ７ｂ， ８ｂ， ９ａおよび１１ａ）に分類することができる（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ２００１， ６９３−７１２）。本発明に関して、各ＨＣＶタンパク質は、同じＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプ、あるいは、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプのいずれかの組合せに由来するものでよく、さらには、ＨＣＶタンパク質を用いてもよい。遺伝子は、１ｂ遺伝子型、例えば、感染性クローンＪ４Ｌ６（登録番号ＡＦ０５４２４７８、図１を参照）に由来するのが好ましい。
【００６５】
配列決定されている具体的株として、ＨＣＶ−Ｊ（Ｋａｔｏら、１９９０， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８７；９７２４−９５２８）およびＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、１９９１， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：１１０５−１１１３）が挙げられる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、コードされたタンパク質の発現（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏのいずれで起こってもよい）による生産に有益である。従って、上記ヌクレオチドは、例えば、収率を高めるための組換えタンパク質合成に関与する、あるいは、ＤＮＡワクチン接種法に使用される治療剤として独立に用いることも可能である。本発明のポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでコードしたタンパク質の生産に用いる場合には、例えば、細胞培養物中の細胞を改変して、発現させようとするポリヌクレオチドを含むようにする。このような細胞として、一過性の、または好ましくは安定な哺乳動物細胞系が挙げられる。本発明のポリタンパク質をコードするベクターの挿入により改変することができる細胞の特定例としては、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３およびＣＯＳ細胞が挙げられる。選択する細胞系は、安定しているだけでなく、ポリタンパク質の成熟グリコシル化と細胞表面発現を可能にするものが好ましい。発現は、形質転換した卵母細胞で達成することができる。ポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞において、本発明のポリヌクレオチドから発現させることができる。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるトランスジェニック非ヒト動物も本発明の範囲に含まれる。
【００６７】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。このような発現ベクターは、分子生物学の分野では日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡと好適な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよびその他のエレメント（例えば、タンパク質発現に必要で、そのために正しい配向で配置されるポリアデニル化シグナルなど）を含むことができる。その他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関するさらに別の例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．（１９８９）を参照されたい。
【００６８】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド、またはベクターにおいて本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を達成することが可能な制御配列に機能しうる形で連結されている。すなわち、このベクターは発現ベクターである。「機能しうる形で連結されている」という用語は、記載した要素が、意図される様式でそれらが機能できるような関係にある並置を意味する。コード配列に「機能しうる形で連結された」調節配列（例えば、プロモーターなど）は、調節配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように配置される。
【００６９】
発現カセットは、目的の配列または遺伝子の発現を指令することができる集合体である。発現カセットは、制御エレメント、例えば、目的の遺伝子に機能しうる形で連結されたプロモーターなどを含む。
【００７０】
上記ベクターは、例えば、複製起点を備えるプラスミド、人工染色体（例：ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ）、ウイルスもしくはファージベクターでよく、随意に、ポリヌクレオチドの発現用のプロモーター、また随意にプロモーターのレギュレータでもよい。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含み、例えば、細菌プラスミドの場合には、アンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子を、あるいは、真菌ベクターの場合には耐性遺伝子を含む。ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで用いて、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを産生することもできるし、あるいはベクターを用いて宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換することにより、例えば、ベクターがコードしたタンパク質を生産することも可能である。また、ベクターを改変して、ＤＮＡワクチン接種法または遺伝子治療法にｉｎ ｖｉｖｏで用いることも可能である。
【００７１】
プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞と適合するように選択することができる。例えば、哺乳動物プロモーターとして、カドミウムのような重金属に応答して誘導することができるメタロチオネインプロモーター、およびβアクチンプロモーターが挙げられる。また、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、もしくはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を用いてもよい。これらプロモーターはすべて周知であり、当分野において容易に入手可能である。
【００７２】
好適なウイルスベクターの例として、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアもしくはαウイルスベクターおよびレトロウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。これらのウイルスを用いた遺伝子移入の方法は当業者には知られている。例えば、レトロウイルスベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定に組み込むことができるが、このような組換えは好ましくない。対照的に、複製能欠損アデノウイルスベクターは、エピソームのままであるため、一過的発現を可能にする。例えば、サブユニットワクチンとして、または免疫アッセイで使用するために、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞もしくは細菌での発現を駆動することができるベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドがコードした多量のＨＣＶタンパク質を生産することができる。
【００７３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載したポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、本発明の第２の態様に従うＤＮＡベクターを含む。好ましい実施形態では、上記組成物は、ＨＣＶアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含むＤＮＡでコーティングした複数の粒子、好ましくは金粒子を含み、上記ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高度に発現させた哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子のパターンに類似している。別の実施形態では、前記組成物は、医薬的に許容されうる賦形剤と、本発明の第２の態様のＤＮＡベクターを含む。前記組成物はまた、アジュバントも含む。
【００７４】
ＤＮＡワクチンは、液体ワクチンの筋肉への間隙投与（ＷＯ９０／１１０９２）または筋内注射以外の機構により送達することができる。例えば、皮膚への送達は、免疫機構が、感染に対する障壁となる組織（例えば、皮膚や粘膜など）において極めて活発であることから有利である。皮膚への送達は、注射、ジェット式注射器（皮膚、または筋肉などの下層組織に高圧下で液体を強制的に送り出す）もしくはパーティクルボンバードメント（この場合、上皮を貫通するのに十分な密度の粒子にＤＮＡをコーティングしうる）（米国特許第５３７１０１５号）により実施することができる。例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４： ３７−４２（１９９６）に記載されているように、ヌクレオチド配列をプラスミドに組み込み、これを金ビーズにコーティングした後、これらビーズを高圧下で表皮に投与する。皮膚へのこれら粒子の投入により、表皮細胞および表皮ランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎ）細胞両方の直接トランスフェクションが達成される。ランゲルハンス細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ＤＮＡを取り込み、コードされたペプチドを発現し、これらをプロセッシングして細胞表面ＭＨＣタンパク質に展示する。トランスフェクションされたランゲルハンス細胞は、リンパ節に移動し、そこで、展示された抗原断片をリンパ球に提示して、免疫応答を引き起こす。粒子が媒介する皮膚への送達により免疫応答を誘発するには、非常に少量のＤＮＡ（１μｇ以下、往々にして０．５μｇ以下）でよいが、これは、直接筋内注射後に免疫応答を生じさせる場合、ミリグラム量のＤＮＡを必要とすることが知られているのとは対照的である。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドを治療薬、例えば、ＤＮＡワクチン接種に使用する場合には、ワクチン接種しようとする哺乳動物、例えば、ヒトに核酸を投与する。ＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＤＮＡのような核酸は、前記のようなベクターの形態で提供され、これを該哺乳動物の細胞に発現させることができる。ポリヌクレオチドは、利用可能な方法のどれで投与してもよい。例えば、核酸は、針注射、好ましくは、皮内、皮下もしくは筋内注射により投与する。あるいは、粒子媒介ＤＮＡ送達（ＰＭＤＤ）のような核酸送達装置を用いて、核酸を皮膚内に直接送達することもできる。この方法では、不活性粒子（金ビーズなど）を核酸でコーティングし、例えば、投射装置からの高圧下放出により、粒子が受容体（例：皮膚）の表面を貫通するのに十分な速度で加速する。（本発明の核酸分子でコーティングした粒子は、このような粒子を装填した送達装置と同様に、本発明の範囲に含まれる）。組成物は、０．５〜５μｍ、好ましくは約２μｍの平均直径を有する金粒子を含むのが望ましい。好ましい実施形態では、コーティングした金ビーズをカートリッジとして機能する管に装填し、各カートリッジが、１カートリッジ当たり０．１〜５μｇ、好ましくは約０．５μｇのＤＮＡをコーティングした０．１〜１ｍｇ、好ましくは約０．１ ｍｇの金を含むようにする。
【００７６】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載したようなポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、細菌、例えば、大腸菌、哺乳動物、例えば、ヒトでもよいし、あるいは昆虫細胞でもよい。本発明のベクターを含む哺乳動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションした培養細胞でもよいし、あるいは、哺乳動物へのベクターの投与により哺乳動物細胞をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションすることもできる。
【００７７】
別の態様では、本発明は、前記のような医薬組成物を製造する方法であって、野生型ＨＣＶヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンを変更するか、またはポリヌクレオチド配列を合成により形成して、高度発現哺乳動物遺伝子に類似したコドン使用頻度パターンを有し、かつ野生型ＨＣＶアミノ酸配列、もしくはポリペプチドの１以上の天然の機能を不活性化するのに十分なアミノ酸変化を有する野生型配列を含む突然変異ＨＣＶアミノ酸配列、をコードする配列を製造するステップを含む、上記方法を提供する。
【００７８】
また、ＨＣＶ感染の治療または予防における、本明細書に記載したポリヌクレオチドまたはワクチンの使用も提供する。
【００７９】
患者に裸のポリヌクレオチドまたはベクターを導入する好適な方法として、好適なビヒクルを用いた局所適用がある。例えば、鼻内、経口、膣内もしくは直腸内投与により、核酸を皮膚、または粘膜表面に局所投与してもよい。裸のポリヌクレオチドまたはベクターは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような医薬的に許容されうる賦形剤と一緒に存在してもよい。ＤＮＡ取込みは、ブピバカインのような促進剤を別々に、またはＤＮＡ製剤に含有させて用いることにより、さらに容易にすることができる。核酸を受容者に直接投与する別の方法としては、超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよびマイクロシーディング（米国特許第５，６９７，９０１号に記載されている）が挙げられる。
【００８０】
核酸構築物の取込みは、複数の周知のトランスフェクション法、例えば、トランスフェクション剤の使用を含む方法により増強することができる。これらの薬剤の例としては、カチオン剤、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ならびに、リポフェクタント、例えば、リポフェクタムおよびトランスフェクタムが挙げられる。投与しようとする核酸の用量は変更することができる。典型的に核酸は、粒子媒介遺伝子送達の場合には、１ｐｇ〜１ｍｇ、好ましくは１ｐｇ〜１０μｇ核酸の範囲、またその他の経路の場合には、１０μｇ〜１ｍｇの範囲の量を投与する。
【００８１】
また、本発明の核酸配列は、遺伝子治療に有用な専用送達ベクターにより投与することもできる。遺伝子治療法については、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７， ３８９：２３９−２４２に記載されている。ウイルスおよび非ウイルスベクター系のいずれを用いてもよい。ウイルス系としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、カナリア痘およびワクシニア−ウイルスベースの系が挙げられる。好ましいアデノウイルスベクターは、ヒト以外の霊長類に由来するものである。特に、米国特許第６０８３７１６号に記載されているＰａｎ ９（Ｃ６８）、ＷＯ０３／０４６１２４に記載されているＰａｎ５、６ もしくは７が挙げられる。
【００８２】
非ウイルスベースの系としては、核酸、ミクロスフィアカプセル化法（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）と、リポソームベースの系の直接投与が挙げられる。最初のワクチン接種後にブースター注射を実施するのが望ましい場合には、ウイルスおよび非ウイルス送達系を組み合わせてもよく、例えば、プラスミドのような非ウイルスベクターを用いた最初の「初回感作（プライム）」ＤＮＡワクチン接種の後、ウイルスベクターまたは非ウイルスベースの系を用いた１回以上の「追加免疫（ブースト）」ワクチン接種を行なう。プライム−ブーストプロトコルは、アジュバント中のタンパク質で初回感作し、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡまたはウイルスベクターで追加免疫するという利点もある。あるいは、タンパク質を基剤とするワクチンをブースターとして用いてもよい。タンパク質ワクチンは、ＤＮＡ／ウイルスベクターのワクチンが含むすべての抗原を含むのが好ましい。しかし、タンパク質は個別の形態でも、ポリタンパク質の形態をしていてもよい。
【００８３】
本発明の核酸配列は、形質転換した細胞により投与することもできる。このような細胞として、被験者から採取した細胞がある。本発明の裸のポリヌクレオチドまたはベクターをこのような細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入し、その後、形質転換した細胞を被験者に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドは、相同組換え事象により細胞にすでに存在する核酸に組み込むことができる。所望であれば、形質転換した細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、こうして得られた１個以上の細胞を本発明で用いてもよい。公知の手術またはマイクロサージャリー法（例：移植、マイクロインジェクションなど）により患者の適切な部位に細胞を送達することができる。
【００８４】
好適な細胞としては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）があり、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣに工学的に操作されてもよいその他の細胞が挙げられる。このような細胞は、遺伝子的に改変することにより、抗原提示能力を増大する、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改善する、それ自体で抗腫瘍、例えば抗子宮頸部癌効果を有する、ならびに／あるいは受容体（すなわち、対合ＨＬＡハプロタイプ）と免疫学的に適合性となるようにすることもできるが、必ずしも必要なわけではない。ＡＰＣは一般に、生物由来の多様な体液および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれから単離されてもよく、オートロガス、同種異系、同系もしくは異種細胞のいずれでもよい。
【００８５】
本発明の特定の好ましい実施形態では、樹状細胞またはその前駆細胞を抗原提示細胞として用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換させてから患者に戻すか、あるいは、例えば、粒子媒介ＤＮＡ送達により、ワクチン中の被送達ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ標的として用いる。樹状細胞は高い能力を有するＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ およびＳｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１， １９９８）、予防または治療のための抗腫瘍免疫を誘発する生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０：５０７−５２９， １９９９）。一般に、樹状細胞は、その典型的な形状（ｉｎ ｓｉｔｕで星形、ｉｎ ｖｉｒｔｏ視覚化可能な顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）と、高い効率で抗原を取り込み、プロセッシングおよび提示する能力、ナイーブＴ細胞応答を活性化する能力に基づいて、確認することができる。勿論、樹状細胞を工学的に操作して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで樹状細胞に通常認められない特定の細胞−表面受容体またはリガンド、例えば、本発明の構築物にコードされた抗原を発現させることも可能であり、このような改変された樹状細胞も本発明によって意図される。樹状細胞に代わるものとして、分泌小胞抗原負荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（エキソソームと称する）をワクチンの中で用いてもよい（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：５９４−６００， １９９８参照のこと）。
【００８６】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織−浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血もしくはその他の好適な組織または体液から取得することができる。例えば、樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦのようなサイトカインの組合せを末梢血液から収集した単球の培養物に添加することにより、ｅｘ ｖｉｖｏで分化させることができる。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦ、ＣＤ４０リガンド、リポ多糖ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド（プロフェショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞の産生に重要なサイトカイン）および／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘発するその他の化合物の組合せを培養培地に添加することにより、末梢血、臍帯血もしくは骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞を樹状細胞に分化させることができる。
【００８７】
ＡＰＣは一般に、抗原のＨＣＶアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、本発明で考慮されるコドン最適化ポリヌクレオチドでトランスフェクションすることもできる。このようなトランスフェクションは、ｅｘ ｖｉｖｏで行うことができ、トランスフェクションしたそのような細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書に記載するように、治療の目的で用いることができる。あるいは、樹状、またはその他の抗原提示細胞をターゲッティングする遺伝子送達ビヒクルを患者に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションを起こすことも可能である。樹状細胞のｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションは、例えば、ＷＯ ９７／２４４４７に記載されているような当分野では公知の方法のいずれか、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６−４６０， １９９７に記載された粒子媒介方法を用いて、一般に実施することができる。
【００８８】
本発明のワクチンおよび医薬組成物は、抗ウイルス剤、例えば、αインターフェロン、好ましくは、ＰＥＧ化αインターフェロンおよびリボバリンと組合せて用いてもよい。ワクチンおよび医薬組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封したアンプルまたはバイアルに収容することができる。このような容器は、気密シールすることにより、使用まで製剤の滅菌を保存するのが好ましい。一般に、製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液もしくは乳濁液として保存することができる。これ以外にも、凍結乾燥した状態でワクチンまたは医薬組成物を保存し、使用の直前に滅菌液体担体を添加するだけにしてもよい。粒子媒介送達による投与を意図する場合のヌクレオチド配列含有ワクチンは、圧縮ガス送達装置に用いるのに適したカートリッジの形態をしていてもよく、その際、カートリッジは、中空の管からなり、その内面は、随意に医薬的に許容されうる他の成分が存在してもよいワクチンヌクレオチド配列を担持する粒子でコーティングされている。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、アジュバント化合物、もしくはＤＮＡによりコードされるタンパク質により誘発される免疫応答をモジュレートまたは増強するのに役立つその他の物質を含んでもよい。これらは、抗原とは別に、または抗原との融合物としてＤＮＡによりコードされるか、あるいは、製剤の非ＤＮＡエレメントとして含有させてもよい。本発明の製剤に含有させることができるアジュバントタイプの物質の例として、ユビキチン、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、ｆｌｔ３−リガンドおよびその他のサイトカイン（例：ＩＦＮ−γおよびＧＭＣＳＦ）が挙げられる。
【００９０】
上記以外の好適なアジュバントは、以下に挙げる市販のもの、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， デトロイト、ＭＩ）；イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（３Ｍ， Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）；レシミキモド（３Ｍ， セントポール、ＭＮ）；メルクアジュバント（Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ）６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， ローウェイ、ＮＪ）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン的に誘導体化した多糖；ポリホスファゼン；生物分解性ミクロスフェア；モノホスホリル脂質ＡおよびクイルＡである。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦもしくはインターロイキン−２、−７もしくは−１２もアジュバントとして用いることができる。
【００９１】
本発明の製剤では、アジュバント組成物が、主にＴｈ１型の免疫応答を誘発するのが好ましい。従って、アジュバントは、ＤＮＡがコードした抗原に応答して生じた免疫応答を主にＴｈ２型から主にＴｈ１型の応答へとモジュレートする上で役立つものである。高レベルのＴｈ−１型サイトカイン（例：ＩＦＮ−、ＴＦＮ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介免疫応答の誘発を有利にする傾向がある。応答が主にＴｈ１型である好ましい実施形態では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより大幅に増大するであろう。これらのサイトカインのレベルは標準的アッセイを用いて、容易に評価することができる。サイトカインのファミリーについては、Ｍｏｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：１４５−１７３， １９８９を参照されたい。
【００９２】
従って、Ｔｈ１型が優勢な応答を誘発するための使用に適したアジュバントとしては、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。Ｔｈ１型免疫応答を優先的に誘発するその他の公知のアジュバントとして、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがある。このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６にも記載されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、同じまたは異なるポリヌクレオチド構築物におけるＨＣＶ抗原から個別にコードされたものでもよいし、もしくは、例えば、該抗原との融合物として、それらにすぐ隣接していてもよい。あるいはまた、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを個別に、すなわち、コードされた抗原を含む組成物の一部としてではなく、投与してもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、単独でも、他のアジュバントと組み合わせて用いてもよい。例えば、増強された系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ ００／０９１５９およびＷＯ ００／６２８００に記載されているようなＣｐＧとＱＳ２１の組合せを含む。この製剤は、さらに水中油形乳濁液および／またはトコフェロールを含むのが好ましい。
【００９３】
別の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， フラミンガム、ＭＡ）であり、これは単独でも、他のアジュバントと組み合わせて用いてもよい。例えば、増強された系は、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組合せ、例えば、ＷＯ ９４／００１５３に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ ９６／３３７３９に記載されているように、ＱＳ２１をコレステロールでクエンチングした、反応性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の低い組成物を含む。別の好ましい製剤は、水中油形乳濁液およびトコフェロールを含む。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよび水中油形乳濁液中のトコフェロールを含む、特に効力のあるアジュバント製剤については、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【００９４】
別の好ましいアジュバントとして、モンタニドＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、デトクス（Ｄｅｔｏｘ）（Ｒｉｂｉ、ハミルトン、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、ハミルトン、ＭＴ）ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が挙げられる。
【００９５】
ワクチンがアジュバントを含む場合、ワクチン製剤を２部に分けて投与してもよい。例えば、抗原をコードするヌクレオチド構築物を含む製剤の部分を、例えば、皮下または筋内注射、あるいは経皮粒子媒介送達により最初に投与してから、アジュバントを含む製剤の部分をその直後、またはワクチン分野に精通した医師には明らかな適当な時間をおいて、投与することができる。このような状況で、アジュバントは、抗原製剤と同じ経路、または別の経路のいずれにより投与してもよい。別の実施形態では、製剤のアジュバント部分を抗原部分の前に投与する。一実施形態では、アジュバントは局所製剤として、抗原をコードするヌクレオチド配列の粒子媒介送達の部位で、その粒子媒介送達の前または後のいずれかに、皮膚に適用する。
【００９６】
好ましくは、本発明のＤＮＡワクチンは、有効な免疫応答、典型的には、ＨＣＶ抗原に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋免疫を刺激する。好ましくは、広範囲のエピトープに対する免疫を刺激する。治療に用いる場合には、ワクチン接種の後、肝線維症および／または炎症を軽減するのが好ましい。
【００９７】
本明細書で用いる「含む」という用語は、非制限的意味で用いることを意図しており、その他の要素の存在も排除されない。しかし、「含んでいる」という用語は、その排他的意味で理解できるように意図することもあり、その場合、「構成される」または「からなる」と同等である。本発明を以下の実施例により説明するが、これらに限定されるわけではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１ 抗原パネルに導入した突然変異
１）コンセンサス突然変異
すべての既知ＨＣＶ分離物の全ゲノム配列を比較した。Ｊ４Ｌ６ポリタンパク質内の特定の位置を、他の大部分のＨＣＶ分離物から、特異である／逸脱するものとして確認した。特に重要なのは、これらの位置が、１ａ、２、３群、およびその他の群（この群では、さもなくば、同等の位置に１または２個の別のアミノ酸残基が占めていた。）に及ぶ関連１ｂ群の分離物全体のより一致性の高い残基から逸脱することが認められたことである。選択したコンセンサス突然変異で、既知ＣＤ４またはＣＤ８エピトープを妨害するものはない。ＮＳ３における２つの変更により、実際に免疫優性ＨＬＡ−Ｂ３５制限ＣＤ８エピトープを修復する［イソロイシン（Ｉ）１３６５からバリン（Ｖ）、およびグリシン（Ｇ）１３６６からアラニン（Ａ）］。
【００９９】
不用な可変性のために、ＮＳ４Ｂの最初の５１アミノ酸を除去した。
【０１００】
コア：
アラニン（Ａ）５２からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１０１】
ＮＳ３：
バリン（Ｖ）１０４０からロイシン（Ｌ）へ。
【０１０２】
ロイシン（Ｌ）１１０６からグルタミン（Ｑ）へ。
【０１０３】
セリン（Ｓ）１１２４からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１０４】
バリン（Ｖ）１１７９からイソロイシン（Ｉ）へ。
【０１０５】
トレオニン（Ｔ）１２１５からセリン（Ｓ）へ。
【０１０６】
グリシン（Ｇ）１２８９からアラニン（Ａ）へ。
【０１０７】
セリン（Ｓ）１２９０からプロリン（Ｐ）へ。
【０１０８】
イソロイシン（Ｉ）１３６５からバリン（Ｖ）へ。
【０１０９】
グリシン（Ｇ）１３６６からアラニン（Ａ）へ。
【０１１０】
トレオニン（Ｔ）１４０８からセリン（Ｓ）へ。
【０１１１】
プロリン（Ｐ）１４２８からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１１２】
イソロイシン（Ｉ）１４２９からセリン（Ｓ）へ。
【０１１３】
イソロイシン（Ｉ）１６３６からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１１４】
ＮＳ４Ｂ：
フェニルアラニン（Ｆ）１７６０でＯＲＦを開始。
【０１１５】
ＮＳ５Ｂ：
イソロイシン（Ｉ）２８２４からバリン（Ｖ）へ。
【０１１６】
トレオニン（Ｔ）２８９２からセリン（Ｓ）へ。
【０１１７】
トレオニン（Ｔ）２９１８からバリン（Ｖ）へ。
【０１１８】
Ｎ．Ｂ．：番号付けは、Ｊ４Ｌ６分離物のポリタンパク質における位置に従う。
【０１１９】
実施例２ プラスミドＤＮＡワクチンの構築
ＨＣＶコア、ＮＳ３、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチド配列に対し、ＳｙｎＧｅｎｅ ２ｅソフトウエアを用い、哺乳動物コドン使用頻度についてコドン最適化を実施した。コドン使用頻度係数は、各ポリヌクレオチドについて０．７以上まで改善された。コドン最適化、酵素ノックアウト突然変異、ならびにコンセンサス突然変異を組み込んだ新しいポリヌクレオチド配列各々のセンスおよびアンチセンス鎖を４０〜６０ヌクレオチドの領域（２０ヌクレオチドのオーバーラップを含む）に分割した。これらの領域を商業的に合成し、オリゴアッセンブリィＰＣＲ法によりポリヌクレオチドを製造した。
【０１２０】
クローニングに用いられるユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を例示する、各ポリヌクレオチドの外側正方向および逆方向ＰＣＲプライマーの概略を以下に記載する。
【化１２】
【０１２１】
単一抗原をコードするポリヌクレオチドはすべて、Ｎｏｔ ＩおよびＢａｍＨＩユニーククローニング部位を介して哺乳動物発現ベクターｐ７３１３ｉｅにクローン化した（図７参照）。
【０１２２】
コードされたポリタンパク質は、以下の通りであった（突然変異とコドン最適化を含む）。
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【０１２３】
実施例３ 免疫応答アッセイ
Ｃ５７ＢＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｐ７３１３ベクターにおいて個別に発現させた４つのＨＣＶ抗原のＷＴまたはコドン最適化＋突然変異形態で免疫した。１．０μｇ／カートリッジの標準用量を含むＰＭＩＤによりマウスを免疫し、２１日目に追加免疫（追加免疫１）、４９日目に再度追加免疫（追加免疫２）した。脾細胞を個々のマウスから採取し、様々なＨＣＶ抗原製剤を用いたＥＬＩＳＰＯＴで再刺激した。ＩＬ２およびＩＦＮγ応答の両方を測定した。免疫応答を測定するのに用いた試薬は、ミクロゲン（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ）、ワクシニア−コアおよびワクシニアＮＳ３−５（社内の遺伝子型１ｂ）からの精製ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ（遺伝子型１ｂ）タンパク質であった。
【０１２４】
ＨＣＶコア：
ＷＴ全長（ＦＬ−１−１９１）または切断型（ＴＲ１−１１５）コアで免疫したＣ５７ＢＬマウスをＨＣＶコアタンパク質で再刺激したところ、精製コアタンパク質を用いて良好な応答が観察された（図８）。
【０１２５】
ＨＣＶ ＮＳ３：
ｐ７３１３ ＷＴと、ＰＭＩＤを用いてコドン最適化したＮＳ３とでマウスを免疫した。ＮＳ３タンパク質とワクシニア３−５の両方を用いたＣ５７Ｂｌマウスにおいて、免疫および１回の追加免疫後、ＮＳ３に対する良好な応答が実証され、ＥＬＩＳＰＯＴにより応答を読み出した。ＩＬ２およびＩＦＮγ応答の両方を検出した。この実験では、野生型と、コドン最適化した（ｃｏ ＋ ｍ）形態の構築物との間に有意な差は観察されなかった（図９）。しかし、一過的トランスフェクション後のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現には、野生型とコドン最適化構築物との間に差が認められた。ＤＮＡ用量が低い構築物、または一次応答を比較する実験から、プラスミドの効力の差が明らかになると考えられる。
【０１２６】
ＨＣＶ ＮＳ４Ｂ：
ＢＡＬＢ／ｃマウスのＰＭＩＤ免疫後に、全長ＷＴ ｐ７３１３ ＮＳ４Ｂに対する応答を観察した。ＮＳ４Ｂタンパク質およびワクシニア３−５のいずれかでｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激後に、ＩＬ２およびＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の両方を観察した（図１０）。
【０１２７】
ＮＳ４Ｂタンパク質をＮ末端で切断することにより、高度可変領域を除去したが、Ｎ末端領域に対して利用可能な抗血清が産生されていたため、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション実験後に、タンパク質の発現を検出することはできなかった。この領域の発現を確認するために、これをＮＳ５Ｂタンパク質と融合させた。近年の実験から、ＮＳ４Ｂタンパク質とＮＳ３−５ワクシニアを用いて、切断型ＮＳ４Ｂタンパク質（単独またはＮＳ５Ｂとの融合物として）に対し免疫応答を検出できることが確認されている。ＷＴおよびコドン最適化ＮＳ４Ｂに対して良好な応答を観察した。
【０１２８】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ：
ＷＴおよびコドン最適化（ｃｏ＋Ｍ）配列を用いた免疫後に、ＰＭＩＤ後のＮＳ５Ｂに対する免疫応答を調べた。ＮＳ３タンパク質とワクシニア３−５の両方を用いたＣ５７ＢＬマウスにおいて、免疫および１回の追加免疫後、ＮＳ５Ｂに対する良好な応答が実証され、ＥＬＩＳＰＯＴにより応答を読み出した。ＮＳ３を用いた場合と同様、この実験でも、ＷＴとｃｏ＋ｍ形態の構築物との間に、免疫応答の差は認められなかった（図１１）。
【０１２９】
実施例４ ＨＣＶポリタンパク質の発現
４つの選択したＨＣＶ抗原コア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをｐ７３１３ｉｅにフォーマット化することにより、単一の融合ポリタンパク質として発現させた。これらの抗原を以下に示すように様々な構築物において異なる順序で発現させた。（４つの抗原の各々がアミノ末端の位置を順に占めるように、単一ポリタンパク質の発現をコードする構築パネルを設計し、この重要な位置で１つの抗原の存在が他の抗原に対し、発現のレベルを有意に改善するのか、あるいは低減させるのかをモニターした。）さらに、コアタンパク質を２つの断片、すなわち、コア６６−１９１＞１−６５と１０５−１９１＞１−１０４を介して再配置した、２つの構築物を製造した。
【化１７】
【０１３０】
標準的な製造者のプロトコルに従い、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、標準化量のＤＮＡをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を回収し、ＭＯＰＳまたはＭＥＳ既製バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかで前形成したＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、ＮＳ５Ｂ全タンパク質に対して産生したウサギ抗血清を用いて、タンパク質発現をモニターした。二次プローブは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）に結合させた抗ウサギ免疫グロブリン抗血清であり、続いて、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、化学発光検出を実施した。
【０１３１】
この発現実験の結果を図１２に示す。これらの結果から、ポリタンパク質はすべて、同様の程度まで発現するが、ＮＳ５Ｂを発現する単一抗原に認められるものよりは低いレベルである。ＨＣＶ５００の分子量がやや低いのは、Ｎ末端位置からのＨＣＶコアの切断のためである。ＨＣＶ５０２は、クローニングの誤りによりこの実験では検出されなかった。別のクローンを用いた反復実験では、ＨＣＶ５０２の発現レベルは他のポリタンパク質と類似していた。
【０１３２】
実施例５ ＨＣＶポリタンパク質に対する免疫応答の検出
ポリタンパク質の各々をコードするＤＮＡ（１μｇ）を含むＰＭＩＤによりＣ５７ＢＬマウスを免疫し、実施例４に記載したようにそれから３週間後に追加免疫した。ＥＬＩＳＰＯＴ、またはＨＣＶ抗原に対する細胞内サイトカインの産生を用いて、追加免疫から７日後に免疫応答をモニタリングした。
【０１３３】
ＨＣＶ遺伝子産物に対するＴ細胞応答についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
脾細胞の調製：
追加免疫から７日後に、免疫動物から脾臓を取得した。脾臓をスライドガラスの間で粉砕して処理することにより、細胞懸濁液を生成した。塩化アンモニウム処理で赤血球を溶解させた後、細胞破片を除去することにより、脾細胞の微細な懸濁液を得た。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いるため、マウスが一次免疫しか受けていない場合は４×１０６／ｍｌ、またマウスが追加免疫を受けている場合には２×１０６／ｍｌの濃度で細胞をＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。
【０１３４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
１５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）のラット抗マウスＩＦＮγまたはラット抗マウスＩＬ−２（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）でプレートを被覆した。プレートは＋４℃で一晩被覆した。使用前に、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。４×１０５細胞／ウェルで脾細胞をプレートに添加した。組換えＨＣＶ抗原をミクロゲン（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ）から取得し、１μｇ／ｍｌで用いた。１〜１０μＭの最終濃度でペプチドをアッセイに用いることにより、ＣＤ４またはＣＤ８応答を測定した。これらのペプチドは、Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから取得した。各ウェルの合計容量は２００μｌであった。抗原で刺激した細胞を含むプレートを、加湿した３７℃のインキュベーター内で１６時間インキュベートした。いくつかの実験では、ＮＳ３−５またはワクシニア野生型を発現する組換えワクシニアに感染させた細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで抗原として用いた。
【０１３５】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイプレートの展開：
水で１回（細胞の溶解を確実にするため１分浸ける）、次にＰＢＳで３回洗浄することにより、プレートから細胞を除去した。ビオチン結合ラット抗マウスＩＦＮγまたはＩＬ−２（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）を１μｇ／ｍｌでＰＢＳに添加した。プレートを室温で攪拌しながら２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｃａｌｔａｇ）を１／１０００希釈で添加した。ＰＢＳで３回の洗浄後、ＢＣＩＣＰ基質（Ｂｉｏｒａｄ）を用いた１５〜４５分のインキュベーションにより、スポットが明らかになった。水を用いて基質を洗浄してから、プレートを乾燥させた。イメージ分析装置を用いて、スポットを数えた。
【０１３６】
ペプチド刺激に応答するＴ細胞からのＩＦＮγおよびＩＬ−２産生を検出するためのフローサイトメトリー：
試験管１本当たり約３×１０６個の脾細胞に等分し、回転することによりペレットとした。上清を除去し、サンプルを激しく攪拌し、ペレットを壊した。０．５μｇの抗ＣＤ２８＋０．５μｇの抗ＣＤ４９ｄ（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）を各試験管に添加し、室温で１０分放置することによりインキュベートした。適切な試験管に１ｍｌの培地を添加したが、これは培地だけか、もしくはＨＣＶ抗原を含む培地であった。次にサンプルを加熱水浴中に３７℃で１時間インキュベートした。１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを各試験管に添加し、３７℃でのインキュベーションをさらに５時間継続した。プログラム化した水浴を６℃に戻し、その温度で一晩維持した。
【０１３７】
抗マウスＣＤ４−ＣｙＣｈｒｏｍｅ（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）と抗マウスＣＤ８ビオチン（Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈ）でサンプルを染色した。サンプルを洗浄し、ストレプトアビジン−ＥＣＤで染色した。サンプルを洗浄し、「イントラプレップ膜透過試薬（Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）」キット（Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈ）から１００μｇの固定液を１５分室温で添加した。洗浄後、イントラプレップキットからの１００μｇの膜透過試薬を、抗ＩＦＮ−γ−ＰＥ＋抗ＩＬ−２−ＦＩＴＣを含む各サンプルに添加した。サンプルを室温で１５分インキュベートした後、洗浄した。サンプルを０．５ ｍｌバッファー中に再懸濁させ、フローサイトメーターで分析した。
【０１３８】
１サンプル当たり合計５００，０００個の細胞を収集してから、ＣＤ４およびＣＤ８細胞をゲーティングすることにより、刺激に応答してＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌する細胞の集団を測定した。
【０１３９】
これらの結果から、様々な順序でコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをコードするポリタンパク質はすべてＮＳ３（すなわち、ＨＣＶ ５００、５１０、５２０、５３０）に対する免疫応答を刺激できることがわかった。ＩＬ２（図１３Ａ）およびＩＦＮ−γ（図１３Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴによりモニタリングしたところ、ＮＳ３タンパク質に対する応答は、ＨＣＶポリタンパク質（ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０）の各々で類似していた。
【０１４０】
応答細胞の表現型をＩＣＳによりさらに詳細に分析した。良好なＣＤ４＋Ｔ細胞応答が免疫優性ＮＳ３ ＣＤ４特異的ペプチドに対して誘発され、これは、ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０間で類似していた。
【表１】
【０１４１】
抗原の存在または非存在下で６時間、最後の４時間はブレフェルジンＡの存在下で、脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ特異的なＴ細胞応答が検出された。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのゲーティングおよびＩＦＮγ ＦＩＴＣでの染色により、ＩＦＮｇが検出された。
【０１４２】
また、ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０での免疫後、免疫優性ＮＳ３特異的ペプチドに対する強いＣＤ８応答が生じ、ＣＤ８＋細胞の２．５〜６％の頻度に達した。
【０１４３】
ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０での免疫によって、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂ抗原の両方に対するＣＤ４およびＣＤ８応答も検出されたが、ＣＤ８応答は、後の単一抗原での免疫後に比べ、ポリタンパク質に対して弱かった。
【表２】
【０１４４】
抗原の存在または非存在下で６時間、最後の４時間はブレフェルジンＡの存在下で、脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ特異的なＴ細胞応答が検出された。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのゲーティングおよびＩＦＮγ ＦＩＴＣでの染色により、ＩＦＮｇが検出された。
【表３】
【０１４５】
抗原の存在または非存在下で６時間、最後の４時間はブレフェルジンＡの存在下で、脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ特異的なＴ細胞応答が検出された。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのゲーティングおよびＩＦＮγ ＦＩＴＣでの染色により、ＩＦＮｇが検出された。
【０１４６】
用いたペプチドは以下の配列を有する。
【化１８】
【０１４７】
内因的にプロセッシングされた抗原の認識：
ＨＣＶポリタンパク質でのＰＭＩＤ免疫が、内因的にプロセッシングされた抗原を認識することができる応答を誘発したか否かを決定するために、ＮＳ３−５を発現するワクシニア組換えウイルスに感染させた標的細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで刺激因子として用いた。結果から、５００、５１０、５２０および５３０での免疫後、良好なＩＬ２およびＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答が検出されたことがわかる（図１４）。
【０１４８】
ＨＣＶポリタンパク質での免疫は機能的ＣＴＬ活性を誘導する：
ＮＳ３だけ、ＨＣＶ５００、５１０および５２０をコードする０．０１μｇのＤＮＡでＣ５７ＢＬマウスを免疫した。初回免疫および１回の追加免疫後、各グループからの脾細胞をＮＳ３ ＣＤ８ペプチドおよびＩＬ２で５日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。同じペプチドを用いてパルスしたＥＬ４細胞に対するＣＴＬ活性を測定した。すべての構築物で免疫したマウスが、このアッセイにおいて同様の死滅レベルを示した。
【０１４９】
このことから、ＨＣＶポリタンパク質によるＰＭＩＤ免疫が機能的ＣＤ８応答を誘発できることがわかる。結果を図１５に示す。
【０１５０】
実施例６ 二重プロモーター構築物を介したＨＣＶ抗原の送達
以下に示す方法を用いて、二重プロモーター構築物を作製した。発現カセット１（アイオワ−レングス（Ｉｏｗａ−ｌｅｎｇｔｈ）ＣＭＶプロモーター、エクソン１、目的のタンパク質／融合タンパク質をコードする遺伝子、プラス、ウサギグロビンポリ−Ａシグナル）を保有する断片をその宿主ベクター、すなわちｐ７３１３ｉｅから、ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位ＣｌａＩおよびＸｍｎＩにより切除した。ＸｍｎＩは、切除した断片の３−プライム（ｐｒｉｍｅ）末端に平滑末端を形成した。
【０１５１】
受容プラスミドベクターは、発現カセット２を含むｐ７３１３ｉｅであった。これは、ユニーク制限エンドヌクレアーゼＳｓｅ８３８７Ｉによる消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートして、形成された３−プライムオーバーハングを除去することによって、線状分子の５−プライム末端および３−プライム末端の両方を平滑末端にすることにより、作製した。これは、２５９ ｂｐ断片を除去するユニーク制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩを用いて切断された。
【０１５２】
ＣｌａＩ／平滑適合性末端を介して、発現カセット１をｐ７３１３ｉｅ／発現カセット２にクローン化して、ｐ７３１３ｉｅ／発現カセット１＋発現カセット２を作製したが、その際、カセット１はカセット２の上流に位置した。
【０１５３】
以下のものを含むｐ７３１３ｉｅプラスミドを作製した。
【化１９】
【０１５４】
上に示した構築物パネルは完全であり、ウェスタンブロットにより、２９３Ｔ細胞における一過的トランスフェクションからの発現についてモニターした。ウェスタンブロット分析の結果を図１６に示す：
レーンの説明：
１．ｐ７３１３ｉｅ／コア
２．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３
３．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ５B
４．ｐ７３１３ｉｅ／コアＮＳ３
５．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４B５B
６．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３コア
７．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３４B５B
８．ｐ７３１３ｉｅ／コアＮＳ３＋ＮＳ４B５B
９．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４B５B＋コアＮＳ３
１０．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３コア＋ＮＳ４B５B
１１．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４B５B＋ＮＳ３コア
１２．ｐ７３１３ｉｅ／コア＋ＮＳ３４B５B
１３．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３４B５B＋コア
構築物の各対は２つの独立した発現カセットを保有する。カセットをベクターに挿入する順序が、いずれかのカセットからの発現に影響を及ぼすとは予想しなかった。しかし、これらの結果から、ＮＳ４Ｂ５ＢまたはＮＳ３４Ｂ５Ｂ融合タンパク質の発現に関して、それぞれの発現カセットがコア、ＮＳ３コア、もしくはコアＮＳ３カセットの下流に位置するとき、有意に不利であることがわかる。
【０１５５】
発現レベルは、単一抗原構築物ほど明確ではないが、大きさの有意な増大（１７５〜２２８％）のためにある程度の低減が予想され、これは、細胞に送達されるプラスミドのコピー数の減少（同じ質量のＤＮＡに対して約５０％以下の減少）を意味する。
【０１５６】
二重プロモーター構築物により誘発されるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性:
免疫原性実験のために、４つの抗原すべての最大発現を呈示した３つの二重プロモーター構築物を選択した。これらは、ｐ７３１３ｉｅ ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ＋コア／ＮＳ３、ｐ７３１３ｉｅ ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ＋ＮＳ３コアおよびｐ７３１３ｉｅ ＮＳ３／ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ＋コアであった。Ｃ５７ＢＬマウスをＰＭＩＤにより１μｇのＤＮＡで免疫し、７日後、ＩＬ２についてはＥＬＩＳＰＯＴを用いて、優性ＮＳ３ ＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対する応答を測定した。結果（図１７に示す）から、単一免疫（ＣＤ４およびＣｄ８ ＮＳ３Ｔ細胞特異的なペプチドで刺激した脾細胞）後、すべての二重プロモーター構築物に対して応答が観察されたことがわかる。
【０１５７】
実施例７ コアの欠失突然変異
コアのＯＲＦをコードする多数の遺伝子を、３’末端から１回につき２０アミノ酸にわたる領域ずつ徐々に欠失させて作製し、完全に配列決定した。
【表４】
【０１５８】
図１８は、コアの断片をコードする遺伝子の範囲を示すＤＮＡアガロースゲルを表す。これらの構築物の発現を、ＮＳ４Ｂ５Ｂ 融合物（ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４Ｂ５Ｂ）の発現レベルへのそれらの作用と併せて、２９３Ｔ細胞での共トランスフェクションにより試験した。結果を図１９に示す。レーンは以下のようにロードされた。
【表５】
【０１５９】
コア１９１、コアΔ１５、コア１７１、コア１５１、およびコア１３１の発現は、ＮＳ４Ｂ５Ｂの発現の抗ＮＳ５Ｂ検出後、ウェスタンブロットを抗コアでプローブすると、はっきりと検出される。恐らく、用いたゲル系のサイズキャプチャー（ｓｉｚｅ−ｃａｐｔｕｒｅ）制限のために、コアの別の切断形態は検出されていない。
【０１６０】
結果から、コア１９１およびコアΔ１５の存在下でのＮＳ４Ｂ５Ｂの発現レベルに、両コア種の強い発現にもかかわらず、有意な低減（これは、コア１７１、そして再度コア１５１で回復する）が明らかである。この観察は、ＮＳ４Ｂ５Ｂで２回、ＮＳ３およびＮＳ５Ｂで１回繰り返した。
【０１６１】
実施例８ ＮＳ３、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ融合物およびＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ三重融合物の発現に対するコアおよびコア１５１の影響
実験１−トランスフォーマットでの発現：
コアをトランスで発現させる、すなわち別々のプラスミド上にコードさせた場合に、非構造抗原の発現に対するコア１９１対コア１５１の発現の影響を比較してモニタリングするための実験を実施した。実験プロトコルは、実施例７に記載したのと同じであった。簡単にいうと、標準的プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を用いて、各々０．５μｇの２種のＤＮＡプラスミドベクター（概略を以下の表に示す）をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中に共トランスフェクションした。（トランスフェクションおよびウェスタンブロット方法は、実施例４に記載の通り）。
【０１６２】
結果を図２０に示すが、同図では、レーンを以下の表に記載したようにロードしており、ウェスタンブロット分析を実施することにより、主として抗ＮＳ３および抗ＮＳ５Ｂ抗血清を用いて非構造タンパク質の発現、および抗コアを含む同じブロットの二次プローブによりコアの発現を検出した。
【表６】
【０１６３】
すべてのケースで、コア１５１と一緒にトランスで産生された場合、非構造タンパク質または融合物（ＮＳ３、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ）の量は、コア１９１と一緒にトランスで発現させたときに産生されるレベルと比較して、有意に増加することが示された。
【０１６４】
実験２−シスフォーマットでの発現：
コアをシスで発現させる、すなわち、非構造要素と融合した同じプラスミド上にコードさせた場合に、非構造抗原の発現に対するコア１９１対コア１５１の発現の影響を比較してモニタリングするための実験を実施した。各ケースで、コア１５１は、指定した非構造領域とカルボキシ末端融合したコア１９１に置換した。
【０１６５】
標準的プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を用いて、１μｇのＤＮＡプラスミドベクター（概略を以下の表に示す）をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションさせた（トランスフェクションおよびウェスタンブロット方法は、実施例４に記載の通り）。
【０１６６】
結果を図２１に示す。ウェスタンブロット分析を実施することにより、ゲルＡにおいて、主として抗ＮＳ３および抗ＮＳ５Ｂ抗血清を用いて非構造成分の発現、及び抗コアを含む同じブロットの二次プローブによりコアの発現を検出した。レーンは以下の表に記載するようにロードした。
【表７】
【０１６７】
結果から、抗原がポリタンパク質融合物の形態であるシス様式では、コアの切断により、融合タンパク質の発現が増大することがわかる。
【０１６８】
ＮＳ３に対する免疫応答に対するコア１９１およびコア１５１の影響の比較：
Ｃ５７ＢＬマウスをＰＭＩＤにより全ＤＮＡ１．５μｇの２回の注射で免疫した。免疫したグループは、空ベクターｐ７３１３ｉｅだけ、ｐ７３１３ｉｅＮＳ３、ｐ７３１３ｉｅＮＳ５Ｂとｐ７３１３ｉｅコア１９１またはｐ７３１３ｉｅＮＳ３、ｐ７３１３ｉｅＮＳ５Ｂとｐ７３１３ｉｅコア１５１による金ビーズの共コーティングを含んでいた。共コーティングを用いたのは、これによって、すべてのプラスミドが同じ細胞に送達され、この細胞が、前記のｉｎ ｖｉｔｒｏ共トランスフェクション実験を模倣すると考えられるためである。初回免疫から１４日後、ＩＦＮγおよびＩＬ２抗原特異的な応答を測定するための細胞内サイトカイン染色を用いて、ＮＳ３からの優性ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答を測定した。結果（図２２に示す）から、ＣＤ４およびＣＤ８ ＮＳ３応答は、コア１９１と比較してコア１５１の存在下で約２倍以上高くなったことがわかる。
【０１６９】
別の実験では、コア１９１またはコア１５１のいずれかと一緒に、ｐ７３１３ｉｅＮＳ３／ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ 三重融合物を発現するプラスミドを共コーティングした金ビーズでＣ５７ＢＬマウスを免疫した。マウスをさらに同じ構築物で追加免疫し、追加免疫から７日後に、応答を測定するために細胞内サイトカイン染色を用いてＮＳ３に対する応答をモニターした。図２３に示した結果から、ＮＳ３抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８応答は、コア１９１と比較して、コア１５１の存在下で約２倍高いことがわかる。
【０１７０】
コアの存在下でのＮＳ３に対する応答を比較するｉｎ ｖｉｖｏ実験全体は、ＦＬコアと非構造タンパク質の同時送達により非構造抗原の発現が低減する可能性があり、これによって、構築物の免疫原性が低下するというｉｎ ｖｉｔｒｏ発現データを支持する。この影響は、Ｃ末端４０アミノ酸が除去された切断型コアを共コーティングすることにより少なくとも部分的に解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１−１】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−２】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−３】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−４】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−５】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図２】コドン最適化ＨＣＶコアポリヌクレオチド。
【図３】コドン最適化ＨＣＶ ＮＳ３ポリヌクレオチド。
【図４】コドン最適化ＨＣＶ ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド。
【図５】コドン最適化ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリヌクレオチド。
【図６−１】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム（野生型配列）の翻訳。
【図６−２】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム（野生型配列）の翻訳。
【図７】ｐ７３１３−ｉｅの構造。
【図８】コアに対する免疫応答。
【図９】ＮＳ３免疫原性。
【図１０】ＮＳ４Ｂに対する免疫応答。
【図１１】ＮＳ５Ｂに対する免疫応答。
【図１２】抗ＨＣＶ ＮＳ５Ｂを用いるタンパク質発現のモニタリング。
【図１３】ＩＬ２（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ） ＥＬＩＳＰＯＴによるＮＳ３タンパク質に対する免疫応答。
【図１４】ＮＳ３−５を発現するワクシニアウイルスに感染させた脾細胞を刺激因子とするＩＬ２及びＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果。
【図１５】ＨＣＶポリタンパク質でのＰＭＩＤ免疫による機能的ＣＤ８応答の誘発。
【図１６】２９３Ｔ細胞での一過的トランスフェクションからの発現を示すウエスタンブロット分析の結果。
【図１７】二重プロモーター構築物により誘導されるＮＳ３ Ｔ細胞応答の比較。
【図１８】コアの断片をコードする遺伝子の範囲を示すＤＮＡアガロースゲル。
【図１９】２９３Ｔ細胞での共トランスフェクションとＮＳ４Ｂ５Ｂ融合物の発現レベル。
【図２０】２９３Ｔ細胞での共トランスフェクション後のＮＳ３、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ４Ｂ５Ｂ、およびＮＳ３４Ｂ５Ｂの発現に対するコアおよびコア１５１の影響。
【図２１】２９３Ｔ細胞での一過的トランスフェクションにおけるコア１５１のコア１９１への置換後の融合タンパク質の発現に対する影響。
【図２２】ＮＳ３からの優性ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答。
【図２３】ＮＳ３に対するＣＤ４及びＣＤ８応答。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ならびにそれに関連する症候および疾患の治療および予防に有用な方法および組成物に関する。特に、本発明は、ＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチン、ならびに、本発明のワクチンの投与を含む、ＨＣＶに感染した個体の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、輸血後および市中獲得型非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因として近年確認された。約１億７千万人がＨＣＶに慢性的に感染しており、有病率は１〜１０％である。有病率が１．８％の米国における医療費は２０億ドルであると推定される。４０〜６０％の肝疾患はＨＣＶによるものであり、３０％の英国移植患者はＨＣＶ感染のためである。ＨＣＶは、初め無症状の感染であり、患者の９０％以上が慢性疾患を発症する。この疾患過程は、典型的に、慢性活動性肝炎（７０％）、線維症、肝硬変（４０％）から肝細胞癌（６０％）に移行する。感染から肝硬変までの期間の中央値は２０年であり、肝細胞癌までは、２０年である（Ｌａｕｅｒ Ｇ．およびＷａｌｋｅｒ Ｂ． ２００１， Ｎ． Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ ３４５， ４１， Ｃｏｈｅｎ Ｊ． ２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５ （５４２４） ２６）。
【０００３】
ＨＣＶの治療を改善することが強く求められる。現在、利用可能な小分子複製阻害剤は存在しない。リボビリンとＰＥＧ化インターフェロンからなる現在の最良の標準治療が、ＨＣＶ感染治療の主軸を表している。しかし、現行の治療法が持続的な効果を達成する能力は依然として最適以下である（６ヶ月までの間、全体で５０％有効率だが、遺伝子型１ｂの場合、有効率はそれより低い（２７％））。この治療はまた、不快な副作用も伴う。これにより、特に、治療を始めて６ヶ月が過ぎると、有効率が急激に下降する。
【０００４】
いくつかの研究から、個々のＨＶＣタンパク質は正常なマウス（ＤＮＡによる免疫を受けたものを含む）において免疫原性であることがわかっている。数種のＨＣＶワクチンが、予防または治療のいずれかを目的として現在臨床試験中である。最も進んでいるのは、Ｅ１またはＥ２エンベロープタンパク質を用いたＣｈｉｒｏｎおよびＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓによるものでフェーズ２にある。Ｔｒａｎｓｖａｘによるエピトープワクチンもフェーズ２にある。また、各種の送達系（ＤＮＡを含む）による、コアおよび非構造抗原由来の配列を用いる数種のワクチンが、前臨床開発段階にある。
【０００５】
ＨＣＶはフラビウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは長さが９．４ ｋｂで、１つのオープンリーディングフレームを有する。ＨＣＶゲノムは、単一のポリタンパク質として翻訳され、これが、宿主およびウイルスプロテアーゼによりプロセシングされて、構造タンパク質（コア、エンベロープＥ１およびＥ２、ならびにｐ７）と、様々な酵素活性を有する６つの非構造タンパク質を産生する。１ｂ遺伝子型の一例であるＨＣＶ Ｊ４Ｌ６分離物のゲノムは、登録番号ＡＦ０５４２４７（Ｙａｎａｇｉ， Ｍ．， Ｓｔ Ｃｌａｉｒｅ，Ｍ．， Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．， Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｕ．， Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．およびＢｕｋｈ，Ｊ． “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ ａｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４４ （１）， １６１−１７２ （１９９８））として見出されているが、これを図１に示す。
【０００６】
エンベロープタンパク質によって、標的細胞の認識、これへの結合および進入が可能になる。ウイルス複製に関与する主要な非構造タンパク質としては、ＮＳ２（Ｚｎ依存性メタロプロテイナーゼ）、ＮＳ３（セリンプロテアーゼ／ヘリカーゼ）、ＮＳ４Ａ（プロテアーゼ補因子）、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ（ＲＮＡポリメラーゼ）が挙げられる（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ ＢおよびＬｏｈｍａｎｎ Ｖ． ２０００． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ． Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８１， １６３１）。
【０００７】
ＨＣＶポリタンパク質の構造は、次のように示すことができる（数字は、各タンパク質の第１アミノ酸の位置を示す；Ｊ４Ｌ６分離物の完全ポリタンパク質は、長さが３０１０アミノ酸である）。
【化１】
【０００８】
ウイルスの突然変異率は高く、保存および非保存領域のヌクレオチド配列に基づき、少なくとも６つの主要遺伝子型が明らかにされている。しかし、単一の患者から単離したＨＣＶは、常に近縁のゲノムもしくは準種の混合物として提示されるため、さらなる不均質性が存在する。
【０００９】
ＨＣＶゲノムは高度の遺伝子多様性を示し、これは、６つの主要な遺伝子型（１ａ、１ｂ、２、３、４、５および６）に分類される。遺伝子型１ａ、１ｂ、２および３は、欧州、北および南アメリカ、アジア、中国、日本およびオーストラリアで最も優勢である。遺伝子型４および５はアフリカで、また遺伝子型６は東南アジアでそれぞれ優勢である。
【００１０】
ＨＣＶ感染の治療法の改善と共に、多数のＨＣＶ遺伝子型を治療できる多様な能力の治療法も強く求められている。本発明の第１の態様では、様々な遺伝子型に対する保護が多様な新規ワクチン製剤を提供する。
【００１１】
１種以上のＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＨＣＶワクチンが記載されている。Ｎ３をコードするプラスミドＤＮＡまたはセムリキフォレストウイルスベクターを含むワクチンがＢｒｉｎｓｔｅｒらにより記載されている（２００２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８３， ３６９−３８１）。ＮＳ５ＢをコードするポリヌクレオチドワクチンがＷＯ９９／５１７８１に開示されている。ＨＣＶ Ｅ１、Ｅ１＋Ｅ２融合物、ＮＳ５Ａ およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードするコドン最適化遺伝子、ならびに、それを含むワクチンが、ＷＯ９７／４７３５８に記載されている。ＷＯ ０１／０４１４９は、コア、ＮＳ３、ＮＳ４もしくはＮＳ５Ａに由来する、ＨＣＶエピトープのモザイクをコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドを開示している。ワクチンに有用な融合タンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含む）、ならびにこのような融合タンパク質をコードするＤＮＡがＷＯ ０１／３０８１２に記載されている；随意に、上記融合タンパク質はコアタンパク質の断片を含むと言われている。ＷＯ ０３／０３１５８８には、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードするアデノウイルスベクターが記載され、これは、ワクチンとしての使用に適している。
【００１２】
「非処理の」コアタンパク質と非構造タンパク質を含むポリペプチドを含むワクチンがＷＯ ９６／３７６０６に記載されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＨＣＶタンパク質であるコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチドワクチンの提供に関する。本発明のポリヌクレオチドワクチンは、ＮＳ４Ａ ＨＣＶタンパク質および／またはＮＳ５Ａタンパク質をコードしない。また、本発明のポリヌクレオチドワクチンは、コア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂ ＨＣＶタンパク質をコードし、それ以外のＨＣＶタンパク質はコードしないのが好ましい。本発明はまた、医療における、および、ＨＣＶ感染の治療または予防のための医薬品の製造における、前記抗原をコードするポリヌクレオチドワクチンの使用を提供する。
【００１４】
本発明のワクチンに使用するポリヌクレオチド配列は、好ましくは、ＤＮＡ配列である。
【００１５】
ＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、様々な組合せまたは立体配置のものでありうる。例えば、タンパク質は、個々のタンパク質、もしくは融合タンパク質として発現されてもよい。融合物（ＤＮＡまたはタンパク質レベルのいずれでもよい）の例として、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂのアミノ酸配列を含む、もしくはコードする単一ポリペプチドまたはポリヌクレオチドからなる二重融合物（ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ）、ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂのアミノ酸配列を含む、もしくはコードする三重融合物、あるいは、本発明の４つの抗原すべての融合物（ｍＣｏｒｅ−ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ）が挙げられる。
【００１６】
本発明の好ましい融合物は、ＮＳ４ＢとＮＳ５Ｂ（ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＢまたはＮＳ５Ｂ−ＮＳ４Ｂ）；ならびに、コアとＮＳ３（ＮＳ３−コアまたはコア−ＮＳ３）の二重融合物をコードするポリヌクレオチドである。好ましい三重融合物は、ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００１７】
単一の抗原または融合タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、単一のまたは複数の発現ベクター中に存在することができる。各抗原をコードするポリヌクレオチドが、同じ発現ベクターまたはプラスミド中に存在することが好ましい。これに関連して、ＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単一発現カセットに存在するか、もしくはシリーズ発現カセットに複数存在してもよい。
【００１８】
他のＨＣＶタンパク質の発現を最適化するために、ＨＣＶコアタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの他のＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットの下流にある発現カセットに存在するのが好ましい。ＨＣＶコアタンパク質は、ＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットの下流にある発現カセットに存在するのが好ましい。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドワクチンによりコードされるポリペプチドは、全長アミノ酸配列を含むか、あるいは、このポリペプチドは、全長タンパク質より短くてもよく、その際、該ポリペプチドは、短くなった遺伝子の発現産物が、全長タンパク質と交差反応する免疫応答を生じさせることを可能にするのに十分な比率の全長ポリヌクレオチド配列を含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本来の配列の領域が欠失した切断型ＨＣＶタンパク質であるＨＣＶタンパク質の断片をコードすることができ、その際、最終断片は、本来の全長アミノ酸配列の９０％以下を含むが、本来の配列の７０％以下もしくは５０％以下であってもよい。別の言い方をすれば、長さが少なくとも８、例えば、８〜１０アミノ酸、あるいは長さが最高２０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０もしくは２００アミノ酸までの断片をコードするポリヌクレオチドは、コードされたオリゴまたはポリペプチドがＨＣＶ抗原性を示す限り、本発明の範囲内にあると考えられる。特に、しかし、限定するわけではないが、本発明のこの態様は、ポリヌクレオチドが完全なＨＣＶタンパク質配列の断片をコードし、該タンパク質の１以上の別々のエピトープを呈示しうる場合の状況も含む。
【００２０】
本発明の好ましいワクチンでは、ＨＣＶポリペプチドの少なくとも１つ、好ましいすべてを（末端）切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または突然変異により不活性化させる。例えば、ＮＳ３のヘリカーゼおよびプロテアーゼ活性は、遺伝子の突然変異により低減または破壊するのが好ましい。発現させたポリペプチドのＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性は、突然変異により低減または破壊するのが好ましい。発現させたポリペプチドのＮＳ４Ｂ活性は、突然変異により低減または破壊するのが好ましい。発現させたポリペプチドのコアタンパク質の活性は、切断または突然変異により低減または破壊するのが好ましい。この意味での突然変異には、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する付加、欠失、置換もしくは転位事象が含まれる。これ以外にも、全長配列を２つ以上の別々の部分に発現させてもよい。
【００２１】
ＨＣＶポリペプチドＮＳ３およびＮＳ５Ｂの機能構造および酵素機能については当分野で記載されている。
【００２２】
ＮＳ５Ｂは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして記載されている（Ｑｉｎら、２００１， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ３３， ｐｐ ７２８−７３７；Ｌｏｈｍａｎｎら、２０００， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ；Ｌｏｈｍａｎｎら、１９９７， Ｎｏｖ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８４１６−８４２８；Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、２０００， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２０（１）， ６９−８３）。ＮＳ５Ｂポリペプチドは、４つの機能性モチーフＡ、Ｂ、ＣおよびＤを有するものとして記載されている。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドワクチンによりコードされるＮＳ５Ｂポリペプチドを突然変異させることにより、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を低減または除去するのが好ましい。好ましくは、上記ポリペプチドを突然変異させることにより、ＮＳ５ＢのモチーフＡを破壊するが、例えば、２６３９位のアスパラギン酸（Ｄ）をグリシン（Ｇ）に置換する；または２６４４位のアスパラギン酸（Ｄ）をグリシン（Ｇ）に置換するなどがある。ワクチンポリヌクレオチドによりコードされるＮＳ５Ｂポリペプチドは、これら両方のアスパラギン酸突然変異を含むのが好ましい。
【００２４】
好ましくは、コードされたＮＳ５Ｂポリペプチドは、そのモチーフＣでの破壊を含む。例えば、非変異アスパラギン酸残基であるＤ２７３７をＨ、ＮまたはＥに置換する突然変異によってＮＳ５Ｂの完全な不活性化が起こる。
【００２５】
好ましくは、本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ５Ｂは、モチーフＡ突然変異を含むが、随意にモチーフＣ突然変異を含んでもよい。モチーフＡでの好ましい突然変異には、アスパラギン酸（Ｄ）２６３９のグリシンへの置換、およびアスパラギン酸（Ｄ）２６４４のグリシンへの置換が含まれる。後述の実施例１に記載するように、さらに別のコンセンサス突然変異が存在してもよい。
【００２６】
ＮＳ３は、プロテアーゼとヘリカーゼ活性の両方を持つものとして記載されている。本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ３ポリペプチドを突然変異させることにより、ＮＳ３のプロテアーゼおよびヘリカーゼ活性の両方を破壊するのが好ましい。ＮＳ３のプロテアーゼ活性は、Ｈ−１０８３、Ｄ−１１０７およびＳ−１１６５の「触媒三つ組（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）」に結合していることがわかっている。本発明のワクチンによりコードされるＮＳ３は、触媒三つ組残基に突然変異を含むのが好ましく、最も好ましくは、ＮＳ３はセリン１１６５からバリンへの単一の点突然変異を含む（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ．， Ｐｅｓｓｉ， ａ およびＳｔｅｉｎｋｕｈｌｅｒ Ｃ． １９９８． Ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｚｉｎｃ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ． Ａｎｔｉ− Ｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ３， １−１８）。
【００２７】
ＮＳ３の構造および機能は次のように表すことができる：
【化２】
【００２８】
ＮＳ３のヘリカーゼ活性については、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの４つの重要なモチーフが確認されている。本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ３は、これらモチーフの少なくとも１つに対する破壊的突然変異を含むのが好ましい。アスパラギン酸１３１６からグルタミンへの置換が存在するのが最も好ましい（Ｐａｏｌｉｎｉ， Ｃ， Ｌａｈｍ Ａ， Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ ＲおよびＧａｌｌｉｎａｒｉ Ｐ ２０００， Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｌｉｃａｓｅ． Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ８１， １６４９）。これらの最も好ましいＮＳ３突然変異、Ｓ−１１６５ＶもしくはＤ１３１６Ｑのいずれも、公知または予測されるＴ細胞エピトープ内に存在しない。
【００２９】
最も好ましくは、本発明のＤＮＡワクチンによりコードされるＮＳ３ポリペプチドは、セリン（Ｓ）１１６５からバリン（Ｖ）およびアスパラギン酸（Ｄ）１３１６からグルタミン（Ｑ）への突然変異を含む。加えて、後述の実施例１に記載するように、１以上のコンセンサス突然変異が存在してもよい。
【００３０】
ＨＣＶコアタンパク質の生物学的機能は複雑であり、個々の点突然変異と相関しない（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ Ｊ． ２０００． Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ｊ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ７， ２−４）。コアがリンホトキシンβ受容体と直接的に相互作用し、ＮＦκＢおよびＰＫＲ経路とも相互作用することができ、かつ細胞の生存およびアポトーシスにも影響を与えることができることが証明されている。コアを発現する組換えワクシニア構築物が、ｉｎ ｖｉｖｏでコアをより有毒にするワクシニアに対する細胞応答を阻害することが見出された。
【００３１】
感染中にコアタンパク質は宿主細胞のプロテアーゼによってウイルスポリタンパク質から２ヶ所で切断される。第１の切断は１９１位で生じ、Ｅ１のＮ末端を生成する。第２の切断が生じる残基は正確に位置付けられておらず、１７４〜１９１位のアミノ酸に存在し、それによって約１７アミノ酸の長さの短いコアペプチド配列を遊離させる（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ Ｊ． （２０００） Ｊ． Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ． ７， ２−１４； ＹａｓｕｉＫ， Ｌａｕ ＪＹＮ， Ｍｉｚｏｋａｍｉ Ｍ．，ら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９８． ７２ ６０４８−６０５５）。
【００３２】
本発明のワクチンに使用するコアポリペプチドは全長あるいは切断型の形態のいずれかである。コアポリペプチドは全長であってもよいが、その配列を再配列することによりコアタンパク質のあらゆる活性を破壊(又は阻害)する。コアポリペプチドを少なくとも２つの断片に分割してもよく、コアアミノ酸６６〜１９１とそれに続くアミノ酸１〜６５からなるポリペプチド、あるいはコアアミノ酸１０５〜１９１とそれに続くコアアミノ酸１〜１０４からなるポリペプチドを形成することが最も好ましい。
【００３３】
同一の細胞における他のＨＣＶタンパク質の産生に与えるコアの負の作用を最小にするために、使用されるコアタンパク質が切断型タンパク質であることが最も好ましい。本発明の好適な態様では、コードされるコアタンパク質は、他のＨＣＶタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断される。最も好ましくは、産生されるタンパク質の配列がコアの第２切断から生じる天然の遊離Ｃ末端ペプチド配列を欠くように；より好ましくはこのタンパク質が少なくとも最後の１０アミノ酸を欠くように、好ましくは少なくとも最後の１５アミノ酸を欠くように、より好ましくは最後の２０アミノ酸を欠くように、より好ましくは最後の２６アミノ酸を欠くように、そして最も好ましくは最後の４０アミノ酸を欠くように、コアタンパク質がカルボキシ末端から切断される。本発明における使用に適したコアをコードする最も好適なポリヌクレオチドは、１〜１７１位、１〜１６５位、１〜１５１位のアミノ酸を含有する切断型コアをコードするものである。本発明の使用に適したコアをコードするポリヌクレオチドが、１〜１５１位のアミノ酸の切断型コアタンパク質をコードするものであるのが最も好ましい。実施例１で説明するような１以上のコンセンサス突然変異が存在してもよい。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされる好ましいＮＳ４Ｂポリペプチドは、ＨＣＶ分離物と遺伝子型の間で超可変の領域を除去するようなＮ末端切断を含む。好ましくは、ＮＳ４Ｂポリペプチドは、Ｎ末端から３０〜１００アミノ酸、さらに好ましくは４０〜８０アミノ酸の欠失、最も好ましくは最初のＮ末端の４８アミノ酸の欠失を含む（Ｊ４Ｌ６分離物の場合、これは、アミノ酸１７６０までの切断に相当し、これは、ＮＳ４Ｂの最初の４８アミノ酸の消失である；その他のＨＣＶ分離物における同等の切断も本発明に含まれる）。さらに、ＮＳ４Ｂ配列を２つ以上の断片に分割し、野生型分子に認められるものとは違う順序で配置したＮＳ４Ｂの配列を有するポリペプチドに発現させてもよい。
【００３５】
本発明のワクチンに存在するポリヌクレオチドは、ＨＣＶウイルスに認められる天然ヌクレオチド配列を含んでもよいが、ヌクレオチド配列のコドンは、哺乳動物細胞での発現のために最適化されているものが好ましい。
【００３６】
コドンの最適化に加えて、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをコードする本発明のポリヌクレオチドでのコドン使用頻度を変更することにより、希有コドンが濃縮クラスターに現れるのではなく、反対に、ポリヌクレオチド配列全体にわたって比較的均等な間隔をおいて存在するか、あるいはコドン最適化遺伝子から排除されるようにする。
【００３７】
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、これらを用いて、３文字の「コドン」を綴るが、このコドンは、生物の遺伝子においてコードされたタンパク質のアミノ酸を表すものである。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直鎖状配列をこれら遺伝子によりコードされたタンパク質中のアミノの直鎖状配列に翻訳する。コードは高度に縮重しており、６１個のコドンが２０個の天然アミノ酸をコードし、３個のコドンが「停止」シグナルを表す。従って、ほとんどのアミノ酸は２個以上のコドンによりコードされる。実際には、数個が、４個以上の異なるコドンによりコードされる。
【００３８】
所与のアミノ酸をコードするのに１個以上のコドンが利用可能である場合には、生物のコドン使用頻度パターンは極めて非ランダムである。種によってコドン選択に偏りがあり、さらにコドンの使用は、単一の種においても、高および低レベルで発現する遺伝子間では著しく異なる可能性がある。この偏りは、ウイルス、植物、細菌および哺乳動物細胞で異なり、いくつかの種は、他の種よりランダムコドン選択から離れた強い偏りを示す。例えば、ヒトおよびその他の哺乳動物は、特定の細菌またはウイルスと比較してあまり強く偏っていない。これらの理由から、大腸菌に発現させた哺乳動物遺伝子、または哺乳動物細胞に発現させたウイルス遺伝子は、効率的な発現にとって不適切なコドン分布を有する。しかし、大腸菌発現に適したコドン使用頻度パターンを有する遺伝子をヒトに効率的に発現させることもできる。発現を起こそうとする宿主に稀に観察されるように、異種ＤＮＡ配列にコドンのクラスターが存在すると、その宿主での異種発現レベルが低いことが推定される。
【００３９】
宿主に希有なものから宿主が優先するものへコドンを変えて（「コドン最適化」）、異種発現レベルを増強するいくつかの例があり、例えば、ＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は、哺乳動物コドン使用頻度パターンについて最適化され、これは、哺乳動物（Ｃｏｓ−１）細胞培養物における野生型ＨＰＶ配列に対する発現レベルを増強することがわかっている（Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９９． ７３， ４９７２−４９８２）。この研究では、哺乳動物と比べてＢＰＶで２倍以上の頻度で生じた（使用頻度比＞２）すべてのＢＰＶコドンと、使用頻度比が＞１．５のほとんどのコドンを、優先的に用いられる哺乳動物コドンで保存的に置換した。ＷＯ９７／３１１１５、ＷＯ９７／４８３７０およびＷＯ９８／３４６４０（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）において、ＨＩＶ遺伝子またはそのセグメントのコドン最適化により、最適化を意図した宿主哺乳動物においてコドン最適化した配列をＤＮＡワクチンとして用いると、タンパク質発現が増大し、免疫原性が向上することがわかっている。これらの文献では、各ウイルスコドンを、意図する宿主の最適コドンで保存的に置換するため、配列は、全体が最適化コドンから構成される（ただし、これが、不要な制限部位、イントロンスプライス部位などを導入する場合を除く）。
【００４０】
「コドン使用頻度パターン」という用語は、上記のヌクレオチド配列、遺伝子もしくは遺伝子のクラス（例えば、高度に発現した哺乳動物遺伝子）におけるすべてのコドンについての平均頻度を意味する。哺乳動物（ヒトを含む）についてのコドン使用頻度パターンを文献にみいだすことができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６、２４：２１４−２１５参照）。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドでは、コドン使用頻度パターンは、ＨＣＶの典型的なものから、標的生物、例えば、大腸菌または哺乳動物、特にヒトのコドン出現偏りをより忠実に表すものに変更するのが好ましい。「コドン使用頻度係数」すなわちコドン適合指数（Ｓｈａｒｐ ＰＭ． Ｌｉ ＷＨ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １５（３）：１２８１−９５， １９８７）は、所与のポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが、標的種のパターンにどれくらい密に類似しているかの尺度である。６１個のコドンの各々についてのコドン出現頻度（選択したクラスの遺伝子について１０００コドン当たりの出現数として表される）を２０個の天然アミノ酸の各々について標準化して、各アミノ酸について最も使用頻度の高いコドンの値を１に設定し、これより少ない共通コドンの頻度が、０〜１の間になるように比例的に定められる。すなわち、６１個のコドンの各々が、標的種の高度発現遺伝子について１以下の値を割り当てられる。これを優先値（Ｗ）と呼ぶ。その種の高度発現遺伝子に対する特定のポリヌクレオチドのコドン使用頻度係数を算出するため、特定のポリヌクレオチドの各コドンについて定めた値を記録し、これらすべての値の相乗平均を求める（コドンの総数でこれらの値の自然対数の和を割り算し、真数（ａｎｔｉ−ｌｏｇ）を求める）。係数は０から１の間の値になり、係数が高いほど、そのポリヌクレオチドにおいて使用頻度の高いコドンが多い。ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度係数が１の場合には、全コドンが、標的種の高度発現遺伝子について「最も使用頻度の高い」コドンである。
【００４２】
本発明は、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢもしくはＮＳ５Ｂアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンが、高度に発現した哺乳動物遺伝子のものに類似している、上記ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。上記ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高度に発現したヒト遺伝子のものに類似しているのが望ましい。
【００４３】
ＨＣＶコア（１−１９１）をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図２に示す。Ｓ１１６５ＶおよびＤ１３１６Ｑポリペプチド突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ３をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図３に示す。ポリペプチドのＮ末端１−４８切断を含むＨＣＶ ＮＳ４Ｂをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを図４に示す。Ｄ２６３９ＧおよびＤ２６４４Ｇポリペプチド突然変異を含むＨＣＶ ＮＳ５Ｂをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図５に示す。
【００４４】
従って、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢもしくはＮＳ５Ｂアミノ酸配列を一緒にコードする複数のコドンを含み、本発明のワクチンを形成する合成遺伝子であって、上記アミノ酸配列をコードするのに用いられる可能なコドンの選択を最適哺乳動物コドン使用頻度に類似するように変更することにより、上記合成遺伝子におけるコドン使用頻度が、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子のそれより、高度に発現した哺乳動物遺伝子の使用頻度に密に類似するようにする、上記合成遺伝子が提供される。コドン使用頻度パターンは、高度に発現したヒト遺伝子のものと実質的に同じであるのが好ましい。「天然の」ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂ配列のコドン使用頻度については分析がなされている。ＨＣＶタンパク質のコドン使用頻度係数は、コア（０．４８７）、ＮＳ３（０．４８２）、ＮＳ４Ｂ（０．４８１）およびＮＳ５Ｂ（０．４５９）である。本発明のポリヌクレオチドは、一般に、高度に発現したヒト遺伝子について、０．５以上、好ましくは０．６以上、最も好ましくは０．７以上であるが、１以下のコドン使用頻度係数（すでに定義した通り）を有する。ポリヌクレオチドはまた、高度に発現した大腸菌遺伝子について０．５以上、好ましくは０．６以上、最も好ましくは０．７以上のコドン使用頻度係数を有する。
【００４５】
コドン最適化のほかにも、合成遺伝子を突然変異させることにより、希有コドンのクラスターの出現を排除する。これは２つの方法のいずれかにより達成することができる。これを達成する好ましい方法は、遺伝子配列から希有コドンを排除するものである。希有コドンを定義する一つの方法によれば、希有コドンは、標的生物の高度発現遺伝子において、特定のアミノ酸に用いられるコドンの＜２０％を占めるコドン、好ましくは、特定のアミノ酸について＜１０％を占めるコドンである。あるいは、標的生物の高度発現遺伝子において、相対同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）値が＜０．３、または好ましくは＜０．２のコドンとして希有コドンを定義することもできる。ＲＳＣＵ値は、観察されたコドン数を、該アミノ酸の全コドンが同等に高頻度で用いられた場合に予想される数で割って得られる数値である。希有コドンの適切な定義は当業者に明らかであろう。
【００４６】
あるいは、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂポリヌクレオチドを最適化することにより、濃縮領域に存在する希有の非最適コドンのクラスター形成を防止する。従って、個々の希有コドン、例えば、ＲＳＣＵが＜０．４（さらに好ましくは＜０．３）がポリヌクレオチド全体に均等な間隔をおいて存在するように、ポリヌクレオチドを最適化する。
【００４７】
ウエスタンブロットで評価されるように、コドンが最適化された突然変異コア、ＮＳ３およびＮＳ５Ｂの発現レベルは野生型と比べて増加することが示されている。切断型のコドン最適化ＮＳ４ＢはＮＳ５Ｂとの融合物として発現し、この融合物は十分に発現する。
【００４８】
本発明のワクチンは、ＨＣＶポリペプチドの個々の発現を指令するベクターを含む。あるいは、ＨＣＶポリペプチドを１以上の融合タンパク質として発現させてもよい。
【００４９】
本発明の好ましいワクチンは、タンパク質またはポリヌクレオチドレベルのいずれかで四重融合物を含み、そのような融合物として以下のものが挙げられる：
ＨＣＶ組合せ１： ＨＣＶ５００
【化３】
【００５０】
ＨＣＶ組合せ２： ＨＣＶ５１０
【化４】
【００５１】
ＨＣＶ組合せ３： ＨＣＶ５２０
【化５】
【００５２】
ＨＣＶ組合せ４： ＨＣＶ５３０
【化６】
【００５３】
ＨＣＶ組合せ５： ＨＣＶ５０１
【化７】
【００５４】
ＨＣＶ組合せ６： ＨＣＶ５０２
【化８】
【００５５】
ＨＣＶ組合せ７：
【化９】
【００５６】
他の好適な融合物はHCV組合せ１、２および３に類似しているが、ここで、コアタンパク質は切断型コアタンパク質、典型的にはコア1−151である。本発明の別の好ましいワクチンを以下に挙げるが、これらは、同じプラスミド内の様々な発現カセットに存在するポリヌクレオチド二重および三重融合物を含み、各カセットは、プロモーターユニット（例：ＨＣＭＶ ＩＥ）の独立した制御下にある（矢印で示す）。
【００５７】
このような二重プロモーター構築物は、同じ細胞内で４つのタンパク質抗原の発現を２つの別個のタンパク質として駆動する（矢印で示す）。
【化１０】
【００５８】
好適な構築物はHCV組合せ7、9、11、または12である。特に好適なものは7と11である。
【００５９】
本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドワクチンは場合によりコアタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まない。例えば、本発明のこの態様における好適なポリヌクレオチドは下記のものを含む。
【化１１】
【００６０】
上記ＨＣＶ組合せ８〜１９について、用いた用語、例えば、（コアＮＳ３）＋（ＮＳ４Ｂ５Ｂ）は、各々が個別のプロモーターにより独立に制御される２つの発現カセット、この例の場合、コアＮＳ３二重融合タンパク質をコードする１つの発現カセットと、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ二重融合タンパク質をコードする別のカセットを含むポリヌクレオチドベクターの開示を意味する。各ＨＣＶ組合せ８〜１９も同様に解釈すべきである。
【００６１】
前記ＨＣＶ組合せ１〜１９は、ＨＣＶタンパク質、ポリタンパク質融合物、もしくはポリヌクレオチドの相対配向を開示する。また、前記ＨＣＶ組合せ１〜１９のすべては、構成タンパク質の活性を除去するのに好ましい突然変異または切断の各々と一緒に開示されることが具体的に記載される。例えば、組合せ１〜１９の好ましい変異体（別途記載のない限り）は、コア（１−１９１（生物学的活性を不能にする2以上の断片への分割配列を除く）または好ましくは、その切断型１−１５１または１−１６５もしくは１−１７１で存在するコア）；ＮＳ３ １０２７−１６５７（ヘリカーゼ（アスパラギン酸１３１６からグルタミン）およびプロテアーゼ（セリン１１６５からバリン）活性を不活性化するための突然変異；ポリメラーゼ活性を不活性化させるためのＮＳ５Ｂ ２４２０−３０１０（アスパラギン酸２６３９からグリシンおよびアスパラギン酸２６４４からグリシンへの突然変異、モチーフＡ）；ならびに、ＮＳ４Ｂ １７１２−１９７２（随意に１７６０−１９７２に切断して、Ｎ−末端高度可変断片を除去する）を含む。
【００６２】
本発明は、前述したような新規のＤＮＡワクチンとポリペプチドを提供する。また、本発明により、記載したポリペプチドの類似体、ならびにそれらを含むＤＮＡワクチンが提供される。
【００６３】
用語「類似体」とは、本発明の別のポリペプチドと同じアミノ酸をコードするが、遺伝子コードの重複性を通して、異なるヌクレオチド配列を有するが、同じコドン使用頻度パターンを維持する、例えば、同じコドン使用頻度係数、または他方のポリヌクレオチドのそれの０．１以内、好ましくは、０．０５以内のコドン使用頻度係数を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００６４】
ＨＣＶポリヌクレオチド配列は、様々なＨＣＶ遺伝子型、株もしくは分離物のいずれに由来するものでもよい。ＨＣＶ分離物は、１以上のサブタイプを含む以下の６つの主要遺伝子型：ＨＣＶ １（１ａ、１ｂもしくは１ｃ）、ＨＣＶ ２（２ａ、２ｂもしくは２ｃ）、ＨＣＶ ３（３ａ、３ｂ、１０ａ）、ＨＣＶ ４（４ａ）、ＨＣＶ ５（５ａ）ならびにＨＣＶ ６（６ａ， ６ｂ， ７ｂ， ８ｂ， ９ａおよび１１ａ）に分類することができる（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ２００１， ６９３−７１２）。本発明に関して、各ＨＣＶタンパク質は、同じＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプ、あるいは、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプのいずれかの組合せに由来するものでよく、さらには、ＨＣＶタンパク質を用いてもよい。遺伝子は、１ｂ遺伝子型、例えば、感染性クローンＪ４Ｌ６（登録番号ＡＦ０５４２４７８、図１を参照）に由来するのが好ましい。
【００６５】
配列決定されている具体的株として、ＨＣＶ−Ｊ（Ｋａｔｏら、１９９０， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８７；９７２４−９５２８）およびＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、１９９１， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：１１０５−１１１３）が挙げられる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、コードされたタンパク質の発現（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏのいずれで起こってもよい）による生産に有益である。従って、上記ヌクレオチドは、例えば、収率を高めるための組換えタンパク質合成に関与する、あるいは、ＤＮＡワクチン接種法に使用される治療剤として独立に用いることも可能である。本発明のポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでコードしたタンパク質の生産に用いる場合には、例えば、細胞培養物中の細胞を改変して、発現させようとするポリヌクレオチドを含むようにする。このような細胞として、一過性の、または好ましくは安定な哺乳動物細胞系が挙げられる。本発明のポリタンパク質をコードするベクターの挿入により改変することができる細胞の特定例としては、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３およびＣＯＳ細胞が挙げられる。選択する細胞系は、安定しているだけでなく、ポリタンパク質の成熟グリコシル化と細胞表面発現を可能にするものが好ましい。発現は、形質転換した卵母細胞で達成することができる。ポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞において、本発明のポリヌクレオチドから発現させることができる。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるトランスジェニック非ヒト動物も本発明の範囲に含まれる。
【００６７】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。このような発現ベクターは、分子生物学の分野では日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡと好適な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよびその他のエレメント（例えば、タンパク質発現に必要で、そのために正しい配向で配置されるポリアデニル化シグナルなど）を含むことができる。その他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関するさらに別の例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．（１９８９）を参照されたい。
【００６８】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド、またはベクターにおいて本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を達成することが可能な制御配列に機能しうる形で連結されている。すなわち、このベクターは発現ベクターである。「機能しうる形で連結されている」という用語は、記載した要素が、意図される様式でそれらが機能できるような関係にある並置を意味する。コード配列に「機能しうる形で連結された」調節配列（例えば、プロモーターなど）は、調節配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように配置される。
【００６９】
発現カセットは、目的の配列または遺伝子の発現を指令することができる集合体である。発現カセットは、制御エレメント、例えば、目的の遺伝子に機能しうる形で連結されたプロモーターなどを含む。
【００７０】
上記ベクターは、例えば、複製起点を備えるプラスミド、人工染色体（例：ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ）、ウイルスもしくはファージベクターでよく、随意に、ポリヌクレオチドの発現用のプロモーター、また随意にプロモーターのレギュレータでもよい。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含み、例えば、細菌プラスミドの場合には、アンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子を、あるいは、真菌ベクターの場合には耐性遺伝子を含む。ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで用いて、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを産生することもできるし、あるいはベクターを用いて宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換することにより、例えば、ベクターがコードしたタンパク質を生産することも可能である。また、ベクターを改変して、ＤＮＡワクチン接種法または遺伝子治療法にｉｎ ｖｉｖｏで用いることも可能である。
【００７１】
プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞と適合するように選択することができる。例えば、哺乳動物プロモーターとして、カドミウムのような重金属に応答して誘導することができるメタロチオネインプロモーター、およびβアクチンプロモーターが挙げられる。また、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、もしくはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を用いてもよい。これらプロモーターはすべて周知であり、当分野において容易に入手可能である。
【００７２】
好適なウイルスベクターの例として、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアもしくはαウイルスベクターおよびレトロウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。これらのウイルスを用いた遺伝子移入の方法は当業者には知られている。例えば、レトロウイルスベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定に組み込むことができるが、このような組換えは好ましくない。対照的に、複製能欠損アデノウイルスベクターは、エピソームのままであるため、一過的発現を可能にする。例えば、サブユニットワクチンとして、または免疫アッセイで使用するために、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞もしくは細菌での発現を駆動することができるベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドがコードした多量のＨＣＶタンパク質を生産することができる。
【００７３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載したポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、本発明の第２の態様に従うＤＮＡベクターを含む。好ましい実施形態では、上記組成物は、ＨＣＶアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含むＤＮＡでコーティングした複数の粒子、好ましくは金粒子を含み、上記ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高度に発現させた哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子のパターンに類似している。別の実施形態では、前記組成物は、医薬的に許容されうる賦形剤と、本発明の第２の態様のＤＮＡベクターを含む。前記組成物はまた、アジュバントも含む。
【００７４】
ＤＮＡワクチンは、液体ワクチンの筋肉への間隙投与（ＷＯ９０／１１０９２）または筋内注射以外の機構により送達することができる。例えば、皮膚への送達は、免疫機構が、感染に対する障壁となる組織（例えば、皮膚や粘膜など）において極めて活発であることから有利である。皮膚への送達は、注射、ジェット式注射器（皮膚、または筋肉などの下層組織に高圧下で液体を強制的に送り出す）もしくはパーティクルボンバードメント（この場合、上皮を貫通するのに十分な密度の粒子にＤＮＡをコーティングしうる）（米国特許第５３７１０１５号）により実施することができる。例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４： ３７−４２（１９９６）に記載されているように、ヌクレオチド配列をプラスミドに組み込み、これを金ビーズにコーティングした後、これらビーズを高圧下で表皮に投与する。皮膚へのこれら粒子の投入により、表皮細胞および表皮ランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎ）細胞両方の直接トランスフェクションが達成される。ランゲルハンス細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ＤＮＡを取り込み、コードされたペプチドを発現し、これらをプロセッシングして細胞表面ＭＨＣタンパク質に展示する。トランスフェクションされたランゲルハンス細胞は、リンパ節に移動し、そこで、展示された抗原断片をリンパ球に提示して、免疫応答を引き起こす。粒子が媒介する皮膚への送達により免疫応答を誘発するには、非常に少量のＤＮＡ（１μｇ以下、往々にして０．５μｇ以下）でよいが、これは、直接筋内注射後に免疫応答を生じさせる場合、ミリグラム量のＤＮＡを必要とすることが知られているのとは対照的である。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドを治療薬、例えば、ＤＮＡワクチン接種に使用する場合には、ワクチン接種しようとする哺乳動物、例えば、ヒトに核酸を投与する。ＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＤＮＡのような核酸は、前記のようなベクターの形態で提供され、これを該哺乳動物の細胞に発現させることができる。ポリヌクレオチドは、利用可能な方法のどれで投与してもよい。例えば、核酸は、針注射、好ましくは、皮内、皮下もしくは筋内注射により投与する。あるいは、粒子媒介ＤＮＡ送達（ＰＭＤＤ）のような核酸送達装置を用いて、核酸を皮膚内に直接送達することもできる。この方法では、不活性粒子（金ビーズなど）を核酸でコーティングし、例えば、投射装置からの高圧下放出により、粒子が受容体（例：皮膚）の表面を貫通するのに十分な速度で加速する。（本発明の核酸分子でコーティングした粒子は、このような粒子を装填した送達装置と同様に、本発明の範囲に含まれる）。組成物は、０．５〜５μｍ、好ましくは約２μｍの平均直径を有する金粒子を含むのが望ましい。好ましい実施形態では、コーティングした金ビーズをカートリッジとして機能する管に装填し、各カートリッジが、１カートリッジ当たり０．１〜５μｇ、好ましくは約０．５μｇのＤＮＡをコーティングした０．１〜１ｍｇ、好ましくは約０．１ ｍｇの金を含むようにする。
【００７６】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載したようなポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、細菌、例えば、大腸菌、哺乳動物、例えば、ヒトでもよいし、あるいは昆虫細胞でもよい。本発明のベクターを含む哺乳動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションした培養細胞でもよいし、あるいは、哺乳動物へのベクターの投与により哺乳動物細胞をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションすることもできる。
【００７７】
別の態様では、本発明は、前記のような医薬組成物を製造する方法であって、野生型ＨＣＶヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンを変更するか、またはポリヌクレオチド配列を合成により形成して、高度発現哺乳動物遺伝子に類似したコドン使用頻度パターンを有し、かつ野生型ＨＣＶアミノ酸配列、もしくはポリペプチドの１以上の天然の機能を不活性化するのに十分なアミノ酸変化を有する野生型配列を含む突然変異ＨＣＶアミノ酸配列、をコードする配列を製造するステップを含む、上記方法を提供する。
【００７８】
また、ＨＣＶ感染の治療または予防における、本明細書に記載したポリヌクレオチドまたはワクチンの使用も提供する。
【００７９】
患者に裸のポリヌクレオチドまたはベクターを導入する好適な方法として、好適なビヒクルを用いた局所適用がある。例えば、鼻内、経口、膣内もしくは直腸内投与により、核酸を皮膚、または粘膜表面に局所投与してもよい。裸のポリヌクレオチドまたはベクターは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような医薬的に許容されうる賦形剤と一緒に存在してもよい。ＤＮＡ取込みは、ブピバカインのような促進剤を別々に、またはＤＮＡ製剤に含有させて用いることにより、さらに容易にすることができる。核酸を受容者に直接投与する別の方法としては、超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよびマイクロシーディング（米国特許第５，６９７，９０１号に記載されている）が挙げられる。
【００８０】
核酸構築物の取込みは、複数の周知のトランスフェクション法、例えば、トランスフェクション剤の使用を含む方法により増強することができる。これらの薬剤の例としては、カチオン剤、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ならびに、リポフェクタント、例えば、リポフェクタムおよびトランスフェクタムが挙げられる。投与しようとする核酸の用量は変更することができる。典型的に核酸は、粒子媒介遺伝子送達の場合には、１ｐｇ〜１ｍｇ、好ましくは１ｐｇ〜１０μｇ核酸の範囲、またその他の経路の場合には、１０μｇ〜１ｍｇの範囲の量を投与する。
【００８１】
また、本発明の核酸配列は、遺伝子治療に有用な専用送達ベクターにより投与することもできる。遺伝子治療法については、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７， ３８９：２３９−２４２に記載されている。ウイルスおよび非ウイルスベクター系のいずれを用いてもよい。ウイルス系としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、カナリア痘およびワクシニア−ウイルスベースの系が挙げられる。好ましいアデノウイルスベクターは、ヒト以外の霊長類に由来するものである。特に、米国特許第６０８３７１６号に記載されているＰａｎ ９（Ｃ６８）、ＷＯ０３／０４６１２４に記載されているＰａｎ５、６ もしくは７が挙げられる。
【００８２】
非ウイルスベースの系としては、核酸、ミクロスフィアカプセル化法（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）と、リポソームベースの系の直接投与が挙げられる。最初のワクチン接種後にブースター注射を実施するのが望ましい場合には、ウイルスおよび非ウイルス送達系を組み合わせてもよく、例えば、プラスミドのような非ウイルスベクターを用いた最初の「初回感作（プライム）」ＤＮＡワクチン接種の後、ウイルスベクターまたは非ウイルスベースの系を用いた１回以上の「追加免疫（ブースト）」ワクチン接種を行なう。プライム−ブーストプロトコルは、アジュバント中のタンパク質で初回感作し、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡまたはウイルスベクターで追加免疫するという利点もある。あるいは、タンパク質を基剤とするワクチンをブースターとして用いてもよい。タンパク質ワクチンは、ＤＮＡ／ウイルスベクターのワクチンが含むすべての抗原を含むのが好ましい。しかし、タンパク質は個別の形態でも、ポリタンパク質の形態をしていてもよい。
【００８３】
本発明の核酸配列は、形質転換した細胞により投与することもできる。このような細胞として、被験者から採取した細胞がある。本発明の裸のポリヌクレオチドまたはベクターをこのような細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入し、その後、形質転換した細胞を被験者に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドは、相同組換え事象により細胞にすでに存在する核酸に組み込むことができる。所望であれば、形質転換した細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、こうして得られた１個以上の細胞を本発明で用いてもよい。公知の手術またはマイクロサージャリー法（例：移植、マイクロインジェクションなど）により患者の適切な部位に細胞を送達することができる。
【００８４】
好適な細胞としては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）があり、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣに工学的に操作されてもよいその他の細胞が挙げられる。このような細胞は、遺伝子的に改変することにより、抗原提示能力を増大する、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改善する、それ自体で抗腫瘍、例えば抗子宮頸部癌効果を有する、ならびに／あるいは受容体（すなわち、対合ＨＬＡハプロタイプ）と免疫学的に適合性となるようにすることもできるが、必ずしも必要なわけではない。ＡＰＣは一般に、生物由来の多様な体液および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれから単離されてもよく、オートロガス、同種異系、同系もしくは異種細胞のいずれでもよい。
【００８５】
本発明の特定の好ましい実施形態では、樹状細胞またはその前駆細胞を抗原提示細胞として用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換させてから患者に戻すか、あるいは、例えば、粒子媒介ＤＮＡ送達により、ワクチン中の被送達ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ標的として用いる。樹状細胞は高い能力を有するＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ およびＳｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１， １９９８）、予防または治療のための抗腫瘍免疫を誘発する生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０：５０７−５２９， １９９９）。一般に、樹状細胞は、その典型的な形状（ｉｎ ｓｉｔｕで星形、ｉｎ ｖｉｒｔｏ視覚化可能な顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）と、高い効率で抗原を取り込み、プロセッシングおよび提示する能力、ナイーブＴ細胞応答を活性化する能力に基づいて、確認することができる。勿論、樹状細胞を工学的に操作して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで樹状細胞に通常認められない特定の細胞−表面受容体またはリガンド、例えば、本発明の構築物にコードされた抗原を発現させることも可能であり、このような改変された樹状細胞も本発明によって意図される。樹状細胞に代わるものとして、分泌小胞抗原負荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（エキソソームと称する）をワクチンの中で用いてもよい（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：５９４−６００， １９９８参照のこと）。
【００８６】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織−浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血もしくはその他の好適な組織または体液から取得することができる。例えば、樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦのようなサイトカインの組合せを末梢血液から収集した単球の培養物に添加することにより、ｅｘ ｖｉｖｏで分化させることができる。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦ、ＣＤ４０リガンド、リポ多糖ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド（プロフェショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞の産生に重要なサイトカイン）および／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘発するその他の化合物の組合せを培養培地に添加することにより、末梢血、臍帯血もしくは骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞を樹状細胞に分化させることができる。
【００８７】
ＡＰＣは一般に、抗原のＨＣＶアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、本発明で考慮されるコドン最適化ポリヌクレオチドでトランスフェクションすることもできる。このようなトランスフェクションは、ｅｘ ｖｉｖｏで行うことができ、トランスフェクションしたそのような細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書に記載するように、治療の目的で用いることができる。あるいは、樹状、またはその他の抗原提示細胞をターゲッティングする遺伝子送達ビヒクルを患者に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションを起こすことも可能である。樹状細胞のｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションは、例えば、ＷＯ ９７／２４４４７に記載されているような当分野では公知の方法のいずれか、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６−４６０， １９９７に記載された粒子媒介方法を用いて、一般に実施することができる。
【００８８】
本発明のワクチンおよび医薬組成物は、抗ウイルス剤、例えば、αインターフェロン、好ましくは、ＰＥＧ化αインターフェロンおよびリボバリンと組合せて用いてもよい。ワクチンおよび医薬組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封したアンプルまたはバイアルに収容することができる。このような容器は、気密シールすることにより、使用まで製剤の滅菌を保存するのが好ましい。一般に、製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液もしくは乳濁液として保存することができる。これ以外にも、凍結乾燥した状態でワクチンまたは医薬組成物を保存し、使用の直前に滅菌液体担体を添加するだけにしてもよい。粒子媒介送達による投与を意図する場合のヌクレオチド配列含有ワクチンは、圧縮ガス送達装置に用いるのに適したカートリッジの形態をしていてもよく、その際、カートリッジは、中空の管からなり、その内面は、随意に医薬的に許容されうる他の成分が存在してもよいワクチンヌクレオチド配列を担持する粒子でコーティングされている。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、アジュバント化合物、もしくはＤＮＡによりコードされるタンパク質により誘発される免疫応答をモジュレートまたは増強するのに役立つその他の物質を含んでもよい。これらは、抗原とは別に、または抗原との融合物としてＤＮＡによりコードされるか、あるいは、製剤の非ＤＮＡエレメントとして含有させてもよい。本発明の製剤に含有させることができるアジュバントタイプの物質の例として、ユビキチン、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、ｆｌｔ３−リガンドおよびその他のサイトカイン（例：ＩＦＮ−γおよびＧＭＣＳＦ）が挙げられる。
【００９０】
上記以外の好適なアジュバントは、以下に挙げる市販のもの、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， デトロイト、ＭＩ）；イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（３Ｍ， Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）；レシミキモド（３Ｍ， セントポール、ＭＮ）；メルクアジュバント（Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ）６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， ローウェイ、ＮＪ）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン的に誘導体化した多糖；ポリホスファゼン；生物分解性ミクロスフェア；モノホスホリル脂質ＡおよびクイルＡである。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦもしくはインターロイキン−２、−７もしくは−１２もアジュバントとして用いることができる。
【００９１】
本発明の製剤では、アジュバント組成物が、主にＴｈ１型の免疫応答を誘発するのが好ましい。従って、アジュバントは、ＤＮＡがコードした抗原に応答して生じた免疫応答を主にＴｈ２型から主にＴｈ１型の応答へとモジュレートする上で役立つものである。高レベルのＴｈ−１型サイトカイン（例：ＩＦＮ−、ＴＦＮ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介免疫応答の誘発を有利にする傾向がある。応答が主にＴｈ１型である好ましい実施形態では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより大幅に増大するであろう。これらのサイトカインのレベルは標準的アッセイを用いて、容易に評価することができる。サイトカインのファミリーについては、Ｍｏｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：１４５−１７３， １９８９を参照されたい。
【００９２】
従って、Ｔｈ１型が優勢な応答を誘発するための使用に適したアジュバントとしては、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。Ｔｈ１型免疫応答を優先的に誘発するその他の公知のアジュバントとして、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがある。このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６にも記載されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、同じまたは異なるポリヌクレオチド構築物におけるＨＣＶ抗原から個別にコードされたものでもよいし、もしくは、例えば、該抗原との融合物として、それらにすぐ隣接していてもよい。あるいはまた、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを個別に、すなわち、コードされた抗原を含む組成物の一部としてではなく、投与してもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、単独でも、他のアジュバントと組み合わせて用いてもよい。例えば、増強された系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ ００／０９１５９およびＷＯ ００／６２８００に記載されているようなＣｐＧとＱＳ２１の組合せを含む。この製剤は、さらに水中油形乳濁液および／またはトコフェロールを含むのが好ましい。
【００９３】
別の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， フラミンガム、ＭＡ）であり、これは単独でも、他のアジュバントと組み合わせて用いてもよい。例えば、増強された系は、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組合せ、例えば、ＷＯ ９４／００１５３に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ ９６／３３７３９に記載されているように、ＱＳ２１をコレステロールでクエンチングした、反応性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の低い組成物を含む。別の好ましい製剤は、水中油形乳濁液およびトコフェロールを含む。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよび水中油形乳濁液中のトコフェロールを含む、特に効力のあるアジュバント製剤については、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【００９４】
別の好ましいアジュバントとして、モンタニドＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、デトクス（Ｄｅｔｏｘ）（Ｒｉｂｉ、ハミルトン、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、ハミルトン、ＭＴ）ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が挙げられる。
【００９５】
ワクチンがアジュバントを含む場合、ワクチン製剤を２部に分けて投与してもよい。例えば、抗原をコードするヌクレオチド構築物を含む製剤の部分を、例えば、皮下または筋内注射、あるいは経皮粒子媒介送達により最初に投与してから、アジュバントを含む製剤の部分をその直後、またはワクチン分野に精通した医師には明らかな適当な時間をおいて、投与することができる。このような状況で、アジュバントは、抗原製剤と同じ経路、または別の経路のいずれにより投与してもよい。別の実施形態では、製剤のアジュバント部分を抗原部分の前に投与する。一実施形態では、アジュバントは局所製剤として、抗原をコードするヌクレオチド配列の粒子媒介送達の部位で、その粒子媒介送達の前または後のいずれかに、皮膚に適用する。
【００９６】
好ましくは、本発明のＤＮＡワクチンは、有効な免疫応答、典型的には、ＨＣＶ抗原に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋免疫を刺激する。好ましくは、広範囲のエピトープに対する免疫を刺激する。治療に用いる場合には、ワクチン接種の後、肝線維症および／または炎症を軽減するのが好ましい。
【００９７】
本明細書で用いる「含む」という用語は、非制限的意味で用いることを意図しており、その他の要素の存在も排除されない。しかし、「含んでいる」という用語は、その排他的意味で理解できるように意図することもあり、その場合、「構成される」または「からなる」と同等である。本発明を以下の実施例により説明するが、これらに限定されるわけではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１ 抗原パネルに導入した突然変異
１）コンセンサス突然変異
すべての既知ＨＣＶ分離物の全ゲノム配列を比較した。Ｊ４Ｌ６ポリタンパク質内の特定の位置を、他の大部分のＨＣＶ分離物から、特異である／逸脱するものとして確認した。特に重要なのは、これらの位置が、１ａ、２、３群、およびその他の群（この群では、さもなくば、同等の位置に１または２個の別のアミノ酸残基が占めていた。）に及ぶ関連１ｂ群の分離物全体のより一致性の高い残基から逸脱することが認められたことである。選択したコンセンサス突然変異で、既知ＣＤ４またはＣＤ８エピトープを妨害するものはない。ＮＳ３における２つの変更により、実際に免疫優性ＨＬＡ−Ｂ３５制限ＣＤ８エピトープを修復する［イソロイシン（Ｉ）１３６５からバリン（Ｖ）、およびグリシン（Ｇ）１３６６からアラニン（Ａ）］。
【００９９】
不用な可変性のために、ＮＳ４Ｂの最初の５１アミノ酸を除去した。
【０１００】
コア：
アラニン（Ａ）５２からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１０１】
ＮＳ３：
バリン（Ｖ）１０４０からロイシン（Ｌ）へ。
【０１０２】
ロイシン（Ｌ）１１０６からグルタミン（Ｑ）へ。
【０１０３】
セリン（Ｓ）１１２４からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１０４】
バリン（Ｖ）１１７９からイソロイシン（Ｉ）へ。
【０１０５】
トレオニン（Ｔ）１２１５からセリン（Ｓ）へ。
【０１０６】
グリシン（Ｇ）１２８９からアラニン（Ａ）へ。
【０１０７】
セリン（Ｓ）１２９０からプロリン（Ｐ）へ。
【０１０８】
イソロイシン（Ｉ）１３６５からバリン（Ｖ）へ。
【０１０９】
グリシン（Ｇ）１３６６からアラニン（Ａ）へ。
【０１１０】
トレオニン（Ｔ）１４０８からセリン（Ｓ）へ。
【０１１１】
プロリン（Ｐ）１４２８からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１１２】
イソロイシン（Ｉ）１４２９からセリン（Ｓ）へ。
【０１１３】
イソロイシン（Ｉ）１６３６からトレオニン（Ｔ）へ。
【０１１４】
ＮＳ４Ｂ：
フェニルアラニン（Ｆ）１７６０でＯＲＦを開始。
【０１１５】
ＮＳ５Ｂ：
イソロイシン（Ｉ）２８２４からバリン（Ｖ）へ。
【０１１６】
トレオニン（Ｔ）２８９２からセリン（Ｓ）へ。
【０１１７】
トレオニン（Ｔ）２９１８からバリン（Ｖ）へ。
【０１１８】
Ｎ．Ｂ．：番号付けは、Ｊ４Ｌ６分離物のポリタンパク質における位置に従う。
【０１１９】
実施例２ プラスミドＤＮＡワクチンの構築
ＨＣＶコア、ＮＳ３、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチド配列に対し、ＳｙｎＧｅｎｅ ２ｅソフトウエアを用い、哺乳動物コドン使用頻度についてコドン最適化を実施した。コドン使用頻度係数は、各ポリヌクレオチドについて０．７以上まで改善された。コドン最適化、酵素ノックアウト突然変異、ならびにコンセンサス突然変異を組み込んだ新しいポリヌクレオチド配列各々のセンスおよびアンチセンス鎖を４０〜６０ヌクレオチドの領域（２０ヌクレオチドのオーバーラップを含む）に分割した。これらの領域を商業的に合成し、オリゴアッセンブリィＰＣＲ法によりポリヌクレオチドを製造した。
【０１２０】
クローニングに用いられるユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を例示する、各ポリヌクレオチドの外側正方向および逆方向ＰＣＲプライマーの概略を以下に記載する。
【化１２】
【０１２１】
単一抗原をコードするポリヌクレオチドはすべて、Ｎｏｔ ＩおよびＢａｍＨＩユニーククローニング部位を介して哺乳動物発現ベクターｐ７３１３ｉｅにクローン化した（図７参照）。
【０１２２】
コードされたポリタンパク質は、以下の通りであった（突然変異とコドン最適化を含む）。
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【０１２３】
実施例３ 免疫応答アッセイ
Ｃ５７ＢＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｐ７３１３ベクターにおいて個別に発現させた４つのＨＣＶ抗原のＷＴまたはコドン最適化＋突然変異形態で免疫した。１．０μｇ／カートリッジの標準用量を含むＰＭＩＤによりマウスを免疫し、２１日目に追加免疫（追加免疫１）、４９日目に再度追加免疫（追加免疫２）した。脾細胞を個々のマウスから採取し、様々なＨＣＶ抗原製剤を用いたＥＬＩＳＰＯＴで再刺激した。ＩＬ２およびＩＦＮγ応答の両方を測定した。免疫応答を測定するのに用いた試薬は、ミクロゲン（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ）、ワクシニア−コアおよびワクシニアＮＳ３−５（社内の遺伝子型１ｂ）からの精製ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ（遺伝子型１ｂ）タンパク質であった。
【０１２４】
ＨＣＶコア：
ＷＴ全長（ＦＬ−１−１９１）または切断型（ＴＲ１−１１５）コアで免疫したＣ５７ＢＬマウスをＨＣＶコアタンパク質で再刺激したところ、精製コアタンパク質を用いて良好な応答が観察された（図８）。
【０１２５】
ＨＣＶ ＮＳ３：
ｐ７３１３ ＷＴと、ＰＭＩＤを用いてコドン最適化したＮＳ３とでマウスを免疫した。ＮＳ３タンパク質とワクシニア３−５の両方を用いたＣ５７Ｂｌマウスにおいて、免疫および１回の追加免疫後、ＮＳ３に対する良好な応答が実証され、ＥＬＩＳＰＯＴにより応答を読み出した。ＩＬ２およびＩＦＮγ応答の両方を検出した。この実験では、野生型と、コドン最適化した（ｃｏ ＋ ｍ）形態の構築物との間に有意な差は観察されなかった（図９）。しかし、一過的トランスフェクション後のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現には、野生型とコドン最適化構築物との間に差が認められた。ＤＮＡ用量が低い構築物、または一次応答を比較する実験から、プラスミドの効力の差が明らかになると考えられる。
【０１２６】
ＨＣＶ ＮＳ４Ｂ：
ＢＡＬＢ／ｃマウスのＰＭＩＤ免疫後に、全長ＷＴ ｐ７３１３ ＮＳ４Ｂに対する応答を観察した。ＮＳ４Ｂタンパク質およびワクシニア３−５のいずれかでｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激後に、ＩＬ２およびＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の両方を観察した（図１０）。
【０１２７】
ＮＳ４Ｂタンパク質をＮ末端で切断することにより、高度可変領域を除去したが、Ｎ末端領域に対して利用可能な抗血清が産生されていたため、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション実験後に、タンパク質の発現を検出することはできなかった。この領域の発現を確認するために、これをＮＳ５Ｂタンパク質と融合させた。近年の実験から、ＮＳ４Ｂタンパク質とＮＳ３−５ワクシニアを用いて、切断型ＮＳ４Ｂタンパク質（単独またはＮＳ５Ｂとの融合物として）に対し免疫応答を検出できることが確認されている。ＷＴおよびコドン最適化ＮＳ４Ｂに対して良好な応答を観察した。
【０１２８】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ：
ＷＴおよびコドン最適化（ｃｏ＋Ｍ）配列を用いた免疫後に、ＰＭＩＤ後のＮＳ５Ｂに対する免疫応答を調べた。ＮＳ３タンパク質とワクシニア３−５の両方を用いたＣ５７ＢＬマウスにおいて、免疫および１回の追加免疫後、ＮＳ５Ｂに対する良好な応答が実証され、ＥＬＩＳＰＯＴにより応答を読み出した。ＮＳ３を用いた場合と同様、この実験でも、ＷＴとｃｏ＋ｍ形態の構築物との間に、免疫応答の差は認められなかった（図１１）。
【０１２９】
実施例４ ＨＣＶポリタンパク質の発現
４つの選択したＨＣＶ抗原コア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをｐ７３１３ｉｅにフォーマット化することにより、単一の融合ポリタンパク質として発現させた。これらの抗原を以下に示すように様々な構築物において異なる順序で発現させた。（４つの抗原の各々がアミノ末端の位置を順に占めるように、単一ポリタンパク質の発現をコードする構築パネルを設計し、この重要な位置で１つの抗原の存在が他の抗原に対し、発現のレベルを有意に改善するのか、あるいは低減させるのかをモニターした。）さらに、コアタンパク質を２つの断片、すなわち、コア６６−１９１＞１−６５と１０５−１９１＞１−１０４を介して再配置した、２つの構築物を製造した。
【化１７】
【０１３０】
標準的な製造者のプロトコルに従い、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、標準化量のＤＮＡをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を回収し、ＭＯＰＳまたはＭＥＳ既製バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかで前形成したＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、ＮＳ５Ｂ全タンパク質に対して産生したウサギ抗血清を用いて、タンパク質発現をモニターした。二次プローブは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）に結合させた抗ウサギ免疫グロブリン抗血清であり、続いて、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、化学発光検出を実施した。
【０１３１】
この発現実験の結果を図１２に示す。これらの結果から、ポリタンパク質はすべて、同様の程度まで発現するが、ＮＳ５Ｂを発現する単一抗原に認められるものよりは低いレベルである。ＨＣＶ５００の分子量がやや低いのは、Ｎ末端位置からのＨＣＶコアの切断のためである。ＨＣＶ５０２は、クローニングの誤りによりこの実験では検出されなかった。別のクローンを用いた反復実験では、ＨＣＶ５０２の発現レベルは他のポリタンパク質と類似していた。
【０１３２】
実施例５ ＨＣＶポリタンパク質に対する免疫応答の検出
ポリタンパク質の各々をコードするＤＮＡ（１μｇ）を含むＰＭＩＤによりＣ５７ＢＬマウスを免疫し、実施例４に記載したようにそれから３週間後に追加免疫した。ＥＬＩＳＰＯＴ、またはＨＣＶ抗原に対する細胞内サイトカインの産生を用いて、追加免疫から７日後に免疫応答をモニタリングした。
【０１３３】
ＨＣＶ遺伝子産物に対するＴ細胞応答についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
脾細胞の調製：
追加免疫から７日後に、免疫動物から脾臓を取得した。脾臓をスライドガラスの間で粉砕して処理することにより、細胞懸濁液を生成した。塩化アンモニウム処理で赤血球を溶解させた後、細胞破片を除去することにより、脾細胞の微細な懸濁液を得た。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いるため、マウスが一次免疫しか受けていない場合は４×１０６／ｍｌ、またマウスが追加免疫を受けている場合には２×１０６／ｍｌの濃度で細胞をＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。
【０１３４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
１５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）のラット抗マウスＩＦＮγまたはラット抗マウスＩＬ−２（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）でプレートを被覆した。プレートは＋４℃で一晩被覆した。使用前に、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。４×１０５細胞／ウェルで脾細胞をプレートに添加した。組換えＨＣＶ抗原をミクロゲン（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ）から取得し、１μｇ／ｍｌで用いた。１〜１０μＭの最終濃度でペプチドをアッセイに用いることにより、ＣＤ４またはＣＤ８応答を測定した。これらのペプチドは、Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから取得した。各ウェルの合計容量は２００μｌであった。抗原で刺激した細胞を含むプレートを、加湿した３７℃のインキュベーター内で１６時間インキュベートした。いくつかの実験では、ＮＳ３−５またはワクシニア野生型を発現する組換えワクシニアに感染させた細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで抗原として用いた。
【０１３５】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイプレートの展開：
水で１回（細胞の溶解を確実にするため１分浸ける）、次にＰＢＳで３回洗浄することにより、プレートから細胞を除去した。ビオチン結合ラット抗マウスＩＦＮγまたはＩＬ−２（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）を１μｇ／ｍｌでＰＢＳに添加した。プレートを室温で攪拌しながら２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｃａｌｔａｇ）を１／１０００希釈で添加した。ＰＢＳで３回の洗浄後、ＢＣＩＣＰ基質（Ｂｉｏｒａｄ）を用いた１５〜４５分のインキュベーションにより、スポットが明らかになった。水を用いて基質を洗浄してから、プレートを乾燥させた。イメージ分析装置を用いて、スポットを数えた。
【０１３６】
ペプチド刺激に応答するＴ細胞からのＩＦＮγおよびＩＬ−２産生を検出するためのフローサイトメトリー：
試験管１本当たり約３×１０６個の脾細胞に等分し、回転することによりペレットとした。上清を除去し、サンプルを激しく攪拌し、ペレットを壊した。０．５μｇの抗ＣＤ２８＋０．５μｇの抗ＣＤ４９ｄ（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）を各試験管に添加し、室温で１０分放置することによりインキュベートした。適切な試験管に１ｍｌの培地を添加したが、これは培地だけか、もしくはＨＣＶ抗原を含む培地であった。次にサンプルを加熱水浴中に３７℃で１時間インキュベートした。１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを各試験管に添加し、３７℃でのインキュベーションをさらに５時間継続した。プログラム化した水浴を６℃に戻し、その温度で一晩維持した。
【０１３７】
抗マウスＣＤ４−ＣｙＣｈｒｏｍｅ（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）と抗マウスＣＤ８ビオチン（Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈ）でサンプルを染色した。サンプルを洗浄し、ストレプトアビジン−ＥＣＤで染色した。サンプルを洗浄し、「イントラプレップ膜透過試薬（Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）」キット（Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈ）から１００μｇの固定液を１５分室温で添加した。洗浄後、イントラプレップキットからの１００μｇの膜透過試薬を、抗ＩＦＮ−γ−ＰＥ＋抗ＩＬ−２−ＦＩＴＣを含む各サンプルに添加した。サンプルを室温で１５分インキュベートした後、洗浄した。サンプルを０．５ ｍｌバッファー中に再懸濁させ、フローサイトメーターで分析した。
【０１３８】
１サンプル当たり合計５００，０００個の細胞を収集してから、ＣＤ４およびＣＤ８細胞をゲーティングすることにより、刺激に応答してＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌する細胞の集団を測定した。
【０１３９】
これらの結果から、様々な順序でコア、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをコードするポリタンパク質はすべてＮＳ３（すなわち、ＨＣＶ ５００、５１０、５２０、５３０）に対する免疫応答を刺激できることがわかった。ＩＬ２（図１３Ａ）およびＩＦＮ−γ（図１３Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴによりモニタリングしたところ、ＮＳ３タンパク質に対する応答は、ＨＣＶポリタンパク質（ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０）の各々で類似していた。
【０１４０】
応答細胞の表現型をＩＣＳによりさらに詳細に分析した。良好なＣＤ４＋Ｔ細胞応答が免疫優性ＮＳ３ ＣＤ４特異的ペプチドに対して誘発され、これは、ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０間で類似していた。
【表１】
【０１４１】
抗原の存在または非存在下で６時間、最後の４時間はブレフェルジンＡの存在下で、脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ特異的なＴ細胞応答が検出された。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのゲーティングおよびＩＦＮγ ＦＩＴＣでの染色により、ＩＦＮｇが検出された。
【０１４２】
また、ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０での免疫後、免疫優性ＮＳ３特異的ペプチドに対する強いＣＤ８応答が生じ、ＣＤ８＋細胞の２．５〜６％の頻度に達した。
【０１４３】
ＨＣＶ ５００、５１０、５２０および５３０での免疫によって、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂ抗原の両方に対するＣＤ４およびＣＤ８応答も検出されたが、ＣＤ８応答は、後の単一抗原での免疫後に比べ、ポリタンパク質に対して弱かった。
【表２】
【０１４４】
抗原の存在または非存在下で６時間、最後の４時間はブレフェルジンＡの存在下で、脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ特異的なＴ細胞応答が検出された。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのゲーティングおよびＩＦＮγ ＦＩＴＣでの染色により、ＩＦＮｇが検出された。
【表３】
【０１４５】
抗原の存在または非存在下で６時間、最後の４時間はブレフェルジンＡの存在下で、脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ特異的なＴ細胞応答が検出された。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞上でのゲーティングおよびＩＦＮγ ＦＩＴＣでの染色により、ＩＦＮｇが検出された。
【０１４６】
用いたペプチドは以下の配列を有する。
【化１８】
【０１４７】
内因的にプロセッシングされた抗原の認識：
ＨＣＶポリタンパク質でのＰＭＩＤ免疫が、内因的にプロセッシングされた抗原を認識することができる応答を誘発したか否かを決定するために、ＮＳ３−５を発現するワクシニア組換えウイルスに感染させた標的細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで刺激因子として用いた。結果から、５００、５１０、５２０および５３０での免疫後、良好なＩＬ２およびＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答が検出されたことがわかる（図１４）。
【０１４８】
ＨＣＶポリタンパク質での免疫は機能的ＣＴＬ活性を誘導する：
ＮＳ３だけ、ＨＣＶ５００、５１０および５２０をコードする０．０１μｇのＤＮＡでＣ５７ＢＬマウスを免疫した。初回免疫および１回の追加免疫後、各グループからの脾細胞をＮＳ３ ＣＤ８ペプチドおよびＩＬ２で５日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。同じペプチドを用いてパルスしたＥＬ４細胞に対するＣＴＬ活性を測定した。すべての構築物で免疫したマウスが、このアッセイにおいて同様の死滅レベルを示した。
【０１４９】
このことから、ＨＣＶポリタンパク質によるＰＭＩＤ免疫が機能的ＣＤ８応答を誘発できることがわかる。結果を図１５に示す。
【０１５０】
実施例６ 二重プロモーター構築物を介したＨＣＶ抗原の送達
以下に示す方法を用いて、二重プロモーター構築物を作製した。発現カセット１（アイオワ−レングス（Ｉｏｗａ−ｌｅｎｇｔｈ）ＣＭＶプロモーター、エクソン１、目的のタンパク質／融合タンパク質をコードする遺伝子、プラス、ウサギグロビンポリ−Ａシグナル）を保有する断片をその宿主ベクター、すなわちｐ７３１３ｉｅから、ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位ＣｌａＩおよびＸｍｎＩにより切除した。ＸｍｎＩは、切除した断片の３−プライム（ｐｒｉｍｅ）末端に平滑末端を形成した。
【０１５１】
受容プラスミドベクターは、発現カセット２を含むｐ７３１３ｉｅであった。これは、ユニーク制限エンドヌクレアーゼＳｓｅ８３８７Ｉによる消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートして、形成された３−プライムオーバーハングを除去することによって、線状分子の５−プライム末端および３−プライム末端の両方を平滑末端にすることにより、作製した。これは、２５９ ｂｐ断片を除去するユニーク制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩを用いて切断された。
【０１５２】
ＣｌａＩ／平滑適合性末端を介して、発現カセット１をｐ７３１３ｉｅ／発現カセット２にクローン化して、ｐ７３１３ｉｅ／発現カセット１＋発現カセット２を作製したが、その際、カセット１はカセット２の上流に位置した。
【０１５３】
以下のものを含むｐ７３１３ｉｅプラスミドを作製した。
【化１９】
【０１５４】
上に示した構築物パネルは完全であり、ウェスタンブロットにより、２９３Ｔ細胞における一過的トランスフェクションからの発現についてモニターした。ウェスタンブロット分析の結果を図１６に示す：
レーンの説明：
１．ｐ７３１３ｉｅ／コア
２．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３
３．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ５B
４．ｐ７３１３ｉｅ／コアＮＳ３
５．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４B５B
６．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３コア
７．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３４B５B
８．ｐ７３１３ｉｅ／コアＮＳ３＋ＮＳ４B５B
９．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４B５B＋コアＮＳ３
１０．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３コア＋ＮＳ４B５B
１１．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４B５B＋ＮＳ３コア
１２．ｐ７３１３ｉｅ／コア＋ＮＳ３４B５B
１３．ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ３４B５B＋コア
構築物の各対は２つの独立した発現カセットを保有する。カセットをベクターに挿入する順序が、いずれかのカセットからの発現に影響を及ぼすとは予想しなかった。しかし、これらの結果から、ＮＳ４Ｂ５ＢまたはＮＳ３４Ｂ５Ｂ融合タンパク質の発現に関して、それぞれの発現カセットがコア、ＮＳ３コア、もしくはコアＮＳ３カセットの下流に位置するとき、有意に不利であることがわかる。
【０１５５】
発現レベルは、単一抗原構築物ほど明確ではないが、大きさの有意な増大（１７５〜２２８％）のためにある程度の低減が予想され、これは、細胞に送達されるプラスミドのコピー数の減少（同じ質量のＤＮＡに対して約５０％以下の減少）を意味する。
【０１５６】
二重プロモーター構築物により誘発されるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性:
免疫原性実験のために、４つの抗原すべての最大発現を呈示した３つの二重プロモーター構築物を選択した。これらは、ｐ７３１３ｉｅ ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ＋コア／ＮＳ３、ｐ７３１３ｉｅ ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ＋ＮＳ３コアおよびｐ７３１３ｉｅ ＮＳ３／ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ＋コアであった。Ｃ５７ＢＬマウスをＰＭＩＤにより１μｇのＤＮＡで免疫し、７日後、ＩＬ２についてはＥＬＩＳＰＯＴを用いて、優性ＮＳ３ ＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対する応答を測定した。結果（図１７に示す）から、単一免疫（ＣＤ４およびＣｄ８ ＮＳ３Ｔ細胞特異的なペプチドで刺激した脾細胞）後、すべての二重プロモーター構築物に対して応答が観察されたことがわかる。
【０１５７】
実施例７ コアの欠失突然変異
コアのＯＲＦをコードする多数の遺伝子を、３’末端から１回につき２０アミノ酸にわたる領域ずつ徐々に欠失させて作製し、完全に配列決定した。
【表４】
【０１５８】
図１８は、コアの断片をコードする遺伝子の範囲を示すＤＮＡアガロースゲルを表す。これらの構築物の発現を、ＮＳ４Ｂ５Ｂ 融合物（ｐ７３１３ｉｅ／ＮＳ４Ｂ５Ｂ）の発現レベルへのそれらの作用と併せて、２９３Ｔ細胞での共トランスフェクションにより試験した。結果を図１９に示す。レーンは以下のようにロードされた。
【表５】
【０１５９】
コア１９１、コアΔ１５、コア１７１、コア１５１、およびコア１３１の発現は、ＮＳ４Ｂ５Ｂの発現の抗ＮＳ５Ｂ検出後、ウェスタンブロットを抗コアでプローブすると、はっきりと検出される。恐らく、用いたゲル系のサイズキャプチャー（ｓｉｚｅ−ｃａｐｔｕｒｅ）制限のために、コアの別の切断形態は検出されていない。
【０１６０】
結果から、コア１９１およびコアΔ１５の存在下でのＮＳ４Ｂ５Ｂの発現レベルに、両コア種の強い発現にもかかわらず、有意な低減（これは、コア１７１、そして再度コア１５１で回復する）が明らかである。この観察は、ＮＳ４Ｂ５Ｂで２回、ＮＳ３およびＮＳ５Ｂで１回繰り返した。
【０１６１】
実施例８ ＮＳ３、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ融合物およびＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ三重融合物の発現に対するコアおよびコア１５１の影響
実験１−トランスフォーマットでの発現：
コアをトランスで発現させる、すなわち別々のプラスミド上にコードさせた場合に、非構造抗原の発現に対するコア１９１対コア１５１の発現の影響を比較してモニタリングするための実験を実施した。実験プロトコルは、実施例７に記載したのと同じであった。簡単にいうと、標準的プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を用いて、各々０．５μｇの２種のＤＮＡプラスミドベクター（概略を以下の表に示す）をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中に共トランスフェクションした。（トランスフェクションおよびウェスタンブロット方法は、実施例４に記載の通り）。
【０１６２】
結果を図２０に示すが、同図では、レーンを以下の表に記載したようにロードしており、ウェスタンブロット分析を実施することにより、主として抗ＮＳ３および抗ＮＳ５Ｂ抗血清を用いて非構造タンパク質の発現、および抗コアを含む同じブロットの二次プローブによりコアの発現を検出した。
【表６】
【０１６３】
すべてのケースで、コア１５１と一緒にトランスで産生された場合、非構造タンパク質または融合物（ＮＳ３、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ）の量は、コア１９１と一緒にトランスで発現させたときに産生されるレベルと比較して、有意に増加することが示された。
【０１６４】
実験２−シスフォーマットでの発現：
コアをシスで発現させる、すなわち、非構造要素と融合した同じプラスミド上にコードさせた場合に、非構造抗原の発現に対するコア１９１対コア１５１の発現の影響を比較してモニタリングするための実験を実施した。各ケースで、コア１５１は、指定した非構造領域とカルボキシ末端融合したコア１９１に置換した。
【０１６５】
標準的プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を用いて、１μｇのＤＮＡプラスミドベクター（概略を以下の表に示す）をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションさせた（トランスフェクションおよびウェスタンブロット方法は、実施例４に記載の通り）。
【０１６６】
結果を図２１に示す。ウェスタンブロット分析を実施することにより、ゲルＡにおいて、主として抗ＮＳ３および抗ＮＳ５Ｂ抗血清を用いて非構造成分の発現、及び抗コアを含む同じブロットの二次プローブによりコアの発現を検出した。レーンは以下の表に記載するようにロードした。
【表７】
【０１６７】
結果から、抗原がポリタンパク質融合物の形態であるシス様式では、コアの切断により、融合タンパク質の発現が増大することがわかる。
【０１６８】
ＮＳ３に対する免疫応答に対するコア１９１およびコア１５１の影響の比較：
Ｃ５７ＢＬマウスをＰＭＩＤにより全ＤＮＡ１．５μｇの２回の注射で免疫した。免疫したグループは、空ベクターｐ７３１３ｉｅだけ、ｐ７３１３ｉｅＮＳ３、ｐ７３１３ｉｅＮＳ５Ｂとｐ７３１３ｉｅコア１９１またはｐ７３１３ｉｅＮＳ３、ｐ７３１３ｉｅＮＳ５Ｂとｐ７３１３ｉｅコア１５１による金ビーズの共コーティングを含んでいた。共コーティングを用いたのは、これによって、すべてのプラスミドが同じ細胞に送達され、この細胞が、前記のｉｎ ｖｉｔｒｏ共トランスフェクション実験を模倣すると考えられるためである。初回免疫から１４日後、ＩＦＮγおよびＩＬ２抗原特異的な応答を測定するための細胞内サイトカイン染色を用いて、ＮＳ３からの優性ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答を測定した。結果（図２２に示す）から、ＣＤ４およびＣＤ８ ＮＳ３応答は、コア１９１と比較してコア１５１の存在下で約２倍以上高くなったことがわかる。
【０１６９】
別の実験では、コア１９１またはコア１５１のいずれかと一緒に、ｐ７３１３ｉｅＮＳ３／ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ｂ 三重融合物を発現するプラスミドを共コーティングした金ビーズでＣ５７ＢＬマウスを免疫した。マウスをさらに同じ構築物で追加免疫し、追加免疫から７日後に、応答を測定するために細胞内サイトカイン染色を用いてＮＳ３に対する応答をモニターした。図２３に示した結果から、ＮＳ３抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８応答は、コア１９１と比較して、コア１５１の存在下で約２倍高いことがわかる。
【０１７０】
コアの存在下でのＮＳ３に対する応答を比較するｉｎ ｖｉｖｏ実験全体は、ＦＬコアと非構造タンパク質の同時送達により非構造抗原の発現が低減する可能性があり、これによって、構築物の免疫原性が低下するというｉｎ ｖｉｔｒｏ発現データを支持する。この影響は、Ｃ末端４０アミノ酸が除去された切断型コアを共コーティングすることにより少なくとも部分的に解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１−１】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−２】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−３】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−４】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図１−５】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム野生型ｃＤＮＡ配列（参照登録番号ＡＦ０５４２４７）。
【図２】コドン最適化ＨＣＶコアポリヌクレオチド。
【図３】コドン最適化ＨＣＶ ＮＳ３ポリヌクレオチド。
【図４】コドン最適化ＨＣＶ ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド。
【図５】コドン最適化ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリヌクレオチド。
【図６−１】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム（野生型配列）の翻訳。
【図６−２】ＨＣＶ Ｊ４Ｌ６ゲノム（野生型配列）の翻訳。
【図７】ｐ７３１３−ｉｅの構造。
【図８】コアに対する免疫応答。
【図９】ＮＳ３免疫原性。
【図１０】ＮＳ４Ｂに対する免疫応答。
【図１１】ＮＳ５Ｂに対する免疫応答。
【図１２】抗ＨＣＶ ＮＳ５Ｂを用いるタンパク質発現のモニタリング。
【図１３】ＩＬ２（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ） ＥＬＩＳＰＯＴによるＮＳ３タンパク質に対する免疫応答。
【図１４】ＮＳ３−５を発現するワクシニアウイルスに感染させた脾細胞を刺激因子とするＩＬ２及びＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果。
【図１５】ＨＣＶポリタンパク質でのＰＭＩＤ免疫による機能的ＣＤ８応答の誘発。
【図１６】２９３Ｔ細胞での一過的トランスフェクションからの発現を示すウエスタンブロット分析の結果。
【図１７】二重プロモーター構築物により誘導されるＮＳ３ Ｔ細胞応答の比較。
【図１８】コアの断片をコードする遺伝子の範囲を示すＤＮＡアガロースゲル。
【図１９】２９３Ｔ細胞での共トランスフェクションとＮＳ４Ｂ５Ｂ融合物の発現レベル。
【図２０】２９３Ｔ細胞での共トランスフェクション後のＮＳ３、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ４Ｂ５Ｂ、およびＮＳ３４Ｂ５Ｂの発現に対するコアおよびコア１５１の影響。
【図２１】２９３Ｔ細胞での一過的トランスフェクションにおけるコア１５１のコア１９１への置換後の融合タンパク質の発現に対する影響。
【図２２】ＮＳ３からの優性ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答。
【図２３】ＮＳ３に対するＣＤ４及びＣＤ８応答。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVタンパク質コア、NS3、NS4BおよびNS5Bのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む、医療における使用のためのHCVワクチン。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが他のHCVタンパク質をコードしない、請求項1に記載のHVCワクチン。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、他のHCVタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断されたコアタンパク質をコードする、請求項1または2に記載のHCVワクチン。
【請求項４】
前記切断型コアタンパク質が、少なくともC末端の10アミノ酸の欠失を有する、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項５】
前記切断型コアタンパク質がコア1−151配列からなる、請求項4に記載のHCVワクチン。
【請求項６】
前記HCVタンパク質が1以上の前記HCVタンパク質を含有する融合タンパク質の形態で存在する、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項７】
前記融合タンパク質がNS4BとNS5Bのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項８】
前記融合タンパク質がNS3とコアのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項９】
前記HCVタンパク質が1以上の発現カセット中のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１０】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、少なくとも前記他のHCVタンパク質をコードする発現カセットの下流のシス位置にある、請求項9に記載のHCVワクチン。
【請求項１１】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、前記NS5Bタンパク質をコードする発現カセットの下流である、請求項10に記載のHCVワクチン。
【請求項１２】
前記HCVタンパク質の少なくとも1つが突然変異により不活性化されている、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがモチーフAに突然変異を含むNS5Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのプロテアーゼ活性が触媒三つ組アミノ酸のいずれかにおける突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのヘリカーゼ活性がヘリカーゼモチーフI、II、III、もしくはIVの1以上における突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、高度可変のN末端領域を除去する切断を含むNS4Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドワクチンがHCV組合せ1〜19のいずれか1つをコードする、請求項1〜16のいずれか1項に記載のHCVワクチン。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがDNA配列である、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１９】
前記DNA配列がプラスミドの形態である、請求項18に記載のHCVワクチン。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのコドンが哺乳動物細胞での発現のために最適化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるHCV感染症の予防または治療方法。
【請求項２２】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドワクチンを取得し、金ビーズ上にポリヌクレオチドをコーティングし、該金ビーズを皮膚内に送達することを含む、個体のワクチン接種方法。
【請求項２３】
HCV治療用の医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載のHCVワクチンの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVタンパク質コア、NS3、NS4BおよびNS5Bのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む医療に使用するためのHCVワクチンであって、該ポリヌクレオチドが他のHCVタンパク質をコードしない、上記ワクチン。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、他のHCVタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断されたコアタンパク質をコードする、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項３】
前記切断型コアタンパク質が少なくともC末端の10アミノ酸の欠失を有する、請求項２に記載のHCVワクチン。
【請求項４】
前記切断型コアタンパク質がコア1−151配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項５】
前記切断型コアタンパク質がコア1−165配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項６】
前記HCVタンパク質が1以上の前記HCVタンパク質を含有する融合タンパク質の形態で存在する、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項７】
前記融合タンパク質がNS4BとNS5Bのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項８】
前記融合タンパク質がNS３とコアのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項９】
前記HCVタンパク質が２つ以上の発現カセット中のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１０】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、少なくとも前記他のHCVタンパク質をコードする発現カセットの下流のシス位置にある、請求項9に記載のHCVワクチン。
【請求項１１】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、NS5Bタンパク質をコードする発現カセットの下流にある、請求項10に記載のHCVワクチン。
【請求項１２】
前記HCVタンパク質の少なくとも1つが突然変異により不活性化されている、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがモチーフAに突然変異を含むNS5Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのプロテアーゼ活性が触媒三つ組アミノ酸のいずれかにおける突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのヘリカーゼ活性がヘリカーゼモチーフI、II、IIIもしくはIVの1以上における突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、高度可変のN末端領域を除去する切断を含むNS4Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドワクチンがHCV組合せ1〜19のいずれか1つをコードする、請求項1〜16のいずれか1項に記載のHCVワクチン。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがDNA配列である、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１９】
前記DNA配列がプラスミドの形態である、請求項18に記載のHCVワクチン。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのコドンが哺乳動物細胞での発現のために最適化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるHCV感染症の予防または治療方法。
【請求項２２】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドワクチンを取得し、金ビーズ上に該ポリヌクレオチドをコーティングし、該金ビーズを皮膚内に送達することを含む、個体のワクチン接種の方法。
【請求項２３】
HCV治療用の医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載のHCVワクチンの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVタンパク質コア、NS3、NS4BおよびNS5Bのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む医療に使用するためのHCVワクチンであって、該ポリヌクレオチドが他のHCVタンパク質をコードしない、上記ワクチン。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、他のHCVタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断されたコアタンパク質をコードする、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項３】
前記切断型コアタンパク質が少なくともC末端の10アミノ酸の欠失を有する、請求項２に記載のHCVワクチン。
【請求項４】
前記切断型コアタンパク質がコア1−151配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項５】
前記切断型コアタンパク質がコア1−165配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項６】
前記HCVタンパク質が1以上の前記HCVタンパク質を含有する融合タンパク質の形態で存在する、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項７】
前記融合タンパク質がNS4BとNS5Bのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項８】
前記融合タンパク質がNS３とコアのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項９】
前記HCVタンパク質が２つ以上の発現カセット中のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１０】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、少なくとも前記他のHCVタンパク質をコードする発現カセットの下流のシス位置にある、請求項9に記載のHCVワクチン。
【請求項１１】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、NS5Bタンパク質をコードする発現カセットの下流にある、請求項10に記載のHCVワクチン。
【請求項１２】
前記HCVタンパク質の少なくとも1つが突然変異により不活性化されている、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがモチーフAに突然変異を含むNS5Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのプロテアーゼ活性が触媒三つ組アミノ酸のいずれかにおける突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのヘリカーゼ活性がヘリカーゼモチーフI、II、IIIもしくはIVの1以上における突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、高度可変のN末端領域を除去する切断を含むNS4Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドワクチンがHCV組合せ1〜19のいずれか1つをコードする、請求項1〜16のいずれか1項に記載のHCVワクチン。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがDNA配列である、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１９】
前記DNA配列がプラスミドの形態である、請求項18に記載のHCVワクチン。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのコドンが哺乳動物細胞での発現のために最適化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２１】
HCV治療用の医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載のHCVワクチンの使用。
【請求項１】
HCVタンパク質コア、NS3、NS4BおよびNS5Bのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む、医療における使用のためのHCVワクチン。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが他のHCVタンパク質をコードしない、請求項1に記載のHVCワクチン。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、他のHCVタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断されたコアタンパク質をコードする、請求項1または2に記載のHCVワクチン。
【請求項４】
前記切断型コアタンパク質が、少なくともC末端の10アミノ酸の欠失を有する、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項５】
前記切断型コアタンパク質がコア1−151配列からなる、請求項4に記載のHCVワクチン。
【請求項６】
前記HCVタンパク質が1以上の前記HCVタンパク質を含有する融合タンパク質の形態で存在する、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項７】
前記融合タンパク質がNS4BとNS5Bのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項８】
前記融合タンパク質がNS3とコアのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項９】
前記HCVタンパク質が1以上の発現カセット中のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１０】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、少なくとも前記他のHCVタンパク質をコードする発現カセットの下流のシス位置にある、請求項9に記載のHCVワクチン。
【請求項１１】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、前記NS5Bタンパク質をコードする発現カセットの下流である、請求項10に記載のHCVワクチン。
【請求項１２】
前記HCVタンパク質の少なくとも1つが突然変異により不活性化されている、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがモチーフAに突然変異を含むNS5Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのプロテアーゼ活性が触媒三つ組アミノ酸のいずれかにおける突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのヘリカーゼ活性がヘリカーゼモチーフI、II、III、もしくはIVの1以上における突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、高度可変のN末端領域を除去する切断を含むNS4Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドワクチンがHCV組合せ1〜19のいずれか1つをコードする、請求項1〜16のいずれか1項に記載のHCVワクチン。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがDNA配列である、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１９】
前記DNA配列がプラスミドの形態である、請求項18に記載のHCVワクチン。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのコドンが哺乳動物細胞での発現のために最適化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるHCV感染症の予防または治療方法。
【請求項２２】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドワクチンを取得し、金ビーズ上にポリヌクレオチドをコーティングし、該金ビーズを皮膚内に送達することを含む、個体のワクチン接種方法。
【請求項２３】
HCV治療用の医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載のHCVワクチンの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVタンパク質コア、NS3、NS4BおよびNS5Bのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む医療に使用するためのHCVワクチンであって、該ポリヌクレオチドが他のHCVタンパク質をコードしない、上記ワクチン。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、他のHCVタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断されたコアタンパク質をコードする、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項３】
前記切断型コアタンパク質が少なくともC末端の10アミノ酸の欠失を有する、請求項２に記載のHCVワクチン。
【請求項４】
前記切断型コアタンパク質がコア1−151配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項５】
前記切断型コアタンパク質がコア1−165配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項６】
前記HCVタンパク質が1以上の前記HCVタンパク質を含有する融合タンパク質の形態で存在する、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項７】
前記融合タンパク質がNS4BとNS5Bのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項８】
前記融合タンパク質がNS３とコアのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項９】
前記HCVタンパク質が２つ以上の発現カセット中のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１０】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、少なくとも前記他のHCVタンパク質をコードする発現カセットの下流のシス位置にある、請求項9に記載のHCVワクチン。
【請求項１１】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、NS5Bタンパク質をコードする発現カセットの下流にある、請求項10に記載のHCVワクチン。
【請求項１２】
前記HCVタンパク質の少なくとも1つが突然変異により不活性化されている、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがモチーフAに突然変異を含むNS5Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのプロテアーゼ活性が触媒三つ組アミノ酸のいずれかにおける突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのヘリカーゼ活性がヘリカーゼモチーフI、II、IIIもしくはIVの1以上における突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、高度可変のN末端領域を除去する切断を含むNS4Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドワクチンがHCV組合せ1〜19のいずれか1つをコードする、請求項1〜16のいずれか1項に記載のHCVワクチン。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがDNA配列である、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１９】
前記DNA配列がプラスミドの形態である、請求項18に記載のHCVワクチン。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのコドンが哺乳動物細胞での発現のために最適化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるHCV感染症の予防または治療方法。
【請求項２２】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドワクチンを取得し、金ビーズ上に該ポリヌクレオチドをコーティングし、該金ビーズを皮膚内に送達することを含む、個体のワクチン接種の方法。
【請求項２３】
HCV治療用の医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載のHCVワクチンの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVタンパク質コア、NS3、NS4BおよびNS5Bのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む医療に使用するためのHCVワクチンであって、該ポリヌクレオチドが他のHCVタンパク質をコードしない、上記ワクチン。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、他のHCVタンパク質の発現に与えるコアの抑制作用を低減するのに十分な量でカルボキシ末端から切断されたコアタンパク質をコードする、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項３】
前記切断型コアタンパク質が少なくともC末端の10アミノ酸の欠失を有する、請求項２に記載のHCVワクチン。
【請求項４】
前記切断型コアタンパク質がコア1−151配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項５】
前記切断型コアタンパク質がコア1−165配列からなる、請求項3に記載のHCVワクチン。
【請求項６】
前記HCVタンパク質が1以上の前記HCVタンパク質を含有する融合タンパク質の形態で存在する、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項７】
前記融合タンパク質がNS4BとNS5Bのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項８】
前記融合タンパク質がNS３とコアのポリペプチド配列で構成される二重融合物である、請求項6に記載のHCVワクチン。
【請求項９】
前記HCVタンパク質が２つ以上の発現カセット中のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１０】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、少なくとも前記他のHCVタンパク質をコードする発現カセットの下流のシス位置にある、請求項9に記載のHCVワクチン。
【請求項１１】
コアタンパク質をコードする前記発現カセットが、NS5Bタンパク質をコードする発現カセットの下流にある、請求項10に記載のHCVワクチン。
【請求項１２】
前記HCVタンパク質の少なくとも1つが突然変異により不活性化されている、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがモチーフAに突然変異を含むNS5Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのプロテアーゼ活性が触媒三つ組アミノ酸のいずれかにおける突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがNS3タンパク質をコードし、そのヘリカーゼ活性がヘリカーゼモチーフI、II、IIIもしくはIVの1以上における突然変異により破壊されている、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、高度可変のN末端領域を除去する切断を含むNS4Bタンパク質をコードする、請求項12に記載のHCVワクチン。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドワクチンがHCV組合せ1〜19のいずれか1つをコードする、請求項1〜16のいずれか1項に記載のHCVワクチン。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがDNA配列である、請求項1に記載のHCVワクチン。
【請求項１９】
前記DNA配列がプラスミドの形態である、請求項18に記載のHCVワクチン。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのコドンが哺乳動物細胞での発現のために最適化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項２１】
HCV治療用の医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載のHCVワクチンの使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００６−５２４１８１（Ｐ２００６−５２４１８１Ａ）
【公表日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５２６２１（Ｐ２００４−５５２６２１）
【出願日】平成１５年１１月１３日（２００３．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１２８３０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６１７６
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月１３日（２００３．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１２８３０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６１７６
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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