一分子型プローブ及びその利用
【課題】発光輝度が高く、容易に設計可能な一分子型プローブを提供する。
【解決手段】本発明に係る融合タンパク質は、標的物質を検出するプローブとして使用されるものであり、前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加するものである。
【解決手段】本発明に係る融合タンパク質は、標的物質を検出するプローブとして使用されるものであり、前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料中の標的物質を検出する融合タンパク質及びその利用に関し、より具体的には、被験試料中の標的物質を検出する一分子型プローブとして用いられる融合タンパク質及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の変形、タンパク質分子間の結合などに基づく生命現象として、例えば、ホルモン刺激により構造変化を経て活性化状態となり、二量体となる核受容体（ＮＲ：nuclear receptor）が挙げられる。そして、二量体化した核受容体は、核内に移行し、核内の核受容体応答配列（ＮＲＥ：nuclear receptor response element）に結合して、転写活性を引き起こす（非特許文献１）。
【０００３】
また、細胞は、細胞外部からの成長ホルモン（growth factor）刺激に対して、特異的な受容体（growth factor receptor）を介して応答し、一連のタンパク質リン酸化の媒介によって細胞内部に信号を伝達する（非特許文献２）。さらに、細胞は、細胞内部のコレステロール濃度の変化をモニタリングするシステムを有している。その一例として、細胞は、コレステロール濃度を調節するタンパク質（ＳＲＥＢＰ−２：Sterol-response element binding protein-2）を保有している。細胞内のコレステロール濃度が一定以下に低下した場合、細胞はそれを感知し、ＳＲＥＢＰ−２が分割される。そして、２分割されたＳＲＥＢＰ−２の断片の一部が二量体化して核内移行し、核内でステロール応答配列（ＳＲＥ：Sterol-response element）に結合することによって、一連のコレステロール調節因子を発現させる（非特許文献３）。
【０００４】
この様な細胞内分子現象は、生体が生命活動の恒常性を維持しつつ、外部の環境変化に素早く応答するための機構である。これらの信号伝達を担うタンパク質は、細胞が外部刺激に素早く反応し、対処する上で極めて重要な役割を果たしている。
【０００５】
細胞内分子現象を測定するためのいくつかの方法が開示されている。例えば、タンパク質―タンパク質間相互作用、タンパク質の立体構造の変化、タンパク質のリン酸化等を測定する手法が知られている。タンパク質―タンパク質間の相互作用を検出する方法として、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）法及びＢＲＥＴ（bioluminescence resonance energy transfer）法が広く使用されている（非特許文献４及び５）。
【０００６】
また、本発明者らは以前に、一分子型及び二分子型生物発光プローブを提案している（非特許文献６及び７ならびに特許文献１〜３）。これらの生物発光プローブは、発光酵素を２分割し、それらの間に１つ又は２つのタンパク質を挿入した形態の生物発光可視化プローブである。一分子型生物発光プローブの一例として、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）由来の発光酵素を２分割し、カルシウム認識タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ：calmodulin）をその間に挿入したものが挙げられる。この一分子型生物発光プローブを真核細胞に導入した場合、Ｃａ２＋の濃度に依存した生物発光の変化を観察できる（非特許文献８及び特許文献３）。
【０００７】
さらに、本発明者らは以前に、円順列置換した発光酵素用いた生物発光プローブを提案している（非特許文献９）。この生物発光プローブにおいて、発光酵素の本来のＮ末端とＣ末端とを連結する一方で、酵素の酵素活性部位を切断して人工的なＮ末端とＣ末端とを作ることによって円順列置換されている。そして、人工的に作製したこれらの末端のそれぞれにタンパク質を連結する。このように分子設計することによって、発光酵素の酵素活性部位は２分割され、分割された酵素活性部位がそれぞれ分子の中心から外側に配置される。従って、酵素活性部位間の衝突確率を顕著に抑えることができる。結果として、シグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ比：signal-to-noise ratio）を格段に改善することができる。
【０００８】
また、本発明者らは以前に、男性ホルモン受容体（ＡＲ：androgen receptor）の核内移行を指標とした、生物発光イメージングプローブを提案している（非特許文献１）。このプローブでは、発光酵素を２分割する一方で、タンパク質組み継ぎ反応を起こすタンパク質（ＤｎａＥ）も２分割する。そして、２分割したそれぞれの一方の断片をＡＲに連結して通常は細胞質に局在させておき、その残りの断片を核内に局在させておく。ＡＲは、ステロイドホルモン依存的に核内に移行し、ＡＲに連結された断片は、核内に局在している残りの断片と相互作用する。これにより回復した生物発光強度を測定することによって、タンパク質間相互作用を検出する。
【０００９】
さらに他の細胞内分子現象を測定する方法として、特許文献４には、ホタルルシフェラーゼに１つのタンパク質を挿入したプローブを用いて、外部刺激により低下する発光量を測定する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０８４８６９号パンフレット
【特許文献２】特開２００９−３４０５９号公報（２００９年２月１９日公開）
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１７６２３９号公報（２００９年７月９日公開）
【特許文献４】国際公開第２００５／０３８０２９号パンフレット（２００５年４月２８日）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kim, S. B.; Ozawa, T.; Watanabe, S.; Umezawa, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 11542-11547.
【非特許文献２】Kaihara, A.; Umezawa, Y. Chemistry, An Asian Journal 2008, 3, 38-45.
【非特許文献３】Kim, S. B.; Takao, R.; Ozawa, T.; Umezawa, Y. Analytical Chemistry 2005, 77, 6928-6934.
【非特許文献４】Awais, M.; Sato, M.; Lee, X. F.; Umezawa, Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2707-2712.
【非特許文献５】Hoshino, H.; Nakajima, Y.; Ohmiya, Y. Nat. Methods 2007, 4, 637-639.
【非特許文献６】Kim, S. B.; Otani, Y.; Umezawa, Y.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, 4820-4826.
【非特許文献７】Kim, S. B.; Awais, M.; Sato, M.; Umezawa, Y.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, 1874-1880.
【非特許文献８】Kim, S. B.; Sato, M.; Tao, H. Anal. Chem. 2009, 81, 67-74.
【非特許文献９】Kim, S. B.; Sato, M.; Tao, H. Bioconjugate Chemistry 2008, 19, 2480-2486.
【非特許文献１０】Hodges, Y. K.; Tung, L.; Yan, X. D.; Graham, J. D.; Horwitz, K. B.; Horwitz, L. D. Circulation 2000, 101, 1792-1798.
【非特許文献１１】Loening, A. M.; Wu, A. M.; Gambhir, S.S. Nat. Methods 2007, 4, 641-643.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した、発光酵素を含有する発光プローブを用いた検出方法は、従来のタンパク質間相互作用検出用のＦＲＥＴにおける、自己蛍光によるバックグラウンド蛍光が高いこと、外部光源が必要となること、蛍光測定のために大型の蛍光顕微鏡を必要とすること、分析できる細胞数が限られており、得られる結果が定量的というよりもむしろ定性的となること等の問題を解決し得るものである。
【００１３】
そのため、このような発光プローブによる検出精度のさらなる向上が要求されており、特に、十分な検出精度を得るために、より安定性が高い発光プローブが求められている。また、発光プローブの開発費用等を抑え、広く使用するために、設計が容易であることが求められている。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、発光強度が高く、設計が容易な新規のプローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、以下の点に深く考慮することにより本発明を完成させた。
【００１６】
まず、発光酵素が本来持つ酵素活性を侵害しないことに考慮し、発光酵素の全長をそのまま利用することを見出した。そして、発光酵素の構造上の変形による酵素活性度の変化を指標とすることによって、高い発光強度のままでの測定が可能であり、発光プローブの構造をより単純化して設計上の試行錯誤を容易に回避できることを見出した。
【００１７】
本発明に係る融合タンパク質は、上記課題を解決するために、標的物質を検出する融合タンパク質であって、前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加するものであることを特徴としている。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記酵素は略球形状であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る融合タンパク質において、前記酵素は発光酵素であり、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるものであることが好ましい。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する蛍光タンパク質をさらに有することが好ましい。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記発光酵素は、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼからなる群より選択されることが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明に係る融合タンパク質において、前記一次結合タンパク質は、核内受容体、サイトカイン受容体、タンパク質キナーゼ、セカンドメッセンジャー認識タンパク質、及び転写因子からなる群より選択されることが好ましい。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記一次結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、前記二次結合タンパク質がＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインであり、前記発光酵素がウミシイタケルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明に係る融合タンパク質は、前記一次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第１リンカーと、前記二次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第２リンカーとをさらに備え、前記第１リンカー及び前記第２リンカーはそれぞれ、５アミノ酸以下のアミノ酸配列からなることが好ましい。さらに、本発明に係る融合タンパク質において、前記第１リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列からなり、前記第２リンカーは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明に係る融合タンパク質は、配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質；あるいは配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質であることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記いずれかの融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドであることを特徴としている。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一であり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るベクターは、上記いずれかのポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係る形質転換体は、上記いずれかのポリヌクレオチド、又は上記ベクターを含んでいることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る標的物質を検出する方法は、被験試料中の標的物質を検出する方法であって、前記被験試料と、上記いずれかの融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴としている。本発明に係る標的物質を検出するためのキットは、上記いずれかの融合タンパク質を備えていることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係るプローブの生産方法は、上記いずれかのポリヌクレオチド又は上記ベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本発明に係るプローブの生産キットは、上記いずれかのポリヌクレオチド又はベクターを備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る融合タンパク質によれば、活性型の酵素又はその前駆体を用いることによって、設計が容易であり、かつ発光強度が高く、種々のタンパク質間相互作用の可視化検出をより高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る発光プローブの一例を用いたリガンド認識メカニズムを模式的に示す図である。
【図２】ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８）の結晶構造を示す図である。
【図３】ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）の結晶構造を示す図である。
【図４】ＲＬｕｃ８の酵素活性部位における各アミノ酸と基質との間の相互作用を示す図であり、酵素末端から近いアミノ酸を破線によって囲んで示す。
【図５】本発明に係る発光プローブを用いたリガンド認識メカニズムを示す模式図である。
【図６】本発明に係る発光プローブを作製するためのＤＮＡコンストラクト構成の一例を示す図である。
【図７】ＲＬｕｃ８を挿入した発光プローブ（ＥＲＳ）を発現した形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。
【図８】ＥＲＳ、ＥＧＳ（ＧＬｕｃを挿入した発光プローブ）、ＥＣＳ（ＣＢＬｕｃを挿入した発光プローブ）、ＥＦＳ（ＦＬｕｃを挿入した発光プローブ）をそれぞれ発現した形質転換体における発光強度の割合を示すグラフである。
【図９】発光酵素の種々の基質の化学構造を示す図であり、重要なサイドチェーンにあたる部位を破線によって囲んで示す。
【図１０】種々の基質共存下における発光スペクトルを示すグラフである。
【図１１】種々の基質共存下における発光スペクトルのピーク強度の割合を示すグラフである。
【図１２】ＲＬｕｃ８を発現する形質転換体、及びＥＲＳを発現する形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】ＥＲＳを発現する形質転換体におけるリガンド応答曲線を示す図である。
【図１４】ＥＲＳ、ＥｍＲＳ（ＥＲ ＬＢＤのリン酸化部位が変異した発光プローブ）、ＥＲ＋ＲＳ（ＲＬｕｃ８とＥＲ ＬＢＤとが連結されたプローブ（ＥＲ）及びＲＬｕｃ８とＳＨ２ドメインとが連結されたプローブ（ＲＳ））を発現する形質転換体における相対発光強度を示すグラフである。
【図１５】ＥＲ又はＲＳを発現させるためのＤＮＡコンストラクト構成を示す図である。
【図１６】ＥＲ及びＲＳの構造を模式的に示す図である。
【図１７】種々のリガンドの化学構造を示す図である。
【図１８】ＥＲＳを発現する形質転換体における、種々のリガンドに応答した発光強度を示すグラフである。
【図１９】本発明に係る発光プローブ（ＥＥＲＳ）を作製するための構成の一例を示す図である。
【図２０】ＥＹＦＰ及びＲＬｕｃ８を挿入した発光プローブ（ｐＥＥＲＳ）を発現した形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。
【図２１】本発明に係る発光プローブであり、その内部での発光共鳴エネルギー移動を起こす発光プローブ（ＥＥＲＳ）のリガンド認識メカニズムを模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔１．融合タンパク質及びポリヌクレオチド〕
本発明に係る融合タンパク質は、一分子型生物発光プローブとして用いられ、標的物質を検出する融合タンパク質であって、前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、前記一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質である。
【００２９】
後述するように、本発明に係る融合タンパク質に含まれる活性型の酵素又はその前駆体の代表的な例として、活性型の発光酵素又はその前駆体が挙げられる。したがって、以下では、例として、本発明に係る融合タンパク質における酵素を発光酵素として説明し、本発明に係る融合タンパク質を発光プローブと称することもあるが、本発明はこれに限定されず、他の酵素であっても同様に説明され得る。
【００３０】
本明細書において、「発光プローブ」は、「生物発光プローブ」又は「プローブ」と交換可能に使用され、標的に特異的な標的物質によって引き起こされる様々な分子現象を、生きた細胞又は生体において、生物発光として可視化イメージングすることが可能なプローブである。また、「一分子型発光プローブ」とは、上述した可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に含むプローブである。例えば、上述した（ｉ）一次結合タンパク質、（ｉｉ）活性型酵素又はその前駆体、（ｉｉｉ）二次結合タンパク質を、基本構成要素として含む融合タンパク質が含まれ得る。
【００３１】
本発明の融合タンパク質は、一次結合タンパク質と二次結合タンパク質との間に活性型酵素又はその前駆体が挿入されていればどのような順番でもよいが、一次結合タンパク質、活性型酵素又はその前駆体、二次結合タンパク質の順に直鎖状に連結された形態であることが好ましく、アミノ末端から一次結合タンパク質、活性型酵素又はその前駆体、二次結合タンパク質の順に直鎖状に連結された形態であることがより好ましい。
【００３２】
また、本発明の融合タンパク質は、前記酵素が発光酵素であり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるものであることが好ましい。さらに、本発明の融合タンパク質は、一次結合タンパク質と二次結合タンパク質との間に位置する蛍光タンパク質をさらに有することが好ましい。この構成であれば、発光共鳴エネルギー移動を起こすことができる。
【００３３】
ここで、「一次結合タンパク質」は、その標的物質の結合部位に標的物質が結合するタンパク質が意図され、「標的物質結合タンパク質」と称することもある。後述するように、本発明によって検出する標的物質をリガンドと称する場合には、標的物質結合タンパク質を、「リガンド結合タンパク質」と称することもある。
【００３４】
一次結合タンパク質は、例えば、標的物質が結合することによって立体構造が変化し、後述する二次結合タンパク質の分子認識部位と結合することができるタンパク質であり得る。このような一次結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質又は信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体（ＮＲ）、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。一次結合タンパク質は、対象とする標的物質によって適宜選択される。
【００３５】
本明細書中における「標的物質」は、本発明に係る発光プローブの検出の対象となる物質であり、生細胞膜上又は生細胞内の特定タンパク質と特異的に結合してその機能を変化させうる物質を意味しており、「リガンド」と称することもある。例えば、核リセプターに対してはステロイド又は合成化学物質をさし、サイトカイン受容体に対しては各種サイトカインをさし、インシュリン受容体のような細胞膜上受容体に対してはインシュリンを含む刺激物質をさす。
【００３６】
本発明によって検出するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。例えば、受容体タンパク質（例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等）に対するアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。また、細胞内の情報伝達に関与する分子に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。
【００３７】
例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合タンパク質（セカンドメッセンジャー認識タンパク質）を使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、イノシトール３リン酸（ＩＰ３：inositol triphosphate）、ＩＰ４、Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール（diacylglycerol）、アラキドン酸（arachidonic acid）等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのＣａ２＋に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン（ＣａＭ）を用いることができる。
【００３８】
また、例えば、リガンドとして核内受容体に特異的なリガンドを対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、核内受容体の公知の結合ドメイン（ＬＢＤ：ligand binding domain）を使用することができる。さらに、リン酸化アミノ酸残基又はＧタンパク質結合型受容体リガンドを対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、それぞれリン酸化アミノ酸結合ドメイン又はＧタンパク質結合型受容体を使用することができる。核内受容体リガンド結合ドメインとしては、エストロゲンをリガンドとするエストロゲン受容体（ＥＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）のリガンド結合ドメインが好適に用いられる。
【００３９】
例えば、エストロゲン受容体のＬＢＤは、全長ヒトエストロゲン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/Ｐ０３３７２）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号３０５〜５５０）を、遺伝子工学的に又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、例えばアンドロゲン受容体のＬＢＤは、全長ヒトアンドロゲン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/ＡＦ１６２７０４）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号６７２〜９１０）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、例えばグルココルチコイド受容体のＬＢＤは、全長ヒトグルココルチコイド受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/１２０１２７７Ａ）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号５２７〜７７７）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、同様にプロゲステロン受容体のＬＢＤについても、全長ヒトプロゲステロン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/Ｐ０６４０１）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号６７７−９３３）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。
【００４０】
本明細書において「二次結合タンパク質」は、上述したリガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する分子認識部位を有するタンパク質が意図され、「認識タンパク質」と称することもある。認識タンパク質には、例えば、リガンドの結合により立体構造が変化したリガンド結合タンパク質に結合するタンパク質等が包含される。
【００４１】
例えばリガンド結合タンパク質としてカルモジュリンを用いた場合、認識タンパク質として、ミオシン軽鎖キナーゼ（miosin light chain kinase）由来のペプチドであるＭ１３ペプチドが好適に用いられる。また、Ｍ１３以外にもカルモジュリンに対して結合できるタンパク質として、アデニリルシクラーゼ、カルモジュリンキナーゼＩＩのようなＣａＭ依存性タンパク質キナーゼ類を挙げることができる。このようなタンパク質の一部分をＭ１３の代わりに用いることができる。
【００４２】
また、例えばリガンド結合タンパク質として、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体等の核内受容体を用いた場合、認識タンパク質として共転写因子（coactivator）由来のＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１２）、ＡＲのＮ末側（ＡＲ ＮＴＤ）由来のＦＱＮＬＦモチーフ、ＦＸＸＬＦモチーフ、ＷＸＸＬＦモチーフ等が用いられ得る。好ましくは、共転写因子の一種であるＲｉｐ１４０（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＰ００３４８０）、又はＳｒｃ−１ａ（steroid receptor coactivator 1 isoform 1；ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＰ００３７３４）のＬＸＸＬＬモチーフ（約１５アミノ酸）が用いられる。
【００４３】
さらに、リン酸化アミノ酸残基を認識できるドメインである、各種キナーゼタンパク質のＳＨ２ドメインを、認識タンパク質として用いてもよい。例えば、発癌制御タンパク質であるＳｒｃタンパク質（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src；ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＰ９３８０３３）のリン酸化認識ドメイン（ＳＨ２ドメイン；アミノ酸番号１５０〜２４８）、細胞増殖、発癌等に関連する増殖因子レセプター結合タンパク質Ｇｒｂ２（growth factor receptor-binding protein2）のＳＨ２ドメイン等を用いることができる。また、リガンド結合タンパク質としてＧタンパク質結合型受容体を用いた場合、認識タンパク質としてＧタンパク質等を好適に用いることができる。
【００４４】
本発明におけるリガンド結合タンパク質及び認識タンパク質の組み合わせとしては、条件依存的に結合する２つのタンパク質であってもよい。例えばＦＲＢとＢＲＡＤ、ＥＲ ＬＢＤとＬＸＸＬＬモチーフ、ＡＲ ＬＢＤとＦＱＮＬＦモチーフ、ＣａＭとＭ１３、核内受容体とそのコアクチベーター、リン酸化タンパク質とそのリン酸化認識タンパク質、核受容体間のホモ又はヘテロ結合（二量化）を行う２つのタンパク質等のペアを用いることができる。
【００４５】
本明細書中において「活性型の酵素又はその前駆体」は、その酵素活性部位に基質を結合し得る、活性化状態の酵素又はその前駆体であることが意図され、酵素の全長配列を含むものであることが意図される。なお、「酵素の全長配列」とは、少なくとも酵素活性部位を含む領域を、欠失、分割等せずにそのまま全て含むものであり、本来の酵素活性を保持しているものであればよい。例えば、欠失させても酵素活性には影響を及ぼさないＮ末側又はＣ末側の一部分等が欠失しているものについても、「酵素の全長配列」に含まれる。
【００４６】
ここで、酵素の前駆体とは、不活性なものであるが、何らかの修飾を受けることによって、活性化し、活性型の酵素となるものを意図しており、活性型の酵素と同一の配列からなるものである。例えば、リン酸化により不活性状態から活性化する酵素を使用する場合、前駆体の状態で発光プローブに挿入し、リガンドの検出時にリン酸化することによって活性化して、活性型の酵素として使用することができる。以下で、本発明において使用する「酵素の全長」又は単に「酵素」について記載する場合、活性型の酵素又はその前駆体を意図している。
【００４７】
本発明において使用する酵素は、そのＮ末側とＣ末側とにそれぞれつながれているリガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが互いに相互作用することによって、外部からの分子テンションが加わり、その構造的な変形が生じることによって、発光プローブからの酵素活性度が変化する酵素であり得る。このような酵素の代表的なものとして、発光酵素（ＬＥ：lighting enzyme）が挙げられる。
【００４８】
また、本発明において使用する酵素は、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に、蛍光タンパク質と連結されて挿入されていてもよい。この場合の酵素とは、発光酵素であることが好ましい。また、蛍光タンパク質は、発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の受け皿となり得るものであることが好ましい。すなわち、蛍光タンパク質は、発光酵素の活性によって発生した発光エネルギーを吸収できるものであることが好ましい。これにより、発光共鳴を誘導する（発光共鳴エネルギー移動を起こす）ことが可能になる。
【００４９】
本発明において使用する発光酵素と蛍光タンパク質との組み合わせは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に挿入されることによって、発光酵素と蛍光タンパク質との発光共鳴エネルギー移動の一部に影響を受けるものであることが望ましい。また、発光酵素と蛍光タンパク質との組み合わせは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが互いに相互作用することによって、外部からの分子テンションが加わり、それらの内部構造的な変形が生じることにより発光酵素と蛍光タンパク質との発光共鳴エネルギー移動が影響を受けるものであって、これによって、発光プローブからの酵素活性度が変化する発光酵素と蛍光タンパク質との組み合わせであり得る。
【００５０】
なお、蛍光タンパク質は、酵素のＮ末側に連結されていてもよいし、酵素のＣ末側に連結されていてもよい。
【００５１】
本明細書中において「分子テンション」とは、上述した酵素（酵素分子）、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせにＮ末端とＣ末端とから加わる力（緊張）であり、好ましくは酵素分子、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせに構造的な変形を生じさせるような力である。
【００５２】
本明細書中において「構造的な変形」とは、上述したような酵素分子、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせに外部から加わる分子テンションによって、酵素分子、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせの分子が捩れる等の構造上の変化であることを意図しており、構造が大きく変形するようなものでなくてもよく、その変形により発光プローブからの酵素活性度が増加するような変形であればよい。
【００５３】
本発明に係る発光プローブの各構成要素であるリガンド結合タンパク質、酵素の全長あるいは酵素の全長及び蛍光タンパク質、ならびに認識タンパク質は、直鎖状の融合分子となるように、それぞれ直接に、又は最適なリンカーペプチドを介して連結される。リンカーペプチドを介して連結する場合、リンカーペプチド配列の種類及び長さを変えることで、各構成要素間の距離を適宜調整することが可能である。
【００５４】
このようなリンカーペプチドとしては、本発明に係る発光プローブを一本鎖の融合タンパク質として発現するための連結ペプチドであることが好ましい。リンカーペプチドとしては、サイドチェーンのない、柔軟なアミノ酸（例えば、グリシン（Ｇ：Glysine）など）を介してもよい。リンカーペプチドの長さは短いことが好ましく、例えば５アミノ酸以下の短いアミノ酸配列であることが好ましい。このように、各要素間のリンカーペプチドの長さを最短に抑えることによって、リガンド応答性の良いプローブを設計できる。また、リガンド結合タンパク質と、酵素又は当該酵素と組み合わされて挿入される蛍光タンパク質と、を連結する第１リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列からなり、認識タンパク質と、酵素又は当該酵素と組み合わされて挿入される蛍光タンパク質と、を連結する第２リンカーは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列からなることが好ましく、これにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用による生じる分子テンションを効率よく酵素に伝達し、確実に酵素に構造的な変形を生じさせることができる。
【００５５】
ここで、本発明に係る発光プローブの一例を用いたリガンド認識メカニズムを模式的に図１に示す。本発明に係る発光プローブの一例は、図１に示すように、例えばリガンド結合タンパク質（Ａ）と認識タンパク質（Ｂ）との間に、発光酵素であるルシフェラーゼ（Luciferase）の全長が挿入されている。なお、全長とは、酵素活性に関与しない一部が欠損されているものであってもよい。そして、リガンドにより刺激されると、リガンドがリガンド結合タンパク質に結合し、この結合を認識タンパク質が認識することにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用する。リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用は、必然的にその間に存在する発光酵素に一定の構造的な変形（ストレイン）を引き起こし、この変形によって発光プローブからの酵素活性度が増加する。
【００５６】
また、本発明に係る発光プローブの他の例を用いたリガンド認識メカニズムを模式的に図２１に示す。本発明に係る発光プローブの他の例は、図２１に示すように、例えばリガンド結合タンパク質（Ａ）と認識タンパク質（Ｂ）との間に、発光酵素であるルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８）の全長と、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ：Enhanced Yellow Fluorescence Protein）とが挿入されている。ＥＹＦＰは、ＲＬｕｃ８のＮ末側に連結されている。リガンドがない条件では、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用せず、ＥＹＦＰとＲＬｕｃ８との間の生物発光共鳴エネルギー移動（bioluminescence resonance energy transfer；ＢＲＥＴ）は弱く、発光強度は弱い。一方、リガンドにより刺激されると、リガンドがリガンド結合タンパク質に結合し、この結合を認識タンパク質が認識することにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用する。リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用は、必然的にその間に存在する発光酵素及び蛍光タンパク質に一定の構造的な変形（ストレイン）を引き起こし、発光酵素と蛍光タンパク質との間の生物発光共鳴エネルギー移動が影響を受けることによって、発光プローブからの酵素活性度が増加する。
【００５７】
酵素活性度の増加は、リガンドの濃度、性質等に依存するため、この酵素活性度の増加、すなわち発光強度の増加を指標として、リガンドの性質、量等を測定することができる。以上のような原理でリガンドを検出するため、本発明に係る発光プローブを「ストレインプローブ（Strain probe）」と称することもある。
【００５８】
このように、発光プローブに挿入される発光酵素は、全長の発光酵素の両側に連結されたタンパク質同士の相互作用によって分子テンションが加わり、分子の構造的な変形（分子変形）が生じ、発光プローブからの酵素活性度を増加させるものであればよく、その種類、発光特性、分子量等は、特に限定されない。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８：Renilla luciferase 8）、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ：Gaussia luciferase）、ビートル（昆虫）ルシフェラーゼの一種であるクリックビートルルシフェラーゼ（ＣＢＬｕｃ：click beetle luciferase）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ：firefly luciferase）、ＲＬｕｃ、ＭｐＬｕｃ１（Metridia pacifica luciferase 1）、ＭｐＬｕｃ２（Metridia pacifica luciferase 2）、ＭＬｕｃ（Metridia longa luciferase）、ＯＬｕｃ（Oplophorus）、ＲＷＬｕｃ（Rail-road worm luciferase）等を含む海洋生物、昆虫、バクテリア由来のルシフェラーゼを、特に制限なく使用できる。これらの発光酵素のなかでも、ＲＬｕｃ８、ＧＬｕｃ、ＣＢＬｕｃ、ＦＬｕｃ等を好適に用いることができる。
【００５９】
これらの発光酵素は、アミノ酸配列や遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列が公知であり（例えば、ＦＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＢ０６２７８６等、ＣＢＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＹ２５８５９２．１等、ＧＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＹ０１５９９３等）、これらの配列情報に基づいて公知の方法によりＤＮＡを取得することができる。
【００６０】
ここで、ＲＬｕｃ８とＦＬｕｃとの構造を比較する。図２は、ＲＬｕｃ８の結晶構造を示す図であり、図３は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）の結晶構造を示す図である。なお、図２において、ＮはＮ末端を示し、ＣはＣ末端を示す。また、酵素活性部位を矢印部位（ａ）で示す。図２に示すように、ＲＬｕｃ８は、略球形状の１つのユニットからなり、堅い分子構造を有している。一方、図３に示すように、ＦＬｕｃは、２つのドメインによって構成されており、Ｎ末側ドメインとＣ末側ドメインとは柔軟性の高い親水性アミノ酸によって繋がっている。これらの構造の違いから、酵素を単独でリガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に挿入する場合には、ＦＬｕｃのような２ドメイン構造よりも、ＲＬｕｃ８のような構造を有する酵素の方が、分子末端からの分子テンションが酵素本体に効率よく伝わり、構造的な変形が起こりやすいため好ましい。
【００６１】
次に、ＲＬｕｃ８の酵素活性部位について考察する。図４は、ＲＬｕｃ８の酵素活性部位における各アミノ酸と基質との間の相互作用（結合）を示す図である（非特許文献１１）。なお、図４において、破線によって囲まれたアミノ酸は、酵素末端から近いアミノ酸である。ＲＬｕｃ８の酵素活性部位を構成するアミノ酸のうち、Ｈ２８５、Ｆ２８６、及びＦ２６１等は、Ｃ末端（Ｑ３１１）から近いため、特にＣ末端にかかる外部からの分子テンションにより直接影響を受けやすい。したがって、ＲＬｕｃ８は、外部からの分子テンションが酵素活性部位に効率よく伝わるため、変形により酵素活性が変化しやすい構造となっている。
【００６２】
このように、本発明に係る発光プローブに用いる酵素としては、酵素を単独でリガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に挿入する場合には、ＲＬｕｃ８のような、略球形状の１つのドメインからなり、酵素活性部位が末端に近いなど、変形しやすく、かつ変形により酵素活性が変化しやすいものが好ましい。
【００６３】
なお、本明細書中において「酵素が略球形状である」とは、酵素分子の立体構造が全体として略球形状をしていることを意味する。したがって、例えば酵素分子が２つのドメインによって構成されていても、酵素分子が全体として略球形状であれば、その酵素は略球形状である。なお、「略球形状」とは、完全な球形状との差異が比較的小さい形状であって、酵素分子の中心から酵素分子の表面上の任意の点までの距離が略一定である形状であればよい。
【００６４】
また、発光プローブに発光酵素と蛍光タンパク質とを組み合わせて挿入する場合には、発光酵素としては、上述したものを特に制限なく使用できる。発光酵素と組み合わされる蛍光タンパク質としては、当該発光酵素の活性によって発生した発光エネルギーを効率よく吸収できるものが望ましい。例えば、蛍光タンパク質は、その吸収スペクトルの全部又は一部が、発光酵素の発光スペクトルの全部又は一部と重なるものであることが望ましい。蛍光タンパク質としては、上述したＥＹＦＰの他に、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ，Ｋａｅｄｅ，Ｄｒｏｎｐａ等が挙げられる。
【００６５】
本発明に係る発光プローブとしては、リガンド結合タンパク質として、エストロゲン（女性ホルモン）受容体（ＥＲ：estrogen receptor）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ：ligand-binding domain）を用い、認識タンパク質としてキナーゼＳｒｃのリン酸化認識ドメイン（Ｓｒｃ ＳＨ２）を用い、発光酵素の全長としてＲＬｕｃ８を用いた発光プローブ（ＥＲＳ）であることが好ましい。ＥＲ ＬＢＤは、１７β−エストラジオール（estradiol）（Ｅ２）等のエストロゲン（estrogen）、エストロゲンアンタゴニスト（ＯＨＴ； 4-hydroxytamoxifen）等のリガンドに応答するものである。この発光プローブは、ＥＲ ＬＢＤをリン酸化するリガンドを検出するために用いることができる。
【００６６】
このように、最適な発光酵素を選択することによって、発光プローブの構造的変化による分子テンションが効率よく発光酵素に伝達され、さらに発光プローブの構造を単純化することができる。そして、発光プローブをこのように構成することによって、従来の酵素分割型に比べて発光プローブから格段に高い発光強度を維持しつつ、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用による発光量を顕著に増加させることができる。例えば、後述する実施例において示すように、発光プローブの発光酵素としてＲＬｕｃ８を用いた場合には、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用によって、これらが相互作用していないときに対して発光量を６５０％まで増加させることができる（図１０のｆｃｐを参照）。このように、本発明に係る発光プローブは、分子テンションによる酵素の変形、それに伴う酵素活性度の増加が生じるものであることが好ましい。
【００６７】
このように構成された発光プローブを用いたリガンド認識メカニズムを示す模式図を図５に示す。図５に示すように、ＥＲ ＬＢＤは、ＯＨＴ等のリガンドによる刺激に応じて構造変化（活性化）する。この構造変化の結果、ＥＲ ＬＢＤにおけるＹ５３７がリン酸化されると、ＳｒｃのＳＨ２ドメインがこのリン酸化部位を認識し、分子内相互作用によりＥＲ ＬＢＤとＳＨ２ドメインとが結合する。ＥＲ ＬＢＤ−ＳＨ２ドメイン間の結合は、ＲＬｕｃ８の構造的な変形を引き起こし、発光プローブの酵素活性度を増加させる。この酵素活性度の増加は、リガンドの濃度等に依存する。そのため、発光プローブからの発光強度の変化を指標に、リガンドの量を測定することができる。
【００６８】
また、例えばアンドロゲン受容体に対するリガンドを検出するためには、リガンド結合タンパク質としてＡＲ ＬＢＤを用い、認識タンパク質としてＬＸＸＬＬモチーフを用いることができる。
【００６９】
本発明に係る発光プローブにおいては、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを、同じ分子内の認識タンパク質が認識した場合に、酵素に構造的な変形が生じることによって、発光プローブの酵素活性度、すなわち発光量が、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合する前の状態における発光プローブからの発光量よりも増える。すなわち、リガンドが結合する前と後とで、発光プローブからの発光量が異なるものであればよく、その発光量の変化の要因としては、変形による酵素の量子収率（Quantum yield）の向上、酵素の変形による発光プローブの代謝回転率（Turn-over rate）の向上（安定性の向上）等が挙げられる。しかしながら、本発明に係る発光プローブによるリガンドの検出においては、発光プローブからの発光量の変化の要因に関わらず、発光プローブからの発光量の増加を指標とすればよいことは言うまでもない。
【００７０】
本発明に係る発光プローブは、各構成要素のポリペプチドを化学合成法等で得た後に、それぞれを連結して得てもよいが、各構成要素のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直鎖状に連結したポリヌクレオチド、すなわちキメラＤＮＡが挿入されたベクターを用いて細胞を形質転換し、形質転換した細胞内に発現させることによっても得られる。
【００７１】
ここで、キメラＤＮＡとは、由来の異なるいくつかのＤＮＡ断片が人工的に直鎖状に連結されたものであり、いくつかのポリペプチドを構成要素とする融合タンパク質を発現することのできるＤＮＡである。
【００７２】
本明細書中において、「生細胞」とは、生物における細胞（原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ヒトを含めた哺乳動物細胞等）のみならず、その本来の機能を維持した状態の培養細胞（原核細胞及び真核細胞）、生物個体内に移植、感染した細胞などを含み、特に実験動物、例えばマウス等の細胞である。また、生物の個体そのものをも含む概念である。
【００７３】
本明細書中において、融合タンパク質とは、由来の異なるいくつかのタンパク質又はポリペプチドが人工的に連結されたものであり得る。
【００７４】
本明細書中において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現され産生された組換えポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然の、又は組換えのポリペプチド及びタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００７５】
本発明に係る発光プローブにおいて、各構成要素のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
【００７６】
また、本発明に係る発光プローブ及び各構成要素のポリペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグ（配列番号７）、Ｍｙｃタグ（配列番号９）、Ｆｌａｇタグ（配列番号８）等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。本発明に係る融合タンパク質は、好ましい形態に改変され、組換え発現され得る。例えば、本発明に係る融合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に特定のアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域等を付加することによって、宿主細胞内、精製、精製に引き続く操作、及び保存等における安定性、持続性等を改善することができる。
【００７７】
一実施形態において、本発明に係る発光プローブは、配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質又はその変異体であることが好ましい。ここで、当該変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質であることが好ましい。
【００７８】
本明細書中においてポリペプチドまたはタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、本来のアミノ酸の少なくとも１つ以上がポイント変異、挿入、逆転、反復、欠損、タイプ置換されたポリペプチド又はタンパク質であって、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるポリペプチドまたはタンパク質が意図される。
【００７９】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、タイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）、及びポイント変異などを含む変異体が挙げられる。アミノ酸の置換には、例えば、ポリペプチドにおける中性アミノ酸を別の中性アミノ酸に置換する場合等が含まれる。
【００８０】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００８１】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００８２】
変異体としては、好ましくは保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、又は添加等の変異を有する変異体である。変異体が有する変異としては、好ましくは、サイレント置換、添加、及び欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係る発光プローブの発光活性を変化させない。
【００８３】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの中での１アミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの間の置換である。
【００８４】
他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００８５】
他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００８６】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が意図される。
【００８８】
また、他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００８９】
ＤＮＡ塩基配列の６６％以上が同一であれば、全く同様の活性を持つ融合タンパク質を作製できる根拠としては、サイレント変異を考えられる。遺伝子暗記票によれば、例えば、アミノ酸のバリン（Ｖａｌｉｎｅ）をコードする遺伝子は、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧのいずれでもよい。従って、最大３３％の遺伝子塩基が違っても全く同一の融合タンパク質プローブを作製できることから、数字の６６％が同一塩基配列か否かを判定する上で妥当な意味を持つ。
【００９０】
また、機能が解明されている多くのタンパク質は、自然変異体またはアイソフォームを持つ。本実施例にあげたＥＲでさえ、自然界にはＥＲαとＥＲβとが存在しており、女性ホルモンに対して同様のセンシング能をもつことが知られている（非特許文献１０）。ところが、そのアミノ酸間の相同性はわずか３０％（Ｎ-末側領域；ＮＴＤ）、５３％（リガンド結合領域；ＬＢＤ）に過ぎない点を考慮すべきである。
【００９１】
さらに、本実施例において用いたＥＲと同じ核受容体であるグルココルチコイド（ＧＲ）では、ＧＲαＡ、ＧＲβＡ、ＧＲα２、ＧＲβ２、ＧＲＡα、ＧＲＡβ、ＧＲ−Ｐ、ＧＲ−βＢなどのイソフォームが存在し、それぞれ同じＧＲ類として生体内で機能している（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０４１５０）点を考慮しなければならない。
【００９２】
例えば、「本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも６６％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」である対象塩基配列は、当該参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり３３個までの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得るが、参照塩基配列と同じ表現型（アミノ酸配列）のタンパク質をコードする配列である。参照塩基配列に少なくとも６６％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、例えば参照配列における塩基の３３％までが、欠失されていてもよく、又は別の塩基で置換されていてもよい。また、参照塩基配列における全塩基の３３％までにあたる数の塩基が、参照塩基配列に挿入されていてもよい。対象塩基配列における、参照塩基配列とは不一致な塩基は、対象塩基配列の５’もしくは３’末端位置、又はそれ以外の塩基配列中において、個々に、又は１以上の隣接した群において分散されていてよく、また、対象塩基配列中のどこにあってもよい。
【００９３】
本発明はまた、本発明に係る発光プローブをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るポリヌクレオチドは、生細胞内外において、本発明に係る発光プローブを発現可能なポリヌクレオチドである。本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、リガンド結合タンパク質、発光酵素の全長、及び認識タンパク質が直鎖状に配列した融合タンパク質となるように、それぞれをコードするｃＤＮＡを直鎖状に連結して作製されたキメラＤＮＡである。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）もしくはリボヌクレオチド（Ｃ、Ａ、Ｇ及びＵ）の配列として示される。また、「配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」とは、配列番号４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び／又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分が意図される。
【００９５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００９６】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその変異体であることが好ましい。
【００９７】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質をコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれかであることが好ましい：配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００９８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列又はベクター配列（発現用ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００９９】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒトまたはマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプル又は細胞サンプル）が意図される。
【０１００】
本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、発現用ベクター等にサブクローンして、発光プローブを発現させるためのベクター（プラスミド）を作製し、これを細胞内に導入することによって、当該ポリヌクレオチドがコードする発光プローブを細胞内に発現させることができる。なお、本発明に係るポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする領域の上流に、細胞内において発光プローブを発現させるためのプロモーター配列等が組み込まれたものであってもよい。
【０１０１】
本発明に係る融合タンパク質又はポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、細胞内外における分子の可視化イメージングのための発光プローブとして使用され得る。より具体的には、本発明に係る融合タンパク質は一本鎖の融合ポリペプチドとして構成され、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合すると、その立体構造が変化し、リガンド結合タンパク質が認識タンパク質によって認識される。その結果、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用すると、これによってリガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に位置する全長の発光酵素、又は連結された全長の発光酵素及び蛍光タンパク質、が変形し、発光量を増加させる。このように、本発明に係る融合タンパク質によれば、発光量の変化に基づいて、細胞内外における分子の動き、信号伝達等を可視化検出することができる。
【０１０２】
したがって、本発明に係る融合タンパク質を用いれば、標的特異的なリガンドの生理活性、濃度等を高精度に検出することが可能であり、例えば発癌物質のような生体内危険因子のスクリーニング、薬学分野における新薬候補物質のスクリーニング、抗癌剤の薬理作用の定量評価（新薬の開発）、環境汚染・毒性物質の判定、診断用のキット、新型万能細胞（ｉＰＳ）における分化・生理作用の測定などに有用である。
【０１０３】
つまり、本発明の目的は、発光プローブ及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した融合タンパク質作製方法及びポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得される発光プローブ及びこれをコードするポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０４】
〔２．ベクター〕
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を生物又は細胞内で発現させるベクターを提供する。本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入し、当該生物又は細胞内において本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。
【０１０５】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクター等が挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミド等を用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１０６】
発現用ベクターの具体的な種類は特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクター等が適宜選択され得る。例えば、公知の真核又は原核細胞用のベクター等を使用することができる。また、ある臓器に特異的に宿る既知のベクターを使うことによって、特定臓器に選択的に本発明に係る融合タンパク質を発現させることもできる。
【０１０７】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を制御するために（例えば、生物個体における特定組織での発現）、公知の組織特異的プロモーター配列を組み込むようにしてもよい。また、特定のリガンド、刺激物等の有無によって、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を制御するために、公知の特定刺激特異的プロモーター配列を組み込むようにしてもよい。
【０１０８】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを、例えばｐＭＸなどのレトロウイルスベクターにつなげたものであってもよい。これを高力価のウイルス産生能を有するパッケイジング細胞ＰＬＡＴＥに導入することによって、動物に感染するレトロウイルスの作成が可能である。このウイルスを動物の各臓器に感染させることによって、各臓器内におけるセカンドメッセンジャー特性のリアルタイムイメージングができる。
【０１０９】
すなわち、本発明に係るベクターは、確実に本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質を発現させるために、適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドとを各種プラスミド等に組み込んだものであってもよい。
【０１１０】
本発明に係るベクターは、例えばマイクロインジェクション法、エレクトロポーレーション法、脂質試薬によるトランスフェクション法（例えばＴｒａｎｓＩＴ、Ｍｉｒｕｓ社製）等の公知の方法により宿主内に導入することができる。上記の宿主は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞、生物個体等を好適に用いることができる。
【０１１１】
なお、目的とする本発明に係る融合タンパク質が常に合成される場合に限定されず、ＩＰＴＧを添加することにより、合成が誘導されるものであってもよい。また、ベクターには、合成されるタンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ、ＨＡタグ（配列番号１０）、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇ等のタグ配列を付加する配列を含むものであってもよい。
【０１１２】
また、本発明に係るベクターは、例えば、融合タンパク質を発現させる目的ではなく、融合タンパク質をコードする配列の上流に発現制御をし得る制御配列を繋げることによって、融合タンパク質の発現の有無を指標としてさらなる生物分析のために利用することができる。
【０１１３】
本発明に係るベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、又はネオマイシン、ゼオシン、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢ等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、大腸菌及び他の細菌における培養については、カナマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン又はアンピシリン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【０１１４】
本発明に係るベクターを用いれば、生物又は細胞に導入することにより、当該生物又は細胞中に本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。また、本発明に係るベクターを導入した細胞から融合タンパク質を抽出して、精製し又は未精製のままで（非細胞系）、診断キットのセンサー成分として使用できる。例えば、生体試料内の各種生理物質の一例としてステロイドホルモン又は化学物質を測定することによって、各リガンドの生理活性を迅速に測定することができる。
【０１１５】
さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、本発明に係る融合タンパク質を合成することができる。
【０１１６】
なお、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよい。すなわち、発現用ベクター以外のベクターも本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１１７】
〔３．形質転換体〕
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を発現させ得る形質転換体を提供する。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいることを特徴としている。本明細書中において、「形質転換体」は、細胞、組織又は器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいる限り、特に限定されるものではない。
【０１１８】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、本発明に係る融合タンパク質が発現され得るように生物又は細胞中に導入することによって得られる。なお、組換えベクターを導入する宿主生物及び細胞としては、特に限定されないが、例えばＣＯＳ−７、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、ＣＨＯのような真核培養細胞、体細胞由来の新型万能細胞（ｉＰＳ）、原核細胞、植物細胞、高等動物等を用いることができる。
【０１１９】
本発明に係るポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入する方法、すなわち形質転換方法は特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主のゲノムに組み込まれていない状態で一過性に発現する、一過性形質転換体であってもよく、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主のゲノムに組み込まれ安定的に発現し続ける、安定形質転換体であってもよい。
【０１２０】
本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係る融合タンパク質を発現させることができるため、本発明に係る形質転換体をリガンドで刺激し、当該形質転換体からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、濃度、活性の程度等を評価することができる。
【０１２１】
〔４．標的物質検出方法及びキット〕
本発明は、さらに、被験試料中の標的物質を検出する標的物質検出方法及びキットを提供する。標的物質をリガンドと称する場合、標的物質検出方法及びキットを、リガンド検出方法及びキットと称する。本発明に係る標的物質検出方法は、被験試料と、本発明に係る融合タンパク質とを共存させる工程を包含することを特徴としている。本方法においては、被験試料と接触させる融合タンパク質に含まれる酵素の基質を、適宜接触させてもよい。これにより、本発明に係る融合タンパク質からの発光量を指標に、被験試料中の標的物質を検出する。本明細書中において、「被験試料」は、リガンドそのものであってもよく、リガンドを含む生体試料等であってもよい。また、被験試料は、本発明に係る融合タンパク質が発現した細胞において二次的に生産された細胞内物質であることもできる。
【０１２２】
上記工程において、被験試料の存在下及び非存在下において、本発明に係る融合タンパク質からの発光量が増加した場合、当該被験試料中において、本発明に係る融合タンパク質のリガンド結合タンパク質に結合するリガンドを検出することができる。本発明に係るリガンド検出方法によれば、後述する実施例に示すように、リガンドの性質、リガンドの活性の程度、リガンドの濃度等を分析することが可能である。
【０１２３】
本発明に係る標的物質検出方法によれば、既知のアゴニストに対する未知のアンタゴニストを検出することもできる。例えば、本発明に係る融合タンパク質に候補物質を含む被験試料を接触させ、ついで既知のアゴニストを接触させて、本発明に係る融合タンパク質からの発光量を測定する。被験試料中の候補物質がアンタゴニスト作用を有するものであれば、一次結合タンパク質のアゴニスト結合部位は候補物質によって占有されているので、その後に導入されたアゴニストは一次結合タンパク質に結合することはできない。
【０１２４】
このとき、アンタゴニストの結合によっては立体構造が増加しない一次結合タンパク質を用いていれば、アンタゴニストの結合により融合タンパク質からの発光量は増加しないため、アゴニスト単独で導入した場合に比して発光量は低い。一方、アゴニストの結合によっては立体構造が変化しない一次結合タンパク質を用いていれば、同様に既知のアンタゴニストを用いて、未知のアゴニストを検出することもできる。
【０１２５】
本発明に係る標的物質検出方法においては、典型的には、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換した生細胞と、被験試料とを接触させて刺激し、刺激前後における本発明に係る融合タンパク質からの発光量の増加を測定する。本発明に係る融合タンパク質と被験試料とを接触させる方法は、特に限定されないが、例えば本発明に係る融合タンパク質が発現した生細胞の培養培地に被験試料を添加し、エンドサイトーシス作用によって被験試料を細胞内に取り込ませて接触させてもよい。また、被験試料が細胞内物質の場合には、本発明に係る融合タンパク質を当該細胞内において発現させることによって、接触させてもよい。また、生細胞がない状態であっても、例えば培地中に分泌した本発明に係る融合タンパク質を含む培養液、又は精製した本発明に係る融合タンパク質を用いれば、各発光酵素の基質を同時に存在させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定も可能である。
【０１２６】
本発明に係る標的物質検出方法において、生細胞中に発現させた発光プローブを用いる場合、以下の方法を適用できるが、この方法に限定されない。
（ｉ）本発明に係る発光プローブをコードするポリヌクレオチドを有するプラスミドを、２４穴プレート上の生細胞に導入し、さらに１６時間培養する。
（ｉｉ）上記細胞を被験試料で２０分間刺激する。
（ｉｉｉ）基質共存下で、上記細胞における発光量の変化を発光度計で測定する。
【０１２７】
本発明に係る標的物質検出方法において、本発明に係る発光プローブを用いた非細胞系実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を行った場合、以下の方法を適用できるが、この方法に限定されない。
（ｉ）公知の方法により精製した発光プローブを、直径１．２センチの十字架型紙片の末端に垂らして乾燥させる。
（ｉｉ）上記十字架型紙片のもう一方の末端に刺激物質（リガンド）を含む基質溶液を点滴し、即時に発光Ｓｃａｎｎｅｒ（例えば、ＲＡＳ−３０００；ＦｕｊｉＦｉｌｍ）で発光量の変化を測定する。
【０１２８】
本発明に係る標的物質を検出するための標的物質検出キットは、本発明に係る融合タンパク質を備えていることを特徴としている。また、本キットは、本発明に係る融合タンパク質に含まれる発光酵素の基質を、さらに備えていてもよい。
【０１２９】
ここで、本キットが備える本発明に係る融合タンパク質は、真核細胞内及び原核細胞内において大量発現させた後に精製することが可能である。例えば哺乳動物細胞を用いた場合、従来公知の適切なシグナル配列（例えば、ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ等）を繋いで培地中に大量に分泌させることによって、精製工程なしでも分析に用いることが可能な、大量の融合タンパク質含有培養上清が得られる。また、さらに精製用のタグ（例えば、Ｈｉｓ Ｔａｇ）をつけることで、容易に融合タンパク質を大量精製することができる。
【０１３０】
このようにして得られた融合タンパク質を備えたキットと同様に、本発明に係る融合タンパク質を発現している形質転換体を備えたキットも、被験試料中の標的物質の検出に用いられ得る。また、例えば精製した発光プローブを備える紙ストリップと、発光酵素の基質とを組み合わせたキットは、発光プローブを発現している形質転換体を備えたキットと同様に、外部刺激及びそれによる二次現象であるセカンドメッセンジャーの定性定量分析が可能なキット構成とすることができる。また、本発明に係るポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドにより形質転換される細胞とを備えたキット、及び本発明に係るベクターと当該ベクターにより形質転換される細胞とを備えたキットも、同様に被験試料中の標的物質の検出に用いられ得る。
【０１３１】
〔５．プローブ生産方法及びキット〕
本発明は、さらに、本発明に係るプローブの生産方法及びキットを提供する。本発明に係るプローブの生産方法は、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本方法においては、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換し、本発明に係るプローブを細胞中に発現させることによって、本発明に係るプローブを生産する。細胞中に発現させたプローブは、公知の方法により細胞中から回収し、精製することができる。
【０１３２】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチド又はベクターを用いて細胞を形質転換し、培養した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、本発明に係るプローブを回収、精製することができる。また、細胞中で発現させたポリヌクレオチドに精製用のタグが付加されている場合には、より容易に回収することができる。
【０１３３】
本発明に係るプローブの生産キットは、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを備えていることを特徴としている。また、本キットは、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターにより形質転換される細胞を、さらに供えていてもよい。さらに、本発明に係る融合タンパク質に含まれる酵素の基質を備えていてもよい。また、本発明に係るプローブの生産キットは、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを備えていてもよい。
【０１３４】
本発明では、従来の方法における問題点を克服すべく、酵素の全長を用いる、新規の一分子型プローブとして用いられる融合タンパク質を提供する。例えば、酵素として発光酵素を用いる、新規な生物発光による可視化手段を提供する。また、本発明の手法は、生物発光酵素を用いる基礎原理をも提供している。
【０１３５】
本発明は、酵素にかかる分子の捩れ現象を指標としたユニークな生物分析法を用いるものである。本発明は、酵素の全長を用いるので、酵素として発光酵素を用いた場合には、高輝度の生物発光イメージングが可能である。また、本発明に係る融合タンパク質は、分解、ミスフォールディングなどが起こりにくいので安定性が高い。また、１つの分子内タンパク質間相互作用を指標とするため、非細胞系における生物分析にも適用できる。従って、本発明に係る融合タンパク質は、高精度で安定性の高い分析手段を提供するものであり、かつ、細胞・非細胞系ともに適用できる、簡便な手法を提供するものである。本発明における分析原理は、新薬候補物質のスクリーニング、毒性物質及び環境汚染物質の評価などに広く適用できる。
【０１３６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１３７】
なお、本明細書における用語は、基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人 (1986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992)；R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987) などの参考文献に記載の方法、上記文献に引用された文献に記載の方法、またはこれらと実質的に同一の方法、もしくはその改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質、ペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース（ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）から入手することができる。
【実施例】
【０１３８】
〔実施例１：発光酵素を挿入したストレインプローブの設計〕
まず、ＲＬｕｃ８（１−２３４アミノ酸）、ＧＬｕｃ（１７−１８５アミノ酸）、ＣＢＬｕｃ（１−５１５アミノ酸）、及びＦＬｕｃ（１−５５０アミノ酸）をそれぞれコードするｃＤＮＡに対して、そのＮ末側にＥＲ ＬＢＤのｃＤＮＡを連結し、そのＣ末側にＳｒｃのＳＨ２ドメインのｃＤＮＡを連結して、これらのｃＤＮＡを直鎖状に連結したキメラＤＮＡコンストラクトを作製した（配列番号４〜６、１５）。作製したコンストラクトを、ｐｃＤＮＡ ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンした。
【０１３９】
図６は、ストレインプローブを作製するためのプラスミド構成の一例を示す図である。なお、図６には、ＲＬｕｃ８を挿入したストレインプローブ（ＥＲＳプローブ）を発現させるためのプラスミド（ｐＥＲＳ）のみのＤＮＡコンストラクト構成を示すが、ＧＬｕｃを挿入したストレインプローブ（ＥＧＳプローブ）を発現させるプラスミド（ｐＥＧＳ）、ＣＢＬｕｃを挿入したストレインプローブ（ＥＣＳプローブ）を発現させるプラスミド（ｐＥＣＳ）又はＦＬｕｃを挿入したストレインプローブ（ＥＦＳプローブ）を発現させるプラスミド（ｐＥＦＳ）についてもこれと同様に構成した。
【０１４０】
次に、これらのプラスミドをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）に形質転換した。具体的には、ＣＯＳ−７細胞を、１０％ステロイドフリーウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ製）を含む２４ウエルプレートにおいて、ｃｅｌｌインキュベータ（Ｓａｎｙｏ製）中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。導入試薬としてＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ製）を用いて、ＣＯＳ−７細胞に、ｐＥＲＳ、ｐＥＧＳ、ｐＥＣＳ及びｐＥＦＳ（各ウエル当り０．２μｇ）を一過性形質転換した。形質転換した細胞を、５％ＣＯ２存在下で１６時間インキュベートした。
【０１４１】
得られた形質転換体を用いて、リガンドとして用いた４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の存在下・非存在下それぞれにおける発光強度を観察した。
【０１４２】
まず、作製したｐＥＲＳ、ｐＥＧＳ、ｐＥＣＳ又はｐＥＦＳが導入されたＣＯＳ−７細胞を、ＯＨＴ １０−６Ｍ（終濃度）存在下又は非存在下で２０分間刺激した後、基質としてセレンテラジン又はＤ−ルシフェリン（Ｄ−luciferin）を用いて発光強度を測定した。
【０１４３】
発光強度の測定を以下のとおり行った。ｐＥＲＳが導入されたＣＯＳ−７細胞について、刺激後の細胞を、基質を含む２００μＬの細胞溶解バッファに溶解し、全溶解物を石英セル（４５×１２．５×７．５ｍｍ）に移した。分光光度計（ＦＰ−７５０；Ｊａｓｃｏ社）を用いて、４００ｎｍから７００ｎｍの範囲の発光を測定した（ｎ＝２）。また、ｐＥＲＳ、ｐＥＧＳ、ｐＥＣＳ又はｐＥＦＳが導入されたＣＯＳ−７細胞について、発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ ＬＢ９５０６）を用いて発光強度を測定した。結果を図７及び８に示す。
【０１４４】
図７は、ｐＥＲＳが導入された形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。図７に示すように、ＲＬｕｃ８を挿入したＥＲＳプローブにおいて、ＯＨＴ刺激依存的に発光強度が大幅に増加することが示された。また、発光スペクトルは、４７５ｎｍ近傍において最高値を示した。
【０１４５】
また、図８は、各ストレインプローブをそれぞれ発現する形質転換体の、バックグラウンド（−ＯＨＴ）を１としたときの発光強度の割合を示すグラフである。図８に示すように、それぞれのストレインプローブにおいて、ＯＨＴ刺激依存的に発光強度が増加することが示された。このように、ＯＨＴ刺激によってストレインプローブからの発光強度が大きくなったという結果から、外部刺激を受けることによって、ストレインプローブ自身の代謝回転率が改善される、又はストレインプローブの量子収率が改善されることが示唆された。
【０１４６】
また、図８に示すように、ＲＬｕｃ８を挿入したＥＲＳプローブにおいて、他の発光酵素を挿入したストレインプローブと比較して特に発光強度が大きく増加した。この結果から、外部刺激によるストレインプローブの発光量の変化が、挿入した発光酵素の分子構造に強く依存することが示唆された。すなわち、挿入した発光酵素が、外部からの分子テンションが加わることにより酵素活性部位の構造が変形しやすい分子構造であるか否かが、ストレインプローブの発光量の変化に影響を及ぼすことが示唆された。上述したように、ＲＬｕｃ８は、略球形状であるため、外部からの分子テンションが酵素活性部位に効率よく伝わり、その構造が変形しやすい（ストレインがかかりやすい）構造となっている。したがって、他の発光酵素と比較して、外部刺激による発光強度の増加量が多い結果が得られたと言える。また、ＧＬｕｃは、他の発光酵素に比べて分子量（１８―１８５アミノ酸；１８ｋＤ）が非常に小さいため、外部からの分子テンションが酵素本体に伝わりにくく、その活性部位の構造が変形しにくいため、ＲＬｕｃ８と比較して外部刺激による発光強度の増加量が少ない結果となったと言える。
【０１４７】
また、ＥＲＳプローブを発現する形質転換体からの発光強度は、非常に高かった。これは、ＥＲＳプローブが、ＲＬｕｃ８の全長をそのまま含んでいるためであると言える。
【０１４８】
このように、本発明に係るストレインプローブを用いれば、様々なタンパク質―タンパク質間の相互作用を高感度、かつ高い発光強度で測定できることが示された。
【０１４９】
〔実施例２：ストレインプローブの基質選択性〕
次に、ＥＲＳプローブにおける発光酵素ＲＬｕｃ８の基質選択性について調べた。ＣＯＳ−７細胞を１２穴プレートにおいて十分に培養した後、脂質試薬を用いてｐＥＲＳをＣＯＳ−７細胞に導入し、さらに１６時間培養した。その後、この細胞を溶媒又はＯＨＴ１０−６Ｍ（終濃度）により２０分間刺激し、種々の基質の共存下又は非存在下（バックグラウンド）における発光強度を実施例１と同様に、分光光度計（ＦＰ−７５０；Ｊａｓｃｏ社）を用いて測定した。基質として、図９に示すセレンテラジン（coelenterazine）（ｃｏｅｌｅ）、セレンテラジンｃｐ（ｃｐ）、セレンテラジンｈｃｐ（ｈｃｐ）、セレンテラジンｆｃｐ（ｆｃｐ）、セレンテラジンｉｐ（ｉｐ）、及びセレンテラジン４００Ａ（４００Ａ）を用いた。なお、図９において、重要なサイドチェーンにあたる部位を破線によって囲んで示した。結果を図１０及び１１に示す。
【０１５０】
図１０は、種々の基質共存下における、ｐＥＲＳを導入したＣＯＳ７細胞の発光スペクトルを示すグラフである。また、図１１は、種々の基質共存下におけるｐＥＲＳを導入したＣＯＳ７細胞の、バックグラウンドを１としたときの発光スペクトルのピーク強度の割合を示すグラフである。図１０及び図１１に示すように、いずれの基質を用いた場合であっても発光強度はＯＨＴ依存的に増加したが、基質の種類によって、その増加率が異なっていた。発光強度は、セレンテラジンを用いた場合が最も高かった（図示せず）。一方、バックグラウンドに対するシグナル比率は、セレンテラジンｆｃｐを用いた場合が最も大きかった。
【０１５１】
この結果から、実験の目的に応じて基質を使い分けることができることが示唆された。また、各セレンテラジンのサイドチェーンを比較することによって、本発明のストレインプローブの基質における＾重要なサイドチェーンを同定し得ることが示唆された。
【０１５２】
また、ＲＬｕｃ８を単独で用いた場合、又はＥＲＳを用いた場合の発光強度を、同様の方法を用いて測定した。ＲＬｕｃ８の全長をコードするｃＤＮＡのみをｐｃＤＮＡ ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンしてプラスミドを構築し、当該プラスミドをＣＯＳ−７細胞に形質転換することによって、ＲＬｕｃ８を単独で発現した形質転換体を得た。結果を図１２に示す。
【０１５３】
図１２は、ＲＬｕｃ８を単独で発現した形質転換体、又はＥＲＳを発現した形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。図１２に示すように、セレンテラジンｆｃｐ共存下において、ＲＬｕｃ８を単独で発現した形質転換体においては、ＯＨＴ依存的な発光スペクトルの変化が見られなかったが、ＥＲＳを発現した形質転換体では、ＯＨＴ依存的な発光スペクトルの変化が見られた。
【０１５４】
〔実施例３：ＥＲＳのリガンド依存性、検出限界及びリガンド選択性〕
まず、ＥＲＳのリガンド依存性及び検出限界について調べた。１２穴プレートにおいて培養したＣＯＳ−７細胞に、ｐＥＲＳを導入（トランスフェクト）した後、さらに１６時間培養した。その後、この細胞を種々の濃度のＯＨＴ又はテストステロン（Ｔ：testosterone）により２０分間刺激し、次いでライセート試薬を１５分間導入することによってライセートを作製した。作製したライセートについて、基質としてセレンテラジンの共存下において、発光強度の変化を発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ ＬＢ９５０６）を用いて測定した。結果を図１３に示す。
【０１５５】
図１３は、ＥＲＳを発現した形質転換体におけるリガンド応答曲線を示す図である。図１３に示すように、ＥＲＳを発現した形質転換体における発光強度は、濃度約１０−１０のＯＨＴ刺激によって増加しはじめ、濃度１０−７近傍において最高値に達した。一方、テストステロンの刺激に対しては、発光強度の増加による応答は見られなかった。これにより、ＥＲＳは、ＯＨＴに特異的に応答することが示された。
【０１５６】
次に、ＥＲＳに及ぼすＥＲ ＬＢＤのリン酸化の影響、及び発光強度の変化に及ぼすＥＲＳの一分子型構造変化の影響を調べた。ＥＲ ＬＢＤのリン酸化部位であるＹ５３７に変異を導入した、ＥｍＲＳプローブを発現するプラスミドを構築し、これをＣＯＳ−７細胞に導入した形質転換体を得た。また、図１５に示すように、ＲＬｕｃ８のＮ末側にＥＲ ＬＢＤのみをつなげたプローブ（ＥＲプローブ）を発現させるためのＤＮＡコンストラクト構成を有するプラスミド（ｐＥＲ）、ＲＬｕｃ８のＣ末側にＳＨ２ドメインのみをつなげたプローブ（ＲＳプローブ）を発現させるためのＤＮＡコンストラクト構成を有するプラスミド（ｐＲＳ）をそれぞれ構築した。そして、構築したｐＥＲ及びｐＲＳを同時にＣＯＳ−７細胞に導入した形質転換体（ＥＲ＋ＲＳ）を得た。
【０１５７】
得られた形質転換体をＯＨＴ又は０．ｌ％ＤＭＳＯ（コントロール）によって刺激し、その発光強度を上記と同様の方法により測定し、比較した。結果を図１４に示す。図１４は、ＥＲＳ、ＥｍＲＳ、並びにＥＲ及びＲＳをそれぞれ発現した形質転換体の、コントロールを１としたときの相対発光強度を示すグラフである。
【０１５８】
図１４に示すように、ＥＲＳを発現した形質転換体は、ＯＨＴ刺激に対して、コントロールと比較して約３倍の発光強度を示した。一方、ＥｍＲＳを発現した形質転換体は、ＯＨＴ刺激に対する発光強度の増加は、コントロールと比較して約１．７倍であった。これにより、リン酸化部位を変異したＥｍＲＳにおいては、外部刺激によるＥＲ ＬＢＤとＳＨ２ドメインとの相互作用が生じにくく、外部刺激に依存した発光量の変化が見られにくいことが示唆された。
【０１５９】
また、ＥＲ及びＲＳを共発現する形質転換体（ＥＲ＋ＲＳ）においては、ＯＨＴ刺激に対して発光強度の増加が認められなかった。ここで、図１６に、ＥＲ及びＲＳの構造を模式的に示す。図５に示すＥＲＳとを比較して、図１６に示すＥＲ及びＲＳが共発現する形質転換体（ＥＲ＋ＲＳ）においては、ＯＨＴの刺激によりＳＨ２ドメインとＥＲ ＬＢＤとが相互作用したとしても、ＲＬｕｃ８に外部からの分子テンションが加わらない。したがって、ＲＬｕｃ８に変形、すなわち捩れが生じないので、その酵素活性部位が変形せず、発光強度が増加しなかった。
【０１６０】
次に、ＥＲＳにおけるリガンド選択性を調べた。図１７に示す、ＯＨＴ、Ｅ２（１７β−エストラディオール）、及びパーシャルアゴニスト（partial agonist）であるゲニステイン（Genistein）、ならびにデヒドロテストステロン（ＤＨＴ：5α-dihydrotestosterone）、テストステロン（Ｔ）、及びコルチゾール（cortisol）を、リガンドとして用いた。濃度１０−６Ｍの各リガンドを用いて、ＥＲＳを発現した形質転換体を刺激した後、上記と同様の方法により発光強度を測定し、リガンドの代わりに溶媒を用いた場合（vehicle）の発光強度と比較した。結果を図１８に示す。
【０１６１】
図１８は、ＥＲＳを発現した形質転換体の、種々のリガンド応答による発光強度を示すグラフである。ＥＲＳを発現した形質転換体は、ＯＨＴ及びＥ２に対してほぼ同等の発光強度の増加を示した。また、ゲニステインに対して、ＯＨＴ及びＥ２よりは低いが、発光強度の増加を示した。一方、ＤＨＴ、テストステロン、及びコルチゾールに対しては、発光強度の増加を示さなかった。
【０１６２】
この結果から、ＥＲＳが女性ホルモン受容体に特異的なリガンド感受性を有することが示された。また、ＥＲＳがリガンドに対して感度よく応答できることが示された。
【０１６３】
〔実施例４：発光酵素と蛍光タンパク質とを組み合わせて挿入したストレインプローブの設計〕
まず、蛍光タンパク質ＥＹＦＰをコードするｃＤＮＡを、ＲＬｕｃ８（１−２３４アミノ酸）をコードするｃＤＮＡのＮ末側に連結した。連結したｃＤＮＡに対して、そのＮ末側にさらにＥＲ ＬＢＤのｃＤＮＡを連結し、そのＣ末側にＳｒｃ ＳＨ２ドメインのｃＤＮＡを連結して、このｃＤＮＡを直鎖状に連結したキメラＤＮＡコンストラクトを作製した（配列番号１６）。作製したコンストラクトを、ｐｃＤＮＡ ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンした。
【０１６４】
図１９は、ストレインプローブを作製するためのプラスミド構成の一例を示す図である。図１９には、ＥＹＦＰのＣ末側にＲＬｕｃ８を連結したものを挿入したストレインプローブ（ＥＥＲＳプローブ）を発現させるためのプラスミド（ｐＥＥＲＳ）のＤＮＡコンストラクト構成を示す。
【０１６５】
次に、実施例１に示した方法と同様の方法を用いて、このプラスミドをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）に形質転換し、得られた形質転換体を用いて、ＯＨＴの存在下・非存在下それぞれにおける発光強度を測定した。結果を図２０に示す。
【０１６６】
図２０は、ｐＥＥＲＳが導入された形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。図２０に示すように、ＥＹＦＰ及びＲＬｕｃ８を挿入したＥＥＲＳプローブにおいて、ＯＨＴ刺激依存的に発光強度が増加することが示された。
【０１６７】
この結果から、以下のことが示された。図２１に示すように、リガンド（ＯＨＴ）がない条件では、リガンド結合タンパク質（ＥＲ ＬＢＤ）と認識タンパク質（Ｓｒｃ ＳＨ２）とが相互作用せず、ＥＹＦＰとＲＬｕｃ８との間の生物発光共鳴エネルギー移動が弱いため、発光強度は弱かった。一方、リガンドにより刺激されると、リガンドがリガンド結合タンパク質に結合し、この結合を認識タンパク質が認識することにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用する。リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用は、必然的にその間に存在する発光酵素（ＲＬｕｃ８）及び蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）に一定の構造的な変形（ストレイン）を引き起こし、発光酵素と蛍光タンパク質との間の生物発光共鳴エネルギー移動が影響を受けることによって、発光プローブからの酵素活性度、すなわち発光総量が増加した。すなわち、ＥＥＲＳプローブは、その内部において発光共鳴エネルギー移動を起こすものであることが示された。
【０１６８】
したがって、本発明に係る発光プローブは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に、酵素を含む２つのタンパク質分子を挿入した場合においても、リガンド依存的な酵素活性度の変化が起こり得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明に係る融合タンパク質は、発光強度が高く、設計が容易であるので、バイオ産業、医薬品産業、食品産業等の広範な分野に応用することができる。特に、診断医療分野、ナノバイオ分野、薬理作用評価分野、環境分析分野等において、好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料中の標的物質を検出する融合タンパク質及びその利用に関し、より具体的には、被験試料中の標的物質を検出する一分子型プローブとして用いられる融合タンパク質及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の変形、タンパク質分子間の結合などに基づく生命現象として、例えば、ホルモン刺激により構造変化を経て活性化状態となり、二量体となる核受容体（ＮＲ：nuclear receptor）が挙げられる。そして、二量体化した核受容体は、核内に移行し、核内の核受容体応答配列（ＮＲＥ：nuclear receptor response element）に結合して、転写活性を引き起こす（非特許文献１）。
【０００３】
また、細胞は、細胞外部からの成長ホルモン（growth factor）刺激に対して、特異的な受容体（growth factor receptor）を介して応答し、一連のタンパク質リン酸化の媒介によって細胞内部に信号を伝達する（非特許文献２）。さらに、細胞は、細胞内部のコレステロール濃度の変化をモニタリングするシステムを有している。その一例として、細胞は、コレステロール濃度を調節するタンパク質（ＳＲＥＢＰ−２：Sterol-response element binding protein-2）を保有している。細胞内のコレステロール濃度が一定以下に低下した場合、細胞はそれを感知し、ＳＲＥＢＰ−２が分割される。そして、２分割されたＳＲＥＢＰ−２の断片の一部が二量体化して核内移行し、核内でステロール応答配列（ＳＲＥ：Sterol-response element）に結合することによって、一連のコレステロール調節因子を発現させる（非特許文献３）。
【０００４】
この様な細胞内分子現象は、生体が生命活動の恒常性を維持しつつ、外部の環境変化に素早く応答するための機構である。これらの信号伝達を担うタンパク質は、細胞が外部刺激に素早く反応し、対処する上で極めて重要な役割を果たしている。
【０００５】
細胞内分子現象を測定するためのいくつかの方法が開示されている。例えば、タンパク質―タンパク質間相互作用、タンパク質の立体構造の変化、タンパク質のリン酸化等を測定する手法が知られている。タンパク質―タンパク質間の相互作用を検出する方法として、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）法及びＢＲＥＴ（bioluminescence resonance energy transfer）法が広く使用されている（非特許文献４及び５）。
【０００６】
また、本発明者らは以前に、一分子型及び二分子型生物発光プローブを提案している（非特許文献６及び７ならびに特許文献１〜３）。これらの生物発光プローブは、発光酵素を２分割し、それらの間に１つ又は２つのタンパク質を挿入した形態の生物発光可視化プローブである。一分子型生物発光プローブの一例として、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）由来の発光酵素を２分割し、カルシウム認識タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ：calmodulin）をその間に挿入したものが挙げられる。この一分子型生物発光プローブを真核細胞に導入した場合、Ｃａ２＋の濃度に依存した生物発光の変化を観察できる（非特許文献８及び特許文献３）。
【０００７】
さらに、本発明者らは以前に、円順列置換した発光酵素用いた生物発光プローブを提案している（非特許文献９）。この生物発光プローブにおいて、発光酵素の本来のＮ末端とＣ末端とを連結する一方で、酵素の酵素活性部位を切断して人工的なＮ末端とＣ末端とを作ることによって円順列置換されている。そして、人工的に作製したこれらの末端のそれぞれにタンパク質を連結する。このように分子設計することによって、発光酵素の酵素活性部位は２分割され、分割された酵素活性部位がそれぞれ分子の中心から外側に配置される。従って、酵素活性部位間の衝突確率を顕著に抑えることができる。結果として、シグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ比：signal-to-noise ratio）を格段に改善することができる。
【０００８】
また、本発明者らは以前に、男性ホルモン受容体（ＡＲ：androgen receptor）の核内移行を指標とした、生物発光イメージングプローブを提案している（非特許文献１）。このプローブでは、発光酵素を２分割する一方で、タンパク質組み継ぎ反応を起こすタンパク質（ＤｎａＥ）も２分割する。そして、２分割したそれぞれの一方の断片をＡＲに連結して通常は細胞質に局在させておき、その残りの断片を核内に局在させておく。ＡＲは、ステロイドホルモン依存的に核内に移行し、ＡＲに連結された断片は、核内に局在している残りの断片と相互作用する。これにより回復した生物発光強度を測定することによって、タンパク質間相互作用を検出する。
【０００９】
さらに他の細胞内分子現象を測定する方法として、特許文献４には、ホタルルシフェラーゼに１つのタンパク質を挿入したプローブを用いて、外部刺激により低下する発光量を測定する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０８４８６９号パンフレット
【特許文献２】特開２００９−３４０５９号公報（２００９年２月１９日公開）
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１７６２３９号公報（２００９年７月９日公開）
【特許文献４】国際公開第２００５／０３８０２９号パンフレット（２００５年４月２８日）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kim, S. B.; Ozawa, T.; Watanabe, S.; Umezawa, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 11542-11547.
【非特許文献２】Kaihara, A.; Umezawa, Y. Chemistry, An Asian Journal 2008, 3, 38-45.
【非特許文献３】Kim, S. B.; Takao, R.; Ozawa, T.; Umezawa, Y. Analytical Chemistry 2005, 77, 6928-6934.
【非特許文献４】Awais, M.; Sato, M.; Lee, X. F.; Umezawa, Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2707-2712.
【非特許文献５】Hoshino, H.; Nakajima, Y.; Ohmiya, Y. Nat. Methods 2007, 4, 637-639.
【非特許文献６】Kim, S. B.; Otani, Y.; Umezawa, Y.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, 4820-4826.
【非特許文献７】Kim, S. B.; Awais, M.; Sato, M.; Umezawa, Y.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, 1874-1880.
【非特許文献８】Kim, S. B.; Sato, M.; Tao, H. Anal. Chem. 2009, 81, 67-74.
【非特許文献９】Kim, S. B.; Sato, M.; Tao, H. Bioconjugate Chemistry 2008, 19, 2480-2486.
【非特許文献１０】Hodges, Y. K.; Tung, L.; Yan, X. D.; Graham, J. D.; Horwitz, K. B.; Horwitz, L. D. Circulation 2000, 101, 1792-1798.
【非特許文献１１】Loening, A. M.; Wu, A. M.; Gambhir, S.S. Nat. Methods 2007, 4, 641-643.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した、発光酵素を含有する発光プローブを用いた検出方法は、従来のタンパク質間相互作用検出用のＦＲＥＴにおける、自己蛍光によるバックグラウンド蛍光が高いこと、外部光源が必要となること、蛍光測定のために大型の蛍光顕微鏡を必要とすること、分析できる細胞数が限られており、得られる結果が定量的というよりもむしろ定性的となること等の問題を解決し得るものである。
【００１３】
そのため、このような発光プローブによる検出精度のさらなる向上が要求されており、特に、十分な検出精度を得るために、より安定性が高い発光プローブが求められている。また、発光プローブの開発費用等を抑え、広く使用するために、設計が容易であることが求められている。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、発光強度が高く、設計が容易な新規のプローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、以下の点に深く考慮することにより本発明を完成させた。
【００１６】
まず、発光酵素が本来持つ酵素活性を侵害しないことに考慮し、発光酵素の全長をそのまま利用することを見出した。そして、発光酵素の構造上の変形による酵素活性度の変化を指標とすることによって、高い発光強度のままでの測定が可能であり、発光プローブの構造をより単純化して設計上の試行錯誤を容易に回避できることを見出した。
【００１７】
本発明に係る融合タンパク質は、上記課題を解決するために、標的物質を検出する融合タンパク質であって、前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加するものであることを特徴としている。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記酵素は略球形状であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る融合タンパク質において、前記酵素は発光酵素であり、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるものであることが好ましい。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する蛍光タンパク質をさらに有することが好ましい。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記発光酵素は、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼからなる群より選択されることが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明に係る融合タンパク質において、前記一次結合タンパク質は、核内受容体、サイトカイン受容体、タンパク質キナーゼ、セカンドメッセンジャー認識タンパク質、及び転写因子からなる群より選択されることが好ましい。また、本発明に係る融合タンパク質において、前記一次結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、前記二次結合タンパク質がＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインであり、前記発光酵素がウミシイタケルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明に係る融合タンパク質は、前記一次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第１リンカーと、前記二次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第２リンカーとをさらに備え、前記第１リンカー及び前記第２リンカーはそれぞれ、５アミノ酸以下のアミノ酸配列からなることが好ましい。さらに、本発明に係る融合タンパク質において、前記第１リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列からなり、前記第２リンカーは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明に係る融合タンパク質は、配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質；あるいは配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質であることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記いずれかの融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドであることを特徴としている。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一であり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るベクターは、上記いずれかのポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係る形質転換体は、上記いずれかのポリヌクレオチド、又は上記ベクターを含んでいることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る標的物質を検出する方法は、被験試料中の標的物質を検出する方法であって、前記被験試料と、上記いずれかの融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴としている。本発明に係る標的物質を検出するためのキットは、上記いずれかの融合タンパク質を備えていることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係るプローブの生産方法は、上記いずれかのポリヌクレオチド又は上記ベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本発明に係るプローブの生産キットは、上記いずれかのポリヌクレオチド又はベクターを備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る融合タンパク質によれば、活性型の酵素又はその前駆体を用いることによって、設計が容易であり、かつ発光強度が高く、種々のタンパク質間相互作用の可視化検出をより高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る発光プローブの一例を用いたリガンド認識メカニズムを模式的に示す図である。
【図２】ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８）の結晶構造を示す図である。
【図３】ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）の結晶構造を示す図である。
【図４】ＲＬｕｃ８の酵素活性部位における各アミノ酸と基質との間の相互作用を示す図であり、酵素末端から近いアミノ酸を破線によって囲んで示す。
【図５】本発明に係る発光プローブを用いたリガンド認識メカニズムを示す模式図である。
【図６】本発明に係る発光プローブを作製するためのＤＮＡコンストラクト構成の一例を示す図である。
【図７】ＲＬｕｃ８を挿入した発光プローブ（ＥＲＳ）を発現した形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。
【図８】ＥＲＳ、ＥＧＳ（ＧＬｕｃを挿入した発光プローブ）、ＥＣＳ（ＣＢＬｕｃを挿入した発光プローブ）、ＥＦＳ（ＦＬｕｃを挿入した発光プローブ）をそれぞれ発現した形質転換体における発光強度の割合を示すグラフである。
【図９】発光酵素の種々の基質の化学構造を示す図であり、重要なサイドチェーンにあたる部位を破線によって囲んで示す。
【図１０】種々の基質共存下における発光スペクトルを示すグラフである。
【図１１】種々の基質共存下における発光スペクトルのピーク強度の割合を示すグラフである。
【図１２】ＲＬｕｃ８を発現する形質転換体、及びＥＲＳを発現する形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】ＥＲＳを発現する形質転換体におけるリガンド応答曲線を示す図である。
【図１４】ＥＲＳ、ＥｍＲＳ（ＥＲ ＬＢＤのリン酸化部位が変異した発光プローブ）、ＥＲ＋ＲＳ（ＲＬｕｃ８とＥＲ ＬＢＤとが連結されたプローブ（ＥＲ）及びＲＬｕｃ８とＳＨ２ドメインとが連結されたプローブ（ＲＳ））を発現する形質転換体における相対発光強度を示すグラフである。
【図１５】ＥＲ又はＲＳを発現させるためのＤＮＡコンストラクト構成を示す図である。
【図１６】ＥＲ及びＲＳの構造を模式的に示す図である。
【図１７】種々のリガンドの化学構造を示す図である。
【図１８】ＥＲＳを発現する形質転換体における、種々のリガンドに応答した発光強度を示すグラフである。
【図１９】本発明に係る発光プローブ（ＥＥＲＳ）を作製するための構成の一例を示す図である。
【図２０】ＥＹＦＰ及びＲＬｕｃ８を挿入した発光プローブ（ｐＥＥＲＳ）を発現した形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。
【図２１】本発明に係る発光プローブであり、その内部での発光共鳴エネルギー移動を起こす発光プローブ（ＥＥＲＳ）のリガンド認識メカニズムを模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔１．融合タンパク質及びポリヌクレオチド〕
本発明に係る融合タンパク質は、一分子型生物発光プローブとして用いられ、標的物質を検出する融合タンパク質であって、前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、前記一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質である。
【００２９】
後述するように、本発明に係る融合タンパク質に含まれる活性型の酵素又はその前駆体の代表的な例として、活性型の発光酵素又はその前駆体が挙げられる。したがって、以下では、例として、本発明に係る融合タンパク質における酵素を発光酵素として説明し、本発明に係る融合タンパク質を発光プローブと称することもあるが、本発明はこれに限定されず、他の酵素であっても同様に説明され得る。
【００３０】
本明細書において、「発光プローブ」は、「生物発光プローブ」又は「プローブ」と交換可能に使用され、標的に特異的な標的物質によって引き起こされる様々な分子現象を、生きた細胞又は生体において、生物発光として可視化イメージングすることが可能なプローブである。また、「一分子型発光プローブ」とは、上述した可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に含むプローブである。例えば、上述した（ｉ）一次結合タンパク質、（ｉｉ）活性型酵素又はその前駆体、（ｉｉｉ）二次結合タンパク質を、基本構成要素として含む融合タンパク質が含まれ得る。
【００３１】
本発明の融合タンパク質は、一次結合タンパク質と二次結合タンパク質との間に活性型酵素又はその前駆体が挿入されていればどのような順番でもよいが、一次結合タンパク質、活性型酵素又はその前駆体、二次結合タンパク質の順に直鎖状に連結された形態であることが好ましく、アミノ末端から一次結合タンパク質、活性型酵素又はその前駆体、二次結合タンパク質の順に直鎖状に連結された形態であることがより好ましい。
【００３２】
また、本発明の融合タンパク質は、前記酵素が発光酵素であり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるものであることが好ましい。さらに、本発明の融合タンパク質は、一次結合タンパク質と二次結合タンパク質との間に位置する蛍光タンパク質をさらに有することが好ましい。この構成であれば、発光共鳴エネルギー移動を起こすことができる。
【００３３】
ここで、「一次結合タンパク質」は、その標的物質の結合部位に標的物質が結合するタンパク質が意図され、「標的物質結合タンパク質」と称することもある。後述するように、本発明によって検出する標的物質をリガンドと称する場合には、標的物質結合タンパク質を、「リガンド結合タンパク質」と称することもある。
【００３４】
一次結合タンパク質は、例えば、標的物質が結合することによって立体構造が変化し、後述する二次結合タンパク質の分子認識部位と結合することができるタンパク質であり得る。このような一次結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質又は信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体（ＮＲ）、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。一次結合タンパク質は、対象とする標的物質によって適宜選択される。
【００３５】
本明細書中における「標的物質」は、本発明に係る発光プローブの検出の対象となる物質であり、生細胞膜上又は生細胞内の特定タンパク質と特異的に結合してその機能を変化させうる物質を意味しており、「リガンド」と称することもある。例えば、核リセプターに対してはステロイド又は合成化学物質をさし、サイトカイン受容体に対しては各種サイトカインをさし、インシュリン受容体のような細胞膜上受容体に対してはインシュリンを含む刺激物質をさす。
【００３６】
本発明によって検出するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。例えば、受容体タンパク質（例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等）に対するアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。また、細胞内の情報伝達に関与する分子に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。
【００３７】
例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合タンパク質（セカンドメッセンジャー認識タンパク質）を使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、イノシトール３リン酸（ＩＰ３：inositol triphosphate）、ＩＰ４、Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール（diacylglycerol）、アラキドン酸（arachidonic acid）等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのＣａ２＋に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン（ＣａＭ）を用いることができる。
【００３８】
また、例えば、リガンドとして核内受容体に特異的なリガンドを対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、核内受容体の公知の結合ドメイン（ＬＢＤ：ligand binding domain）を使用することができる。さらに、リン酸化アミノ酸残基又はＧタンパク質結合型受容体リガンドを対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、それぞれリン酸化アミノ酸結合ドメイン又はＧタンパク質結合型受容体を使用することができる。核内受容体リガンド結合ドメインとしては、エストロゲンをリガンドとするエストロゲン受容体（ＥＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）のリガンド結合ドメインが好適に用いられる。
【００３９】
例えば、エストロゲン受容体のＬＢＤは、全長ヒトエストロゲン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/Ｐ０３３７２）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号３０５〜５５０）を、遺伝子工学的に又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、例えばアンドロゲン受容体のＬＢＤは、全長ヒトアンドロゲン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/ＡＦ１６２７０４）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号６７２〜９１０）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、例えばグルココルチコイド受容体のＬＢＤは、全長ヒトグルココルチコイド受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/１２０１２７７Ａ）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号５２７〜７７７）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、同様にプロゲステロン受容体のＬＢＤについても、全長ヒトプロゲステロン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/Ｐ０６４０１）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号６７７−９３３）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。
【００４０】
本明細書において「二次結合タンパク質」は、上述したリガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する分子認識部位を有するタンパク質が意図され、「認識タンパク質」と称することもある。認識タンパク質には、例えば、リガンドの結合により立体構造が変化したリガンド結合タンパク質に結合するタンパク質等が包含される。
【００４１】
例えばリガンド結合タンパク質としてカルモジュリンを用いた場合、認識タンパク質として、ミオシン軽鎖キナーゼ（miosin light chain kinase）由来のペプチドであるＭ１３ペプチドが好適に用いられる。また、Ｍ１３以外にもカルモジュリンに対して結合できるタンパク質として、アデニリルシクラーゼ、カルモジュリンキナーゼＩＩのようなＣａＭ依存性タンパク質キナーゼ類を挙げることができる。このようなタンパク質の一部分をＭ１３の代わりに用いることができる。
【００４２】
また、例えばリガンド結合タンパク質として、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体等の核内受容体を用いた場合、認識タンパク質として共転写因子（coactivator）由来のＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１２）、ＡＲのＮ末側（ＡＲ ＮＴＤ）由来のＦＱＮＬＦモチーフ、ＦＸＸＬＦモチーフ、ＷＸＸＬＦモチーフ等が用いられ得る。好ましくは、共転写因子の一種であるＲｉｐ１４０（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＰ００３４８０）、又はＳｒｃ−１ａ（steroid receptor coactivator 1 isoform 1；ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＰ００３７３４）のＬＸＸＬＬモチーフ（約１５アミノ酸）が用いられる。
【００４３】
さらに、リン酸化アミノ酸残基を認識できるドメインである、各種キナーゼタンパク質のＳＨ２ドメインを、認識タンパク質として用いてもよい。例えば、発癌制御タンパク質であるＳｒｃタンパク質（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src；ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＰ９３８０３３）のリン酸化認識ドメイン（ＳＨ２ドメイン；アミノ酸番号１５０〜２４８）、細胞増殖、発癌等に関連する増殖因子レセプター結合タンパク質Ｇｒｂ２（growth factor receptor-binding protein2）のＳＨ２ドメイン等を用いることができる。また、リガンド結合タンパク質としてＧタンパク質結合型受容体を用いた場合、認識タンパク質としてＧタンパク質等を好適に用いることができる。
【００４４】
本発明におけるリガンド結合タンパク質及び認識タンパク質の組み合わせとしては、条件依存的に結合する２つのタンパク質であってもよい。例えばＦＲＢとＢＲＡＤ、ＥＲ ＬＢＤとＬＸＸＬＬモチーフ、ＡＲ ＬＢＤとＦＱＮＬＦモチーフ、ＣａＭとＭ１３、核内受容体とそのコアクチベーター、リン酸化タンパク質とそのリン酸化認識タンパク質、核受容体間のホモ又はヘテロ結合（二量化）を行う２つのタンパク質等のペアを用いることができる。
【００４５】
本明細書中において「活性型の酵素又はその前駆体」は、その酵素活性部位に基質を結合し得る、活性化状態の酵素又はその前駆体であることが意図され、酵素の全長配列を含むものであることが意図される。なお、「酵素の全長配列」とは、少なくとも酵素活性部位を含む領域を、欠失、分割等せずにそのまま全て含むものであり、本来の酵素活性を保持しているものであればよい。例えば、欠失させても酵素活性には影響を及ぼさないＮ末側又はＣ末側の一部分等が欠失しているものについても、「酵素の全長配列」に含まれる。
【００４６】
ここで、酵素の前駆体とは、不活性なものであるが、何らかの修飾を受けることによって、活性化し、活性型の酵素となるものを意図しており、活性型の酵素と同一の配列からなるものである。例えば、リン酸化により不活性状態から活性化する酵素を使用する場合、前駆体の状態で発光プローブに挿入し、リガンドの検出時にリン酸化することによって活性化して、活性型の酵素として使用することができる。以下で、本発明において使用する「酵素の全長」又は単に「酵素」について記載する場合、活性型の酵素又はその前駆体を意図している。
【００４７】
本発明において使用する酵素は、そのＮ末側とＣ末側とにそれぞれつながれているリガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが互いに相互作用することによって、外部からの分子テンションが加わり、その構造的な変形が生じることによって、発光プローブからの酵素活性度が変化する酵素であり得る。このような酵素の代表的なものとして、発光酵素（ＬＥ：lighting enzyme）が挙げられる。
【００４８】
また、本発明において使用する酵素は、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に、蛍光タンパク質と連結されて挿入されていてもよい。この場合の酵素とは、発光酵素であることが好ましい。また、蛍光タンパク質は、発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の受け皿となり得るものであることが好ましい。すなわち、蛍光タンパク質は、発光酵素の活性によって発生した発光エネルギーを吸収できるものであることが好ましい。これにより、発光共鳴を誘導する（発光共鳴エネルギー移動を起こす）ことが可能になる。
【００４９】
本発明において使用する発光酵素と蛍光タンパク質との組み合わせは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に挿入されることによって、発光酵素と蛍光タンパク質との発光共鳴エネルギー移動の一部に影響を受けるものであることが望ましい。また、発光酵素と蛍光タンパク質との組み合わせは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが互いに相互作用することによって、外部からの分子テンションが加わり、それらの内部構造的な変形が生じることにより発光酵素と蛍光タンパク質との発光共鳴エネルギー移動が影響を受けるものであって、これによって、発光プローブからの酵素活性度が変化する発光酵素と蛍光タンパク質との組み合わせであり得る。
【００５０】
なお、蛍光タンパク質は、酵素のＮ末側に連結されていてもよいし、酵素のＣ末側に連結されていてもよい。
【００５１】
本明細書中において「分子テンション」とは、上述した酵素（酵素分子）、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせにＮ末端とＣ末端とから加わる力（緊張）であり、好ましくは酵素分子、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせに構造的な変形を生じさせるような力である。
【００５２】
本明細書中において「構造的な変形」とは、上述したような酵素分子、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせに外部から加わる分子テンションによって、酵素分子、又は酵素と蛍光タンパク質との組み合わせの分子が捩れる等の構造上の変化であることを意図しており、構造が大きく変形するようなものでなくてもよく、その変形により発光プローブからの酵素活性度が増加するような変形であればよい。
【００５３】
本発明に係る発光プローブの各構成要素であるリガンド結合タンパク質、酵素の全長あるいは酵素の全長及び蛍光タンパク質、ならびに認識タンパク質は、直鎖状の融合分子となるように、それぞれ直接に、又は最適なリンカーペプチドを介して連結される。リンカーペプチドを介して連結する場合、リンカーペプチド配列の種類及び長さを変えることで、各構成要素間の距離を適宜調整することが可能である。
【００５４】
このようなリンカーペプチドとしては、本発明に係る発光プローブを一本鎖の融合タンパク質として発現するための連結ペプチドであることが好ましい。リンカーペプチドとしては、サイドチェーンのない、柔軟なアミノ酸（例えば、グリシン（Ｇ：Glysine）など）を介してもよい。リンカーペプチドの長さは短いことが好ましく、例えば５アミノ酸以下の短いアミノ酸配列であることが好ましい。このように、各要素間のリンカーペプチドの長さを最短に抑えることによって、リガンド応答性の良いプローブを設計できる。また、リガンド結合タンパク質と、酵素又は当該酵素と組み合わされて挿入される蛍光タンパク質と、を連結する第１リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列からなり、認識タンパク質と、酵素又は当該酵素と組み合わされて挿入される蛍光タンパク質と、を連結する第２リンカーは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列からなることが好ましく、これにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用による生じる分子テンションを効率よく酵素に伝達し、確実に酵素に構造的な変形を生じさせることができる。
【００５５】
ここで、本発明に係る発光プローブの一例を用いたリガンド認識メカニズムを模式的に図１に示す。本発明に係る発光プローブの一例は、図１に示すように、例えばリガンド結合タンパク質（Ａ）と認識タンパク質（Ｂ）との間に、発光酵素であるルシフェラーゼ（Luciferase）の全長が挿入されている。なお、全長とは、酵素活性に関与しない一部が欠損されているものであってもよい。そして、リガンドにより刺激されると、リガンドがリガンド結合タンパク質に結合し、この結合を認識タンパク質が認識することにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用する。リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用は、必然的にその間に存在する発光酵素に一定の構造的な変形（ストレイン）を引き起こし、この変形によって発光プローブからの酵素活性度が増加する。
【００５６】
また、本発明に係る発光プローブの他の例を用いたリガンド認識メカニズムを模式的に図２１に示す。本発明に係る発光プローブの他の例は、図２１に示すように、例えばリガンド結合タンパク質（Ａ）と認識タンパク質（Ｂ）との間に、発光酵素であるルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８）の全長と、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ：Enhanced Yellow Fluorescence Protein）とが挿入されている。ＥＹＦＰは、ＲＬｕｃ８のＮ末側に連結されている。リガンドがない条件では、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用せず、ＥＹＦＰとＲＬｕｃ８との間の生物発光共鳴エネルギー移動（bioluminescence resonance energy transfer；ＢＲＥＴ）は弱く、発光強度は弱い。一方、リガンドにより刺激されると、リガンドがリガンド結合タンパク質に結合し、この結合を認識タンパク質が認識することにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用する。リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用は、必然的にその間に存在する発光酵素及び蛍光タンパク質に一定の構造的な変形（ストレイン）を引き起こし、発光酵素と蛍光タンパク質との間の生物発光共鳴エネルギー移動が影響を受けることによって、発光プローブからの酵素活性度が増加する。
【００５７】
酵素活性度の増加は、リガンドの濃度、性質等に依存するため、この酵素活性度の増加、すなわち発光強度の増加を指標として、リガンドの性質、量等を測定することができる。以上のような原理でリガンドを検出するため、本発明に係る発光プローブを「ストレインプローブ（Strain probe）」と称することもある。
【００５８】
このように、発光プローブに挿入される発光酵素は、全長の発光酵素の両側に連結されたタンパク質同士の相互作用によって分子テンションが加わり、分子の構造的な変形（分子変形）が生じ、発光プローブからの酵素活性度を増加させるものであればよく、その種類、発光特性、分子量等は、特に限定されない。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８：Renilla luciferase 8）、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ：Gaussia luciferase）、ビートル（昆虫）ルシフェラーゼの一種であるクリックビートルルシフェラーゼ（ＣＢＬｕｃ：click beetle luciferase）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ：firefly luciferase）、ＲＬｕｃ、ＭｐＬｕｃ１（Metridia pacifica luciferase 1）、ＭｐＬｕｃ２（Metridia pacifica luciferase 2）、ＭＬｕｃ（Metridia longa luciferase）、ＯＬｕｃ（Oplophorus）、ＲＷＬｕｃ（Rail-road worm luciferase）等を含む海洋生物、昆虫、バクテリア由来のルシフェラーゼを、特に制限なく使用できる。これらの発光酵素のなかでも、ＲＬｕｃ８、ＧＬｕｃ、ＣＢＬｕｃ、ＦＬｕｃ等を好適に用いることができる。
【００５９】
これらの発光酵素は、アミノ酸配列や遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列が公知であり（例えば、ＦＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＢ０６２７８６等、ＣＢＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＹ２５８５９２．１等、ＧＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＹ０１５９９３等）、これらの配列情報に基づいて公知の方法によりＤＮＡを取得することができる。
【００６０】
ここで、ＲＬｕｃ８とＦＬｕｃとの構造を比較する。図２は、ＲＬｕｃ８の結晶構造を示す図であり、図３は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）の結晶構造を示す図である。なお、図２において、ＮはＮ末端を示し、ＣはＣ末端を示す。また、酵素活性部位を矢印部位（ａ）で示す。図２に示すように、ＲＬｕｃ８は、略球形状の１つのユニットからなり、堅い分子構造を有している。一方、図３に示すように、ＦＬｕｃは、２つのドメインによって構成されており、Ｎ末側ドメインとＣ末側ドメインとは柔軟性の高い親水性アミノ酸によって繋がっている。これらの構造の違いから、酵素を単独でリガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に挿入する場合には、ＦＬｕｃのような２ドメイン構造よりも、ＲＬｕｃ８のような構造を有する酵素の方が、分子末端からの分子テンションが酵素本体に効率よく伝わり、構造的な変形が起こりやすいため好ましい。
【００６１】
次に、ＲＬｕｃ８の酵素活性部位について考察する。図４は、ＲＬｕｃ８の酵素活性部位における各アミノ酸と基質との間の相互作用（結合）を示す図である（非特許文献１１）。なお、図４において、破線によって囲まれたアミノ酸は、酵素末端から近いアミノ酸である。ＲＬｕｃ８の酵素活性部位を構成するアミノ酸のうち、Ｈ２８５、Ｆ２８６、及びＦ２６１等は、Ｃ末端（Ｑ３１１）から近いため、特にＣ末端にかかる外部からの分子テンションにより直接影響を受けやすい。したがって、ＲＬｕｃ８は、外部からの分子テンションが酵素活性部位に効率よく伝わるため、変形により酵素活性が変化しやすい構造となっている。
【００６２】
このように、本発明に係る発光プローブに用いる酵素としては、酵素を単独でリガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に挿入する場合には、ＲＬｕｃ８のような、略球形状の１つのドメインからなり、酵素活性部位が末端に近いなど、変形しやすく、かつ変形により酵素活性が変化しやすいものが好ましい。
【００６３】
なお、本明細書中において「酵素が略球形状である」とは、酵素分子の立体構造が全体として略球形状をしていることを意味する。したがって、例えば酵素分子が２つのドメインによって構成されていても、酵素分子が全体として略球形状であれば、その酵素は略球形状である。なお、「略球形状」とは、完全な球形状との差異が比較的小さい形状であって、酵素分子の中心から酵素分子の表面上の任意の点までの距離が略一定である形状であればよい。
【００６４】
また、発光プローブに発光酵素と蛍光タンパク質とを組み合わせて挿入する場合には、発光酵素としては、上述したものを特に制限なく使用できる。発光酵素と組み合わされる蛍光タンパク質としては、当該発光酵素の活性によって発生した発光エネルギーを効率よく吸収できるものが望ましい。例えば、蛍光タンパク質は、その吸収スペクトルの全部又は一部が、発光酵素の発光スペクトルの全部又は一部と重なるものであることが望ましい。蛍光タンパク質としては、上述したＥＹＦＰの他に、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ，Ｋａｅｄｅ，Ｄｒｏｎｐａ等が挙げられる。
【００６５】
本発明に係る発光プローブとしては、リガンド結合タンパク質として、エストロゲン（女性ホルモン）受容体（ＥＲ：estrogen receptor）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ：ligand-binding domain）を用い、認識タンパク質としてキナーゼＳｒｃのリン酸化認識ドメイン（Ｓｒｃ ＳＨ２）を用い、発光酵素の全長としてＲＬｕｃ８を用いた発光プローブ（ＥＲＳ）であることが好ましい。ＥＲ ＬＢＤは、１７β−エストラジオール（estradiol）（Ｅ２）等のエストロゲン（estrogen）、エストロゲンアンタゴニスト（ＯＨＴ； 4-hydroxytamoxifen）等のリガンドに応答するものである。この発光プローブは、ＥＲ ＬＢＤをリン酸化するリガンドを検出するために用いることができる。
【００６６】
このように、最適な発光酵素を選択することによって、発光プローブの構造的変化による分子テンションが効率よく発光酵素に伝達され、さらに発光プローブの構造を単純化することができる。そして、発光プローブをこのように構成することによって、従来の酵素分割型に比べて発光プローブから格段に高い発光強度を維持しつつ、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用による発光量を顕著に増加させることができる。例えば、後述する実施例において示すように、発光プローブの発光酵素としてＲＬｕｃ８を用いた場合には、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用によって、これらが相互作用していないときに対して発光量を６５０％まで増加させることができる（図１０のｆｃｐを参照）。このように、本発明に係る発光プローブは、分子テンションによる酵素の変形、それに伴う酵素活性度の増加が生じるものであることが好ましい。
【００６７】
このように構成された発光プローブを用いたリガンド認識メカニズムを示す模式図を図５に示す。図５に示すように、ＥＲ ＬＢＤは、ＯＨＴ等のリガンドによる刺激に応じて構造変化（活性化）する。この構造変化の結果、ＥＲ ＬＢＤにおけるＹ５３７がリン酸化されると、ＳｒｃのＳＨ２ドメインがこのリン酸化部位を認識し、分子内相互作用によりＥＲ ＬＢＤとＳＨ２ドメインとが結合する。ＥＲ ＬＢＤ−ＳＨ２ドメイン間の結合は、ＲＬｕｃ８の構造的な変形を引き起こし、発光プローブの酵素活性度を増加させる。この酵素活性度の増加は、リガンドの濃度等に依存する。そのため、発光プローブからの発光強度の変化を指標に、リガンドの量を測定することができる。
【００６８】
また、例えばアンドロゲン受容体に対するリガンドを検出するためには、リガンド結合タンパク質としてＡＲ ＬＢＤを用い、認識タンパク質としてＬＸＸＬＬモチーフを用いることができる。
【００６９】
本発明に係る発光プローブにおいては、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを、同じ分子内の認識タンパク質が認識した場合に、酵素に構造的な変形が生じることによって、発光プローブの酵素活性度、すなわち発光量が、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合する前の状態における発光プローブからの発光量よりも増える。すなわち、リガンドが結合する前と後とで、発光プローブからの発光量が異なるものであればよく、その発光量の変化の要因としては、変形による酵素の量子収率（Quantum yield）の向上、酵素の変形による発光プローブの代謝回転率（Turn-over rate）の向上（安定性の向上）等が挙げられる。しかしながら、本発明に係る発光プローブによるリガンドの検出においては、発光プローブからの発光量の変化の要因に関わらず、発光プローブからの発光量の増加を指標とすればよいことは言うまでもない。
【００７０】
本発明に係る発光プローブは、各構成要素のポリペプチドを化学合成法等で得た後に、それぞれを連結して得てもよいが、各構成要素のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直鎖状に連結したポリヌクレオチド、すなわちキメラＤＮＡが挿入されたベクターを用いて細胞を形質転換し、形質転換した細胞内に発現させることによっても得られる。
【００７１】
ここで、キメラＤＮＡとは、由来の異なるいくつかのＤＮＡ断片が人工的に直鎖状に連結されたものであり、いくつかのポリペプチドを構成要素とする融合タンパク質を発現することのできるＤＮＡである。
【００７２】
本明細書中において、「生細胞」とは、生物における細胞（原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ヒトを含めた哺乳動物細胞等）のみならず、その本来の機能を維持した状態の培養細胞（原核細胞及び真核細胞）、生物個体内に移植、感染した細胞などを含み、特に実験動物、例えばマウス等の細胞である。また、生物の個体そのものをも含む概念である。
【００７３】
本明細書中において、融合タンパク質とは、由来の異なるいくつかのタンパク質又はポリペプチドが人工的に連結されたものであり得る。
【００７４】
本明細書中において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現され産生された組換えポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然の、又は組換えのポリペプチド及びタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００７５】
本発明に係る発光プローブにおいて、各構成要素のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
【００７６】
また、本発明に係る発光プローブ及び各構成要素のポリペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグ（配列番号７）、Ｍｙｃタグ（配列番号９）、Ｆｌａｇタグ（配列番号８）等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。本発明に係る融合タンパク質は、好ましい形態に改変され、組換え発現され得る。例えば、本発明に係る融合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に特定のアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域等を付加することによって、宿主細胞内、精製、精製に引き続く操作、及び保存等における安定性、持続性等を改善することができる。
【００７７】
一実施形態において、本発明に係る発光プローブは、配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質又はその変異体であることが好ましい。ここで、当該変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質であることが好ましい。
【００７８】
本明細書中においてポリペプチドまたはタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、本来のアミノ酸の少なくとも１つ以上がポイント変異、挿入、逆転、反復、欠損、タイプ置換されたポリペプチド又はタンパク質であって、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるポリペプチドまたはタンパク質が意図される。
【００７９】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、タイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）、及びポイント変異などを含む変異体が挙げられる。アミノ酸の置換には、例えば、ポリペプチドにおける中性アミノ酸を別の中性アミノ酸に置換する場合等が含まれる。
【００８０】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００８１】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００８２】
変異体としては、好ましくは保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、又は添加等の変異を有する変異体である。変異体が有する変異としては、好ましくは、サイレント置換、添加、及び欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係る発光プローブの発光活性を変化させない。
【００８３】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの中での１アミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの間の置換である。
【００８４】
他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００８５】
他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００８６】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が意図される。
【００８８】
また、他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００８９】
ＤＮＡ塩基配列の６６％以上が同一であれば、全く同様の活性を持つ融合タンパク質を作製できる根拠としては、サイレント変異を考えられる。遺伝子暗記票によれば、例えば、アミノ酸のバリン（Ｖａｌｉｎｅ）をコードする遺伝子は、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧのいずれでもよい。従って、最大３３％の遺伝子塩基が違っても全く同一の融合タンパク質プローブを作製できることから、数字の６６％が同一塩基配列か否かを判定する上で妥当な意味を持つ。
【００９０】
また、機能が解明されている多くのタンパク質は、自然変異体またはアイソフォームを持つ。本実施例にあげたＥＲでさえ、自然界にはＥＲαとＥＲβとが存在しており、女性ホルモンに対して同様のセンシング能をもつことが知られている（非特許文献１０）。ところが、そのアミノ酸間の相同性はわずか３０％（Ｎ-末側領域；ＮＴＤ）、５３％（リガンド結合領域；ＬＢＤ）に過ぎない点を考慮すべきである。
【００９１】
さらに、本実施例において用いたＥＲと同じ核受容体であるグルココルチコイド（ＧＲ）では、ＧＲαＡ、ＧＲβＡ、ＧＲα２、ＧＲβ２、ＧＲＡα、ＧＲＡβ、ＧＲ−Ｐ、ＧＲ−βＢなどのイソフォームが存在し、それぞれ同じＧＲ類として生体内で機能している（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０４１５０）点を考慮しなければならない。
【００９２】
例えば、「本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも６６％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」である対象塩基配列は、当該参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり３３個までの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得るが、参照塩基配列と同じ表現型（アミノ酸配列）のタンパク質をコードする配列である。参照塩基配列に少なくとも６６％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、例えば参照配列における塩基の３３％までが、欠失されていてもよく、又は別の塩基で置換されていてもよい。また、参照塩基配列における全塩基の３３％までにあたる数の塩基が、参照塩基配列に挿入されていてもよい。対象塩基配列における、参照塩基配列とは不一致な塩基は、対象塩基配列の５’もしくは３’末端位置、又はそれ以外の塩基配列中において、個々に、又は１以上の隣接した群において分散されていてよく、また、対象塩基配列中のどこにあってもよい。
【００９３】
本発明はまた、本発明に係る発光プローブをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るポリヌクレオチドは、生細胞内外において、本発明に係る発光プローブを発現可能なポリヌクレオチドである。本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、リガンド結合タンパク質、発光酵素の全長、及び認識タンパク質が直鎖状に配列した融合タンパク質となるように、それぞれをコードするｃＤＮＡを直鎖状に連結して作製されたキメラＤＮＡである。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）もしくはリボヌクレオチド（Ｃ、Ａ、Ｇ及びＵ）の配列として示される。また、「配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」とは、配列番号４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び／又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分が意図される。
【００９５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００９６】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその変異体であることが好ましい。
【００９７】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させる融合タンパク質をコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれかであることが好ましい：配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００９８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列又はベクター配列（発現用ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００９９】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒトまたはマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプル又は細胞サンプル）が意図される。
【０１００】
本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、発現用ベクター等にサブクローンして、発光プローブを発現させるためのベクター（プラスミド）を作製し、これを細胞内に導入することによって、当該ポリヌクレオチドがコードする発光プローブを細胞内に発現させることができる。なお、本発明に係るポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする領域の上流に、細胞内において発光プローブを発現させるためのプロモーター配列等が組み込まれたものであってもよい。
【０１０１】
本発明に係る融合タンパク質又はポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、細胞内外における分子の可視化イメージングのための発光プローブとして使用され得る。より具体的には、本発明に係る融合タンパク質は一本鎖の融合ポリペプチドとして構成され、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合すると、その立体構造が変化し、リガンド結合タンパク質が認識タンパク質によって認識される。その結果、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用すると、これによってリガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に位置する全長の発光酵素、又は連結された全長の発光酵素及び蛍光タンパク質、が変形し、発光量を増加させる。このように、本発明に係る融合タンパク質によれば、発光量の変化に基づいて、細胞内外における分子の動き、信号伝達等を可視化検出することができる。
【０１０２】
したがって、本発明に係る融合タンパク質を用いれば、標的特異的なリガンドの生理活性、濃度等を高精度に検出することが可能であり、例えば発癌物質のような生体内危険因子のスクリーニング、薬学分野における新薬候補物質のスクリーニング、抗癌剤の薬理作用の定量評価（新薬の開発）、環境汚染・毒性物質の判定、診断用のキット、新型万能細胞（ｉＰＳ）における分化・生理作用の測定などに有用である。
【０１０３】
つまり、本発明の目的は、発光プローブ及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した融合タンパク質作製方法及びポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得される発光プローブ及びこれをコードするポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０４】
〔２．ベクター〕
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を生物又は細胞内で発現させるベクターを提供する。本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入し、当該生物又は細胞内において本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。
【０１０５】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクター等が挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミド等を用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１０６】
発現用ベクターの具体的な種類は特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクター等が適宜選択され得る。例えば、公知の真核又は原核細胞用のベクター等を使用することができる。また、ある臓器に特異的に宿る既知のベクターを使うことによって、特定臓器に選択的に本発明に係る融合タンパク質を発現させることもできる。
【０１０７】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を制御するために（例えば、生物個体における特定組織での発現）、公知の組織特異的プロモーター配列を組み込むようにしてもよい。また、特定のリガンド、刺激物等の有無によって、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を制御するために、公知の特定刺激特異的プロモーター配列を組み込むようにしてもよい。
【０１０８】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを、例えばｐＭＸなどのレトロウイルスベクターにつなげたものであってもよい。これを高力価のウイルス産生能を有するパッケイジング細胞ＰＬＡＴＥに導入することによって、動物に感染するレトロウイルスの作成が可能である。このウイルスを動物の各臓器に感染させることによって、各臓器内におけるセカンドメッセンジャー特性のリアルタイムイメージングができる。
【０１０９】
すなわち、本発明に係るベクターは、確実に本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質を発現させるために、適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドとを各種プラスミド等に組み込んだものであってもよい。
【０１１０】
本発明に係るベクターは、例えばマイクロインジェクション法、エレクトロポーレーション法、脂質試薬によるトランスフェクション法（例えばＴｒａｎｓＩＴ、Ｍｉｒｕｓ社製）等の公知の方法により宿主内に導入することができる。上記の宿主は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞、生物個体等を好適に用いることができる。
【０１１１】
なお、目的とする本発明に係る融合タンパク質が常に合成される場合に限定されず、ＩＰＴＧを添加することにより、合成が誘導されるものであってもよい。また、ベクターには、合成されるタンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ、ＨＡタグ（配列番号１０）、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇ等のタグ配列を付加する配列を含むものであってもよい。
【０１１２】
また、本発明に係るベクターは、例えば、融合タンパク質を発現させる目的ではなく、融合タンパク質をコードする配列の上流に発現制御をし得る制御配列を繋げることによって、融合タンパク質の発現の有無を指標としてさらなる生物分析のために利用することができる。
【０１１３】
本発明に係るベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、又はネオマイシン、ゼオシン、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢ等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、大腸菌及び他の細菌における培養については、カナマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン又はアンピシリン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【０１１４】
本発明に係るベクターを用いれば、生物又は細胞に導入することにより、当該生物又は細胞中に本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。また、本発明に係るベクターを導入した細胞から融合タンパク質を抽出して、精製し又は未精製のままで（非細胞系）、診断キットのセンサー成分として使用できる。例えば、生体試料内の各種生理物質の一例としてステロイドホルモン又は化学物質を測定することによって、各リガンドの生理活性を迅速に測定することができる。
【０１１５】
さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、本発明に係る融合タンパク質を合成することができる。
【０１１６】
なお、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよい。すなわち、発現用ベクター以外のベクターも本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１１７】
〔３．形質転換体〕
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を発現させ得る形質転換体を提供する。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいることを特徴としている。本明細書中において、「形質転換体」は、細胞、組織又は器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいる限り、特に限定されるものではない。
【０１１８】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、本発明に係る融合タンパク質が発現され得るように生物又は細胞中に導入することによって得られる。なお、組換えベクターを導入する宿主生物及び細胞としては、特に限定されないが、例えばＣＯＳ−７、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、ＣＨＯのような真核培養細胞、体細胞由来の新型万能細胞（ｉＰＳ）、原核細胞、植物細胞、高等動物等を用いることができる。
【０１１９】
本発明に係るポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入する方法、すなわち形質転換方法は特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主のゲノムに組み込まれていない状態で一過性に発現する、一過性形質転換体であってもよく、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主のゲノムに組み込まれ安定的に発現し続ける、安定形質転換体であってもよい。
【０１２０】
本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係る融合タンパク質を発現させることができるため、本発明に係る形質転換体をリガンドで刺激し、当該形質転換体からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、濃度、活性の程度等を評価することができる。
【０１２１】
〔４．標的物質検出方法及びキット〕
本発明は、さらに、被験試料中の標的物質を検出する標的物質検出方法及びキットを提供する。標的物質をリガンドと称する場合、標的物質検出方法及びキットを、リガンド検出方法及びキットと称する。本発明に係る標的物質検出方法は、被験試料と、本発明に係る融合タンパク質とを共存させる工程を包含することを特徴としている。本方法においては、被験試料と接触させる融合タンパク質に含まれる酵素の基質を、適宜接触させてもよい。これにより、本発明に係る融合タンパク質からの発光量を指標に、被験試料中の標的物質を検出する。本明細書中において、「被験試料」は、リガンドそのものであってもよく、リガンドを含む生体試料等であってもよい。また、被験試料は、本発明に係る融合タンパク質が発現した細胞において二次的に生産された細胞内物質であることもできる。
【０１２２】
上記工程において、被験試料の存在下及び非存在下において、本発明に係る融合タンパク質からの発光量が増加した場合、当該被験試料中において、本発明に係る融合タンパク質のリガンド結合タンパク質に結合するリガンドを検出することができる。本発明に係るリガンド検出方法によれば、後述する実施例に示すように、リガンドの性質、リガンドの活性の程度、リガンドの濃度等を分析することが可能である。
【０１２３】
本発明に係る標的物質検出方法によれば、既知のアゴニストに対する未知のアンタゴニストを検出することもできる。例えば、本発明に係る融合タンパク質に候補物質を含む被験試料を接触させ、ついで既知のアゴニストを接触させて、本発明に係る融合タンパク質からの発光量を測定する。被験試料中の候補物質がアンタゴニスト作用を有するものであれば、一次結合タンパク質のアゴニスト結合部位は候補物質によって占有されているので、その後に導入されたアゴニストは一次結合タンパク質に結合することはできない。
【０１２４】
このとき、アンタゴニストの結合によっては立体構造が増加しない一次結合タンパク質を用いていれば、アンタゴニストの結合により融合タンパク質からの発光量は増加しないため、アゴニスト単独で導入した場合に比して発光量は低い。一方、アゴニストの結合によっては立体構造が変化しない一次結合タンパク質を用いていれば、同様に既知のアンタゴニストを用いて、未知のアゴニストを検出することもできる。
【０１２５】
本発明に係る標的物質検出方法においては、典型的には、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換した生細胞と、被験試料とを接触させて刺激し、刺激前後における本発明に係る融合タンパク質からの発光量の増加を測定する。本発明に係る融合タンパク質と被験試料とを接触させる方法は、特に限定されないが、例えば本発明に係る融合タンパク質が発現した生細胞の培養培地に被験試料を添加し、エンドサイトーシス作用によって被験試料を細胞内に取り込ませて接触させてもよい。また、被験試料が細胞内物質の場合には、本発明に係る融合タンパク質を当該細胞内において発現させることによって、接触させてもよい。また、生細胞がない状態であっても、例えば培地中に分泌した本発明に係る融合タンパク質を含む培養液、又は精製した本発明に係る融合タンパク質を用いれば、各発光酵素の基質を同時に存在させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定も可能である。
【０１２６】
本発明に係る標的物質検出方法において、生細胞中に発現させた発光プローブを用いる場合、以下の方法を適用できるが、この方法に限定されない。
（ｉ）本発明に係る発光プローブをコードするポリヌクレオチドを有するプラスミドを、２４穴プレート上の生細胞に導入し、さらに１６時間培養する。
（ｉｉ）上記細胞を被験試料で２０分間刺激する。
（ｉｉｉ）基質共存下で、上記細胞における発光量の変化を発光度計で測定する。
【０１２７】
本発明に係る標的物質検出方法において、本発明に係る発光プローブを用いた非細胞系実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を行った場合、以下の方法を適用できるが、この方法に限定されない。
（ｉ）公知の方法により精製した発光プローブを、直径１．２センチの十字架型紙片の末端に垂らして乾燥させる。
（ｉｉ）上記十字架型紙片のもう一方の末端に刺激物質（リガンド）を含む基質溶液を点滴し、即時に発光Ｓｃａｎｎｅｒ（例えば、ＲＡＳ−３０００；ＦｕｊｉＦｉｌｍ）で発光量の変化を測定する。
【０１２８】
本発明に係る標的物質を検出するための標的物質検出キットは、本発明に係る融合タンパク質を備えていることを特徴としている。また、本キットは、本発明に係る融合タンパク質に含まれる発光酵素の基質を、さらに備えていてもよい。
【０１２９】
ここで、本キットが備える本発明に係る融合タンパク質は、真核細胞内及び原核細胞内において大量発現させた後に精製することが可能である。例えば哺乳動物細胞を用いた場合、従来公知の適切なシグナル配列（例えば、ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ等）を繋いで培地中に大量に分泌させることによって、精製工程なしでも分析に用いることが可能な、大量の融合タンパク質含有培養上清が得られる。また、さらに精製用のタグ（例えば、Ｈｉｓ Ｔａｇ）をつけることで、容易に融合タンパク質を大量精製することができる。
【０１３０】
このようにして得られた融合タンパク質を備えたキットと同様に、本発明に係る融合タンパク質を発現している形質転換体を備えたキットも、被験試料中の標的物質の検出に用いられ得る。また、例えば精製した発光プローブを備える紙ストリップと、発光酵素の基質とを組み合わせたキットは、発光プローブを発現している形質転換体を備えたキットと同様に、外部刺激及びそれによる二次現象であるセカンドメッセンジャーの定性定量分析が可能なキット構成とすることができる。また、本発明に係るポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドにより形質転換される細胞とを備えたキット、及び本発明に係るベクターと当該ベクターにより形質転換される細胞とを備えたキットも、同様に被験試料中の標的物質の検出に用いられ得る。
【０１３１】
〔５．プローブ生産方法及びキット〕
本発明は、さらに、本発明に係るプローブの生産方法及びキットを提供する。本発明に係るプローブの生産方法は、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本方法においては、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換し、本発明に係るプローブを細胞中に発現させることによって、本発明に係るプローブを生産する。細胞中に発現させたプローブは、公知の方法により細胞中から回収し、精製することができる。
【０１３２】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチド又はベクターを用いて細胞を形質転換し、培養した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、本発明に係るプローブを回収、精製することができる。また、細胞中で発現させたポリヌクレオチドに精製用のタグが付加されている場合には、より容易に回収することができる。
【０１３３】
本発明に係るプローブの生産キットは、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを備えていることを特徴としている。また、本キットは、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターにより形質転換される細胞を、さらに供えていてもよい。さらに、本発明に係る融合タンパク質に含まれる酵素の基質を備えていてもよい。また、本発明に係るプローブの生産キットは、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを備えていてもよい。
【０１３４】
本発明では、従来の方法における問題点を克服すべく、酵素の全長を用いる、新規の一分子型プローブとして用いられる融合タンパク質を提供する。例えば、酵素として発光酵素を用いる、新規な生物発光による可視化手段を提供する。また、本発明の手法は、生物発光酵素を用いる基礎原理をも提供している。
【０１３５】
本発明は、酵素にかかる分子の捩れ現象を指標としたユニークな生物分析法を用いるものである。本発明は、酵素の全長を用いるので、酵素として発光酵素を用いた場合には、高輝度の生物発光イメージングが可能である。また、本発明に係る融合タンパク質は、分解、ミスフォールディングなどが起こりにくいので安定性が高い。また、１つの分子内タンパク質間相互作用を指標とするため、非細胞系における生物分析にも適用できる。従って、本発明に係る融合タンパク質は、高精度で安定性の高い分析手段を提供するものであり、かつ、細胞・非細胞系ともに適用できる、簡便な手法を提供するものである。本発明における分析原理は、新薬候補物質のスクリーニング、毒性物質及び環境汚染物質の評価などに広く適用できる。
【０１３６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１３７】
なお、本明細書における用語は、基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人 (1986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992)；R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987) などの参考文献に記載の方法、上記文献に引用された文献に記載の方法、またはこれらと実質的に同一の方法、もしくはその改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質、ペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース（ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）から入手することができる。
【実施例】
【０１３８】
〔実施例１：発光酵素を挿入したストレインプローブの設計〕
まず、ＲＬｕｃ８（１−２３４アミノ酸）、ＧＬｕｃ（１７−１８５アミノ酸）、ＣＢＬｕｃ（１−５１５アミノ酸）、及びＦＬｕｃ（１−５５０アミノ酸）をそれぞれコードするｃＤＮＡに対して、そのＮ末側にＥＲ ＬＢＤのｃＤＮＡを連結し、そのＣ末側にＳｒｃのＳＨ２ドメインのｃＤＮＡを連結して、これらのｃＤＮＡを直鎖状に連結したキメラＤＮＡコンストラクトを作製した（配列番号４〜６、１５）。作製したコンストラクトを、ｐｃＤＮＡ ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンした。
【０１３９】
図６は、ストレインプローブを作製するためのプラスミド構成の一例を示す図である。なお、図６には、ＲＬｕｃ８を挿入したストレインプローブ（ＥＲＳプローブ）を発現させるためのプラスミド（ｐＥＲＳ）のみのＤＮＡコンストラクト構成を示すが、ＧＬｕｃを挿入したストレインプローブ（ＥＧＳプローブ）を発現させるプラスミド（ｐＥＧＳ）、ＣＢＬｕｃを挿入したストレインプローブ（ＥＣＳプローブ）を発現させるプラスミド（ｐＥＣＳ）又はＦＬｕｃを挿入したストレインプローブ（ＥＦＳプローブ）を発現させるプラスミド（ｐＥＦＳ）についてもこれと同様に構成した。
【０１４０】
次に、これらのプラスミドをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）に形質転換した。具体的には、ＣＯＳ−７細胞を、１０％ステロイドフリーウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ製）を含む２４ウエルプレートにおいて、ｃｅｌｌインキュベータ（Ｓａｎｙｏ製）中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。導入試薬としてＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ製）を用いて、ＣＯＳ−７細胞に、ｐＥＲＳ、ｐＥＧＳ、ｐＥＣＳ及びｐＥＦＳ（各ウエル当り０．２μｇ）を一過性形質転換した。形質転換した細胞を、５％ＣＯ２存在下で１６時間インキュベートした。
【０１４１】
得られた形質転換体を用いて、リガンドとして用いた４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の存在下・非存在下それぞれにおける発光強度を観察した。
【０１４２】
まず、作製したｐＥＲＳ、ｐＥＧＳ、ｐＥＣＳ又はｐＥＦＳが導入されたＣＯＳ−７細胞を、ＯＨＴ １０−６Ｍ（終濃度）存在下又は非存在下で２０分間刺激した後、基質としてセレンテラジン又はＤ−ルシフェリン（Ｄ−luciferin）を用いて発光強度を測定した。
【０１４３】
発光強度の測定を以下のとおり行った。ｐＥＲＳが導入されたＣＯＳ−７細胞について、刺激後の細胞を、基質を含む２００μＬの細胞溶解バッファに溶解し、全溶解物を石英セル（４５×１２．５×７．５ｍｍ）に移した。分光光度計（ＦＰ−７５０；Ｊａｓｃｏ社）を用いて、４００ｎｍから７００ｎｍの範囲の発光を測定した（ｎ＝２）。また、ｐＥＲＳ、ｐＥＧＳ、ｐＥＣＳ又はｐＥＦＳが導入されたＣＯＳ−７細胞について、発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ ＬＢ９５０６）を用いて発光強度を測定した。結果を図７及び８に示す。
【０１４４】
図７は、ｐＥＲＳが導入された形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。図７に示すように、ＲＬｕｃ８を挿入したＥＲＳプローブにおいて、ＯＨＴ刺激依存的に発光強度が大幅に増加することが示された。また、発光スペクトルは、４７５ｎｍ近傍において最高値を示した。
【０１４５】
また、図８は、各ストレインプローブをそれぞれ発現する形質転換体の、バックグラウンド（−ＯＨＴ）を１としたときの発光強度の割合を示すグラフである。図８に示すように、それぞれのストレインプローブにおいて、ＯＨＴ刺激依存的に発光強度が増加することが示された。このように、ＯＨＴ刺激によってストレインプローブからの発光強度が大きくなったという結果から、外部刺激を受けることによって、ストレインプローブ自身の代謝回転率が改善される、又はストレインプローブの量子収率が改善されることが示唆された。
【０１４６】
また、図８に示すように、ＲＬｕｃ８を挿入したＥＲＳプローブにおいて、他の発光酵素を挿入したストレインプローブと比較して特に発光強度が大きく増加した。この結果から、外部刺激によるストレインプローブの発光量の変化が、挿入した発光酵素の分子構造に強く依存することが示唆された。すなわち、挿入した発光酵素が、外部からの分子テンションが加わることにより酵素活性部位の構造が変形しやすい分子構造であるか否かが、ストレインプローブの発光量の変化に影響を及ぼすことが示唆された。上述したように、ＲＬｕｃ８は、略球形状であるため、外部からの分子テンションが酵素活性部位に効率よく伝わり、その構造が変形しやすい（ストレインがかかりやすい）構造となっている。したがって、他の発光酵素と比較して、外部刺激による発光強度の増加量が多い結果が得られたと言える。また、ＧＬｕｃは、他の発光酵素に比べて分子量（１８―１８５アミノ酸；１８ｋＤ）が非常に小さいため、外部からの分子テンションが酵素本体に伝わりにくく、その活性部位の構造が変形しにくいため、ＲＬｕｃ８と比較して外部刺激による発光強度の増加量が少ない結果となったと言える。
【０１４７】
また、ＥＲＳプローブを発現する形質転換体からの発光強度は、非常に高かった。これは、ＥＲＳプローブが、ＲＬｕｃ８の全長をそのまま含んでいるためであると言える。
【０１４８】
このように、本発明に係るストレインプローブを用いれば、様々なタンパク質―タンパク質間の相互作用を高感度、かつ高い発光強度で測定できることが示された。
【０１４９】
〔実施例２：ストレインプローブの基質選択性〕
次に、ＥＲＳプローブにおける発光酵素ＲＬｕｃ８の基質選択性について調べた。ＣＯＳ−７細胞を１２穴プレートにおいて十分に培養した後、脂質試薬を用いてｐＥＲＳをＣＯＳ−７細胞に導入し、さらに１６時間培養した。その後、この細胞を溶媒又はＯＨＴ１０−６Ｍ（終濃度）により２０分間刺激し、種々の基質の共存下又は非存在下（バックグラウンド）における発光強度を実施例１と同様に、分光光度計（ＦＰ−７５０；Ｊａｓｃｏ社）を用いて測定した。基質として、図９に示すセレンテラジン（coelenterazine）（ｃｏｅｌｅ）、セレンテラジンｃｐ（ｃｐ）、セレンテラジンｈｃｐ（ｈｃｐ）、セレンテラジンｆｃｐ（ｆｃｐ）、セレンテラジンｉｐ（ｉｐ）、及びセレンテラジン４００Ａ（４００Ａ）を用いた。なお、図９において、重要なサイドチェーンにあたる部位を破線によって囲んで示した。結果を図１０及び１１に示す。
【０１５０】
図１０は、種々の基質共存下における、ｐＥＲＳを導入したＣＯＳ７細胞の発光スペクトルを示すグラフである。また、図１１は、種々の基質共存下におけるｐＥＲＳを導入したＣＯＳ７細胞の、バックグラウンドを１としたときの発光スペクトルのピーク強度の割合を示すグラフである。図１０及び図１１に示すように、いずれの基質を用いた場合であっても発光強度はＯＨＴ依存的に増加したが、基質の種類によって、その増加率が異なっていた。発光強度は、セレンテラジンを用いた場合が最も高かった（図示せず）。一方、バックグラウンドに対するシグナル比率は、セレンテラジンｆｃｐを用いた場合が最も大きかった。
【０１５１】
この結果から、実験の目的に応じて基質を使い分けることができることが示唆された。また、各セレンテラジンのサイドチェーンを比較することによって、本発明のストレインプローブの基質における＾重要なサイドチェーンを同定し得ることが示唆された。
【０１５２】
また、ＲＬｕｃ８を単独で用いた場合、又はＥＲＳを用いた場合の発光強度を、同様の方法を用いて測定した。ＲＬｕｃ８の全長をコードするｃＤＮＡのみをｐｃＤＮＡ ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンしてプラスミドを構築し、当該プラスミドをＣＯＳ−７細胞に形質転換することによって、ＲＬｕｃ８を単独で発現した形質転換体を得た。結果を図１２に示す。
【０１５３】
図１２は、ＲＬｕｃ８を単独で発現した形質転換体、又はＥＲＳを発現した形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。図１２に示すように、セレンテラジンｆｃｐ共存下において、ＲＬｕｃ８を単独で発現した形質転換体においては、ＯＨＴ依存的な発光スペクトルの変化が見られなかったが、ＥＲＳを発現した形質転換体では、ＯＨＴ依存的な発光スペクトルの変化が見られた。
【０１５４】
〔実施例３：ＥＲＳのリガンド依存性、検出限界及びリガンド選択性〕
まず、ＥＲＳのリガンド依存性及び検出限界について調べた。１２穴プレートにおいて培養したＣＯＳ−７細胞に、ｐＥＲＳを導入（トランスフェクト）した後、さらに１６時間培養した。その後、この細胞を種々の濃度のＯＨＴ又はテストステロン（Ｔ：testosterone）により２０分間刺激し、次いでライセート試薬を１５分間導入することによってライセートを作製した。作製したライセートについて、基質としてセレンテラジンの共存下において、発光強度の変化を発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ ＬＢ９５０６）を用いて測定した。結果を図１３に示す。
【０１５５】
図１３は、ＥＲＳを発現した形質転換体におけるリガンド応答曲線を示す図である。図１３に示すように、ＥＲＳを発現した形質転換体における発光強度は、濃度約１０−１０のＯＨＴ刺激によって増加しはじめ、濃度１０−７近傍において最高値に達した。一方、テストステロンの刺激に対しては、発光強度の増加による応答は見られなかった。これにより、ＥＲＳは、ＯＨＴに特異的に応答することが示された。
【０１５６】
次に、ＥＲＳに及ぼすＥＲ ＬＢＤのリン酸化の影響、及び発光強度の変化に及ぼすＥＲＳの一分子型構造変化の影響を調べた。ＥＲ ＬＢＤのリン酸化部位であるＹ５３７に変異を導入した、ＥｍＲＳプローブを発現するプラスミドを構築し、これをＣＯＳ−７細胞に導入した形質転換体を得た。また、図１５に示すように、ＲＬｕｃ８のＮ末側にＥＲ ＬＢＤのみをつなげたプローブ（ＥＲプローブ）を発現させるためのＤＮＡコンストラクト構成を有するプラスミド（ｐＥＲ）、ＲＬｕｃ８のＣ末側にＳＨ２ドメインのみをつなげたプローブ（ＲＳプローブ）を発現させるためのＤＮＡコンストラクト構成を有するプラスミド（ｐＲＳ）をそれぞれ構築した。そして、構築したｐＥＲ及びｐＲＳを同時にＣＯＳ−７細胞に導入した形質転換体（ＥＲ＋ＲＳ）を得た。
【０１５７】
得られた形質転換体をＯＨＴ又は０．ｌ％ＤＭＳＯ（コントロール）によって刺激し、その発光強度を上記と同様の方法により測定し、比較した。結果を図１４に示す。図１４は、ＥＲＳ、ＥｍＲＳ、並びにＥＲ及びＲＳをそれぞれ発現した形質転換体の、コントロールを１としたときの相対発光強度を示すグラフである。
【０１５８】
図１４に示すように、ＥＲＳを発現した形質転換体は、ＯＨＴ刺激に対して、コントロールと比較して約３倍の発光強度を示した。一方、ＥｍＲＳを発現した形質転換体は、ＯＨＴ刺激に対する発光強度の増加は、コントロールと比較して約１．７倍であった。これにより、リン酸化部位を変異したＥｍＲＳにおいては、外部刺激によるＥＲ ＬＢＤとＳＨ２ドメインとの相互作用が生じにくく、外部刺激に依存した発光量の変化が見られにくいことが示唆された。
【０１５９】
また、ＥＲ及びＲＳを共発現する形質転換体（ＥＲ＋ＲＳ）においては、ＯＨＴ刺激に対して発光強度の増加が認められなかった。ここで、図１６に、ＥＲ及びＲＳの構造を模式的に示す。図５に示すＥＲＳとを比較して、図１６に示すＥＲ及びＲＳが共発現する形質転換体（ＥＲ＋ＲＳ）においては、ＯＨＴの刺激によりＳＨ２ドメインとＥＲ ＬＢＤとが相互作用したとしても、ＲＬｕｃ８に外部からの分子テンションが加わらない。したがって、ＲＬｕｃ８に変形、すなわち捩れが生じないので、その酵素活性部位が変形せず、発光強度が増加しなかった。
【０１６０】
次に、ＥＲＳにおけるリガンド選択性を調べた。図１７に示す、ＯＨＴ、Ｅ２（１７β−エストラディオール）、及びパーシャルアゴニスト（partial agonist）であるゲニステイン（Genistein）、ならびにデヒドロテストステロン（ＤＨＴ：5α-dihydrotestosterone）、テストステロン（Ｔ）、及びコルチゾール（cortisol）を、リガンドとして用いた。濃度１０−６Ｍの各リガンドを用いて、ＥＲＳを発現した形質転換体を刺激した後、上記と同様の方法により発光強度を測定し、リガンドの代わりに溶媒を用いた場合（vehicle）の発光強度と比較した。結果を図１８に示す。
【０１６１】
図１８は、ＥＲＳを発現した形質転換体の、種々のリガンド応答による発光強度を示すグラフである。ＥＲＳを発現した形質転換体は、ＯＨＴ及びＥ２に対してほぼ同等の発光強度の増加を示した。また、ゲニステインに対して、ＯＨＴ及びＥ２よりは低いが、発光強度の増加を示した。一方、ＤＨＴ、テストステロン、及びコルチゾールに対しては、発光強度の増加を示さなかった。
【０１６２】
この結果から、ＥＲＳが女性ホルモン受容体に特異的なリガンド感受性を有することが示された。また、ＥＲＳがリガンドに対して感度よく応答できることが示された。
【０１６３】
〔実施例４：発光酵素と蛍光タンパク質とを組み合わせて挿入したストレインプローブの設計〕
まず、蛍光タンパク質ＥＹＦＰをコードするｃＤＮＡを、ＲＬｕｃ８（１−２３４アミノ酸）をコードするｃＤＮＡのＮ末側に連結した。連結したｃＤＮＡに対して、そのＮ末側にさらにＥＲ ＬＢＤのｃＤＮＡを連結し、そのＣ末側にＳｒｃ ＳＨ２ドメインのｃＤＮＡを連結して、このｃＤＮＡを直鎖状に連結したキメラＤＮＡコンストラクトを作製した（配列番号１６）。作製したコンストラクトを、ｐｃＤＮＡ ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンした。
【０１６４】
図１９は、ストレインプローブを作製するためのプラスミド構成の一例を示す図である。図１９には、ＥＹＦＰのＣ末側にＲＬｕｃ８を連結したものを挿入したストレインプローブ（ＥＥＲＳプローブ）を発現させるためのプラスミド（ｐＥＥＲＳ）のＤＮＡコンストラクト構成を示す。
【０１６５】
次に、実施例１に示した方法と同様の方法を用いて、このプラスミドをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）に形質転換し、得られた形質転換体を用いて、ＯＨＴの存在下・非存在下それぞれにおける発光強度を測定した。結果を図２０に示す。
【０１６６】
図２０は、ｐＥＥＲＳが導入された形質転換体における発光スペクトルを示すグラフである。図２０に示すように、ＥＹＦＰ及びＲＬｕｃ８を挿入したＥＥＲＳプローブにおいて、ＯＨＴ刺激依存的に発光強度が増加することが示された。
【０１６７】
この結果から、以下のことが示された。図２１に示すように、リガンド（ＯＨＴ）がない条件では、リガンド結合タンパク質（ＥＲ ＬＢＤ）と認識タンパク質（Ｓｒｃ ＳＨ２）とが相互作用せず、ＥＹＦＰとＲＬｕｃ８との間の生物発光共鳴エネルギー移動が弱いため、発光強度は弱かった。一方、リガンドにより刺激されると、リガンドがリガンド結合タンパク質に結合し、この結合を認識タンパク質が認識することにより、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが相互作用する。リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との相互作用は、必然的にその間に存在する発光酵素（ＲＬｕｃ８）及び蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）に一定の構造的な変形（ストレイン）を引き起こし、発光酵素と蛍光タンパク質との間の生物発光共鳴エネルギー移動が影響を受けることによって、発光プローブからの酵素活性度、すなわち発光総量が増加した。すなわち、ＥＥＲＳプローブは、その内部において発光共鳴エネルギー移動を起こすものであることが示された。
【０１６８】
したがって、本発明に係る発光プローブは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に、酵素を含む２つのタンパク質分子を挿入した場合においても、リガンド依存的な酵素活性度の変化が起こり得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明に係る融合タンパク質は、発光強度が高く、設計が容易であるので、バイオ産業、医薬品産業、食品産業等の広範な分野に応用することができる。特に、診断医療分野、ナノバイオ分野、薬理作用評価分野、環境分析分野等において、好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を検出する融合タンパク質であって、
前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、
前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、
前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、
前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加するものであることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記酵素は略球形状であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記酵素は発光酵素であり、
前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する蛍光タンパク質をさらに有することを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記発光酵素は、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項３または４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記一次結合タンパク質は、核内受容体、サイトカイン受容体、タンパク質キナーゼ、セカンドメッセンジャー認識タンパク質、及び転写因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記一次結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、前記二次結合タンパク質がＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインであり、前記発光酵素がウミシイタケルシフェラーゼであることを特徴とする請求項３または４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記一次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第１リンカーと、前記二次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第２リンカーとをさらに備え、
前記第１リンカー及び前記第２リンカーはそれぞれ、５アミノ酸以下のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第１リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列からなり、前記第２リンカーは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質；あるいは
配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一であり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１６】
被験試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記被験試料と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を備えていることを特徴とする被験試料中の標的物質を検出するためのキット。
【請求項１８】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
【請求項１９】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
【請求項２０】
請求項１３に記載のベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載のベクターを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
【請求項１】
標的物質を検出する融合タンパク質であって、
前記標的物質が結合する結合部位を有する一次結合タンパク質と、
前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを認識する二次結合タンパク質と、
前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する、活性型の酵素又はその前駆体とを有し、
前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加するものであることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記酵素は略球形状であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記酵素は発光酵素であり、
前記一次結合タンパク質に前記標的物質が結合したことを前記二次結合タンパク質が認識した場合に、発光量を増加させるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記一次結合タンパク質と前記二次結合タンパク質との間に位置する蛍光タンパク質をさらに有することを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記発光酵素は、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項３または４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記一次結合タンパク質は、核内受容体、サイトカイン受容体、タンパク質キナーゼ、セカンドメッセンジャー認識タンパク質、及び転写因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記一次結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、前記二次結合タンパク質がＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインであり、前記発光酵素がウミシイタケルシフェラーゼであることを特徴とする請求項３または４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記一次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第１リンカーと、前記二次結合タンパク質と前記酵素とを連結する第２リンカーとをさらに備え、
前記第１リンカー及び前記第２リンカーはそれぞれ、５アミノ酸以下のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第１リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列からなり、前記第２リンカーは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質；あるいは
配列番号１〜３及び１３〜１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは
配列番号４〜６及び１５〜１６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一であり、一次結合タンパク質に標的物質が結合したことを二次結合タンパク質が認識した場合に、酵素活性度を増加する融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１６】
被験試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記被験試料と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を備えていることを特徴とする被験試料中の標的物質を検出するためのキット。
【請求項１８】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
【請求項１９】
請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
【請求項２０】
請求項１３に記載のベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載のベクターを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図７】
【図１０】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図７】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−６７１９０（Ｐ２０１１−６７１９０Ａ）
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８７５９（Ｐ２０１０−１８７５９）
【出願日】平成２２年１月２９日（２０１０．１．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２９日（２０１０．１．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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