三置換ベンゾピラノンの使用
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への三置換ベンゾピラノンの使用、新規な三置換ベンゾピラノンおよびその生理学的に許容できる塩、およびこれらの化合物を含有する植物抽出物、薬物、食品および製剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への三置換ベンゾピラノンの使用と、新規な三置換ベンゾピラノンおよび生理学的に許容できるその塩とに関する。さらに本発明は、植物抽出物、薬物、食品および製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
遊離基とは、外部軌道内に不対電子を有する原子または分子である。生体内作用にとって最も重要な遊離基とは、還元によって異なる代謝産物を形成することができる酸素分子である。これらの代謝産物は、一般に「活性酸素種」（ＲＯＳ）という総称で呼ばれている。ＲＯＳの例としては、超酸化物アニオン、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、過酸化物アニオン、一重項酸素、次亜塩素酸塩、窒素酸化物および過酸化亜硝酸が挙げられる。
ＲＯＳは、様々な生体内作用によって自然発生する。細胞を微生物、生体異物あるいは内在物質で刺激した後、スーパーオキシドラジカルおよび他のＲＯＳが、膜状ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化することによって酸素分子から発生する反応生成物として形成されるといういわゆる白血球の「呼吸バースト」は、特に重要である。呼吸バーストとは、初期の非特異免疫防御の最も重要な機構の一つであり、主に、侵入した感染体および腫瘍細胞を死滅させる役割を果たす。さらに、ＲＯＳは、不十分な共役反応に起因する電子の漏出によって主に発生する。これは、例えば、ミトコンドリア呼吸中の、虚血性状態におけるヒポキサンチンのキサンチンオキシダーゼ触媒酸化によるアラキドン酸からのプロスタグランジンおよびロイコトリエンの合成または生体異物のシトクロムＰ４５０媒介代謝の過程において生ずる。
【０００３】
呼吸バーストが基本的に感染からの防御における望ましい反応であるのに対し、形成されるＲＯＳの増加およびＲＯＳの連続した形成は通常望ましくない。その理由は、酸化攻撃は侵入してくる微生物に限られておらず、しかも生体組織がそれらの毒性に曝されるからである。これは、とりわけ、自己免疫疾患の経過中におけるＲＯＳの形成の増加のごとき非感染性疾患、虚血の経過中における変性疾患、または医薬品の代謝に当てはまる。遊離基およびＲＯＳの好ましからざる効果は、それらと核酸（例えば、ＤＮＡ鎖切断の誘発）、タンパク質（例えば、変性、酵素系の不活性化）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸の解重合）およびとりわけ脂質（例えば、脂質過酸化反応、粘膜の病変、炎症性プロスタグランジンおよびロイコトリエンの形成）との相互作用に基づく。
活性酸素種（ＲＯＳ）が様々な病気の発症に関わっていることは約５０年前に言明されていたが、今日、これらの分子が、様々な病気、例えば糖尿病Ｉ型およびＩＩ型、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、ぜんそく、潰瘍性大腸炎、乾癬）、細菌感染およびウイルス感染（例えば、インフルエンザ、エイズ、ウイルス性肝炎）、アテローム性動脈硬化性、虚血、神経系の病気（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性病）、白内障、鎌状赤血球貧血および腫瘍の発症において重要な役割を果たしていること、および、これらの分子が老化プロセスにも関与していることは確かであると考えられている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
生物は、遊離基やＲＯＳの悪影響から防御するための様々な防御システムを備えている。前記防御システムとしては、ビタミン（例えば、ビタミンＥおよびビタミンＣ）および他の低分子化合物（例えば、グルタチオン、尿酸）、抗酸化酵素（例えば、スーパオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ）並びに金属結合タンパク質（例えば、トランスフェリン、セルロプラスミン）が挙げられる。しかしながら、生体の抗酸化システムは、病的過程の初期段階において活発になることが多い。その理由は、単に、進行中の病的過程において形成されるＲＯＳの濃度の増大が内部防御機構の容量をはるかに上回ってしまうからである。
【０００５】
従って、酸化的ストレスは、ＲＯＳの濃度と抗酸化防御システムの間の不均衡であると考えられる。従って、数多くの疾病に関してのＲＯＳの突出した重要性により、そのような病的状態の予防および治療に用いることができる抗酸化性を有する物質に多大な関心が寄せられている。
ＲＯＳは炎症反応にとってとりわけ重要であり、酸化的ストレスは炎症性エイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）の合成の増加を伴うことが多い。従って、とりわけ、抗酸化性を示し尚且つこれらの炎症メディエータの形成を妨げる物質が求められている。
【非特許文献１】Ａ． Ｂｅｎｄｉｃｈ（１９９４） ｉｎ： Ｂ． Ｆｒｅｉ（ｅｄ．） “Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐ． ４４７
【非特許文献２】Ｅ． Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ（１９９７） Ｊ． Ｎｕｔｒ． １２７， ９６２ Ｓ
【非特許文献３】Ｄ． Ｖ． Ｐａｒｋｅ（１９９９） ｉｎ： Ｔ． Ｋ． Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．） “Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ”， ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ｐ． １
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態を治療または予防するための化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への一般式Ｉ
【０００８】
【化１】
【０００９】
式中、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｈまたはそれらの生理学的に許容できる塩を表す、
で表される化合物の使用によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
驚くべきことに、６，７，８−トリヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩ）は特に有利な薬理学的特性を示すことが分かった。強力な抗酸化作用に加えて、この化合物は、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンの合成および炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の合成も示す。従って、化合物ＩＩは、酸化的ストレスを伴う病気、例えば糖尿病Ｉ型および／またはＩＩ型、アテローム性動脈硬化性および内皮機能不全、虚血、神経系の病気（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性病）、白内障および腫瘍を治療または予防するのに基本的に好適である。しかしながら、化合物ＩＩは、炎症成分を有する病気、例えば関節リウマチ、ぜんそく、潰瘍性大腸炎、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、乾癬、神経皮膚炎、細菌やウィルスによる感染（例えば、インフルエンザ、エイズ、ウイルス性肝炎）および他の病原体（例えば、寄生虫、菌類およびプリオン）に対して特に有利である。化合物ＩＩは、文献（Ｏ． Ｋａｙｓｅｒ ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９， １１８１−１１８５（１９９５）； Ｓ． Ｋｕｍａｒ， Ａ． Ｂ． Ｒａｙ， Ｃ． Ｋｏｎｎｏ， Ｙ． Ｏｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｈ． Ｈｉｋｉｎｏ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７， ６３６−６３８（１９８８）； Ｋ． Ｐ． Ｌａｔｔｅ， Ｏ． Ｋａｙｓｅｒ， Ｎ． Ｔａｎ， Ｍ． Ｋａｌｏｇａ ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ， Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ． ５５ｃ， ５２８−５３３（２０００））にすでに記載されているが、化合物ＩＩの薬理効果は未だ不明である。化合物ＩＩは、ペラルゴニウムシドイデスにはわずか０．０００４％しか含有されておらず（Ｋａｙｓｅｒら、Ｌａｔｔｅら、上記参照）、ペラルゴニウムレニフォルメにはわずか０．０２％しか含有されていない（Ｌａｔｔｅら、上記参照）。これより、化合物ＩＩは、これらの低い濃度において、ペラルゴニウムシドイデスおよびレニフォルメの生物学的効率に多大な貢献はしていないと結論付けられる。
従って、本発明の主題は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への化合物ＩＩの使用である。
【００１１】
化合物ＩＩは、一般式Ｉの硫酸エステルの形態で投与することも可能である。これは、化合物ＩＩが経口投与時にそれらの化合物から放出されるからである。このため、一般式Ｉの化合物は、前述の病的状態の治療または予防にも好適である。一般式Ｉの好ましい化合物としては、６，７−ジヒドロキシ−８−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（Ｒ６＝Ｒ７＝Ｈ； Ｒ８＝ＳＯ３Ｈ）および７，８−ジヒドロキシ−６−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ； Ｒ６＝ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（Ｒ６＝Ｒ８＝ＳＯ３Ｈ； Ｒ７＝Ｈ； 化合物ＩＩＩ）が特に好ましい。残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物は新規である。従って、これらの化合物、とりわけ化合物ＩＩＩ、並びに酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防へのそれらの使用も本発明の一部である。
【００１２】
【化２】
【００１３】
一般式Ｉにおいて、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素原子またはＳＯ３Ｈ残基である。一般式Ｉの化合物並びに化合物ＩＩおよびＩＩＩは、それらの生理学的に許容できるアルカリ金属、アルカリ土類金属および他の塩、例えばカリウム塩、の形態をとることもできる。これらの塩も本発明の主題である。
【００１４】
さらに、植物抽出物、とりわけ、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物を１種以上含有するペラルゴニウム種からの植物抽出物も、本発明の一部を形成する。これにより、植物抽出物の乾燥物中の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種の濃度が０．１％〜１０％である植物抽出物が好ましく、前記濃度が０．５％〜５％である植物抽出物が特に好ましい。前記乾燥物は、Ｐｈ． Ｅｕｒ．（流体抽出物）に応じた乾燥残留物に相当する。この場合、例えば流体抽出物に直接分析を施すこともでき、乾燥残留物は計算によって求めることができる。
【００１５】
化合物ＩＩの調製は、例えば市販のフラキシンまたは残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物の加水分解および／またはエーテル開裂によって行うことができる。
【００１６】
残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物の調製は、化合物ＩＩを三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体と反応させることによって、または化合物ＩＩＩの場合、好適な植物材料、例えばペラルゴニウムシドイデスの乾燥した根から単離することによって達成することができる。化合物６，７−ジヒドロキシ−８−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（一般式Ｉ； Ｒ６＝Ｒ７＝Ｈ； Ｒ８＝ＳＯ３Ｈ）および７，８−ジヒドロキシ−６−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（一般式Ｉ； Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ； Ｒ６＝ＳＯ３Ｈ）も、化合物ＩＩＩを部分加水分解することによって得ることができる。
【００１７】
本発明による抽出物は、例えば水、メタノール、エタノール、アセトン等およびこれらの混合物のごとき溶媒を用いる公知の調製法によって、室温〜６０℃の温度で、１０分間〜２４時間、ゆっくり〜激しく攪拌しながらまたは濾過によって、ペラルゴニウム植物またはその一部から、様々な組成で得ることができる。好ましい抽出溶媒は、水またはエタノールと水との混合物である。前記混合物中の水の割合は少なくとも５０重量％であり、エタノール／水の比率は、１０／９０〜１５／８５（ｗ／ｗ）であることが特に好ましい。本発明による一般式Ｉの化合物をさらに濃縮するために、さらなる濃縮、例えば１−ブタノール／水またはエチルアセテート／水を用いた液液分配、イオン交換体、ＬＨ２０、ＨＰ２０および他の樹脂を用いた吸脱着またはＲＰ１８、シリカゲル等を用いたクロマトグラフ分離を行ってもよい。必要に応じて、それ自体公知の方法に従って、高温および／または低圧において溶媒を取り除くことによってまたは凍結乾燥によって、乾燥抽出物を得るためのさらなる処理を行ってもよい。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａによれば、乾燥抽出物は、一般に、少なくとも９５重量％の乾燥残留物を有する。
【００１８】
本発明による一般式Ｉの化合物およびそれら化合物のうちの少なくとも１種を含有する抽出物は、粉末、顆粒、錠剤、糖衣錠あるいはカプセルの形態でまたは溶液として、好ましくは経口で投与することができる。
投与量としては、一般式Ｉの化合物の１種以上が１日当たり０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは１日当たり０．３〜５０ｍｇ投与される。
【００１９】
錠剤を調製するには、一般式Ｉの化合物の少なくとも１種または対応する抽出物を、好適な生理学的に許容できるアジュバント、例えばラクトース、セルロース、二酸化ケイ素、クロスカルメロースおよびステアリン酸マグネシウムと混ぜ合わせ、プレスして錠剤にする。前記錠剤は、任意に、例えばヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、着色剤（例えば、酸化チタン、酸化鉄）およびタルクからなる好適なコーティングを施されていてもよい。
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態における化合物ＩＩの効果は、下記実験によって立証される。
【実施例】
【００２０】
抗酸化性
脂質の自動酸化は発光を伴う。この非常に弱い化学発光の測定は、過酸化物の定量化と酸化防止剤の効力の評価との両方に用いることができる。本研究では、オスのネズミ（ＮＭＲＩ； ２０〜３０ｇ； Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ， Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）の脳組織を、脂質が豊富な組織として用いた。脳を摘出後、よく冷えたリン酸塩緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）で洗浄し、髄膜および残った血を取り除いた。組織サンプルを、前記サンプルの体積（ｖ／ｗ）の４倍のＰＢＳと均質化させ、１，０００ × ｇ および４℃で１０分間遠心分離機にかけた。直ちに、上澄み液を同じ緩衝液で３倍に希釈し、氷の上で保存した。２５０μｌの希釈済み上澄み液を試験管に移し、３７℃において、６チャネル照度計（Ｍｕｌｔｉ−Ｂｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ ９５０５ Ｃ， Ｂｅｒｔｈｏｌｄ， Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ）で１０分間培養した。２．５％ＤＭＳＯを添加したＰＢＳに２５μｌの化合物ＩＩを添加した後、さらに１０分間培養を続けた。その後、化学発光（ＣＬ）の強度を６０分間にわたって測定した。自動酸化の抑制の比率を、同時に測定した溶媒対照（２．５％ＤＭＳＯを添加したＰＢＳ）と比較して計算した。化合物ＩＩは、５３ｎｇ／ｍｌの半最大抑制濃度において、脂質の自動酸化を優れた効力で抑制した（図１）。一方、抗酸化性の測定において基準物質としてしばしば用いられるＴｒｏｌｏｘは、１６６５ｎｇ／ｍｌの半最大抑制濃度を示したに過ぎなかった。
図１は、脂質の自動酸化に対する化合物ＩＩおよびＴｒｏｌｏｘの作用を示す。３つの独立した試験からの溶媒対照と比較した脂質過酸化の抑制の比率（平均値±ＳＤ）が示されている。
【００２１】
炎症性サイトカインの合成の抑制
炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の合成に対する化合物ＩＩの作用を、活性化マウス腹腔マクロファージを用いて測定した。前記活性化マクロファージを得るために、０．５ｍｌのＰＢＳ中の３ｘ１０９個の死菌コリネバクテリアパルバムバクテリア（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｙａｎｓｈｅｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）を、オスのＮＭＲＩマウス（Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ， Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内に注入した。６日後、腹腔を、カルシウムおよびマグネシウムを含有せず且つ１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを添加した２．５ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。細胞を、１０％のウシ胎仔血清が添加された完全ＲＰＭＩ培地に、１ｍｌ当たり２ｘ１０６個の濃度で再懸濁させた。２００μｍの細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに充填した。２時間の培養期間の後、非接着性細胞を取り除きし、残った細胞ローンを培養液（３７℃）で２度洗浄した。マクロファージを化合物ＩＩを用いて３０分間予備培養させた後、１μｇ／ｍｌの大腸菌のリポポリサッカライド（血清型０１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を添加することによって炎症性サイトカインの合成を誘発させた。２４時間（３７℃、空気中のＣＯ２濃度：５％）培養させた後、凍結および解凍を３回繰り返すことによって細胞を溶解させ、細胞上澄み液を回収し、分析するまで−８０℃で凍らせておいた。細胞上澄み液中のサイトカインの濃度の測定は、製造業者の手引きに従って市販の検査キット（Ｄｕｏｓｅｔｓ ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６、Ｒ＆Ｄ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）を用いて行った。すべての調査は３回行った。サイトカインの合成に対する化合物ＩＩの作用を、同時に試験した溶媒対照（完全ＲＰＭＩ培地中の０．１％ＤＭＳＯ）と比較して評価した。下記表１から分かるように、１００μｇ／ｍｌの濃度における化合物ＩＩは、３つの測定サイトカインすべての合成に対して著しい抑制効果を示したが、ＩＬ−６の製造に対する効果が最も高かった。
【００２２】
【表１】
【００２３】
ヒト全血におけるシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ活性の抑制
ヘパリン化ヒト全血を検査に用いた。１００μｌの全血を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに充填した。独立したプレートを用いて、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ１）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯ）活性の測定およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）の誘導を行った。
【００２４】
ＤＭＳＯ（最終濃度：０．１％）を溶解促進剤として用い、１％の抗生物質／抗真菌剤溶液と２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）とで、化合物ＩＩをＤＭＥ培地（ＤＭＥＭ）中で希釈した。５０μｌの化合物ＩＩを添加した後、試験対象を３７℃で６０分間培養させた。その後、５０μｌのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（最終濃度：５０μＭ）を添加することによって、エイコサノイド合成を促進させた。３７℃でさらに３０分間培養させた後、マイクロタイタープレートを４℃において５分間、１，５００ｇで遠心分離機にかけた。血漿をピペットで取り、分析するまで−８０℃で凍らせておいた。
【００２５】
ＣＯＸ２活性を検証するために、血液サンプル（１００μｌ／ウェル）を、まずアスピリン（ＤＭＥＭ中の５０μｌ、最終濃度：１２μｇ／ｍｌ）で、３７℃において６時間予備処理することによって、ＣＯＸ１を不活性化させた。その後、化合物ＩＩおよび溶媒（０．１％のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ）を、それぞれ２５μｌずつ添加した。さらに、ＣＯＸ２の発現を誘発するために、２５μｌの大腸菌のリポポリサッカライド（血清型０１２７：Ｂ８、最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で１８時間培養させた後、上記のようにして血漿を採取し、分析するまで−８０℃で凍らせておいた。
【００２６】
血漿サンプルについて、ＴＸＢ２、ＰＧＥ２およびシステニルロイコトリエン（システニル−ＬＴ）を、ＣＯＸ１活性、ＣＯＸ２活性およびＬＯ活性についてのパラメータとして測定した。分析のために、市販のＥＩＡ検査キット（ＴＸＢ２およびＰＧＥ２： Ｃａｙｍａｎｎ／ＢＬ， Ｈａｍｂｕｒｇ； システニルロイコトリエン： ＣＡＳＴ−２０００， Ｍｉｌｅｎｉａ， Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ）を製造業者の手引きに従って用いた。その結果（表２参照）から、化合物ＩＩはＣＯＸ２およびＬＯの活性を強力に抑制する効果を示すことが明らかとなった。一方、ＣＯＸ１の活性はほとんど影響を受けなかった。この効力範囲は非常に有利であるととらえられるべきである。なぜならば、化合物ＩＩの治療的使用において、ＣＯＸ１抑制剤に特有である副作用、例えば消化管の合併症（浸食、潰瘍）または血小板の凝集の抑制に因る出血、を考慮する必要が無くなるからである。
【００２７】
【表２】
【００２８】
実施例１： ６，７，８−トリヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩ）の調製
２０ｇ（４２．７ｍｍｏｌ）の６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンカリウム塩を４８０ｍｌの約２Ｎの塩酸に投入し、４０〜５０℃で２０時間攪拌した。冷却後、沈殿した粗生成物を濾別し、水で再結晶化させた（熱濾過）。得られた結晶化物を濾別および洗浄した後、１００℃で真空乾燥させた。５．９ｇ（７１％）、融点：２６０℃で分解開始。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲは、Ｏ．Ｋａｙｓｅｒ ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ （Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９， １１８１−１１８５（１９９５））の指摘に適合している。
【００２９】
実施例２： ６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンカリウム塩（化合物ＩＩＩのカリウム塩）の単離および構造決定
１５ｋｇのペラルゴニウムシドイデスの根を、室温において、７５ｌの水および４０ｌの水で濾過した。得られた水性抽出物をそのおよそ１／３にまで濃縮した後、７ｋｇの硫酸アンモニウムを添加し、そして２−ブタノン／エタノールの３／２混合物で数回抽出した。得られた有機相を混ぜ合わせ、蒸発によって濃縮した。
この残留物をＨＰ２０カラム（溶離液：水）でクロマトグラフ分析した。６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン成分を濃縮し、水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを８に調節し、エタノールで１／１の割合で希釈した。得られた沈殿物を濾別し、水中に懸濁させた。水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを１０．７に調節し、エタノールで１／１の割合で希釈した。その結果として得られた沈殿物を熱湯に再溶解させた。得られた溶液を濾過し、エタノールで１／１の割合で希釈した。沈殿した結晶化物を濾別および洗浄した後、５０℃で真空乾燥させた。２７．６ｇ（植物材料に対して０．１４％、遊離酸として計算）。
融点：２１６℃で分解開始；Ｃ９Ｈ３Ｋ３Ｏ１１Ｓ２（４６８．５５） 実測値：Ｃ ２３．０８％、 Ｈ ０．７０％、Ｋ ２４．６５％、Ｓ １３．９％ − 計算値： Ｃ ２３．０７％、 Ｈ ０．６５％、Ｋ ２５．０４％、Ｏ ３７．５６％、Ｓ １３．６９％； １ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．６２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ、Ｈ−４）、７．０３（ｓ，Ｈ−５）、５．５９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ、Ｈ−３）、１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．９（Ｃ−７）、１６１．９（Ｃ−２）、１４７．７（Ｃ−８）、１４５．１（Ｃ−４）、１４２．２（Ｃ−６）、１３０．４（Ｃ−８ａ）、１１５．５（Ｃ−５）、１０２．４（Ｃ−３）、１０１．５（Ｃ−４ａ）。
【００３０】
トリヒドロキシクマリン二硫酸カリウム塩の酸加水分解によって、６，７，８−トリヒドロキシクマリンが得られた（実施例１参照）。さらなる構造決定のため、下記反応順序に従って、化合物ＩＩＩを誘導体化させた。
【００３１】
【化３】
【００３２】
このために、トリヒドロキシクマリン二硫酸カリウム塩を、炭酸カリウムの存在下、６０℃においてＤＭＦ中でヨウ化メチルと反応させて、対応する７−メチルエーテルを得た。濃塩酸で酸性化させた後、反応混合物を５０℃で２４時間攪拌し、酢酸エチルで抽出し、シリカゲル（溶離液：ヘプタン／酢酸エチル ７／３）でクロマトグラフ分析した。６，８−ジヒドロキシ−７−メトキシクマリンが得られた。これを、炭酸カリウムおよびヨウ化カリウムの存在下、室温においてＤＭＦ中で臭化ベンジルと反応させた。得られた混合物を濃縮し、残留物を水とＴＢＭＥとの間に分散させた。得られた有機相を濃縮し、シリカゲル（溶離液：トルエン／エタノール ９５／５）でクロマトグラフ分析した。６，８−ジベンジルオキシ−７−メトキシクマリンが得られた。
【００３３】
後者の化合物の置換パターンを、ＣＤＣｌ３中において、一次元および二次元ＮＭＲ分光法によって求めた。Ｈ−５とＣＨ２信号の１つとの間の明白なＮＯＥＳＹ相関関係により、６位におけるベンジルオキシ残基の存在が明確に導き出される。さらに、ＯＣＨ３信号は、メトキシ基が２つのベンジルオキシ残基の間、すなわち、７位に位置することを示す両方のＣＨ２信号と相関関係がある。Ｃ−７とＨ−５並びにＯＣＨ３との間、並びにＣ−８とＨ−４並びに８−ＣＨ２との間のＨＭＢＣ相関関係は、置換パターンがＮＯＥＳＹから派生していることを裏付けている。トリヒドロキシクマリジサルフェートのスルホキシ残基は６位と８位との間に結合していることは、調査した誘導体の調製手順およびその構造から明確に導き出すことができる。
【００３４】
【化４】
【００３５】
実施例３： ６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩＩ）を含有する植物抽出物
５００ｇのペラルゴニウムシドイデスの根を、室温において、３ｋｇの水で４時間抽出した。抽出された植物抽出物を濾別した後、上記条件下において２ｋｇの水でもう１度抽出し、濾過した。得られたろ液を混ぜ合わせ、約３５℃において濃縮し、そして凍結乾燥させた。化合物ＩＩＩの含有率が１．５４％である乾燥抽出物が５８．７ｇ（１１．７％）得られた。
【００３６】
実施例４： ６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩＩ）を含有する植物抽出物
約１．２５ｋｇのペラルゴニウムシドイデスの根を、室温において、約１２．５ｋｇのエタノール／水 １１／８９（ｗ／ｗ）で抽出した。濾過後、得られたろ液を約４５℃で濃縮し、そして凍結乾燥させた。化合物ＩＩＩの含有率が１．８６％である乾燥抽出物が９０．４ｇ（７．２％）得られた。
【００３７】
実施例５： 錠剤
求められる効力に依って５〜２５０ｍｇの活性材料を含有する錠剤を調製するには、下記が必要とされる。
化合物ＩＩ ２００〜５，０００ｇ
セルロース粉末 ２，０００ｇ
澱粉 １，２００ｇ
コロイドケイ酸 ８０ｇ
ステアリン酸マグネシウム ２０ｇ
ラクトース 〜１０，０００ｇ
活性材料は、任意に粉砕され、アジュバントと均質に混ぜ合わされ、そして慣用の方法で各々の重量が２５０ｍｇ、直径が９ｍｍの錠剤にプレスされる。１２５ｍｇを超える投与量については、各々の重量が５００ｍｇ、直径が１１ｍｍの錠剤をプレスする。必要に応じて、錠剤にフィルムをコーティングする。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】脂質の自動酸化に対する化合物ＩＩおよびＴｒｏｌｏｘの作用を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への三置換ベンゾピラノンの使用と、新規な三置換ベンゾピラノンおよび生理学的に許容できるその塩とに関する。さらに本発明は、植物抽出物、薬物、食品および製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
遊離基とは、外部軌道内に不対電子を有する原子または分子である。生体内作用にとって最も重要な遊離基とは、還元によって異なる代謝産物を形成することができる酸素分子である。これらの代謝産物は、一般に「活性酸素種」（ＲＯＳ）という総称で呼ばれている。ＲＯＳの例としては、超酸化物アニオン、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、過酸化物アニオン、一重項酸素、次亜塩素酸塩、窒素酸化物および過酸化亜硝酸が挙げられる。
ＲＯＳは、様々な生体内作用によって自然発生する。細胞を微生物、生体異物あるいは内在物質で刺激した後、スーパーオキシドラジカルおよび他のＲＯＳが、膜状ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化することによって酸素分子から発生する反応生成物として形成されるといういわゆる白血球の「呼吸バースト」は、特に重要である。呼吸バーストとは、初期の非特異免疫防御の最も重要な機構の一つであり、主に、侵入した感染体および腫瘍細胞を死滅させる役割を果たす。さらに、ＲＯＳは、不十分な共役反応に起因する電子の漏出によって主に発生する。これは、例えば、ミトコンドリア呼吸中の、虚血性状態におけるヒポキサンチンのキサンチンオキシダーゼ触媒酸化によるアラキドン酸からのプロスタグランジンおよびロイコトリエンの合成または生体異物のシトクロムＰ４５０媒介代謝の過程において生ずる。
【０００３】
呼吸バーストが基本的に感染からの防御における望ましい反応であるのに対し、形成されるＲＯＳの増加およびＲＯＳの連続した形成は通常望ましくない。その理由は、酸化攻撃は侵入してくる微生物に限られておらず、しかも生体組織がそれらの毒性に曝されるからである。これは、とりわけ、自己免疫疾患の経過中におけるＲＯＳの形成の増加のごとき非感染性疾患、虚血の経過中における変性疾患、または医薬品の代謝に当てはまる。遊離基およびＲＯＳの好ましからざる効果は、それらと核酸（例えば、ＤＮＡ鎖切断の誘発）、タンパク質（例えば、変性、酵素系の不活性化）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸の解重合）およびとりわけ脂質（例えば、脂質過酸化反応、粘膜の病変、炎症性プロスタグランジンおよびロイコトリエンの形成）との相互作用に基づく。
活性酸素種（ＲＯＳ）が様々な病気の発症に関わっていることは約５０年前に言明されていたが、今日、これらの分子が、様々な病気、例えば糖尿病Ｉ型およびＩＩ型、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、ぜんそく、潰瘍性大腸炎、乾癬）、細菌感染およびウイルス感染（例えば、インフルエンザ、エイズ、ウイルス性肝炎）、アテローム性動脈硬化性、虚血、神経系の病気（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性病）、白内障、鎌状赤血球貧血および腫瘍の発症において重要な役割を果たしていること、および、これらの分子が老化プロセスにも関与していることは確かであると考えられている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
生物は、遊離基やＲＯＳの悪影響から防御するための様々な防御システムを備えている。前記防御システムとしては、ビタミン（例えば、ビタミンＥおよびビタミンＣ）および他の低分子化合物（例えば、グルタチオン、尿酸）、抗酸化酵素（例えば、スーパオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ）並びに金属結合タンパク質（例えば、トランスフェリン、セルロプラスミン）が挙げられる。しかしながら、生体の抗酸化システムは、病的過程の初期段階において活発になることが多い。その理由は、単に、進行中の病的過程において形成されるＲＯＳの濃度の増大が内部防御機構の容量をはるかに上回ってしまうからである。
【０００５】
従って、酸化的ストレスは、ＲＯＳの濃度と抗酸化防御システムの間の不均衡であると考えられる。従って、数多くの疾病に関してのＲＯＳの突出した重要性により、そのような病的状態の予防および治療に用いることができる抗酸化性を有する物質に多大な関心が寄せられている。
ＲＯＳは炎症反応にとってとりわけ重要であり、酸化的ストレスは炎症性エイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）の合成の増加を伴うことが多い。従って、とりわけ、抗酸化性を示し尚且つこれらの炎症メディエータの形成を妨げる物質が求められている。
【非特許文献１】Ａ． Ｂｅｎｄｉｃｈ（１９９４） ｉｎ： Ｂ． Ｆｒｅｉ（ｅｄ．） “Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐ． ４４７
【非特許文献２】Ｅ． Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ（１９９７） Ｊ． Ｎｕｔｒ． １２７， ９６２ Ｓ
【非特許文献３】Ｄ． Ｖ． Ｐａｒｋｅ（１９９９） ｉｎ： Ｔ． Ｋ． Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．） “Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ”， ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ｐ． １
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態を治療または予防するための化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への一般式Ｉ
【０００８】
【化１】
【０００９】
式中、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｈまたはそれらの生理学的に許容できる塩を表す、
で表される化合物の使用によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
驚くべきことに、６，７，８−トリヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩ）は特に有利な薬理学的特性を示すことが分かった。強力な抗酸化作用に加えて、この化合物は、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンの合成および炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の合成も示す。従って、化合物ＩＩは、酸化的ストレスを伴う病気、例えば糖尿病Ｉ型および／またはＩＩ型、アテローム性動脈硬化性および内皮機能不全、虚血、神経系の病気（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性病）、白内障および腫瘍を治療または予防するのに基本的に好適である。しかしながら、化合物ＩＩは、炎症成分を有する病気、例えば関節リウマチ、ぜんそく、潰瘍性大腸炎、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、乾癬、神経皮膚炎、細菌やウィルスによる感染（例えば、インフルエンザ、エイズ、ウイルス性肝炎）および他の病原体（例えば、寄生虫、菌類およびプリオン）に対して特に有利である。化合物ＩＩは、文献（Ｏ． Ｋａｙｓｅｒ ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９， １１８１−１１８５（１９９５）； Ｓ． Ｋｕｍａｒ， Ａ． Ｂ． Ｒａｙ， Ｃ． Ｋｏｎｎｏ， Ｙ． Ｏｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｈ． Ｈｉｋｉｎｏ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７， ６３６−６３８（１９８８）； Ｋ． Ｐ． Ｌａｔｔｅ， Ｏ． Ｋａｙｓｅｒ， Ｎ． Ｔａｎ， Ｍ． Ｋａｌｏｇａ ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ， Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ． ５５ｃ， ５２８−５３３（２０００））にすでに記載されているが、化合物ＩＩの薬理効果は未だ不明である。化合物ＩＩは、ペラルゴニウムシドイデスにはわずか０．０００４％しか含有されておらず（Ｋａｙｓｅｒら、Ｌａｔｔｅら、上記参照）、ペラルゴニウムレニフォルメにはわずか０．０２％しか含有されていない（Ｌａｔｔｅら、上記参照）。これより、化合物ＩＩは、これらの低い濃度において、ペラルゴニウムシドイデスおよびレニフォルメの生物学的効率に多大な貢献はしていないと結論付けられる。
従って、本発明の主題は、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への化合物ＩＩの使用である。
【００１１】
化合物ＩＩは、一般式Ｉの硫酸エステルの形態で投与することも可能である。これは、化合物ＩＩが経口投与時にそれらの化合物から放出されるからである。このため、一般式Ｉの化合物は、前述の病的状態の治療または予防にも好適である。一般式Ｉの好ましい化合物としては、６，７−ジヒドロキシ−８−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（Ｒ６＝Ｒ７＝Ｈ； Ｒ８＝ＳＯ３Ｈ）および７，８−ジヒドロキシ−６−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ； Ｒ６＝ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（Ｒ６＝Ｒ８＝ＳＯ３Ｈ； Ｒ７＝Ｈ； 化合物ＩＩＩ）が特に好ましい。残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物は新規である。従って、これらの化合物、とりわけ化合物ＩＩＩ、並びに酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防へのそれらの使用も本発明の一部である。
【００１２】
【化２】
【００１３】
一般式Ｉにおいて、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素原子またはＳＯ３Ｈ残基である。一般式Ｉの化合物並びに化合物ＩＩおよびＩＩＩは、それらの生理学的に許容できるアルカリ金属、アルカリ土類金属および他の塩、例えばカリウム塩、の形態をとることもできる。これらの塩も本発明の主題である。
【００１４】
さらに、植物抽出物、とりわけ、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物を１種以上含有するペラルゴニウム種からの植物抽出物も、本発明の一部を形成する。これにより、植物抽出物の乾燥物中の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種の濃度が０．１％〜１０％である植物抽出物が好ましく、前記濃度が０．５％〜５％である植物抽出物が特に好ましい。前記乾燥物は、Ｐｈ． Ｅｕｒ．（流体抽出物）に応じた乾燥残留物に相当する。この場合、例えば流体抽出物に直接分析を施すこともでき、乾燥残留物は計算によって求めることができる。
【００１５】
化合物ＩＩの調製は、例えば市販のフラキシンまたは残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物の加水分解および／またはエーテル開裂によって行うことができる。
【００１６】
残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１つがＳＯ３Ｈ残基である一般式Ｉの化合物の調製は、化合物ＩＩを三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体と反応させることによって、または化合物ＩＩＩの場合、好適な植物材料、例えばペラルゴニウムシドイデスの乾燥した根から単離することによって達成することができる。化合物６，７−ジヒドロキシ−８−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（一般式Ｉ； Ｒ６＝Ｒ７＝Ｈ； Ｒ８＝ＳＯ３Ｈ）および７，８−ジヒドロキシ−６−スルホオキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（一般式Ｉ； Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ； Ｒ６＝ＳＯ３Ｈ）も、化合物ＩＩＩを部分加水分解することによって得ることができる。
【００１７】
本発明による抽出物は、例えば水、メタノール、エタノール、アセトン等およびこれらの混合物のごとき溶媒を用いる公知の調製法によって、室温〜６０℃の温度で、１０分間〜２４時間、ゆっくり〜激しく攪拌しながらまたは濾過によって、ペラルゴニウム植物またはその一部から、様々な組成で得ることができる。好ましい抽出溶媒は、水またはエタノールと水との混合物である。前記混合物中の水の割合は少なくとも５０重量％であり、エタノール／水の比率は、１０／９０〜１５／８５（ｗ／ｗ）であることが特に好ましい。本発明による一般式Ｉの化合物をさらに濃縮するために、さらなる濃縮、例えば１−ブタノール／水またはエチルアセテート／水を用いた液液分配、イオン交換体、ＬＨ２０、ＨＰ２０および他の樹脂を用いた吸脱着またはＲＰ１８、シリカゲル等を用いたクロマトグラフ分離を行ってもよい。必要に応じて、それ自体公知の方法に従って、高温および／または低圧において溶媒を取り除くことによってまたは凍結乾燥によって、乾燥抽出物を得るためのさらなる処理を行ってもよい。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａによれば、乾燥抽出物は、一般に、少なくとも９５重量％の乾燥残留物を有する。
【００１８】
本発明による一般式Ｉの化合物およびそれら化合物のうちの少なくとも１種を含有する抽出物は、粉末、顆粒、錠剤、糖衣錠あるいはカプセルの形態でまたは溶液として、好ましくは経口で投与することができる。
投与量としては、一般式Ｉの化合物の１種以上が１日当たり０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは１日当たり０．３〜５０ｍｇ投与される。
【００１９】
錠剤を調製するには、一般式Ｉの化合物の少なくとも１種または対応する抽出物を、好適な生理学的に許容できるアジュバント、例えばラクトース、セルロース、二酸化ケイ素、クロスカルメロースおよびステアリン酸マグネシウムと混ぜ合わせ、プレスして錠剤にする。前記錠剤は、任意に、例えばヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、着色剤（例えば、酸化チタン、酸化鉄）およびタルクからなる好適なコーティングを施されていてもよい。
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態における化合物ＩＩの効果は、下記実験によって立証される。
【実施例】
【００２０】
抗酸化性
脂質の自動酸化は発光を伴う。この非常に弱い化学発光の測定は、過酸化物の定量化と酸化防止剤の効力の評価との両方に用いることができる。本研究では、オスのネズミ（ＮＭＲＩ； ２０〜３０ｇ； Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ， Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）の脳組織を、脂質が豊富な組織として用いた。脳を摘出後、よく冷えたリン酸塩緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）で洗浄し、髄膜および残った血を取り除いた。組織サンプルを、前記サンプルの体積（ｖ／ｗ）の４倍のＰＢＳと均質化させ、１，０００ × ｇ および４℃で１０分間遠心分離機にかけた。直ちに、上澄み液を同じ緩衝液で３倍に希釈し、氷の上で保存した。２５０μｌの希釈済み上澄み液を試験管に移し、３７℃において、６チャネル照度計（Ｍｕｌｔｉ−Ｂｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ ９５０５ Ｃ， Ｂｅｒｔｈｏｌｄ， Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ）で１０分間培養した。２．５％ＤＭＳＯを添加したＰＢＳに２５μｌの化合物ＩＩを添加した後、さらに１０分間培養を続けた。その後、化学発光（ＣＬ）の強度を６０分間にわたって測定した。自動酸化の抑制の比率を、同時に測定した溶媒対照（２．５％ＤＭＳＯを添加したＰＢＳ）と比較して計算した。化合物ＩＩは、５３ｎｇ／ｍｌの半最大抑制濃度において、脂質の自動酸化を優れた効力で抑制した（図１）。一方、抗酸化性の測定において基準物質としてしばしば用いられるＴｒｏｌｏｘは、１６６５ｎｇ／ｍｌの半最大抑制濃度を示したに過ぎなかった。
図１は、脂質の自動酸化に対する化合物ＩＩおよびＴｒｏｌｏｘの作用を示す。３つの独立した試験からの溶媒対照と比較した脂質過酸化の抑制の比率（平均値±ＳＤ）が示されている。
【００２１】
炎症性サイトカインの合成の抑制
炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の合成に対する化合物ＩＩの作用を、活性化マウス腹腔マクロファージを用いて測定した。前記活性化マクロファージを得るために、０．５ｍｌのＰＢＳ中の３ｘ１０９個の死菌コリネバクテリアパルバムバクテリア（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｙａｎｓｈｅｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）を、オスのＮＭＲＩマウス（Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｌｅｖａｇｅ Ｊａｎｖｉｅｒ， Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内に注入した。６日後、腹腔を、カルシウムおよびマグネシウムを含有せず且つ１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを添加した２．５ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。細胞を、１０％のウシ胎仔血清が添加された完全ＲＰＭＩ培地に、１ｍｌ当たり２ｘ１０６個の濃度で再懸濁させた。２００μｍの細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに充填した。２時間の培養期間の後、非接着性細胞を取り除きし、残った細胞ローンを培養液（３７℃）で２度洗浄した。マクロファージを化合物ＩＩを用いて３０分間予備培養させた後、１μｇ／ｍｌの大腸菌のリポポリサッカライド（血清型０１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を添加することによって炎症性サイトカインの合成を誘発させた。２４時間（３７℃、空気中のＣＯ２濃度：５％）培養させた後、凍結および解凍を３回繰り返すことによって細胞を溶解させ、細胞上澄み液を回収し、分析するまで−８０℃で凍らせておいた。細胞上澄み液中のサイトカインの濃度の測定は、製造業者の手引きに従って市販の検査キット（Ｄｕｏｓｅｔｓ ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６、Ｒ＆Ｄ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）を用いて行った。すべての調査は３回行った。サイトカインの合成に対する化合物ＩＩの作用を、同時に試験した溶媒対照（完全ＲＰＭＩ培地中の０．１％ＤＭＳＯ）と比較して評価した。下記表１から分かるように、１００μｇ／ｍｌの濃度における化合物ＩＩは、３つの測定サイトカインすべての合成に対して著しい抑制効果を示したが、ＩＬ−６の製造に対する効果が最も高かった。
【００２２】
【表１】
【００２３】
ヒト全血におけるシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ活性の抑制
ヘパリン化ヒト全血を検査に用いた。１００μｌの全血を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに充填した。独立したプレートを用いて、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ１）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯ）活性の測定およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）の誘導を行った。
【００２４】
ＤＭＳＯ（最終濃度：０．１％）を溶解促進剤として用い、１％の抗生物質／抗真菌剤溶液と２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）とで、化合物ＩＩをＤＭＥ培地（ＤＭＥＭ）中で希釈した。５０μｌの化合物ＩＩを添加した後、試験対象を３７℃で６０分間培養させた。その後、５０μｌのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（最終濃度：５０μＭ）を添加することによって、エイコサノイド合成を促進させた。３７℃でさらに３０分間培養させた後、マイクロタイタープレートを４℃において５分間、１，５００ｇで遠心分離機にかけた。血漿をピペットで取り、分析するまで−８０℃で凍らせておいた。
【００２５】
ＣＯＸ２活性を検証するために、血液サンプル（１００μｌ／ウェル）を、まずアスピリン（ＤＭＥＭ中の５０μｌ、最終濃度：１２μｇ／ｍｌ）で、３７℃において６時間予備処理することによって、ＣＯＸ１を不活性化させた。その後、化合物ＩＩおよび溶媒（０．１％のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ）を、それぞれ２５μｌずつ添加した。さらに、ＣＯＸ２の発現を誘発するために、２５μｌの大腸菌のリポポリサッカライド（血清型０１２７：Ｂ８、最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で１８時間培養させた後、上記のようにして血漿を採取し、分析するまで−８０℃で凍らせておいた。
【００２６】
血漿サンプルについて、ＴＸＢ２、ＰＧＥ２およびシステニルロイコトリエン（システニル−ＬＴ）を、ＣＯＸ１活性、ＣＯＸ２活性およびＬＯ活性についてのパラメータとして測定した。分析のために、市販のＥＩＡ検査キット（ＴＸＢ２およびＰＧＥ２： Ｃａｙｍａｎｎ／ＢＬ， Ｈａｍｂｕｒｇ； システニルロイコトリエン： ＣＡＳＴ−２０００， Ｍｉｌｅｎｉａ， Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ）を製造業者の手引きに従って用いた。その結果（表２参照）から、化合物ＩＩはＣＯＸ２およびＬＯの活性を強力に抑制する効果を示すことが明らかとなった。一方、ＣＯＸ１の活性はほとんど影響を受けなかった。この効力範囲は非常に有利であるととらえられるべきである。なぜならば、化合物ＩＩの治療的使用において、ＣＯＸ１抑制剤に特有である副作用、例えば消化管の合併症（浸食、潰瘍）または血小板の凝集の抑制に因る出血、を考慮する必要が無くなるからである。
【００２７】
【表２】
【００２８】
実施例１： ６，７，８−トリヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩ）の調製
２０ｇ（４２．７ｍｍｏｌ）の６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンカリウム塩を４８０ｍｌの約２Ｎの塩酸に投入し、４０〜５０℃で２０時間攪拌した。冷却後、沈殿した粗生成物を濾別し、水で再結晶化させた（熱濾過）。得られた結晶化物を濾別および洗浄した後、１００℃で真空乾燥させた。５．９ｇ（７１％）、融点：２６０℃で分解開始。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲは、Ｏ．Ｋａｙｓｅｒ ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ （Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９， １１８１−１１８５（１９９５））の指摘に適合している。
【００２９】
実施例２： ６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンカリウム塩（化合物ＩＩＩのカリウム塩）の単離および構造決定
１５ｋｇのペラルゴニウムシドイデスの根を、室温において、７５ｌの水および４０ｌの水で濾過した。得られた水性抽出物をそのおよそ１／３にまで濃縮した後、７ｋｇの硫酸アンモニウムを添加し、そして２−ブタノン／エタノールの３／２混合物で数回抽出した。得られた有機相を混ぜ合わせ、蒸発によって濃縮した。
この残留物をＨＰ２０カラム（溶離液：水）でクロマトグラフ分析した。６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン成分を濃縮し、水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを８に調節し、エタノールで１／１の割合で希釈した。得られた沈殿物を濾別し、水中に懸濁させた。水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを１０．７に調節し、エタノールで１／１の割合で希釈した。その結果として得られた沈殿物を熱湯に再溶解させた。得られた溶液を濾過し、エタノールで１／１の割合で希釈した。沈殿した結晶化物を濾別および洗浄した後、５０℃で真空乾燥させた。２７．６ｇ（植物材料に対して０．１４％、遊離酸として計算）。
融点：２１６℃で分解開始；Ｃ９Ｈ３Ｋ３Ｏ１１Ｓ２（４６８．５５） 実測値：Ｃ ２３．０８％、 Ｈ ０．７０％、Ｋ ２４．６５％、Ｓ １３．９％ − 計算値： Ｃ ２３．０７％、 Ｈ ０．６５％、Ｋ ２５．０４％、Ｏ ３７．５６％、Ｓ １３．６９％； １ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．６２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ、Ｈ−４）、７．０３（ｓ，Ｈ−５）、５．５９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ、Ｈ−３）、１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．９（Ｃ−７）、１６１．９（Ｃ−２）、１４７．７（Ｃ−８）、１４５．１（Ｃ−４）、１４２．２（Ｃ−６）、１３０．４（Ｃ−８ａ）、１１５．５（Ｃ−５）、１０２．４（Ｃ−３）、１０１．５（Ｃ−４ａ）。
【００３０】
トリヒドロキシクマリン二硫酸カリウム塩の酸加水分解によって、６，７，８−トリヒドロキシクマリンが得られた（実施例１参照）。さらなる構造決定のため、下記反応順序に従って、化合物ＩＩＩを誘導体化させた。
【００３１】
【化３】
【００３２】
このために、トリヒドロキシクマリン二硫酸カリウム塩を、炭酸カリウムの存在下、６０℃においてＤＭＦ中でヨウ化メチルと反応させて、対応する７−メチルエーテルを得た。濃塩酸で酸性化させた後、反応混合物を５０℃で２４時間攪拌し、酢酸エチルで抽出し、シリカゲル（溶離液：ヘプタン／酢酸エチル ７／３）でクロマトグラフ分析した。６，８−ジヒドロキシ−７−メトキシクマリンが得られた。これを、炭酸カリウムおよびヨウ化カリウムの存在下、室温においてＤＭＦ中で臭化ベンジルと反応させた。得られた混合物を濃縮し、残留物を水とＴＢＭＥとの間に分散させた。得られた有機相を濃縮し、シリカゲル（溶離液：トルエン／エタノール ９５／５）でクロマトグラフ分析した。６，８−ジベンジルオキシ−７−メトキシクマリンが得られた。
【００３３】
後者の化合物の置換パターンを、ＣＤＣｌ３中において、一次元および二次元ＮＭＲ分光法によって求めた。Ｈ−５とＣＨ２信号の１つとの間の明白なＮＯＥＳＹ相関関係により、６位におけるベンジルオキシ残基の存在が明確に導き出される。さらに、ＯＣＨ３信号は、メトキシ基が２つのベンジルオキシ残基の間、すなわち、７位に位置することを示す両方のＣＨ２信号と相関関係がある。Ｃ−７とＨ−５並びにＯＣＨ３との間、並びにＣ−８とＨ−４並びに８−ＣＨ２との間のＨＭＢＣ相関関係は、置換パターンがＮＯＥＳＹから派生していることを裏付けている。トリヒドロキシクマリジサルフェートのスルホキシ残基は６位と８位との間に結合していることは、調査した誘導体の調製手順およびその構造から明確に導き出すことができる。
【００３４】
【化４】
【００３５】
実施例３： ６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩＩ）を含有する植物抽出物
５００ｇのペラルゴニウムシドイデスの根を、室温において、３ｋｇの水で４時間抽出した。抽出された植物抽出物を濾別した後、上記条件下において２ｋｇの水でもう１度抽出し、濾過した。得られたろ液を混ぜ合わせ、約３５℃において濃縮し、そして凍結乾燥させた。化合物ＩＩＩの含有率が１．５４％である乾燥抽出物が５８．７ｇ（１１．７％）得られた。
【００３６】
実施例４： ６，８−ビス（スルホオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物ＩＩＩ）を含有する植物抽出物
約１．２５ｋｇのペラルゴニウムシドイデスの根を、室温において、約１２．５ｋｇのエタノール／水 １１／８９（ｗ／ｗ）で抽出した。濾過後、得られたろ液を約４５℃で濃縮し、そして凍結乾燥させた。化合物ＩＩＩの含有率が１．８６％である乾燥抽出物が９０．４ｇ（７．２％）得られた。
【００３７】
実施例５： 錠剤
求められる効力に依って５〜２５０ｍｇの活性材料を含有する錠剤を調製するには、下記が必要とされる。
化合物ＩＩ ２００〜５，０００ｇ
セルロース粉末 ２，０００ｇ
澱粉 １，２００ｇ
コロイドケイ酸 ８０ｇ
ステアリン酸マグネシウム ２０ｇ
ラクトース 〜１０，０００ｇ
活性材料は、任意に粉砕され、アジュバントと均質に混ぜ合わされ、そして慣用の方法で各々の重量が２５０ｍｇ、直径が９ｍｍの錠剤にプレスされる。１２５ｍｇを超える投与量については、各々の重量が５００ｍｇ、直径が１１ｍｍの錠剤をプレスする。必要に応じて、錠剤にフィルムをコーティングする。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】脂質の自動酸化に対する化合物ＩＩおよびＴｒｏｌｏｘの作用を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への一般式Ｉ
【化１】
式中、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｈまたはそれらの生理学的に許容できる塩を表す、
で表される化合物の使用。
【請求項２】
残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素原子である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
残基Ｒ６およびＲ８がＯＳＯ３Ｈを表し、そして残基Ｒ７が水素を表す、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
一般式Ｉの化合物の１種以上が植物抽出物に含有されている、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
前記植物抽出物はペラルゴニウム種からの抽出物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記植物抽出物はペラルゴニウムシドイデスからの抽出物である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
乾燥した前記植物抽出物中における一般式Ｉの化合物の少なくとも１種の濃度は、０．１％〜１０％である、請求項４〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
乾燥した前記植物抽出物中における一般式Ｉの化合物の少なくとも１種の濃度は、０．５％〜５％である、請求項４〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
前記病的状態が、糖尿病Ｉ型および／またはＩＩ型、関節リウマチを含む炎症性疾患、ぜんそく、潰瘍性大腸炎、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、乾癬、神経皮膚炎、細菌による感染、インフルエンザウイルス、エイズ、ウイルス性肝炎および寄生虫、菌類およびプリオンを含んでなる他の病原体、アテローム性動脈硬化性および内皮機能不全、虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性病を含んでなる神経系の病気または白内障および腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
一般式Ｉ
【化２】
式中、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、ＨまたはＯＳＯ３Ｈまたはそれらの生理学的に許容できる塩を表す、ただしＲ６、Ｒ７およびＲ８が同時に水素であることはない、
で表される化合物。
【請求項１１】
Ｒ６およびＲ８がＳＯ３Ｈを表し、Ｒ７が水素を表す、または、
Ｒ６がＳＯ３Ｈを表し、Ｒ７およびＲ８が水素を表す、または、
Ｒ８がＳＯ３Ｈを表し、Ｒ６およびＲ７が水素を表す、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の化合物の１種以上を含有する植物抽出物。
【請求項１３】
前記植物抽出物はペラルゴニウム種からの抽出物である、請求項１２に記載の植物抽出物。
【請求項１４】
前記植物抽出物はペラルゴニウムシドイデスからの抽出物である、請求項１３に記載の植物抽出物。
【請求項１５】
乾燥した前記植物抽出物中における請求項１０または１１に記載の化合物の少なくとも１種の濃度は、０．１％〜１０％である、請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の植物抽出物。
【請求項１６】
乾燥した前記植物抽出物中における請求項１０または１１に記載の化合物の少なくとも１種の濃度は、０．５％〜５％である、請求項１２に記載の植物抽出物。
【請求項１７】
請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種を含有する、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態を治療または予防するための薬物。
【請求項１８】
請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種を含有する、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療を支援するためのまたは前記病的状態を予防するための食品。
【請求項１９】
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態を治療または予防するための薬物を製造するための、請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【請求項２０】
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療を支援するためのまたは前記病的状態を予防するための食品を製造するための、請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【請求項２１】
請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種と、好適なアジュバントとを含んでなる経口投与用製剤。
【請求項２２】
請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の植物抽出液と、好適なアジュバントとを含んでなる経口投与用製剤。
【請求項１】
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療または予防への一般式Ｉ
【化１】
式中、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｈまたはそれらの生理学的に許容できる塩を表す、
で表される化合物の使用。
【請求項２】
残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が水素原子である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
残基Ｒ６およびＲ８がＯＳＯ３Ｈを表し、そして残基Ｒ７が水素を表す、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
一般式Ｉの化合物の１種以上が植物抽出物に含有されている、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
前記植物抽出物はペラルゴニウム種からの抽出物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記植物抽出物はペラルゴニウムシドイデスからの抽出物である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
乾燥した前記植物抽出物中における一般式Ｉの化合物の少なくとも１種の濃度は、０．１％〜１０％である、請求項４〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
乾燥した前記植物抽出物中における一般式Ｉの化合物の少なくとも１種の濃度は、０．５％〜５％である、請求項４〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
前記病的状態が、糖尿病Ｉ型および／またはＩＩ型、関節リウマチを含む炎症性疾患、ぜんそく、潰瘍性大腸炎、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、乾癬、神経皮膚炎、細菌による感染、インフルエンザウイルス、エイズ、ウイルス性肝炎および寄生虫、菌類およびプリオンを含んでなる他の病原体、アテローム性動脈硬化性および内皮機能不全、虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性病を含んでなる神経系の病気または白内障および腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
一般式Ｉ
【化２】
式中、残基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、ＨまたはＯＳＯ３Ｈまたはそれらの生理学的に許容できる塩を表す、ただしＲ６、Ｒ７およびＲ８が同時に水素であることはない、
で表される化合物。
【請求項１１】
Ｒ６およびＲ８がＳＯ３Ｈを表し、Ｒ７が水素を表す、または、
Ｒ６がＳＯ３Ｈを表し、Ｒ７およびＲ８が水素を表す、または、
Ｒ８がＳＯ３Ｈを表し、Ｒ６およびＲ７が水素を表す、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の化合物の１種以上を含有する植物抽出物。
【請求項１３】
前記植物抽出物はペラルゴニウム種からの抽出物である、請求項１２に記載の植物抽出物。
【請求項１４】
前記植物抽出物はペラルゴニウムシドイデスからの抽出物である、請求項１３に記載の植物抽出物。
【請求項１５】
乾燥した前記植物抽出物中における請求項１０または１１に記載の化合物の少なくとも１種の濃度は、０．１％〜１０％である、請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の植物抽出物。
【請求項１６】
乾燥した前記植物抽出物中における請求項１０または１１に記載の化合物の少なくとも１種の濃度は、０．５％〜５％である、請求項１２に記載の植物抽出物。
【請求項１７】
請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種を含有する、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態を治療または予防するための薬物。
【請求項１８】
請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種を含有する、酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療を支援するためのまたは前記病的状態を予防するための食品。
【請求項１９】
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態を治療または予防するための薬物を製造するための、請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【請求項２０】
酸化的ストレスおよび／または炎症反応に関連する病的状態の治療を支援するためのまたは前記病的状態を予防するための食品を製造するための、請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【請求項２１】
請求項１、２または３に記載の一般式Ｉの化合物の少なくとも１種と、好適なアジュバントとを含んでなる経口投与用製剤。
【請求項２２】
請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の植物抽出液と、好適なアジュバントとを含んでなる経口投与用製剤。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５０５０６４（Ｐ２００８−５０５０６４Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１８５３６（Ｐ２００７−５１８５３６）
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７０５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２９１８
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５００２８７２８２）ドクター．ヴィルマー シュワーベ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー．カーゲー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７０５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２９１８
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５００２８７２８２）ドクター．ヴィルマー シュワーベ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー．カーゲー (7)
【Ｆターム（参考）】
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