上皮成長因子受容体(EGFREGFR)タンパク質SRM/MRMアッセイ

本開示は、選択反応モニタリング(SRM)質量分析、または多重反応モニタリング(MRM)質量分析とも名付けられてもいる方法により、ホルマリン中で固定された生物検体中で直接的にEGFRタンパク質を定量するための特に好都合な、上皮成長因子受容体(EGFR)タンパク質由来の特異的ペプチド、および生成されるペプチドのイオン化特性を提供する。このような生物検体は、化学的に保存および固定され、前記生物検体は、ホルマリン固定組織/細胞、ホルマリン固定/パラフィン包埋(FFPE)組織/細胞、FFPE組織ブロックおよびこれらのブロック由来の細胞、ならびにホルマリン固定および/またはパラフィン包埋されている組織培養細胞を含む試薬/固定液を含むホルムアルデヒドで処理した組織および細胞から選択される。タンパク質検体は、前記生物検体からLiquid Tissue(登録商標)試薬およびプロトコルを使って調製され、EGFRタンパク質が、SRM/MRM質量分析法を使って、Liquid Tissue(登録商標)検体中でタンパク質検体中の少なくとも1つ以上の記載ペプチドを定量することにより定量化される。これらのペプチドが修飾または非修飾型で存在する場合は、定量化可能である。EGFRペプチドの修飾型の一例は、ペプチド配列内のチロシン、トレオニン、セリン、および/または他のアミノ酸残基のリン酸化である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、2009年12月22日出願の「上皮成長因子1受容体(EGFR)タンパク質SRM/MRMアッセイ」の名称の米国特許仮出願第61/289,384号(発明者DavidB.Krizman)の利益を主張し、その全内容が本明細書に参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
緒言
上皮成長因子1受容体タンパク質(EGFR、また受容体チロシンプロテインキナーゼ(receptor tyrosine−protein kinase)ErbB−1タンパク質とも呼ばれる)のサブシーケンス由来の特異的ペプチドが提供される。各ペプチドに対するペプチド配列およびフラグメント/遷移イオンは、質量分析ベース選択反応モニタリング(SRM)(多重反応モニタリング(MRM)とも呼ばれる)アッセイでは特に有用で、この分析は、SRM/MRMと呼ばれる。EGFRタンパク質のSRM/MRM定量分析用として、この内の1つのペプチドの使用について記載する。
【0003】
このSRM/MRMアッセイを使って、EGFRタンパク質由来の1つ以上の特異的ペプチドの相対的または絶対的定量値を測定することができ、従って、生物検体から得た所与のタンパク質調製物中のEGFRタンパク質の量を質量分析により測定する手段を提供することができる。
【0004】
さらに具体的には、SRM/MRMアッセイで、患者組織検体、例えば、ホルマリン固定癌患者組織、から得た細胞より調製した複合タンパク質ライセート検体中のこれらのペプチドを直接測定可能である。ホルマリン固定組織からタンパク質検体を調製する方法は、米国特許第7,473,532号に記載されている。この特許の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第7,473,532号に記載の方法は、Expression Pathology Inc.(Rockville、MD)から入手可能であるLiquid Tissue(登録商標)試薬およびプロトコルを使って都合よく行うことができる。
【0005】
最も広範にまた便利に入手できる癌患者組織由来の組織の形は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的採取組織のホルムアルデヒド/ホルマリン固定は、世界中でこれまで最もよく行われている癌組織検体保存方法であり、標準的病理学実践のための認められた方法である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「100%」ホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液(約40容量%または37重量%に相当)から構成され、酸化および重合の度合いを制限するための少量の安定剤、通常はメタノール、を含む。組織を保存する最もよく用いられ方法は、水性のホルムアルデヒド(通常、10%中性緩衝ホルマリンと命名されている)中に全組織を長時間(8時間〜48時間)浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。従って、ホルマリン固定癌組織を分析する分子分析方法が、最も受け入れられ、また、頻繁に使用されている癌患者組織の分析方法であると思われる。
【0006】
SRM/MRMアッセイの結果は、組織(生物検体)を採取し保存した患者または被験者の特定の組織検体(例えば、癌組織検体)内のEGFRタンパク質の正確で精密な定量値を関連付けるために使用可能である。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者の患者に対する治療の適切な判断を可能とする。患部組織または他の患者の検体中のタンパク質発現レベルに関する、診断上また治療上で重要な情報を提供するこのアッセイは、コンパニオン診断アッセイと名付けられている。例えば、このようなアッセイは、癌の病期または程度を診断するように設計可能であり、患者が最も反応しそうな治療薬を決定できる。
【発明の概要】
【0007】
要約
本明細書記載のアッセイは、EGFRタンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対的または絶対的量を測定し、また、EGFRタンパク質由来の特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的量も測定できる。修飾の例には、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が含まれる。
【0008】
EGFRタンパク質の相対的定量レベルは、SRM/MRM法、例えば、異なる検体中の個別のEGFRペプチドのSRM/MRMシグネチャ(signature)ピーク面積(例えば、シグネチャピーク面積または積分フラグメントイオン強度)を比較することにより、測定できる。あるいは、それ自体の特異的SRM/MRMシグネチャピークをそれぞれ有する、複数のEGFRシグネチャペプチドの複数のSRM/MRMシグネチャピーク面積を比較し、1つ以上の追加のまたは異なる生物検体中にEGFRタンパク質含量を有する1つの生物検体中の相対的EGFRタンパク質含量を測定できる。この方法では、EGFREタンパク質由来の特定の1つ以上のペプチドの量、従って、EGFRタンパク質の量が、同じ実験条件下の2つ以上の生物検体の間における同じ1つ以上のEGFRペプチドと比較して、測定される。さらに、SRM/MRM法によるそのペプチドのシグネチャピーク面積を、生物検体由来の同じタンパク質調製物内の異なる1つ以上のタンパク質由来の別の異なる1つ以上のペプチドと比較することにより、単一の検体中の所与の1つ以上のEGFRタンパク質由来のペプチドを相対定量することができる。この方法では、EGFRタンパク質由来の特定のペプチドの量、従って、EGFRタンパク質量を、同じ検体内で相対的に測定できる。これらの手法では、生物検体由来のタンパク質調製物中のEGFRペプチドの容量に対する絶対重量または重量に対する絶対重量のいずれであっても、シグネチャピーク面積により求めた量が相互に相対的である検体間および検体内の間の別の1つ以上のペプチドの量に対する、EGFRタンパク質由来の個別の1つ以上のペプチドの定量化が行える。異なる検体間の個別のシグネチャピーク面積に関する相対的定量データは、検体毎に分析したタンパク質の量に正規化される。複数のタンパク質由来の多くのペプチドおよびEGFRタンパク質について、単一の検体中、および/または多くの検体間で同時に相対的定量化を行い、相対的タンパク質の量、他のペプチド/タンパク質と比較して1つのペプチド/タンパク質に対する洞察を得ることができる。
【0009】
EGFRタンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、SRM/MRM法により測定でき、この方法では、1つの生物検体内の個別のEGFRタンパク質由来のペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積が、添加内部標準のSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較される。一実施形態では、内部標準は、1つ以上の重同位元素で標識した1つ以上のアミノ酸残基を含む、合成バージョンの正確に同じEGFRペプチドである。このような同位体標識内部標準を合成し、それにより、質量分析で分析した場合、これは、元のEGFRペプチドシグネチャピークとは異なる、区別可能で、予測可能かつ一貫したSRM/MRMシグネチャピークを生成し、比較ピークとして使用可能である。従って、生物検体由来のタンパク質調製物中に既知の量の内部標準が添加され、質量分析で分析された場合、元のペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積が内部標準ペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較され、この数値比較は、元の生物検体由来のタンパク質調製物中に存在する元のペプチドの絶対的モル濃度および/または絶対的重量を示す。フラグメントペプチドに対する絶対的データは、検体毎に分析されるタンパク質の量に従って、表示される。単一の検体中、および/または多くの検体間で同時に多くのペプチド、従って、タンパク質に関し、絶対的定量化を行い、個別生物検体および個別検体の全体コホート中の絶対的タンパク質量に対する洞察を得ることができる。
【0010】
SRM/MRMアッセイ法は、例えば、直接的に、ホルマリン固定組織等の患者由来の組織を使って、癌の病期の診断を支援し、また、どの治療薬が患者の治療に対する使用に最も都合が良いかどうかという決定を支援するのに使用できる。手術、例えば、部分または全体腫瘍の治療的除去により、または疑わしい疾患が存在するか否かを判断するために行う生検法により患者から取り出した癌組織を分析し、その患者組織中に1つ以上の特異的タンパク質があるのかどうか、およびどの型のタンパク質なのかを判断する。さらに、1つ以上のタンパク質の発現レベルが測定でき、健康な組織中で見つかった「正常な」または参照レベルと比較できる。健康な組織中で見つかったタンパク質の正常なまたは参照レベルは、例えば、癌を有さない1つ以上の個体の関連する組織由来であってもよい。あるいは、正常なまたは参照レベルは、癌の個体に対し、癌に罹患していない関連する組織の分析から得てもよい。タンパク質レベルのアッセイ(例えば、EGFRレベル)は、EGFRレベルを採用することにより癌と診断された患者または被験者の癌の病期の診断にも使用可能である。タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、SRM/MRMアッセイにより測定されたタンパク質またはペプチドのモル、質量または重量により表現される量として定義できる。レベルまたは量は、分析ライセート中の全体タンパク質または他の成分のレベルまたは量に対し正規化できる(例えば、タンパク質のマイクロモル/マイクログラムまたはタンパク質のマイクログラム/マイクログラムとして表現)。さらに、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、容量ベース、例えば、マイクロモルまたはナノグラム/マイクロリットルによる表現に基づいて測定してもよい。SRM/MRMアッセイにより測定されたタンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、また、分析した細胞の数で正規化可能である。EGFRに関する情報は、従って、EGFRタンパク質(またはEGFRタンパク質フラグメントペプチド)のレベルを正常組織で観察されるレベルと相互に関連付けることにより癌の病期またはグレードを決定するのを支援するために使用できる。癌の病期および/またはグレード、および/またはEGFRタンパク質の発現特性が解るとすぐに、その情報は、例えば、アッセイされる1つ以上のタンパク質(例えば、EGFR)の異常な発現を特徴とする癌組織を特異的に治療するように開発された治療薬(化学および生物学的)のリストと照合することができる。例えば、EGFRタンパク質またはタンパク質を発現している細胞/組織を特異的に標的にする治療薬のリストを照合するEGFRタンパク質アッセイからの情報は、疾患を治療するための、いわゆるオーダーメイド医療手法を規定する。本明細書記載のアッセイ方法は、患者自信の組織由来のタンパク質の分析を診断と治療決定のソースとして使って、オーダーメイド医療手法の基盤を形成する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】パートA〜Cは、Liquid Tissue(登録商標)ライセートを使って三連四重極質量分析計により行ったEGFRペプチドの定量化によるEGFRタンパク質由来の単一ペプチドのSRM/MRMアッセイの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
詳細な説明
原理的には、例えば、既知の特異性のプロテアーゼ(例えば、トリプシン)で消化されることにより調製されるEGFRタンパク質由来のいずれの予測されるペプチドも、質量分析ベースSRM/MRMアッセイを使って検体中のEGFRタンパク質の存在量を測定するための代用レポーターとして使用可能である。同様に、EGFRタンパク質中で潜在的に修飾されることが解っている部位のアミノ酸残基を含むいずれの予測されるペプチド配列も、また、検体中のEGFRタンパク質の修飾の度合いのアッセイに使用できる可能性がある。
【0013】
EGFRフラグメントペプチドは、米国特許第7,473,532号で提供されるLiquid Tissue(登録商標)プロトコルの使用を含む種々の手段で生成可能である。Liquid Tissue(登録商標)プロトコルおよび試薬を使って、組織/生物検体中のタンパク質のタンパク分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に適したペプチド検体を作ることができる。Liquid Tissue(登録商標)プロトコルでは、組織/生物検体は、長期間の緩衝液中で加熱され(例えば、約80℃〜約100℃で、約10分〜約4時間)、タンパク質架橋の逆転または解放が起こる。採用される緩衝液は、中性の緩衝液(例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤含有緩衝液)である。熱処理後、組織/生物検体は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテアーゼLys−Cを含む(これに限定されない)1つ以上のプロテアーゼを使って、前記生物検体の組織と細胞構造を破壊し、前記検体を液化するのに充分な時間(例えば、温度37℃〜65℃で30分〜24時間)処理される。加熱および蛋白質分解の生成物は、可溶性で希釈可能な液体生体分子ライセートである。
【0014】
驚くべきことに、EGFRタンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列が、質量分析ベースSRM/MRMアッセイでの使用に対し不適切であるか、または効果がないことが明らかになったが、理由はすぐには明らかになっていない。MRM/SRMアッセイに対し最も適したペプチドの予測が可能ではないので、EGFRタンパク質用の信頼できる正確なSRM/MRMアッセイを開発するために、実際のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で、修飾および非修飾ペプチドを実験的に特定することが必要であった。いかなる理論にも拘泥する意図はないが、うまくイオン化せず、または他のタンパク質とは異なるフラグメントを生成しない、また、ペプチドが分離工程中(例えば、液体クロマトグラフィー)で、うまく分解できない、またはガラスまたはプラスチック器具に付着する可能性があるために、一部のペプチドは、例えば、質量分析によって検出することが困難である可能性があると考えられている。
【0015】
本開示の種々の実施形態(例えば、表1および2)のEGFRペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製した複合Liquid Tissue(登録商標)ライセート中の全タンパク質のプロテアーゼ消化によるEGFRタンパク質由来であった。別段の指定がなければ、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。Liquid Tissue(登録商標)ライセートは、次に、質量分析で分析され、質量分析により検出され分析されるEGFRタンパク質由来のペプチドが測定される。質量分析用に好ましい特異的サブセットのペプチドの特定は、次の項目に基づいている;1)タンパク質由来の1つ以上のどのペプチドがLiquid Tissue(登録商標)ライセートの質量分析中にイオン化するかの実験的決定、および2)Liquid Tissue(登録商標)ライセートを調製するのに使用されるプロトコルおよび実験条件に対し生き残るためのペプチドの能力。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、ペプチド内の修飾アミノ酸残基の修飾された形態で検体調製の間、生き残る能力までも及ぶものである。
【表1】


【表2】

【0016】
ホルマリン(ホルムアルデヒド)固定組織から直接得た細胞由来のタンパク質ライセートをLiquid Tissue(登録商標)試薬およびプロトコルを使って調製した。この方法は、組織のマイクロダイセクションにより検体チューブ中に細胞を集めた後、細胞をLiquid Tissue(登録商標)緩衝液中で長期間加熱することを伴う。ホルマリン誘導架橋がマイナスの影響を受けるとすぐに、組織/細胞は、例えば、プロテアーゼトリプシン(これに限定されない)等のプロテアーゼを使って予想通りの方式で、完全に消化される。各タンパク質ライセートは、インタクトポリペプチドのプロテアーゼを使った消化により一群のペプチドへと変化する。各Liquid Tissue(登録商標)ライセートを分析し(例えば、イオントラップ質量分析)、複数のペプチドの包括的プロテオミック調査を行った。この場合、各タンパク質ライセート中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により可能な限り多くのペプチドが特定されるように、データを提示した。単一複合タンパク質/ペプチドライセートからできる限り多くのペプチドの特定のための包括的プロファイリングを行うことが可能なイオントラップ質量分析計または別の形式の質量分析計が採用される。しかし、イオントラップ質量分析計は、ペプチドの包括的プロファイリングを行うための質量分析計として最適のタイプであろう。SRM/MRMアッセイの開発および実行を、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で行うことができるが、SRM/MRMアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。
【0017】
採用された条件下で、単一ライセートの単一MS分析により可能な限り多くのペプチドが特定されるとすぐに、そのペプチドリストは、照合され、ライセートで検出されたタンパク質を測定するために使われる。このプロセスは、複数のLiquid Tissue(登録商標)ライセートに対し繰り返され、ペプチドの非常に長いリストが単一のデータセットにまとめられる。そのタイプのデータセットは、分析された(プロテアーゼ消化後に)生物検体のタイプ中で、具体的には、生物検体のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で検出可能な、従って、特定のタンパク質、例えば、EGFRタンパク質に対するペプチドを含む、ペプチドを表していると考えることができる。
【0018】
一実施形態では、EGFR受容体の絶対的または相対的量の測定で有用であると特定されたEGFRトリプシン消化ペプチドには、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、8つ以上の、または10以上の、次の配列番号のペプチドが含まれる:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号38、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、および配列番号74、これらのそれぞれは表1に挙げられている。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製したLiquid Tissue(登録商標)ライセートの質量分析により検出される。従って、表1のペプチドまたはこれらのペプチドのいずれかの組み合わせのそれぞれ(例えば、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、8つ以上の、または10以上の、表1で列挙したこれらのペプチド、および表2にある1つ以上のペプチドとの具体的な組み合わせ)は、ホルマリン固定した患者組織を含むヒト生物検体中のEGFRタンパク質に対する定量的SRM/MRMアッセイでの使用のための候補である。
【0019】
表1に挙げたEGFRトリプシン消化ペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のLiquid Tissue(登録商標)ライセートから検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のEGFRタンパク質の定量的SRM/MRMアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位由来のいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。従って、それぞれのこれらのペプチドは、任意の生物検体または身体の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中のEGFRタンパク質のSRM/MRMアッセイを行うために適すると考えられる。
【0020】
一実施形態では、表1のペプチドまたはこれらのペプチドの任意の組み合わせ(例えば、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、8つ以上の、または9つ以上の、表1で列挙したこれらのペプチド、および、また、表2に挙げられたペプチドとの具体的な組み合わせ)が、免疫学的な方法(例えば、ウェスタンブロッティングまたはELISA)(これに限定されない)を含む質量分析に依存しない方法、によりアッセイされる。ペプチド(絶対的または相対的)の量に対するどのような情報が得られるかに関わらず、その情報は、本明細書記載のいずれかの方法に採用することができ、被験者の癌の存在を示し(診断)、癌の病期/グレード/状態を決定し、予後を示し、または被検者/患者に対する治療薬または治療法を決定することが含まれる。
【0021】
本開示の実施形態では、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、8つ以上の、または10以上の、表1のペプチドを含む組成物が含まれる。一部の実施形態では、組成物は、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、または7つ以上の、表2のペプチドを含む。ペプチドを含む組成物は、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、8つ以上の、または10以上の同位体で標識したペプチドを含んでもよい。それぞれのペプチドは、18O、17O、34S、15N、13C、Hまたはこれらの組み合わせからなる群から独立に選択される1つ以上の同位体で標識してもよい。同位体標識していても、していなくても、EGFRタンパク質由来のペプチド含有組成物は、そのタンパク質由来の全てのペプチド(例えば、トリプシン消化ペプチドの完全のセット)を含む必要はない。一部の実施形態では、組成物は、1つ以上の、2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、5つ以上の、6つ以上の、8つ以上の、または10以上の、EGFR由来のペプチド、および表1または表2に具体的に挙げられているペプチドを含まない。ペプチド含有組成物は、乾燥または凍結乾燥物質、液体(例えば、水性の)溶液または懸濁液、配列、またはブロットの形であってもよい。
【0022】
SRM/MRMアッセイを行う上での重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に使用する装置のタイプである。SRM/MRMアッセイは、開発および実行をMALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計を使って行うことができるが、SRM/MRMアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。そのタイプの質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質由来の1000億の個別ペプチドを含むこともありうる極めて複雑化した単一のタンパク質ライセート内の単離標的ペプチドを分析するための最適の装置であると考えることができる。
【0023】
各EGFRタンパク質由来のペプチドのSRM/MRMアッセイを最も効率よく実施するためには、分析におけるペプチド配列に加えて追加の情報を利用することが望ましい。その追加の情報は、質量分析計(例えば、三連四重極質量分析計を)を操作するために使用して、正しく、的を絞った特異的標的化ペプチドの分析を行うことができ、それにより、アッセイを効率的に行うことが可能となる。
【0024】
通常の標的ペプチドに関する、および特定のEGFRペプチドに関する追加の情報としては、ペプチドの1つ以上のモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質m/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含んでもよい。EGFRタンパク質用のSRM/MRMアッセイを開発するために使用可能な追加のペプチド情報は、表1の一覧中の8つのEGFRペプチドに対する例により示され、これを表2に示す。表2の例で示されるこの8つのEGFRペプチドに対し記載されている類似の追加の情報が、作成され、取得され、さらに表1に含まれる他のペプチドの分析に適用可能である。
【0025】
以下に記載する方法は、1)EGFRタンパク質の質量分析ベースSRM/MRMアッセイ用に使用可能なEGFRタンパク質由来の候補ペプチドを特定する、2)相互に関連付けるために、EGFRタンパク質由来の標的ペプチドのための1つ以上の個別SRM/MRMアッセイを開発する、および3)定量アッセイを癌診断および/または最適治療の選択に適用する、ために使用される。
【0026】
アッセイ方法
1.EGFRタンパク質のためのSRM/MRM候補フラグメントペプチドの特定
a.1つ以上のプロテアーゼ(これには、トリプシンを含んでも含まなくてもよい)を使ってタンパク質を消化して、ホルマリン固定生物検体からLiquid Tissue(登録商標)タンパク質ライセートを調製する。
b.イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Liquid Tissue(登録商標)ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、EGFRタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。この場合、個別フラグメントペプチドは、どのペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化、も含まない。
c.イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Liquid Tissue(登録商標)ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、ペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基を有するEGFRタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。
d.完全長EGFR完全タンパク質から特異的消化方法により生成された全ペプチドを測定することは可能ではあるが、SRM/MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生物検体から調製される複合Liquid Tissue(登録商標)タンパク質ライセートで直接質量分析により特定されるものである。
e.ホルマリン固定生物検体由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセートの分析を行う場合、患者組織中で特異的に修飾され(リン酸化された、グリコシル化された、等)、質量分析計中でイオン化され、検出されるペプチドは、EGFRタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
2.EGFRタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
a.Liquid Tissue(登録商標)ライセート中で特定された個別フラグメントペプチドのための三連四重極質量分析計を使ったSRM/MRMアッセイがEGFRタンパク質由来のペプチドに適用される。
i.最適クロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドに対する最適保持時間の決定。使用されるクロマトグラフィーには、これに限定されないが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、が含まれる。
ii.各ペプチドに対するSRM/MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質m/z値、各ペプチドに対するm/z遷移イオン、および各フラグメントペプチドに対する各遷移イオンのイオンタイプの測定を行う。
iii.次に、(i)および(ii)からの情報を使って、三連四重極質量分析計によりSRM/MRMアッセイを行うことができる。この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のSRM/MRMアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のSRM/MRMシグネチャピークを有する。
b.SRM/MRM質量分析における固有のSRM/MRMシグネチャピーク面積の関数として、検出されるEGFRタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質ライセート中の相対的および絶対的量のタンパク質を表すことができるように、SRM/MRM分析を行う。
i.相対的定量は、下記により行うことができる:
1.1つのホルマリン固定生物検体由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で検出された所与のEGFRペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積を、少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるのホルマリン固定生物検体由来の少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるのLiquid Tissue(登録商標)ライセート中の同じEGFRフラグメントペプチドの同じSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより、EGFRタンパク質の増加または減少を測定する。
2.1つのホルマリン固定生物検体由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で検出された所与のEGFRペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積を、異なる、別の生物学的ソース由来の他の検体中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成したSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより、EGFRタンパク質の増加または減少を測定する。この場合、2検体間のペプチドフラグメントに対するSRM/MRMシグネチャピーク面積比較は、各検体で分析されたタンパク質の量に正規化されている。
3.EGFRタンパク質のレベルの変化を、種々の細胞性条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のEGFRペプチドに対するSRM/MRMシグネチャピーク面積を、ホルマリン固定生物検体由来の同じLiquid Tissue(登録商標)ライセート内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより、EGFRタンパク質の増加または減少を測定する。
4.これらのアッセイは、EGFRタンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に対し適用可能である。この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および/またはグリコシル化が含まれ、また、修飾ペプチドの相対的レベルは、非修飾ペプチドの相対的量測定と同じ方法で測定される。
ii.所与のペプチドの絶対的定量は、個別の生物検体中の所与のフラグメントEGFRタンパク質由来のペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積を、生物検体由来のタンパク質ライセート中に添加された内部フラグメントペプチド標準のSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより行うことができる。
1.内部標準は、標識した合成バージョンのフラグメントEGFRタンパク質由来の参照されるペプチドである。この標準は、既知量で検体中に添加され、SRM/MRMシグネチャピーク面積が、生物検体中の内部フラグメントペプチド標準および元のフラグメントペプチドの両方に対し、別々に測定され、その後、両ピーク面積が比較される。
2.これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用でき、この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および/またはグリコシル化が含まれ、また、絶対的レベルの修飾ペプチドは、絶対的レベルの非修飾ペプチドの測定と同じ方法で測定可能である。
3.フラグメントペプチド定量化の癌診断および治療への適用
a.EGFRタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量化を行い、癌の分野で十分理解されている、EGFRタンパク質発現と患者腫瘍組織中の癌の病期/グレード/状態の間の、以前測定されている関連性が確認されることを証明する。
b.EGFRタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量化を行い、異なる治療戦略から来る臨床的転帰との相関を証明する。この場合、この相関は、この分野ですでに証明されているか、または患者およびこれらの患者由来の組織のコホート全体の相関調査により将来証明可能である。以前確立された相関関係または将来得られる相関関係がこのアッセイにより確認されるとすぐに、本アッセイ方法は、最適治療戦略の決定に使用可能である。
【0027】
図1は、ホルマリン固定癌組織由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセートで行った単一SRM/MRMアッセイの例を示す。SRM/MRMアッセイは、三連四重極質量分析計によるEGFRタンパク質の定量化のために単一ペプチドに対し開発された。このEGFRペプチド(配列IPLENLQIIR)に関しての特異的および固有の特性は、イオントラップおよび三連四重極質量分析計の両方を使って、全EGFRペプチドの分析により開発された。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質m/z値、前駆物質の遷移m/z値、および特定された各遷移のイオンタイプが含まれ、図1Aに示される。その情報は、各および全候補SRM/MRMペプチドに対し、ホルマリン固定組織由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で直接的に実験により測定されなければならない;理由は、興味深いことに、本明細書記載のSRM/MRMを使って、必ずしも全てのEGFRタンパク質由来のペプチドが、このようなライセート中に検出されるとは限らないからであり、検出されなかったEGFRペプチドが、ホルマリン固定組織由来Liquid Tissue(登録商標)ライセート中で直接にペプチド/タンパク質を定量するのに使用するSRM/MRMアッセイを開発するための候補ペプチドと考えられることはあり得ないことを示している。
【0028】
図1Bに示すように、この特殊SRM/MRMアッセイは、三連四重極質量分析計を使って実行された。大量のペプチドが存在することが解っている対照タンパク質ライセートを分析したが、理由は、このライセートがヒト由来癌細胞株のヌードマウスへの注入により生じたマウス異種移植腫瘍から調製されたためである。従って、この異種移植腫瘍は陽性対照であった。この実験の実験検体は、標準ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト乳癌組織から調製されたLiquid Tissue(登録商標)タンパク質ライセートであった。アッセイデータは、対照検体および実験検体の両方中で、このEGFRペプチドに対し固有のSRM/MRMシグネチャピークの存在を示す。これら2検体間のSRM/MRMシグネチャピーク面積の比較により、2つの異なる生物検体間のEGFRタンパク質に対する相対的定量測定値が得られる。
【0029】
図1Cは、癌由来患者検体のコホート全体のEGFRタンパク質の絶対的定量を行うための内部標準を使った、10つのホルマリン固定癌組織の上述ペプチドの定量測定を示す。これらのデータは、分析したタンパク質ライセートのマイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として、このEGFRペプチドの絶対的量を示している。ホルマリン固定患者由来の組織の分析に基づく組織中のEGFRタンパク質レベルの評価は、特定の各患者に関する診断、予後、および治療関連情報を提供できる。一実施形態では、本開示は、生物検体中の上皮成長因子(EGFR)タンパク質のレベルの測定方法が記載され、これには、質量分析を使って前記生物検体から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量の検出および/または定量;および前記検体中の修飾または非修飾EGFRタンパク質のレベルの計算が含まれ;ここで前記レベルは、相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連実施形態では、1つ以上のEGFRフラグメントペプチドの定量化には、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することによる、生物検体中の各EGFRフラグメントペプチドの量の測定が含まれ、ここで、生物検体中の各EGFRフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態では、内部標準は、同位体標識した内部標準ペプチドで、18O、17O、34S、15N、13C、Hまたはこれらの組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む。
【0030】
本明細書記載の生物検体(またはその代替物としてのフラグメントペプチド)中のEGFRタンパク質のレベルを測定する方法は、患者または被験者の癌の診断指標として使用可能である。一実施形態では、EGFRタンパク質のレベルの測定結果は、組織中に認められるEGFR受容体のレベルと正常および/または癌性または前癌性組織で認められるタンパク質のレベルを関連付ける(例えば、比較する)ことにより診断上の癌の病期/グレード/状態を判定するために採用可能である。
【図1−1】

【図1−2】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物検体中の上皮成長因子受容体(EGFR)タンパク質のレベルの測定方法であって、前記生物検体から調製したタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量の質量分析による検出および/または定量;ならびに前記検体中の修飾または非修飾EGFRタンパク質のレベルの計算を含み;さらに前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、方法。
【請求項2】
1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量の検出および/または定量の前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記分画ステップが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、からなる群より選択される請求項2に記載の方法。
【請求項4】
前記生物検体の前記タンパク質消化物が、Liquid Tissue(登録商標)プロトコルにより調製される請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI−TOF質量分析、MALDI質量分析、および/または飛行時間型質量分析を含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および/または複数の選択反応モニタリング(mSRM)である請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記EGFRフラグメントペプチドが、下記に設定されるアミノ酸配列を含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号38、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、および配列番号74。
【請求項10】
前記生物検体が血液サンプル、尿検体、血清検体、腹水検体、痰検体、リンパ体液、唾液検体、細胞、または固形組織である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項11】
前記組織がホルマリン固定組織である請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記組織がパラフィン包埋組織である請求項10または11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
前記組織が腫瘍から入手される請求項10に記載の方法。
【請求項14】
前記腫瘍が原発性腫瘍である請求項13に記載の方法。
【請求項15】
前記腫瘍が2次腫瘍である請求項13に記載の方法。
【請求項16】
修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドを定量することをさらに含む請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項17】
1つの生物検体中の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号38、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、または配列番号74で示されるEGFRの約8〜約45アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む1つ以上のEGFRフラグメントペプチドの量を、異なる、別の生物検体中の同じEGFRフラグメントペプチドの量と比較することを含むEGFRフラグメントペプチドを定量する請求項16に記載の方法。
【請求項18】
1つ以上のEGFRフラグメントペプチドの定量が、既知量の添加内部標準ペプチドに対する比較により、生物検体中の各EGFRフラグメントペプチドの量を測定することを含み、ここで生物検体中の各EGFRフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドに対し比較される請求項17に記載の方法。
【請求項19】
前記内部標準ペプチドが同位体で標識したペプチドである請求項18に記載の方法。
【請求項20】
前記同位体で標識した内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、Hまたはこれらの組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む請求項19に記載の方法。
【請求項21】
タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量の検出および/または定量により、修飾または非修飾EGFRタンパク質の存在および被験者の癌との関連性が示される請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項22】
1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量、または前記EGFRタンパク質のレベルの前記検出および/または定量結果と、診断上の癌の病期/グレード/状態とを関連付けることをさらに含む請求項21に記載の方法。
【請求項23】
1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量、または前記EGFRタンパク質のレベルの前記検出および/または定量結果の、診断上の癌の病期/グレード/状態に対する関連付けが、他のタンパク質由来の他のタンパク質またはペプチドの量の検出および/または定量と組み合わされて、多項目同時測定により、診断上の癌の病期/グレード/状態に関する追加の情報を提供する請求項22に記載の方法。
【請求項24】
前記生物検体が採取された被験者に対し、1つ以上のEGFRフラグメントペプチドの存在、非存在、もしくは量またはEGFRタンパク質のレベルに基づいて治療を選択することをさらに含む請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項25】
前記生物検体が採取された患者に対し、治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、投与される治療薬および/または治療薬の量が、1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量またはEGFRタンパク質のレベルに基づいている請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項26】
治療薬がEGFRタンパク質に結合する、および/またはその生物活性を阻害する請求項24および25に記載の方法。
【請求項27】
前記治療薬が、Tarceva、Iressa、及びErbituxから選択される請求項26に記載の方法。
【請求項28】
前記生物検体が、Liquid Tissue(登録商標)プロトコルおよび試薬を使って、1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドの量を定量するための処理を受けているホルマリン固定腫瘍組織である請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項29】
前記1つ以上の修飾または非修飾EGFRフラグメントペプチドが、2つ以上、3つ以上、4以上、5以上、6以上、8以上、または10以上の表1のペプチドである請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項30】
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、または7つ以上の表2のペプチドの量の定量化を含む請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項31】
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4以上、5以上、6以上、8以上、または10以上の表1のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む組成物。
【請求項32】
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、または7つ以上の表2のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む請求項31に記載の組成物。

【公表番号】特表2013−515272(P2013−515272A)
【公表日】平成25年5月2日(2013.5.2)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−546216(P2012−546216)
【出願日】平成22年12月22日(2010.12.22)
【国際出願番号】PCT/US2010/061916
【国際公開番号】WO2011/087865
【国際公開日】平成23年7月21日(2011.7.21)
【出願人】(505343745)エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】EXPRESSION PATHOLOGY, INC.
【Fターム(参考)】