上皮組織損傷又は脱毛症の予防又は治療
本発明は、例えば炎症反応、加齢又は癌などによって引き起こされる上皮組織損傷を予防及び／又は治療するための方法、並びに／或いは脱毛症を予防及び／又は治療する方法に関する。詳細には、本発明は内因性ＣＤ１ｄ機能を修飾、特に遮断する物質及び／又は組成物に関する。他の態様によると、本発明は本発明の方法及び組成物での使用に適当な化合物のスクリーニング方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば炎症反応、加齢又は癌などによって引き起こされる上皮組織損傷を予防及び／又は治療するための方法に関し、且つ／又は脱毛症を予防及び／又は治療する方法に関する。詳細には、本発明は内因性ＣＤ１ｄ機能を修飾、特に阻止する物質及び／又は組成物に関する。他の態様によると、本発明は本発明の方法及び組成物での使用に適当な化合物についてスクリーニングするための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物で最も目立つ上皮組織は皮膚であり、生物で最大の器官となっている。表皮、真皮及び角質層からなる皮膚外皮系は内臓のそれらと相関し、並行して環境と相互に作用する。皮膚は環境と生物それ自身の境界となっており、体外因子、更には生物の体内系の変数パラメーターによってかなり作用される。したがって皮膚の調整機構は、皮膚外皮の形態及び活動に関する通常の病理学的事象を維持するのに必要な全身の変化を誘導するために、常に活性でなければならない。皮膚の要求にしたがって増加した十分なエネルギー物質及び形成性物質の十分な消費を保証する多くの過程は、皮膚構造の形態学的及び機能上の安定性を保証するものとなる。それ故、皮膚外皮の状態は、健康な皮膚特性、例えば障壁機能、弾性、膨圧特性、保湿、色素沈着その他をもたらす皮膚細胞の活力及び活性に必要な代謝過程の実現を決定する。
【０００３】
生物の生涯の間、老化に特徴的な異なる徴候が皮膚上に現れるが、主な臨床徴候は小じわと深いしわの出現であり、これらは年齢と共に増加するか目立つようになる。更に、皮膚の色つやは通常変化し、部分的にびまん性の炎症及び時折末梢血管拡張症が発生することもある。
【０００４】
老化に伴うこれらの徴候は、外因性作用、例えばＵＶ照射、汚染物質、フリーラジカル又は化学物質に対する皮膚の曝露によっても促進される。
【０００５】
中程度のＵＶ曝露は通常、紅斑として知られる炎症反応を伴う皮膚の発赤という公知の作用を起こす。この現象はしばしば「日焼け」とも称され、疼痛を伴い、一般に後に皮膚の剥離をもたらす。
【０００６】
更に、皮膚の過剰なＵＶ曝露は重い障害、例えば発癌をもたらすことがあり、最も普通に見られる腫瘍は基底細胞癌（ＢＣＣ）であり、扁平上皮癌（ＳＣＣ）がこれに続き、より稀には悪性黒色腫が見られる。ＤＮＡレベルでの傷害は別として、ＵＶ曝露に起因する免疫抑制も非メラノーマ及びメラノーマの癌の促進の要因となるようである。光誘導性免疫抑制は、誘発された腫瘍細胞による通常の免疫学的機構による認識及び拒絶反応の回避、並びに長期間の潜在、並びに結局は増殖して腫瘍に発達するのを許すことが、現在は認められている。この概念は、遺伝的（色素性乾皮症）であれ薬学的であれ免疫不全の患者、例えば、臓器移植患者は、免疫系が正しく機能している人々と比較して皮膚癌の発生率が高い知見と一致する。
【０００７】
当技術分野では、上皮細胞、特に皮膚上皮細胞に対する環境因子の破壊的な作用を予防するために、いくつかの手段が提案されている。
【０００８】
太陽光線に対する保護に関しては「日焼け防止剤（ｓｕｎｂｌｏｃｋ）」又は「日焼け止め（ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ）」が利用できるようになっているが、これらは日光曝露の前に皮膚に塗布される。一般的に、日焼け止め組成物は化学物質、例えばある種のベンゾフェノン、ジベンジルメタン又は置換されたパラアミノ安息香酸塩、即ち紫外線を吸収してそれが皮膚を透過することができないようにする化合物を含む。しかし、この目的のために使われる化合物の一部は十分な耐光性が不足し、しかも長期間の塗布により毒性化することがある。更に、これら化合物が有効となるには、曝露時に連続的に皮膚上に存在しなければならない。しかし、日焼け止めは簡単にこすり落とされ、発汗又は遊泳によって洗い落とされ、また、皮膚に浸透して失われる。
【０００９】
皮膚劣化又は老化を予防する他の手段は、それぞれフリーラジカルを除去する化合物を提供することである。この点に関し、欧州特許第０ ７６１ ２１４号はアニリン誘導体及びジフルフリル誘導体を含む一重項酸素失活剤を開示しており、これらは皮膚に対する酸化性ストレスを低下させると報告されている。
【００１０】
しかしこれらすべての手段及び方法は、我々の環境で増加している曝露の危険性から皮膚を守る能力が十分にあるというわけではない。これに寄与しているのが増加した大気汚染であり、更には社会的行動であり、つまり日焼けが健康、美及び健康状態と結び付けられている。結果として、そのような行動に伴う負の結果が公知となっているにもかかわらず、多くの人々は褐色の肌を得るために皮膚を太陽光線に曝す。地球を覆っているオゾン層が薄くなりＵＶ照射による生物の曝露が多くなっているので、この問題はより顕著になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、皮膚を環境因子、例えばストレスや太陽光線からより良く保護する手段を当技術分野で提供する必要がある。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、環境で遭遇する好ましくない作用、特に酸化性若しくは化学薬品ストレス又は太陽光線から皮膚を保護するために、従来の技術の欠点を取り除き、そのような手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この問題は、上皮細胞内の内因性のＣＤ１ｄ機能を実質的に変更、特に遮断することのできる物質の提供によって解決された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、基本的に、いくつかの異なる細胞、特に上皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質であるＣＤ１ｄが、ストレスに対する細胞の様々な異なる反応を調整するという知見に基づく。以下の好ましい実施形態の詳述から明らかとなるように、前記膜分子を有する細胞で内因性のＣＤ１ｄ機能を本質的に修飾、特に遮断することは、例えば日焼けの結果起こる紫外線照射誘発皮膚傷害、表皮過形成、突然変異体ｐ５３蓄積、炎症、免疫抑制及び皮膚老化などのストレスの有害作用の予防を可能にする。更に驚くべき知見は、上皮細胞でＣＤ１ｄ機能を本質的に遮断する場合、前記細胞での癌の誘発、即ち基底細胞癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫、大腸癌、乳癌、肝癌、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌その他の誘発を予防することができることである。更に、驚くべきことに、ＣＤ１ｄ機能を修飾、特に遮断すると毛の成長及び／又は発達に作用することがわかった。
【００１５】
ＣＤ１ｄそれ自体は、β２マイクログロブリンと非共有結合で結合する１型膜貫通ＭＨＣクラス１様タンパク質である。ＣＤ１ｄ分子は、免疫調節的及び作動的反応で役割を果たすナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）のＴ細胞受容体によって認識される。ＣＤ１ｄはＮＫＴ細胞に対してその活性化のために脂質を提供することが証明されたが、この考えは免疫系に脂質のような疎水性分子を提供するために必要な２つの非常に疎水性の溝を有すＣｄ１ｄの結晶構造が裏付ける。
【００１６】
本発明につながる研究において、驚くことにマウス皮膚のＣＤ１ｄ遺伝子転写が外部ストレス、例えばＵＶ照射に応答することが指摘されているが、この知見はヒトケラチノサイトで確認された。更に、皮膚ＣＤ１ｄがＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子の転写を誘発し、更にＵＶ誘発性アポトーシスを抑制することによって、ＵＶ誘発性皮膚損傷／炎症を媒介することが指摘された。
【００１７】
いかなる理論にも縛られることを欲しないが、生物におけるＣＤ１ｄの内因性の役割の１つは、正常上皮細胞のホメオスタシスを直接制御することであると現在仮定されている。正常な皮膚ホメオスタシスは、表皮細胞の表皮分化、アポトーシス、増殖及び抗アポトーシスの間のきわどく、繊細に調整されたバランスに依存している。皮膚では、これらのプロセスは脂質を通して、特にセラミド及びグルコシルセラミド（スフィンゴリピド）によって調節される。核をもつ細胞層がグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）を生成する一方、Ｃｅｒに対するＧｌｃＣｅｒの割合は表皮分化の後期には低下し、Ｃｅｒ含量は表皮透過障壁の細胞外成分の働きをしている角質層で最大となる。その構造特性に加えて、セラミドは細胞増殖阻害、細胞分化誘発及びプログラム細胞死と関係している。対照的に、ＧｌｃＣｅｒは細胞増殖を誘発してプログラム細胞死を抑制する。
【００１８】
本発明の知見に基づき、ＣＤ１ｄは前記脂質による生物学的な役割の成就を媒介する受容体の１つと考えられる。具体的には、ＣＤ１ｄはアポトーシスの負の制御をするようである。したがって、ストレス状況下の細胞では、例えばＵＶ照射に曝露したときにはＣＤ１ｄはたとえそれらの遺伝物質が傷害を受け且つ／又は突然変異した場合でも前記ストレス下の細胞の継続した生存を支えるが、障害細胞は誘発された炎症プロセスに寄与して結局は老化現象又は腫瘍発達の原因となる。
【００１９】
内因性のＣＤ１ｄ機能の遮断及び／又は修飾においては、ストレス下の細胞の生残及び増殖の代わりにアポトーシスが促進され、ある程度の傷害、特にＤＮＡレベルの障害細胞が増殖してある場合には体内に拡散する可能性がなくなるかもしれない。一旦死んだ細胞は体内で自然のプロセスによって消滅し、「健全な」上皮細胞によって置換される。同様に、ＣＤ１ｄの遮断又は修飾によってもＮＫＴとの相互作用は実質的に阻止されるか、改変され、その場合、ＵＶ光線への曝露中の免疫抑制現象は本質的に減少するか、完全に阻止されよう。また、この状態は、生物の免疫系がＵＶ照射で生じた障害細胞を根絶するのを促進すると考えられる。
【００２０】
ＣＤ１ｄ膜貫通分子の活性を遮断及び／又は修飾することができる物質は、ＣＤ１ｄの内因性生物学的機能と干渉するいかなる物質でよく、特にＣＤ１ｄと内因性又は外因性脂質との結合を阻止するか減少させるいかなる物質でよい。このような物質は以下のステップを含む方法で得られる。即ち、（ａ）上皮細胞を関心のある物質に曝すステップ、（ｂ）前記上皮細胞をストレス状況に置くステップ、（ｃ）前記上皮細胞に対する前記ストレスの作用を以下の検定：（ｉ）上皮過形成（Ｈ＆Ｅ）、（ｉｉ）上皮増殖（ＢｒＵｄ、ＰＣＮＡ）、（ｉｉｉ）上皮アポトーシス、（ｉｖ）ｐ５３突然変異蓄積、（ｖ）上皮脂質の定量的及び定性的評価、（ｖｉ）アポトーシス細胞及び非アポトーシス細胞の表面受容体の共クラスター形成パターン、（ｖｉｉ）炎症誘発性サイトカインの産生、（ｖｉｉｉ）免疫調節性サイトカインの産生、（ｉｘ）炎症マーカー、（ｘ）抗アポトーシスの転写因子活性、及び（ｘｉ）老化マーカーの１つ又は複数でスクリーニングすることによって決定するステップ、並びに（ｄ）得られた結果を対照と比較するステップである。このような対照は、例えば細胞は同じストレス状況に置かれるが、調査するべき物質が加えられない検定（陰性対照）でよい。同様に、対照はまた、公知の陽性の効果を有する物質を検定に含めて試験物質及び公知の物質（陽性対照）の効果の差を測定してもよい。
【００２１】
ある物質が、前記いずれかの検定により詳述したようなストレスの負の作用を阻止した場合、この出願においては活性であるとみなされる。
【００２２】
ＣＤ１ｄ活性は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルに作用する物質によって遮断及び／又は修飾されることが認められよう。
【００２３】
遺伝子レベルで作用する物質はＣＤ１ｄ遺伝子の転写又は翻訳に作用する化合物、特にそれらを阻止する化合物、例えばＣＤ１ｄ遺伝子又はＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡの少なくとも一部にアンチセンスポリヌクレオチドなどである。
【００２４】
本明細書で同じ意味で使われる用語オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのαアノマー型、ポリアミド核酸などを含む自然の又は修飾されたモノマー或いはリンケージの線形のオリゴマー／ポリマーを含み、これらはモノマー対モノマーの相互作用、例えばワトソン−クリック型の塩基対、フーグスティーン型若しくは逆フーグスティーン型塩基対などの規則的パターンを通して標的核酸と特異的に結合することができる。通常、モノマーはホスホジエステル結合又はその類似結合によって結合して少数のモノマー単位、例えば３〜５個から数百個、若しくは数千モノマー単位の大きさのオリゴヌクレオチドを形成する。
【００２５】
（アンチ）センスのオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドは、特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達性又は他の効能関連特性を強化するために、ペンダントの基又は部分、例えばコレステロール分子、アクリジンなどの二重鎖インターカレーター、ポリ−Ｌ−リジン、ホスホロチオエートなどの１種又は複数のヌクレアーゼ耐性連結基による「末端キャッピング」を含んでもよい。対応するオリゴヌクレオチドは転写、ＲＮＡプロセシング及び／又はｍＲＮＡの翻訳の阻止ために使うことができ、したがって、このオリゴヌクレオチドはエクソンのほかに所望によりＣＤ１ｄ標的遺伝子のイントロン配列も含むことができる。
【００２６】
ヒトＣＤ１ｄ遺伝子又はｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ（受入番号：それぞれＡＰ００２５３２及びＮＭ＿００１７６６）から入手できる。当業者はその一般知識及び技術に基づき、ＣＤ１ｄ遺伝子のコード領域の少なくとも一部を選択して、ＣＤ１ｄ遺伝子の転写及び／又は翻訳を阻止する適当なアンチセンスポリヌクレオチドを設計することができる。同様に、ＣＤ１ｄ遺伝子の非コード領域の一部は、ＣＤ１ｄ遺伝子の転写を阻止する因子又は転写産物の数量を減らす因子としての役目をすることができる。ここで特に、プロモーター領域の部分は、アンチセンスポリヌクレオチドを調製するための鋳型としての役目をするが、イントロンからエクソンへの移行領域、またその逆の移行領域も同様である。好ましい一実施形態では、そのような物質はＤＮＡ又はｃＲＮＡ（ＲＮＡ干渉）でよい。
【００２７】
ＣＤ１ｄ遺伝子が標的であることは別として、上皮のホメオスタシスを制御するいくつかの調節分子、例えばセラミド及び／又はグルコシルセラミドの活性も、ＣＤ１ｄ分子に対する所望の作用をもつように修飾することができる。この目的のため、グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子又はグルコシルセラミドシンターゼｍＲＮＡの少なくとも一部にアンチセンスポリヌクレオチドを、最終的には上皮細胞への増殖シグナルが遮断されるように設計することによって、グルコシルセラミドシンターゼ転写産物の数を減らすことができる。グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｉｃｈｉｋａｗａ他、ＰＮＡＳ ９３（１９９６）、４６３８〜４６４３頁で開示されており、該文書は本明細書で参照として組み込まれている。同様に、非コード領域はアンチセンスポリヌクレオチド、例えばプロモーター領域及び／又はイントロンからエクソン、またその逆の移行部のための鋳型としての役目をする。好ましい一実施形態では、そのような物質はＤＮＡ又はｃＲＮＡ（ＲＮＡ干渉）でよい。
【００２８】
増殖シグナルを減らすことのほかに、ＣＤ１ｄ分子を通して上皮細胞をアポトーシスさせるシグナルを強化することができる。この点に関し、対応する転写産物の数を増やすことができ、このことはスフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼ遺伝子及び／又はスフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼｍＲＮＡを含む配列をコードするポリヌクレオチドをより多く提供することによって成就することができる。
【００２９】
遺伝子レベルは別として、ＣＤ１ｄ分子の生物学的活性は、特に上皮細胞の上又は中のＣＤ１ｄ受容体と結合してその内因性の生物学的機能を阻止するいかなる物質によってもタンパク質レベルで修飾、特に遮断することができる。
【００３０】
好ましい一実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を修飾、特に遮断することのできる物質はポリペプチド又はペプチドであり、特には疎水性ペプチド、より好ましくはＣＤ１ｄ受容体と結合してその生物学的機能、例えばＮＫＴとの相互作用を遮断する抗体、若しくはその部分である。その部分としては、特にＦｃ部が欠けているミニ抗体が想定される。他の実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を遮断することのできる物質は可溶性Ｃｄ１ｄ受容体、つまり、その領域が欠けそのポリペプチドを膜に固定するポリペプチドの一部でもよい。可溶性ＣＤ１ｄ受容体はストレスを受けた細胞の生残を促進するｉｎ ｖｉｖｏリガンドを除去し、それによりアポトーシスを進める。更に、ＣＤ１ｄへのナチュラルキラー細胞のｉｎ ｖｉｖｏ結合は減少し、このように、Ｔ細胞の活性化及びその結果としての炎症性且つ／又は免疫抑制性反応を阻止する。
【００３１】
好ましい一実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾することのできる物質は、ホスホリピド、ガングリオシド、スフィンゴリピド、グリコスフィンゴリピド、ホスファチジルイノシトールリン酸塩、ステロール、ポリフェノール、グリセリド若しくは脂肪酸を含む植物、微生物又は動物に由来する脂質である。これらの脂質は、ＣＤ１ｄ分子と直接結合することによって、又はＣＤ１ｄ遺伝子発現に作用することによって間接的にＣＤ１ｄ機能に作用することができる。
【００３２】
他の実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾することのできる物質は、セラミド、例えばセラミド８若しくはスフィンゴシンホスホコリン、又はＴＮＦスーパーファミリーに属している受容体、特にアポトーシスを誘発してＣＤ１ｄの抗アポトーシス機能を妨げるＣＤ９５／ＡＰＯ−１／Ｆａｓのリガンドである。他の実施形態では、目的の物質は化学合成による有機化合物である。
【００３３】
グルコシルセラミドシンターゼを介したセラミドのグリコシル化、及び以降のグルコシルセラミドの蓄積がストレス誘発性プログラム細胞死からの細胞の逃避を可能にし、乳癌、皮膚癌、大腸癌及び類上皮癌を含む様々な癌の細胞の細胞傷害性抗癌剤に対する抵抗性を付与することは、十分に確立されている。ＣＤ１ｄはグルコシルセラミドと結合して同じ多剤耐性癌細胞（例えば扁平上皮癌）によって過剰発現されるので、ＣＤ１ｄの抗アポトーシス活性は、おそらくタンパク質−グルコシルセラミド結合レベルで細胞毒に対する癌細胞の耐性を調節すると考えられる。かくして、原則として内因性ＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾する本発明の物質は、皮膚癌、腸癌及び乳癌を含む様々な癌の多剤耐性をかなり減少させる。
【００３４】
原則として、本発明の物質は膜への及び膜からの双方向性のＣＤ１ｄのトラフィッキングにも作用する。
【００３５】
これらの物質は、個体にこれらの物質を投与するのに適するいかなる組成物、特に食物組成物、化粧組成物又は医薬組成物に含めることができる。
【００３６】
本発明によるＣＤ１ｄ表面分子を遮断又は修飾することができる物質の最低１つを含む医薬組成物は、予防及び／又は治療処置のために投与することができる。治療用途では、本明細書で以下に記載するように、組成物は既に病気を患っている患者に対して、その病気の症状及びその合併症を治療するか最低でも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。この達成に十分な量は「治療有効量」と定義される。このために有効な量は、病気の重症度並びに患者の体重及び一般状態によって決まる。
【００３７】
予防的用途では、本発明によるＣＤ１ｄ表面分子を遮断又は修飾することができる物質の最低１つを含む組成物は、特定の病気に感受性の患者又はその危険がある患者に対して投与される。このような量は「予防有効量」と定義される。この用途では、正確な量は同じく患者の健康状態及び体重によって決まる。
【００３８】
本発明の化合物は好ましくは薬剤として許容される担体と一緒に投与され、担体の性質は投与様式、例えば腸管外、静脈内、経口及び局所（眼を含む）の投与経路で異なる。
【００３９】
所望の剤形は各種賦形剤、例えば医薬品用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロース、炭酸マグネシウムなどを用いて作製できる。この組成物は、錠剤、カプセル、丸薬、溶液、懸濁液、シロップ、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、乾式経管栄養、湿式経管栄養その他でよい。薬剤の放出を制御するためには徐放性剤形を用いることもできる。
【００４０】
担体／賦形剤の種類及びその量は、物質の性質及び企図される薬物送達及び／又は投与の様式によって決まる。例えば、わずかに可溶なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいる剤形では、例えば溶解性を上げるためにＴｗｅｅｎ ８０などの非イオン界面活性剤を約０．０４〜０．０５％（ｗ／ｖ）の量で用いて、マイクロエマルションを使用することができる。他の構成成分としては抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、親水性ポリマー、例えば単糖、二糖及び他の炭水化物、例えばセルロース又はその誘導体、デキストリン、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、及び製薬学者に周知の類似成分が含まれる。利用されるこれらの様々な構成成分は、医薬品濃度調節、溶解性の調節、化学安定化、粘性の調節、吸収強化、ｐＨの調節などを含む様々な機能を提供する。例えば、水溶性剤形では、好ましくは医薬組成物は好ましくは約７から８のｐＨの緩衝剤、例えばリン酸緩衝液又は他の有機酸塩を含む。
【００４１】
当業者が自身の知識に基づき、注射、局所投与、鼻腔内投与、移植若しくは経皮による徐放システムなどでよい投与経路を考慮に入れて、活性化合物を関心のある組織、例えば大腸、胃、皮膚、腎臓又は肝臓に向けさせるために適切な構成成分及び生薬剤形を選択することは認められる。
【００４２】
目的の物質は、化粧製品、例えばローション、シャンプー、クリーム、日焼け止め、日焼け手入れクリーム、日焼け防止剤、老化防止クリーム、軟膏及び／又は脱毛防止液で製剤化することもできる。このことは皮膚でＣＤ１ｄ機能を事実上遮断して太陽照射の有害作用、光線老化及びフリーラジカルによる皮膚の曝露を予防するために特に有利であることを証明する。かくして、例えばＵＶ光線を吸収する通常の剤のほかに本明細書で記載の物質を含んでいる日焼け止めを提供することにより、公知のものをはるかに凌ぐ太陽に対する保護材を提供することができる。この特徴は、目的の物質が皮膚を浸透して標的分子に到着した後にその効果を及ぼすという事実に特に基づく。この効果は暫くの間継続するので、万一日焼け止めが、例えばスポーツなどの間にこすり落とされるか洗い落とされた場合でも太陽に対する保護は存在する。また、日焼け止めは別として、目的の物質は環境汚染、酸化ストレスその他を含む日常の環境の負の作用を予防するために、通常の日常クリーム、ローションその他に含まれてもよい。本化粧製品に当業者に公知の異なる成分の混合物を含ませて目的の物質の皮膚への速やかな浸透を可能にし、また貯蔵中のその分解を予防できるようにすることは認められる。
【００４３】
本発明に従う他の非常に重要な組成物は食品材料である。現在社会では保存料、成分又は腸に有害な物質を含む多くの食品、例えばソーセージ、塩漬け肉又は焼肉その他が摂取される。例えば、焼肉は発癌性であることが公知の脂肪族及び芳香族化合物を含む。また、食品材料、例えばソーセージに含まれる微生物をＤＮＡの操作により殺す保存料は、腸の細胞に対して類似した作用を及ぼす。実際、腸癌の数は我々の社会で着実に増加しているが、それは少なくとも一部は人間が摂取する食品の種類によるものと考えることができる。
【００４４】
したがって、本発明はそのような腸障害の開始及び／又は発達を予防する食品組成物、例えば、少なくとも事実上ＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾することのできる物質を含む乳製品若しくは発酵乳製品、例えばヨーグルト、カード、チーズ、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、乳ベースの粉製品、乳児食、穀物製品及び発酵穀物ベースの製品、ミネラルウォーター、チョコレート又はペットフードからなる群から選択される組成物を提供する。目的の化合物は食品材料中にその本来の味覚に作用を及ぼさない量で含まれるので、消費者は製品のいかなる変化にも気付かないがその有益効果、つまり予防効果又は治療効果でさえ経験する。一旦食品材料が摂取されると目的の物質は標的細胞に到着するが、標的細胞は腸、即ち胃又は腸の上皮細胞でよく、そこでＣＤ１ｄ受容体と結合してその活性を及ぼす。結果として、既に障害細胞は好ましくは傷害を受けた状態で維持されることなくアポトーシスに向かう。
【００４５】
ＣＤ１ｄをもつ上皮細胞はいくつかの器官、例えば肝臓、小腸、大腸、腎臓、前立腺、子宮、膵臓、乳房、皮膚及び結膜で見つかっているので、上で詳述した組成物の選択は概して標的組織によって決まる。理解されるように、皮膚に対しては化粧品が最も良い組成物であるかもしれないが、目的の物質を直接腸又は大腸に送達する場合には、食品が第一選択であるかもしれない。しかし、食品は目的の物質又は単に物質を他の器官、例えば腎臓若しくは肝臓に送達するためにも適し、それは体内での物質の安定性及び腸から体内へ吸収される能力に依存する。食品は毎日摂取される材料であるので、そのような製品は多種多様な異なる可能性を提供する。また目的の物質が腸での分解に感受性がある場合には医薬組成物を選択することができ、例えばカプセル化又は他の生薬剤形により目的の物質は標的の組織／細胞に送達される。
【００４６】
本発明の概念は、現在使用されている薬物療法を助ける補助療法として同様に適用することができることが理解されよう。この点に関し、本発明の医薬組成物は、例えば、治療される腫瘍のその治療からの逃避を予防するために又は医薬投薬で捕えられなかった残存性の癌細胞の殺滅を助けるために、細胞増殖抑制剤と共に投与することができ、このような逃避はある種の腫瘍の長期間治療でしばしば起こる。本発明の物質は食品材料と共に簡単に投与することができるので、目的の物質を多く含む特別な臨床用食品を利用することができる。また、メラノーマは、メラノーマに対して本明細書で記載の医薬組成物又は化粧品と共に抗体投与で直接治療することができる。本明細書並びに付随する請求項を読んだ後には、当業者が本明細書に記載の特定の実施形態に対する様々な異なる代替手段を想定することは明らかとなる。
【００４７】
原則として、本発明に従う物質はストレス状況、例えば化学的、生物学的若しくは物理的ストレス、例えばオキシダント若しくは発癌物質への曝露、細菌、ウイルス、真菌類、環境中の細胞及び／又は微生物に由来する脂質への曝露、又はＵＶ照射への曝露によるストレス状況によって起こる上皮組織、例えば皮膚、腸、眼、肺臓、肝臓、前立腺、胸部、腎臓及び／又は子宮の上皮組織における傷害の治療及び／又は予防のために使用できる。同様に、この物質は脱毛症を予防及び／又は治療するために利用できる。
【００４８】
したがって、本発明に従う物質及び／又は組成物は、皮膚の傷害、特に皮膚の光化学的傷害及び老化による傷害、例えば乾燥、日光性角化症、不規則な色素沈着（特に、染み、ほくろ、滴状のメラニン減少症及び永続性色素沈着過度を含む）、しわ（特に、表面の小じわ及び深い溝を含む）、星状の偽瘢痕、弾力線維症、弾力低下、末梢血管拡張症、静脈湖、紫斑病、にきび、脂腺の過形成、先端線維性軟ゆう、老年性血管腫、脂漏症角化上皮症、黒子、基底細胞癌及び扁平細胞癌腫、皮膚火傷及び／又は水ぶくれ、白内障形成、表皮過形成、炎症、免疫抑制並びに癌、例えば非メラノーマ及びメラノーマ皮膚癌の治療及び／又は予防のために利用できる。
【００４９】
上記特性を有する他の物質を見つけるために、本発明はそのような物質についてスクリーニングするための方法も提供する。この方法では、一次培養の形態、つまり個体から直接導かれた状態又は細胞系の状態の上皮細胞が利用される。この方法を実行するためには細胞培養が特に好ましく、その理由は実験期間を通して上皮細胞を継続して供給することができるからである。使用される上皮細胞の細胞培養は、一次培養の細胞又は組織試料から直接得られる上皮細胞と同じ表現型形質を示すことに留意する必要がある。当業者は検定方法にしたがって出発物質を選択することが理解されよう。それ故に、第１回目の検定を実行するときは細胞培養が最も適当なようであり、更なる検定では、つまり潜在的な候補物質の活性を評価する場合は、組織又は動物モデルを用いた検定がより適当なようである。
【００５０】
上皮細胞は、関心のある物質と細胞が確実に接触するのに十分な時間この物質に曝される。次のステップでは上皮細胞はストレス状況に曝され、このストレス状況は、例えば異なる線量のＵＶ光線で細胞を照射するか、過酸化水素又は毒性化学物質を細胞培養に加えることによってもたらされる。しかし、細胞がチャレンジされ、通常、ストレス状況で開始されるプロセス、例えば炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＦＮ−□、ＴＮＦ−□、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８の産生、アポトーシス、脂質代謝の変化、ｐ５３の増産、細胞表面受容体の共クラスター形成パターンの変化の結果としての細胞シグナル伝達の変化、ＮＦ−кＢ活性化、ＡＰ１活性化、過増殖（抗アポトーシス）、障壁機能の変化などのプロセスを開始する限り、ストレスの種類は決定的ではない。第２回目以降の検定で有益であるとわかるかもしれない複数の物質、つまり１つ又は複数の物質の混合物を同時に試験することもできることが理解されよう。
【００５１】
次のステップでは、上皮細胞に対する前記ストレスの作用を、以下の特徴の１つ又は複数を評価することによって決定する。例えば：上皮増殖（ＰＣＮＡ：Ｏｕｈｔｉｔ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０００）、（１５６：２０１〜２０７）；ＢｒＵｄ：Ｌｕ Ｙ−Ｐ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）、（５９：４５９１〜４６０２）；上皮アポトーシス（Ｔｕｎｅｌ検定；Ｏｕｈｔｉｔ他によって概説されたプロトコルの変更、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０００）、１５６：２０１〜２０７）；ｐ５３突然変異蓄積（対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）及び一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）、Ａｎａｎｔｈａｓｗａｍｙ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）、３：５１０〜５１４）；炎症誘発性及び免疫調節的なサイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＰＧＥ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、血小板活性化因子、ＴＧＦβ）の生産；炎症マーカー（例えばＣＯＸ−２、ｉＮｏｓ）；及びＴａｑＭａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学による抗アポトーシスの転写因子（ＡＰ−１、ＮＦκＢを含む）活性；ホスホリピド、グリコスフィンゴリピド及びスフィンゴリピド含量の定性的及び定量的評価（電子スプレータンデム型質量分析）；蛍光共鳴電子移動分析（ＦＲＥＴ）による上皮細胞表面受容体分子、例えばサイトカイン受容体（例えばＩＬ−６）、受容体ＴＮＦスーパーファミリーの分子（例えばＣＤ９５／ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）及び増殖調節受容体（例えばＥＧＦ、インスリン）の共クラスター形成パターンの解析；老化のマーカー、例えばエラスターゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、テロメラーゼである。
【００５２】
得られた結果は次に対照と比較するが、対照は単に検定でよく、同じ種類の細胞を同じストレス状態に曝すが、但しＣＤ１ｄを遮断する能力について評価する化合物は用いない。動物モデルに関しては、陽性対照はＣＤ１ｄ−／−動物で表され、ＣＤ１ｄ活性はまったくない。
【００５３】
以下の実施例は更に詳細に本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５４】
ＣＤ１ｄ突然変異体マウスの作製
マウスＣＤ１ｄは２つの遺伝子、ＣＤ１ｄ１及びＣＤ１ｄ２によってコードされ、これらは高いヌクレオチド配列同一性を共有する（Ｂｒａｄｂｕｒｙ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、７（１９８８）、３０８１〜３０８６）。ＣＤ１ｄ１遺伝子の産物は記載されているすべての抗ＣＤ１抗体によって認識され、ＣＤ１ｄ２産物の表面発現はまだ証明されていない。更に、ＣＤ１ｄ２遺伝子産物の予測されたα２領域は、発表されているすべての古典的及び非古典的ＭＨＣクラスＩ分子のα２領域に存在する領域内ジスルフィド結合を欠く（Ｂｒａｄｂｕｒｙ、上記）。このジスルフィド結合は、抗原結合溝の折畳みのために重要であると考えられる。このように、ＣＤ１ｄ２遺伝子は機能的抗原提示分子をコードすることができず、以前にマウスＣＤ１によるものと考えられていたすべての機能はＣＤ１ｄ１遺伝子産物によってもたらされる。この理由から、対象の突然変異をＣＤ１ｄ１遺伝子に導入して、ＣＤ１ｄ２はそのままにすることを決定した。
【００５５】
ＣＤ１ｄ遺伝子は、系統１２９／Ｓｖファージライブラリーから、ＰＣＲ法で作製したプローブで単離された。ターゲティング構築物は、ＣＤ１ｄ遺伝子の５’領域を含む２．８ｋｂのＡｐａｌ断片、ＣＤ１ｄ遺伝子の３’領域を含む３．２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｎｏｔｌ断片（この断片のＮｏｔＩ部位はファージＤＮＡが最初にサブクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに由来する）、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて調製された。この構築物は、ＣＤ１ｄ１のα２領域をコードするエクソンから約２００ｂｐの断片を削除するように設計されていた。系統１２９／Ｓｖ由来の胚性幹（ＥＳ）細胞系ＴＬ１は、ＮｏｔＩ線形化ターゲティングベクターでトランスフェクションした。Ｖａｎ Ｋａｅｒ他、Ｃｅｌｌ ７１（１９９２）、（１２０５〜１２１４）で記載されているように、Ｇ４１８耐性コロニーを選択して単離した。個々のクローンからのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、ＣＤ１ｄ１遺伝子の５’末端に由来する２．３ｋｂのＣＩａＩ−ＥｃｏＲＩプローブとハイブリダイズした。組換えは、ＫｐｎＩによる消化及びＣＤ１ｄ１遺伝子の３’末端に由来する７００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩプローブとのハイブリダイゼーションで確認した。キメラマウスは生殖細胞系伝達を評価するためにＣ５７ＢＬ／６マウスとかけ合わされ、異型接合突然変異体マウスを交雑させて（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９／Ｓｖ）Ｆ２同型接合突然変異体を得た。マウスは５’プローブによるゲノムサザンブロット法により、そのＣＤ１ｄ１状態で分類した。変異体マウスは健康で、正常に成育した。
【００５６】
突然変異体動物を作製するのに用いたＥＳ細胞及びマウス系統はそのＴＬ状態が異なる（１２９／ＳｖはＴＬ＋系統で、Ｃ５７ＢＬ／６はＴＬ−系統）ので、この研究で使ったすべてのマウスはＴＬにつき遺伝子型を決定した。マウスのＴＬ状態の分類のために、尾部ＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化して系統１２９／Ｓｖ（ＴＬ＋）及びＣ５７ＢＬ／６（ＴＬ−）間の多型を検出するＴＬ特異的なプローブとハイブリダイズした（Ｐｏｎｔａｒｏｔｔｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）、１７８２〜１７８６）。このプローブは、公表された以下の配列（Ｐｏｎｔａｒｏｔｔｉ、上記）に基づいて設計された一組のプライマーを使ってＰＣＲ法で作製した：
５’−ＴＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＧＧＡＣ−３’；及び
５’−ＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣ−３’。
【００５７】
ＣＤ１ｄ１変異体及び野生型マウスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）に公認されたＳＰＦ障壁動物施設で飼育された。実験開始時１２〜１６週齢の動物が使われた。動物は、１２時間の明／暗周期で管理されたフィルター保護されたケージに収容され、オートクレーブしたＮＩＨオープンフォーミュラマウス固形飼料及び水を随意に供給された。組織のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはすべての手順を承認した。各実験内で、すべてのマウスは年齢及び性別を揃えた。
【００５８】
ＣＤ１ｄ変異体マウスを作出するために他の遺伝的背景、例えばＢａｌｂ／Ｃの遺伝的背景を使えることが強調される。
【実施例２】
【００５９】
マウスのＵＶ照射
フィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯（フィリップス社、オランダ）５個一列を用いてマウスを照射した。これらのランプは、２７０から４００ｎｍのスペクトルを発する。照射の５４％は太陽スペクトルのＵＶＢ範囲（２８０〜３１５ｎｍ）内であり、４５％はＵＶＡ（３１５〜４００ｎｍ）の領域、１％未満がＵＶ−Ｃ（２４０〜２８０ｎｍ）の範囲内であった。５つの電球の放照射度は、ＵＶＢ ＰＭＡリサーチ輻射計で測定すると平均で１０Ｗ／ｍ２であった。
【００６０】
マウスの背側の毛を電気クリッパーで取り除き、プレキシガラスデバイダーで個々の区画に分けられたプレキシガラスの箱にマウスを入れ、入射線量を１４％カットする針金トップで覆った。各々のＵＶ照射のために、電球の長辺方向のエネルギーの偏在を補償するために、各回ランプの下の同じ位置に箱を置いた。マウスは、フィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯５個からの８６ｍＪ／ｃｍ２ ＵＶＢの入射線量に１度又は２度曝露させた。マウスは、第１の照射から９６時間後にＵＶＢ光線の第２線量に曝露させた。すべてのマウスは、最後のＵＶＢ照射から２４、４８、７２及び９６時間後に、皮膚損傷の徴候につき分析した。
【００６１】
肉眼検査では、裸にされた背のＵＶＢ照射の後に皮膚損傷程度の明らかな相違が野生型とＣＤ１ｄノックアウトマウスの間で観察された。ＵＶ照射した野生型マウスは明瞭で顕著な皮膚傷害（火傷、皮膚損傷）を示したが、ＵＶ照射ＣＤ１ｄノックアウトマウスでは皮膚傷害の明らかな徴候を認めなかった。
【実施例３】
【００６２】
表皮アポトーシスの測定
アポトーシスによる細胞死はＤｅａｄＥｎｄ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って検出し、このシステムは酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使って３’−ＯＨ ＤＮＡ末端でフルオロセインー１２−ｄＵＴＰを触媒により取り込むことによって、アポトーシス細胞の断片化ＤＮＡを測定する。ＴｄＴは、ＴＵＮＥＬ検定の原理を使ってポリマー末端を形成する。つまり、スライド上のホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片を室温で５分間、新しいキシレンで２回脱パラフィンした。それらを１００％エチルアルコールで５分間洗浄し、次に、切片を段階的（１００％、９５％、８５％、７０％、５０％）エチルアルコール洗浄液に３分間浸すことによって逐次再水和した。その後、切片を０．８５％ＮａＣｌに５分間浸し、ＰＢＳで洗浄し、次に４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定してＰＢＳで２回洗浄した。残留液を軽くたたいて切片から取り除いた後、各組織切片を室温で８〜１０分間、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ社）で覆った。プロテイナーゼＫ処理の後、組織切片をＰＢＳで洗浄し、次に、５分間４％のパラホルムアルデヒドに浸すことによって固定した。次にＰＢＳで洗浄し、残留液をたたいて除去し、切片を平衡緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の後、加湿チャンバ内で切片をＴｄＴ酵素と共に３７℃で１時間インキュベートした。切片は反応を終了するために停止緩衝液（ＳＳＣ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に１５分間浸漬し、次にＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、使用前にＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したヨウ化プロピジウム溶液で切片を暗黒下１５分間染色した。切片を次に脱イオン水で５分間、３回洗浄し、その後、細胞周囲の領域から余分な液を拭き取った。次に切片を蛍光顕微鏡下で直ちに検鏡した。
【００６３】
ＵＶ照射から２、６、２４、４８、７２及び９６時間後（急性／慢性）、ＣＤ１ｄ−／−マウス及び野生型マウスから採取した皮膚のＴＵＮＥＬ検定（Ｏｕｈｔｉｔ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０００）、１５６：２０１〜２０７によって概説されたプロトコルの変更）を行った。結果は、ＣＤ１ｄ−／−マウスの皮膚内の表皮細胞では、野生型マウスと比較してアポトーシスが高度に進行していることを明らかにした。対照的に、野生型の皮膚においては、表皮細胞のアポトーシスの進行は有意に少なかった。
【実施例４】
【００６４】
表皮過形成の測定
背側の皮膚生検材料を４％のパラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。切片をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して光学顕微鏡で検鏡した。
【００６５】
ＵＶＢ照射後、Ｃｄ１ｄ−／−マウスは最後のＵＶＢ処理から４８時間後に、ＵＶ照射野生型マウスと比較して有意に減少した表皮過形成を示した。
【実施例５】
【００６６】
遺伝子プロファイリング
ＣＤ１ｄ機能を解明するために、野生型及びＣＤ１ｄノックアウトマウスの遺伝子発現を比較する遺伝子プロファイリング検定を行った。
【００６７】
皮膚組織を５つの個々の野生型及びＣＤ１ｄノックアウトマウスから抽出し、またいかなるゲノムＤＮＡ汚染を取り除くためにＴｒｉｚｏｌキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、バーゼル、スイス）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（バーゼル、スイス）をメーカーの説明書に従って使い、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により別々に抽出した。ＲＮＡ試料をＯＤで定量し、その後ダイナミックゲル電気泳動をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒで行い、インタクトな２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡについて分析した（すべての２８／１８比は、１．６と２．０の間であった）。試験試料は、ＧｅｎｅＣｈｉｐとのハイブリダイゼーションに十分な量の高品質ＲＮＡを含むと判断された。他の品質管理手段として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、サンタクララ、ＣＡ）とのハイブリダイゼーションの前に、すべての試料が予め選択された遺伝子に対して強いシグナルを発すことをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ試験チップ（試験チップの５’／３’比は３．０未満であった）を用いて確認した。
【００６８】
皮膚に関しては、すべてのマウス個体試料で総計１０μｇのＲＮＡが出発物質であった。一般的に、全ＲＮＡはビオチン化ｃＲＮＡに変換され、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブアレイカートリッジでハイブリダイズされ、染色され、その後定量化された。第１鎖及び第２鎖のｃＤＮＡ合成には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、バーゼル、スイス）をメーカー説明書に従って使用したが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合部を含むオリゴｄＴプライマーを使った。標識されたｃＲＮＡは、ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、ＮＹ）で調製した。反応ではビオチン化ＣＴＰ及びＵＴＰは非標識のＮＴＰと共に使い、取り込まれなかったヌクレオチドはＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ドーレン、ドイツ）で取り除いた。
【００６９】
ｃＲＮＡ（２０μｇ）を、２００ｍＭのトリス酢酸塩ｐＨ８．１、５００ｍＭのＫＯＡｃ、１５０ｍＭのＭｇＯＡｃを含む緩衝液中で９４℃で３５分間断片化した。ハイブリダイゼーションの前に、ハイブリダイゼーション混合液（１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５ｎｇ／μｌのＢＳＡ、０．１ｎｇ／μｌのニシン精液及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ対照を含む緩衝液）中の断片化ｃＲＮＡを９５℃で５分間加熱してから４５℃に冷却し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブアレイカートリッジに入れた。プローブアレイを４５℃で１６時間、一定の回転速度（６０ｒｐｍ）でインキュベートし、その後Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの洗浄及び染色プロトコルに従った。
【００７０】
このプロトコルは、以下の操作を含んでいた：
・非ストリンジェント緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％の消泡剤）による１回の洗浄
・ストリンジェント緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０）による１回の洗浄
・１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中の０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）による第１の染色。
・非ストリンジェント緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％の消泡剤）による１回の洗浄
・１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中の３μｇ／ｍｌのビオチン化抗ストレプトアビジン＋０．２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧによる第２の染色。
・１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中の０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）による第３の染色。
・非ストリンジェント緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％の消泡剤）による１回の洗浄
【００７１】
差別的に調節された遺伝子の選択のために、数学的方法を開発し、ＧｅｎｅＣｈｉｐの生データに適用した。この方法は、絶対表現即ち絶対差強度（ＡＤＩ）から標準偏差（ＳＤ）を考慮することによって、一様な倍率変化カットオフ（ｓｉｎｇｌｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｃｕｔ−ｏｆｆ）の設定を超える方法である。
【００７２】
この方法には以下のステップが含まれる。即ち、（Ａ）市販の「ＭＡＳ５」Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプログラム（サンタクララ、ＣＡ、米国）によるデータ処理及び再評価、（Ｂ）再評価されたデータの正規分布への対数変換、（Ｃ）複数の仮説（遺伝子につき１つの）分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定、（Ｄ）条件ＳＤ（方程式１）の範囲内、条件間の有意限度ＳＤ、いわゆるＲＥＧＥｘｐｒｅｓｓ機能を決定するための平均のＡＤＩレベルにより命じられる２００個の遺伝子のビンの範囲内（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１ ２（１２）；リプリント０００９．１から０００９．３１の方程式２）の頑健平均の決定、並びに（Ｅ）作用の重要性に焦点を当てるためのＲＥＧＥＸｐｒｅｓｓ及びＡＮＯＶＡのｐ値による遺伝子のランク付けである。選択は複数仮説（遺伝子につき１つの）ＡＮＯＶＡ検定からのｐ値及び／又はＲＥＧＥｘｐｒｅｓｓからのｐ値で行う。
【００７３】
プローブアレイは、アルゴンイオンレーザ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのためにＡｇｉｌｅｎｔによって作製された）を使って４８８ｎｍで調べた。量的調査からの読取り値は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現分析ソフトウェアで分析した。
【００７４】
知見は、下記の表Ｉ〜ＩＩＩにまとめる。増加（＋）倍率又は減少（−）倍率は、野生型マウスで発現される同じ遺伝子と比較したときの、ＣＤ１ｄノックアウトマウスで発現される遺伝子の統計学的に有意の相対的な増加倍率又は減少倍率である。ＣＤ１ｄを遮断すると毛包発達を制御する遺伝子は上方調節され、炎症及び癌の発達に関係した遺伝子は下方調節されることは明白になる。
【００７５】
【表１】
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
【実施例６】
【００７８】
ＴＰＡの単回局所投与によって誘発された炎症反応の評価
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ ＢＰ７０１、３８２９７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって提供されたホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸塩（ＴＰＡ）を０．０１％（Ｗ／Ｖ）の量でアセトンに溶かし、急性の炎症反応を誘発するために溶液の２０μｌをＣＤ１ｄ−／−マウス又は野生型マウスの右耳の内部表面に局所的に塗布した。
【００７９】
動物は動物飼育室の個々のケージへ入れ、標準ペレット食餌及び１２時間の明暗周期で飼育した。設備には、２２±２℃の温度、５５±１０％の相対湿度の濾過空気が供給される。
【００８０】
炎症反応は、塗布後６時間、２４時間及び４８時間後にマイクロメーターを使って耳の水腫を測定することによって定量化される（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｇｍｂｈ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ １２５５ Ｄ３６３７２ Ｓｃｈｌｕｃｈｌｅｒｎ、ドイツによって提供された＜＜ｏｄｉｔｅｓｔ＞＞）。
【００８１】
水腫は以下のように計算される。
（水腫＝処理群耳厚み−アセトン群の耳厚み）。
ＣＤ１ｄ−／−群の平均値は、スチューデントのｔ検定を使って野生型群の平均値と比較される。
【実施例７】
【００８２】
アラキドン酸の単回局所投与によって誘発された炎症反応の評価
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ ＢＰ７０１、３８２９７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって提供されたアラキドン酸（５−８−１１−エイコサテトラエン酸）を１４０ｎＭの濃度でアセトンに溶かし、急性の炎症反応を誘発するために溶液の２５μｌをＣＤ１ｄ−／−マウス又は野生型マウスの右耳の内部表面に局所的に塗布した。
【００８３】
動物は動物飼育室の個々のケージへ入れ、標準ペレット食餌及び１２時間の明暗周期で飼育した。設備には、２２±２℃の温度、５５±１０％の相対湿度の濾過空気が供給された。
【００８４】
炎症反応は、塗布後１時間、２時間及び４時間後にマイクロメーターを使って耳の水腫を測定することによって定量化される（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｇｍｂｈ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ １２５５ Ｄ３６３７２ Ｓｃｈｌｕｃｈｌｅｒｎ、ドイツによって提供された＜＜ｏｄｉｔｅｓｔ＞＞）。
【００８５】
水腫は以下のように計算される。
（水腫＝処理群耳厚み−アセトン群の耳厚み）。
ＣＤ１ｄ−／−群の平均値は、スチューデントのｔ検定を使って野生型群の平均値と比較される。
【実施例８】
【００８６】
オキサゾロンによって誘発されたＤＴＨ（遅延型過敏症）反応の評価
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ ＢＰ７０１、３８２９７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって提供されたオキサゾロン（４−エトキシメチレン−２−フェニル−オキサゾール−５−オン）を１％（Ｗ／Ｖ）の濃度でアセトンに溶かし、溶液の５０μｌを毛剃りＣＤ１ｄ−／−マウス又は毛剃り野生型マウスの腹部皮膚に１日１回、４日間塗布する。
【００８７】
４日後に、動物はアセトンに０．３％の用量で溶かしたオキサゾロンによる右耳の内部表面上への単回投与（２０μｌ）によりチャレンジされる。チャレンジ後の反応は、塗布後２４時間及び４８時間後にマイクロメーターを使って耳の水腫を測定することによって定量化される（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｇｍｂｈ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ １２５５ Ｄ３６３７２ Ｓｃｈｌｕｃｈｌｅｒｎ、ドイツによって提供された＜＜ｏｄｉｔｅｓｔ＞＞）。
【００８８】
水腫は以下のように計算される。
（水腫＝処理群耳厚み−アセトン群の耳厚み）。
ＣＤ１ｄ−／−群の平均値は、スチューデントのｔ検定を使って野生型群の平均値と比較される。
【実施例９】
【００８９】
太陽シミュレーターを用いたＵＶ照射によって誘発される皮膚損傷の評価
ＵＶＣフィルターを備えた太陽シミュレーター（Ｏｒｉｅｌ ８１０５０）を用いてＣＤ１ｄ−／−マウス又は野生型マウスを照射する。
【００９０】
照射：ＵＶＢ＋ＵＶＡ線量、正確にする
表皮への作用：ＳＢＣ計数、表皮性過形成測定
真皮への作用：免疫組織化学的方法によるＭＭＰ１及びＭＭＰ３発現
【実施例１０】
【００９１】
ＵＶ照射によるＣＤ１ｄ遺伝子転写の調節並びにＵＶ誘発ＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子転写の調節におけるＣＤ１ｄの役割
マウス
ＳＰＦ雄非近交系１２９／Ｃ５７ＢＬ／６野生型及び１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ１ｄノックアウトマウスをＬ．Ｖａｎ Ｋａｅｒ、ヴァンダービルト大学医療センター（ナッシュビル、ＴＮ、米国）から入手した。動物は、現行のスイス規則及び基準に従って施設で維持された。動物はフィルターで保護されたケージに収容され、周囲の照明は１２時間明／１２時間暗の周期となるように調節された。オートクレーブされたオープンフォーミュラマウス固形飼料及び水は、無制限に供給された。組織のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはすべての動物処置を審査して承認した。各実験内で、すべてのマウスは年齢及び性別を揃えた。各実験の開始時、マウスは１６週齢であった。
【００９２】
ＵＶ光源
ＵＶＢ光源はフィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯（フィリップス社、オランダ）５個一列を用いた。これらのランプは、２７０から４００ｎｍのスペクトルを発する。照射の５４％は太陽スペクトルのＵＶＢ範囲（２８０〜３１５ｎｍ）内であり、４５％はＵＶＡ（３１５〜４００ｎｍ）の領域、１％未満がＵＶ−Ｃ（２４０〜２８０ｎｍ）の範囲内であった。５つの電球の放照射度は、ＵＶＢ ＰＭＡリサーチ輻射計で測定すると平均で１０Ｗ／ｍ２であった。太陽のシミュレーション光（ＵＶＡ＋ＵＶＢ）は、ＷＧ−３２０大気減衰フィルター（厚さ１ｍｍ）、可視／赤外帯域通過遮断フィルター（ＵＧ−５；厚さ５ｍｍ）、並びに更に可視及び赤外線のエネルギーを減らすダイクロイックミラーを備えた１０００ＷのエクソンＵＶ太陽シミュレーター（Ｓｏｌａｒ Ｌｉｇｈｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＰＡ、米国）によって作られた。
【００９３】
マウスのＵＶ照射
マウスの背側の毛は、電気クリッパーで取り除いた。ＵＶＢ照射に曝されたマウスは、プレキシガラスデバイダーで個々の区画に分けられたプレキシガラスの箱に入れ、入射線量を１４％カットする針金トップで覆った。各ＵＶＢ照射のために、電球の長辺方向のエネルギーの偏在を補償するために、各回ランプの下の同じ位置に箱を置いた。太陽のＵＶ光線（ＵＶＡ＋ＵＶＢ）に曝すマウスについては、太陽シミュレーターの光線を照射する前にマウスに麻酔をかけて固定した。マウスは、フィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯５個からの８６、２１５又は４３０ｍＪ／ｃｍ２ ＵＶＢの入射線量に１度曝露した。太陽光線（ＵＶＡ＋ＵＶＢ）に曝すマウスは、１６８０（１分）、１６，８００（１０分）又は３３，６００ｍＪ／ｃｍ２（２０分）の太陽光入射線に１度曝された。
【００９４】
ケラチノサイト細胞培養のＵＶ照射
無菌の６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）で培養したケラチノサイトの集密培養物を、太陽のＵＶ照射に１回（５７００ｍＪ／ｃｍ２）曝した。培地を取り除き無菌のＨＢＳＳで置換した後、プラスチックの蓋をしないで処理を行った。対照培養物は、照射しなかった。ＵＶ曝露の後、ＨＢＳＳを取り除いて培地を培養物に戻した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、その後様々な時点でＲＮＡのために収穫した。
【００９５】
マウス組織の免疫染色
野生型マウス皮膚の生検材料をホルマリン固定してからパラフィンに包埋した。パラフィン包埋組織の切片（厚さ５μｍ）を作成し、弱く加熱してパラフィンを除き、脱水して以下の手順で再水和した。即ち、キシレン中で３分間を２回、エチルアルコール１００％中で３分、エチルアルコール９５％中で３分、エチルアルコール８０％中で３分及びＰＢＳ １×中で３分とした。新鮮な皮膚をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（４５８３、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、米国）にも包埋し、液体窒素で凍結させた。次に切片をＰＢＳ １×中で数分間再水和した。切片は抗マウスＣＤ１ｄ １Ｈ１一次ｍＡｂを使って染色し、マウスＨｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ｐｌｕｓキット（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、サンフランシスコ、米国）を使って展開した。
【００９６】
皮膚又は細胞溶解物からの総ＲＮＡの抽出
６穴プレートで培養したヒトケラチノサイトの処理培養物及び対照培養物を氷上に置き、４℃のＰＢＳ １×を使って２回洗浄した。１％のβ−メルカプトエタノールを加えた３５０μｌの細胞溶解緩衝液ＲＬＴ（７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）中で細胞をこすり、軽く撹拌して細胞溶解物を得た。１３，０００×ｇで２分間遠心にかけて細胞抽出物をホモジナイズするのにＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（７９６５６、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）を用いた。次に、メーカーのプロトコルに従ってＲＮＡｅａｓｙキット（７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）を使って総ＲＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ混入物は、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼセット（７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）を使い、オンカラムＤＮアーゼ消化で取り除いた。１ｃｍ×１ｃｍの皮膚試料を細断し、ローターステーターホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、Ｌｕｚｅｒｎ、スイス）を用いて１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（１５５９６−０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、バーゼル、スイス）中でホモジナイズした。１２，０００×ｇでの遠心の後に得られた上清を新しい試験管に回収し、室温で５分間インキュベートした。０．２ｍｌのクロロホルムを試験管に加え、それを１５秒間激しく振盪し、室温で２〜３分間インキュベートした。試料を１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上の水相を新しい試験管へ移し、総ＲＮＡを０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを使って室温で１０分間沈殿させた。４℃における１２，０００×ｇで１０分間の遠心によって得られたＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％ＥｔＯＨで洗浄し、次に７，５００×ｇ５分間、４℃で遠心した。ＲＮＡペレットは最終的に室温で乾燥し、試料を５５〜６０℃で１０分間インキュベートすることによってＲＮａｓｅを含まない４０μｌの水に溶かした。可能なＤＮＡ汚染は、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼセットを使ってオンカラムＤＮアーゼ消化で取り除いた。
【００９７】
半定量的なＲＴ−ＰＣＲ
Ａ．逆転写ＰＣＲ法及びＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（１１９０４−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、バーゼル、スイス）をメーカーの説明書に従って使い、オリゴｄＴプライミングにより５μｇの総ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡのＰＣＲは、単一遺伝子（単一ＰＣＲ）又は同義遺伝子（同義遺伝子ＰＣＲ）の特異的発現を検出するために行われた。単一ＰＣＲについては、５μｌのＰＣＲ緩衝液、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５０μＭセンス及びアンチセンスのオリゴヌクレオチドを０．５μｌ、３μｌのＤＭＳＯ、３４．５μｌの水並びに０．５μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む４８μｌのＰＣＲマスターミックスを、２μｌのｃＤＮＡに加えた。すべての試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１５５５８−０２６及び１８４２７−０１３、バーゼル、スイス）から購入した。ｃＤＮＡ試料の増幅のために適用されたサイクル回数及びアニーリング温度は試験した各遺伝子に特有で、１サイクルは９４℃で３０秒、ｘ℃で３０秒、及び７２℃で３０秒からなり、各増幅の前には９４℃で２分間処理され、７２℃で３分間の処理で終了した。アポトーシス及び炎症に関係する遺伝子の同義遺伝子ＰＣＲのためのキットＭＰ−７０２１１（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンフランシスコ、米国）を説明書通りに用いた。各キットを使う前に、同義遺伝子を検出するために複数の逆方向プライマー及び順方向プライマーを同時に操作する条件を決定した。ＴＮＦ−α及びＣＯＸ−２遺伝子を検出するためのプライマーを含んだキットＭＰ−７０２１１の使用条件は次の通りである。９６℃で１分間及び６０℃で４分間（２サイクル）；９４℃で１分間及び６０℃で２分間（２９サイクル）；７０℃で１０分間（１サイクル）及び２５℃で浸漬。１組の条件下で同義遺伝子を検出するためのＭＰＣＲキットで使用した逆方向プライマー及び順方向プライマーのＤＮＡ塩基配列は工業所有権があるので、この報告書では記載しない。
【００９８】
プライマー配列及び増幅サイクル数
ヒト：
【表４】
【００９９】
マウス：
【表５】
【０１００】
Ｂ．ｍＲＮＡレベルの相対的定量化
遺伝子の増幅は、２％のエチジウムブロマイドを含む１ＸＴＡＥ緩衝液中で１５０Ｖで３０分間流した３％アガロースゲルに１０μｌのＰＣＲ産物をロードすることによって分析した。ＰＣＲ産物はＵＶ光下で蛍光バンドとして視覚化された。ゲルはＫｏｄａｃ ＤＣ １２０カメラを使って調べ、バンドの蛍光強度はソフトウェアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ β４．０２ Ｗｉｎ（Ｓｃｉｏｎ社、メリーランド、米国）を使って定量化した。
【０１０１】
ネズミの系におけるＣＤ１ｄタンパク質の研究は腸管の上皮細胞及び肝細胞と同様に多くの種類の造血細胞における広範囲で構成的な発現を示唆するが、この分子が正常及び／又はＵＶ照射のマウス皮膚細胞、特にケラチノサイトによって発現されるかどうかは分かっていない。この問題に対処するため、非照射及びＵＶＢ照射の野生型マウスからの皮膚をホルマリンで固定し、切片を作製し、抗マウスＣＤ１ｄ ｍＡｂ（１Ｈ１）を使って染色してＣＤ１ｄタンパク質を検出した。正常の非照射皮膚のＣＤ１ｄタンパク質の検出は陰性であった（データは示されていない）。しかし、ＣＤ１ｄタンパク質は、ＵＶＢを照射したマウス皮膚の表皮及び真皮で検出された（茶色）（図５）。染色は主に皮膚のより分化した層（顆粒層及び角質層）に限定され、細胞レベルでは細胞質及び核膜に限局された。
【０１０２】
このように、ＵＶＢ起因性マウス皮膚損傷／火傷は抗原提示細胞（局所的又は全身的）によってではなく、マウスケラチノサイトのレベルで直接制御される。
【０１０３】
ＣＤ１ｄ遺伝子転写はＵＶ照射によって調節される
ＵＶＢ起因性皮膚損傷がＣＤ１ｄによって調節され、ＣＤ１ｄタンパク質がマウス表皮細胞（ケラチノサイト）によって発現されることが証明され、次に重要なことは皮膚ＣＤ１ｄ発現がＵＶ照射によって調節されるかどうかの立証であった。皮膚ＣＤ１ｄ発現がＵＶ照射によって調節されることのいかなる指標は、皮膚内ＣＤ１ｄレベルの調整がＵＶ誘発性皮膚損傷の調節を担う重要な因子であることを示唆するであろう。この問題に対処するために、野生型マウスの毛剃りをした背をＵＶＢ照射に単回（８６ｍＪ／ｃｍ２）曝し、照射後様々な時間（６、２４、４８、７２及び９６時間後）に照射された皮膚を切除し、ＲＮＡを抽出して精製し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。対照として、正常非照射マウス皮膚を切除し、ＲＮＡを抽出して精製し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１０４】
図６で示すように、ＵＶＢ照射から６時間後には早くも低下したマウス皮膚全体におけるＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルは、照射後２４時間には正常な非照射皮膚で検出されたレベルと比較して有意に低下していた。対照的に、ＵＶＢ照射から４８、７２及び９６時間後には、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルは正常な非照射の対照皮膚で検出されたレベルより高くなっていた。皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写に及ぼすＵＶＢ照射の作用に関する我々の研究を更に確認するために、我々は野生型マウスの剃った背を太陽のＵＶ照射（ＵＶＢ＋ＵＶＡ）の様々な線量（太陽ＵＶ光の１６８０ｍＪ／ｃｍ２（１分）、１６，８００ｍＪ／ｃｍ２（１０分）又は３３，６００ｍＪ／ｃｍ２（２０分））に露出させた。照射から６及び７２時間後、照射皮膚を切除し、ＲＮＡを抽出して精製し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した（図７）。ＵＶＢ照射と同様に、我々はＵＶ線量を問わず太陽ＵＶ照射から６及び７２時間後に類似したＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルのそれぞれ低下及び上昇を観察し、ＵＶ照射への皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写の反応はＵＶ曝露の有害な作用に対する皮膚の反応における重要な事象であることを示唆している。
【０１０５】
ヒトケラチノサイトＣＤ１ｄ遺伝子転写は、太陽ＵＶ光照射によって調節される
ヒトＣＤ１ｄ遺伝子転写がＵＶ照射によって調節されるかどうか取り組む中で、培養ヒトケラチノサイトがＵＶ照射に対して類似した遺伝子転写動態プロフィールを示すかどうか調査を行った。３反復のＤＫ７細胞ケラチノサイト培養物を１回量５７００ｍＪ／ｃｍ２の太陽ＵＶ光照射へ曝露してから異なる時間に細胞をＲＮＡのために収穫し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡの相対レベルを決定するために半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実行した（図８）。ＵＶ照射（ＵＶＢ又は太陽光）マウス皮膚で観察されたように、正常な非照射対照と比較して、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルは照射後６時間に低下した。照射後１０時間のＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルの分析の結果、これらのレベルは正常な非照射細胞培養で検出されたレベルと比較して更に減少していたことが分かった。ＵＶ曝露から１６時間及び４８時間の間に、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡのレベルは比例的に増加した。また、マウス皮膚におけるＵＶ誘発性ＣＤ１ｄ遺伝子転写はケラチノサイトのレベルで調節されている可能性を示唆するパターンも、ＵＶ照射を受けた野生型マウスの全皮膚で観察された。
【０１０６】
ヒトケラチノサイトＣＤ１ｄ遺伝子転写はＵＶ照射に反応し、マウス皮膚ＣＤ１ｄと同様の方法で調節されるようであり、このことはａ）皮膚ＣＤ１ｄはＵＶ照射に対する皮膚反応の調節において重要な役割を担い、またｂ）皮膚のＣＤ１ｄレベルの調整はＵＶ誘発性皮膚炎症／損傷の調節を担う重要な因子であることを暗示している。
【０１０７】
皮膚炎症を調節する鍵遺伝子の遺伝子転写は、ＵＶＢを照射したＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚では減少する
ＵＶＢ誘発性皮膚炎症／損傷の調節を担う重要な分子としてのＣＤ１ｄを更に確認するために、我々は次にＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子転写（ＵＶＢ誘発性の皮膚炎症／損傷の調節を担う鍵遺伝子）はＵＶ光を照射したＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚では調節されないかどうかを調査した。ＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚においてＣＯＸ−２及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルがＵＶ光照射から４８及び７２時間後に阻害されることが分かった（図９）。ＵＶ光誘発性皮膚損傷／炎症がＵＶ光照射から４８及び７２時間後に野生型マウスで観察されることから、これらのデータは皮膚ＣＤ１ｄがＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子の転写を誘発することによってＵＶ光誘発性皮膚炎症／損傷を媒介することを証明している。
【実施例１１】
【０１０８】
ＣＤ１ｄノックアウトマウスのＵＶ照射をした皮膚の炎症性サイトカイン合成は、野生型対照マウスと比較して減少する。
【０１０９】
マウスのＵＶ照射
マウスは、２００ｍＪ／ｍ２のＵＶＢの入射線量に１度曝露させた。３カ月齢の雌近交の１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ及び１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ１ｄ ＫＯマウスがこの研究に含まれた（ｎ＝４）。
【０１１０】
サイトカイン定量化
皮膚の８ｍｍパンチ生検材を照射後０、２４、４８、７２、９６及び１６８時間後に収穫して直ちに液体窒素で凍結した。古典的ＥＬＩＳＡ法を用いて皮膚ホモジェネートのＩＬ−６及びＭＩＰ１−αを定量した。
【０１１１】
ＷＴマウスではＵＶ−Ｂ照射は照射の４８時間後に炎症性サイトカイン合成の高い上方調節を誘発するが、ＣＤ１ｄ ＫＯマウスではＩＬ−６及びＭＩＰ１−αタンパク質の合成は有意に減少する。このことはＵＶＢ誘発性皮膚炎症におけるＣＤ１ｄの主要な役割を示す。
【実施例１２】
【０１１２】
ヒドロコルチゾンは、化学的ストレス誘発性ＣＤ１ｄ遺伝子転写を抑制する。
【０１１３】
一次ヒトケラチノサイトを完全ＫＧＭで培養してから、ストレス因子としての３００μＭのＨ２Ｏ２に曝露させた。接種の４８時間後にＫＧＭ培地をヒドロコルチゾンを含まないＫＧＭで置換し、培養物を３００μＭのＨ２Ｏ２で処理した。処理後異なる時間で総ＲＮＡを抽出し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲによって定量化した。
【０１１４】
Ｔａｑ Ｍａｎ検定については、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓは１ウェルあたり１０から１００ｎｇの初期のＲＮＡ量の使用を推奨している。したがって、第１鎖ｃＤＮＡの合成は、メーカーの推奨（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ、１１９０４−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って１μｇの総ＲＮＡ及び１５０μｇのランダム六量体を使って２０μｌの体積で行った。得られたｃＤＮＡ試料の１μｌをリアルタイムＰＣＲによる増幅のために使用した。
【０１１５】
ＣＤ１ｄのｃＤＮＡの検出のために使われたプライマー及びプローブのセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからＡｓｓａｙｓ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄとして提供された（それぞれＨｓ００１７４３２１＿ｍｌ及びＨｓ００１６６２８９＿ｍｌ）。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのためのプライマー及びプローブはＰＤＡＲＳ（４３１０８８４Ｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として提供された。
【０１１６】
すべてのｃＤＮＡ試料は３反復で試験した。ＰＣＲ反応混合物はミクロ遠心管で氷上で調製した。１反復は、１．２５μｌの２０×の標的又は対照の混合液、１０．２５μｌの水及び１２．５μｌの２×のＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ混合液を使って２４μｌのプレミックスを作製し、１μｌのｃＤＮＡに加えた。ＰＣＲ反応混合物を穏やかに且つ速く遠心分離し、９６ウェルプレートに１ウェルにつき２５μｌを等分して入れた。プレートを密封し、２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、以下のＰＣＲプログラムを用いた温度サイクル及び蛍光分析のための５７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムに入れた：
− ５０℃２分
− ９５℃１０分
− ９５℃１５秒及び６０℃１分を４０サイクル
【０１１７】
結果は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ ＳＤＳソフトウェアを使用して解析した。サイクル数の関数としての関心のあるｃＤＮＡの増幅を示す増幅グラフが得られた。
【０１１８】
対照条件と比較してこの試験条件で得られた遺伝子発現倍率の変化は、下記式を使って比較Ｃｔ法で測定された：
【数１】
【０１１９】
図１１で示すように、細胞がＨ２Ｏ２に曝されたときにＣＤ１ｄ遺伝子発現の調整が時間と共に観察される。ヒドロコルチゾンの存在下では、Ｈ２Ｏ２チャレンジ後に得られるＣＤ１ｄ遺伝子発現のパターンはヒドロコルチゾンがＣＤ１ｄ転写を抑制した点で異なった。
【０１２０】
このように、ヒドロコルチゾンはストレスを受けた細胞でＣＤ１ｄの発現を抑制することができる。
【実施例１３】
【０１２１】
リン脂質レベルは、野生型マウス皮膚と比較してＣＤ１ｄノックアウトマウスの皮膚及び腸では調節されない。
【０１２２】
マウス：５カ月齢の雌近交のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ１ｄ−／−及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを屠殺してそれぞれの組織を切除した。各マウスからの皮膚／腸管組織の切片を液体窒素で急速冷凍した。それらを脂質含量について分析した。
【０１２３】
皮膚のＣＤ１ｄによって調節された主な脂質ファミリーはリン脂質であった。
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
スフィンゴミエリン
動物細胞膜の遍在構成成分であり、断然最も多く存在するスフィンゴ脂質である。実際、ある種の組織では脂質の５０％を占めるが、通常ホスファチジルコリンよりは少ない。例えば、スフィンゴミエリンは脳脂質の約１０％を占める。大部分の反すう動物の赤血球に単独で最も多く存在する脂質であり、そこでは完全にホスファチジルコリンを置換する。この場合、スフィンゴミエリンは分解しないがグリセロリン脂質を分解する非常に活性の高いホスホリパーゼＡが存在することが知られている。ホスファチジルコリンと同様に、スフィンゴミエリンは原形質膜、特に細胞の外側の小葉に最も豊富となる傾向がある。
【０１２６】
今ではスフィンゴミエリン（及び他のスフィンゴ脂質）並びにコレステロールは、一緒に膜の特定のサブドメイン（「ラフト（ｒａｆｔ）」又は「カベオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）」と呼ばれる関連した構造）に位置することが分かっている。長く、多くは飽和したアシル鎖を含んでいるので、スフィンゴ脂質は、膜グリセロリン脂質より互いに密に充填され、そのため融点もはるかに高い。このアシル鎖の密な充填はラフト脂質の組織化に必須であるが、その理由は、スフィンゴ脂質及びリン脂質の差別的充填機能が、膜内で相分離をもたらし、グリセロリン脂質の豊富な領域（「無秩序液」相）で囲まれたスフィンゴ脂質の豊富なラフト（「秩序液」相）を生じると考えられているからである。特定の細胞タンパク質とこれらラフトの脂質間の相互作用はシグナル伝達機構に重要と考えられており、細胞シグナル伝達の調節におけるスフィンゴミエリンの重要な役割を暗示している。
【０１２７】
スフィンゴミエリンは、アポトーシスに関係するシグナル伝達プロセスにおける鍵脂質である。
【０１２８】
また、スフィンゴミエリンはセラミド、長鎖塩基及び「スフィンゴミエリンサイクル」の一部としてスフィンゴシン−１−リン酸塩、並びに他の多くの重要なスフィンゴ脂質の前駆体の役目もする。（下記図を参照）。これらの一部は細胞内メッセンジャーの機能を有し、一部は必須の膜構成成分である。
【化１】
【０１２９】
リゾホスファチジルコリン
− 炎症誘発性のリン脂質
− 乾癬病変で上昇する
− 皮内注射は皮膚炎症を誘発する
− アラキドン酸の生産において律速段階であるホスホリパーゼＡ２の作用によって形成される。（ＣＤ１ｄによるＣＯＸ−２の調節との関連）。
【０１３０】
大腸では以下の結果が得られた：
【表７】
【０１３１】
小腸では以下の結果が得られた：
【表８】
【０１３２】
この上記データは、炎症プロセスを制御するリン脂質代謝の調節におけるＣＤ１ｄの役割を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害（火傷）を示す野生型マウスの図である。
【図１Ｂ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害（火傷）を示す野生型マウスの図である。（拡大図）
【図１Ｃ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害の明瞭な徴候を示さないＣＤ１ｄノックアウトマウスの図である。
【図１Ｄ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害の明瞭な徴候を示さないＣＤ１ｄノックアウトマウスの図である。（拡大図）
【図２】ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）を２回投与された野生型（右）及びＣＤ１ｄノックアウト（左）マウス間のＵＶＢによって誘発された皮膚傷害の程度の差を示す図である。
【図２Ａ】ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）を２回投与された野生型マウスの傷害（病変）を受けた背面皮膚を示す図である。（拡大図）
【図２Ｂ】ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）を２回投与されたＣＤ１ｄノックアウトマウスの無傷の背面皮膚を示す図である。
【図３】ＴＵＮＥＬで測定した場合の、野生型マウスと比較して背面の表皮により多くの表皮アポトーシスを示すＣＤ１ｄノックアウトマウスの図である。ＵＶ照射に曝されない野生型（Ａ）及びＣＤ１ｄノックアウト（Ｂ）マウスの皮膚。ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）に１回曝されてから４８時間後の野生型（Ｃ）及びＣＤ１ｄノックアウト（Ｄ）マウスの皮膚。
【図４ａ】マウス及びヒトの異なる組織におけるＣＤ１ｄのおよその量を示すグラフである。
【図４ｂ】マウス及びヒトの異なる組織におけるＣＤ１ｄのおよその量を示すグラフである。
【図５】ＵＶＢ照射の単回投与（４３０ｍＪ／ｍ２）後７２時間のマウス皮膚表皮に発現したＣＤ１ｄタンパク質を示す図である。
【図６】ＵＶＢ照射後に調節されたマウス皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写を示す図である。
【図７】模擬太陽光照射後に調節されたマウス皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写を示す図である。
【図８】太陽光のＵＶ照射後に調節された、不死化（ＤＫ７）ヒトケラチノサイトのＣＤ１ｄ遺伝子転写を示す図である。
【図９】ＵＶＢ照射ＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚においてＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α ｍＲＮＡレベルが下方調節されたことを示す図である。
【図１０ａ】ＣＤ１ｄ ＫＯマウスにおいてＵＶＢ照射４８時間後にマウス皮膚ＩＬ−６及びＭＩＰ１−αタンパク質レベルが顕著に低下したことを示す図である。
【図１０ｂ】ＣＤ１ｄ ＫＯマウスにおいてＵＶＢ照射４８時間後にマウス皮膚ＩＬ−６及びＭＩＰ１−αタンパク質レベルが顕著に低下したことを示す図である。
【図１１】ヒドロコルチゾンが化学的ストレスに曝された細胞でＣＤ１ｄ転写を抑制することを示す図である。
【図１２】ヒト毛包で発現したＣＤ１ｄを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば炎症反応、加齢又は癌などによって引き起こされる上皮組織損傷を予防及び／又は治療するための方法に関し、且つ／又は脱毛症を予防及び／又は治療する方法に関する。詳細には、本発明は内因性ＣＤ１ｄ機能を修飾、特に阻止する物質及び／又は組成物に関する。他の態様によると、本発明は本発明の方法及び組成物での使用に適当な化合物についてスクリーニングするための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物で最も目立つ上皮組織は皮膚であり、生物で最大の器官となっている。表皮、真皮及び角質層からなる皮膚外皮系は内臓のそれらと相関し、並行して環境と相互に作用する。皮膚は環境と生物それ自身の境界となっており、体外因子、更には生物の体内系の変数パラメーターによってかなり作用される。したがって皮膚の調整機構は、皮膚外皮の形態及び活動に関する通常の病理学的事象を維持するのに必要な全身の変化を誘導するために、常に活性でなければならない。皮膚の要求にしたがって増加した十分なエネルギー物質及び形成性物質の十分な消費を保証する多くの過程は、皮膚構造の形態学的及び機能上の安定性を保証するものとなる。それ故、皮膚外皮の状態は、健康な皮膚特性、例えば障壁機能、弾性、膨圧特性、保湿、色素沈着その他をもたらす皮膚細胞の活力及び活性に必要な代謝過程の実現を決定する。
【０００３】
生物の生涯の間、老化に特徴的な異なる徴候が皮膚上に現れるが、主な臨床徴候は小じわと深いしわの出現であり、これらは年齢と共に増加するか目立つようになる。更に、皮膚の色つやは通常変化し、部分的にびまん性の炎症及び時折末梢血管拡張症が発生することもある。
【０００４】
老化に伴うこれらの徴候は、外因性作用、例えばＵＶ照射、汚染物質、フリーラジカル又は化学物質に対する皮膚の曝露によっても促進される。
【０００５】
中程度のＵＶ曝露は通常、紅斑として知られる炎症反応を伴う皮膚の発赤という公知の作用を起こす。この現象はしばしば「日焼け」とも称され、疼痛を伴い、一般に後に皮膚の剥離をもたらす。
【０００６】
更に、皮膚の過剰なＵＶ曝露は重い障害、例えば発癌をもたらすことがあり、最も普通に見られる腫瘍は基底細胞癌（ＢＣＣ）であり、扁平上皮癌（ＳＣＣ）がこれに続き、より稀には悪性黒色腫が見られる。ＤＮＡレベルでの傷害は別として、ＵＶ曝露に起因する免疫抑制も非メラノーマ及びメラノーマの癌の促進の要因となるようである。光誘導性免疫抑制は、誘発された腫瘍細胞による通常の免疫学的機構による認識及び拒絶反応の回避、並びに長期間の潜在、並びに結局は増殖して腫瘍に発達するのを許すことが、現在は認められている。この概念は、遺伝的（色素性乾皮症）であれ薬学的であれ免疫不全の患者、例えば、臓器移植患者は、免疫系が正しく機能している人々と比較して皮膚癌の発生率が高い知見と一致する。
【０００７】
当技術分野では、上皮細胞、特に皮膚上皮細胞に対する環境因子の破壊的な作用を予防するために、いくつかの手段が提案されている。
【０００８】
太陽光線に対する保護に関しては「日焼け防止剤（ｓｕｎｂｌｏｃｋ）」又は「日焼け止め（ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ）」が利用できるようになっているが、これらは日光曝露の前に皮膚に塗布される。一般的に、日焼け止め組成物は化学物質、例えばある種のベンゾフェノン、ジベンジルメタン又は置換されたパラアミノ安息香酸塩、即ち紫外線を吸収してそれが皮膚を透過することができないようにする化合物を含む。しかし、この目的のために使われる化合物の一部は十分な耐光性が不足し、しかも長期間の塗布により毒性化することがある。更に、これら化合物が有効となるには、曝露時に連続的に皮膚上に存在しなければならない。しかし、日焼け止めは簡単にこすり落とされ、発汗又は遊泳によって洗い落とされ、また、皮膚に浸透して失われる。
【０００９】
皮膚劣化又は老化を予防する他の手段は、それぞれフリーラジカルを除去する化合物を提供することである。この点に関し、欧州特許第０ ７６１ ２１４号はアニリン誘導体及びジフルフリル誘導体を含む一重項酸素失活剤を開示しており、これらは皮膚に対する酸化性ストレスを低下させると報告されている。
【００１０】
しかしこれらすべての手段及び方法は、我々の環境で増加している曝露の危険性から皮膚を守る能力が十分にあるというわけではない。これに寄与しているのが増加した大気汚染であり、更には社会的行動であり、つまり日焼けが健康、美及び健康状態と結び付けられている。結果として、そのような行動に伴う負の結果が公知となっているにもかかわらず、多くの人々は褐色の肌を得るために皮膚を太陽光線に曝す。地球を覆っているオゾン層が薄くなりＵＶ照射による生物の曝露が多くなっているので、この問題はより顕著になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、皮膚を環境因子、例えばストレスや太陽光線からより良く保護する手段を当技術分野で提供する必要がある。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、環境で遭遇する好ましくない作用、特に酸化性若しくは化学薬品ストレス又は太陽光線から皮膚を保護するために、従来の技術の欠点を取り除き、そのような手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この問題は、上皮細胞内の内因性のＣＤ１ｄ機能を実質的に変更、特に遮断することのできる物質の提供によって解決された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、基本的に、いくつかの異なる細胞、特に上皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質であるＣＤ１ｄが、ストレスに対する細胞の様々な異なる反応を調整するという知見に基づく。以下の好ましい実施形態の詳述から明らかとなるように、前記膜分子を有する細胞で内因性のＣＤ１ｄ機能を本質的に修飾、特に遮断することは、例えば日焼けの結果起こる紫外線照射誘発皮膚傷害、表皮過形成、突然変異体ｐ５３蓄積、炎症、免疫抑制及び皮膚老化などのストレスの有害作用の予防を可能にする。更に驚くべき知見は、上皮細胞でＣＤ１ｄ機能を本質的に遮断する場合、前記細胞での癌の誘発、即ち基底細胞癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫、大腸癌、乳癌、肝癌、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌その他の誘発を予防することができることである。更に、驚くべきことに、ＣＤ１ｄ機能を修飾、特に遮断すると毛の成長及び／又は発達に作用することがわかった。
【００１５】
ＣＤ１ｄそれ自体は、β２マイクログロブリンと非共有結合で結合する１型膜貫通ＭＨＣクラス１様タンパク質である。ＣＤ１ｄ分子は、免疫調節的及び作動的反応で役割を果たすナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）のＴ細胞受容体によって認識される。ＣＤ１ｄはＮＫＴ細胞に対してその活性化のために脂質を提供することが証明されたが、この考えは免疫系に脂質のような疎水性分子を提供するために必要な２つの非常に疎水性の溝を有すＣｄ１ｄの結晶構造が裏付ける。
【００１６】
本発明につながる研究において、驚くことにマウス皮膚のＣＤ１ｄ遺伝子転写が外部ストレス、例えばＵＶ照射に応答することが指摘されているが、この知見はヒトケラチノサイトで確認された。更に、皮膚ＣＤ１ｄがＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子の転写を誘発し、更にＵＶ誘発性アポトーシスを抑制することによって、ＵＶ誘発性皮膚損傷／炎症を媒介することが指摘された。
【００１７】
いかなる理論にも縛られることを欲しないが、生物におけるＣＤ１ｄの内因性の役割の１つは、正常上皮細胞のホメオスタシスを直接制御することであると現在仮定されている。正常な皮膚ホメオスタシスは、表皮細胞の表皮分化、アポトーシス、増殖及び抗アポトーシスの間のきわどく、繊細に調整されたバランスに依存している。皮膚では、これらのプロセスは脂質を通して、特にセラミド及びグルコシルセラミド（スフィンゴリピド）によって調節される。核をもつ細胞層がグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）を生成する一方、Ｃｅｒに対するＧｌｃＣｅｒの割合は表皮分化の後期には低下し、Ｃｅｒ含量は表皮透過障壁の細胞外成分の働きをしている角質層で最大となる。その構造特性に加えて、セラミドは細胞増殖阻害、細胞分化誘発及びプログラム細胞死と関係している。対照的に、ＧｌｃＣｅｒは細胞増殖を誘発してプログラム細胞死を抑制する。
【００１８】
本発明の知見に基づき、ＣＤ１ｄは前記脂質による生物学的な役割の成就を媒介する受容体の１つと考えられる。具体的には、ＣＤ１ｄはアポトーシスの負の制御をするようである。したがって、ストレス状況下の細胞では、例えばＵＶ照射に曝露したときにはＣＤ１ｄはたとえそれらの遺伝物質が傷害を受け且つ／又は突然変異した場合でも前記ストレス下の細胞の継続した生存を支えるが、障害細胞は誘発された炎症プロセスに寄与して結局は老化現象又は腫瘍発達の原因となる。
【００１９】
内因性のＣＤ１ｄ機能の遮断及び／又は修飾においては、ストレス下の細胞の生残及び増殖の代わりにアポトーシスが促進され、ある程度の傷害、特にＤＮＡレベルの障害細胞が増殖してある場合には体内に拡散する可能性がなくなるかもしれない。一旦死んだ細胞は体内で自然のプロセスによって消滅し、「健全な」上皮細胞によって置換される。同様に、ＣＤ１ｄの遮断又は修飾によってもＮＫＴとの相互作用は実質的に阻止されるか、改変され、その場合、ＵＶ光線への曝露中の免疫抑制現象は本質的に減少するか、完全に阻止されよう。また、この状態は、生物の免疫系がＵＶ照射で生じた障害細胞を根絶するのを促進すると考えられる。
【００２０】
ＣＤ１ｄ膜貫通分子の活性を遮断及び／又は修飾することができる物質は、ＣＤ１ｄの内因性生物学的機能と干渉するいかなる物質でよく、特にＣＤ１ｄと内因性又は外因性脂質との結合を阻止するか減少させるいかなる物質でよい。このような物質は以下のステップを含む方法で得られる。即ち、（ａ）上皮細胞を関心のある物質に曝すステップ、（ｂ）前記上皮細胞をストレス状況に置くステップ、（ｃ）前記上皮細胞に対する前記ストレスの作用を以下の検定：（ｉ）上皮過形成（Ｈ＆Ｅ）、（ｉｉ）上皮増殖（ＢｒＵｄ、ＰＣＮＡ）、（ｉｉｉ）上皮アポトーシス、（ｉｖ）ｐ５３突然変異蓄積、（ｖ）上皮脂質の定量的及び定性的評価、（ｖｉ）アポトーシス細胞及び非アポトーシス細胞の表面受容体の共クラスター形成パターン、（ｖｉｉ）炎症誘発性サイトカインの産生、（ｖｉｉｉ）免疫調節性サイトカインの産生、（ｉｘ）炎症マーカー、（ｘ）抗アポトーシスの転写因子活性、及び（ｘｉ）老化マーカーの１つ又は複数でスクリーニングすることによって決定するステップ、並びに（ｄ）得られた結果を対照と比較するステップである。このような対照は、例えば細胞は同じストレス状況に置かれるが、調査するべき物質が加えられない検定（陰性対照）でよい。同様に、対照はまた、公知の陽性の効果を有する物質を検定に含めて試験物質及び公知の物質（陽性対照）の効果の差を測定してもよい。
【００２１】
ある物質が、前記いずれかの検定により詳述したようなストレスの負の作用を阻止した場合、この出願においては活性であるとみなされる。
【００２２】
ＣＤ１ｄ活性は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルに作用する物質によって遮断及び／又は修飾されることが認められよう。
【００２３】
遺伝子レベルで作用する物質はＣＤ１ｄ遺伝子の転写又は翻訳に作用する化合物、特にそれらを阻止する化合物、例えばＣＤ１ｄ遺伝子又はＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡの少なくとも一部にアンチセンスポリヌクレオチドなどである。
【００２４】
本明細書で同じ意味で使われる用語オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのαアノマー型、ポリアミド核酸などを含む自然の又は修飾されたモノマー或いはリンケージの線形のオリゴマー／ポリマーを含み、これらはモノマー対モノマーの相互作用、例えばワトソン−クリック型の塩基対、フーグスティーン型若しくは逆フーグスティーン型塩基対などの規則的パターンを通して標的核酸と特異的に結合することができる。通常、モノマーはホスホジエステル結合又はその類似結合によって結合して少数のモノマー単位、例えば３〜５個から数百個、若しくは数千モノマー単位の大きさのオリゴヌクレオチドを形成する。
【００２５】
（アンチ）センスのオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドは、特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達性又は他の効能関連特性を強化するために、ペンダントの基又は部分、例えばコレステロール分子、アクリジンなどの二重鎖インターカレーター、ポリ−Ｌ−リジン、ホスホロチオエートなどの１種又は複数のヌクレアーゼ耐性連結基による「末端キャッピング」を含んでもよい。対応するオリゴヌクレオチドは転写、ＲＮＡプロセシング及び／又はｍＲＮＡの翻訳の阻止ために使うことができ、したがって、このオリゴヌクレオチドはエクソンのほかに所望によりＣＤ１ｄ標的遺伝子のイントロン配列も含むことができる。
【００２６】
ヒトＣＤ１ｄ遺伝子又はｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ（受入番号：それぞれＡＰ００２５３２及びＮＭ＿００１７６６）から入手できる。当業者はその一般知識及び技術に基づき、ＣＤ１ｄ遺伝子のコード領域の少なくとも一部を選択して、ＣＤ１ｄ遺伝子の転写及び／又は翻訳を阻止する適当なアンチセンスポリヌクレオチドを設計することができる。同様に、ＣＤ１ｄ遺伝子の非コード領域の一部は、ＣＤ１ｄ遺伝子の転写を阻止する因子又は転写産物の数量を減らす因子としての役目をすることができる。ここで特に、プロモーター領域の部分は、アンチセンスポリヌクレオチドを調製するための鋳型としての役目をするが、イントロンからエクソンへの移行領域、またその逆の移行領域も同様である。好ましい一実施形態では、そのような物質はＤＮＡ又はｃＲＮＡ（ＲＮＡ干渉）でよい。
【００２７】
ＣＤ１ｄ遺伝子が標的であることは別として、上皮のホメオスタシスを制御するいくつかの調節分子、例えばセラミド及び／又はグルコシルセラミドの活性も、ＣＤ１ｄ分子に対する所望の作用をもつように修飾することができる。この目的のため、グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子又はグルコシルセラミドシンターゼｍＲＮＡの少なくとも一部にアンチセンスポリヌクレオチドを、最終的には上皮細胞への増殖シグナルが遮断されるように設計することによって、グルコシルセラミドシンターゼ転写産物の数を減らすことができる。グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｉｃｈｉｋａｗａ他、ＰＮＡＳ ９３（１９９６）、４６３８〜４６４３頁で開示されており、該文書は本明細書で参照として組み込まれている。同様に、非コード領域はアンチセンスポリヌクレオチド、例えばプロモーター領域及び／又はイントロンからエクソン、またその逆の移行部のための鋳型としての役目をする。好ましい一実施形態では、そのような物質はＤＮＡ又はｃＲＮＡ（ＲＮＡ干渉）でよい。
【００２８】
増殖シグナルを減らすことのほかに、ＣＤ１ｄ分子を通して上皮細胞をアポトーシスさせるシグナルを強化することができる。この点に関し、対応する転写産物の数を増やすことができ、このことはスフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼ遺伝子及び／又はスフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼｍＲＮＡを含む配列をコードするポリヌクレオチドをより多く提供することによって成就することができる。
【００２９】
遺伝子レベルは別として、ＣＤ１ｄ分子の生物学的活性は、特に上皮細胞の上又は中のＣＤ１ｄ受容体と結合してその内因性の生物学的機能を阻止するいかなる物質によってもタンパク質レベルで修飾、特に遮断することができる。
【００３０】
好ましい一実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を修飾、特に遮断することのできる物質はポリペプチド又はペプチドであり、特には疎水性ペプチド、より好ましくはＣＤ１ｄ受容体と結合してその生物学的機能、例えばＮＫＴとの相互作用を遮断する抗体、若しくはその部分である。その部分としては、特にＦｃ部が欠けているミニ抗体が想定される。他の実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を遮断することのできる物質は可溶性Ｃｄ１ｄ受容体、つまり、その領域が欠けそのポリペプチドを膜に固定するポリペプチドの一部でもよい。可溶性ＣＤ１ｄ受容体はストレスを受けた細胞の生残を促進するｉｎ ｖｉｖｏリガンドを除去し、それによりアポトーシスを進める。更に、ＣＤ１ｄへのナチュラルキラー細胞のｉｎ ｖｉｖｏ結合は減少し、このように、Ｔ細胞の活性化及びその結果としての炎症性且つ／又は免疫抑制性反応を阻止する。
【００３１】
好ましい一実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾することのできる物質は、ホスホリピド、ガングリオシド、スフィンゴリピド、グリコスフィンゴリピド、ホスファチジルイノシトールリン酸塩、ステロール、ポリフェノール、グリセリド若しくは脂肪酸を含む植物、微生物又は動物に由来する脂質である。これらの脂質は、ＣＤ１ｄ分子と直接結合することによって、又はＣＤ１ｄ遺伝子発現に作用することによって間接的にＣＤ１ｄ機能に作用することができる。
【００３２】
他の実施形態によると、生物学的なＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾することのできる物質は、セラミド、例えばセラミド８若しくはスフィンゴシンホスホコリン、又はＴＮＦスーパーファミリーに属している受容体、特にアポトーシスを誘発してＣＤ１ｄの抗アポトーシス機能を妨げるＣＤ９５／ＡＰＯ−１／Ｆａｓのリガンドである。他の実施形態では、目的の物質は化学合成による有機化合物である。
【００３３】
グルコシルセラミドシンターゼを介したセラミドのグリコシル化、及び以降のグルコシルセラミドの蓄積がストレス誘発性プログラム細胞死からの細胞の逃避を可能にし、乳癌、皮膚癌、大腸癌及び類上皮癌を含む様々な癌の細胞の細胞傷害性抗癌剤に対する抵抗性を付与することは、十分に確立されている。ＣＤ１ｄはグルコシルセラミドと結合して同じ多剤耐性癌細胞（例えば扁平上皮癌）によって過剰発現されるので、ＣＤ１ｄの抗アポトーシス活性は、おそらくタンパク質−グルコシルセラミド結合レベルで細胞毒に対する癌細胞の耐性を調節すると考えられる。かくして、原則として内因性ＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾する本発明の物質は、皮膚癌、腸癌及び乳癌を含む様々な癌の多剤耐性をかなり減少させる。
【００３４】
原則として、本発明の物質は膜への及び膜からの双方向性のＣＤ１ｄのトラフィッキングにも作用する。
【００３５】
これらの物質は、個体にこれらの物質を投与するのに適するいかなる組成物、特に食物組成物、化粧組成物又は医薬組成物に含めることができる。
【００３６】
本発明によるＣＤ１ｄ表面分子を遮断又は修飾することができる物質の最低１つを含む医薬組成物は、予防及び／又は治療処置のために投与することができる。治療用途では、本明細書で以下に記載するように、組成物は既に病気を患っている患者に対して、その病気の症状及びその合併症を治療するか最低でも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。この達成に十分な量は「治療有効量」と定義される。このために有効な量は、病気の重症度並びに患者の体重及び一般状態によって決まる。
【００３７】
予防的用途では、本発明によるＣＤ１ｄ表面分子を遮断又は修飾することができる物質の最低１つを含む組成物は、特定の病気に感受性の患者又はその危険がある患者に対して投与される。このような量は「予防有効量」と定義される。この用途では、正確な量は同じく患者の健康状態及び体重によって決まる。
【００３８】
本発明の化合物は好ましくは薬剤として許容される担体と一緒に投与され、担体の性質は投与様式、例えば腸管外、静脈内、経口及び局所（眼を含む）の投与経路で異なる。
【００３９】
所望の剤形は各種賦形剤、例えば医薬品用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロース、炭酸マグネシウムなどを用いて作製できる。この組成物は、錠剤、カプセル、丸薬、溶液、懸濁液、シロップ、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、乾式経管栄養、湿式経管栄養その他でよい。薬剤の放出を制御するためには徐放性剤形を用いることもできる。
【００４０】
担体／賦形剤の種類及びその量は、物質の性質及び企図される薬物送達及び／又は投与の様式によって決まる。例えば、わずかに可溶なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいる剤形では、例えば溶解性を上げるためにＴｗｅｅｎ ８０などの非イオン界面活性剤を約０．０４〜０．０５％（ｗ／ｖ）の量で用いて、マイクロエマルションを使用することができる。他の構成成分としては抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、親水性ポリマー、例えば単糖、二糖及び他の炭水化物、例えばセルロース又はその誘導体、デキストリン、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、及び製薬学者に周知の類似成分が含まれる。利用されるこれらの様々な構成成分は、医薬品濃度調節、溶解性の調節、化学安定化、粘性の調節、吸収強化、ｐＨの調節などを含む様々な機能を提供する。例えば、水溶性剤形では、好ましくは医薬組成物は好ましくは約７から８のｐＨの緩衝剤、例えばリン酸緩衝液又は他の有機酸塩を含む。
【００４１】
当業者が自身の知識に基づき、注射、局所投与、鼻腔内投与、移植若しくは経皮による徐放システムなどでよい投与経路を考慮に入れて、活性化合物を関心のある組織、例えば大腸、胃、皮膚、腎臓又は肝臓に向けさせるために適切な構成成分及び生薬剤形を選択することは認められる。
【００４２】
目的の物質は、化粧製品、例えばローション、シャンプー、クリーム、日焼け止め、日焼け手入れクリーム、日焼け防止剤、老化防止クリーム、軟膏及び／又は脱毛防止液で製剤化することもできる。このことは皮膚でＣＤ１ｄ機能を事実上遮断して太陽照射の有害作用、光線老化及びフリーラジカルによる皮膚の曝露を予防するために特に有利であることを証明する。かくして、例えばＵＶ光線を吸収する通常の剤のほかに本明細書で記載の物質を含んでいる日焼け止めを提供することにより、公知のものをはるかに凌ぐ太陽に対する保護材を提供することができる。この特徴は、目的の物質が皮膚を浸透して標的分子に到着した後にその効果を及ぼすという事実に特に基づく。この効果は暫くの間継続するので、万一日焼け止めが、例えばスポーツなどの間にこすり落とされるか洗い落とされた場合でも太陽に対する保護は存在する。また、日焼け止めは別として、目的の物質は環境汚染、酸化ストレスその他を含む日常の環境の負の作用を予防するために、通常の日常クリーム、ローションその他に含まれてもよい。本化粧製品に当業者に公知の異なる成分の混合物を含ませて目的の物質の皮膚への速やかな浸透を可能にし、また貯蔵中のその分解を予防できるようにすることは認められる。
【００４３】
本発明に従う他の非常に重要な組成物は食品材料である。現在社会では保存料、成分又は腸に有害な物質を含む多くの食品、例えばソーセージ、塩漬け肉又は焼肉その他が摂取される。例えば、焼肉は発癌性であることが公知の脂肪族及び芳香族化合物を含む。また、食品材料、例えばソーセージに含まれる微生物をＤＮＡの操作により殺す保存料は、腸の細胞に対して類似した作用を及ぼす。実際、腸癌の数は我々の社会で着実に増加しているが、それは少なくとも一部は人間が摂取する食品の種類によるものと考えることができる。
【００４４】
したがって、本発明はそのような腸障害の開始及び／又は発達を予防する食品組成物、例えば、少なくとも事実上ＣＤ１ｄ機能を遮断及び／又は修飾することのできる物質を含む乳製品若しくは発酵乳製品、例えばヨーグルト、カード、チーズ、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、乳ベースの粉製品、乳児食、穀物製品及び発酵穀物ベースの製品、ミネラルウォーター、チョコレート又はペットフードからなる群から選択される組成物を提供する。目的の化合物は食品材料中にその本来の味覚に作用を及ぼさない量で含まれるので、消費者は製品のいかなる変化にも気付かないがその有益効果、つまり予防効果又は治療効果でさえ経験する。一旦食品材料が摂取されると目的の物質は標的細胞に到着するが、標的細胞は腸、即ち胃又は腸の上皮細胞でよく、そこでＣＤ１ｄ受容体と結合してその活性を及ぼす。結果として、既に障害細胞は好ましくは傷害を受けた状態で維持されることなくアポトーシスに向かう。
【００４５】
ＣＤ１ｄをもつ上皮細胞はいくつかの器官、例えば肝臓、小腸、大腸、腎臓、前立腺、子宮、膵臓、乳房、皮膚及び結膜で見つかっているので、上で詳述した組成物の選択は概して標的組織によって決まる。理解されるように、皮膚に対しては化粧品が最も良い組成物であるかもしれないが、目的の物質を直接腸又は大腸に送達する場合には、食品が第一選択であるかもしれない。しかし、食品は目的の物質又は単に物質を他の器官、例えば腎臓若しくは肝臓に送達するためにも適し、それは体内での物質の安定性及び腸から体内へ吸収される能力に依存する。食品は毎日摂取される材料であるので、そのような製品は多種多様な異なる可能性を提供する。また目的の物質が腸での分解に感受性がある場合には医薬組成物を選択することができ、例えばカプセル化又は他の生薬剤形により目的の物質は標的の組織／細胞に送達される。
【００４６】
本発明の概念は、現在使用されている薬物療法を助ける補助療法として同様に適用することができることが理解されよう。この点に関し、本発明の医薬組成物は、例えば、治療される腫瘍のその治療からの逃避を予防するために又は医薬投薬で捕えられなかった残存性の癌細胞の殺滅を助けるために、細胞増殖抑制剤と共に投与することができ、このような逃避はある種の腫瘍の長期間治療でしばしば起こる。本発明の物質は食品材料と共に簡単に投与することができるので、目的の物質を多く含む特別な臨床用食品を利用することができる。また、メラノーマは、メラノーマに対して本明細書で記載の医薬組成物又は化粧品と共に抗体投与で直接治療することができる。本明細書並びに付随する請求項を読んだ後には、当業者が本明細書に記載の特定の実施形態に対する様々な異なる代替手段を想定することは明らかとなる。
【００４７】
原則として、本発明に従う物質はストレス状況、例えば化学的、生物学的若しくは物理的ストレス、例えばオキシダント若しくは発癌物質への曝露、細菌、ウイルス、真菌類、環境中の細胞及び／又は微生物に由来する脂質への曝露、又はＵＶ照射への曝露によるストレス状況によって起こる上皮組織、例えば皮膚、腸、眼、肺臓、肝臓、前立腺、胸部、腎臓及び／又は子宮の上皮組織における傷害の治療及び／又は予防のために使用できる。同様に、この物質は脱毛症を予防及び／又は治療するために利用できる。
【００４８】
したがって、本発明に従う物質及び／又は組成物は、皮膚の傷害、特に皮膚の光化学的傷害及び老化による傷害、例えば乾燥、日光性角化症、不規則な色素沈着（特に、染み、ほくろ、滴状のメラニン減少症及び永続性色素沈着過度を含む）、しわ（特に、表面の小じわ及び深い溝を含む）、星状の偽瘢痕、弾力線維症、弾力低下、末梢血管拡張症、静脈湖、紫斑病、にきび、脂腺の過形成、先端線維性軟ゆう、老年性血管腫、脂漏症角化上皮症、黒子、基底細胞癌及び扁平細胞癌腫、皮膚火傷及び／又は水ぶくれ、白内障形成、表皮過形成、炎症、免疫抑制並びに癌、例えば非メラノーマ及びメラノーマ皮膚癌の治療及び／又は予防のために利用できる。
【００４９】
上記特性を有する他の物質を見つけるために、本発明はそのような物質についてスクリーニングするための方法も提供する。この方法では、一次培養の形態、つまり個体から直接導かれた状態又は細胞系の状態の上皮細胞が利用される。この方法を実行するためには細胞培養が特に好ましく、その理由は実験期間を通して上皮細胞を継続して供給することができるからである。使用される上皮細胞の細胞培養は、一次培養の細胞又は組織試料から直接得られる上皮細胞と同じ表現型形質を示すことに留意する必要がある。当業者は検定方法にしたがって出発物質を選択することが理解されよう。それ故に、第１回目の検定を実行するときは細胞培養が最も適当なようであり、更なる検定では、つまり潜在的な候補物質の活性を評価する場合は、組織又は動物モデルを用いた検定がより適当なようである。
【００５０】
上皮細胞は、関心のある物質と細胞が確実に接触するのに十分な時間この物質に曝される。次のステップでは上皮細胞はストレス状況に曝され、このストレス状況は、例えば異なる線量のＵＶ光線で細胞を照射するか、過酸化水素又は毒性化学物質を細胞培養に加えることによってもたらされる。しかし、細胞がチャレンジされ、通常、ストレス状況で開始されるプロセス、例えば炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＦＮ−□、ＴＮＦ−□、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８の産生、アポトーシス、脂質代謝の変化、ｐ５３の増産、細胞表面受容体の共クラスター形成パターンの変化の結果としての細胞シグナル伝達の変化、ＮＦ−кＢ活性化、ＡＰ１活性化、過増殖（抗アポトーシス）、障壁機能の変化などのプロセスを開始する限り、ストレスの種類は決定的ではない。第２回目以降の検定で有益であるとわかるかもしれない複数の物質、つまり１つ又は複数の物質の混合物を同時に試験することもできることが理解されよう。
【００５１】
次のステップでは、上皮細胞に対する前記ストレスの作用を、以下の特徴の１つ又は複数を評価することによって決定する。例えば：上皮増殖（ＰＣＮＡ：Ｏｕｈｔｉｔ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０００）、（１５６：２０１〜２０７）；ＢｒＵｄ：Ｌｕ Ｙ−Ｐ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）、（５９：４５９１〜４６０２）；上皮アポトーシス（Ｔｕｎｅｌ検定；Ｏｕｈｔｉｔ他によって概説されたプロトコルの変更、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０００）、１５６：２０１〜２０７）；ｐ５３突然変異蓄積（対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）及び一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）、Ａｎａｎｔｈａｓｗａｍｙ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）、３：５１０〜５１４）；炎症誘発性及び免疫調節的なサイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＰＧＥ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、血小板活性化因子、ＴＧＦβ）の生産；炎症マーカー（例えばＣＯＸ−２、ｉＮｏｓ）；及びＴａｑＭａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学による抗アポトーシスの転写因子（ＡＰ−１、ＮＦκＢを含む）活性；ホスホリピド、グリコスフィンゴリピド及びスフィンゴリピド含量の定性的及び定量的評価（電子スプレータンデム型質量分析）；蛍光共鳴電子移動分析（ＦＲＥＴ）による上皮細胞表面受容体分子、例えばサイトカイン受容体（例えばＩＬ−６）、受容体ＴＮＦスーパーファミリーの分子（例えばＣＤ９５／ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）及び増殖調節受容体（例えばＥＧＦ、インスリン）の共クラスター形成パターンの解析；老化のマーカー、例えばエラスターゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、テロメラーゼである。
【００５２】
得られた結果は次に対照と比較するが、対照は単に検定でよく、同じ種類の細胞を同じストレス状態に曝すが、但しＣＤ１ｄを遮断する能力について評価する化合物は用いない。動物モデルに関しては、陽性対照はＣＤ１ｄ−／−動物で表され、ＣＤ１ｄ活性はまったくない。
【００５３】
以下の実施例は更に詳細に本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５４】
ＣＤ１ｄ突然変異体マウスの作製
マウスＣＤ１ｄは２つの遺伝子、ＣＤ１ｄ１及びＣＤ１ｄ２によってコードされ、これらは高いヌクレオチド配列同一性を共有する（Ｂｒａｄｂｕｒｙ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、７（１９８８）、３０８１〜３０８６）。ＣＤ１ｄ１遺伝子の産物は記載されているすべての抗ＣＤ１抗体によって認識され、ＣＤ１ｄ２産物の表面発現はまだ証明されていない。更に、ＣＤ１ｄ２遺伝子産物の予測されたα２領域は、発表されているすべての古典的及び非古典的ＭＨＣクラスＩ分子のα２領域に存在する領域内ジスルフィド結合を欠く（Ｂｒａｄｂｕｒｙ、上記）。このジスルフィド結合は、抗原結合溝の折畳みのために重要であると考えられる。このように、ＣＤ１ｄ２遺伝子は機能的抗原提示分子をコードすることができず、以前にマウスＣＤ１によるものと考えられていたすべての機能はＣＤ１ｄ１遺伝子産物によってもたらされる。この理由から、対象の突然変異をＣＤ１ｄ１遺伝子に導入して、ＣＤ１ｄ２はそのままにすることを決定した。
【００５５】
ＣＤ１ｄ遺伝子は、系統１２９／Ｓｖファージライブラリーから、ＰＣＲ法で作製したプローブで単離された。ターゲティング構築物は、ＣＤ１ｄ遺伝子の５’領域を含む２．８ｋｂのＡｐａｌ断片、ＣＤ１ｄ遺伝子の３’領域を含む３．２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｎｏｔｌ断片（この断片のＮｏｔＩ部位はファージＤＮＡが最初にサブクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに由来する）、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて調製された。この構築物は、ＣＤ１ｄ１のα２領域をコードするエクソンから約２００ｂｐの断片を削除するように設計されていた。系統１２９／Ｓｖ由来の胚性幹（ＥＳ）細胞系ＴＬ１は、ＮｏｔＩ線形化ターゲティングベクターでトランスフェクションした。Ｖａｎ Ｋａｅｒ他、Ｃｅｌｌ ７１（１９９２）、（１２０５〜１２１４）で記載されているように、Ｇ４１８耐性コロニーを選択して単離した。個々のクローンからのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、ＣＤ１ｄ１遺伝子の５’末端に由来する２．３ｋｂのＣＩａＩ−ＥｃｏＲＩプローブとハイブリダイズした。組換えは、ＫｐｎＩによる消化及びＣＤ１ｄ１遺伝子の３’末端に由来する７００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩプローブとのハイブリダイゼーションで確認した。キメラマウスは生殖細胞系伝達を評価するためにＣ５７ＢＬ／６マウスとかけ合わされ、異型接合突然変異体マウスを交雑させて（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９／Ｓｖ）Ｆ２同型接合突然変異体を得た。マウスは５’プローブによるゲノムサザンブロット法により、そのＣＤ１ｄ１状態で分類した。変異体マウスは健康で、正常に成育した。
【００５６】
突然変異体動物を作製するのに用いたＥＳ細胞及びマウス系統はそのＴＬ状態が異なる（１２９／ＳｖはＴＬ＋系統で、Ｃ５７ＢＬ／６はＴＬ−系統）ので、この研究で使ったすべてのマウスはＴＬにつき遺伝子型を決定した。マウスのＴＬ状態の分類のために、尾部ＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化して系統１２９／Ｓｖ（ＴＬ＋）及びＣ５７ＢＬ／６（ＴＬ−）間の多型を検出するＴＬ特異的なプローブとハイブリダイズした（Ｐｏｎｔａｒｏｔｔｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）、１７８２〜１７８６）。このプローブは、公表された以下の配列（Ｐｏｎｔａｒｏｔｔｉ、上記）に基づいて設計された一組のプライマーを使ってＰＣＲ法で作製した：
５’−ＴＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＧＧＡＣ−３’；及び
５’−ＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣ−３’。
【００５７】
ＣＤ１ｄ１変異体及び野生型マウスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）に公認されたＳＰＦ障壁動物施設で飼育された。実験開始時１２〜１６週齢の動物が使われた。動物は、１２時間の明／暗周期で管理されたフィルター保護されたケージに収容され、オートクレーブしたＮＩＨオープンフォーミュラマウス固形飼料及び水を随意に供給された。組織のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはすべての手順を承認した。各実験内で、すべてのマウスは年齢及び性別を揃えた。
【００５８】
ＣＤ１ｄ変異体マウスを作出するために他の遺伝的背景、例えばＢａｌｂ／Ｃの遺伝的背景を使えることが強調される。
【実施例２】
【００５９】
マウスのＵＶ照射
フィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯（フィリップス社、オランダ）５個一列を用いてマウスを照射した。これらのランプは、２７０から４００ｎｍのスペクトルを発する。照射の５４％は太陽スペクトルのＵＶＢ範囲（２８０〜３１５ｎｍ）内であり、４５％はＵＶＡ（３１５〜４００ｎｍ）の領域、１％未満がＵＶ−Ｃ（２４０〜２８０ｎｍ）の範囲内であった。５つの電球の放照射度は、ＵＶＢ ＰＭＡリサーチ輻射計で測定すると平均で１０Ｗ／ｍ２であった。
【００６０】
マウスの背側の毛を電気クリッパーで取り除き、プレキシガラスデバイダーで個々の区画に分けられたプレキシガラスの箱にマウスを入れ、入射線量を１４％カットする針金トップで覆った。各々のＵＶ照射のために、電球の長辺方向のエネルギーの偏在を補償するために、各回ランプの下の同じ位置に箱を置いた。マウスは、フィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯５個からの８６ｍＪ／ｃｍ２ ＵＶＢの入射線量に１度又は２度曝露させた。マウスは、第１の照射から９６時間後にＵＶＢ光線の第２線量に曝露させた。すべてのマウスは、最後のＵＶＢ照射から２４、４８、７２及び９６時間後に、皮膚損傷の徴候につき分析した。
【００６１】
肉眼検査では、裸にされた背のＵＶＢ照射の後に皮膚損傷程度の明らかな相違が野生型とＣＤ１ｄノックアウトマウスの間で観察された。ＵＶ照射した野生型マウスは明瞭で顕著な皮膚傷害（火傷、皮膚損傷）を示したが、ＵＶ照射ＣＤ１ｄノックアウトマウスでは皮膚傷害の明らかな徴候を認めなかった。
【実施例３】
【００６２】
表皮アポトーシスの測定
アポトーシスによる細胞死はＤｅａｄＥｎｄ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って検出し、このシステムは酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使って３’−ＯＨ ＤＮＡ末端でフルオロセインー１２−ｄＵＴＰを触媒により取り込むことによって、アポトーシス細胞の断片化ＤＮＡを測定する。ＴｄＴは、ＴＵＮＥＬ検定の原理を使ってポリマー末端を形成する。つまり、スライド上のホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片を室温で５分間、新しいキシレンで２回脱パラフィンした。それらを１００％エチルアルコールで５分間洗浄し、次に、切片を段階的（１００％、９５％、８５％、７０％、５０％）エチルアルコール洗浄液に３分間浸すことによって逐次再水和した。その後、切片を０．８５％ＮａＣｌに５分間浸し、ＰＢＳで洗浄し、次に４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定してＰＢＳで２回洗浄した。残留液を軽くたたいて切片から取り除いた後、各組織切片を室温で８〜１０分間、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ社）で覆った。プロテイナーゼＫ処理の後、組織切片をＰＢＳで洗浄し、次に、５分間４％のパラホルムアルデヒドに浸すことによって固定した。次にＰＢＳで洗浄し、残留液をたたいて除去し、切片を平衡緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の後、加湿チャンバ内で切片をＴｄＴ酵素と共に３７℃で１時間インキュベートした。切片は反応を終了するために停止緩衝液（ＳＳＣ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に１５分間浸漬し、次にＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、使用前にＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したヨウ化プロピジウム溶液で切片を暗黒下１５分間染色した。切片を次に脱イオン水で５分間、３回洗浄し、その後、細胞周囲の領域から余分な液を拭き取った。次に切片を蛍光顕微鏡下で直ちに検鏡した。
【００６３】
ＵＶ照射から２、６、２４、４８、７２及び９６時間後（急性／慢性）、ＣＤ１ｄ−／−マウス及び野生型マウスから採取した皮膚のＴＵＮＥＬ検定（Ｏｕｈｔｉｔ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０００）、１５６：２０１〜２０７によって概説されたプロトコルの変更）を行った。結果は、ＣＤ１ｄ−／−マウスの皮膚内の表皮細胞では、野生型マウスと比較してアポトーシスが高度に進行していることを明らかにした。対照的に、野生型の皮膚においては、表皮細胞のアポトーシスの進行は有意に少なかった。
【実施例４】
【００６４】
表皮過形成の測定
背側の皮膚生検材料を４％のパラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。切片をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して光学顕微鏡で検鏡した。
【００６５】
ＵＶＢ照射後、Ｃｄ１ｄ−／−マウスは最後のＵＶＢ処理から４８時間後に、ＵＶ照射野生型マウスと比較して有意に減少した表皮過形成を示した。
【実施例５】
【００６６】
遺伝子プロファイリング
ＣＤ１ｄ機能を解明するために、野生型及びＣＤ１ｄノックアウトマウスの遺伝子発現を比較する遺伝子プロファイリング検定を行った。
【００６７】
皮膚組織を５つの個々の野生型及びＣＤ１ｄノックアウトマウスから抽出し、またいかなるゲノムＤＮＡ汚染を取り除くためにＴｒｉｚｏｌキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、バーゼル、スイス）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（バーゼル、スイス）をメーカーの説明書に従って使い、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により別々に抽出した。ＲＮＡ試料をＯＤで定量し、その後ダイナミックゲル電気泳動をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒで行い、インタクトな２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡについて分析した（すべての２８／１８比は、１．６と２．０の間であった）。試験試料は、ＧｅｎｅＣｈｉｐとのハイブリダイゼーションに十分な量の高品質ＲＮＡを含むと判断された。他の品質管理手段として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、サンタクララ、ＣＡ）とのハイブリダイゼーションの前に、すべての試料が予め選択された遺伝子に対して強いシグナルを発すことをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ試験チップ（試験チップの５’／３’比は３．０未満であった）を用いて確認した。
【００６８】
皮膚に関しては、すべてのマウス個体試料で総計１０μｇのＲＮＡが出発物質であった。一般的に、全ＲＮＡはビオチン化ｃＲＮＡに変換され、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブアレイカートリッジでハイブリダイズされ、染色され、その後定量化された。第１鎖及び第２鎖のｃＤＮＡ合成には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、バーゼル、スイス）をメーカー説明書に従って使用したが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合部を含むオリゴｄＴプライマーを使った。標識されたｃＲＮＡは、ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、ＮＹ）で調製した。反応ではビオチン化ＣＴＰ及びＵＴＰは非標識のＮＴＰと共に使い、取り込まれなかったヌクレオチドはＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ドーレン、ドイツ）で取り除いた。
【００６９】
ｃＲＮＡ（２０μｇ）を、２００ｍＭのトリス酢酸塩ｐＨ８．１、５００ｍＭのＫＯＡｃ、１５０ｍＭのＭｇＯＡｃを含む緩衝液中で９４℃で３５分間断片化した。ハイブリダイゼーションの前に、ハイブリダイゼーション混合液（１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５ｎｇ／μｌのＢＳＡ、０．１ｎｇ／μｌのニシン精液及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ対照を含む緩衝液）中の断片化ｃＲＮＡを９５℃で５分間加熱してから４５℃に冷却し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブアレイカートリッジに入れた。プローブアレイを４５℃で１６時間、一定の回転速度（６０ｒｐｍ）でインキュベートし、その後Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの洗浄及び染色プロトコルに従った。
【００７０】
このプロトコルは、以下の操作を含んでいた：
・非ストリンジェント緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％の消泡剤）による１回の洗浄
・ストリンジェント緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０）による１回の洗浄
・１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中の０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）による第１の染色。
・非ストリンジェント緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％の消泡剤）による１回の洗浄
・１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中の３μｇ／ｍｌのビオチン化抗ストレプトアビジン＋０．２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧによる第２の染色。
・１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中の０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）による第３の染色。
・非ストリンジェント緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％の消泡剤）による１回の洗浄
【００７１】
差別的に調節された遺伝子の選択のために、数学的方法を開発し、ＧｅｎｅＣｈｉｐの生データに適用した。この方法は、絶対表現即ち絶対差強度（ＡＤＩ）から標準偏差（ＳＤ）を考慮することによって、一様な倍率変化カットオフ（ｓｉｎｇｌｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｃｕｔ−ｏｆｆ）の設定を超える方法である。
【００７２】
この方法には以下のステップが含まれる。即ち、（Ａ）市販の「ＭＡＳ５」Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプログラム（サンタクララ、ＣＡ、米国）によるデータ処理及び再評価、（Ｂ）再評価されたデータの正規分布への対数変換、（Ｃ）複数の仮説（遺伝子につき１つの）分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定、（Ｄ）条件ＳＤ（方程式１）の範囲内、条件間の有意限度ＳＤ、いわゆるＲＥＧＥｘｐｒｅｓｓ機能を決定するための平均のＡＤＩレベルにより命じられる２００個の遺伝子のビンの範囲内（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１ ２（１２）；リプリント０００９．１から０００９．３１の方程式２）の頑健平均の決定、並びに（Ｅ）作用の重要性に焦点を当てるためのＲＥＧＥＸｐｒｅｓｓ及びＡＮＯＶＡのｐ値による遺伝子のランク付けである。選択は複数仮説（遺伝子につき１つの）ＡＮＯＶＡ検定からのｐ値及び／又はＲＥＧＥｘｐｒｅｓｓからのｐ値で行う。
【００７３】
プローブアレイは、アルゴンイオンレーザ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのためにＡｇｉｌｅｎｔによって作製された）を使って４８８ｎｍで調べた。量的調査からの読取り値は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現分析ソフトウェアで分析した。
【００７４】
知見は、下記の表Ｉ〜ＩＩＩにまとめる。増加（＋）倍率又は減少（−）倍率は、野生型マウスで発現される同じ遺伝子と比較したときの、ＣＤ１ｄノックアウトマウスで発現される遺伝子の統計学的に有意の相対的な増加倍率又は減少倍率である。ＣＤ１ｄを遮断すると毛包発達を制御する遺伝子は上方調節され、炎症及び癌の発達に関係した遺伝子は下方調節されることは明白になる。
【００７５】
【表１】
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
【実施例６】
【００７８】
ＴＰＡの単回局所投与によって誘発された炎症反応の評価
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ ＢＰ７０１、３８２９７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって提供されたホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸塩（ＴＰＡ）を０．０１％（Ｗ／Ｖ）の量でアセトンに溶かし、急性の炎症反応を誘発するために溶液の２０μｌをＣＤ１ｄ−／−マウス又は野生型マウスの右耳の内部表面に局所的に塗布した。
【００７９】
動物は動物飼育室の個々のケージへ入れ、標準ペレット食餌及び１２時間の明暗周期で飼育した。設備には、２２±２℃の温度、５５±１０％の相対湿度の濾過空気が供給される。
【００８０】
炎症反応は、塗布後６時間、２４時間及び４８時間後にマイクロメーターを使って耳の水腫を測定することによって定量化される（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｇｍｂｈ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ １２５５ Ｄ３６３７２ Ｓｃｈｌｕｃｈｌｅｒｎ、ドイツによって提供された＜＜ｏｄｉｔｅｓｔ＞＞）。
【００８１】
水腫は以下のように計算される。
（水腫＝処理群耳厚み−アセトン群の耳厚み）。
ＣＤ１ｄ−／−群の平均値は、スチューデントのｔ検定を使って野生型群の平均値と比較される。
【実施例７】
【００８２】
アラキドン酸の単回局所投与によって誘発された炎症反応の評価
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ ＢＰ７０１、３８２９７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって提供されたアラキドン酸（５−８−１１−エイコサテトラエン酸）を１４０ｎＭの濃度でアセトンに溶かし、急性の炎症反応を誘発するために溶液の２５μｌをＣＤ１ｄ−／−マウス又は野生型マウスの右耳の内部表面に局所的に塗布した。
【００８３】
動物は動物飼育室の個々のケージへ入れ、標準ペレット食餌及び１２時間の明暗周期で飼育した。設備には、２２±２℃の温度、５５±１０％の相対湿度の濾過空気が供給された。
【００８４】
炎症反応は、塗布後１時間、２時間及び４時間後にマイクロメーターを使って耳の水腫を測定することによって定量化される（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｇｍｂｈ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ １２５５ Ｄ３６３７２ Ｓｃｈｌｕｃｈｌｅｒｎ、ドイツによって提供された＜＜ｏｄｉｔｅｓｔ＞＞）。
【００８５】
水腫は以下のように計算される。
（水腫＝処理群耳厚み−アセトン群の耳厚み）。
ＣＤ１ｄ−／−群の平均値は、スチューデントのｔ検定を使って野生型群の平均値と比較される。
【実施例８】
【００８６】
オキサゾロンによって誘発されたＤＴＨ（遅延型過敏症）反応の評価
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ ＢＰ７０１、３８２９７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）によって提供されたオキサゾロン（４−エトキシメチレン−２−フェニル−オキサゾール−５−オン）を１％（Ｗ／Ｖ）の濃度でアセトンに溶かし、溶液の５０μｌを毛剃りＣＤ１ｄ−／−マウス又は毛剃り野生型マウスの腹部皮膚に１日１回、４日間塗布する。
【００８７】
４日後に、動物はアセトンに０．３％の用量で溶かしたオキサゾロンによる右耳の内部表面上への単回投与（２０μｌ）によりチャレンジされる。チャレンジ後の反応は、塗布後２４時間及び４８時間後にマイクロメーターを使って耳の水腫を測定することによって定量化される（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ Ｇｍｂｈ、Ｐｏｓｔｆａｃｈ １２５５ Ｄ３６３７２ Ｓｃｈｌｕｃｈｌｅｒｎ、ドイツによって提供された＜＜ｏｄｉｔｅｓｔ＞＞）。
【００８８】
水腫は以下のように計算される。
（水腫＝処理群耳厚み−アセトン群の耳厚み）。
ＣＤ１ｄ−／−群の平均値は、スチューデントのｔ検定を使って野生型群の平均値と比較される。
【実施例９】
【００８９】
太陽シミュレーターを用いたＵＶ照射によって誘発される皮膚損傷の評価
ＵＶＣフィルターを備えた太陽シミュレーター（Ｏｒｉｅｌ ８１０５０）を用いてＣＤ１ｄ−／−マウス又は野生型マウスを照射する。
【００９０】
照射：ＵＶＢ＋ＵＶＡ線量、正確にする
表皮への作用：ＳＢＣ計数、表皮性過形成測定
真皮への作用：免疫組織化学的方法によるＭＭＰ１及びＭＭＰ３発現
【実施例１０】
【００９１】
ＵＶ照射によるＣＤ１ｄ遺伝子転写の調節並びにＵＶ誘発ＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子転写の調節におけるＣＤ１ｄの役割
マウス
ＳＰＦ雄非近交系１２９／Ｃ５７ＢＬ／６野生型及び１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ１ｄノックアウトマウスをＬ．Ｖａｎ Ｋａｅｒ、ヴァンダービルト大学医療センター（ナッシュビル、ＴＮ、米国）から入手した。動物は、現行のスイス規則及び基準に従って施設で維持された。動物はフィルターで保護されたケージに収容され、周囲の照明は１２時間明／１２時間暗の周期となるように調節された。オートクレーブされたオープンフォーミュラマウス固形飼料及び水は、無制限に供給された。組織のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはすべての動物処置を審査して承認した。各実験内で、すべてのマウスは年齢及び性別を揃えた。各実験の開始時、マウスは１６週齢であった。
【００９２】
ＵＶ光源
ＵＶＢ光源はフィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯（フィリップス社、オランダ）５個一列を用いた。これらのランプは、２７０から４００ｎｍのスペクトルを発する。照射の５４％は太陽スペクトルのＵＶＢ範囲（２８０〜３１５ｎｍ）内であり、４５％はＵＶＡ（３１５〜４００ｎｍ）の領域、１％未満がＵＶ−Ｃ（２４０〜２８０ｎｍ）の範囲内であった。５つの電球の放照射度は、ＵＶＢ ＰＭＡリサーチ輻射計で測定すると平均で１０Ｗ／ｍ２であった。太陽のシミュレーション光（ＵＶＡ＋ＵＶＢ）は、ＷＧ−３２０大気減衰フィルター（厚さ１ｍｍ）、可視／赤外帯域通過遮断フィルター（ＵＧ−５；厚さ５ｍｍ）、並びに更に可視及び赤外線のエネルギーを減らすダイクロイックミラーを備えた１０００ＷのエクソンＵＶ太陽シミュレーター（Ｓｏｌａｒ Ｌｉｇｈｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＰＡ、米国）によって作られた。
【００９３】
マウスのＵＶ照射
マウスの背側の毛は、電気クリッパーで取り除いた。ＵＶＢ照射に曝されたマウスは、プレキシガラスデバイダーで個々の区画に分けられたプレキシガラスの箱に入れ、入射線量を１４％カットする針金トップで覆った。各ＵＶＢ照射のために、電球の長辺方向のエネルギーの偏在を補償するために、各回ランプの下の同じ位置に箱を置いた。太陽のＵＶ光線（ＵＶＡ＋ＵＶＢ）に曝すマウスについては、太陽シミュレーターの光線を照射する前にマウスに麻酔をかけて固定した。マウスは、フィリップス社製ＴＬ−４０Ｗ／１２太陽灯５個からの８６、２１５又は４３０ｍＪ／ｃｍ２ ＵＶＢの入射線量に１度曝露した。太陽光線（ＵＶＡ＋ＵＶＢ）に曝すマウスは、１６８０（１分）、１６，８００（１０分）又は３３，６００ｍＪ／ｃｍ２（２０分）の太陽光入射線に１度曝された。
【００９４】
ケラチノサイト細胞培養のＵＶ照射
無菌の６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）で培養したケラチノサイトの集密培養物を、太陽のＵＶ照射に１回（５７００ｍＪ／ｃｍ２）曝した。培地を取り除き無菌のＨＢＳＳで置換した後、プラスチックの蓋をしないで処理を行った。対照培養物は、照射しなかった。ＵＶ曝露の後、ＨＢＳＳを取り除いて培地を培養物に戻した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、その後様々な時点でＲＮＡのために収穫した。
【００９５】
マウス組織の免疫染色
野生型マウス皮膚の生検材料をホルマリン固定してからパラフィンに包埋した。パラフィン包埋組織の切片（厚さ５μｍ）を作成し、弱く加熱してパラフィンを除き、脱水して以下の手順で再水和した。即ち、キシレン中で３分間を２回、エチルアルコール１００％中で３分、エチルアルコール９５％中で３分、エチルアルコール８０％中で３分及びＰＢＳ １×中で３分とした。新鮮な皮膚をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（４５８３、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、米国）にも包埋し、液体窒素で凍結させた。次に切片をＰＢＳ １×中で数分間再水和した。切片は抗マウスＣＤ１ｄ １Ｈ１一次ｍＡｂを使って染色し、マウスＨｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ｐｌｕｓキット（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、サンフランシスコ、米国）を使って展開した。
【００９６】
皮膚又は細胞溶解物からの総ＲＮＡの抽出
６穴プレートで培養したヒトケラチノサイトの処理培養物及び対照培養物を氷上に置き、４℃のＰＢＳ １×を使って２回洗浄した。１％のβ−メルカプトエタノールを加えた３５０μｌの細胞溶解緩衝液ＲＬＴ（７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）中で細胞をこすり、軽く撹拌して細胞溶解物を得た。１３，０００×ｇで２分間遠心にかけて細胞抽出物をホモジナイズするのにＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（７９６５６、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）を用いた。次に、メーカーのプロトコルに従ってＲＮＡｅａｓｙキット（７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）を使って総ＲＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ混入物は、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼセット（７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ社、バーゼル、スイス）を使い、オンカラムＤＮアーゼ消化で取り除いた。１ｃｍ×１ｃｍの皮膚試料を細断し、ローターステーターホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、Ｌｕｚｅｒｎ、スイス）を用いて１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（１５５９６−０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、バーゼル、スイス）中でホモジナイズした。１２，０００×ｇでの遠心の後に得られた上清を新しい試験管に回収し、室温で５分間インキュベートした。０．２ｍｌのクロロホルムを試験管に加え、それを１５秒間激しく振盪し、室温で２〜３分間インキュベートした。試料を１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上の水相を新しい試験管へ移し、総ＲＮＡを０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを使って室温で１０分間沈殿させた。４℃における１２，０００×ｇで１０分間の遠心によって得られたＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％ＥｔＯＨで洗浄し、次に７，５００×ｇ５分間、４℃で遠心した。ＲＮＡペレットは最終的に室温で乾燥し、試料を５５〜６０℃で１０分間インキュベートすることによってＲＮａｓｅを含まない４０μｌの水に溶かした。可能なＤＮＡ汚染は、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼセットを使ってオンカラムＤＮアーゼ消化で取り除いた。
【００９７】
半定量的なＲＴ−ＰＣＲ
Ａ．逆転写ＰＣＲ法及びＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（１１９０４−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、バーゼル、スイス）をメーカーの説明書に従って使い、オリゴｄＴプライミングにより５μｇの総ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡのＰＣＲは、単一遺伝子（単一ＰＣＲ）又は同義遺伝子（同義遺伝子ＰＣＲ）の特異的発現を検出するために行われた。単一ＰＣＲについては、５μｌのＰＣＲ緩衝液、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５０μＭセンス及びアンチセンスのオリゴヌクレオチドを０．５μｌ、３μｌのＤＭＳＯ、３４．５μｌの水並びに０．５μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む４８μｌのＰＣＲマスターミックスを、２μｌのｃＤＮＡに加えた。すべての試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１５５５８−０２６及び１８４２７−０１３、バーゼル、スイス）から購入した。ｃＤＮＡ試料の増幅のために適用されたサイクル回数及びアニーリング温度は試験した各遺伝子に特有で、１サイクルは９４℃で３０秒、ｘ℃で３０秒、及び７２℃で３０秒からなり、各増幅の前には９４℃で２分間処理され、７２℃で３分間の処理で終了した。アポトーシス及び炎症に関係する遺伝子の同義遺伝子ＰＣＲのためのキットＭＰ−７０２１１（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンフランシスコ、米国）を説明書通りに用いた。各キットを使う前に、同義遺伝子を検出するために複数の逆方向プライマー及び順方向プライマーを同時に操作する条件を決定した。ＴＮＦ−α及びＣＯＸ−２遺伝子を検出するためのプライマーを含んだキットＭＰ−７０２１１の使用条件は次の通りである。９６℃で１分間及び６０℃で４分間（２サイクル）；９４℃で１分間及び６０℃で２分間（２９サイクル）；７０℃で１０分間（１サイクル）及び２５℃で浸漬。１組の条件下で同義遺伝子を検出するためのＭＰＣＲキットで使用した逆方向プライマー及び順方向プライマーのＤＮＡ塩基配列は工業所有権があるので、この報告書では記載しない。
【００９８】
プライマー配列及び増幅サイクル数
ヒト：
【表４】
【００９９】
マウス：
【表５】
【０１００】
Ｂ．ｍＲＮＡレベルの相対的定量化
遺伝子の増幅は、２％のエチジウムブロマイドを含む１ＸＴＡＥ緩衝液中で１５０Ｖで３０分間流した３％アガロースゲルに１０μｌのＰＣＲ産物をロードすることによって分析した。ＰＣＲ産物はＵＶ光下で蛍光バンドとして視覚化された。ゲルはＫｏｄａｃ ＤＣ １２０カメラを使って調べ、バンドの蛍光強度はソフトウェアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ β４．０２ Ｗｉｎ（Ｓｃｉｏｎ社、メリーランド、米国）を使って定量化した。
【０１０１】
ネズミの系におけるＣＤ１ｄタンパク質の研究は腸管の上皮細胞及び肝細胞と同様に多くの種類の造血細胞における広範囲で構成的な発現を示唆するが、この分子が正常及び／又はＵＶ照射のマウス皮膚細胞、特にケラチノサイトによって発現されるかどうかは分かっていない。この問題に対処するため、非照射及びＵＶＢ照射の野生型マウスからの皮膚をホルマリンで固定し、切片を作製し、抗マウスＣＤ１ｄ ｍＡｂ（１Ｈ１）を使って染色してＣＤ１ｄタンパク質を検出した。正常の非照射皮膚のＣＤ１ｄタンパク質の検出は陰性であった（データは示されていない）。しかし、ＣＤ１ｄタンパク質は、ＵＶＢを照射したマウス皮膚の表皮及び真皮で検出された（茶色）（図５）。染色は主に皮膚のより分化した層（顆粒層及び角質層）に限定され、細胞レベルでは細胞質及び核膜に限局された。
【０１０２】
このように、ＵＶＢ起因性マウス皮膚損傷／火傷は抗原提示細胞（局所的又は全身的）によってではなく、マウスケラチノサイトのレベルで直接制御される。
【０１０３】
ＣＤ１ｄ遺伝子転写はＵＶ照射によって調節される
ＵＶＢ起因性皮膚損傷がＣＤ１ｄによって調節され、ＣＤ１ｄタンパク質がマウス表皮細胞（ケラチノサイト）によって発現されることが証明され、次に重要なことは皮膚ＣＤ１ｄ発現がＵＶ照射によって調節されるかどうかの立証であった。皮膚ＣＤ１ｄ発現がＵＶ照射によって調節されることのいかなる指標は、皮膚内ＣＤ１ｄレベルの調整がＵＶ誘発性皮膚損傷の調節を担う重要な因子であることを示唆するであろう。この問題に対処するために、野生型マウスの毛剃りをした背をＵＶＢ照射に単回（８６ｍＪ／ｃｍ２）曝し、照射後様々な時間（６、２４、４８、７２及び９６時間後）に照射された皮膚を切除し、ＲＮＡを抽出して精製し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。対照として、正常非照射マウス皮膚を切除し、ＲＮＡを抽出して精製し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１０４】
図６で示すように、ＵＶＢ照射から６時間後には早くも低下したマウス皮膚全体におけるＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルは、照射後２４時間には正常な非照射皮膚で検出されたレベルと比較して有意に低下していた。対照的に、ＵＶＢ照射から４８、７２及び９６時間後には、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルは正常な非照射の対照皮膚で検出されたレベルより高くなっていた。皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写に及ぼすＵＶＢ照射の作用に関する我々の研究を更に確認するために、我々は野生型マウスの剃った背を太陽のＵＶ照射（ＵＶＢ＋ＵＶＡ）の様々な線量（太陽ＵＶ光の１６８０ｍＪ／ｃｍ２（１分）、１６，８００ｍＪ／ｃｍ２（１０分）又は３３，６００ｍＪ／ｃｍ２（２０分））に露出させた。照射から６及び７２時間後、照射皮膚を切除し、ＲＮＡを抽出して精製し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した（図７）。ＵＶＢ照射と同様に、我々はＵＶ線量を問わず太陽ＵＶ照射から６及び７２時間後に類似したＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルのそれぞれ低下及び上昇を観察し、ＵＶ照射への皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写の反応はＵＶ曝露の有害な作用に対する皮膚の反応における重要な事象であることを示唆している。
【０１０５】
ヒトケラチノサイトＣＤ１ｄ遺伝子転写は、太陽ＵＶ光照射によって調節される
ヒトＣＤ１ｄ遺伝子転写がＵＶ照射によって調節されるかどうか取り組む中で、培養ヒトケラチノサイトがＵＶ照射に対して類似した遺伝子転写動態プロフィールを示すかどうか調査を行った。３反復のＤＫ７細胞ケラチノサイト培養物を１回量５７００ｍＪ／ｃｍ２の太陽ＵＶ光照射へ曝露してから異なる時間に細胞をＲＮＡのために収穫し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡの相対レベルを決定するために半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実行した（図８）。ＵＶ照射（ＵＶＢ又は太陽光）マウス皮膚で観察されたように、正常な非照射対照と比較して、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルは照射後６時間に低下した。照射後１０時間のＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡレベルの分析の結果、これらのレベルは正常な非照射細胞培養で検出されたレベルと比較して更に減少していたことが分かった。ＵＶ曝露から１６時間及び４８時間の間に、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡのレベルは比例的に増加した。また、マウス皮膚におけるＵＶ誘発性ＣＤ１ｄ遺伝子転写はケラチノサイトのレベルで調節されている可能性を示唆するパターンも、ＵＶ照射を受けた野生型マウスの全皮膚で観察された。
【０１０６】
ヒトケラチノサイトＣＤ１ｄ遺伝子転写はＵＶ照射に反応し、マウス皮膚ＣＤ１ｄと同様の方法で調節されるようであり、このことはａ）皮膚ＣＤ１ｄはＵＶ照射に対する皮膚反応の調節において重要な役割を担い、またｂ）皮膚のＣＤ１ｄレベルの調整はＵＶ誘発性皮膚炎症／損傷の調節を担う重要な因子であることを暗示している。
【０１０７】
皮膚炎症を調節する鍵遺伝子の遺伝子転写は、ＵＶＢを照射したＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚では減少する
ＵＶＢ誘発性皮膚炎症／損傷の調節を担う重要な分子としてのＣＤ１ｄを更に確認するために、我々は次にＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子転写（ＵＶＢ誘発性の皮膚炎症／損傷の調節を担う鍵遺伝子）はＵＶ光を照射したＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚では調節されないかどうかを調査した。ＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚においてＣＯＸ−２及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルがＵＶ光照射から４８及び７２時間後に阻害されることが分かった（図９）。ＵＶ光誘発性皮膚損傷／炎症がＵＶ光照射から４８及び７２時間後に野生型マウスで観察されることから、これらのデータは皮膚ＣＤ１ｄがＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α遺伝子の転写を誘発することによってＵＶ光誘発性皮膚炎症／損傷を媒介することを証明している。
【実施例１１】
【０１０８】
ＣＤ１ｄノックアウトマウスのＵＶ照射をした皮膚の炎症性サイトカイン合成は、野生型対照マウスと比較して減少する。
【０１０９】
マウスのＵＶ照射
マウスは、２００ｍＪ／ｍ２のＵＶＢの入射線量に１度曝露させた。３カ月齢の雌近交の１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ及び１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ１ｄ ＫＯマウスがこの研究に含まれた（ｎ＝４）。
【０１１０】
サイトカイン定量化
皮膚の８ｍｍパンチ生検材を照射後０、２４、４８、７２、９６及び１６８時間後に収穫して直ちに液体窒素で凍結した。古典的ＥＬＩＳＡ法を用いて皮膚ホモジェネートのＩＬ−６及びＭＩＰ１−αを定量した。
【０１１１】
ＷＴマウスではＵＶ−Ｂ照射は照射の４８時間後に炎症性サイトカイン合成の高い上方調節を誘発するが、ＣＤ１ｄ ＫＯマウスではＩＬ−６及びＭＩＰ１−αタンパク質の合成は有意に減少する。このことはＵＶＢ誘発性皮膚炎症におけるＣＤ１ｄの主要な役割を示す。
【実施例１２】
【０１１２】
ヒドロコルチゾンは、化学的ストレス誘発性ＣＤ１ｄ遺伝子転写を抑制する。
【０１１３】
一次ヒトケラチノサイトを完全ＫＧＭで培養してから、ストレス因子としての３００μＭのＨ２Ｏ２に曝露させた。接種の４８時間後にＫＧＭ培地をヒドロコルチゾンを含まないＫＧＭで置換し、培養物を３００μＭのＨ２Ｏ２で処理した。処理後異なる時間で総ＲＮＡを抽出し、ＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲによって定量化した。
【０１１４】
Ｔａｑ Ｍａｎ検定については、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓは１ウェルあたり１０から１００ｎｇの初期のＲＮＡ量の使用を推奨している。したがって、第１鎖ｃＤＮＡの合成は、メーカーの推奨（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ、１１９０４−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って１μｇの総ＲＮＡ及び１５０μｇのランダム六量体を使って２０μｌの体積で行った。得られたｃＤＮＡ試料の１μｌをリアルタイムＰＣＲによる増幅のために使用した。
【０１１５】
ＣＤ１ｄのｃＤＮＡの検出のために使われたプライマー及びプローブのセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからＡｓｓａｙｓ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄとして提供された（それぞれＨｓ００１７４３２１＿ｍｌ及びＨｓ００１６６２８９＿ｍｌ）。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのためのプライマー及びプローブはＰＤＡＲＳ（４３１０８８４Ｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として提供された。
【０１１６】
すべてのｃＤＮＡ試料は３反復で試験した。ＰＣＲ反応混合物はミクロ遠心管で氷上で調製した。１反復は、１．２５μｌの２０×の標的又は対照の混合液、１０．２５μｌの水及び１２．５μｌの２×のＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ混合液を使って２４μｌのプレミックスを作製し、１μｌのｃＤＮＡに加えた。ＰＣＲ反応混合物を穏やかに且つ速く遠心分離し、９６ウェルプレートに１ウェルにつき２５μｌを等分して入れた。プレートを密封し、２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、以下のＰＣＲプログラムを用いた温度サイクル及び蛍光分析のための５７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムに入れた：
− ５０℃２分
− ９５℃１０分
− ９５℃１５秒及び６０℃１分を４０サイクル
【０１１７】
結果は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ ＳＤＳソフトウェアを使用して解析した。サイクル数の関数としての関心のあるｃＤＮＡの増幅を示す増幅グラフが得られた。
【０１１８】
対照条件と比較してこの試験条件で得られた遺伝子発現倍率の変化は、下記式を使って比較Ｃｔ法で測定された：
【数１】
【０１１９】
図１１で示すように、細胞がＨ２Ｏ２に曝されたときにＣＤ１ｄ遺伝子発現の調整が時間と共に観察される。ヒドロコルチゾンの存在下では、Ｈ２Ｏ２チャレンジ後に得られるＣＤ１ｄ遺伝子発現のパターンはヒドロコルチゾンがＣＤ１ｄ転写を抑制した点で異なった。
【０１２０】
このように、ヒドロコルチゾンはストレスを受けた細胞でＣＤ１ｄの発現を抑制することができる。
【実施例１３】
【０１２１】
リン脂質レベルは、野生型マウス皮膚と比較してＣＤ１ｄノックアウトマウスの皮膚及び腸では調節されない。
【０１２２】
マウス：５カ月齢の雌近交のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ１ｄ−／−及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを屠殺してそれぞれの組織を切除した。各マウスからの皮膚／腸管組織の切片を液体窒素で急速冷凍した。それらを脂質含量について分析した。
【０１２３】
皮膚のＣＤ１ｄによって調節された主な脂質ファミリーはリン脂質であった。
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
スフィンゴミエリン
動物細胞膜の遍在構成成分であり、断然最も多く存在するスフィンゴ脂質である。実際、ある種の組織では脂質の５０％を占めるが、通常ホスファチジルコリンよりは少ない。例えば、スフィンゴミエリンは脳脂質の約１０％を占める。大部分の反すう動物の赤血球に単独で最も多く存在する脂質であり、そこでは完全にホスファチジルコリンを置換する。この場合、スフィンゴミエリンは分解しないがグリセロリン脂質を分解する非常に活性の高いホスホリパーゼＡが存在することが知られている。ホスファチジルコリンと同様に、スフィンゴミエリンは原形質膜、特に細胞の外側の小葉に最も豊富となる傾向がある。
【０１２６】
今ではスフィンゴミエリン（及び他のスフィンゴ脂質）並びにコレステロールは、一緒に膜の特定のサブドメイン（「ラフト（ｒａｆｔ）」又は「カベオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）」と呼ばれる関連した構造）に位置することが分かっている。長く、多くは飽和したアシル鎖を含んでいるので、スフィンゴ脂質は、膜グリセロリン脂質より互いに密に充填され、そのため融点もはるかに高い。このアシル鎖の密な充填はラフト脂質の組織化に必須であるが、その理由は、スフィンゴ脂質及びリン脂質の差別的充填機能が、膜内で相分離をもたらし、グリセロリン脂質の豊富な領域（「無秩序液」相）で囲まれたスフィンゴ脂質の豊富なラフト（「秩序液」相）を生じると考えられているからである。特定の細胞タンパク質とこれらラフトの脂質間の相互作用はシグナル伝達機構に重要と考えられており、細胞シグナル伝達の調節におけるスフィンゴミエリンの重要な役割を暗示している。
【０１２７】
スフィンゴミエリンは、アポトーシスに関係するシグナル伝達プロセスにおける鍵脂質である。
【０１２８】
また、スフィンゴミエリンはセラミド、長鎖塩基及び「スフィンゴミエリンサイクル」の一部としてスフィンゴシン−１−リン酸塩、並びに他の多くの重要なスフィンゴ脂質の前駆体の役目もする。（下記図を参照）。これらの一部は細胞内メッセンジャーの機能を有し、一部は必須の膜構成成分である。
【化１】
【０１２９】
リゾホスファチジルコリン
− 炎症誘発性のリン脂質
− 乾癬病変で上昇する
− 皮内注射は皮膚炎症を誘発する
− アラキドン酸の生産において律速段階であるホスホリパーゼＡ２の作用によって形成される。（ＣＤ１ｄによるＣＯＸ−２の調節との関連）。
【０１３０】
大腸では以下の結果が得られた：
【表７】
【０１３１】
小腸では以下の結果が得られた：
【表８】
【０１３２】
この上記データは、炎症プロセスを制御するリン脂質代謝の調節におけるＣＤ１ｄの役割を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害（火傷）を示す野生型マウスの図である。
【図１Ｂ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害（火傷）を示す野生型マウスの図である。（拡大図）
【図１Ｃ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害の明瞭な徴候を示さないＣＤ１ｄノックアウトマウスの図である。
【図１Ｄ】ＵＶＢ照射の単回投与（８６ｍＪ／ｍ２）後の皮膚傷害の明瞭な徴候を示さないＣＤ１ｄノックアウトマウスの図である。（拡大図）
【図２】ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）を２回投与された野生型（右）及びＣＤ１ｄノックアウト（左）マウス間のＵＶＢによって誘発された皮膚傷害の程度の差を示す図である。
【図２Ａ】ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）を２回投与された野生型マウスの傷害（病変）を受けた背面皮膚を示す図である。（拡大図）
【図２Ｂ】ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）を２回投与されたＣＤ１ｄノックアウトマウスの無傷の背面皮膚を示す図である。
【図３】ＴＵＮＥＬで測定した場合の、野生型マウスと比較して背面の表皮により多くの表皮アポトーシスを示すＣＤ１ｄノックアウトマウスの図である。ＵＶ照射に曝されない野生型（Ａ）及びＣＤ１ｄノックアウト（Ｂ）マウスの皮膚。ＵＶＢ照射（８６ｍＪ／ｍ２）に１回曝されてから４８時間後の野生型（Ｃ）及びＣＤ１ｄノックアウト（Ｄ）マウスの皮膚。
【図４ａ】マウス及びヒトの異なる組織におけるＣＤ１ｄのおよその量を示すグラフである。
【図４ｂ】マウス及びヒトの異なる組織におけるＣＤ１ｄのおよその量を示すグラフである。
【図５】ＵＶＢ照射の単回投与（４３０ｍＪ／ｍ２）後７２時間のマウス皮膚表皮に発現したＣＤ１ｄタンパク質を示す図である。
【図６】ＵＶＢ照射後に調節されたマウス皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写を示す図である。
【図７】模擬太陽光照射後に調節されたマウス皮膚ＣＤ１ｄ遺伝子転写を示す図である。
【図８】太陽光のＵＶ照射後に調節された、不死化（ＤＫ７）ヒトケラチノサイトのＣＤ１ｄ遺伝子転写を示す図である。
【図９】ＵＶＢ照射ＣＤ１ｄノックアウトマウス皮膚においてＣＯＸ−２及びＴＮＦ−α ｍＲＮＡレベルが下方調節されたことを示す図である。
【図１０ａ】ＣＤ１ｄ ＫＯマウスにおいてＵＶＢ照射４８時間後にマウス皮膚ＩＬ−６及びＭＩＰ１−αタンパク質レベルが顕著に低下したことを示す図である。
【図１０ｂ】ＣＤ１ｄ ＫＯマウスにおいてＵＶＢ照射４８時間後にマウス皮膚ＩＬ−６及びＭＩＰ１−αタンパク質レベルが顕著に低下したことを示す図である。
【図１１】ヒドロコルチゾンが化学的ストレスに曝された細胞でＣＤ１ｄ転写を抑制することを示す図である。
【図１２】ヒト毛包で発現したＣＤ１ｄを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ＣＤ１ｄ機能を遮断又は修飾することのできる物質であって、
（ａ）上皮細胞を関心のある物質に曝すステップと、
（ｂ）前記上皮細胞をストレス状況に置くステップと、
（ｃ）前記上皮細胞に対する前記ストレスの作用を、以下の検定、
（ｉ）上皮の過形成（Ｈ＆Ｅ）、
（ｉｉ）上皮増殖（ＢｒＵｄ，ＰＣＮＡ）、
（ｉｉｉ）上皮アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）、
（ｉｖ）ｐ５３突然変異蓄積、
（ｖ）上皮脂質の量的及び質的な評価、
（ｖｉ）アポトーシス細胞及び非アポトーシス細胞の表面受容体の共クラスター形成パターン、
（ｖｉｉ）炎症誘発性サイトカインの産生、
（ｖｉｉｉ）免疫調節性サイトカインの産生、
（ｉｘ）炎症のマーカー、
（ｘ）抗アポトーシス転写因子、及び
（ｘｉ）老化のマーカー
の１つ又は複数についてスクリーニングすることによって決定するステップと、
（ｄ）得られた結果を対照と比較するステップ
とを含む方法で得られる物質。
【請求項２】
上皮細胞に対するストレスの有害作用を予防及び／又は治療することのできる、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
脱毛症を予防又は治療することのできる、請求項１に記載の物質。
【請求項４】
ＣＤ１ｄ遺伝子の転写及び／又は翻訳を減少させる化合物である、前記請求項のいずれかに記載の物質。
【請求項５】
ＣＤ１ｄ遺伝子及び／又はＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡに含まれる配列にアンチセンスなポリヌクレオチドである、請求項４に記載の物質。
【請求項６】
グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子及び／又はグルコシルセラミドシンターゼｍＲＮＡに含まれる配列にアンチセンスなポリヌクレオチドである、請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項７】
スフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼ遺伝子及び／又はスフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼのｍＲＮＡに含まれる配列にセンスなポリヌクレオチドである、請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項８】
ＣＤ１ｄと結合して本質的にＣＤ１ｄ機能を遮断又は修飾するポリペプチド又はペプチドである、請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項９】
前記ポリペプチドが抗体又は抗体可変部である、請求項８に記載の物質。
【請求項１０】
脂質である請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項１１】
前記脂質がスフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質、リン脂質、ガングリオシド、ステロール、脂肪酸、グリセリド又はホスファチジルイノシトールリン酸である、請求項１０に記載の物質。
【請求項１２】
植物、微生物又は動物に由来するか、或いは植物化学物質、特に天然若しくは合成のポリフェノール、又は緑茶成分、ギンコライド、ビタミン、アミノ酸又はカロテノイドである、請求項１０及び１１に記載の物質。
【請求項１３】
セラミドであるか、又はＴＮＦスーパーファミリー、特にＣＤ９５／ＡＰＯ−１／Ｆａｓに属する受容体のリガンドである、請求項８に記載の物質。
【請求項１４】
上皮細胞に対するストレスの有害作用及び／又は脱毛症の予防及び／又は治療用の担体の調製のための、前記請求項のいずれかに記載の物質。
【請求項１５】
少なくとも前記請求項のいずれかに記載の物質を含む組成物。
【請求項１６】
食品組成物、化粧組成物又は医薬組成物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
牛乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、乳ベースの粉製品、乳児食、穀物製品、発酵穀物ベースの製品、ミネラルウォーター、チョコレート又はペットフード、或いはローション、シャンプー、クリーム、日焼け止め、日焼け手入れクリーム、老化予防クリーム及び／又は軟膏若しくは錠剤、液剤、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、乾燥若しくは湿性経管栄養、又は抗癌剤である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ストレス状況によって起こる上皮組織の損傷の予防及び／又は治療、並びに／或いは脱毛症の予防及び／又は治療のための、請求項１から１４までのいずれかに記載の物質又は請求項１３から１５までのいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１９】
前記ストレス状況が化学的ストレス、生物学的ストレス又は物理的ストレスである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記化学的ストレスがオキシダント又は発癌物質への曝露によって起こるか、或いは前記生物学的なストレスが細菌、ウイルス、真菌類、周辺細胞及び／若しくは微生物に由来する脂質への曝露によって起こるか、或いは前記物理的ストレスがＵＶ光照射への曝露によって起こる、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記損傷が皮膚の火傷及び／又は水ぶくれ、白内障形成、表皮性の過形成、癌、炎症、免疫抑制、皮膚老化である、請求項１８から２０までのいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記上皮細胞が皮膚、腸、眼、肺、前立腺、肝臓、乳房、腎臓、及び／又は子宮に由来する、請求項１８から２１までのいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記癌が乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、腎臓癌、非メラノーマ及びメラノーマ皮膚癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
ＣＤ１ｄを遮断又は修飾する物質を識別する方法であって、
（ａ）上皮細胞を関心のある物質に曝すステップと、
（ｂ）前記上皮細胞をストレス状況に置くステップと、
（ｃ）前記上皮細胞に対する前記ストレスの作用を、以下の検定、
（ｉ）上皮の過形成（Ｈ＆Ｅ）、
（ｉｉ）上皮増殖（ＢｒＵｄ，ＰＣＮＡ）、
（ｉｉｉ）上皮アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）、
（ｉｖ）ｐ５３突然変異蓄積、
（ｖ）上皮脂質の量的及び質的な評価、
（ｖｉ）アポトーシス細胞及び非アポトーシス細胞の表面受容体の共クラスター形成パターン、
（ｖｉｉ）炎症誘発性サイトカインの産生、
（ｖｉｉｉ）免疫調節性サイトカインの産生、
（ｉｘ）炎症のマーカー、
（ｘ）抗アポトーシス転写因子、及び
（ｘｉ）老化のマーカー
の１つ又は複数についてスクリーニングすることによって決定するステップと、
（ｄ）得られた結果を対照と比較するステップ
とを含む方法。
【請求項２５】
前記ストレス状況が化学的ストレス、生物学的ストレス又は物理的ストレスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学的ストレスがオキシダント又は発癌物質への曝露によって起こるか、或いは前記生物学的なストレスが細菌、ウイルス、真菌類、周辺細胞及び／若しくは微生物に由来する脂質への曝露によって起こるか、或いは前記物理的ストレスがＵＶ光照射への曝露によって起こる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症誘発性サイトカインがＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−８からなる群から選択される、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫調節性サイトカインがＰＡＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４又はＴＧＦ−βからなる群から選択される、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記脂質がリン酸脂質、スフィンゴ脂質及びグリコスフィンゴ脂質からなる群から選択される、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症マーカーがＣＯＸ−２及びｉＮｏｓを含む、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記抗アポトーシス転写因子がＡＰ−１及びＮＦκＢを含む、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記老化マーカーがエラスターゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン及びテロメラーゼを含む、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
癌の多剤耐性を減少させるための、請求項１から１４までのいずれかに記載の物質又は請求項１５から１７までのいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３４】
前記癌が皮膚癌、腸癌又は乳癌である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ＣＤ１ｄ機能を修飾及び／又は遮断する物質をスクリーニングするための検定において、ＣＤ１ｄを発現及び／又は過剰発現する細胞の使用。
【請求項３６】
ストレス状況によって引き起こされる上皮組織の損傷及び／又は脱毛症に作用する物質の活性を決定するための、試験モデルとしてのＣＤ１ｄ−／−動物の使用。
【請求項３７】
遺伝子治療における請求項１から１４までのいずれかに記載の物質の使用。
【請求項１】
内因性ＣＤ１ｄ機能を遮断又は修飾することのできる物質であって、
（ａ）上皮細胞を関心のある物質に曝すステップと、
（ｂ）前記上皮細胞をストレス状況に置くステップと、
（ｃ）前記上皮細胞に対する前記ストレスの作用を、以下の検定、
（ｉ）上皮の過形成（Ｈ＆Ｅ）、
（ｉｉ）上皮増殖（ＢｒＵｄ，ＰＣＮＡ）、
（ｉｉｉ）上皮アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）、
（ｉｖ）ｐ５３突然変異蓄積、
（ｖ）上皮脂質の量的及び質的な評価、
（ｖｉ）アポトーシス細胞及び非アポトーシス細胞の表面受容体の共クラスター形成パターン、
（ｖｉｉ）炎症誘発性サイトカインの産生、
（ｖｉｉｉ）免疫調節性サイトカインの産生、
（ｉｘ）炎症のマーカー、
（ｘ）抗アポトーシス転写因子、及び
（ｘｉ）老化のマーカー
の１つ又は複数についてスクリーニングすることによって決定するステップと、
（ｄ）得られた結果を対照と比較するステップ
とを含む方法で得られる物質。
【請求項２】
上皮細胞に対するストレスの有害作用を予防及び／又は治療することのできる、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
脱毛症を予防又は治療することのできる、請求項１に記載の物質。
【請求項４】
ＣＤ１ｄ遺伝子の転写及び／又は翻訳を減少させる化合物である、前記請求項のいずれかに記載の物質。
【請求項５】
ＣＤ１ｄ遺伝子及び／又はＣＤ１ｄ−ｍＲＮＡに含まれる配列にアンチセンスなポリヌクレオチドである、請求項４に記載の物質。
【請求項６】
グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子及び／又はグルコシルセラミドシンターゼｍＲＮＡに含まれる配列にアンチセンスなポリヌクレオチドである、請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項７】
スフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼ遺伝子及び／又はスフィンゴミエリナーゼ若しくはセラミドシンターゼのｍＲＮＡに含まれる配列にセンスなポリヌクレオチドである、請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項８】
ＣＤ１ｄと結合して本質的にＣＤ１ｄ機能を遮断又は修飾するポリペプチド又はペプチドである、請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項９】
前記ポリペプチドが抗体又は抗体可変部である、請求項８に記載の物質。
【請求項１０】
脂質である請求項１から４までのいずれかに記載の物質。
【請求項１１】
前記脂質がスフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質、リン脂質、ガングリオシド、ステロール、脂肪酸、グリセリド又はホスファチジルイノシトールリン酸である、請求項１０に記載の物質。
【請求項１２】
植物、微生物又は動物に由来するか、或いは植物化学物質、特に天然若しくは合成のポリフェノール、又は緑茶成分、ギンコライド、ビタミン、アミノ酸又はカロテノイドである、請求項１０及び１１に記載の物質。
【請求項１３】
セラミドであるか、又はＴＮＦスーパーファミリー、特にＣＤ９５／ＡＰＯ−１／Ｆａｓに属する受容体のリガンドである、請求項８に記載の物質。
【請求項１４】
上皮細胞に対するストレスの有害作用及び／又は脱毛症の予防及び／又は治療用の担体の調製のための、前記請求項のいずれかに記載の物質。
【請求項１５】
少なくとも前記請求項のいずれかに記載の物質を含む組成物。
【請求項１６】
食品組成物、化粧組成物又は医薬組成物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
牛乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、乳ベースの粉製品、乳児食、穀物製品、発酵穀物ベースの製品、ミネラルウォーター、チョコレート又はペットフード、或いはローション、シャンプー、クリーム、日焼け止め、日焼け手入れクリーム、老化予防クリーム及び／又は軟膏若しくは錠剤、液剤、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、乾燥若しくは湿性経管栄養、又は抗癌剤である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ストレス状況によって起こる上皮組織の損傷の予防及び／又は治療、並びに／或いは脱毛症の予防及び／又は治療のための、請求項１から１４までのいずれかに記載の物質又は請求項１３から１５までのいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１９】
前記ストレス状況が化学的ストレス、生物学的ストレス又は物理的ストレスである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記化学的ストレスがオキシダント又は発癌物質への曝露によって起こるか、或いは前記生物学的なストレスが細菌、ウイルス、真菌類、周辺細胞及び／若しくは微生物に由来する脂質への曝露によって起こるか、或いは前記物理的ストレスがＵＶ光照射への曝露によって起こる、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記損傷が皮膚の火傷及び／又は水ぶくれ、白内障形成、表皮性の過形成、癌、炎症、免疫抑制、皮膚老化である、請求項１８から２０までのいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記上皮細胞が皮膚、腸、眼、肺、前立腺、肝臓、乳房、腎臓、及び／又は子宮に由来する、請求項１８から２１までのいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記癌が乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、腎臓癌、非メラノーマ及びメラノーマ皮膚癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
ＣＤ１ｄを遮断又は修飾する物質を識別する方法であって、
（ａ）上皮細胞を関心のある物質に曝すステップと、
（ｂ）前記上皮細胞をストレス状況に置くステップと、
（ｃ）前記上皮細胞に対する前記ストレスの作用を、以下の検定、
（ｉ）上皮の過形成（Ｈ＆Ｅ）、
（ｉｉ）上皮増殖（ＢｒＵｄ，ＰＣＮＡ）、
（ｉｉｉ）上皮アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）、
（ｉｖ）ｐ５３突然変異蓄積、
（ｖ）上皮脂質の量的及び質的な評価、
（ｖｉ）アポトーシス細胞及び非アポトーシス細胞の表面受容体の共クラスター形成パターン、
（ｖｉｉ）炎症誘発性サイトカインの産生、
（ｖｉｉｉ）免疫調節性サイトカインの産生、
（ｉｘ）炎症のマーカー、
（ｘ）抗アポトーシス転写因子、及び
（ｘｉ）老化のマーカー
の１つ又は複数についてスクリーニングすることによって決定するステップと、
（ｄ）得られた結果を対照と比較するステップ
とを含む方法。
【請求項２５】
前記ストレス状況が化学的ストレス、生物学的ストレス又は物理的ストレスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学的ストレスがオキシダント又は発癌物質への曝露によって起こるか、或いは前記生物学的なストレスが細菌、ウイルス、真菌類、周辺細胞及び／若しくは微生物に由来する脂質への曝露によって起こるか、或いは前記物理的ストレスがＵＶ光照射への曝露によって起こる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症誘発性サイトカインがＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−８からなる群から選択される、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫調節性サイトカインがＰＡＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４又はＴＧＦ−βからなる群から選択される、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記脂質がリン酸脂質、スフィンゴ脂質及びグリコスフィンゴ脂質からなる群から選択される、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症マーカーがＣＯＸ−２及びｉＮｏｓを含む、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記抗アポトーシス転写因子がＡＰ−１及びＮＦκＢを含む、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記老化マーカーがエラスターゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン及びテロメラーゼを含む、請求項２４から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
癌の多剤耐性を減少させるための、請求項１から１４までのいずれかに記載の物質又は請求項１５から１７までのいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３４】
前記癌が皮膚癌、腸癌又は乳癌である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ＣＤ１ｄ機能を修飾及び／又は遮断する物質をスクリーニングするための検定において、ＣＤ１ｄを発現及び／又は過剰発現する細胞の使用。
【請求項３６】
ストレス状況によって引き起こされる上皮組織の損傷及び／又は脱毛症に作用する物質の活性を決定するための、試験モデルとしてのＣＤ１ｄ−／−動物の使用。
【請求項３７】
遺伝子治療における請求項１から１４までのいずれかに記載の物質の使用。
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４Ｂ】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図３】
【図４ａ】
【図４Ｂ】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００６−５１１４６２（Ｐ２００６−５１１４６２Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３２１２３（Ｐ２００４−５３２１２３）
【出願日】平成１５年８月２７日（２００３．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９４９６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１９９００
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（５９０００２０１３）ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月２７日（２００３．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９４９６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１９９００
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（５９０００２０１３）ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム (31)
【Ｆターム（参考）】
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