下等真核生物におけるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ発現

本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼのセットの異種発現によってさらに修飾されて、哺乳動物（例えば、ヒト）治療用糖タンパク質の精製のための宿主株になり得る、修飾オリゴ糖を有する真核生物宿主細胞に関する。そのプロセスは、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現および標的化するために使用され得る操作された宿主細胞を提供する。修飾脂質結合オリゴ糖を有する宿主細胞が作製されるかまたは選択される。操作された宿主細胞において作製されたＮ−グリカンは、バイセクト型Ｎ−グリカン構造を生成するＧｎＴＩＩＩ活性を示し、１種以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ）の異種発現によってさらに修飾されて、ヒト様糖タンパク質を生じ得る。

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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、該プロセスは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を該細胞に導入する工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、該プロセスは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を該細胞において発現させる工程を包含する、プロセス。
【請求項３】
下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、該プロセスは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２バイセクト型構造を含むＮ−グリカンを生成する１以上の酵素活性を該細胞において発現させる工程を包含する、プロセス。
【請求項４】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、バイセクト型グリカンを生成する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記糖タンパク質は、バイセクト型グリカンを含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項６】
前記活性は、実質的に細胞内にある、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項７】
前記宿主細胞から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１、２、または３に記載のプロセス。
【請求項８】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１、２、または３に記載のプロセス。
【請求項９】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択される、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記糖タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項１、２、または３に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記治療用タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１−アンチトリプシン、α−フェトプロテイン、ＤＮａｓｅＩＩ、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ｏｎｅｒｃｅｐｔ、ＴＮＦ結合タンパク質１ともいわれる）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびサイクロフィリンリガンド相互作用因子）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ありまたはなしのＧＬＰ−１からなる群より選択される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項１４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項１５】
前記活性は、実質的に細胞内にある、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性で反応し得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含むＮ−グリカンを生成する、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、バイセクト型グリカンを生成する、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
バイセクト型グリカンを含むＮ−グリカンを含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項１９】
前記Ｎ−グリカンは、１０モル％を超える前記バイセクト型グリカンを含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記Ｎ−グリカンは、８０モル％を超える前記バイセクト型グリカンを含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２バイセクト型構造を含むＮ−グリカンを含む下等真核生物宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１３、１４、１８、または２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択される、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
バイセクト型ＧｌｃＮＡｃにより修飾される、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造またはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項２６】
前記細胞は、１０モル％を超える前記修飾構造を生成する、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記細胞は、５０モル％を超える前記修飾構造を生成する、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項２９】
前記活性は、実質的に細胞内にある、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性で反応し得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を含むＮ−グリカンを生成する、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、バイセクト型グリカンを生成する、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ＧｎＴＩＩＩ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞。
【請求項３３】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性をさらに含む、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
ＯＣＨ１マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている、請求項１３、１４、２８、または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている、請求項１３、１４、２８、または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
α−１，２−マンノシダーゼＩ活性をさらに含む、請求項１３、１４、２８、または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをさらに含む、請求項１３、１４、２８、または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４１】
請求項２に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４２】
請求項３に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４３】
請求項８に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４４】
請求項９に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４５】
請求項１０に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４６】
請求項１１に記載のプロセスによって作製される、糖タンパク質。
【請求項４７】
下等真核生物宿主細胞において生成されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造にバイセクト型ＧｌｃＮＡｃを含む、糖タンパク質。
【請求項４８】
下等真核生物宿主細胞において生成されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造に結合したバイセクト型ＧｌｃＮＡｃを含む、糖タンパク質。
【請求項４９】
１０モル％を超える前記コア構造がバイセクト型ＧｌｃＮＡｃにより修飾される、請求項４８に記載の糖タンパク質。
【請求項５０】
８０モル％を超える前記コア構造がバイセクト型ＧｌｃＮＡｃにより修飾される、請求項４８に記載の糖タンパク質。
【請求項５１】
請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の糖タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項５２】
ｐＶＡ、ｐＶＢ、およびｐＶＣからなる群より選択される、ベクター。
【請求項５３】
前記ベクターは、ｐＶＡ５３、ｐＶＡ５４、ｐＶＡ５５、ｐＶＢ５３、ｐＶＢ５４、およびｐＶＢ５５からなる群より選択される、請求項５２に記載のベクター。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６−１】

【図１６−２】

【図１６−３】

【図１６−４】

【図１７】

【図１８】

【図１９−１】

【図１９−２】

【図１９−３】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【公表番号】特表２００６−５１８５９７（Ｐ２００６−５１８５９７Ａ）
【公表日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】

【出願番号】特願２００６−５０３７５７（Ｐ２００６−５０３７５７）
【出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５１２８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４５８
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５０５３１００７９）