下等真核生物細胞におけるクラス２マンノシダーゼおよびクラスＩＩＩマンノシダーゼの発現
【課題】下等真核生物において、Ｍａｎα１，３グリコシル結合およびＭａｎα１，６グリコシル結合に対して基質特異性を有するクラス２α−マンノシダーゼを発現することによってヒト−様糖タンパク質を生産する方法を提供する。
【解決手段】細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法からなる。
【解決手段】細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法からなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１
，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノ
シダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タ
ンパク質を生産する方法。
【請求項２】
細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質をインビボで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を
発現させる工程を含む下等真核生物宿主細胞において所望のＮ−グリカンを生産する方法
であって、該所望のＮ−グリカンは少なくとも１０モル％の収率で該宿主細胞内で生産さ
れる方法であって、Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３Ｇｌ
ｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される、請求項２に記載の
方法。
【請求項３】
前記所望のＮ−グリカンが少なくともオリゴ糖分岐Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６）Ｍ
ａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを有することを特徴とする
請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記マンノシダーゼ酵素活性が、Ｍａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を
含むオリゴ糖基質のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６双方の結合をインビボで加水分
解することができる、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴ糖基質がＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−
ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎ
α１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡ
ｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮ
Ａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎα
１，３ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
ｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，
３（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ
β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａ
ｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４
−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａ
ｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎまたは高マンナンとして特徴付けられる請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記マンノシダーゼ活性がクラス２マンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項１ま
たは２記載の方法。
【請求項７】
クラス２マンノシダーゼ活性がＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍ
ａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｇｌｃ
ＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−Ｇｌ
ｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；またはＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３
（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記クラス２マンノシダーゼ活性が、より高等な真核生物宿主細胞のゴルジ装置で通常見
出されるものである請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記マンノシダーゼ活性がクラスＩＩｘマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
１または２記載の方法。
【請求項１０】
クラスＩＩｘマンノシダーゼ活性がＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍ
ａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎ
α１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
ｎ；またはＭａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，
６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性
を有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記マンノシダーゼ活性がクラスＩＩＩマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
１または２記載の方法。
【請求項１２】
前記クラスＩＩＩマンノシダーゼ活性が（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）
Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；または高マンナンに対
する基質特異性を有する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記マンノシダーゼ活性が過剰発現される請求項１または２記載の方法。
【請求項１４】
前記マンノシダーゼが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる請求項１または２
記載の方法。
【請求項１５】
前記マンノシダーゼ活性が約５．０〜約８．０のｐＨ最適値を有する請求項１または２記
載の方法。
【請求項１６】
前記マンノシダーゼが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる請求項１または２
記載の方法。
【請求項１７】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞の分泌経路内に局在化された請求項１または２記載
の方法。
【請求項１８】
前記マンノシダーゼ活性が宿主細胞のＥＲ、ゴルジ装置またはトランスゴルジネットワー
クのうちの少なくとも１つ内に局在化されたポリペプチドから発現される請求項１または
２記載の方法。
【請求項１９】
前記マンノシダーゼ活性が、細胞標的化シグナルペプチドに融合したマンノシダーゼ触媒
ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸から発現される請求項１または２記載の方
法。
【請求項２０】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して天然であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
コードする配列を含む核酸から発現される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して異種であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
コードする配列を含む核酸から発現される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記マンノシダーゼ酵素活性がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｙａｎａマンノシダー
ゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉ
ｓマンノシダーゼＩＩ、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ
、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、
昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マ
ンノシダーゼＩＩよりなる群から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、宿主細胞に対して天然である標的ペプチドをコードする配列を含む
核酸から発現される請求項１または２記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、マンノシダーゼ触媒ドメインに対して異種である標的ペプチドをコ
ードする配列を含む核酸から発現される請求項１または２記載の方法。
【請求項２５】
さらに、宿主細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ
、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔ
ｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃ
ｒａｓｓａよりなる群から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該糖タンパク質が治療タンパク質である、請求項１または２記載の方法であって、該治療
タンパク質はエリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性Ｉｇｅ受容体α−鎖、
ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプ
シン阻害剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキ
シンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄系先祖阻害因子
−１、オステオプロテゲリン、α−１−抗トリプシン、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、
ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（
膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドイン
ターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／および
ｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エ
ンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセ
レブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）より
なる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、ここに少なくとも１つの遺伝子構築物が、
通常は関連しない細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸断片とイン−フレーム連
結したマンノシダーゼクラス２、ＩＩｘまたはＩＩＩ触媒ドメインをコードする核酸断片
を含む、核酸ライブラリー。
【請求項３０】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａマンノシ
ダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａ
ｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼ
ＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ
ｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞
質マンノシダーゼＩＩよりなる群から選択される請求項２９記載のライブラリー。
【請求項３１】
細胞標的化ペプチドをコードする核酸断片がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉ
ｃｈｉａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈ
ｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｎ
ＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１、お
よびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６よりなる群から選択される請求項２９記載の
ライブラリー。
【請求項３２】
発現制御配列に作動可能に連結した請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のライブラリ
ーに由来する融合構築物を含むベクターであって、ここに、該細胞標的化シグナルペプチ
ドがＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークのうちの少なくとも１つに標的化
された、ベクター。
【請求項３３】
前記発現制御配列が誘導性または構成的である請求項３２記載のベクター。
【請求項３４】
宿主細胞における発現に際して、インビボにてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａ
ｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の生産に関与するマンノシダーゼ活性
をコードする請求項３２記載のベクター。
【請求項３５】
請求項３４記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
ｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６と命名されたベクターの群
から選択される少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
標的化シグナルペプチドにイン−フレームに融合し、かつ下等真核生物宿主細胞での発現
に際して、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質を該基質のＭａｎα１，３結合および／またはＭａｎα
１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度までインビボで加水分解
できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプチド。
【請求項３８】
標的化シグナルベプチドにイン−フレームに融合し、下等真核生物宿主細胞における発現
に際して、Ｍａｎα１，３グリコシド結合、Ｍａｎα１，６グリコシド結合、またはＭａ
ｎα１，２グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３結合、Ｍａｎ
α１，６結合またはＭａｎα１，２結合の検出可能な部位がインビボで加水分解される程
度まで、インビボで加水分解できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプ
チド。
【請求項３９】
請求項３７記載のキメラポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４０】
請求項３７記載のキメラポリペプチドを含む宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３９記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４２】
請求項４０または４１記載の宿主細胞において生産された糖タンパク質。
【請求項４３】
請求項４０または４１記載の宿主細胞で生産されたＮ−グリカン。
【請求項４４】
前記Ｎ−グリカンが均一であることを特徴とする請求項４３記載のＮ−グリカン。
【請求項４５】
請求項１または２記載の方法によって生産された糖タンパク質。
【請求項４６】
請求項１または請求項２記載の方法によって生産されたＮ−グリカン。
【請求項４７】
前記Ｎ−グリカンが均一であることを特徴とする請求項４６記載のＮ−グリカン。
【請求項４８】
（ａ）配列番号９２（図２３からのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）；
（ｂ）配列番号９２のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
約９０％類似；
（ｃ）配列番号９３と少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号９２のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９２に少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくと
も９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９２にハイブリダイズする核酸配列；およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの断
片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項４９】
（ａ）配列番号９３（図２３からのラット）；
（ｂ）配列番号９３のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
９５％類似；
（ｃ）配列番号９３に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号９３のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９３に少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９３にハイブリダイズする核酸配列：およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの
断片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項５０】
（ａ）配列番号９４からのＣｉｏｎａ）；
（ｂ）配列番号９４のドナーヌクレオシチド結合部位のアミノ酸残基に少なくとも約９
０％類似；
（ｃ）配列番号９４に少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％または少なくとも９９．９％同一の核酸配列；
（ｄ）配列番号９４のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９４に少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくと
も９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９４にハイブリダイズする核酸配列；およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの
断片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項５１】
（ａ）配列番号９５（図２３からのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）；
（ｂ）配列番号９５のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
約９５％類似；
（ｃ）配列番号９５に少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一の核酸配列；
（ｄ）配列番号９５のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９５に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９５にハイブリダイズする核酸配列；およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの
断片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項５２】
配列番号５〜配列番号１５の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含むか
、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、コードされたポリ
ペプチドはオリゴ糖のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６グリコシド結合の加
水分解に関与する、修飾されたポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列番号４９〜配列番号５９の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含む
か、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、該コードされた
ポリペプチドは、オリゴ糖のＭａｎα１，３グリコシド結合および／またはＭａｎα１，
６グリコシド結合の加水分解に関与する、修飾されたヌクレオチド。
【請求項５４】
ｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６なる群から選択されたベク
ター。
【請求項１】
細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１
，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノ
シダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タ
ンパク質を生産する方法。
【請求項２】
細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質をインビボで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を
発現させる工程を含む下等真核生物宿主細胞において所望のＮ−グリカンを生産する方法
であって、該所望のＮ−グリカンは少なくとも１０モル％の収率で該宿主細胞内で生産さ
れる方法であって、Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３Ｇｌ
ｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される、請求項２に記載の
方法。
【請求項３】
前記所望のＮ−グリカンが少なくともオリゴ糖分岐Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６）Ｍ
ａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを有することを特徴とする
請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記マンノシダーゼ酵素活性が、Ｍａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を
含むオリゴ糖基質のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６双方の結合をインビボで加水分
解することができる、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴ糖基質がＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−
ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎ
α１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡ
ｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮ
Ａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎα
１，３ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
ｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，
３（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ
β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａ
ｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４
−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａ
ｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎまたは高マンナンとして特徴付けられる請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記マンノシダーゼ活性がクラス２マンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項１ま
たは２記載の方法。
【請求項７】
クラス２マンノシダーゼ活性がＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍ
ａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｇｌｃ
ＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−Ｇｌ
ｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；またはＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３
（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記クラス２マンノシダーゼ活性が、より高等な真核生物宿主細胞のゴルジ装置で通常見
出されるものである請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記マンノシダーゼ活性がクラスＩＩｘマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
１または２記載の方法。
【請求項１０】
クラスＩＩｘマンノシダーゼ活性がＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍ
ａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎ
α１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
ｎ；またはＭａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，
６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性
を有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記マンノシダーゼ活性がクラスＩＩＩマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
１または２記載の方法。
【請求項１２】
前記クラスＩＩＩマンノシダーゼ活性が（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）
Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；または高マンナンに対
する基質特異性を有する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記マンノシダーゼ活性が過剰発現される請求項１または２記載の方法。
【請求項１４】
前記マンノシダーゼが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる請求項１または２
記載の方法。
【請求項１５】
前記マンノシダーゼ活性が約５．０〜約８．０のｐＨ最適値を有する請求項１または２記
載の方法。
【請求項１６】
前記マンノシダーゼが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる請求項１または２
記載の方法。
【請求項１７】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞の分泌経路内に局在化された請求項１または２記載
の方法。
【請求項１８】
前記マンノシダーゼ活性が宿主細胞のＥＲ、ゴルジ装置またはトランスゴルジネットワー
クのうちの少なくとも１つ内に局在化されたポリペプチドから発現される請求項１または
２記載の方法。
【請求項１９】
前記マンノシダーゼ活性が、細胞標的化シグナルペプチドに融合したマンノシダーゼ触媒
ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸から発現される請求項１または２記載の方
法。
【請求項２０】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して天然であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
コードする配列を含む核酸から発現される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して異種であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
コードする配列を含む核酸から発現される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記マンノシダーゼ酵素活性がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｙａｎａマンノシダー
ゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉ
ｓマンノシダーゼＩＩ、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ
、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、
昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マ
ンノシダーゼＩＩよりなる群から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、宿主細胞に対して天然である標的ペプチドをコードする配列を含む
核酸から発現される請求項１または２記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、マンノシダーゼ触媒ドメインに対して異種である標的ペプチドをコ
ードする配列を含む核酸から発現される請求項１または２記載の方法。
【請求項２５】
さらに、宿主細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ
、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔ
ｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃ
ｒａｓｓａよりなる群から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該糖タンパク質が治療タンパク質である、請求項１または２記載の方法であって、該治療
タンパク質はエリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性Ｉｇｅ受容体α−鎖、
ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプ
シン阻害剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキ
シンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄系先祖阻害因子
−１、オステオプロテゲリン、α−１−抗トリプシン、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、
ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（
膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドイン
ターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／および
ｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エ
ンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセ
レブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）より
なる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、ここに少なくとも１つの遺伝子構築物が、
通常は関連しない細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸断片とイン−フレーム連
結したマンノシダーゼクラス２、ＩＩｘまたはＩＩＩ触媒ドメインをコードする核酸断片
を含む、核酸ライブラリー。
【請求項３０】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａマンノシ
ダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａ
ｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼ
ＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ
ｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞
質マンノシダーゼＩＩよりなる群から選択される請求項２９記載のライブラリー。
【請求項３１】
細胞標的化ペプチドをコードする核酸断片がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉ
ｃｈｉａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈ
ｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｎ
ＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１、お
よびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６よりなる群から選択される請求項２９記載の
ライブラリー。
【請求項３２】
発現制御配列に作動可能に連結した請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のライブラリ
ーに由来する融合構築物を含むベクターであって、ここに、該細胞標的化シグナルペプチ
ドがＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークのうちの少なくとも１つに標的化
された、ベクター。
【請求項３３】
前記発現制御配列が誘導性または構成的である請求項３２記載のベクター。
【請求項３４】
宿主細胞における発現に際して、インビボにてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａ
ｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の生産に関与するマンノシダーゼ活性
をコードする請求項３２記載のベクター。
【請求項３５】
請求項３４記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
ｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６と命名されたベクターの群
から選択される少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
標的化シグナルペプチドにイン−フレームに融合し、かつ下等真核生物宿主細胞での発現
に際して、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質を該基質のＭａｎα１，３結合および／またはＭａｎα
１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度までインビボで加水分解
できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプチド。
【請求項３８】
標的化シグナルベプチドにイン−フレームに融合し、下等真核生物宿主細胞における発現
に際して、Ｍａｎα１，３グリコシド結合、Ｍａｎα１，６グリコシド結合、またはＭａ
ｎα１，２グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３結合、Ｍａｎ
α１，６結合またはＭａｎα１，２結合の検出可能な部位がインビボで加水分解される程
度まで、インビボで加水分解できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプ
チド。
【請求項３９】
請求項３７記載のキメラポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４０】
請求項３７記載のキメラポリペプチドを含む宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３９記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４２】
請求項４０または４１記載の宿主細胞において生産された糖タンパク質。
【請求項４３】
請求項４０または４１記載の宿主細胞で生産されたＮ−グリカン。
【請求項４４】
前記Ｎ−グリカンが均一であることを特徴とする請求項４３記載のＮ−グリカン。
【請求項４５】
請求項１または２記載の方法によって生産された糖タンパク質。
【請求項４６】
請求項１または請求項２記載の方法によって生産されたＮ−グリカン。
【請求項４７】
前記Ｎ−グリカンが均一であることを特徴とする請求項４６記載のＮ−グリカン。
【請求項４８】
（ａ）配列番号９２（図２３からのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）；
（ｂ）配列番号９２のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
約９０％類似；
（ｃ）配列番号９３と少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号９２のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９２に少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくと
も９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９２にハイブリダイズする核酸配列；およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの断
片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項４９】
（ａ）配列番号９３（図２３からのラット）；
（ｂ）配列番号９３のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
９５％類似；
（ｃ）配列番号９３に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号９３のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９３に少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９３にハイブリダイズする核酸配列：およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの
断片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項５０】
（ａ）配列番号９４からのＣｉｏｎａ）；
（ｂ）配列番号９４のドナーヌクレオシチド結合部位のアミノ酸残基に少なくとも約９
０％類似；
（ｃ）配列番号９４に少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％または少なくとも９９．９％同一の核酸配列；
（ｄ）配列番号９４のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９４に少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくと
も９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９４にハイブリダイズする核酸配列；およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの
断片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項５１】
（ａ）配列番号９５（図２３からのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）；
（ｂ）配列番号９５のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
約９５％類似；
（ｃ）配列番号９５に少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一の核酸配列；
（ｄ）配列番号９５のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列；
（ｅ）配列番号９５に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９５にハイブリダイズする核酸配列；およ
び
（ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの
断片を含む核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項５２】
配列番号５〜配列番号１５の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含むか
、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、コードされたポリ
ペプチドはオリゴ糖のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６グリコシド結合の加
水分解に関与する、修飾されたポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列番号４９〜配列番号５９の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含む
か、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、該コードされた
ポリペプチドは、オリゴ糖のＭａｎα１，３グリコシド結合および／またはＭａｎα１，
６グリコシド結合の加水分解に関与する、修飾されたヌクレオチド。
【請求項５４】
ｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６なる群から選択されたベク
ター。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【公開番号】特開２０１０−２２０６１６（Ｐ２０１０−２２０６１６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０４１７１（Ｐ２０１０−１０４１７１）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【分割の表示】特願２００６−５０３７６０（Ｐ２００６−５０３７６０）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【分割の表示】特願２００６−５０３７６０（Ｐ２００６−５０３７６０）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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