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下等真核生物細胞におけるクラス2マンノシダーゼおよびクラスIIIマンノシダーゼの発現
説明

下等真核生物細胞におけるクラス2マンノシダーゼおよびクラスIIIマンノシダーゼの発現

【課題】下等真核生物において、Manα1,3グリコシル結合およびManα1,6グリコシル結合に対して基質特異性を有するクラス2α−マンノシダーゼを発現することによってヒト−様糖タンパク質を生産する方法を提供する。
【解決手段】細胞中で、Manα1,3グリコシド結合およびManα1,6グリコシド結合のいずれかまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のManα1,3および/またはManα1,6結合の少なくとも10%がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法からなる。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞中で、Manα1,3グリコシド結合およびManα1,6グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のManα1,3および/またはManα1
,6結合の少なくとも10%がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノ
シダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タ
ンパク質を生産する方法。
【請求項2】
細胞中で、Manα1,3グリコシド結合およびManα1,6グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質をインビボで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を
発現させる工程を含む下等真核生物宿主細胞において所望のN−グリカンを生産する方法
であって、該所望のN−グリカンは少なくとも10モル%の収率で該宿主細胞内で生産さ
れる方法であって、N−グリカンはManGlcNAc、GlcNAcManGl
cNAcおよびManGlcNAcよりなる群から選択される、請求項2に記載の
方法。
【請求項3】
前記所望のN−グリカンが少なくともオリゴ糖分岐Manα1,3(Manα1,6)M
anβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asnを有することを特徴とする
請求項2記載の方法。
【請求項4】
前記マンノシダーゼ酵素活性が、Manα1,3およびManα1,6グリコシド結合を
含むオリゴ糖基質のManα1,3およびManα1,6双方の結合をインビボで加水分
解することができる、請求項1または2記載の方法。
【請求項5】
前記オリゴ糖基質がManα1,3(Manα1,6Manα1,6)Manβ1,4−
GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;Manα1,3(Manα1,3Man
α1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;GlcNA
cβ1,2Manα1,3(Manα1,6Manα1,6)Manβ1,4−GlcN
Acβ1,4−GlcNAc−Asn;GlcNAcβ1,2Manα1,3)Manα
1,3 Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−As
n;Manα1,3(Manα1,3 Manα1,6 Manα1,6)Manβ1,
4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;GlcNAcβ1,2Manα1,
3(Manα1,3 Manα1,6 Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAc
β1,4−GlcNAc−Asn;Manα1,2Manα1,3(Manα1,3Ma
nα1,6Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−A
sn;Manα1,2Manα1,3(Manα1,3Manα1,6)Manβ1,4
−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;Manα1,2Manα1,3(Ma
nα1,6Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−A
snまたは高マンナンとして特徴付けられる請求項1または2記載の方法。
【請求項6】
前記マンノシダーゼ活性がクラス2マンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項1ま
たは2記載の方法。
【請求項7】
クラス2マンノシダーゼ活性がGlcNAcβ1,2Manα1,3(Manα1,6M
anα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;Glc
NAcβ1,2Manα1,3(Manα1,3Manα1,6)Manβ1,4−Gl
cNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;またはGlcNAcβ1,2Manα1,3
(Manα1,3Manα1,6Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,
4−GlcNAc−Asnに対する基質特異性を有する請求項6記載の方法。
【請求項8】
前記クラス2マンノシダーゼ活性が、より高等な真核生物宿主細胞のゴルジ装置で通常見
出されるものである請求項6記載の方法。
【請求項9】
前記マンノシダーゼ活性がクラスIIxマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
1または2記載の方法。
【請求項10】
クラスIIxマンノシダーゼ活性がManα1,3(Manα1,6Manα1,6)M
anβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;Manα1,3(Man
α1,3Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−As
n;またはManα1,2Manα1,3(Manα1,3Manα1,6Manα1,
6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asnに対する基質特異性
を有する請求項9記載の方法。
【請求項11】
前記マンノシダーゼ活性がクラスIIIマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
1または2記載の方法。
【請求項12】
前記クラスIIIマンノシダーゼ活性が(Manα1,6Manα1,6)Manβ1,
4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;(Manα1,3Manα1,6)
Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;または高マンナンに対
する基質特異性を有する請求項11記載の方法。
【請求項13】
前記マンノシダーゼ活性が過剰発現される請求項1または2記載の方法。
【請求項14】
前記マンノシダーゼが、さらに、Manα1,2結合を加水分解できる請求項1または2
記載の方法。
【請求項15】
前記マンノシダーゼ活性が約5.0〜約8.0のpH最適値を有する請求項1または2記
載の方法。
【請求項16】
前記マンノシダーゼが、さらに、Manα1,2結合を加水分解できる請求項1または2
記載の方法。
【請求項17】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞の分泌経路内に局在化された請求項1または2記載
の方法。
【請求項18】
前記マンノシダーゼ活性が宿主細胞のER、ゴルジ装置またはトランスゴルジネットワー
クのうちの少なくとも1つ内に局在化されたポリペプチドから発現される請求項1または
2記載の方法。
【請求項19】
前記マンノシダーゼ活性が、細胞標的化シグナルペプチドに融合したマンノシダーゼ触媒
ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸から発現される請求項1または2記載の方
法。
【請求項20】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して天然であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
コードする配列を含む核酸から発現される請求項19記載の方法。
【請求項21】
前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して異種であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
コードする配列を含む核酸から発現される請求項19記載の方法。
【請求項22】
前記マンノシダーゼ酵素活性がArabidopsis thalyanaマンノシダー
ゼII、C.elegansマンノシダーゼII、Ciona intestinali
sマンノシダーゼII、ショウジョウバエマンノシダーゼII、ヒトマンノシダーゼII
、マウスマンノシダーゼII、ラットマンノシダーゼII、ヒトマンノシダーゼIIx、
昆虫細胞マンノシダーゼIII、ヒトリソソームマンノシダーゼIIおよびヒト細胞質マ
ンノシダーゼIIよりなる群から選択される請求項1または2記載の方法。
【請求項23】
前記ポリペプチドが、宿主細胞に対して天然である標的ペプチドをコードする配列を含む
核酸から発現される請求項1または2記載の方法。
【請求項24】
前記ポリペプチドが、マンノシダーゼ触媒ドメインに対して異種である標的ペプチドをコ
ードする配列を含む核酸から発現される請求項1または2記載の方法。
【請求項25】
さらに、宿主細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む請求項1または2記載の方法。
【請求項26】
前記宿主細胞がPichia pastoris、Pichia finlandica
、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pic
hia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pic
hia thermotolerans、Pichia salictaria、Pic
hia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stipt
is、Pichia methanolica、Pichia sp.、Sacchar
omyces cerevisiae、Saccharomyces sp.、Hans
enula polymorpha、Kluyveromyces sp.、Kluyv
eromyces lactis、Candida albicans、Aspergi
llus nidulans、Aspergillus niger、Aspergil
lus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysospor
ium lucknowense、Fusarium sp、Fusarium gra
mineum、Fusarium venenatumおよびNeurospora c
rassaよりなる群から選択される請求項1または2記載の方法。
【請求項27】
宿主細胞がPichia pastorisである請求項26記載の方法。
【請求項28】
該糖タンパク質が治療タンパク質である、請求項1または2記載の方法であって、該治療
タンパク質はエリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性Ige受容体α−鎖、
IgG、IgG断片、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプ
シン阻害剤、IGF−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキ
シンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−2、骨髄系先祖阻害因子
−1、オステオプロテゲリン、α−1−抗トリプシン、α−フェトタンパク質、AAT、
rhTBP−1(オネルセプト、aka TNF結合タンパク質1)、TACI−Ig(
膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドイン
ターアクター)、FSH(小胞刺激ホルモン)、GM−CSF、GLP−1 w/および
w/o FC(グルカゴン様タンパク質1)IL−1受容体アゴニスト、sTNFr(エ
ンブレル、aka可溶性TNF受容体Fc融合)ATIII、rhトロンビン、グルコセ
レブロシダーゼおよびCTLA4−Ig(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig)より
なる群から選択される請求項28記載の方法。
【請求項29】
少なくとも2つの異なる遺伝子構築物を含み、ここに少なくとも1つの遺伝子構築物が、
通常は関連しない細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸断片とイン−フレーム連
結したマンノシダーゼクラス2、IIxまたはIII触媒ドメインをコードする核酸断片
を含む、核酸ライブラリー。
【請求項30】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインがArabidopsis thalianaマンノシ
ダーゼII、C.elegansマンノシダーゼII、Ciona intestina
lisマンノシダーゼII、ショウジョウバエマンノシダーゼII、ヒトマンノシダーゼ
II、マウスマンノシダーゼII、ラットマンノシダーゼII、ヒトマンノシダーゼII
x、昆虫細胞マンノシダーゼIII、ヒトリソソームマンノシダーゼIIおよびヒト細胞
質マンノシダーゼIIよりなる群から選択される請求項29記載のライブラリー。
【請求項31】
細胞標的化ペプチドをコードする核酸断片がSaccharomyces GLS1、S
accharomyces MNS1、Saccharomyces SEC12、Pi
chia SEC、Pichia OCH1、Saccharomyces MNN9、
Saccharomyces VAN1、Saccharomyces ANP1、Sa
ccharomyces HOC1、Saccharomyces MNN10、Sac
charomyces MNN11、Saccharomyces MNT1、Pich
ia D2、Pichia D9、Pichia J3、Saccharomyces
KTR1、Saccharomyces KTR2、Kluyveromyces Gn
TI、Saccharomyces MNN2、Saccharomyces MNN5
、Saccharomyces YUR1、Saccharomyces MNN1、お
よびSaccharomyces MNN6よりなる群から選択される請求項29記載の
ライブラリー。
【請求項32】
発現制御配列に作動可能に連結した請求項29〜31のいずれか1項に記載のライブラリ
ーに由来する融合構築物を含むベクターであって、ここに、該細胞標的化シグナルペプチ
ドがER、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークのうちの少なくとも1つに標的化
された、ベクター。
【請求項33】
前記発現制御配列が誘導性または構成的である請求項32記載のベクター。
【請求項34】
宿主細胞における発現に際して、インビボにてGlcNAcManGlcNAcMa
GlcNAcまたはManGlcNAcの生産に関与するマンノシダーゼ活性
をコードする請求項32記載のベクター。
【請求項35】
請求項34記載の少なくとも1つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項36】
pKD53、pKD1、pKD5、pKD6およびpKD16と命名されたベクターの群
から選択される少なくとも1つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項37】
標的化シグナルペプチドにイン−フレームに融合し、かつ下等真核生物宿主細胞での発現
に際して、Manα1,3グリコシド結合およびManα1,6グリコシド結合のいずれ
かまたは双方を含むオリゴ糖基質を該基質のManα1,3結合および/またはManα
1,6結合の少なくとも10%がインビボで加水分解される程度までインビボで加水分解
できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプチド。
【請求項38】
標的化シグナルベプチドにイン−フレームに融合し、下等真核生物宿主細胞における発現
に際して、Manα1,3グリコシド結合、Manα1,6グリコシド結合、またはMa
nα1,2グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、該基質のManα1,3結合、Man
α1,6結合またはManα1,2結合の検出可能な部位がインビボで加水分解される程
度まで、インビボで加水分解できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプ
チド。
【請求項39】
請求項37記載のキメラポリペプチドをコードする核酸。
【請求項40】
請求項37記載のキメラポリペプチドを含む宿主細胞。
【請求項41】
請求項39記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項42】
請求項40または41記載の宿主細胞において生産された糖タンパク質。
【請求項43】
請求項40または41記載の宿主細胞で生産されたN−グリカン。
【請求項44】
前記N−グリカンが均一であることを特徴とする請求項43記載のN−グリカン。
【請求項45】
請求項1または2記載の方法によって生産された糖タンパク質。
【請求項46】
請求項1または請求項2記載の方法によって生産されたN−グリカン。
【請求項47】
前記N−グリカンが均一であることを特徴とする請求項46記載のN−グリカン。
【請求項48】
(a)配列番号92(図23からのC.elegans);
(b)配列番号92のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
約90%類似;
(c)配列番号93と少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少な
くとも99%または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号92のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列;
(e)配列番号92に少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくと
も99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)ストリンジェントな条件下で配列番号92にハイブリダイズする核酸配列;およ

(g)長さが少なくとも60連続ヌクレオチドである(a)〜(f)のいずれか一つの断
片を含む核酸配列;
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項49】
(a)配列番号93(図23からのラット);
(b)配列番号93のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
95%類似;
(c)配列番号93に少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または
少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号93のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列;
(e)配列番号93に少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または
少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)ストリンジェントな条件下で配列番号93にハイブリダイズする核酸配列:およ

(g)長さが少なくとも60連続ヌクレオチドである(a)〜(f)のいずれか一つの
断片を含む核酸配列;
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項50】
(a)配列番号94からのCiona);
(b)配列番号94のドナーヌクレオシチド結合部位のアミノ酸残基に少なくとも約9
0%類似;
(c)配列番号94に少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少な
くとも99%または少なくとも99.9%同一の核酸配列;
(d)配列番号94のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列;
(e)配列番号94に少なくとも73%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくと
も99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)ストリンジェントな条件下で配列番号94にハイブリダイズする核酸配列;およ

(g)長さが少なくとも60連続ヌクレオチドである(a)〜(f)のいずれか一つの
断片を含む核酸配列;
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項51】
(a)配列番号95(図23からのArabidopsis);
(b)配列番号95のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
約95%類似;
(c)配列番号95に少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%または
少なくとも99.9%同一の核酸配列;
(d)配列番号95のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
配列;
(e)配列番号95に少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または
少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)ストリンジェントな条件下で配列番号95にハイブリダイズする核酸配列;およ

(g)長さが少なくとも60連続ヌクレオチドである(a)〜(f)のいずれか1つの
断片を含む核酸配列;
よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
レオチド。
【請求項52】
配列番号5〜配列番号15の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含むか
、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、コードされたポリ
ペプチドはオリゴ糖のManα1,3および/またはManα1,6グリコシド結合の加
水分解に関与する、修飾されたポリヌクレオチド。
【請求項53】
配列番号49〜配列番号59の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含む
か、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、該コードされた
ポリペプチドは、オリゴ糖のManα1,3グリコシド結合および/またはManα1,
6グリコシド結合の加水分解に関与する、修飾されたヌクレオチド。
【請求項54】
pKD53、pKD1、pKD5、pKD6およびpKD16なる群から選択されたベク
ター。

【図1A】
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【図1B】
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【図2】
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【図3−1】
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【図3−2】
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【図4A】
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【図4B】
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【図4C】
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【図4D】
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【図4E】
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【図4F】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【公開番号】特開2010−220616(P2010−220616A)
【公開日】平成22年10月7日(2010.10.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−104171(P2010−104171)
【出願日】平成22年4月28日(2010.4.28)
【分割の表示】特願2006−503760(P2006−503760)の分割
【原出願日】平成16年2月20日(2004.2.20)
【出願人】(503007287)グライコフィ, インコーポレイテッド (37)
【Fターム(参考)】