両親媒性分子の混合物および融合による細胞膜修飾方法
本発明は、両親媒性分子の混合物およびこれらの分子との膜融合によるｉｎ ｖｉｖｏ細胞修飾方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性分子の混合物およびこれらの分子との融合による細胞膜修飾方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Simbergら（D. Simberg、Weisman S.、Talmon、Y、Barenholz (2004) DOTAP (and Other Cationic Lipids): Chemistry Biophysics, and Transfection。Crit. Reviews in Therap. Drug Carr. Systems、2004、21、257〜317（非特許文献１））の公表から、例えばＤＯＰＥのような他のリン脂質と混合した例えばＤＯＴＡＰのような陽イオン性脂質（S. W. Hui, M. Langner、Y. Zhao、P. Ross、E. Hurley、およびK. Chan (1996) The Role of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer。Biophysical Journal、1996、71、590〜599（非特許文献２））を、細胞中へのＤＮＡ導入（トランスフェクション）のために使用することができることが知られている。これらの粒子が細胞によって取り込まれる方式は、Weijunら（Weijun LiおよびFrancis C. Szoka Jr. 2007。Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery。Pharmaceutical Research、24、438〜449（非特許文献３））から公知のようなエンドサイトーシスである。この方式は、リポソーム中に封入されたＤＮＡの１〜１０％だけが細胞によって取り込まれることから、非常に非効率的であることが明らかとなっている。
【０００３】
例えばトランスフェリンのようなさらなるタンパク質でこの混合物を修飾することは、Sakaguchiら（N. Sakaguchi、Ch. Kojima、A. Harada、K. KoiwaiおよびK. Kono、2008。The correlation between fusion capability and transfection activity in hybrid complexws of lipoplexes and pH-sensitive liposomes。Biomaterials 29、4029〜4036（非特許文献４））から公知である。
【０００４】
融合混合物のさらなる修飾が、担体粒子表面上へのウイルス成分の結合によって行われる。この方法の欠点は、その複合体の製造に用いなければならない労力および費用である。
【０００５】
さらなる融合系は、Gopalakrishnanら（G. Gopalakrishnan、C. Danelon、P. Izewska、M. Prummer、P.-Y. Bolinger、I. Geissbuehler、D. Demurtas、J. Dubochet、およびH. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells。Angew. Chem. Int. Ed. 2006、45、5478〜5483（非特許文献５））から公知である。この著者らは、生きた細胞膜と、ＤＭＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００および量子ナノドットから成る小胞構造との融合を記載している。この方法の欠点は、生物学的に分解不可能な粒子（量子ナノドット）が使用されることである。そのために、さらなる医学的または薬学的使用が除外される。
【０００６】
したがって、技術の現状による方法は、不利に非効率的であるか、または細胞にとっての高いストレスと関係する。追加的にその方法は、各細胞型について最適化されなければならず、そのために労力およびコストが大きい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】D. Simberg、Weisman S.、Talmon、Y、Barenholz (2004) DOTAP (and Other Cationic Lipids): Chemistry Biophysics, and Transfection。Crit. Reviews in Therap. Drug Carr. Systems、2004、21、257〜317
【非特許文献２】S. W. Hui, M. Langner、Y. Zhao、P. Ross、E. Hurley、およびK. Chan (1996) The Role of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer。Biophysical Journal、1996、71、590〜599
【非特許文献３】Weijun LiおよびFrancis C. Szoka Jr. 2007。Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery。Pharmaceutical Research、24、438〜449
【非特許文献４】N. Sakaguchi、Ch. Kojima、A. Harada、K. KoiwaiおよびK. Kono、2008。The correlation between fusion capability and transfection activity in hybrid complexws of lipoplexes and pH-sensitive liposomes。Biomaterials 29、4029〜4036
【非特許文献５】G. Gopalakrishnan、C. Danelon、P. Izewska、M. Prummer、P.-Y. Bolinger、I. Geissbuehler、D. Demurtas、J. Dubochet、およびH. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells。Angew. Chem. Int. Ed. 2006、45、5478〜5483
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明の課題は、細胞膜との効率的な融合をｉｎ ｖｉｖｏでも導く分子混合物を提供することである。さらになお、本発明の課題は、分子混合物との融合による効率的なｉｎ ｖｉｖｏ細胞膜修飾方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、細胞を修飾する際の分子混合物の利用可能性を提示することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
その課題は、請求項１に記載の混合物によって、およびｉｎ ｖｉｖｏ細胞（膜）修飾方法によって、および従属請求項に従ってこのやり方で調製された細胞によって解決される。その方法は、任意の細胞膜と本発明の両親媒性分子の混合物との間の膜融合に基づく。これによって、生物学的または薬学的に関連する分子を融合によって細胞内部および／または細胞膜に組み入れることができ、かつ／またはその表面でそれらに連結することもできる。その混合物は、単一の細胞だけでなく、有利には組織または組織切片にも使用可能である。
【００１０】
融合混合物
両親媒性分子の混合物は、親水性領域に正の総電荷を担持する両親媒性分子種Ａと、親水性および／または疎水性領域に非局在化した電子系を形成する両親媒性分子種Ｂとを有する。
【００１１】
したがって、非局在化した電子系を有する分子種Ｂは、共役二重結合および／または自由電子対（ｆｒｅｉｅ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎｐａａｒｅ）および／または空のｐ軌道によって形成される、本発明の少なくとも１種（または複数種）の環状構造モチーフを含む。これらは、ヒュッケル則に従う。
【００１２】
特に有利には、非局在化した電子系中の分子種Ｂの共有結合性隣接原子は、０．４以上の電気陰性度の差（Δχ）を有する。この法則を満たす分子種Ｂは、融合効率を上げる。
【００１３】
さらになお、分子種Ｂにおいて、非局在化した電子系を形成する基Ｒが疎水性領域または親水性領域に結合していることが有利である。
【００１４】
本発明の一形態において、その混合物は、分子種Ａとして１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００１５】
分子種Ｂは、本発明のさらなる一形態では、非局在化した電子系を有する蛍光色素が結合しているリン脂質によって形成される。しかしながら他の色素、例えばアゾ色素を、リン脂質に結合させることもできる。
【００１６】
分子種Ｂのリン脂質として、混合物中に特に１−ヘキサデカノイル−２−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたは１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンが提供される。
【００１７】
分子種Ｂにおいて非局在化した電子系は、有利には次に挙げるような基Ｒによって形成される：２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）またはＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）またはリサミンローダミンＢスルホニルまたは（５−（クロロスルホニル）−２−（１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ，１５Ｈ，１６Ｈ，１７Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリジノ［１’，９’：６，７，８］クロメノ［２，３−ｆ］キノリン−４−イウム−９−イル）ベンゼンスルホネートまたは７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イルまたはカルボキシフルオレセインまたは１−ピレンスルホニル。
【００１８】
明記された分子種Ｂの基本構成要素、すなわち例えばリン脂質と、前記基Ｒとは、自由に相互に組み合わせ可能であって、すなわち色素のそれぞれがリン脂質に結合することができる。
【００１９】
融合混合物は、既知の融合混合物に比べて広範にわたる利点を有する。その混合物は、全ての（哺乳動物）細胞型で、したがって普遍的に使用可能である。そのうえその混合物は、高効率であって（＞５０％）、融合によって細胞に損傷も発生しない。したがって細胞は、融合後に無制限に分裂可能である。そのうえその混合物は、組織切片にも使用可能である。さらなる利点は、例えば方式３に挙げられたように、特異的分子で細胞膜を官能化することによって達成される。
【００２０】
本発明の混合物にさらなる両親媒性分子種Ｃをヘルパー分子として提供することができる。
【００２１】
これに加えて、特に１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が分子種Ｃとして存在することができる。
【００２２】
分子種Ａ、ＢおよびＣの好ましい比は、約１：０．０５〜０．２：１ｗｔ／ｗｔである。
【００２３】
上記混合物は、最大９９％ｗｔの両親媒性分子種Ａ、４０％ｗｔの両親媒性分子種Ｂ（基Ｒを有する）、および最大７０％ｗｔの両親媒性分子種Ｃを含む。
【００２４】
本発明の方法のために、任意の混合物が有機溶媒に溶解され、十分に均一化される（例えばボルテックス、超音波）。その溶媒は、例えば真空中で除去され、分子種の乾燥混合物を水性緩衝液に溶解させる。この混合物は、冷却すると長期保存可能である。
【００２５】
特に好ましくは分子種Ａ、ＢおよびＣは、脂質として存在する。次にこれらは、水性緩衝液中に入れられるとリポソームを形成する。リポソームが好ましいのは、すぐれた方式でさらなる分子種を細胞膜内および細胞膜に接して配置することができ、リポソームに封入された分子をリポソームと細胞膜との融合の間に細胞内に導入することもできるからである。
【００２６】
したがって、とりわけ好ましくは、その混合物はリポソームとして存在する。特に有利には本発明のリポソームによって、細胞の好ましい修飾へと導くことができるさらなる分子をその中に配置することができるようになる。
【００２７】
しかし、分子種Ａおよび／またはＢおよび／またはＣとして脂質の代わりにポリマーを挙げることも考えられる。
【００２８】
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞修飾のための本発明の方法のために、細胞膜を有する選択された細胞を、好ましくは緩衝化された混合物、場合によってはリポソームと接触させる。接触過程は、有利には融合の間にわずか数分、例えば１〜１２０、好ましくは１０〜３０分間継続する。単一の細胞は、有利には混合物、場合によりリポソームと接触直後にこれと融合する。細胞組織は、状況によっては幾分長い時間、すなわち最大約１２０分間を必要とする。リポソームのエンドサイトーシスは、融合と厳密に区別すべきである。
【００２９】
この方法は、技術の現状に比べてそして短い接触時間で高い割合の、混合物またはリポソームと融合した細胞を示す。そこからの効率は、有利には５０％よりも大きい。
【００３０】
その方法の間に、本発明の混合物に多様なさらなる分子を供給することができる。これに関して本発明の方法は、多面的であって頑健であることが実証される。それに関して、多数の異なる機能的な分子種を個別にまたは同時に混合することができ、それで膜だけではなく細胞の所望の修飾へと導くことができる。ｖｉｖｏ系であることから、細胞は機能的なままである。
【００３１】
例示的に、親水性領域に官能基を有する、特に官能基としてキレート基を有する両親媒性分子種Ｄを、分子種Ａ、Ｂおよび場合によりＣを有する本発明の混合物に供給することができる。その場合、その混合物は、例えば分子種Ａ、Ｂ、Ｄおよび場合によりＣを含む。官能基は、混合物、場合によりリポソームと、細胞の細胞膜との融合の間に細胞膜表面に配置される。
【００３２】
このアプローチを用いて、細胞膜表面を特異的に修飾および官能化することができる。これに対して官能基は、細胞表面から外側に突出し、さらなる化学基によって狙いを定めた修飾が可能である。これは、本発明の特に有利な一形態において、癌治療の成功へと導くことができる。
【００３３】
したがって本発明の一混合物は、この目的のために例えば、分子種Ａとして１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび分子種ＢとしてＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｃとしてトリエチルアンモニウム塩／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｄとして１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を例えば１：０．１：１：０．００２ｗｔ／ｗｔの混合比率で含む。
【００３４】
次に、記載されたさらなる細胞修飾は、６×ヒスチジンリピートに結合した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの添加によって行われる。これは、方式３（下記参照）に挙げられたような癌療法の成功へと導く。
【００３５】
両親媒性分子種Ｅ、特に分子種ＥとしてのバクテリオロドプシンまたはグリコホリンＡまたはインテグリンをその混合物に供給することができ、融合の間に細胞の細胞膜中に配置することができる。
【００３６】
さらになお、予め乾燥された混合物の緩衝化溶液に、非両親媒性の親水性分子種Ｆも供給し、融合の間に細胞内腔に送達することができる。分子種Ｆに関して、特にＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｃａ２＋、ペプチド、タンパク質または薬剤、例えばアセチルサリチル酸が含まれる。
【００３７】
同様に非両親媒性の疎水性分子種Ｇを、同時にその混合物に供給し、融合の間に細胞膜中に配置することができる。これに関して、特にコレステリン、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ、またはコルチゾンのような薬剤が含まれる。
【００３８】
全ての分子種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、場合によりＧは、有機溶媒に溶解し、均一化することができる。それを続いて乾燥させ、水性緩衝液に溶解させ、保存することができる。水性緩衝溶液に溶解させる際に、前記分子種Ｅおよび／Ｆを混合することができる。その際に分子種の性質に応じて、有利には分子種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇからリポソームを形成させることができる。
【００３９】
以下の分子は、膜との融合により細胞膜を修飾するための融合混合物の製造に使用することができる。後に続く列挙は網羅的でも限定的でもない。
【００４０】
分子種Ａの実施例：
分子Ａの基準は、（ａ）その分子が少なくとも一つまたは複数の正電荷を有する親水性領域を有することによって、その分子の親水性部分の合計電荷が正であることである。この分子の課題は、負荷電した細胞膜近辺に静電力によって上記融合混合物をもたらすことである。（ｂ）加えて疎水性領域は、好ましくは二重結合を有するかまたは有さないＣ１０〜Ｃ３０−部分を有する。有利には、二重結合によって、生成したリポソームの膜が弾性になり、それによってリポソームと細胞膜との融合が容易になる。（ｃ）本発明の混合物中の分子種Ａの割合は、最大９９ｗｔ／ｗｔ％でありうる。
【００４１】
例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、または（１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）のような分子が適切である。
【００４２】
第一の例として、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩））が挙げられる。
【００４３】
【化１】
【００４４】
分子種Ｂの実施例：
本発明の融合誘導性分子としての両親媒性分子種Ｂの基準は、以下の通りである。（ａ）それは、電荷を有するかまたは好ましくは電荷を有さない親水性領域を有さなければならない。（ｂ）そしてそれは、二重結合を有するかまたは有さない疎水性領域、好ましくはＣ１０〜Ｃ３０−部分を有さなければならない。二重結合の機能については種Ａを参照されたい。（ｃ）その分子は、疎水性および／または親水性領域のいずれかに、非局在化した電子系を有する基（Ｒ）を有する。それによって、共役二重結合および／または自由電子対および／または空のｐ軌道からの環状構造モチーフが意図される。
【００４５】
基Ｒにおいて、共有結合した隣接原子の間の電気陰性度の差が大きいことが特に好ましい。これは、特に有利には少なくとも０．４（Δχ≧０．４）でありうる。これは、高められた分極率に役立ち、融合にプラスの影響を及ぼす。（ｄ）混合物中の融合誘導性分子種Ｂの割合は、最大４０ｗｔ／ｗｔ％に調整することができる。
【００４６】
後に続く表に、種Ｂの分子について関連する基Ｒをいくつか要約する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
分子種Ｂの第１の例（β−ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２−ＨＰＣ）：
２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）はβ−ＢＯＤＩＰＹであり、基Ｒを意味する。この基Ｒが、１−ヘキサデカノイル−２−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１２−ＨＰＣ）に結合している。両者は一緒になって次の構造式を与える：
【００４９】
【化２】
【００５０】
分子種Ｂの第２の例（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＤＨＰＥ）：
Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）はＢＯＤＩＰＹ−ＦＬである。この基Ｒが、ＤＨＰＥ（１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩））に結合している。両者は一緒になって次の構造式を与える：
【００５１】
【化３】
【００５２】
分子種Ｂの第３の例（「ＤｉＯ」）：
ＤｉＯＣ１８（３）３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩。この分子は、最初の２つの分子Ｂのように脂質と結合した色素ではなく、それ自体次の構造式で示される両親媒性の分子である：
【００５３】
【化４】
【００５４】
分子種Ｂの第４の例（ＬＲ−ＤＯＰＥ）：
リサミンローダミンＢスルホニルが基Ｒである。これは、両親媒性分子としての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）に結合している。両者は次の構造式を与える：
【００５５】
【化５】
【００５６】
分子種Ｂの第５の実施例（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）−ＤＨＰＥ）：
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、（５−（クロロスルホニル）−２−（１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ，１５Ｈ，１６Ｈ，１７Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリジノ［１’，９’：６，７，８］クロメノ［２，３−ｆ］キノリン−４−イウム−９−イル）ベンゼンスルホネート、つまり基Ｒである。これが、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合しており、一緒になって次の構造式を与える：
【００５７】
【化６】
【００５８】
分子種Ｂの第６の例（ＮＢＤ−ＤＯＰＥ）：
ＮＢＤは、（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）、つまり基Ｒである。これが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式となる：
【００５９】
【化７】
【００６０】
分子種Ｂへの第７の例（フルオレセイン−ＤＯＰＥ）：
カルボキシフルオレセインが基Ｒであって、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式となる：
【００６１】
【化８】
【００６２】
分子種Ｂへの第８の例（ピレン−ＤＯＰＥ）
１−ピレンスルホニルが基Ｒであって、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式となる：
【００６３】
【化９】
【００６４】
分子種Ｂの第９の例（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＣ）：
ピレンデカノイルが基Ｒであって、１−ヘキサデカノイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンに結合して次の構造式となる：
【００６５】
【化１０】
【００６６】
全ての基Ｒは、本発明の意味において非局在化電子構造を有する。分子種Ｂ中の基Ｒは、非局在化のためにしばしば色素として存在する。
【００６７】
前記基Ｒは、それ自体、両親媒性分子の疎水性部分および非局在化二重結合によって形成されることが考えられる。
【００６８】
表１から追加的にわかるように、直接隣接した原子の、その電気陰性度に関する差が大きいほど、融合の質は良好である。
【００６９】
それに反して次の分子、例えばｃａｐＢｉｏ−ＤＯＰＥ（キャップビオチニルである基Ｒが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して、次の構造式となったもの）
【００７０】
【化１１】
などは機能しない。
【００７１】
ＰＩ、すなわちＬ−α−ホスファチジルイノシトール（ナトリウム塩）
【００７２】
【化１２】
およびメトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００である基Ｒが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式（ＰＥＧ２０００−ＤＯＰＥ）となったもの
【００７３】
【化１３】
も同様に機能しない。
【００７４】
直前の３種の分子には電子構造の非局在化が欠けている。これは、本発明の混合物がこれを有さなければならないことを示している。
【００７５】
記載されたように、正電荷に関する分子種Ａの有利な性質および非局在化した電子系もしくは電気陰性度の差に関する分子種Ｂの有利な性質を、化学合成分子に統合することも考えられる。したがって、これまでは本発明者らに知られていなかった当該分子も、同じく本発明の対象であるはずである。
【００７６】
前記混合物の場合によるさらに有利な形態は、融合混合物の製造または細胞膜修飾のために以下のさらなる分子が可能である。
【００７７】
ヘルパー分子としての分子種Ｃの実施例
ヘルパー分子／担体分子Ｃの基準は：（ａ）その分子が、親水性領域および（ｂ）二重結合を有するかまたは有さない疎水性領域（特にＣ１０〜Ｃ３０）を有さなければならないことである。二重結合の機能のために、種Ａおよび／または種Ｂを参照されたい。（ｃ）大きな荷電密度および分子種Ａの正荷電分子の間の斥力を中和するために、両方の領域は、中性を有するべきである。この効果は、系の安定化へと導く。（ｄ）担体分子の割合は、最大７０％ｗｔ／ｗｔに調整することができる。
【００７８】
例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジエライドイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジフィタノールｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）のような分子が、適切である。
【００７９】
第１の例として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。
【００８０】
【化１４】
【００８１】
有利には、分子種Ａ、ＢおよびＣを脂質またはポリマーとして形成させることが可能である。両親媒性脂質の場合、すぐに使用可能な混合物を製造するときにリポソームを生成させる。
【００８２】
分子種Ａ、ＢおよびＣの間の重量混合比（ｗｔ／ｗｔ）は、有利には１：０．０５〜０．２：１である。
【００８３】
分子種Ｄ（官能基を有する両親媒性）
両親媒性分子種Ｄの基準は、以下の通りである：（ａ）その分子は、親水性領域および（ｂ）二重結合を有するかまたは有さない疎水性領域（特にＣ１０〜Ｃ３０を有する）を有さなければならない。二重結合の機能については種Ａ、Ｂ、またはＣを参照されたい。（ｃ）その分子は、融合後に細胞表面へのさらなる化学結合を可能にする官能基を親水性領域に有さなければならない。
【００８４】
例えば長鎖脂肪酸およびアルコール、キレート錯体修飾脂質、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）、ビオチン修飾脂質（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップ−ビオチン）、もしくはＰＥＧ修飾脂質（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）のような分子または薬剤も適切である。
【００８５】
これについての第一の実施例は、官能基としての（イミノ二酢酸）スクシニル（ニッケル塩）であり、ここではキレート基の形態で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−５−アミノ−１−カルボキシペンチルに結合している。これは、次の構造式を与える：
【００８６】
【化１５】
【００８７】
分子種Ｅ（両親媒性）：
さらになお、分子種Ｅの基準は、以下の通りである：（ａ）それは両親媒性である。（ｂ）これは、例えばバクテリオロドプシン、インテグリン、グリコホリンＡおよび他多数のような膜タンパク質、ペプチド、表面レセプターでありうる。（ｃ）分子種Ｅは、その他の成分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄのように人工的に合成することもできるし、また細胞から得ることもできる。（ｄ）例えば蛍光または放射性標識のようなこれらの分子の修飾が利用可能である。（ｅ）分子種Ｅは、混合物に最大２０％ｗｔ／ｗｔまで添加することができる。
【００８８】
両親媒性分子種Ｅは、種Ａ〜Ｄとして脂質を利用する際にリポソーム膜中に組み入れられる。非両親媒性分子種Ｅは、種Ａ〜Ｄとして脂質を利用する際にリポソーム膜上に結合して組み入れられる。
【００８９】
分子種Ｆ（水溶性または親水性）：
分子種Ｆの基準は次の通りである：（ａ）その分子は、水溶性であるべきである。以下の例が与えられる：イオン、ペプチド、タンパク質、薬剤、ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【００９０】
分子種Ｆは、分子種として脂質を利用する際にリポソームの内腔中に組み入れられる。
【００９１】
分子種Ｇ（非水溶性または疎水性）：
分子種Ｇへの基準は次の通りである：（ａ）その分子は疎水性の性質を有し、有機溶媒に溶解性良好である。以下の例が与えられる：コレステロール、ビタミンＢ。分子種Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと一緒にこれらを有機溶媒中で混合する。
【００９２】
融合方法
分子種ＡおよびＢを有する本発明の混合物の成分は、場合により、それに混合されたさらなる分子Ｃ、場合によりＤおよび場合によりＧと一緒に、所望の重量比で同時に、有機溶媒、好ましくはクロロホルム、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサン、ヘプタンまたはこれらの混合物中に入れられる。有機溶媒中に均一化した後で、有機溶媒は除去すべきである。
【００９３】
乾燥された混合物は、好ましくはｐＨ値７程度の水性緩衝液に入れられ、再び均一化される。次に、有利には添加された分子種を含むリポソームが形成される。そのうえ、分子種ＥおよびＦの分子を同様に混合することができる。この形態でその混合物は、例えば４℃で少なくとも１ヶ月間保存可能である。このステップは本発明の方法の調製のために役立つ。
【００９４】
本来の方法は、融合混合物を細胞培地で例えば１：１００（混合物：細胞培地ｖ／ｖ）に希釈し、再度均一化して、細胞上に与えることを備える。
【００９５】
生きた細胞への本発明の融合混合物の添加によって、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで融合が生じる。これに関して、細胞を約１〜６０分間、組織試料の場合は例えば６０〜１２０分間その混合物と接触させることで十分である。次に、細胞の洗浄ステップを挿入すべきであろう。
【００９６】
その方法は、有利には少なくとも５０％、好ましくは７０％超、特に９０％超という特に高い融合効率によって特徴づけられる。
【００９７】
膜融合は、特に有利には単一の細胞型に限定されるのではなく、表２に表示するようにほぼ普遍的なメカニズムを意味する。その上、密な組織試料は、延長したインキュベーション時間によってうまく処理することができる。それゆえにその方法は、特に有利に非常に多方面に使用可能である。
【００９８】
本発明の混合物と細胞膜との融合の際に、分子種Ｆの形態の小胞内容物（ｖｅｓｉｋｕｌａｅｒｅｎ Ｖｏｌｕｍｉｎａ）が細胞内に導入されることから、これは、有利には細胞の細胞質への可溶性分子、イオン、タンパク質またはＤＮＡの導入に役立てることができる。したがって分子種Ｆは、本来の意味で両親媒性分子種の混合物の成分ではない。
【００９９】
融合プロセスの間に、生物学的または薬学的に関連する分子種Ｄ、ＥまたはＧを無傷（ｉｎｔａｋｔｅ）細胞膜に取り込むことができる。細胞膜に導入された分子種Ｄの反応基は、例えばカップリング反応のために使用することができる。ペプチドまたはタンパク質のような種Ｅの追加的な膜固有の分子を細胞膜中に組み入れることができる。
【０１００】
本発明の混合物および本発明の方法は、基礎研究の多分野の分析を実施するための方式、例えば無傷細胞膜中に組み込まれた分子の拡散分析、文献中で脂質ラフトとしても公知の脂質のマイクロドメインおよびナノドメインの特徴づけ、または細胞における膜分子の調節および輸送経路の研究を可能にする。
【０１０１】
同時にその系は、例えば医学的に高度に関連する、特定の細胞型に狙いを定めた標識のために、例えば癌細胞の標識のために、細胞遊走の誘導を用いた創傷閉鎖の支援のために、細胞−細胞接触の形成、細胞突起または増殖誘導または細胞−細胞融合の形成のために利用することができる。
【０１０２】
したがって、分子種Ａ、Ｂ、（Ｃ）、ＤとＴＮＦαとの特定の本発明の両親媒性混合物は、医薬として、ならびにそれと同時に癌細胞の標識および治療の際に使用することができる。
【０１０３】
細胞膜修飾のためのいくつかの方法の概要を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
表２に関する略語：
手法１：細胞膜の染色；手法２：細胞表面の修飾；手法３：細胞内腔の修飾；手法４：細胞膜中のタンパク質の再構成
【０１０６】
分子種Ｃに関して：ＤＯＰＥ＝１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
【０１０７】
分子種Ａに関して：ＤＯＴＡＰ＝１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−（トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）
【０１０８】
分子種Ｂに関して：
β−ＢＯＤＩＰＹ Ｃ１２−ＨＰＣ：２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
β−ピレン Ｃ１０−ＨＰＣ：１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＤＨＰＥ：Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、（トリエチルアンモニウム塩）
ＤｉＯ：ＤｉＯＣ１８（３）３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩
フルオレセイン−ＤＨＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（カルボキシフルオレセイン）（アンモニウム塩）
ＬＲ−ＤＨＰＥ：リサミンローダミンＢ １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、（トリエチルアンモニウム塩）
ＬＲ−ＤＯＰＥ：リサミンローダミンＢ １，２−ジオレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、（トリエチルアンモニウム塩）
ＮＢＤ−ＤＯＰＥ：Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジオレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）
ピレン−ＤＯＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（１−ピレンスルホニル）（アンモニウム塩）
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）
【０１０９】
分子種Ｄ〜Ｇに関して：
ＢＲ−ＴＲＩＴＣ：分子種Ｅとしての、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマー混合物でラベルされたハロバクテリウム・サリナラム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）由来バクテリオロドプシン。
ＤＯＧＳ−ＮＴＡ：分子種Ｄとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）。
ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ：分子種Ｄとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップ−ビオチン。
Ｂ ＦＬ−ＳＭ：分子種ＤとしてのＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン
ＧＰＡ−ＴＲＩＴＣ：分子種Ｅとしての、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマー混合物でラベルされたグリコホリンＡ（ＭＮＳ血液型）。
ＰＩ：分子種ＥとしてのＬ−α−ホスファチジル−イノシトール（ナトリウム塩）。
分子種ＦとしてのＣａＣｌ２ｘＨ２Ｏ。
【０１１０】
細胞型および細胞系：
ＢＳＭＣ：気管支平滑筋細胞
ＥＳＭＣ：胎児平滑筋細胞
ＨＥＫ：ヒト胎児腎、ＨＥＫ２９３
ｈ．線維芽細胞：ヒト線維芽細胞
角化細胞：ヒト角化細胞
マクロファージ：ヒトマクロファージ
筋線維芽細胞：ラット心臓線維芽細胞
ニューロン：ラット胎仔皮質ニューロン
Ｒ３７：乳癌細胞系
心膜：ラット胎仔心嚢（ｈｅａｒｔ ｂａｇ）
【０１１１】
表２に関するその他：
ＴＮＦ：ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ：腫瘍壊死因子が６×ヒスチジンリピートと連結したもの
【０１１２】
以下に実施例および添付の図面に基づいて本発明を詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】融合試薬の三つの使用可能性の概略を示す図である。
【図２】表２の第１１行に対応する図である。Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ中で予備インキュベーションされたＨＥＫ２９３細胞に、１ｍＭ ＣａＣｌ２（分子種Ｆ）溶液を充填された融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／ＬＲ−ＤＨＰＥ（分子種Ｂ）＝１／１／０．１ｗｔ／ｗｔ）を添加した後の顕微鏡写真である。緑色Ｃａ２＋指示薬（Ｆｌｕｏ−４チャネル）が細胞内部において高いＣａ２＋濃度（分子種Ｆ）を示す一方で、赤色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（ＬｉｓｓＲｈｏｄチャネル）は細胞膜中に組み入れられた。（スケールバー＝２０μｍ）。
【図３】表２の第２５行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／β−Ｂｏｄｉｐｙ−Ｃ１２ＨＰＣ（分子種Ｂ）／ＢＲ−ＴＲＩＴＣ（分子種Ｅ）＝１／１／０．１／０．０００５ｗｔ／ｗｔ）を添加してから１０分後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。緑色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（β−Ｂｏｄｉｐｙチャネル）および赤色で標識されたチャネルタンパク質（分子種Ｅ）（ＴＲＩＴＣチャネル）が細胞膜中に組み入れられた。（スケールバー＝２０μｍ）
【図４】表２の第２５行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／β−Ｂｏｄｉｐｙ−Ｃ１２ＨＰＣ（分子種Ｂ）／ＢＲ−ＴＲＩＴＣ（分子種Ｅ）＝１／１／０．１／０．０００５ｗｔ／ｗｔ）の洗浄から４時間後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。緑色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（β−Ｂｏｄｉｐｙチャネル）および赤色で標識されたチャネルタンパク質（分子種Ｅ）（ＴＲＩＴＣチャネル）が細胞膜中に組み入れられた。時間に依存した２種類の色素の分離は、細胞膜から細胞内部への膜脂質およびタンパク質の異なる輸送経過を推論させる。（スケールバー＝２０μｍ）。
【図５】表２の第１６行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ（分子種Ｂ）／ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）＝１／１／０．１／０．００２ｗｔ／ｗｔ）の添加から１０分後のＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡写真である。（スケールバー＝５０μｍ）
【図６】表２の第１６行に対応する図である。細胞膜に組み入れられたＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）を有する、ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ処理されたＨＥＫ２９３細胞およびマクロファージの顕微鏡写真、ならびにＢ：細胞膜にＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）を有さない、ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ処理されたＨＥＫ２９３細胞およびマクロファージの顕微鏡写真を示す図である。（スケールバー＝５０μｍ）
【図７】表２の第２３行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＤＨＰＣＣ（分子種Ｂ）／ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ（分子種Ｄ）＝１／１／０．１／０．０１ｗｔ／ｗｔ）を洗浄後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。赤色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄチャネル）および緑色で標識された表面タンパク質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８チャネル）は、リン脂質と、細胞表面に結合したタンパク質との明白な共局在を示す。（スケールバー＝５０μｍ）
【図８】表２の第２４行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＤＨＰＣＣ（分子種Ｂ）／Ｂ ＦＬ−ＳＭ（分子種Ｄ）＝１／１／０．１／０．０１ｗｔ／ｗｔ）を洗浄後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。この写真は、リン脂質（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄチャネル）およびスフィンゴ脂質（ＢＦＬチャネル）の組み入れの成功を示す。（スケールバー＝２０μｍ）
【図９】表２の第４７行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／ＢｏｄｉｐｙＦＬ−ＤＨＰＥ（分子種Ｂ）＝１／１／０．１ｗｔ／ｗｔ）で１時間処理後のラット胚（１９日）からの初代心膜組織（心嚢）の顕微鏡写真である。写真から、分子種Ａ〜Ｃの融合混合物が組織中に深さ約３〜４細胞層まで入り込み、膜融合が誘導されたことが明らかに見てとれる。（スケールバー＝７０μｍ）
【実施例】
【０１１４】
図１は、細胞膜修飾の三つの本発明の方式を示す。各方式は、さらなる実施例で実施される。
【０１１５】
図１の方式１：種Ａ〜Ｃの混合物および細胞内腔への種ＦとしてのＣａ２＋イオンの導入による細胞膜修飾
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）（ＤＳＭＺ、ドイツ）細胞を、細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたりＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中に細胞３００００個の細胞密度で１μｇ／ｍｌのＦｌｕｏ−４ ＡＭ−Ｃａ２＋−指示薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベーションした。インキュベーション後に細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄させ、本発明の融合混合物と共に３０分間インキュベーションした。
【０１１６】
本発明の融合混合物は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ）、リサミンローダミンＢ １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＬＲ−ＤＨＰＥ：基Ｒを有する分子種Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の重量比ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／ＬＲ−ＤＨＰＥ（１／１／０．１ｗｔ／ｗｔ）の脂質混合物から成る。
【０１１７】
脂質成分をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間室温で乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）および１ｍＭ ＣａＣｌ２の緩衝溶液中に分子種Ｆ（ＶＷＲ）として２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液の終濃度となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間室温で均一化した。
【０１１８】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、冷蔵庫内で４℃で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１１９】
５μｌのこの融合混合物をＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈し、超音波を用いて再度５〜１０分間均一化してから、Ｃａ２＋−指示薬Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベーションされたＨＥＫ２９３細胞を有する細胞培養シャーレに添加する。
【０１２０】
その細胞を、本発明の融合方法で本発明の混合物と共に３７℃および５％ＣＯ２で１０〜３０分間インキュベーションする。その後細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した（図２）。
【０１２１】
分子種Ｂの赤色蛍光脂質分子は、膜融合の成功後にＨＥＫ２９３細胞の細胞膜中に組み入れられている。これによって、細胞膜を蛍光顕微鏡下でよく見分けることができる（図２ ＬｉｓｓＲｈｏｄチャネル参照）。
【０１２２】
膜融合後に細胞容積中で高められたＣａ２＋濃度によって引き起こされた、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ４ ＡＭの強い緑色蛍光強度は、小胞内腔の細胞内部への送達およびそれによる分子種Ｆの送達の証拠も提供する（図２ Ｆｌｕｏ−４チャネル）。
【０１２３】
写真およびそれに基づくカウントにより、８０％を超える融合効率、すなわち全細胞の８０％超が本発明の混合物／リポソームと融合したことが示される。
【０１２４】
対照としてＨＥＫ２９３細胞を同様に処理したが、ただし、小胞内腔に１ｍＭ ＣａＣｌ２緩衝液の代わりに２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを充填した。この場合、Ｃａ２＋指示薬は明らかに、より低い細胞内Ｃａ２＋濃度を示した（表示せず）。
【０１２５】
図１の方式２：種Ａ〜Ｃの混合物および細胞膜中へのバクテリオロドプシン（分子種Ｅ）の導入による細胞膜修飾：
心臓線維芽細胞をラット胎仔心臓（１９日）から単離し、Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり２００００個の細胞密度で３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。６日間かけて心臓線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、以下の本発明の方法に使用した。
【０１２６】
筋線維芽細胞を、１／１／０．１の重量比で終濃度２０μｇ脂質／ｍｌ培地の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）および２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ Ｃ１２−ＨＰＣ：分子種Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）製）、ならびに蛍光標識されたチャネルタンパク質（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓａｌｉｎａｒｕｍ由来バクテリオロドプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）−テトラメチルローダミンイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））（ＢＲ−ＴＲＩＴＣ：分子種Ｅ）０．４ｎｇ／ｍｌ）の融合混合物中でインキュベーションした。
【０１２７】
本発明の混合物を次の方法で調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｃ）をクロロホルム（ＶＷＲ）中で均一に混合した。混合後にその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸（ＶＷＲ））緩衝溶液中に終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。全てのステップを室温で実施した。したがって、この混合物はリポソームとして存在する。
【０１２８】
５μｌのこの融合混合物を０．７μｌのＢＲ−ＴＲＩＴＣ溶液（分子種Ｅ）（０．０６ｍｇ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ）と共に６０分間インキュベーションし、その際に慎重に撹拌した。チャネルタンパク質Ｅは、リポソームの脂質二重膜に入れられる。
【０１２９】
その溶液をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、再度超音波（８０〜１００Ｗ）で１〜２分間処理してから筋線維芽細胞を有する細胞培養シャーレに加えた。
【０１３０】
本発明により細胞を融合混合物と共に１０〜２０分間インキュベーションし、次にＦ１０ Ｈａｍ培地で洗浄し、分析した。
【０１３１】
洗浄後に細胞の細胞原形質膜の約８０〜１００％を蛍光顕微鏡（脂質について緑色、タンパク質について赤色）（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検出することができたが、このことは脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）だけでなくタンパク質分子（分子種Ｅ）の膜組み入れの成功も示している（図３および図４）。
【０１３２】
図１の方式３：種Ａ〜Ｄの混合物による細胞膜表面上へのタンパク質結合のための細胞膜修飾、新規な腫瘍治療およびそのための医薬の特徴
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり細胞４００００個の細胞密度のヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）（ＤＳＭＺ、ドイツ）細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、約９０％の集密度で後続のステップに使用した。ＨＥＫ２９３細胞を１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）、（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ：分子種 Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）（ＤＯＧＳ−ＮＴＡ：分子種Ｄ Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を含むＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ／ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（１／１／０．１／０．００２ｗｔ／ｗｔ）の重量比の融合混合物中で２０μｇ脂質／ｍｌ ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の終濃度で３７℃および５％ ＣＯ２で１０〜２０分間直接インキュベーションした。
【０１３３】
融合混合物を次の方法で調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｄ）をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中に均一に混合した。続いて、その溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）の緩衝溶液中に終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。
【０１３４】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、４℃の冷蔵庫内で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１３５】
５μｌのこの融合混合物をＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて再度５〜１０分間均一化してからＨＥＫ２９３細胞を有する細胞培養シャーレに加えた。全ての調製ステップを室温で実施した。
【０１３６】
続いて細胞をＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した。
【０１３７】
図５にそのような検査を示すが、この図は、８０％を超える融合効率を示す。この効率は、顕微鏡写真の助けを借りて計数によって確認した。
【０１３８】
分子種Ｄとして使用されたＤＯＧＳ−ＮＴＡの反応性頭基と反応パートナーとの間の結合を可能にするために、濃度１〜５ｎｇ／ｍｌの、６×ヒスチジン−リピートに結合した腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ）（ＰｒｏＳｐｅｃ、レホボート、イスラエル）のＲＰＭＩ培地溶液中で細胞を約２０分間３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。
【０１３９】
残留タンパク質は、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄するプロセスによって懸濁液から除去した。ＴＮＦαは、体内でマクロファージ活性化因子として役立ち、免疫系に関する癌細胞の認識および排除における主因子である。系の機能性を検査するために、分化したマクロファージを使用した。ヒト単球は、血液からＬｅｕｋｏｓｅｐｔｓｙｓｔｅｍ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、クレムスミュンスター、ＡＵ）およびＢｉｏｃｏｌｌ分離媒質（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ケンブリッジ、ＵＫ）を用いて得た。形成した間期から１０００ｇで１０分間遠心分離後に単球を回収し、後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）で洗浄した。単球をＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に入れ、３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。２日後に０．１ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＦ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）をその単球に与えた。さらなる３日後に単球から不活性なマクロファージに分化した。
【０１４０】
続いて、そのように得られたマクロファージを、ＨＥＫ２９３細胞層に蒔いたが、その細胞は、融合およびそれに続くＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグとのインキュベーションによりマクロファージのための認識シグナルを担持していることになった。認識されると、マクロファージにおける細胞性免疫応答が誘導され、ＨＥＫ２９３細胞が溶解されることになった。対照としてＨＥＫ細胞を同様に処理したが、ただし、反応性頭基を有する分子種Ｄの両親媒性分子（ＤＯＧＳ−ＮＴＡ）を融合アプローチから省略した。両方のアプローチで２４時間インキュベーションし、続いて光学顕微鏡で分析した（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）。図６に、融合アプローチにおいてＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）と共にインキュベーションされたＨＥＫ２９３細胞上でのみ、細胞が認識され、溶解されたこと（プラーク形成）を示す。この例は、膜融合を用いて目的の細胞型が標識され、一例として免疫系に関して可視化することができることを示す。
【０１４１】
ビオチン−アビジン／ストレプトアビジンの結合により細胞膜表面上にタンパク質を結合させるための種Ａ〜Ｄの混合物による細胞膜修飾のさらなる実施例：
心臓線維芽細胞をラット胎仔心臓（１９日）から単離し、Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり２００００個の細胞密度で、３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。６日間かけて心臓線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、以下の本発明の方法に使用した。
【０１４２】
筋線維芽細胞を、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ：分子種Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップ−ビオチン（ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ：分子種Ｄ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を、ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ／ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ（１／１／０．１／０．１ｗｔ／ｗｔ）の重量比で含む、終濃度２０μｇ脂質／ｍｌ Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の融合混合物中で、３７℃および５％ ＣＯ２で１０〜２０分間直接インキュベーションした。
【０１４３】
融合混合物は次のように調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｄ）をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）の緩衝溶液中で終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。
【０１４４】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、冷蔵庫内で４℃で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１４５】
５μｌのこの融合混合物をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて再度５〜１０分間均一化してから筋線維芽細胞を有する細胞培養シャーレに添加した。全ての調製ステップは室温で実施した。
【０１４６】
続いて細胞をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した。
【０１４７】
図７にそのような検査を示すが、この図は、８０％を超える融合効率を示す。この効率は、顕微鏡写真の助けを借りて計数によって確認した。
【０１４８】
分子種Ｄとして使用されたｃａｐＢｉｏＤＯＰＥの反応性頭基と反応パートナーとの間の結合を可能にするために、１００／１のｍｏｌ／ｍｏｌ％のストレプトアビジン／ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ４８８（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ製）を総タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ Ｈａｍ培地となるように溶かした溶液中で細胞を３７℃および５％ ＣＯ２で約２０分間インキュベーションした。
【０１４９】
残留タンパク質は、Ｆ１０ Ｈａｍ培地で３回洗浄するプロセスによって懸濁液から除去した。
【０１５０】
図７にリン脂質（赤色）および細胞表面結合タンパク質（緑色）の明白な共局在を示す。
【０１５１】
細胞膜組成を修飾するための種Ａ〜Ｄの混合物による細胞膜修飾のさらなる実施例：
心臓線維芽細胞をラット胎仔心臓（１９日）から単離し、Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり２００００個の細胞密度で、３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。６日間かけて心臓線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、以下の本発明の方法に使用した。
【０１５２】
筋線維芽細胞を、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ：分子種Ｂ）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン（Ｂ ＦＬ−ＳＭ：分子種Ｄ）（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ製）をＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ／ＢＦＬ−ＳＭ（１／１／０．１／０．０１ｗｔ／ｗｔ）の重量比で含む、終濃度２０μｇ脂質／ｍｌ Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の融合混合物中で、３７℃および５％ ＣＯ２で１０分間直接インキュベーションした。
【０１５３】
融合混合物は次のように調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｄ）をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）の緩衝溶液中で終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。
【０１５４】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、冷蔵庫内で４℃で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１５５】
５μｌのこの融合混合物をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて再度５〜１０分間均一化してから筋線維芽細胞を有する細胞培養シャーレに添加した。全ての調製ステップは室温で実施した。
【０１５６】
続いて細胞をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した。
【０１５７】
図８に実施例ならびに筋線維芽細胞の原形質膜へのリン脂質分子（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ）およびスフィンゴ脂質（ＢＦＬ−ＳＭ）の組み入れの範囲内でそのような検査を示す。
【０１５８】
方式４：組織試料への種Ａ〜Ｃの混合物による細胞膜修飾
融合混合物を用いて個別の哺乳類細胞だけでなく、組織および組織切片中の細胞もまた融合させることができる（図９参照）。ラット胎仔（１９日）から初代心膜組織（心嚢）を単離し、３．５ｃｍ細胞培養シャーレ上のＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）、（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ：分子種Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）の重量比１／１／０．１ｗｔ／ｗｔの融合混合物と共に３７℃および５％ ＣＯ２で１時間インキュベーションした。（分子種ＣおよびＢはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製；分子種Ｂは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡから購入した）。融合混合物は、以下のように調製した。
【０１５９】
脂質成分（分子種Ａ〜Ｃ）は、まずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）の緩衝溶液中に終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。この混合物も、リポソームとして４℃で保存可能である。
【０１６０】
５μｌのこの融合混合物をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、再度超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて５〜１０分間均一化してから組織試料に添加した。全ての調製ステップを室温で実施した。
【０１６１】
続いて、融合された組織を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で分析した。図９に、外部組織層の細胞だけでなく、より深部の細胞レベルの細胞もうまく融合または染色したことを示す。結合組織の細胞由来の約３〜４細胞層をはっきりと認識することができる。場合により、これによる遺伝子療法、癌治療および創傷治癒での使用が考えられる。
【０１６２】
さらなる実施例を挙げることができる。これを表２に示す。その混合物の製造方法は、本明細書に示された四つの例のプロトコールから引用される。細胞膜の融合は上に挙げられた方法に従う。本発明の意味で、実施例における全ての工程ステップを非限定的な性質と見なすことができる。特に融合混合物およびその使用は、広く解釈するべきである。これは、新しい混合物および実施に成功するように、実施例に示された方法および融合混合物を相互に組み合わせることができることを意味する。
【０１６３】
この詳細に述べられた四つの方式は、リポソームから始まる。それは、クロロホルムを添加することおよび緩衝液中に入れることの後に、両親媒性成分がリポソームに変型するからである。
【０１６４】
本特許出願において、本特許出願に添付されるカラー図１〜９が引用される。これらの図の白黒での描写は、開示の規定に基づいて本特許出願に図１０〜１８として添付される。その際に図１０は内容的に図１に対応する。図１１は図２に対応する。図１２は図３に対応する。図１３は図４に対応する。図１４は図５に対応する。図１５は図６に対応する。図１６は図７に対応する。図１７は図８に対応する。図１８は図９に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性分子の混合物およびこれらの分子との融合による細胞膜修飾方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Simbergら（D. Simberg、Weisman S.、Talmon、Y、Barenholz (2004) DOTAP (and Other Cationic Lipids): Chemistry Biophysics, and Transfection。Crit. Reviews in Therap. Drug Carr. Systems、2004、21、257〜317（非特許文献１））の公表から、例えばＤＯＰＥのような他のリン脂質と混合した例えばＤＯＴＡＰのような陽イオン性脂質（S. W. Hui, M. Langner、Y. Zhao、P. Ross、E. Hurley、およびK. Chan (1996) The Role of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer。Biophysical Journal、1996、71、590〜599（非特許文献２））を、細胞中へのＤＮＡ導入（トランスフェクション）のために使用することができることが知られている。これらの粒子が細胞によって取り込まれる方式は、Weijunら（Weijun LiおよびFrancis C. Szoka Jr. 2007。Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery。Pharmaceutical Research、24、438〜449（非特許文献３））から公知のようなエンドサイトーシスである。この方式は、リポソーム中に封入されたＤＮＡの１〜１０％だけが細胞によって取り込まれることから、非常に非効率的であることが明らかとなっている。
【０００３】
例えばトランスフェリンのようなさらなるタンパク質でこの混合物を修飾することは、Sakaguchiら（N. Sakaguchi、Ch. Kojima、A. Harada、K. KoiwaiおよびK. Kono、2008。The correlation between fusion capability and transfection activity in hybrid complexws of lipoplexes and pH-sensitive liposomes。Biomaterials 29、4029〜4036（非特許文献４））から公知である。
【０００４】
融合混合物のさらなる修飾が、担体粒子表面上へのウイルス成分の結合によって行われる。この方法の欠点は、その複合体の製造に用いなければならない労力および費用である。
【０００５】
さらなる融合系は、Gopalakrishnanら（G. Gopalakrishnan、C. Danelon、P. Izewska、M. Prummer、P.-Y. Bolinger、I. Geissbuehler、D. Demurtas、J. Dubochet、およびH. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells。Angew. Chem. Int. Ed. 2006、45、5478〜5483（非特許文献５））から公知である。この著者らは、生きた細胞膜と、ＤＭＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００および量子ナノドットから成る小胞構造との融合を記載している。この方法の欠点は、生物学的に分解不可能な粒子（量子ナノドット）が使用されることである。そのために、さらなる医学的または薬学的使用が除外される。
【０００６】
したがって、技術の現状による方法は、不利に非効率的であるか、または細胞にとっての高いストレスと関係する。追加的にその方法は、各細胞型について最適化されなければならず、そのために労力およびコストが大きい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】D. Simberg、Weisman S.、Talmon、Y、Barenholz (2004) DOTAP (and Other Cationic Lipids): Chemistry Biophysics, and Transfection。Crit. Reviews in Therap. Drug Carr. Systems、2004、21、257〜317
【非特許文献２】S. W. Hui, M. Langner、Y. Zhao、P. Ross、E. Hurley、およびK. Chan (1996) The Role of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer。Biophysical Journal、1996、71、590〜599
【非特許文献３】Weijun LiおよびFrancis C. Szoka Jr. 2007。Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery。Pharmaceutical Research、24、438〜449
【非特許文献４】N. Sakaguchi、Ch. Kojima、A. Harada、K. KoiwaiおよびK. Kono、2008。The correlation between fusion capability and transfection activity in hybrid complexws of lipoplexes and pH-sensitive liposomes。Biomaterials 29、4029〜4036
【非特許文献５】G. Gopalakrishnan、C. Danelon、P. Izewska、M. Prummer、P.-Y. Bolinger、I. Geissbuehler、D. Demurtas、J. Dubochet、およびH. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells。Angew. Chem. Int. Ed. 2006、45、5478〜5483
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明の課題は、細胞膜との効率的な融合をｉｎ ｖｉｖｏでも導く分子混合物を提供することである。さらになお、本発明の課題は、分子混合物との融合による効率的なｉｎ ｖｉｖｏ細胞膜修飾方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、細胞を修飾する際の分子混合物の利用可能性を提示することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
その課題は、請求項１に記載の混合物によって、およびｉｎ ｖｉｖｏ細胞（膜）修飾方法によって、および従属請求項に従ってこのやり方で調製された細胞によって解決される。その方法は、任意の細胞膜と本発明の両親媒性分子の混合物との間の膜融合に基づく。これによって、生物学的または薬学的に関連する分子を融合によって細胞内部および／または細胞膜に組み入れることができ、かつ／またはその表面でそれらに連結することもできる。その混合物は、単一の細胞だけでなく、有利には組織または組織切片にも使用可能である。
【００１０】
融合混合物
両親媒性分子の混合物は、親水性領域に正の総電荷を担持する両親媒性分子種Ａと、親水性および／または疎水性領域に非局在化した電子系を形成する両親媒性分子種Ｂとを有する。
【００１１】
したがって、非局在化した電子系を有する分子種Ｂは、共役二重結合および／または自由電子対（ｆｒｅｉｅ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎｐａａｒｅ）および／または空のｐ軌道によって形成される、本発明の少なくとも１種（または複数種）の環状構造モチーフを含む。これらは、ヒュッケル則に従う。
【００１２】
特に有利には、非局在化した電子系中の分子種Ｂの共有結合性隣接原子は、０．４以上の電気陰性度の差（Δχ）を有する。この法則を満たす分子種Ｂは、融合効率を上げる。
【００１３】
さらになお、分子種Ｂにおいて、非局在化した電子系を形成する基Ｒが疎水性領域または親水性領域に結合していることが有利である。
【００１４】
本発明の一形態において、その混合物は、分子種Ａとして１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００１５】
分子種Ｂは、本発明のさらなる一形態では、非局在化した電子系を有する蛍光色素が結合しているリン脂質によって形成される。しかしながら他の色素、例えばアゾ色素を、リン脂質に結合させることもできる。
【００１６】
分子種Ｂのリン脂質として、混合物中に特に１−ヘキサデカノイル−２−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたは１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンが提供される。
【００１７】
分子種Ｂにおいて非局在化した電子系は、有利には次に挙げるような基Ｒによって形成される：２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）またはＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）またはリサミンローダミンＢスルホニルまたは（５−（クロロスルホニル）−２−（１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ，１５Ｈ，１６Ｈ，１７Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリジノ［１’，９’：６，７，８］クロメノ［２，３−ｆ］キノリン−４−イウム−９−イル）ベンゼンスルホネートまたは７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イルまたはカルボキシフルオレセインまたは１−ピレンスルホニル。
【００１８】
明記された分子種Ｂの基本構成要素、すなわち例えばリン脂質と、前記基Ｒとは、自由に相互に組み合わせ可能であって、すなわち色素のそれぞれがリン脂質に結合することができる。
【００１９】
融合混合物は、既知の融合混合物に比べて広範にわたる利点を有する。その混合物は、全ての（哺乳動物）細胞型で、したがって普遍的に使用可能である。そのうえその混合物は、高効率であって（＞５０％）、融合によって細胞に損傷も発生しない。したがって細胞は、融合後に無制限に分裂可能である。そのうえその混合物は、組織切片にも使用可能である。さらなる利点は、例えば方式３に挙げられたように、特異的分子で細胞膜を官能化することによって達成される。
【００２０】
本発明の混合物にさらなる両親媒性分子種Ｃをヘルパー分子として提供することができる。
【００２１】
これに加えて、特に１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が分子種Ｃとして存在することができる。
【００２２】
分子種Ａ、ＢおよびＣの好ましい比は、約１：０．０５〜０．２：１ｗｔ／ｗｔである。
【００２３】
上記混合物は、最大９９％ｗｔの両親媒性分子種Ａ、４０％ｗｔの両親媒性分子種Ｂ（基Ｒを有する）、および最大７０％ｗｔの両親媒性分子種Ｃを含む。
【００２４】
本発明の方法のために、任意の混合物が有機溶媒に溶解され、十分に均一化される（例えばボルテックス、超音波）。その溶媒は、例えば真空中で除去され、分子種の乾燥混合物を水性緩衝液に溶解させる。この混合物は、冷却すると長期保存可能である。
【００２５】
特に好ましくは分子種Ａ、ＢおよびＣは、脂質として存在する。次にこれらは、水性緩衝液中に入れられるとリポソームを形成する。リポソームが好ましいのは、すぐれた方式でさらなる分子種を細胞膜内および細胞膜に接して配置することができ、リポソームに封入された分子をリポソームと細胞膜との融合の間に細胞内に導入することもできるからである。
【００２６】
したがって、とりわけ好ましくは、その混合物はリポソームとして存在する。特に有利には本発明のリポソームによって、細胞の好ましい修飾へと導くことができるさらなる分子をその中に配置することができるようになる。
【００２７】
しかし、分子種Ａおよび／またはＢおよび／またはＣとして脂質の代わりにポリマーを挙げることも考えられる。
【００２８】
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞修飾のための本発明の方法のために、細胞膜を有する選択された細胞を、好ましくは緩衝化された混合物、場合によってはリポソームと接触させる。接触過程は、有利には融合の間にわずか数分、例えば１〜１２０、好ましくは１０〜３０分間継続する。単一の細胞は、有利には混合物、場合によりリポソームと接触直後にこれと融合する。細胞組織は、状況によっては幾分長い時間、すなわち最大約１２０分間を必要とする。リポソームのエンドサイトーシスは、融合と厳密に区別すべきである。
【００２９】
この方法は、技術の現状に比べてそして短い接触時間で高い割合の、混合物またはリポソームと融合した細胞を示す。そこからの効率は、有利には５０％よりも大きい。
【００３０】
その方法の間に、本発明の混合物に多様なさらなる分子を供給することができる。これに関して本発明の方法は、多面的であって頑健であることが実証される。それに関して、多数の異なる機能的な分子種を個別にまたは同時に混合することができ、それで膜だけではなく細胞の所望の修飾へと導くことができる。ｖｉｖｏ系であることから、細胞は機能的なままである。
【００３１】
例示的に、親水性領域に官能基を有する、特に官能基としてキレート基を有する両親媒性分子種Ｄを、分子種Ａ、Ｂおよび場合によりＣを有する本発明の混合物に供給することができる。その場合、その混合物は、例えば分子種Ａ、Ｂ、Ｄおよび場合によりＣを含む。官能基は、混合物、場合によりリポソームと、細胞の細胞膜との融合の間に細胞膜表面に配置される。
【００３２】
このアプローチを用いて、細胞膜表面を特異的に修飾および官能化することができる。これに対して官能基は、細胞表面から外側に突出し、さらなる化学基によって狙いを定めた修飾が可能である。これは、本発明の特に有利な一形態において、癌治療の成功へと導くことができる。
【００３３】
したがって本発明の一混合物は、この目的のために例えば、分子種Ａとして１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび分子種ＢとしてＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｃとしてトリエチルアンモニウム塩／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｄとして１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を例えば１：０．１：１：０．００２ｗｔ／ｗｔの混合比率で含む。
【００３４】
次に、記載されたさらなる細胞修飾は、６×ヒスチジンリピートに結合した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの添加によって行われる。これは、方式３（下記参照）に挙げられたような癌療法の成功へと導く。
【００３５】
両親媒性分子種Ｅ、特に分子種ＥとしてのバクテリオロドプシンまたはグリコホリンＡまたはインテグリンをその混合物に供給することができ、融合の間に細胞の細胞膜中に配置することができる。
【００３６】
さらになお、予め乾燥された混合物の緩衝化溶液に、非両親媒性の親水性分子種Ｆも供給し、融合の間に細胞内腔に送達することができる。分子種Ｆに関して、特にＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｃａ２＋、ペプチド、タンパク質または薬剤、例えばアセチルサリチル酸が含まれる。
【００３７】
同様に非両親媒性の疎水性分子種Ｇを、同時にその混合物に供給し、融合の間に細胞膜中に配置することができる。これに関して、特にコレステリン、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ、またはコルチゾンのような薬剤が含まれる。
【００３８】
全ての分子種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、場合によりＧは、有機溶媒に溶解し、均一化することができる。それを続いて乾燥させ、水性緩衝液に溶解させ、保存することができる。水性緩衝溶液に溶解させる際に、前記分子種Ｅおよび／Ｆを混合することができる。その際に分子種の性質に応じて、有利には分子種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇからリポソームを形成させることができる。
【００３９】
以下の分子は、膜との融合により細胞膜を修飾するための融合混合物の製造に使用することができる。後に続く列挙は網羅的でも限定的でもない。
【００４０】
分子種Ａの実施例：
分子Ａの基準は、（ａ）その分子が少なくとも一つまたは複数の正電荷を有する親水性領域を有することによって、その分子の親水性部分の合計電荷が正であることである。この分子の課題は、負荷電した細胞膜近辺に静電力によって上記融合混合物をもたらすことである。（ｂ）加えて疎水性領域は、好ましくは二重結合を有するかまたは有さないＣ１０〜Ｃ３０−部分を有する。有利には、二重結合によって、生成したリポソームの膜が弾性になり、それによってリポソームと細胞膜との融合が容易になる。（ｃ）本発明の混合物中の分子種Ａの割合は、最大９９ｗｔ／ｗｔ％でありうる。
【００４１】
例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、または（１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）のような分子が適切である。
【００４２】
第一の例として、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩））が挙げられる。
【００４３】
【化１】
【００４４】
分子種Ｂの実施例：
本発明の融合誘導性分子としての両親媒性分子種Ｂの基準は、以下の通りである。（ａ）それは、電荷を有するかまたは好ましくは電荷を有さない親水性領域を有さなければならない。（ｂ）そしてそれは、二重結合を有するかまたは有さない疎水性領域、好ましくはＣ１０〜Ｃ３０−部分を有さなければならない。二重結合の機能については種Ａを参照されたい。（ｃ）その分子は、疎水性および／または親水性領域のいずれかに、非局在化した電子系を有する基（Ｒ）を有する。それによって、共役二重結合および／または自由電子対および／または空のｐ軌道からの環状構造モチーフが意図される。
【００４５】
基Ｒにおいて、共有結合した隣接原子の間の電気陰性度の差が大きいことが特に好ましい。これは、特に有利には少なくとも０．４（Δχ≧０．４）でありうる。これは、高められた分極率に役立ち、融合にプラスの影響を及ぼす。（ｄ）混合物中の融合誘導性分子種Ｂの割合は、最大４０ｗｔ／ｗｔ％に調整することができる。
【００４６】
後に続く表に、種Ｂの分子について関連する基Ｒをいくつか要約する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
分子種Ｂの第１の例（β−ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２−ＨＰＣ）：
２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）はβ−ＢＯＤＩＰＹであり、基Ｒを意味する。この基Ｒが、１−ヘキサデカノイル−２−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１２−ＨＰＣ）に結合している。両者は一緒になって次の構造式を与える：
【００４９】
【化２】
【００５０】
分子種Ｂの第２の例（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＤＨＰＥ）：
Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）はＢＯＤＩＰＹ−ＦＬである。この基Ｒが、ＤＨＰＥ（１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩））に結合している。両者は一緒になって次の構造式を与える：
【００５１】
【化３】
【００５２】
分子種Ｂの第３の例（「ＤｉＯ」）：
ＤｉＯＣ１８（３）３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩。この分子は、最初の２つの分子Ｂのように脂質と結合した色素ではなく、それ自体次の構造式で示される両親媒性の分子である：
【００５３】
【化４】
【００５４】
分子種Ｂの第４の例（ＬＲ−ＤＯＰＥ）：
リサミンローダミンＢスルホニルが基Ｒである。これは、両親媒性分子としての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）に結合している。両者は次の構造式を与える：
【００５５】
【化５】
【００５６】
分子種Ｂの第５の実施例（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）−ＤＨＰＥ）：
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、（５−（クロロスルホニル）−２−（１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ，１５Ｈ，１６Ｈ，１７Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリジノ［１’，９’：６，７，８］クロメノ［２，３−ｆ］キノリン−４−イウム−９−イル）ベンゼンスルホネート、つまり基Ｒである。これが、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合しており、一緒になって次の構造式を与える：
【００５７】
【化６】
【００５８】
分子種Ｂの第６の例（ＮＢＤ−ＤＯＰＥ）：
ＮＢＤは、（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）、つまり基Ｒである。これが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式となる：
【００５９】
【化７】
【００６０】
分子種Ｂへの第７の例（フルオレセイン−ＤＯＰＥ）：
カルボキシフルオレセインが基Ｒであって、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式となる：
【００６１】
【化８】
【００６２】
分子種Ｂへの第８の例（ピレン−ＤＯＰＥ）
１−ピレンスルホニルが基Ｒであって、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式となる：
【００６３】
【化９】
【００６４】
分子種Ｂの第９の例（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＣ）：
ピレンデカノイルが基Ｒであって、１−ヘキサデカノイル−２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンに結合して次の構造式となる：
【００６５】
【化１０】
【００６６】
全ての基Ｒは、本発明の意味において非局在化電子構造を有する。分子種Ｂ中の基Ｒは、非局在化のためにしばしば色素として存在する。
【００６７】
前記基Ｒは、それ自体、両親媒性分子の疎水性部分および非局在化二重結合によって形成されることが考えられる。
【００６８】
表１から追加的にわかるように、直接隣接した原子の、その電気陰性度に関する差が大きいほど、融合の質は良好である。
【００６９】
それに反して次の分子、例えばｃａｐＢｉｏ−ＤＯＰＥ（キャップビオチニルである基Ｒが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して、次の構造式となったもの）
【００７０】
【化１１】
などは機能しない。
【００７１】
ＰＩ、すなわちＬ−α−ホスファチジルイノシトール（ナトリウム塩）
【００７２】
【化１２】
およびメトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００である基Ｒが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンに結合して次の構造式（ＰＥＧ２０００−ＤＯＰＥ）となったもの
【００７３】
【化１３】
も同様に機能しない。
【００７４】
直前の３種の分子には電子構造の非局在化が欠けている。これは、本発明の混合物がこれを有さなければならないことを示している。
【００７５】
記載されたように、正電荷に関する分子種Ａの有利な性質および非局在化した電子系もしくは電気陰性度の差に関する分子種Ｂの有利な性質を、化学合成分子に統合することも考えられる。したがって、これまでは本発明者らに知られていなかった当該分子も、同じく本発明の対象であるはずである。
【００７６】
前記混合物の場合によるさらに有利な形態は、融合混合物の製造または細胞膜修飾のために以下のさらなる分子が可能である。
【００７７】
ヘルパー分子としての分子種Ｃの実施例
ヘルパー分子／担体分子Ｃの基準は：（ａ）その分子が、親水性領域および（ｂ）二重結合を有するかまたは有さない疎水性領域（特にＣ１０〜Ｃ３０）を有さなければならないことである。二重結合の機能のために、種Ａおよび／または種Ｂを参照されたい。（ｃ）大きな荷電密度および分子種Ａの正荷電分子の間の斥力を中和するために、両方の領域は、中性を有するべきである。この効果は、系の安定化へと導く。（ｄ）担体分子の割合は、最大７０％ｗｔ／ｗｔに調整することができる。
【００７８】
例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジエライドイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジフィタノールｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）のような分子が、適切である。
【００７９】
第１の例として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。
【００８０】
【化１４】
【００８１】
有利には、分子種Ａ、ＢおよびＣを脂質またはポリマーとして形成させることが可能である。両親媒性脂質の場合、すぐに使用可能な混合物を製造するときにリポソームを生成させる。
【００８２】
分子種Ａ、ＢおよびＣの間の重量混合比（ｗｔ／ｗｔ）は、有利には１：０．０５〜０．２：１である。
【００８３】
分子種Ｄ（官能基を有する両親媒性）
両親媒性分子種Ｄの基準は、以下の通りである：（ａ）その分子は、親水性領域および（ｂ）二重結合を有するかまたは有さない疎水性領域（特にＣ１０〜Ｃ３０を有する）を有さなければならない。二重結合の機能については種Ａ、Ｂ、またはＣを参照されたい。（ｃ）その分子は、融合後に細胞表面へのさらなる化学結合を可能にする官能基を親水性領域に有さなければならない。
【００８４】
例えば長鎖脂肪酸およびアルコール、キレート錯体修飾脂質、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）、ビオチン修飾脂質（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップ−ビオチン）、もしくはＰＥＧ修飾脂質（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）のような分子または薬剤も適切である。
【００８５】
これについての第一の実施例は、官能基としての（イミノ二酢酸）スクシニル（ニッケル塩）であり、ここではキレート基の形態で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−５−アミノ−１−カルボキシペンチルに結合している。これは、次の構造式を与える：
【００８６】
【化１５】
【００８７】
分子種Ｅ（両親媒性）：
さらになお、分子種Ｅの基準は、以下の通りである：（ａ）それは両親媒性である。（ｂ）これは、例えばバクテリオロドプシン、インテグリン、グリコホリンＡおよび他多数のような膜タンパク質、ペプチド、表面レセプターでありうる。（ｃ）分子種Ｅは、その他の成分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄのように人工的に合成することもできるし、また細胞から得ることもできる。（ｄ）例えば蛍光または放射性標識のようなこれらの分子の修飾が利用可能である。（ｅ）分子種Ｅは、混合物に最大２０％ｗｔ／ｗｔまで添加することができる。
【００８８】
両親媒性分子種Ｅは、種Ａ〜Ｄとして脂質を利用する際にリポソーム膜中に組み入れられる。非両親媒性分子種Ｅは、種Ａ〜Ｄとして脂質を利用する際にリポソーム膜上に結合して組み入れられる。
【００８９】
分子種Ｆ（水溶性または親水性）：
分子種Ｆの基準は次の通りである：（ａ）その分子は、水溶性であるべきである。以下の例が与えられる：イオン、ペプチド、タンパク質、薬剤、ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【００９０】
分子種Ｆは、分子種として脂質を利用する際にリポソームの内腔中に組み入れられる。
【００９１】
分子種Ｇ（非水溶性または疎水性）：
分子種Ｇへの基準は次の通りである：（ａ）その分子は疎水性の性質を有し、有機溶媒に溶解性良好である。以下の例が与えられる：コレステロール、ビタミンＢ。分子種Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと一緒にこれらを有機溶媒中で混合する。
【００９２】
融合方法
分子種ＡおよびＢを有する本発明の混合物の成分は、場合により、それに混合されたさらなる分子Ｃ、場合によりＤおよび場合によりＧと一緒に、所望の重量比で同時に、有機溶媒、好ましくはクロロホルム、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサン、ヘプタンまたはこれらの混合物中に入れられる。有機溶媒中に均一化した後で、有機溶媒は除去すべきである。
【００９３】
乾燥された混合物は、好ましくはｐＨ値７程度の水性緩衝液に入れられ、再び均一化される。次に、有利には添加された分子種を含むリポソームが形成される。そのうえ、分子種ＥおよびＦの分子を同様に混合することができる。この形態でその混合物は、例えば４℃で少なくとも１ヶ月間保存可能である。このステップは本発明の方法の調製のために役立つ。
【００９４】
本来の方法は、融合混合物を細胞培地で例えば１：１００（混合物：細胞培地ｖ／ｖ）に希釈し、再度均一化して、細胞上に与えることを備える。
【００９５】
生きた細胞への本発明の融合混合物の添加によって、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで融合が生じる。これに関して、細胞を約１〜６０分間、組織試料の場合は例えば６０〜１２０分間その混合物と接触させることで十分である。次に、細胞の洗浄ステップを挿入すべきであろう。
【００９６】
その方法は、有利には少なくとも５０％、好ましくは７０％超、特に９０％超という特に高い融合効率によって特徴づけられる。
【００９７】
膜融合は、特に有利には単一の細胞型に限定されるのではなく、表２に表示するようにほぼ普遍的なメカニズムを意味する。その上、密な組織試料は、延長したインキュベーション時間によってうまく処理することができる。それゆえにその方法は、特に有利に非常に多方面に使用可能である。
【００９８】
本発明の混合物と細胞膜との融合の際に、分子種Ｆの形態の小胞内容物（ｖｅｓｉｋｕｌａｅｒｅｎ Ｖｏｌｕｍｉｎａ）が細胞内に導入されることから、これは、有利には細胞の細胞質への可溶性分子、イオン、タンパク質またはＤＮＡの導入に役立てることができる。したがって分子種Ｆは、本来の意味で両親媒性分子種の混合物の成分ではない。
【００９９】
融合プロセスの間に、生物学的または薬学的に関連する分子種Ｄ、ＥまたはＧを無傷（ｉｎｔａｋｔｅ）細胞膜に取り込むことができる。細胞膜に導入された分子種Ｄの反応基は、例えばカップリング反応のために使用することができる。ペプチドまたはタンパク質のような種Ｅの追加的な膜固有の分子を細胞膜中に組み入れることができる。
【０１００】
本発明の混合物および本発明の方法は、基礎研究の多分野の分析を実施するための方式、例えば無傷細胞膜中に組み込まれた分子の拡散分析、文献中で脂質ラフトとしても公知の脂質のマイクロドメインおよびナノドメインの特徴づけ、または細胞における膜分子の調節および輸送経路の研究を可能にする。
【０１０１】
同時にその系は、例えば医学的に高度に関連する、特定の細胞型に狙いを定めた標識のために、例えば癌細胞の標識のために、細胞遊走の誘導を用いた創傷閉鎖の支援のために、細胞−細胞接触の形成、細胞突起または増殖誘導または細胞−細胞融合の形成のために利用することができる。
【０１０２】
したがって、分子種Ａ、Ｂ、（Ｃ）、ＤとＴＮＦαとの特定の本発明の両親媒性混合物は、医薬として、ならびにそれと同時に癌細胞の標識および治療の際に使用することができる。
【０１０３】
細胞膜修飾のためのいくつかの方法の概要を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
表２に関する略語：
手法１：細胞膜の染色；手法２：細胞表面の修飾；手法３：細胞内腔の修飾；手法４：細胞膜中のタンパク質の再構成
【０１０６】
分子種Ｃに関して：ＤＯＰＥ＝１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
【０１０７】
分子種Ａに関して：ＤＯＴＡＰ＝１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−（トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）
【０１０８】
分子種Ｂに関して：
β−ＢＯＤＩＰＹ Ｃ１２−ＨＰＣ：２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
β−ピレン Ｃ１０−ＨＰＣ：１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＤＨＰＥ：Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、（トリエチルアンモニウム塩）
ＤｉＯ：ＤｉＯＣ１８（３）３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩
フルオレセイン−ＤＨＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（カルボキシフルオレセイン）（アンモニウム塩）
ＬＲ−ＤＨＰＥ：リサミンローダミンＢ １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、（トリエチルアンモニウム塩）
ＬＲ−ＤＯＰＥ：リサミンローダミンＢ １，２−ジオレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、（トリエチルアンモニウム塩）
ＮＢＤ−ＤＯＰＥ：Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジオレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）
ピレン−ＤＯＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（１−ピレンスルホニル）（アンモニウム塩）
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）
【０１０９】
分子種Ｄ〜Ｇに関して：
ＢＲ−ＴＲＩＴＣ：分子種Ｅとしての、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマー混合物でラベルされたハロバクテリウム・サリナラム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）由来バクテリオロドプシン。
ＤＯＧＳ−ＮＴＡ：分子種Ｄとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）。
ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ：分子種Ｄとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップ−ビオチン。
Ｂ ＦＬ−ＳＭ：分子種ＤとしてのＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン
ＧＰＡ−ＴＲＩＴＣ：分子種Ｅとしての、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマー混合物でラベルされたグリコホリンＡ（ＭＮＳ血液型）。
ＰＩ：分子種ＥとしてのＬ−α−ホスファチジル−イノシトール（ナトリウム塩）。
分子種ＦとしてのＣａＣｌ２ｘＨ２Ｏ。
【０１１０】
細胞型および細胞系：
ＢＳＭＣ：気管支平滑筋細胞
ＥＳＭＣ：胎児平滑筋細胞
ＨＥＫ：ヒト胎児腎、ＨＥＫ２９３
ｈ．線維芽細胞：ヒト線維芽細胞
角化細胞：ヒト角化細胞
マクロファージ：ヒトマクロファージ
筋線維芽細胞：ラット心臓線維芽細胞
ニューロン：ラット胎仔皮質ニューロン
Ｒ３７：乳癌細胞系
心膜：ラット胎仔心嚢（ｈｅａｒｔ ｂａｇ）
【０１１１】
表２に関するその他：
ＴＮＦ：ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ：腫瘍壊死因子が６×ヒスチジンリピートと連結したもの
【０１１２】
以下に実施例および添付の図面に基づいて本発明を詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】融合試薬の三つの使用可能性の概略を示す図である。
【図２】表２の第１１行に対応する図である。Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ中で予備インキュベーションされたＨＥＫ２９３細胞に、１ｍＭ ＣａＣｌ２（分子種Ｆ）溶液を充填された融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／ＬＲ−ＤＨＰＥ（分子種Ｂ）＝１／１／０．１ｗｔ／ｗｔ）を添加した後の顕微鏡写真である。緑色Ｃａ２＋指示薬（Ｆｌｕｏ−４チャネル）が細胞内部において高いＣａ２＋濃度（分子種Ｆ）を示す一方で、赤色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（ＬｉｓｓＲｈｏｄチャネル）は細胞膜中に組み入れられた。（スケールバー＝２０μｍ）。
【図３】表２の第２５行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／β−Ｂｏｄｉｐｙ−Ｃ１２ＨＰＣ（分子種Ｂ）／ＢＲ−ＴＲＩＴＣ（分子種Ｅ）＝１／１／０．１／０．０００５ｗｔ／ｗｔ）を添加してから１０分後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。緑色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（β−Ｂｏｄｉｐｙチャネル）および赤色で標識されたチャネルタンパク質（分子種Ｅ）（ＴＲＩＴＣチャネル）が細胞膜中に組み入れられた。（スケールバー＝２０μｍ）
【図４】表２の第２５行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／β−Ｂｏｄｉｐｙ−Ｃ１２ＨＰＣ（分子種Ｂ）／ＢＲ−ＴＲＩＴＣ（分子種Ｅ）＝１／１／０．１／０．０００５ｗｔ／ｗｔ）の洗浄から４時間後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。緑色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（β−Ｂｏｄｉｐｙチャネル）および赤色で標識されたチャネルタンパク質（分子種Ｅ）（ＴＲＩＴＣチャネル）が細胞膜中に組み入れられた。時間に依存した２種類の色素の分離は、細胞膜から細胞内部への膜脂質およびタンパク質の異なる輸送経過を推論させる。（スケールバー＝２０μｍ）。
【図５】表２の第１６行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ（分子種Ｂ）／ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）＝１／１／０．１／０．００２ｗｔ／ｗｔ）の添加から１０分後のＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡写真である。（スケールバー＝５０μｍ）
【図６】表２の第１６行に対応する図である。細胞膜に組み入れられたＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）を有する、ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ処理されたＨＥＫ２９３細胞およびマクロファージの顕微鏡写真、ならびにＢ：細胞膜にＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）を有さない、ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ処理されたＨＥＫ２９３細胞およびマクロファージの顕微鏡写真を示す図である。（スケールバー＝５０μｍ）
【図７】表２の第２３行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＤＨＰＣＣ（分子種Ｂ）／ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ（分子種Ｄ）＝１／１／０．１／０．０１ｗｔ／ｗｔ）を洗浄後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。赤色で標識された脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄチャネル）および緑色で標識された表面タンパク質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８チャネル）は、リン脂質と、細胞表面に結合したタンパク質との明白な共局在を示す。（スケールバー＝５０μｍ）
【図８】表２の第２４行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＤＨＰＣＣ（分子種Ｂ）／Ｂ ＦＬ−ＳＭ（分子種Ｄ）＝１／１／０．１／０．０１ｗｔ／ｗｔ）を洗浄後の線維芽細胞の顕微鏡写真である。この写真は、リン脂質（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄチャネル）およびスフィンゴ脂質（ＢＦＬチャネル）の組み入れの成功を示す。（スケールバー＝２０μｍ）
【図９】表２の第４７行に対応する図である。融合混合物（ＤＯＰＥ（分子種Ｃ）／ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）／ＢｏｄｉｐｙＦＬ−ＤＨＰＥ（分子種Ｂ）＝１／１／０．１ｗｔ／ｗｔ）で１時間処理後のラット胚（１９日）からの初代心膜組織（心嚢）の顕微鏡写真である。写真から、分子種Ａ〜Ｃの融合混合物が組織中に深さ約３〜４細胞層まで入り込み、膜融合が誘導されたことが明らかに見てとれる。（スケールバー＝７０μｍ）
【実施例】
【０１１４】
図１は、細胞膜修飾の三つの本発明の方式を示す。各方式は、さらなる実施例で実施される。
【０１１５】
図１の方式１：種Ａ〜Ｃの混合物および細胞内腔への種ＦとしてのＣａ２＋イオンの導入による細胞膜修飾
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）（ＤＳＭＺ、ドイツ）細胞を、細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたりＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中に細胞３００００個の細胞密度で１μｇ／ｍｌのＦｌｕｏ−４ ＡＭ−Ｃａ２＋−指示薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベーションした。インキュベーション後に細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄させ、本発明の融合混合物と共に３０分間インキュベーションした。
【０１１６】
本発明の融合混合物は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ）、リサミンローダミンＢ １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＬＲ−ＤＨＰＥ：基Ｒを有する分子種Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の重量比ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／ＬＲ−ＤＨＰＥ（１／１／０．１ｗｔ／ｗｔ）の脂質混合物から成る。
【０１１７】
脂質成分をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間室温で乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）および１ｍＭ ＣａＣｌ２の緩衝溶液中に分子種Ｆ（ＶＷＲ）として２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液の終濃度となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間室温で均一化した。
【０１１８】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、冷蔵庫内で４℃で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１１９】
５μｌのこの融合混合物をＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈し、超音波を用いて再度５〜１０分間均一化してから、Ｃａ２＋−指示薬Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベーションされたＨＥＫ２９３細胞を有する細胞培養シャーレに添加する。
【０１２０】
その細胞を、本発明の融合方法で本発明の混合物と共に３７℃および５％ＣＯ２で１０〜３０分間インキュベーションする。その後細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した（図２）。
【０１２１】
分子種Ｂの赤色蛍光脂質分子は、膜融合の成功後にＨＥＫ２９３細胞の細胞膜中に組み入れられている。これによって、細胞膜を蛍光顕微鏡下でよく見分けることができる（図２ ＬｉｓｓＲｈｏｄチャネル参照）。
【０１２２】
膜融合後に細胞容積中で高められたＣａ２＋濃度によって引き起こされた、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ４ ＡＭの強い緑色蛍光強度は、小胞内腔の細胞内部への送達およびそれによる分子種Ｆの送達の証拠も提供する（図２ Ｆｌｕｏ−４チャネル）。
【０１２３】
写真およびそれに基づくカウントにより、８０％を超える融合効率、すなわち全細胞の８０％超が本発明の混合物／リポソームと融合したことが示される。
【０１２４】
対照としてＨＥＫ２９３細胞を同様に処理したが、ただし、小胞内腔に１ｍＭ ＣａＣｌ２緩衝液の代わりに２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを充填した。この場合、Ｃａ２＋指示薬は明らかに、より低い細胞内Ｃａ２＋濃度を示した（表示せず）。
【０１２５】
図１の方式２：種Ａ〜Ｃの混合物および細胞膜中へのバクテリオロドプシン（分子種Ｅ）の導入による細胞膜修飾：
心臓線維芽細胞をラット胎仔心臓（１９日）から単離し、Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり２００００個の細胞密度で３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。６日間かけて心臓線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、以下の本発明の方法に使用した。
【０１２６】
筋線維芽細胞を、１／１／０．１の重量比で終濃度２０μｇ脂質／ｍｌ培地の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）および２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ Ｃ１２−ＨＰＣ：分子種Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）製）、ならびに蛍光標識されたチャネルタンパク質（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓａｌｉｎａｒｕｍ由来バクテリオロドプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）−テトラメチルローダミンイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））（ＢＲ−ＴＲＩＴＣ：分子種Ｅ）０．４ｎｇ／ｍｌ）の融合混合物中でインキュベーションした。
【０１２７】
本発明の混合物を次の方法で調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｃ）をクロロホルム（ＶＷＲ）中で均一に混合した。混合後にその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸（ＶＷＲ））緩衝溶液中に終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。全てのステップを室温で実施した。したがって、この混合物はリポソームとして存在する。
【０１２８】
５μｌのこの融合混合物を０．７μｌのＢＲ−ＴＲＩＴＣ溶液（分子種Ｅ）（０．０６ｍｇ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ）と共に６０分間インキュベーションし、その際に慎重に撹拌した。チャネルタンパク質Ｅは、リポソームの脂質二重膜に入れられる。
【０１２９】
その溶液をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、再度超音波（８０〜１００Ｗ）で１〜２分間処理してから筋線維芽細胞を有する細胞培養シャーレに加えた。
【０１３０】
本発明により細胞を融合混合物と共に１０〜２０分間インキュベーションし、次にＦ１０ Ｈａｍ培地で洗浄し、分析した。
【０１３１】
洗浄後に細胞の細胞原形質膜の約８０〜１００％を蛍光顕微鏡（脂質について緑色、タンパク質について赤色）（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検出することができたが、このことは脂質混合物（分子種Ａ〜Ｃ）だけでなくタンパク質分子（分子種Ｅ）の膜組み入れの成功も示している（図３および図４）。
【０１３２】
図１の方式３：種Ａ〜Ｄの混合物による細胞膜表面上へのタンパク質結合のための細胞膜修飾、新規な腫瘍治療およびそのための医薬の特徴
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり細胞４００００個の細胞密度のヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）（ＤＳＭＺ、ドイツ）細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、約９０％の集密度で後続のステップに使用した。ＨＥＫ２９３細胞を１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）、（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ：分子種 Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）（ＤＯＧＳ−ＮＴＡ：分子種Ｄ Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を含むＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ／ＤＯＧＳ−ＮＴＡ（１／１／０．１／０．００２ｗｔ／ｗｔ）の重量比の融合混合物中で２０μｇ脂質／ｍｌ ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の終濃度で３７℃および５％ ＣＯ２で１０〜２０分間直接インキュベーションした。
【０１３３】
融合混合物を次の方法で調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｄ）をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中に均一に混合した。続いて、その溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）の緩衝溶液中に終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。
【０１３４】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、４℃の冷蔵庫内で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１３５】
５μｌのこの融合混合物をＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて再度５〜１０分間均一化してからＨＥＫ２９３細胞を有する細胞培養シャーレに加えた。全ての調製ステップを室温で実施した。
【０１３６】
続いて細胞をＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した。
【０１３７】
図５にそのような検査を示すが、この図は、８０％を超える融合効率を示す。この効率は、顕微鏡写真の助けを借りて計数によって確認した。
【０１３８】
分子種Ｄとして使用されたＤＯＧＳ−ＮＴＡの反応性頭基と反応パートナーとの間の結合を可能にするために、濃度１〜５ｎｇ／ｍｌの、６×ヒスチジン−リピートに結合した腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグ）（ＰｒｏＳｐｅｃ、レホボート、イスラエル）のＲＰＭＩ培地溶液中で細胞を約２０分間３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。
【０１３９】
残留タンパク質は、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄するプロセスによって懸濁液から除去した。ＴＮＦαは、体内でマクロファージ活性化因子として役立ち、免疫系に関する癌細胞の認識および排除における主因子である。系の機能性を検査するために、分化したマクロファージを使用した。ヒト単球は、血液からＬｅｕｋｏｓｅｐｔｓｙｓｔｅｍ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、クレムスミュンスター、ＡＵ）およびＢｉｏｃｏｌｌ分離媒質（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ケンブリッジ、ＵＫ）を用いて得た。形成した間期から１０００ｇで１０分間遠心分離後に単球を回収し、後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）で洗浄した。単球をＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に入れ、３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。２日後に０．１ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＦ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）をその単球に与えた。さらなる３日後に単球から不活性なマクロファージに分化した。
【０１４０】
続いて、そのように得られたマクロファージを、ＨＥＫ２９３細胞層に蒔いたが、その細胞は、融合およびそれに続くＴＮＦα−Ｈｉｓ−タグとのインキュベーションによりマクロファージのための認識シグナルを担持していることになった。認識されると、マクロファージにおける細胞性免疫応答が誘導され、ＨＥＫ２９３細胞が溶解されることになった。対照としてＨＥＫ細胞を同様に処理したが、ただし、反応性頭基を有する分子種Ｄの両親媒性分子（ＤＯＧＳ−ＮＴＡ）を融合アプローチから省略した。両方のアプローチで２４時間インキュベーションし、続いて光学顕微鏡で分析した（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）。図６に、融合アプローチにおいてＤＯＧＳ−ＮＴＡ（分子種Ｄ）と共にインキュベーションされたＨＥＫ２９３細胞上でのみ、細胞が認識され、溶解されたこと（プラーク形成）を示す。この例は、膜融合を用いて目的の細胞型が標識され、一例として免疫系に関して可視化することができることを示す。
【０１４１】
ビオチン−アビジン／ストレプトアビジンの結合により細胞膜表面上にタンパク質を結合させるための種Ａ〜Ｄの混合物による細胞膜修飾のさらなる実施例：
心臓線維芽細胞をラット胎仔心臓（１９日）から単離し、Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり２００００個の細胞密度で、３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。６日間かけて心臓線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、以下の本発明の方法に使用した。
【０１４２】
筋線維芽細胞を、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ：分子種Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−キャップ−ビオチン（ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ：分子種Ｄ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を、ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ／ｃａｐＢｉｏＤＯＰＥ（１／１／０．１／０．１ｗｔ／ｗｔ）の重量比で含む、終濃度２０μｇ脂質／ｍｌ Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の融合混合物中で、３７℃および５％ ＣＯ２で１０〜２０分間直接インキュベーションした。
【０１４３】
融合混合物は次のように調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｄ）をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）の緩衝溶液中で終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。
【０１４４】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、冷蔵庫内で４℃で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１４５】
５μｌのこの融合混合物をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて再度５〜１０分間均一化してから筋線維芽細胞を有する細胞培養シャーレに添加した。全ての調製ステップは室温で実施した。
【０１４６】
続いて細胞をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した。
【０１４７】
図７にそのような検査を示すが、この図は、８０％を超える融合効率を示す。この効率は、顕微鏡写真の助けを借りて計数によって確認した。
【０１４８】
分子種Ｄとして使用されたｃａｐＢｉｏＤＯＰＥの反応性頭基と反応パートナーとの間の結合を可能にするために、１００／１のｍｏｌ／ｍｏｌ％のストレプトアビジン／ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ４８８（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ製）を総タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ Ｈａｍ培地となるように溶かした溶液中で細胞を３７℃および５％ ＣＯ２で約２０分間インキュベーションした。
【０１４９】
残留タンパク質は、Ｆ１０ Ｈａｍ培地で３回洗浄するプロセスによって懸濁液から除去した。
【０１５０】
図７にリン脂質（赤色）および細胞表面結合タンパク質（緑色）の明白な共局在を示す。
【０１５１】
細胞膜組成を修飾するための種Ａ〜Ｄの混合物による細胞膜修飾のさらなる実施例：
心臓線維芽細胞をラット胎仔心臓（１９日）から単離し、Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で細胞培養シャーレ（φ３．５ｃｍ）１枚あたり２００００個の細胞密度で、３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。６日間かけて心臓線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化し、以下の本発明の方法に使用した。
【０１５２】
筋線維芽細胞を、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ：分子種Ｂ）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン（Ｂ ＦＬ−ＳＭ：分子種Ｄ）（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ製）をＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ／ＢＦＬ−ＳＭ（１／１／０．１／０．０１ｗｔ／ｗｔ）の重量比で含む、終濃度２０μｇ脂質／ｍｌ Ｆ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の融合混合物中で、３７℃および５％ ＣＯ２で１０分間直接インキュベーションした。
【０１５３】
融合混合物は次のように調製した。脂質成分（分子種Ａ〜Ｄ）をまずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ）の緩衝溶液中で終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。
【０１５４】
したがって、その混合物はリポソームとして存在する。この混合物は、冷蔵庫内で４℃で約１ヶ月間保存可能であり、均一化ステップを繰り返した後に再度使用可能である。
【０１５５】
５μｌのこの融合混合物をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて再度５〜１０分間均一化してから筋線維芽細胞を有する細胞培養シャーレに添加した。全ての調製ステップは室温で実施した。
【０１５６】
続いて細胞をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、試薬と細胞膜との融合を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で検査した。
【０１５７】
図８に実施例ならびに筋線維芽細胞の原形質膜へのリン脂質分子（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ）およびスフィンゴ脂質（ＢＦＬ−ＳＭ）の組み入れの範囲内でそのような検査を示す。
【０１５８】
方式４：組織試料への種Ａ〜Ｃの混合物による細胞膜修飾
融合混合物を用いて個別の哺乳類細胞だけでなく、組織および組織切片中の細胞もまた融合させることができる（図９参照）。ラット胎仔（１９日）から初代心膜組織（心嚢）を単離し、３．５ｃｍ細胞培養シャーレ上のＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：分子種Ｃ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ：分子種Ａ）、（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−ＤＨＰＥ：分子種Ｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡ）の重量比１／１／０．１ｗｔ／ｗｔの融合混合物と共に３７℃および５％ ＣＯ２で１時間インキュベーションした。（分子種ＣおよびＢはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、アラバマ、ＡＬ、ＵＳＡ製；分子種Ｂは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、ＯＲ、ＵＳＡから購入した）。融合混合物は、以下のように調製した。
【０１５９】
脂質成分（分子種Ａ〜Ｃ）は、まずクロロホルム（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）中で均一に混合した。続いてその溶液を真空中で３０〜６０分間乾燥させた。脂質分子を再度２０ｍＭ （２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ＶＷＲ、ダルムシュタット、ドイツ）の緩衝溶液中に終濃度２ｍｇ脂質／ｍｌ緩衝液となるように入れ、超音波槽（８０〜１００Ｗ）中で２０分間均一化した。この混合物も、リポソームとして４℃で保存可能である。
【０１６０】
５μｌのこの融合混合物をＦ１０ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１００倍に希釈し、再度超音波（８０〜１００Ｗ）を用いて５〜１０分間均一化してから組織試料に添加した。全ての調製ステップを室温で実施した。
【０１６１】
続いて、融合された組織を蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ、イエーナ製）で分析した。図９に、外部組織層の細胞だけでなく、より深部の細胞レベルの細胞もうまく融合または染色したことを示す。結合組織の細胞由来の約３〜４細胞層をはっきりと認識することができる。場合により、これによる遺伝子療法、癌治療および創傷治癒での使用が考えられる。
【０１６２】
さらなる実施例を挙げることができる。これを表２に示す。その混合物の製造方法は、本明細書に示された四つの例のプロトコールから引用される。細胞膜の融合は上に挙げられた方法に従う。本発明の意味で、実施例における全ての工程ステップを非限定的な性質と見なすことができる。特に融合混合物およびその使用は、広く解釈するべきである。これは、新しい混合物および実施に成功するように、実施例に示された方法および融合混合物を相互に組み合わせることができることを意味する。
【０１６３】
この詳細に述べられた四つの方式は、リポソームから始まる。それは、クロロホルムを添加することおよび緩衝液中に入れることの後に、両親媒性成分がリポソームに変型するからである。
【０１６４】
本特許出願において、本特許出願に添付されるカラー図１〜９が引用される。これらの図の白黒での描写は、開示の規定に基づいて本特許出願に図１０〜１８として添付される。その際に図１０は内容的に図１に対応する。図１１は図２に対応する。図１２は図３に対応する。図１３は図４に対応する。図１４は図５に対応する。図１５は図６に対応する。図１６は図７に対応する。図１７は図８に対応する。図１８は図９に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性領域に正の総電荷を有する両親媒性分子種Ａと、親水性および／または疎水性領域に非局在化した電子系を形成する両親媒性分子種Ｂとを有する、両親媒性分子の混合物。
【請求項２】
共役二重結合および／または自由電子対および／または空のｐ軌道によって形成される少なくとも一つの環状構造モチーフを含む、非局在化した電子系を有する分子種Ｂを特徴とする、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
非局在化した電子系中の分子種Ｂの共有結合性隣接原子が、０．４以上の電気陰性度の差（Δχ）を有することを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項４】
非局在化した電子系を形成する基Ｒを含む分子種Ｂを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項５】
分子種Ａとしての１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項６】
非局在化した電子系を有する蛍光色素が基Ｒとして結合した、分子種Ｂとしてのリン脂質を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項７】
分子種Ｂのリン脂質としての１−ヘキサデカノイル−２−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたは１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項８】
分子種Ｂにおいて非局在化した電子系を形成する、２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）またはＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）またはリサミンローダミンＢスルホニルまたは（５−（クロロスルホニル）−２−（１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ，１５Ｈ，１６Ｈ，１７Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリジノ［１’，９’：６，７，８］クロメノ［２，３−ｆ］キノリン−４−イウム−９−イル）ベンゼンスルホネートまたは７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イルまたはカルボキシフルオレセインまたは１−ピレンスルホニルを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項９】
ヘルパー分子としてのさらなる両親媒性分子種Ｃを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１０】
分子種Ｃとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１１】
分子種Ａ、ＢおよびＣの間で１：０．０５〜０．２：１ｗｔ／ｗｔの比を特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１２】
最大９９％ｗｔの両親媒性分子種Ａを有する、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１３】
最大４０％ｗｔの両親媒性分子種Ｂを有する、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１４】
最大７０％ｗｔの両親媒性分子種Ｃを有する、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１５】
水性緩衝液に溶解して存在することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１６】
分子種Ａおよび／またはＢおよび／またはＣとしての脂質を特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１７】
請求項１５および１６に記載の混合物を含むリポソーム。
【請求項１８】
分子種Ａおよび／またはＢおよび／またはＣとしてのポリマーを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１９】
細胞膜と、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の混合物またはリポソームとの接触および融合を特徴とする、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞修飾方法。
【請求項２０】
融合の間の細胞の細胞膜と前記混合物との最大１〜１２０分間、好ましくは１０〜３０分間の接触を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
５０％を超える、前記混合物または前記リポソームと融合した細胞の割合を特徴とする、請求項１９〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
両親媒性分子種Ｄの親水性領域における官能基、特に官能基としてのキレート基が前記混合物に供給され、前記融合の間に細胞表面に配置されることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
分子種Ａとして１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび分子種ＢとしてＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｃとしてトリエチルアンモニウム塩／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｄとして１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を、例えば１：０．１：１：０．００２ｗｔ／ｗｔの混合比率で含む混合物が、融合のために使用されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
６×ヒスチジンリピートに結合した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの添加によるさらなる細胞修飾が行われることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
両親媒性分子種Ｅ、特に分子種ＥとしてのバクテリオロドプシンまたはグリコホリンＡまたはインテグリンが前記混合物に供給され、前記融合の間に細胞膜に配置されることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
緩衝溶液中の非両親媒性の親水性分子種Ｆ、特に分子種ＦとしてのＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｃａ２＋、ペプチド、タンパク質または薬剤、例えばアセチルサリチル酸が、乾燥された混合物に供給され、前記融合の間に細胞内腔に送達されることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
非両親媒性の疎水性分子種Ｇ、特に分子種Ｇとしてのコレステリン、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫまたは薬剤、例えばコーチゾンが前記混合物に供給され、前記融合の間に細胞膜に配置されることを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２８】
特に１：０．１：１：０．００２ｗｔ／ｗｔの混合比の、分子種Ａとしての１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび分子種ＢとしてのＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｃとしてのトリエチルアンモニウム塩／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｄとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項２９】
請求項１〜１８、２８のいずれか一つに記載の混合物またはリポソームとｉｎ ｖｉｖｏ融合された細胞。
【請求項１】
親水性領域に正の総電荷を有する両親媒性分子種Ａと、親水性および／または疎水性領域に非局在化した電子系を形成する両親媒性分子種Ｂとを有する、両親媒性分子の混合物。
【請求項２】
共役二重結合および／または自由電子対および／または空のｐ軌道によって形成される少なくとも一つの環状構造モチーフを含む、非局在化した電子系を有する分子種Ｂを特徴とする、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
非局在化した電子系中の分子種Ｂの共有結合性隣接原子が、０．４以上の電気陰性度の差（Δχ）を有することを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項４】
非局在化した電子系を形成する基Ｒを含む分子種Ｂを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項５】
分子種Ａとしての１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項６】
非局在化した電子系を有する蛍光色素が基Ｒとして結合した、分子種Ｂとしてのリン脂質を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項７】
分子種Ｂのリン脂質としての１−ヘキサデカノイル−２−ドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたは１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項８】
分子種Ｂにおいて非局在化した電子系を形成する、２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）またはＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）またはリサミンローダミンＢスルホニルまたは（５−（クロロスルホニル）−２−（１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ，１１Ｈ，１２Ｈ，１３Ｈ，１５Ｈ，１６Ｈ，１７Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリジノ［１’，９’：６，７，８］クロメノ［２，３−ｆ］キノリン−４−イウム−９−イル）ベンゼンスルホネートまたは７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イルまたはカルボキシフルオレセインまたは１−ピレンスルホニルを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項９】
ヘルパー分子としてのさらなる両親媒性分子種Ｃを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１０】
分子種Ｃとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１１】
分子種Ａ、ＢおよびＣの間で１：０．０５〜０．２：１ｗｔ／ｗｔの比を特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１２】
最大９９％ｗｔの両親媒性分子種Ａを有する、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１３】
最大４０％ｗｔの両親媒性分子種Ｂを有する、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１４】
最大７０％ｗｔの両親媒性分子種Ｃを有する、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１５】
水性緩衝液に溶解して存在することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１６】
分子種Ａおよび／またはＢおよび／またはＣとしての脂質を特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１７】
請求項１５および１６に記載の混合物を含むリポソーム。
【請求項１８】
分子種Ａおよび／またはＢおよび／またはＣとしてのポリマーを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項１９】
細胞膜と、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の混合物またはリポソームとの接触および融合を特徴とする、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞修飾方法。
【請求項２０】
融合の間の細胞の細胞膜と前記混合物との最大１〜１２０分間、好ましくは１０〜３０分間の接触を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
５０％を超える、前記混合物または前記リポソームと融合した細胞の割合を特徴とする、請求項１９〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
両親媒性分子種Ｄの親水性領域における官能基、特に官能基としてのキレート基が前記混合物に供給され、前記融合の間に細胞表面に配置されることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
分子種Ａとして１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび分子種ＢとしてＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｃとしてトリエチルアンモニウム塩／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｄとして１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を、例えば１：０．１：１：０．００２ｗｔ／ｗｔの混合比率で含む混合物が、融合のために使用されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
６×ヒスチジンリピートに結合した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの添加によるさらなる細胞修飾が行われることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
両親媒性分子種Ｅ、特に分子種ＥとしてのバクテリオロドプシンまたはグリコホリンＡまたはインテグリンが前記混合物に供給され、前記融合の間に細胞膜に配置されることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
緩衝溶液中の非両親媒性の親水性分子種Ｆ、特に分子種ＦとしてのＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｃａ２＋、ペプチド、タンパク質または薬剤、例えばアセチルサリチル酸が、乾燥された混合物に供給され、前記融合の間に細胞内腔に送達されることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
非両親媒性の疎水性分子種Ｇ、特に分子種Ｇとしてのコレステリン、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫまたは薬剤、例えばコーチゾンが前記混合物に供給され、前記融合の間に細胞膜に配置されることを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２８】
特に１：０．１：１：０．００２ｗｔ／ｗｔの混合比の、分子種Ａとしての１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび分子種ＢとしてのＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｃとしてのトリエチルアンモニウム塩／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび分子種Ｄとしての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の混合物。
【請求項２９】
請求項１〜１８、２８のいずれか一つに記載の混合物またはリポソームとｉｎ ｖｉｖｏ融合された細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５３２１５１（Ｐ２０１２−５３２１５１Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１８７５２（Ｐ２０１２−５１８７５２）
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２０１０／０００８１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００３４０６
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（３９００３５４４８）フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (100)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２０１０／０００８１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００３４０６
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（３９００３５４４８）フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (100)
【Ｆターム（参考）】
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