中ないし高分化型がんの免疫療法用組成物および治療方法。
中ないし高分化型がん細胞の存在を特徴とするがんの治療用免疫療法用組成物および治療方法が提供される。代表的な免疫療法用組成物は、前立腺酸性フォスファターゼ／顆粒球-マクロファージ コロニー刺激因子融合タンパク質を含む融合タンパク質のようなタンパク質コンジュゲートによって活性化される、樹状細胞を含む抗原提示細胞を利用する。１個または２個以上の免疫療法用組成物を利用する治療方式に対するがん細胞の感受性を評価する方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療用組成物および治療方法に関する。より具体的には本発明は、中ないし高度に分化したがんの患者におけるがん細胞増殖を阻害する免疫学的治療用組成物および治療方法を提供する。さらに本発明は、免疫学的治療用組成物を用いる治療方式（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｇｉｍｅｎｓ）に対する感受性をがん患者について評価する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、異常細胞の無制御な増殖および転移を特徴とする一群の疾患であり、米国では心臓疾患に次ぐ第２位の死亡原因である。２００１年には、約１，２６８，０００人の新たな患者が診断され、約５５３，４００人が死亡すると予測された。米国における生涯発がんリスクは、男性で約２人に１人、女性で約３人に１人である。
【０００３】
前立腺がんは米国男性で最も多く診断される新生物である。２００１年には、推定で１９８，１００人の前立腺がんの新患者の診断が下され、これは、がんの診断が下された男性の新患者全体の約２９％に相当した。２００１年には、約３１，５００人の死亡原因が前立腺がんであった。１９８８年から１９９２年の間に前立腺がんの発症率が劇的に増大したが、これは、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血液検査の利用の増大を通じて無症状の男性についてより早期に診断できるようになったためである。前立腺がんの発症率はその後減少して安定してきた。男性の６人に１人は生涯のある時点で前立腺がんを発症する。
【０００４】
いずれかのがんについて適当な治療法を決定するためには、ある治療のモダリティの治療としての有効性を予測しようとするさまざまな因子の評価が必要である。従来のがん治療方式は、がんの型にもよるが、外科療法、放射線療法、化学療法、ホルモン療法またはこれらの組み合わせを含むことがしばしばある。
【０００５】
前立腺がんという特定の場合では、患者の年齢、がんの進行段階その他の医学的な条件を考慮すると、外科療法および／または放射線療法が治療の一般的なアプローチである。ホルモン療法および化学療法は転移疾患に頻繁に用いられる。ホルモン療法は、腫瘍のサイズを縮小させて痛みその他の徴候を軽減することによって、長期にわたり前立腺がんを制御する場合がある。場合によっては、特に、低悪性度および／または初期の腫瘍を有する高齢者については、当面積極的な治療を施すことなく注意深く観察すること（経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ ｗａｉｔｉｎｇ））が適切な場合がある。
【０００６】
最近がん研究の進歩が、さまざまながん治療用の免疫療法組成物をもたらしてきた。がん治療の免疫療法的アプローチは、がん細胞が異常あるいは外来の細胞および分子に対する生体防御をしばしばかいくぐることができ、これらの防御は治療によって失地回復するように刺激される場合があるという認識に基づく。非特許文献１を参照せよ。
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ、“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学）、”ｐｇｓ．６２３−６４８（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）
【０００７】
さまざまな免疫エフェクターが直接または間接に腫瘍の成長を阻害できるという最近の観察が、がん療法に対するこのアプローチへの関心を新たにすることにつながった。非特許文献２および３。現代的な免疫療法は、例えば、抗体療法、ポリペプチドワクチンおよび多数の細胞免疫療法を含む。これらの免疫療法の治療モダリティのそれぞれは、がん細胞の監視および根絶を司る患者の免疫システムの要素の増強を共有する。
【非特許文献２】Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６０（１）：１−７（２００１）
【非特許文献３】Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ７９（１２）：６５１−９（２０００）
【０００８】
がんの特定のタイプに関係なく、臨床的な予後は、がん細胞の分化状態を決定することによって予想されることがよくある。ある腫瘍の分化の程度と、その生物学的な挙動との関係は、１世紀以上前から知られてきた。１９２０年代という昔に、組織学的な「等級」、すなわち、分化の数量的表現の患者の予後への影響が初めて分析された。高分化型がん細胞は高い生存率と相関するが、低分化型がん細胞の存在は臨床的予後の悪さを示す。低分化型腫瘍は、高分化型腫瘍よりも攻撃的な経過をたどるという基本的な結論は、その後繰り返し支持されてきた。
【０００９】
腫瘍の等級は、等級１が高分化型でゆっくりと分裂する細胞を有するがんを表し、等級２が中程度の分化型細胞を有するがんを表し、等級３が低分化型で速く分裂する細胞を有するがんを表し、等級４が未分化細胞を有するがんを表す、１ないし３か、１ないし４かのスケールで示されることがしばしばある。がんの予後は等級が大きいほど低下する。
【００１０】
もともと扁平上皮がんについて開発されたＢｒｏｄｅｒの等級法は今日でも用いられている。この方法によって腫瘍は不完全な分化を示す腫瘍の割合に従って４つの等級のうちの１つに分類される。非特許文献４−６。等級が低い高分化型腫瘍は良性腫瘍によく似ているが、等級が高い低分化型腫瘍はほとんど似ていない。正式な等級システムは、近年、基準のより厳格な標準化で改善された。非特許文献７．
【非特許文献４】Ｂｒｏｄｅｒｓ、ＪＡＭＡ ６５６−６５４（１９２０）
【非特許文献５】Ｂｒｏｄｅｒｓ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．７３：１４１−６０（１９２１）
【非特許文献６】Ｂｒｏｄｅｒｓ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂｌ Ｍｅｄ．２：３７６−８１（１９２６）
【非特許文献７】Ｅｌｓｔｏｎ、Ａｕｓｔ ＮＺ Ｊ．Ｓｕｒｇ．５４：１１−１５（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
等級化ががんの予後を予想するうえで価値が大きいことは証明されたが、免疫療法の治療方式を施されている患者の臨床的な予後を将来的に評価するのに追うようできるかもしれないことは理解されていない。したがって、免疫療法に基づくがん治療方式の治療予後を予測するのに利用可能な方法の必要性は本発明の技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、中ないし高分化型がんの患者のがん細胞増殖を阻害する免疫療法用組成物および治療方法を提供することによってこれらおよびその他の関連する必要性に応える。免疫療法用組成物に対するがん患者のがん細胞の感受性を評価する方法も提供される。本明細書で提示される免疫療法用組成物および治療方法のそれぞれは、がん細胞の分化状態の目安となるがん細胞の等級が、免疫療法の治療方式を施されているがん患者の臨床的予後を予想するという知見に基づく。
【００１３】
一部の実施態様では、本発明は、中ないし高分化型がんの患者から得られる、単離された活性化抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣｓ）を含む免疫療法用組成物を提供する。前記抗原提示細胞は、腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）に生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で曝露することによって刺激される。前記腫瘍関連抗原は、腫瘍特異抗原（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）の場合がある。前記腫瘍関連抗原および／または腫瘍特異抗原は、Ｎ末端部分（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｏｉｅｔｙ）およびＣ末端部分（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｏｉｅｔｙ）を含むタンパク質コンジュゲートの構成部分の場合がある。本発明に従って刺激された前記抗原提示細胞は、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分に対する細胞傷害性細胞免疫応答を起こすＴ細胞の活性化に有効である。Ｔ細胞活性化レベルは、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分のいずれか単独に曝露されるときに前記抗原提示細胞により生じるＴ細胞活性化レベルより高い。特定の好ましい実施態様は、前記抗原提示細胞が樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣｓ）であることを示す。
【００１４】
本発明の免疫療法用組成物は、例えば、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとのような、がんの治療に特に適する。その他のがんも治療できる場合がある。本明細書で例示されるのは、前立腺がんの治療用の免疫療法用組成物である。
【００１５】
前記がんが前立腺がんである実施態様では、前記がんの分化状態は、例えば、グリーソン指数（Ｇｌｅａｓｏｎ ｓｃｏｒｅ）によって決定される場合がある。免疫療法用組成物は、中ないし高分化型がん細胞の存在を示す７以下のグリーソン指数を有する前立腺がんと診断された患者から単離された抗原提示細胞を含む場合がある。一部の実施態様では抗原提示細胞は、ホルモン除去療法（ｈｏｒｍｏｎｅ ａｂｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に抵抗性の前立腺がん患者から単離される。他の実施態様は、前記抗原提示細胞がホルモン除去療法に抵抗性でない患者から単離されることを示す。
【００１６】
本発明のある面は、抗原提示細胞が融合タンパク質であるタンパク質コンジュゲートによって刺激される免疫療法用組成物を提供する。本発明のこれらの面によると、前記融合タンパク質は、Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含み、さらに、１個または２個以上のアミノ酸のリンカーペプチドを含む場合がある。Ｎ末端かＣ末端かのいずれかの原子団は、配列番号１に示す配列（ヒトＰＡＰ）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する配列を含む場合があるか、あるいは、ヒトＰＡＰの活性断片、誘導体または変異体を含む場合がある。他の実施態様は、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分が配列番号１に示す配列を有する免疫療法用組成物を提供する。
【００１７】
他の実施態様では、本発明の免疫療法用組成物は、配列番号３に示す配列（ヒトＧＭ−ＣＳＦ）か、ヒトＧＭ−ＣＳＦの活性断片、誘導体または変異体かと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性があるＣ末端部分またはＮ末端部分を有するタンパク質コンジュゲートで刺激された抗原提示細胞を含む。他の実施態様は、Ｃ末端部分またはＮ末端部分が配列番号３に示される配列を含む免疫療法用組成物を提供する。
【００１８】
より好ましいのは、前記抗原提示細胞が、配列番号１に示す配列（ヒトＰＡＰ）か、ヒトＰＡＰの活性断片、誘導体または変異体かと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性があるＮ末端部分と、配列番号３に示す配列（ヒトＧＭ−ＣＳＦ）か、ヒトＧＭ−ＣＳＦの活性断片、誘導体または変異体かと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性があるＣ末端部分かを含むタンパク質コンジュゲートで刺激される、免疫療法用組成物である。最も好ましいのは、配列番号５に示される配列を含むタンパク質コンジュゲートで刺激される、中ないし高分化型のがん細胞を有する患者から得られた抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物である。
【００１９】
本発明は、中ないし高分化型のがん患者のがん細胞増殖を阻害する方法にも向けられる。１つの実施態様では前記方法は、（ａ）免疫療法用組成物を用いる治療に感受性のある患者であることを示す、中ないし高分化型がん細胞の患者の体内での存在を決定するステップと、（ｂ）前記中ないし高分化型がん細胞の患者に免疫療法用組成物の治療上有効な投与量を投与するステップとを含む。これらの方法によって前記がんの進行が１０％、２５％または５０％減退することは、前記がん細胞の成長阻害を示す。
【００２０】
一部の好ましい実施態様では、本発明は、上記の免疫療法用組成物の１つを用いる、中ないし高分化型がん患者のがん細胞の成長を阻害する方法を提供する。
【００２１】
代替的な関連する実施態様は、（ａ）免疫療法用組成物を用いる治療に感受性のある患者であることを示す、中ないし高分化型がん細胞の患者の体内での存在を決定するステップと、（ｂ）前記中ないし高分化型がんの患者から抗原提示細胞を単離するステップと、（ｃ）Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含むタンパク質コンジュゲートに生体外で曝露することによって前記抗原提示細胞を刺激するステップと、（ｄ）刺激された前記抗原提示細胞の治療上の有効投与量を前記患者に投与するステップとを含み、前記抗原提示細胞は前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分のいずれかに対する細胞傷害性の細胞応答を生じるようにＴ細胞を活性化するのに有効で、前記Ｔ細胞の活性化レベルは、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分を単独で曝露された抗原提示細胞によって生じる活性化レベルより高い、中ないし高分化型がん細胞の患者のがん細胞の成長を阻害する方法を提供する。これらの方法によって前記がんの進行が１０％、２５％または５０％減退することは、前記がん細胞の成長阻害を示す。
【００２２】
これらの方法の一部の面では、前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される。他のがんが本発明の方法によって治療される場合もある。好ましい方法では前記がんは前立腺がんである。前記がんが前立腺がんである実施態様では、前記がんの等級は、例えば、指数が７以下であることが免疫療法用組成物を用いる治療方式に感受性がある患者であることを示すグリーソン指数によって決定される場合がある。
【００２３】
本発明は、免疫療法用組成物を用いる治療に対するがん患者の感受性を評価する方法にも向けられる。代表的な方法は、（ａ）前記患者からがん細胞を含む試料を単離するステップと、（ｂ）前記がん細胞の分化および／または成長速度の特性を決定するステップとを含み、中ないし高分化型がん細胞の存在が、免疫療法用組成物を用いる治療に対する前記がん細胞の感受性を示す。
【００２４】
添付図面とともに以下の詳細な説明を参照することによって、本発明の上記およびその他の特徴と該特徴を実現するやり方とは明らかになり、本発明は最もよく理解されるであろう。本明細書に開示された全ての引用文献は、それらの全体が個別に取り込まれたかのように引用によってここに取り込まれる。
【００２５】
発明の詳細な説明
上記のとおり本発明は、中ないし高分化型がんの患者におけるがん細胞の成長を阻害する免疫療法用組成物および治療方法を提供する。免疫療法用組成物に対するがん細胞の感受性をがん患者で評価する方法も提供される。ここに提示される前記免疫療法用組成物および治療方法のそれぞれは、がん細胞の分化状態の目安であるがん細胞の等級が、免疫療法用組成物を用いる治療方式を施されるがん患者の臨床的予後を予想するといる知見に基づく。低分化型がん細胞は免疫療法の治療方式に抵抗性であることがわかったが、中ないし高分化型細胞は、免疫療法用組成物を用いる治療に対する感受性が高かった。
【００２６】
ここで用いられるところの「分化」という用語は、がん細胞は、同じ組織タイプの正常細胞の外観と類似する程度をいう。分化の程度は、特定のがんの臨床的な挙動と、予後とに相関することがしばしばある。がん細胞の分化状態は、一般的には組織学的な等級化方法で評価される。世界保健機関（ＷＨＯ）と米国がん合同委員会（ＡＪＣＣ）とは、組織学的なパラメータに基づくがん細胞分化評価のための４つの等級からなる同様のシステムを独立に提唱した。等級１（Ｇ１）のがんの細胞は、低い等級の腫瘍を形成する、低分化型で成長の遅い細胞であり、等級１のがんは最も攻撃性が弱い挙動を示す。等級２（Ｇ２）のがん細胞は、やや高分化型で、中程度の攻撃性の挙動を示す腫瘍を形成する。逆に、等級３（Ｇ３）または等級４（Ｇ４）のがんの細胞は、それぞれ低分化型または未分化型で、速く分裂し、最も攻撃性の強い挙動を示す高い等級の腫瘍を形成する。
【００２７】
組織学的な等級は、疾患、特に、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんのようながんの将来の経過および予後を推測するための予後指数としてたびたび利用されるが、組織学的な等級は免疫療法の治療方式の有効性の信頼できる指数として利用してもよいことが既に認識されている。Ｃａｒｒｉａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐ．７５（１）：４０６−４２１（１９９４）。本発明の一部として、高分化型（Ｇ１）および中分化型（Ｇ２）がん細胞は、免疫療法の治療方式に感受性があるが、低分化型（Ｇ３）または未分化型（Ｇ４）細胞は、免疫療法用組成物を用いる治療に抵抗性がある。
【００２８】
１つの実施態様では、前立腺がん細胞の組織病理学的等級を評価し、免疫療法の治療方式で治療される前立腺がん患者の臨床的予後を予想して判定するためのグリーソン指数の応用を提供される。９５％を超える前立腺がんは前立腺上皮細胞由来の腺がんである。粘液腫（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ）または印環細胞腫（ｓｉｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、腺様嚢胞がん、カルチノイド、（内膜型を含む）大前立腺導管がん、腺がんおよび小細胞未分化がんを含む他の稀少な組織学的特徴が記載されてきた。多くの研究が、前立腺腺がんの組織学的分化度の臨床的意義（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ）を確認した。分化の程度は、腺形成パターンにより等級化されるのが典型的で、あまり重要ではないが細胞学的な詳細によって等級化されることもある。前立腺腺がんについて最も広範に受け入れられた等級化法は、グリーソンによって開発された方法である。Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．５０：１２５−１２８（１９６６）、引用によりここにその全体が取り込まれる。グリーソンの原報は、高いグリーソン指数と高い死亡率との相関を証明し、これは他の研究者が確認した。グリーソン指数は、今なお最も広範に適用可能で臨床上有用な組織学的等級化システムである。Ｇｌｅａｓｏｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１１１：５８−６４（１９７４）、Ｇｌｅａｓｏｎ、Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ７：１５（１９８８）、およびＢｏｓｔｗｉｃｋ、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４７：２９７−３１９（１９９７）。
【００２９】
グリーソンの前立腺腫瘍分類システムは、前立腺がんの不均一な分化を認識した２つのレベルの指数化に基づく。標本の支配的な形態と、その正常な外観からの逸脱とに基づいて主要な分化パターンは１ないし５のグリーソン等級に分類される。第２のパターン（すなわち、次に最もありふれたパターン）も１ないし５の等級に分類され、組織構築のパターンに基づいて２から１０までの範囲の指数になる。比較的低いグリーソン指数（すなわち２−４）は高分化型で攻撃性の低いがん細胞を表し、中間のグリーソン指数（すなわち５−７）は中分化型がん細胞と分類され、比較的高いグリーソン指数（すなわち８−１０）は低分化型で攻撃性の高い腫瘍を表す。本発明の一部として、７以下のグリーソン指数を有する前立腺がん細胞、すなわち、中ないし高分化型がん細胞は、一般的に免疫療法の治療方式を用いる治療に感受性があるが、８以上のグリーソン指数を示すがん細胞は一般的にかかる治療モダリティに抵抗性がある。
【００３０】
前立腺腺がんについて組織病理学的パラメータを評価するグリーソンシステムに加えて、広くさまざまながんのタイプの分化状態を記録するための多数の他の相似の組織学的な等級化法が存在する。広範ながんを等級化する方法は当業者に周知で、予後の評価を行うための日常的に利用される。本発明はここに提示されるがんの等級化法の実施例の説明に限定されないことを理解すべきであろう。むしろ、ここに開示される免疫療法の使用方法と、免疫療法の治療方式をに対するがん細胞の感受性を評価する方法とは、中ないし高分化型の等級のがんという特徴を有するがんの治療および評価に広範に利用される場合がある。
【００３１】
膀胱に発生するたいていのがんは、移行細胞がん（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＴＣＣｓ）である。一部の移行細胞がんは、扁平な特徴または腺状の構成部分を有する混合パターンを示す。Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４２：２５０−２５３（１９８９）。これより一般性がない病理学的特徴は、腺がん、扁平上皮がんおよび小細胞がんで、これらはそれぞれ膀胱腫瘍の約６％、２％および１％未満である。腫瘍等級化（典型的には等級ＩないしＩＩＩ）は、分裂像の数、核の異常の有無および異型性に基づく。有意な相関が等級と予後との間に存在する。Ｈｅｎｅｙら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３０：１０８３−１０８６（１９８３）。
【００３２】
産婦人科学国際連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ）は、子宮内膜がんの等級化法を採用した（ＦＩＧＯ等級化システム）。Ｍｉｋｕｔａ、Ｃａｎｃｅｒ ７１：１４６０−３（１９９３）、Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｐｐ ４８−５５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ｔｈｉｒｄ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｆａｓｃｉｃｌｅ ３、１９９２）。古典的な子宮内膜腺がんでは腫瘍等級は独立な予後因子として非常に有意である。低分化型腫瘍は子宮筋層深部への侵入、血管隙（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）への浸潤および悪性度の上昇を含む他の悪い予後因子と相関する。Ｍｏｒｒｏｗら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．４０：５５−６５（１９９１）、ＡａｌｄｅｒｓらＯｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．５６：４１９−４２７（１９８０）、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２７：１８０−１８８（１９８７）、Ｓｕｔｔｏｎら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １６０：１３８５−１３９１（１９８９）、および、Ｗｈａｒｔｏｎら、Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１６２：５１５−５２０（１９８６）。内体（ｃｏｒｐｕｓ）のがん腫は、腺がんの分化度に関して以下のとおり分類される。Ｇ１等級の腺がんは、高分化型で、５％以下の非扁平または非桑実状の固形成長パターンという特徴を有する。Ｇ２等級の腺がんは、中分化型で、６−５０％の非扁平または非桑実状の固形成長パターンという特徴を有する。Ｇ３等級の腺がんは、低分化型で、５０％を超える非扁平または非桑実状の固形成長パターンという特徴を有する。
【００３３】
複数の方法論が子宮がんの等級化に適用された。Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ７０：２−１２（１９９８）。典型的には、等級化は、細胞構築、核多形性および分裂像の計測の評価を通じて達成される場合がある。構築の等級化を通じて、腺状、乳頭状または充実性の腫瘍成長の割合が評価され、腫瘍の５０％を超える部分が組織構築上、腺状、乳頭状または充実性のとき、それぞれ等級１、２または３と分類される。核の多形性は、核の大きさおよび形状と、染色質のテクスチャと、核：細胞質の比と、核小体の数および大きさとの変動を計測することによって決定される。等級１は、胞状の核に比較的均一性があり、核：細胞質の比が小さく、染色質の凝集または著大な核小体がないことを示す。等級２は、核の大きさ（２：１ないし４：１）および形態にのばらつきがあり、核小体が小さいが識別可能で、一部の染色質は凝集し、変形細胞（ｂｉｚａｒｒｅ ｃｅｌｌ）が存在しない場合である。等級３は、核の大きさ（４：１を超える）および形態に著しいばらつきがあり、核：細胞質の比が大きく、著大な染色質の凝集があり、角膜が肥厚し、好酸球の核小体が肥大し、変形細胞が存在することを示す。分裂像の計測は、核分裂像（ＭＦ）の存在に焦点を当て、中期、後期または終期の明確な形態学的特徴を幽する核が高倍率顕微鏡視野（ＨＰＦ）で数えられる。９ＭＦ／１０ＨＰＦ（１０枚の高倍率顕微鏡視野あたり９個の分裂像）以下が等級１に分類され、１０ないし２４ＭＦ／１０ＨＰＦが等級２に分類され、２５ＭＦ／１０ＨＰＦが等級３に分類される。代替的には、内膜腺がん（上記参照）に由来するＦＩＧＯ等級は、婦人科がんグループの病理委員会（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＧＯＧ））によって採用されたとおりに利用される場合がある。Ｂｅｎｄａら、ＧＯＧ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂｕｆｆａｌｏ、１９９４）。ＦＩＧＯ等級は、腺状または乳頭状の構造対充実型腫瘍成長の比に基づく（等級１は充実性腫瘍が５％未満、等級２は充実性腫瘍が６−５０％、等級３は充実性腫瘍が５０％を超える）。
【００３４】
乳がんは、腺および管の形成と、細胞の大きさと、核の大きさおよび分化度（核の多形性）と、核過染症の程度と、分裂活性とに応じて、３段階の組織学的悪性度に分類されてきた。Ｂｌｏｏｍら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１：３５９（１９５７）、および、Ｓｃｈａｒｆら、Ｌａｎｃｅｔ ２：５８２（１９３８）。組織学等級１の乳がんは高分化型、等級２は中分化型、そして、等級３は低分化型として識別される。より具体的には、腫瘍領域の少なくとも７５％に明確な管形成が認められるときにはスコア１点が与えられ、腫瘍領域の１０％未満に明確な管形成が認められるときにはスコア３点が割り当てられ、これらの中間のカテゴリーにはスコア２点が与えられる。さらに、核の多形性および／または分裂速度が、乳がんに組織学等級を割り当てるために評価される場合がある。ばらつきがほとんどなく、核が外観上全く規則正しい場合には、スコア１点が割り当てられる場合があり、複数の核小体が存在する場合にはスコア３点が与えられる。１０枚の高倍率視野あたり１０個の分裂像未満であるという特徴がある乳がんはスコア１点が割り当てられ、１０枚の高倍率視野あたり２０個の分裂像を超えることはスコア３点であることを示す。これらの３種類のスコアが合計されて等級が決まる。等級１のがんは、スコア合計が３点（可能な最低スコア）、４点または５点で、等級２は６または７点のスコア合計に割り当てられ、等級３（高い合計組織学等級）が合計８または９点のスコアの症例に与えられる。
【００３５】
軟組織肉腫は国立がん研究所によって提唱された方法論に従って等級化されるのが一般的である。Ｃｏｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ ５３：５３０−４１（１９８４）。一般に、多形性があって、細胞が多くて、分化度が低い腫瘍ほど予後が悪い。がんの等級を評価するために測定されるパラメータのなかには、分裂像の数、粘液様領域の有無、ネクローシスの程度および腫瘍の分化度がある。代替的には、ＥＯＲＴＣ等級システムが軟組織肉腫のがん等級をつけるために利用される場合がある。ＥＯＲＴＣシステムでは、分裂像の計測数とネクローシス値が以下の式で関係づけられる。
スコア＝（０．７３２ｘネクローシス）＋（０．８７３ｘ分裂像の数）
Ｖａｎ Ｕｎｎｉｋ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎ．ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ９（３）：６７７−７００（１９９５）、ａｎｄ Ｃｏｉｎｄｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９Ａ：２０８９−２０９３（１９９３）。このシステムによって、ＩないしＩＶの等級がつけられるが、このうち等級ＩおよびＩＩはそれぞれ高分化型および中分化型がん細胞に対応し、等級ＩＩＩは低分化型がん細胞に対応し、等級ＩＶは未分化型がん細胞に対応する。
【００３６】
骨肉腫は、病巣細胞の細胞学的特徴または産物に依存するメイヨー・クリニックによって提唱された案に従って分類されるのが一般的である。Ｄａｈｌｉｎら、Ｂｏｎｅ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｄａｔａ ｏｎ ８５４２ Ｃａｓｅｓ、ｅｄ．４．（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＩＬ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ、１９８６）。骨肉腫、繊維肉腫および悪性繊維性組織球腫は１ないし４のスケールで等級化される。軟骨肉症および悪性脈管腫は１ないし３のスケールで等級化される。骨肉腫は、等級３または４で等級の高い腫瘍であることが一般的で、本発明の免疫療法の治療方式に向かない場合がある。免疫療法の治療方式に適する等級１および２の骨肉腫は稀である。かかるがんは、わずかな程度の低細胞性でかつ細胞学的な退形成で特徴づけられる。軟骨肉腫は、主に細胞充実性、核の大きさおよび過染色症に基づいて等級化される。利用された他の計測値は、分裂速度と、（１個の小腔内に２個または３個以上の核がある）多核腫瘍細胞の割合とである。等級１の高分化型がんは、核の大きさがわずかないしやや増大し、形態にばらつきがある、軟骨細胞を含む。たまに多核細胞が存在し、分裂活性はほぼない。軟骨様マトリクスは豊富でネクローシスはほとんどない。等級２の中分化型の病巣は、細胞がもっと多く、等級１の腫瘍に比べて核の異型性および過染色症の程度が高い。多核細胞がより頻繁に存在し、たまに分裂像が認められる場合がある。これらの腫瘍は、等級１の病巣よりも軟骨様マトリクスが少ない。粘液様の間質の変化とネクローシスとが共通して認められる特許球３の低分化型のがんは、（特に腫瘍葉（ｔｕｍｏｒ ｌｏｂｅｓ）の辺縁で）細胞数が多く、多形性で、容易に同定可能な核の退形成を示す。軟骨肉腫の大多数は当局面μ１または２である。Ｉｎｗａｒｄｓら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、９（３）：５４５−５６９（１９９５）を参照せよ。
【００３７】
ＷＨＯ分類の悪性度スケールは、星状細胞腫の組織学的等級化について最も一般的に受け入れられたものである。Ｋｌｅｉｈｕｅｓら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．３：２５５−２６８（１９９３）、Ｋｌｅｉｈｕｅｓら、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９３）、Ｄａｕｍａｓ−Ｄｕｐｏｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ ６２：２１５２−６５（１９８８）、および、Ｋｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：２７−３７（１９９１）。等級１の高分化型星状細胞腫は、双極性で「毛様（ｐｉｌｏｉｄ）」の細胞と、Ｒｏｓｅｎｔａｌ繊維と、好エオジン性顆粒状体を有する。等級２の中分化型星状細胞腫は、腫瘍性繊維状または大円形星細胞と核の多形性とを特徴とする。等級３の低分化型星状細胞腫は、等級２の星状細胞腫に分裂活性の存在が加わる。等級４の未分化型星状細胞腫は、細胞退形成、核の多形性、分裂像、脈管増殖およびネクローシスを示す。
【００３８】
免疫療法用組成物
本発明の一部の実施態様では、上記の定義の等級１または２を示すがん細胞のような中ないし高分化型がん細胞を特徴とするがんの治療葉の免疫療法用組成物が提供される。一部の実施態様では、ここで代表的な免疫療法用組成物は、中ないし高分化型がんと診断された患者から得られた、活性化され単離された抗原提示細胞を含む。抗原提示細胞は、該抗原提示細胞がＴ細胞を活性化してＮ末端部分またはＣ末端部分のいずれかに対する細胞傷害性細胞応答を起こすのに効果があるようなＮ末端部分およびＣ末端部分を含むタンパク質コンジュゲートに対して生体外で曝露されることによって刺激される。免疫療法用組成物によって達成されるＴ細胞活性化レベルは、Ｎ末端部分またはＣ末端部分いずれか単独に曝露された抗原提示細胞によって生じるレベルよりも高い。
【００３９】
（ａ）抗原提示細胞および樹状細胞
ここで用いられるところの「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、Ｔ細胞を活性化することができる細胞を指し、ある種のマクロファージと、Ｂ細胞と、最も好ましくは、樹状細胞（ＤＣｓ）とを含むがこれらに限られない。「強力な（ｐｏｔｅｎｔ）抗原提示細胞」は、抗原にパルス刺激された後、ナイーブなＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を一次免疫応答で活性化できる細胞である。「樹状細胞」または「ＤＣｓ」は、リンパ組織または非リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞タイプの多様な集団の構成員である。これらの細胞は、独特な形態と、表面ＭＨＣ−クラスＩＩの高レベル発現とを特徴とする。引用によりここに取り込まれる、Ｓｔｅｉｎｍａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１（１９９１）。抗原提示細胞および樹状細胞は、多数の組織供給源から単離可能で、ここに説明される末梢血から単離することが便利である。本発明の好ましい免疫療法用組成物は、中ないし高分化型がんと診断されたがん患者から単離された抗原提示細胞または樹状細胞を用いる。
【００４０】
抗原提示細胞および樹状細胞は、当業者に容易に利用可能な日常的な方法論によって単離される場合がある。樹状細胞を単離するための代表的な適当な方法論は、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に開示される。簡潔に、バフィー・コート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）が末梢血から調製される場合がある。細胞は、ロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）から回収され、遠心管または遠心器具中の（引用によりここに取り込まれるＤｏｒｎの米国特許第４，９２７，７４９号明細書に記載のとおり調製された）１．０７７０ｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの密度の有機シラン化コロイドシリカ（ＯＣＳ）分離メディウムのカラム上に重層される場合がある。前記ＯＣＳメディウムは、コロイドシリカ（約１０−２０ｎｍの粒径）のシラノール基をアルキルトリメトキシシラン試薬と反応させてブロッキングすることにより調製されることが好ましい。
【００４１】
１つの実施態様では、前記ＯＣＳ密度勾配材料は、シグマ・ケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）から入手可能なＰＶＰ−１０のようなポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加した生理食塩水中で希釈される。前記試験管は遠心され、界面に存在する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が回収される。
【００４２】
末梢血単核細胞は、再懸濁され、結晶板を除去するために再度遠心され、任意的に、ＯＣＳカラム（密度１．０６５０ｇ／ｍＬ、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ）を通過するように遠心される場合がある。得られた界面およびペレットのＴ細胞は回収され、遠心によりＤ−ＰＢＳで洗浄される。前記ペレットの分画は、細胞培養液中に再懸濁され、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ中で４０時間培養される。インキュベーション後、非接着性のＴ細胞が回収される。前記界面の樹状細胞の精製度はＦＡＣＳ分析によって定量化される場合がある。
【００４３】
前記細胞の形態は、光学顕微鏡を用いて評価できる。樹状細胞濃縮分画は、樹状細胞の特徴である、細胞表面から伸びる細胞質突起がある大型のヴェール細胞を含む。
【００４４】
（ｂ）タンパク質コンジュゲート
上記のとおり、本発明の代表的な免疫療法用組成物は、タンパク質コンジュゲートを用いて生体外で刺激された抗原提示細胞または樹状細胞を含む場合がある。好ましいタンパク質コンジュゲートは、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」または「がん遺伝子産物」の少なくとも一部を含むＮ末端部分と、「抗原提示細胞結合タンパク質」か、より好ましくは、「樹状細胞結合タンパク質」の少なくとも一部を含むＣ末端部分とを含む。同等に好ましいのは、「腫瘍関連抗原」または「がん遺伝子産物」の少なくとも一部を含むＣ末端部分と、「抗原提示細胞結合タンパク質」または「樹状細胞結合タンパク質」の少なくとも一部を含むＮ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートである。
【００４５】
ここで用いられるところの「腫瘍関連抗原」という用語は、特定の腫瘍組織を含む、組織タイプに特徴的な抗原を指す。腫瘍組織によって発現される腫瘍関連抗原の例は、全前立腺腫瘍の９０％を超える腫瘍に存在する、前立腺酸性フォスファターゼ抗原である。「がん遺伝子産物」という用語は、細胞のトランスフォメーションに関連する遺伝子によってエンコードされるいずれかのタンパク質を指す。がん遺伝子産物の例は、例えば、Ｈｅｒ２、ｐ２１ＲＡＳおよびｐ５３を含む。
【００４６】
「抗原提示細胞結合タンパク質」および「樹状細胞結合タンパク質」という用語は、いずれかのタンパク質であって、該タンパク質に対するレセプターがそれぞれ、抗原提示細胞または樹状細胞に発現するタンパク質を指す。抗原提示細胞結合タンパク質および樹状細胞結合タンパク質の例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８およびＦＬＴ−３リガンドを含むがこれらに限られない。
【００４７】
ここで開示される「タンパク質コンジュゲート」は、Ｎ末端部分とＣ末端部分との間に形成される共有結合複合体を指す。腫瘍関連抗原／腫瘍特異抗原／がん遺伝子産物と、抗原提示細胞結合タンパク質／樹状細胞結合タンパク質との間のタンパク質コンジュゲートは、化学的に複合体を形成するか、あるいは、以下に詳細に説明されるとおりの融合タンパク質として複合体を形成する。
【００４８】
ここの例示される免疫療法用組成物は、中ないし高分化型の前立腺がんと診断された患者から得られた活性化され単離された抗原提示細胞を含む。前記抗原提示細胞は、前記粒子Ｃ末端は、前立腺腫瘍関連タンパク質のヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ｈｕＰＡＰ）の一部を含むＮ末端部分と、抗原提示細胞／樹状細胞結合タンパク質のヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）の一部を含むＣ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートに生体外で曝露することによって刺激された。このようにして刺激された抗原提示細胞は、Ｔ細胞を活性化してＮ末端のＰＡＰ原子団に対する細胞傷害性の細胞応答を生じさせるうえで効果があった。この代表的な免疫療法用組成物によって達成されたＴ細胞活性化のレベルは、ＰＡＰ単独に曝露された抗原提示細胞によって生じるＴ細胞活性化レベルより高かった。
【００４９】
ここに開示される代表的なＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦタンパク質コンジュゲートは、既に米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に説明され、本明細書で配列番号５として提供される。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。このタンパク質コンジュゲートは、ＰＡＰのＮ末端側３８６個のアミノ酸部分と、Ｃ末端側１２７個のアミノ酸部分との融合タンパク質である。ｈｕＰＡＰおよびｈｕＧＭ−ＣＳＦの完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および３としてここに提供される。さらに、配列番号５のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦタンパク質コンジュゲートは、Ｎ末端部分とＣ末端部分との間に、ｇｌｙ−ｓｅｒという配列を有する２個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを含む。
【００５０】
本発明の実施に同等に適するのは、ＰＡＰおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの部分のアミノ酸配列内に配列の変異を含む融合タンパク質を含むＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦタンパク質コンジュゲートである。例えば本発明は、ＰＡＰおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの部分がそれぞれ配列番号１および３に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質コンジュゲートを意図する。より好ましいのは、それぞれ配列番号１および３に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０、９０、９５および９８％の同一性を有するＰＡＰおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの部分である。
【００５１】
上記に指摘されたとおり、タンパク質の複合体は、従来の結合技術のような化学的な手段で形成される場合もあれば、ＤＮＡコンストラクトの発現によって生成される融合タンパク質として形成される場合もある。化学的結合か融合タンパク質かを問わず、タンパク質複合体を生成する方法は周知で当業者には容易に利用可能である。例えば、Ｎ末端およびＣ末端の原子団は、２つのペプチドの間にペプチド結合を形成させるために、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）のような脱水試薬を用いて結合させる場合がある。代替的には、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いる、スルフヒドリル基、エプシロンアミノ基、カルボキシル基その他のポリペプチドに存在する官能基で形成される場合がある。
【００５２】
融合タンパク質を作成するための従来の分子生物学および組換えＤＮＡ技術は、文献に全て説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ、編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ、編、１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照せよ。これらの刊行物は引用によりその全体がここに取り込まれる。
【００５３】
簡潔には、前記ポリペプチドの構成部分をエンコードするＤＮＡ配列が別々に組み立てられ、適当な発現ベクターに連結される場合がある。１個のポリペプチド構成部分をエンコードするＤＮＡ配列の３‘末端は、ペプチドリンカーとともに、あるいはペプチドリンカーなしで、第２のポリペプチド構成部分をエンコードするＤＮＡ配列の５’末端と、前記配列読み枠が合うように連結される。これは、両方の構成部分のポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質になるように翻訳することを可能にする。
【００５４】
ペプチドリンカー配列は、第１および第２のポリペプチド構成部分を、各ポリペプチドが２次構造および３次構造をとるようにフォールディングすることを担保するのに十分な距離を隔てて離すために用いられる場合がある。かかるペプチドリンカー配列は、当業者に周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に取り込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、（１）柔軟な拡張コンホメーションをとることができること、（２）第１および第２のポリペプチドの機能エピトープと相互作用できる２次構造をとることができないこと、および、（３）前記ポリペプチドの機能エピトープと反応するかもしれない疎水残基または荷電残基がないことという要因に基づいて選択される場合がある。好ましいペプチドリンカー配列は、グリシン、アスパラギンおよびセリン残基を含む。スレオニンおよびアラニンのようなタンパク質および中性アミノ酸が前記リンカー配列に用いられる場合もある。リンカーとして有用に利用される場合があるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６（１９８５）、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２（１９８６）、米国特許第４，９３５，２３３号明細書および米国特許第４，７５１，１８０号明細書に開示されたものを含む。前記リンカー配列は、１から約５０個のアミノ酸の長さであるのが一般的である。リンカー配列は、機能性ドメインを分離して立体障害を防止するための用いることができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有するときには必要がない。
【００５５】
連結された前記ＤＮＡ配列は、適当な転写または翻訳の調節エレメントに操作可能に連結される。ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントは、第１のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の５’側だけに位置する。同様に、翻訳を終了させるのに必要な停止コドンと、転写ターミネータ信号は、第２のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の３’側だけに存在する。
【００５６】
一般に、ここで説明される（融合タンパク質を含む）ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、もともとの環境から除去されたものをいう。例えば、天然タンパク質は、天然のシステム中に共存する材料の一部または全てから分離される場合に単離されるという。好ましくは、かかるポリペプチドは少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも約９５％純粋であり、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないベクターにクローン化される場合に単離されていると考えられる。
【００５７】
Ｎ末端部分およびＣ末端部分の間のタンパク質複合体は、前立腺がんの株細胞からヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）をクローン化し、ＰＢＭＮＣライブラリからヒトＧＭ−ＣＳＦをクローン化することによって作成されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質によってここに代表されるような融合タンパク質として組換えによって作成される場合がある。ＰＡＰのコーディング領域の３’末端の停止コドンは、標準的な突然変異誘発法によって除去され、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に置換されて、ＰＡＰをエンコードするＤＮＡをＧＭ−ＣＳＦをエンコードするＤＮＡに読み枠が合うように融合して、Ｎ末端のＰＡＰとＣ末端のＧＭ−ＣＳＦの部分の間に並置されたポリペプチドリンカーのｇｌｙ−ｓｅｒをエンコードする６個のヌクレオチド領域を生成することを促進した。
【００５８】
ここで例示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の文脈で以上のとおり説明されたように、本発明のタンパク質複合体は、腫瘍関連抗原、がん遺伝子産物または抗原提示細胞／樹状細胞結合タンパク質の機能特性に悪影響を伴わないＮ末端および／またはＣ末端部分の変異体を含む。ここで用いられるポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」とは、該ポリペプチドまたはタンパク質の機能活性が実質的に減少しないような、１個または２個以上の置換、欠失、付加および／または挿入によって天然のポリペプチドまたはタンパク質と異なる、ポリペプチドまたはタンパク質をいう。換言すると、抗原提示細胞または樹状細胞と反応し、あるいは、抗原提示細胞または樹状細胞によって処理される変異体の能力は、天然タンパク質と比較して増強されるか変化しない場合があり、あるいは、得られる免疫療法用組成物の有効性に影響を与えることなく、天然タンパク質と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満に減少する場合がある。
【００５９】
かかる変異体は、前記Ｎ末端および／またはＣ末端の部分のアミノ酸配列の改変をすること、前記改変を行ったポリペプチドの、抗原提示細胞／樹状細胞との反応性か、天然の腫瘍関連抗原またはがん遺伝子産物に対して作成された抗血清との反応性かを評価することによって同定されるのが一般的である。かかる改変および評価は、当業者に周知の分子細胞生物学の技術の日常的な応用を通じて端正される場合がある。
【００６０】
好ましい変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメインのような１個または２個以上の部分が除去された変異体を含む。その他の好ましい変異体は、小さい部分（例えば、１−３０個、好ましくは５−１５個のアミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された変異体を含む。ポリペプチド変異体は、天然のポリペプチドまたはタンパク質との配列の同一性が、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％または９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％または９８％である。
【００６１】
変異体は、１個のアミノ酸が類似の特性を有する他のアミノ酸に置換されて、ペプチド化学の当業者が当該ペプチドの２次構造および親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）は実質的に変化しないと予測するような置換として定義される、「保存的アミノ酸置換」を含むのが好ましい。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行われる場合がある。例えば、負荷電を有するアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸で、正荷電を有するアミノ酸はリジンおよびアルギニンで、類似の親水性度を有する荷電をもたない極性側鎖（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリンと、グリシンおよびアラニンと、アスパラギンおよびグルタミンと、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンとである。宿主村的変化を表す他のグループのアミノ酸は、（１）アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニンと、（２）システイン、セリン、チロシン、スレオニンと、（３）バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニンと、（４）リジン、アルギニン、ヒスチジンと、（５）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンとを含む。変異体は、また、あるいは、代替的に、非保存的な変化を含む場合がある。
【００６２】
変異体は、追加的に、あるいは、代替的に、例えば、当該ペプチドの免疫原性、２次構造および親水性に最小限の影響しか及ぼさないアミノ酸の欠失または付加によって改変される場合がある。
【００６３】
上記のとおり、ポリペプチドまたはタンパク質は、翻訳中（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に該タンパク質の輸送を導くタンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列を含む場合がある。
【００６４】
ポリペプチドは、さまざまな周知技術のいずれかを用いて調製される場合がある。上記のＤＮＡ配列にエンコードされる組換えポリペプチドは、当業者にしられたさまざまな発現ベクターのいずれかを用いて前記ＤＮＡ配列から容易に調製される場合がある。発現は、組換えポリペプチドをエンコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターでトランスフォメーションまたはトランスフェクションされたいずれかの適当な宿主細胞において達成される場合がある。適当な宿主細胞は原核生物、酵母および高等真核細胞を含む。利用される宿主細胞は、大腸菌か、酵母か、ＣＯＳまたはＣＨＯのようなほ乳類の株細胞かであることが好ましい。組換えタンパク質またはポリペプチドを培養液中に分泌する適当な宿主／ベクター系からの上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮される場合がある。濃縮に続いて、濃縮液はアフィニティマトリクスまたはイオン交換樹脂のような適当な精製マトリクスに適用される場合がある。最後に、１回または２回以上の逆相ＨＰＬＣのステップが組換えポリペプチドをさらに精製するために用いられる場合がある。
【００６５】
約１００個未満のアミノ酸、一般的には約５０個未満のアミノ酸を有する部分その他の変異体は、当業者に周知の技術を用いて合成手段によって作成される場合もある。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が順次成長するアミノ酸鎖に付加される、メリーフィールド固相合成法のような市販の固相法のいずれかを用いて合成される場合がある。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６(１９６３）を参照せよ。ポリペプチドの自動合成葉装置は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ部門（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）のような業者から市販されており、製造者の指示書に従って運転される場合がある。
【００６６】
一部の特定の実施態様では、ポリペプチドは、ここで説明する複数のポリペプチドを含む融合タンパク質か、ここで説明する少なくとも１個のポリペプチドと既知の腫瘍タンパク質のような無関係の配列とを含む融合タンパク質かの場合がある。融合のパートナーは、例えば、Ｔヘルパーのエピトープ提供し（免疫学的融合パートナー）、好ましくは、ヒトに認識されるＴヘルパーエピトープを提供することについて補助する場合があり、あるいは、天然の組換えタンパク質よりも高収量で該タンパク質を発現することについて補助する（発現エンハンサー）場合がある。ある種の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現エンハンサーとの両方である。他の融合パートナーは、前記タンパク質の溶解度を増大させるか、所望の細胞内コンパートメントにターゲティングすることを可能にするように選択される場合がある。さらに別の融合パートナーは、前記タンパク質の精製を容易にするアフィニティタグを含む。
【００６７】
代替的な免疫療法用組成物
上記のとおり、一部の実施態様では本発明は、中ないし高分化型のがん細胞を有するがん患者の治療に１個または２個以上の免疫療法用組成物を用いる方法を提供する。上記の免疫療法用組成物に加えて、これらの方法は、当業者が容易に利用できるか、日常的な実験作業で調製できる他の免疫療法用組成物を用いる場合がある。
【００６８】
一部の実施態様では免疫療法用組成物は、治療が、（ここに提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドのような）免疫応答修飾剤の投与で腫瘍に対して反応するように内在する宿主免疫系を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で刺激することに依存する、能動的な免疫療法剤を含む場合がある。
【００６９】
他の実施態様では、免疫療法用組成物は、治療が、抗腫瘍効果を直接的または間接的に仲介することができ、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）の宿主免疫系に必ずしも依存しない、（エフェクター細胞または抗体のような）確立された腫瘍免疫活性を有する薬剤を送達することを伴う、受動的な免疫療法剤を含む場合がある。エフェクター細胞の例は、上記のＴ細胞と、（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球のような）Ｔリンパ球と、（ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞のような）キラー細胞と、Ｂ細胞と、ここに提供されるポリペプチドを発現する（樹状細胞およびマクロファージのような）抗原提示細胞とを含む。ここに列挙されるポリペプチドに対して特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、獲得免疫療法のためにクローン化され発現されて他のベクターまたはエフェクター細胞に導入される場合がある。
【００７０】
ここに説明される免疫療法用組成物は、がんに対する免疫応答を刺激するために用いられる場合がある。免疫療法用組成物は、原発腫瘍の外科的除去および／または放射線療法または従来の化学療法剤のような治療の前か、後かのいずれかに投与される場合がある。前記免疫療法用組成物の投与は、静注、腹腔内注射、筋注、皮下注射、経鼻、皮内、経肛門、経膣、局所および経口の経路での投与を含む、いずれかの適当な方法によって投与される場合がある。
【００７１】
これらの方法に用いられるのに適当な免疫療法用組成物は、例えば、免疫療法用ポリペプチド、免疫療法用抗体、ポリヌクレオチド利用抗がんワクチン、細胞利用免疫療法剤と、１個または２個以上のポリペプチド利用、抗体利用、ポリヌクレオチド利用および／または細胞利用免疫療法剤を含む組み合わせ組成物を含む。ここに提供される免疫療法用組成物のそれぞれは、免疫応答の増幅および／または抗原特異的トレランスの打破のうちの１つまたは２つ以上の特性を共有する。
【００７２】
（ａ）免疫療法用ポリペプチド
上記のタンパク質複合体に加えて、本発明は、中ないし高分化型がん細胞を特徴とするがんの治療用の免疫療法用ポリペプチドの使用を意図する。したがって、本方法に使用するのに適するポリペプチドは免疫原性ポリペプチドを含むが、ここで免疫原性とは、前記ポリペプチドが、がん患者から単離された抗血清および／またはＴ細胞を用いる、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞刺激アッセイのような免疫アッセイで検出可能なように反応する前記ポリペプチドの能力として定義される。免疫原活性についてスクリーニングするための方法は、当業者に周知である。例えば代表的なスクリーニング方法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）に開示されている。したがってポリペプチドは、固相支持体に固定され患者の血清と反応させられて、該血清中の抗体と固定化された前記ポリペプチドとの結合ができる場合がある。未結合の血清は除去され、結合した抗体は、例えば検出可能な標識付きのプロテインＡを用いて検出される場合がある。
【００７３】
本発明で用いるのに適当な代表的なポリペプチドは、例えば、軟組織肉腫か、リンパ腫か、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、遺伝子、卵巣、膵臓、副腎または前立腺のがんかのようながんの患者から単離された試料を含む、組織および／または腫瘍の試料での発現レベルの上昇を示すポリペプチドのような腫瘍関連および／または腫瘍特異ポリペプチドを含むのが最も典型的である。他のがんで発現を上昇させるものとして同定されたポリペプチドも用いるのに適する場合がある。腫瘍試料のかなりの部分、例えば、検査された試料中の約２０％を超えるか、約３０％を超えるか、約５０％を超えるか、それ以上かの試料において、正常組織での発現レベルの少なくとも２倍、最もありふれたものでは少なくとも５倍を超えるレベルで発現するポリペプチドも含まれる。
【００７４】
かかる腫瘍関連および／または腫瘍特異ポリペプチドの免疫原性部分が、本発明の方法で利用される場合があることが当業者には理解されるであろう。「免疫原性部分」とは、ここでは、免疫原性ポリペプチドと特異的に結合するＢ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターと免疫学的に反応する、免疫原性ポリペプチドの断片として定義される。免疫原性部分は、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ ｅｄ．、２４３−２４７(Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３）に提示される方法を含む日常的な方法を用いて同定できる場合がある。代表的な技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることを含む。
【００７５】
ポリペプチドの免疫原性部分は、完全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで抗血清および／またはＴ細胞と反応する配列を含む。前記免疫原性部分の免疫原活性レベルは、典型的には、前記完全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％、より典型的には少なくとも約７０％、最も典型的には約９０％を超える。
【００７６】
したがって、本発明の方法で有用な免疫療法用ポリペプチドは、上記の１個または２個以上の腫瘍特異的および／または腫瘍関連ポリペプチドと免疫学的に反応するＴ細胞および／または抗体を誘発できる。
【００７７】
腫瘍特異的および／または腫瘍関連ポリペプチドは患者の免疫系によって「自己」ポリペプチドとして認識される場合があり、したがって、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の刺激剤としてはよくない場合があることは当業者に明らかであろう。したがって本発明は、異種ポリペプチド特に前記腫瘍関連および／または腫瘍特異的ポリペプチドの免疫原性部分を含む異種ポリペプチドが本発明の方法において代替的に使用される場合があることも意図する。したがって、かかる異種ポリペプチドの使用は、特定の自己ポリペプチドに対する免疫トレランスを克服するために用いられる場合がある。代表的な異種ポリペプチドは、マウス、ラット、サル、ブタおよび／またはその他のヒト以外の動物から単離されたポリペプチドを含む。
【００７８】
上記の融合タンパク質と同様に、本発明のポリペプチドは、当業者に用意に利用可能なさまざまな周知の合成および／または組換え技術のいずれかを用いて調製される場合がある。約１５０個のアミノ酸未満のポリペプチド、部分その他の変異体は、例えば、上記のメリーフィールド固相合成法のような市販の固相技術のいずれかを用いて、合成手段によって作成される場合がある。
【００７９】
（ｂ）ポリヌクレオチドおよびポリペプチド利用療法剤
ここに提供される中ないし高分化型がんの治療法は１個または２個以上の抗がんワクチンを用いる場合があり、該ワクチンの最もありふれたものはポリヌクレオチド利用抗がんワクチンである。特定の抗がんワクチンの具体的な特徴に関係なく、これらは全て抗がん免疫応答を刺激する能力を共有する。前記ワクチンの抗原性のある部分は、上記に開示されたペプチド、タンパク質および融合タンパク質の形状で送達される場合および／または例えばＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスその他の当業者に知られたウイルスのようなポリヌクレオチドの形状で送達される場合がある。
【００８０】
したがって、本発明の方法は、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを用いる場合があり、（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡのような）ＤＮＡか、（ＨｎＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）ＲＮＡかの場合がある。適当なポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドおよび部分を含む、免疫原性ポリペプチドまたはその部分をエンコードする内在配列を含むのが最も典型的である。
【００８１】
免疫療法用ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローン化部位、その他のコーディングセグメント等のような、前記ポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドの発現を増強および／または促進するその他のＤＮＡ配列とともに組み合わされる場合がある。
【００８２】
ポリヌクレオチドは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて普通に実行されるような、化学的手段によって断片を直接合成することによって、容易に調製される場合がある。代替的には、断片は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書のＰＣＲ（商標）技術のような核酸複製技術を応用すること、選択された配列を組換え産生用の組換えベクターに導入すること、その他の当業者に一般的に知られた組換えＤＮＡ技術によって得られる場合がある。一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）を参照せよ。
【００８３】
免疫療法用ポリペプチドを発現する適当なポリヌクレオチドは、例えば、腫瘍関連および／または腫瘍特異的な発現（すなわち、別の組織および／または正常組織での発現よりも少なくとも２倍の発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって同定される場合がある。代表的な適当なマイクロアレイスクリーニング技術は、アフィメトリクス社（カリフォルニア州、サンタクララ）の技術を含み、製造者の指示書に従って利用される場合がある。Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９(１９９６）および、Ｈｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５(１９９７）を参照せよ。
【００８４】
所望のポリペプチドの発現は、対応するポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することによって達成される場合がある。免疫療法用ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの発現を達成する代表的な技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、同上、および、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同上に提供される。
【００８５】
さまざまな発現ベクター／宿主細胞系が腫瘍関連および／または腫瘍特異的なポリヌクレオチドを発現するために用いられる場合がある。発現システムは、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物か、酵母発現ベクターで形質転換された酵母か、ウイルス発現ベクターを感染した昆虫細胞系か、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系か、動物細胞系かを含む。
【００８６】
関心のある免疫療法用ポリペプチドを発現することに加えて、かかるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが、当業者に知られたさまざまな送達システムのうちのいずれか１つを利用することによって患者に投与される場合がある。代表的な遺伝子送達技術は、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３−１９８(１９９８）およびその引用文献に記載される。適当な発現システムは、前記患者における発現のためのＤＮＡ調節配列（すなわち、プロモーターおよび転写終結シグナル）を含むであろう。最もありふれている患者でポリヌクレオチドを発現するシステムは、ウイルスを利用するシステムである。例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルスおよびアルファウイルスを利用したシステムは全て記載されている。
【００８７】
適当なレトロウイルス利用遺伝子発現システムは、米国特許第５，２１９，７４０号明細書、Ｍｉｌｌｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０(１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４(１９９０）；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２(１９９１）；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７(１９９３）；および Ｂｏｒｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９(１９９３）に記載されている。
【００８８】
代表的なアデノウイルス利用システムは、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４(１９８６）；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１(１９９３）；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９(１９９４）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８−９３３−９４０(１９９４）；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８(１９９４）；Ｂｅｒｋｎｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９(１９８８）；および Ｒｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６(１９９３）に提示される。
【００８９】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）利用遺伝子発現システムは、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号明細書、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６(１９８８）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５３３−５３９(１９９２）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９(１９９２）；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１(１９９４）；Ｓｈｅｌｌｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９(１９９４）；および Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５(１９９４）に開示される。
【００９０】
（ｃ）免疫療法用抗体
免疫療法用抗体は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体が典型的である。例えばＰＡＰに対する免疫は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルスワクチンを用いるワクチン処理によるＰＡＰに対する免疫応答の誘導と同様に、ＰＡＰ特異的なモノクローナル抗体の注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によっても誘導できる。かかる抗体は、生体内で前記抗原と結合して抗原提示細胞を該抗原に導く。抗原提示細胞が前記腫瘍内にこのように誘導されて侵入した後、前記抗体はワクチンと同様の腫瘍特異的免疫を誘導する。かかる腫瘍特異的抗体の他の標的は、当業者に周知のである。前記標的は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＶＥＧＦその他の腫瘍関連抗原を含む。
【００９１】
したがって、本発明の方法は、前記抗原に特異的に結合して、免疫応答を誘導する、１個または２個以上の抗体または該抗体の抗原結合断片を利用する場合がある。より具体的には抗体および／または抗原結合断片は、腫瘍関連抗原および／または腫瘍特異抗原への免疫学的結合および／またはこれらの異種変異体への免疫学的結合を示す。抗体またはその抗原結合断片がある免疫療法用ポリペプチド抗原と「特異的な結合」および／または「免疫学的な反応」を行うといえるのは、前記抗体またはその抗原結合断片が前記ポリペプチドとは（例えばＥＬＩＳＡアッセイによって）検出可能なレベルで反応するが、同様の条件下では無関係のポリペプチドとは検出可能な反応をしない場合である。
【００９２】
免疫学的結合とは、抗体と、免疫グロブリンが特異的な抗原との間での非共有結合を指す。免疫学的結合相互作用のアフィニティは、該相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表現されるのが一般的で、Ｋｄが小さいほどアフィニティが高いことを表す。抗体と、そのコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）なポリペプチドとの免疫学的結合特性は、当業者に周知の方法を用いて定量化される場合がある。１つの代表的な方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを含み、これらの速度は、前記複合体のパートナーの濃度と、前記相互作用のアフィニティと、両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的なパラメータとに依存する。「結合速度定数（ｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｏｎ）」および「解離速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｏｆｆ）」の両方が濃度と実際の結合および解離速度との計算によって決定できる。Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆの比は、アフィニティに関係しない全てのパラメータを消去できるので、解離定数Ｋｄに等しい。Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ．５９：４３９−４７３(１９９０）を参照せよ。
【００９３】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）のＮ末端の可変領域（Ｖ領域）のアミノ酸残基によって形成される。前記重鎖および軽鎖のＶ領域内の３カ所の非常に多様性のある部分は「超可変領域」といい、「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」として知られる、より保存された隣接部分に挟まれて配置される。「ＦＲ」という用語は、天然には免疫グロブリンの超可変領域（ＣＤＲｓ）の間に隣接して存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３カ所の超可変領域と重鎖の３カ所の超可変領域とは、互いに対して３次元空間で抗原結合表面を形成するように配置される。前記抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的で、重鎖および軽鎖のそれぞれの３カ所の超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲｓ」と呼ばれる。
【００９４】
抗体は、当業者に周知のさまざまな技術によって調製される場合がある。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、同上を参照せよ。一般に、抗体はここに記載されるモノクローナル抗体の作成と、組換え抗体の産生を可能にする、適当な細菌またはほ乳類細胞宿主へに抗体遺伝子のトランスフェクションとを含み細胞培養技術によって産生できる。１つの技術では、前記ポリペプチドを含み免疫原がまず広範囲のほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。このステップでは、上記の免疫原性ポリペプチドはなんら改変されることなく使用される場合がある。代替的には、前記ポリペプチドがウシ血清アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニンのような担体タンパク質に連結されるとき、優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原性ポリペプチドは動物宿主に注射され、該動物は定期的に採血される。前記ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適当な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって抗血清から精製される場合がある。
【００９５】
免疫原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９(１９７６）の技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性（すなわち、関心のある免疫原性ポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生できる不死化株細胞の作成を含む。かかる株細胞は、例えば上記のとおり免疫された動物から得られた脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種であることが好ましいミエローマ細胞の融合パートナーとの融合によって不死化される。例えば、前記脾臓細胞およびミエローマ細胞は数分間非イオン性デタージェントと混合され、ハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地中に低濃度でプレーティングされる。好ましい選択技術は、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）選択を用いる。前記細胞ハイブリッドの単一コロニーが選択され、培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性および特異性が高いハイブリドーマが好ましい。モノクローナル抗体は増殖中のハイブリドーマのコロニーの上清から単離され、前記抗体を作成するための免疫原として用いられた、免疫原性の前記ポリペプチドか、その免疫原性のある部分かを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される場合がある。
【００９６】
多数の治療上有用な分子は、前記抗体分子の免疫療法活性を示すことができる抗原結合部位を含む。タンパク分解酵素パパインはＩｇＧ分子を優先的に切断して複数の断片を精製するが、前記断片のうちの２個（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ１個の無傷な抗原結合部位を含む共有結合のヘテロ２量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含む複数の断片を提供することができる。
【００９７】
Ｆｖ断片は、ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク分解切断によって産生できる。しかしＦｖ断片は、当業者に知られた組換え技術を用いて作成されるのがもっと一般的である。前記Ｆｖ断片は、天然の抗体の抗原認識および抗原結合能力の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合のＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体を含む。Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２(１９７２）；Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７０６−２７１０(１９７６）；および Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：４０９１−４０９６(１９８０）。
【００９８】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをエンコードするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬをエンコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される共有結合で連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体である。Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９−５８８３(１９８８）。抗原結合部位の構造とほぼ類似する３次元構造にフォールディングするｓｃＦｖ分子の作成を容易にする複数の方法が記載されている。米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号および第４，９４６，７７８号明細書。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【００９９】
ヒト以外の抗体をヒトに投与する場合に該抗体に対する免疫応答を低減するために、本発明の免疫療法用抗体はヒト以外の免疫グロブリンの抗原結合部位の可変ドメインおよび相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をそれぞれ含む「キメラ」および「ヒト化」モノクローナル抗体を含む。キメラ抗体の調製はＣａｂｉｌｌｙに付与された米国特許第４，８１６，５６７号明細書に説明され、ヒト化抗体はＱｕｅｅｎに付与された米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号明細書と、Ａｄａｉｒに付与された米国特許第５，８５９，２０５号明細書と、Ｗｉｎｔｅｒに付与された米国特許第５，２２５，５３９号明細書とに説明される。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【０１００】
抗体の可変ドメインのそれぞれは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられた３個の超可変ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み、前記フレームワーク領域は、ＣＤＲ領域に支持を提供し、ＣＤＲ領域相互間の空間的関係を規定する。抗原結合部位は、重鎖可変領域由来の３個のＣＤＲと軽鎖可変領域由来の３個との６個のＣＤＲを含む。ＣＤＲのアミノ酸残基は前記結合した抗原と接触し、最も強い接触は重鎖ＣＤＲ３を通じて提供される。
【０１０１】
重鎖および軽鎖の可変ドメインのそれぞれには４カ所のフレームワーク領域がある。フレームワーク領域の一部のアミノ酸残基は結合した抗原と接触する場合があるが、フレームワーク領域は可変領域を抗原結合部位にフォールディングさせる役割を主に担う。フレームワーク領域内では、一部のアミノ酸残基と一部の構造的な特徴とが非常によく保存される。例えば、全ての可変領域は約９０個のアミノ酸残基のジスルフィド結合による内部ループを含む。前記可変領域が結合部位にフォールディングするとき、ＣＤＲは抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。フレームワーク領域内の保存された構造領域は、ＣＤＲループのフォールディングした形状に影響を与えて、正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ある種の「カノニカルな」構造を形成させる。そして、一部のフレームワーク領域の残基は、抗原重鎖および軽鎖の相互作用を安定化させる非共有結合のドメイン間接触に参加する。
【０１０２】
ヒト化および／またはキメラ免疫療法用抗体は、天然のフレームワーク領域ポリペプチドフォールディング構造のほぼ全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、前記フレームワーク領域内のアミノ酸残基がヒトフレームワーク領域残基で置換される、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）処理を通じてさらに改変される。ベニア化技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性は、抗原結合表面内での重鎖および軽鎖のＣＤＲの構造および相対的配置によって主に決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３(１９９０）。したがって抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造と、ＣＤＲ構造どうしの相互作用と、ＣＤＲと可変領域ドメインの他の部分との相互作用とが注意深く維持される場合にのみヒト化抗体において保存できる。ベニア化技術を用いることによって、免疫系に容易に遭遇するフレームワーク領域の残基は、免疫原性が弱いか、あるいは、ほぼ非免疫原性かのベニア化表面を含むハイブリッド分子を提供するためにヒトの残基で選択的に置換される。
【０１０３】
他の実施態様では、本発明の方法は、１個または２個以上の完全ヒト化（ｆｕｌｌｙ−ｈｕｍａｎ）免疫療法用抗体を利用するのがより適当である。例えば、上記指摘のとおり、ヒト化およびキメラ抗体を含む非ヒト抗体は、ヒトに生体内で投与されるとき、抗免疫グロブリン免疫応答を誘発することがよくある。
【０１０４】
完全ヒト化抗体の作成法は当業者に容易に利用可能であり、（１）抗体レパートリーがヒトの抗体レパートリーに置換されたトランスジェニック動物を免疫原性ポリペプチドで免疫するか、（２）ファージディスプレイ抗体ライブラリを免疫原性ポリペプチドでスクリーニングして、ヒト抗体重鎖および軽鎖をエンコードするポリヌクレオチドを単離することによって最も頻繁に達成させる。
【０１０５】
本発明の方法に用いる免疫療法用抗体を作成するのに適当なトランスジェニック動物システムは、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，１６２，９６３号、第６，０７５，１８１号および第５，７７０，４２９号明細書に開示される。ファージディスプレイ法は米国特許第６，２４８，５１６号、第６，２９１，１５８号、第６，２９１，１５９号、第６，２９１，１６０号、第６，２９１，１６１号、第５，９６９，１０８号、第６，１７２，１９７号、第５，８８５，７９３号、第６，２６５，１５０号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６９８号、第５，８３７，５００号および第６，３００，０６４号明細書に提示される。これらの特許のそれぞれは、引用によりここに取り込まれる。
【０１０６】
本発明の方法に用いるのに適当な免疫療法用抗体は、例えば、放射性同位元素、分化誘導剤、薬物、毒素および／またはこれらの誘導体のような治療用試薬の１個または２個以上をさらに含む場合がある。代表的な放射性同位元素は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉを含む。適当な薬物は、メトトレキセートおよびピリミジン／プリン類似体を含む。分化誘導剤は、フォルボールエステルおよび酪酸を含む。そして毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
【０１０７】
治療用試薬は、免疫療法用抗体と、直接的か、あるいは間接的（すなわちリンカー原子団を介して）かのいずれかで連結される場合がある。治療用試薬を抗体に結合する方法は当業者に周知である。例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌに付与された米国特許第４，６７１，９５８号明細書は、適当な２価および多価リンカーシステムおよび方法論を開示する。
【０１０８】
切断可能なリンカーは、連結されない治療用試薬の毒性が抗体に結合されたときの毒性を上回るときに、代替的に使用される場合がある。本発明の方法のために治療用試薬を抗体に連結するのに適当な切断可能なリンカーは、例えば、（１）ジスルフィド結合の還元（米国特許第４，４８９，７１０号明細書）、光分解性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）結合の照射（米国特許第４，６２５，０１４号明細書）、（３）誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解（米国特許第４，６３８，０４５号明細書）、（４）血清補体触媒加水分解（米国特許第４，６７１，９５８号明細書）および（５）酸触媒加水分解（米国特許第４，５６９，７８９号明細書）によって切断可能なリンカー基を含む。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【０１０９】
（ｄ）細胞利用免疫療法剤
細胞利用免疫療法用組成物は、上記以外の方法で調製された抗原提示細胞（ＡＰＣ）および樹状細胞（ＤＣ）ワクチンを含む。代替的に、あるいは、追加的に、本発明の方法に用いるのに適当な細胞利用組成物は、上記の腫瘍関連ポリペプチドおよび／または腫瘍特異ポリペプチドに特異的なＴ細胞の１個または２個以上の集団を含む場合がある。
【０１１０】
かかるＡＰＣ／ＤＣ調製物の代表的なものは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのようなサイトカイン中で培養された細胞から調製された、ＡＰＣ／ＤＣワクチンを含むがこれらに限られない。また前記ＡＰＣまたはＤＣは、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡのような核酸、またはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスのいずれかの形状その他の当業者に周知の方法の腫瘍特異抗原に曝露される場合がある。さらに、中ないし高分化型がん細胞に特異的な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞が使用される場合がある。ＴＩＬ集団は、がんから単離され、ＩＬ−２存在下で生体外で増殖され、標準的な養子移植（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）法で前記がんの患者に再投与されつ場合がある。適当なＴＩＬ集団は、ＣＤ４＋かつＣＤ８＋のＴ細胞を含むＴリンパ球を主に含む。
【０１１１】
１個または２個以上のポリペプチドに特異的なＴ細胞は、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて培養下または生体内で調製される場合がある。例えばＴ細胞は、骨髄、末梢血またはがん患者から単離された骨髄または末梢血の分画から、ＩｓｏｌｅｘＴＭ（Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、Ｉｒｖｉｎｅ）のような市販の細胞分離システムか、米国特許第５，２４０，８５６号および第５，２１５，９２６号明細書と、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ８９／０６２８０号、第ＷＯ９１／１６１１６号および第ＷＯ９２／０７２４３号明細書とに記載されたシステムかを使って単離される場合がある。これらの特許文献のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【０１１２】
Ｔ細胞は、免疫療法用ポリペプチド、かかるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドおよび／または前記免疫療法用ポリペプチドの少なくとも一部を提示する抗原提示細胞または樹状細胞で刺激される場合がある。かかる刺激は、関心のある免疫療法用ポリペプチドに特異的なＴ細胞を生成することを可能にするのに十分な条件および時間実行される場合がある。
【０１１３】
Ｔ細胞がある免疫療法用ポリペプチドに特異的といえるのは、該Ｔ細胞が、特異的な増殖、サイトカイン分泌および／または前記ポリペプチドでコーティングされり、前記ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現する標的細胞を殺す場合である。Ｔ細胞の特異性は、例えば、増殖クロム放出アッセイまたは増殖アッセイのような当業者に知られた複数の方法のいずれかを用いて評価される場合があるが、陰性対照と比較した細胞溶解および／または増殖の２倍以上の増大といる刺激指数がＴ細胞特異性を示す。かかるアッセイは、例えばＣｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０(１９９４）に記載されるように実施される場合がある。
【０１１４】
代替的に、Ｔ細胞の増殖の検出は、例えば、（例えば、ＤＮＡに取り込まれるトリチウムチミジン量によって）ＤＮＡ合成速度の増大を測定することによって達成される場合がある。免疫療法用ポリペプチドとの接触は、Ｔ細胞の増殖を少なくとも２倍増大させる結果になるのが典型的である。Ｔ細胞の活性化は、ＴＮＦまたはＩＮＦ−γの放出のような標準的なサイトカインアッセイを用いて測定される場合がある。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１(Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８）を参照せよ。一般的には、現行の方法で免疫療法用の目的に適するＴ細胞は、免疫療法用ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣ／ＤＣに応答して増殖するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１１５】
（ｅ）併用免疫療法剤
一部の実施態様では本発明は、上記の免疫療法用試薬または組成物を２個または３個以上含む併用免疫療法剤を提供する。個々の免疫療法用試薬のそれぞれは、個別に投与される場合もあれば、前記免疫療法用試薬を２個または３個以上含む併用免疫療法剤単一の組成物に混合される場合もある。例えば本発明は、前期のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質またはコンジュゲートを含む免疫療法用組成物を、例えば治療用抗体、抗がんワクチンおよび／または細胞利用治療剤のような１個または２個以上の追加の免疫療法剤とともに提供する。代表的な治療用抗体は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＶＥＧＦおよび／またはその他の腫瘍関連抗原と結合するモノクローナル抗体のような抗体を含むが、これらに限られない。
【０１１６】
ここに提供される代表的な併用免疫療法用組成物は、抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）モノクローナル抗体と組み合わされたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦを含む。例えば、適当な抗ＶＥＧＦ抗体は、腫瘍血管形成の阻害に有効であることが知られているヒト化マウスモノクローナル抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ、ジェネンテク、カリフォルニア州、サンフランシスコ）である。
【０１１７】
免疫療法
他の実施態様では本発明は、上記の免疫療法用組成物を利用してがん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法は、中ないし高分化型を示し、その分化型に相当する増殖特性を有するがん細胞は、免疫療法の治療方式をに独特の感受性があるという観察に基づく。したがって本発明の方法は、（ａ）がん患者におけるがんの文化度を決定するステップと、（ｂ）免疫療法用組成物の治療上の有効量を前記患者に投与するステップと、（ｃ）前記がんの進行を監視するステップとを含む。
【０１１８】
これらの方法による免疫療法の治療方式は、中ないし高分化型のがんの患者の場合に用いられる。１個または２個以上のがん細胞を含む試料が患者から単離され、これらの細胞の分化度が上記のとおり決定される。中ないし高分化型のがん患者が免疫療法用組成物を用いる治療のために選択される。前記免疫療法用組成物の治療上の有効量が投与され、がんの進行が治療効果を確認するために監視される。１０％、２５％または５０％の腫瘍の進行の低減が、本発明の方法によるがんの治療が有効であることを示す。
【０１１９】
本発明の代替的な実施態様は、免疫療法用試薬を２個または３個以上投与することを含む免疫療法の治療方式を提供する。ここに例示するとおり、適当な治療方式は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理した樹状細胞を含む第１の免疫療法用試薬を投与するステップと、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂのような抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含む第２の免疫療法用試薬を投与するステップとを含む。これらの方法によってＰＡＰでパルス処理された樹状細胞は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の投与と同時に患者に投与される。代替的には、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理された樹状細胞は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の投与と独立に投与される場合がある。例えば本発明の特定の実施態様では、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理された樹状細胞は、第０、２および４週に静脈注射で投与される場合があり、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂは第０、２および４週と、その後毒性、病気の進行および／または転移の発生のような事象が起こるまで２週置きに投与される場合がある。
【０１２０】
上記の免疫療法用組成物の投与の経路および頻度と、投与量とは個人ごとに異なるが、標準的な技術を用いて容易に確立できるであろう。一般に前記免疫療法用組成物は、注射（例えば、皮内注射、筋注、静注または皮下）、経鼻（例えば吸引）または経口により投与される場合がある。５２週の期間内に１ないし１０回投与されるのが好ましい。代替的なプロトコールが個々の患者について適当である場合がある。
【０１２１】
適当な投与量は、上記のとおり投与されるとき、抗腫瘍免疫応答を促進できる組成物の量で、基本レベル（すなわち未治療のレベル）の少なくとも１０−５０％を超えるレベルである。かかる応答は、患者の腫瘍細胞を生体外で殺すことができる細胞傷害性エフェクター細胞または患者の抗腫瘍抗体を測定することによって監視できる。かかる免疫療法用組成物は、未治療の患者と比較して、治療された患者で治療結果の改善（例えば、より頻繁な寛解、完全または部分的なあるいはより長期にわたるがんでない状態での生存）につながる免疫応答を起こすことができるはずである。一般に、１個または２個以上のポリペプチドを含む免疫療法用組成物について、１回投与量に存在するそれぞれのポリペプチドの量は、宿主の体重のｋｇあたり約２５ｍｇから５ｍｇまでの範囲である。適当な投与量サイズは、患者のサイズに応じて変わるが、約０．１ｍＬから約５ｍＬまでの範囲が典型的である。
【０１２２】
一般に、適当な投与量および治療方式は、治療の利益を与えるのに十分な量の前記免疫療法用組成物を提供する。かかる応答は、未治療の患者と比較して、治療された患者における治療結果の改善（例えば、より頻繁な寛解、完全または部分的なあるいはより長期にわたるがんでない状態での生存）を確立することによって監視できる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増大は、治療結果の改善と一般的には相関する。一般的にかかる免疫応答は、治療の前後の患者から得られた試料を用いて実施される、標準的な増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを用いて評価される場合がある。
【０１２３】
がん細胞の免疫療法に対する感受性を評価する方法
本発明は、免疫療法用組成物に対する感受性を評価する方法を提供する。上記のとおり、本発明の一部として中ないし高分化型がん細胞は免疫療法のモダリティに独特な感受性がある。
【０１２４】
したがって本発明は、がん患者において免疫療法用組成物に対するがんの感受性を評価する方法であって、（ａ）前記患者から前記がん細胞を含む試料を単離するステップと、（ｂ）前記がん細胞の分化状態を決定するステップとを含み、中ないし高分化型がんが、前記がん細胞は免疫療法用組成物を用いる治療に対して感受性があることを示す、がんの感受性を評価する方法を提供する。
【０１２５】
ここに説明するとおり、がん細胞の分化状態はその等級を評価することによって定義される場合がある。高分化型がんは等級１に分類され、中分化型がんは等級２に分類され、低分化型がんは等級３に分類される。
【０１２６】
本発明に従う評価方法に適する代表的ながんは、例えば、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとを含む。しかし本発明の評価方法は、高分化型および中分化型がん細胞を低分化型がん細胞から鑑別する十分に確立した基準が存在する、いかなるがん、全てのがんに等しく適合することが了解されるであろう。
【０１２７】
上記のとおり高分化型または中分化型と同定されたがんは、ここに開示され、あるいは、当業者に容易に入手可能な免疫療法用組成物のいずれかを用いる治療に対する感受性がある。前立腺がんという具体的なケースでは、本発明は、例えば７以下のグリーソン指数によって証明された高分化型または中分化型の細胞を有しここに開示されたタンパク質コンジュゲートによって刺激される樹状細胞のような刺激された樹状細胞を用いる免疫療法用組成物の１つを用いる治療に対して感受性がある、患者を同定するために用いられる場合がある。一部の好ましい実施態様では、前記免疫療法用組成物が上記に開示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を用いて生体外で刺激された樹状細胞を含む、前立腺がん細胞の治療に対する感受性を評価する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
以下の実施例は例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
【実施例１】
【０１２９】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の構築
本実施例は、既に米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に開示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＰＡ２０２４）をエンコードするｃＤＮＡの構築を説明する。
【０１３０】
ヒトＰＡＰは前立腺がん株細胞ＬｎＣａＰ．ＦＧＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ、メリーランド州、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）からクローン化された。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な方法に従ってＫｅｙｓｔｏｎｅ Ｌａｂｓ（カリフォルニア州、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ）によって注文生産で合成された。これらのプライマーは配列番号２としてここに提示される既知のＰＡＰｃＤＮＡ配列の５’末端に相同性があった。使用する個々の発現ベクターの必要に応じてＨｉｎｄ ＩＩＩ、Ｍｕｎ ＩまたはＸｈｏ Ｉ制限部位が取り付けられた。３’末端には、ＰＡＰ配列の停止コドン用のＢａｍＨ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を置換してグリシンおよびセリンコドンを生成するオリゴヌクレオチドが構築された。このＢａｍＨ Ｉ部位は、ＰＡＰのｃＤＮＡ（配列番号２）を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）からクローン化されたＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ（配列番号４）に融合するための用いられた。前記ＧＭ−ＣＳＦの５’末端には、ＢａｍＨ Ｉ部位が、ＧＭ−ＣＳＦ配列のアミノ酸１８−２３をコーディングヌクレオチドに相同性のあるオリゴヌクレオチドに取り付けられた。ＧＭ−ＣＳＦの３’末端は、ＧＭ−ＣＳＦの読み枠の停止コドンの後まで含み、Ｘｂａ Ｉクローン化部位を生成するオリゴヌクレオチドを用いて作成された。
【０１３１】
ポリＡ＋ＲＮＡは、Ｍｉｃｒｏ Ｆａｓｔ ｔｒａｃｋキット（インビトロジェン）を用いて、製造者の供給するマニュアルに従って、株細胞ＬｎＣａＰ．ＦＧＣおよびＰＢＭＮＣからタンパク質（登録商標）にされた。前記ポリＡ＋ＲＮＡは、ｃＤＮＡサイクルキット（インビトロジェン）を用いて、添付されるマニュアルに記載された手順に従って逆転写された。第１鎖ｃＤＮＡは上記のプライマーを用いて２５回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供された。前記ＰＣＲの産物はベクターｐＣＲ３、ｐＣＥＰ４（ともにインビトロジェン）およびｐＢａｃＰａｃ８（クロンテク）にクローン化されて、それぞれｐＣＲ３−ＰＡＰ−ＧＭ、ｐＣＥＰ４−ＰＡＰ ＧＭおよびＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣが構築された。クローン化されたコンストラクトのＤＮＡ配列は、蛍光シーケンサーモデルＡＢＩ ３７３Ａ（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）で標準的な方法を用いて確認された。ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号６および５として提示される。
【０１３２】
ｐＣＲ３−ＰＡＰ−ＧＭは一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現をさせるためにＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）にエレクトロポレーション処理された。予測されるサイズ、免疫学的同一性および機能のタンパク質がＣＯＳ−７細胞および２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン）で一過性に発現できることが確認された後、安定的なトランスフェクタントが、エピソーム発現ベクターのｐＣＥＰ４（インビトロジェン、カリフォルニア州、サンジエゴ）を用いてヒト胚腎臓細胞株２９３−ＥＢＮＡで作成された。エレクトロポレーションとハイグロマイシンでの選択との後、組換えクローンが、限界希釈条件下で細胞をプレーティングし該細胞の組織培養上清中のＰＡＰの生物活性についてスクリーニングすることによって作成された。産生量の最も大きいクローンが無タンパク質培地に馴化され、ＣｅｌｌＭａｘ中空繊維バイオリアクタ（ギブコ、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）中で増殖された。使用済みの前記培地が回収され、プールされて、遠心によって清澄化された。その後前記培地は、ヒトＰＡＰ特異的モノクローナル抗体ＡＴＣＣＨＢ８５２６（ＡＴＣＣ）をセファロース樹脂に結合することによって作成された免疫アフィニティカラムを通された。洗浄の後、結合した物質は低ｐＨで溶出され、中和されて、生理的バッファーに対して透析された。溶出された分画は、還元条件下での変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。得られたゲルは、完全にグリコシル化されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦの予測サイズに対応する７５ｋＤの単一タンパク質のバンドを示した。
【０１３３】
ＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣは、ＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣとＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡ（クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）との相同組換えによって組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ、バキュロウイルス）を作成するのにも用いられた。ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現システム（クロンテク）からの試薬が用いられ、基本的にその製品マニュアルに記載のとおり手順が実行された。ＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣおよびＢａｃＰＡＫ６はリポフェクションによってＳＦ２１細胞（クロンテク）にコトランスフェクションされた。使用済みの組織培養上清は第５日に回収された。前記上清は新鮮なＳＦ２１細胞上に滴定され、該細胞は半固形培地中で４日間培養された。単層培養が中性赤で染色された後、ウイルスのプラークが同定され、パスツールピペットで拾われた。プラークで精製された組換えウイルスは、新鮮な培養に溶出され、新鮮なＳＦ２１細胞でのＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ産生についてスクリーニングするのに用いられた。陽性のプラークが同定され、ウイルスのストックと組換えタンパク質をその後複数回の新鮮なＳＦ２１細胞感染で作成するために用いられた。産生培養の培地は感染後３日目に回収された。前記培地は２９３−ＥＢＮＡ細胞由来のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦについて説明されたとおりに処理された。免疫アフィニティ精製されたタンパク質の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色後６４ｋＤの単一タンパク質のバンドを示した。
【実施例２】
【０１３４】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の生物活性
本実施例は、米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に既に開示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の生物活性を説明する。
【０１３５】
実施例１に記載の全ての発現システムからのＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ依存Ｔ細胞株の増殖を支持する能力について分析された。前記タンパク質は酸性フォスファターゼアッセイでの酵素活性についても分析された。標準的なバイオアッセイが前記ＧＭ−ＣＳＦ生物活性を決定するために用いられた。
【０１３６】
ＧＭ−ＣＳＦ活性
ＧＭ−ＣＳＦ依存ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１（ＡＴＣＣ、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）と、単球白血病細胞株ＡＭＬ−１９３（ＡＴＣＣ）とが、ＰＡＰとの融合の後でもＧＭ−ＣＳＦがその生物活性を保持するかどうか分析するために用いられた。ＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で日常的に培養される前記細胞株は、アッセイの前２４時間通常の培地中で飢餓状態におかれた。前記細胞は、組織培養培地中で３重に重複してウェル当たり１５００個の細胞の割合でプレーティングされた。テスト用上清または陽性対照として組換えＧＭ−ＣＳＦが前記細胞に添加された。細胞は７２時間培養され、その後、ＤＮＡ合成速度を決定するためにウェル当たり１マイクロキュリーのトリチウム標識チミジンでパルス標識された。
【０１３７】
酸性フォスファターゼ活性
前記融合タンパク質の第２の成分の生物活性は、酸性フォスファターゼ活性の酵素アッセイで決定された。酸性フォスファターゼは、酸性ｐＨでパラ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を加水分解する前記タンパク質の能力として測定された。簡潔には、テスト液は５０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．８中で希釈された。ｐＮＰＰは最終濃度２ｍｇ／ｍＬで添加された。３７°Ｃ３０分間のインキュベーションの後、等量の１Ｍ ＮａＯＨが反応液に添加された。これらの条件下で加水分解されたｐＮＰＰは黄色を呈し、４０５ｎｍの分光光度計で定量することができる。
【実施例３】
【０１３８】
前立腺酸性フォスファターゼ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物を用いるホルモン抵抗性前立腺がん患者の治療
本実施例は、前立腺酸性フォスファターゼ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物（ＡＰＣ８０１５）を用いるホルモン抵抗性前立腺がん患者の治療についての無作為化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）されたプラセボ対照付き第ＩＩＩ相臨床治験に用いられた方法論を開示する。
【０１３９】
１２７名の患者が、（１）アンドロジェン欠乏にもかかわらず病気の進行の証拠がある、組織学的に確認された前立腺腺がんであること、（２）Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ分類のステージＤの転移疾患が存在すること（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５０（６）：１０２７−１０２８(１９９７））、（３）がん関連痛がなく、鎮痛剤を使用していないこと、（４）免疫組織学によりＰＡＰ陽性の腫瘍であること、（５）テストステロンが去勢レベルである５０ｎｇ／ｄＬ未満であること、（６）ＰＳＡが５ｎｇ／ｍｌを超えること、（７）化学療法の治療方式の終了から６ヶ月経過していること（あるいは、４００を超えるＣＤ４カウントが３ヶ月未満であること）、および（８）ホルモン療法後に腫瘍が進行していること、という基準に基づいて第ＩＩＩ相臨床治験のために選択された。腫瘍の進行は、ＣＴか、あるいは、骨のスキャニングで少なくとも２カ所の新たなホットスポットがあることかのいずれかによって放射線写真での進行によって評価され、ＰＳＡの進行は、去勢療法時の少なくとも５０％以上のレベルで、現在の治療でＰＳＡが安定かまたは上昇中であることによって評価された。
【０１４０】
ＡＰＣ８０１５は、各治療コースのたびに新たに調製された。樹状細胞前駆体は標準的な１．５ないし２．０血液体積の単核球の除去血輸血（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって末梢血から回収された。コロニー刺激因子を用いる動員は不要である。前記除去血輸血産物は地元の血液銀行で調製され、Ｄｅｎｄｒｅｏｎの細胞処理工場まで輸送される。樹状細胞前駆体は、Ｈｓｕら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：５２−５８(１９９６）；Ｋｕｎｄｕら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：５１−５６０(１９９８）；および Ｐｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−１３８(１９９８）の方法の変法によって２回の逐次的な浮遊密度遠心のステップによって集められた。
【０１４１】
簡潔には、前記除去血輸血製品は浮遊密度溶液（比重＝１．０７７ｇ／ｍＬ）に重層され、赤血球および顆粒球を除去するために１，０００ｇで２０分間遠心した。界面細胞が集められ、洗浄され、第２の浮遊密度溶液（比重＝１．０６５ｇ／ｍＬ）に重層され、血小板と低密度の単球およびリンパ球とを除去するために８０５ｇで３０分間遠心された。
【０１４２】
以上に詳細に説明されるとおり、ＡＰＣ８０１５の標的抗原である、ＰＡ２０２４は、ヒトＰＡＰとヒトＧＭ−ＣＳＦとの間の融合タンパク質である。前記融合タンパク質は、バキュロウイルスシステムにクローン化され、無血清培地に馴化されたＳｆ２１昆虫細胞で発現された。ＰＡ２０２４は、３段階の逐次的なカラムクロマトグラフィーステップによって９５％を超える純度まで精製された。ＰＡＰの酵素活性と、ＧＭ−ＣＳＦの増殖促進活性によって証明されるとおり、両方のタンパク質の成分は適切な生物活性を保持していた（ＰＡＰおよびＧＭ−ＣＳＦの活性のアッセイの説明は実施例２を参照せよ。）
【０１４３】
樹状細胞前駆体を含む細胞ペレットは洗浄され、１０μｇ／ｍＬの標的抗原ＰＡ２０２４を添加したＡＩＭ培地（ＡＰＣ８０１５処理された患者用）または標的抗原ＰＡ２０２４無添加のＡＩＭ培地（プラセボ処理された患者用）でインキュベーションされた。前記培地は、血清または外在性のサイトカインを含まなかった。４０時間３７°Ｃで５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベーションした後、前記細胞は、洗浄され、２５０ｍＬの乳酸リンゲル液（ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に所望の臨床量で処方された。
【０１４４】
灌流用免疫療法用ＡＰＣ８０１５組成物を放出する基準は、（１）工程内無菌性試験で４０時間内に増殖がないこと、（２）エンドトキシンが１．４ＥＵ／ｍＬ未満であること、（３）Ｔ＝０の値より上の３ＳＤを超えるＣＤ５４発現であること、および、（４）細胞の生存性が７２％を超えることを含む。さらに、表現型は抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５４、ＣＤ６６ｂおよびＣＤ８６モノクローナル抗体（ベクトン・ディキンソン、カリフォルニア州、サンホセ、コールター、フロリダ州、マイアミ）を用いるフロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定された。結果が灌流後に利用可能な追加のテストは、最終製品の無菌性およびマイコプラズマであった。最終的なＡＰＣ８０１５製品またはプラセボ製品は、４°Ｃで元の病院に送り返され、処方８時間以内に患者に輸血された。ＡＰＣ８０１５およびプラセボは、それぞれ３０分間を超える時間をかけて別々に輸血された。患者は輸血前にルーティン化した前処置はされない。患者は輸血後３０分間観察され、帰宅を許された。予め精巣切除されていない患者は黄体形成ホルモン放出ホルモンのアゴニストを用いる生殖腺抑制を継続した。
【０１４５】
ＡＰＣ８０１５を投与された患者８２名と、ＰＡ２０２４ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質で予め刺激されない樹状細胞を含むプラセボで処理された患者４５名について、除去血輸血が−２、１２および２６日目に実施され、それぞれ輸血が０、１４および２８日目に実施された。
【０１４６】
患者は、客観的な疾患の進行か１年間経過かのいずれか早い時点まで観察された。診療上のエンドポイントは、（１）８週間ごとのスキャニングによる疾患の進行と、（２）疾患関連痛の発症という基準によって評価された。血清ＰＳＡレベルは、疾患が進行するまで４週間ごとに測定された。進行するまでの時間は、登録の日から客観的な疾患の進行が記録された日までの時間として定義された。客観的な疾患の進行（例えば、ＰＳＡの上昇）が起こらないのに治験を止めることに決めた患者は、治験からの脱退時に疾患の進行があったものとみなされた。第１のエンドポイントは、（１）骨スキャニング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴映像（ＭＲＩ）によって測定される客観的な疾患の進行と、（２）安全性とを含む。第２のエンドポイントは、疾患関連痛の進行および反応速度を含む。
【実施例４】
【０１４７】
免疫療法用組成物の治療上の有効性は前立腺がんの分化状態と相関する
本実施例は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（すなわちＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物の治療上の有効性は、前立腺がん細胞の分化状態と相関することを証明する。
【０１４８】
上記のＡＰＣ８０１５またはプラセボを用いる免疫療法の治療方式を開始する前に、患者は疾患特性の基線量について評価された。前立腺がん細胞の分化状態を決定するために、前立腺組織試料が各患者から単離され、Ｇｌｅａｓｏｎ、Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ、ｐｐ．１７１−１９７(Ｔａｐｐｅｎｈａｕｍ、編、Ｌｅｅ ＆ Ｆｅｈｉｇｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、１９７７）に記載のグリーソン指数化法による分析に供された。この評価の結果は表１に示される。
【０１４９】
客観的な疾患の進行までの時間は、骨スキャニングまたはＸ線での進行か、あるいは、臨床的な悪化かとして定義され、データはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法による統計解析に供された。ＰＳＡは疾患の進行を決定するためには用いられなかった。表２に示されるとおり、ＡＰＣ８０１５で処理された患者集団についての疾患進行時間のメジアン（中央値）は１１．０週間で、プラセボ処理された患者集団についての疾患進行時間のメジアンは９．１週間であった。表３および図１は、進行のない生存の百分率をＡＰＣ８０１５またはプラセボの投与後の時間の関数として示す。２つの集団についての時間対疾患進行の曲線の比較によって導かれたｐ値は０．０８５であった。
【０１５０】
表４および６は、それぞれ、低分化型（グリーソン指数８以上）の前立腺がん細胞の患者と、中ないし高分化型（グリーソン指数７以下）の前立腺がん細胞の患者についての時間対疾患進行を開示する。表５および図２と、表７および図３とは、それぞれ、低分化型がん細胞の患者集団と、中ないし高分化型がん細胞の患者集団とに対するＡＰＣ８０１５またはプラセボの投与後の時間の関数として進行のない生存の百分率を示す。
【０１５１】
これらのデータは、低分化型前立腺がん細胞を有する患者は、プラセボ処理患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処理患者集団についての客観的な疾患の進行までの時間において統計的に有意な差がないこと（ｐ値＝０．４３１）を証拠として、低分化型前立腺がん細胞の患者はＡＰＣ８０１５を用いる治療に抵抗性があったことを証明した。これに対し、中ないし高分化型前立腺がん細胞（グリーソン指数７以下）の患者について得られた結果は、プラセボ処理患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処理患者集団についての客観的な疾患の進行までの時間において統計的に有意な差がないこと（ｐ値＝０．００２）を証拠として、かかる患者が免疫療法用組成物を用いる治療に感受性があったことを示す。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
【表２】
ａ ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋテストを用いて処置群の疾患進行までの時間の曲線を比較する。
＊ 途中打ち切り（ｃｅｎｓｏｒｅｄ）された観察例
【０１５４】
【表３】
【０１５５】
【表４】
ａ ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋテストを用いて処置群の疾患進行までの時間の曲線を比較する。
＊ 途中打ち切りされた観察例
【０１５６】
【表５】
【０１５７】
【表６】
ａ ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋテストを用いて処置群の疾患進行までの時間の曲線を比較する。
＊ 途中打ち切りされた観察例
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
図５は、ＡＰＣ８０１５を投与された患者が、プラセボを投与された患者と比較して、Ｔ細胞性免疫応答のメジアンにおける統計的に有意な（ｐ値＝０．０００３）増強を示すことを証明するデータを提供する。図６は、グリーソン指数が７以下でＡＰＣ８０１５を投与された患者集団は、グリーソン指数が８以上でＡＰＣ８０１５を投与された患者集団と比較して、Ｔ細胞性免疫応答のメジアンにおける統計的に有意な（ｐ値＝０．００６５）増強を示すことを証明するデータを提供する。
【実施例５】
【０１６０】
本実施例は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（すなわちＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物を投与された患者における疾患関連痛発症までの時間は、グリーソン指数７以下の前立腺がん患者では、プラセボ投与患者での疾患関連痛発症までの時間より延長されるが、グリーソン指数８以上の前立腺がん患者では疾患関連痛発症までの時間はほとんど影響がなかったことを証明する。
【０１６１】
疾患関連痛は、がん関連痛の質および一貫性があり、治験参加後に発症し、痛みの場所が放射線撮影手段によって客観的に確認される疾患部位と対応する痛みとして定義された。疾患関連痛発症までの時間は、患者の無作為化から痛みの発症までの時間である。痛みは２つのやり方で測定された。患者は、十分にバリデーションされた痛みの評価ツールであるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｒｉｅｆ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙに基づく痛みの毎週の記録を記入し、医師が診察の際に評価する。盲検外部評価者（すなわち患者を診察した医師以外の者）が上記の証拠を評価した。痛みは、場所が疾患の撮像された部位に対応するときにだけがん関連痛とされた。上記の痛みのデータはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法による統計解析を用いて時間事象（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ）分析で解析された。図７に示すとおり、プラセボ処置されたグリーソン指数７以下（中ないし高分化型前立腺がん細胞）の患者集団の疾患関連痛発症までのメジアン時間は１８．７週間であった。ＡＰＣ８０１５処置群の治験終了時には痛み発症までのメジアン時間はまだ到来してなかった。ＡＰＣ８０１５処置群とプラセボ処置群との差は、統計上有意であった（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｐ＝０．０１６）。対照的に、グリーソン指数８以上（低分化型前立腺がん細胞）の患者集団の疾患関連痛発症までのメジアン時間についてＡＰＣ８０１５処置群とプラセボ処置群との差は有意ではなかった（ｐ＝０．３０４）。
【０１６２】
これらのデータは、プラセボ処置患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処置群の疾患関連痛発症までの時間に統計上有意な差がないこと（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｐ＝０．３０４）を証拠として、低分化型前立腺がん細胞の患者はＡＰＣ８０１５処置によって疾患関連痛発症までの時間にほとんど影響がなかったことを証明する。対照的に、中ないし高分化型（グリーソン指数７以下）前立腺がん細胞の患者について得られた結果は、プラセボ処置患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処置患者集団のついての疾患関連痛発症までの時間に統計上高度な有意性があること（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｐ＝０．０１６）を証拠として、かかる患者はＡＰＣ８０１５処置が有益であったことを示す。
【０１６３】
さらに表８に示されるデータは、ＡＰＣ８０１５は、プラセボ投与患者集団と比較して、前立腺がん患者に好ましく受け入れられたこと（１０％以上の患者で発症、ｐ値０．０５以上）を証明する。
【０１６４】
【表８】
副作用のあった患者数（％）
【実施例６】
【０１６５】
局所利用法後血清学的な進行所見のある前立腺がん患者におけるｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂと併用されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞
本実施例は、血清学的な進行所見のある前立腺がん患者におけるヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの投与と併用してＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞の投与することを含む併用免疫療法用治療方式の有効性を開示する。
【０１６６】
簡潔には、アンドロジェン依存性（ホルモン感受性）前立腺がんで、確定的な外科または放射線療法を既に受け、０．４ｎｇ／ｍｌないし６．０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ増大で示される非転移性の再発疾患の患者が第ＩＩ相臨床治験に登録された。ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理された患者の樹状細胞が、第０、２および４週目に静注によって投与された。ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、第０、２および４週目と、その後、基線ＰＳＡ値の倍増（少なくとも４ｎｇ／ｍＬ）または転移の発症によって定義される疾患の進行か、毒性がみられるまで２週間ごとに静注によって投与された。Ｔ細胞増殖と、ＰＡＰに応答するサイトカイン産生と、樹状細胞の同時刺激／活性化マーカー発現とが検定された。表９は、第ＩＩ相臨床治験への患者の適格性についての登録および除外の基準を示す。
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
１４名の患者がこの第ＩＩ相臨床治験に参加した。１名の患者は同意を取り下げ、６名の患者は治療後期間メジアン２８週間（範囲は１２−４８週間）でＰＳＡ異常のため治験から除外され、１名の患者は、プロトコールの処置と関係があるかもしれないグレード３の心不全（ＣＨＦ）の後でＰＳＡは安定していたが前記治験から除外された。６名の患者が治験に残り、メジアン２８週間（範囲は２ないし６０週間）でＰＳＡは安定していた。処置を受けた患者の年齢のメジアンは６１歳（範囲は６０−７６歳）であった。前記患者のうち１１名のグリーソン指数は、５（患者２名）、６（患者５名）、７（患者２名）および８（患者２名）であった。
【０１６９】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞およびｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの投与
樹状細胞（ＤＣ）前駆体は、第０、２および４週の第１日目に、４時間の除去血輸血によって末梢血から回収された。樹状細胞前駆体は、前記除去血輸血の製品から浮遊密度遠心法によって単離された。前駆体細胞は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦとともに４０時間培養された。患者は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理された樹状細胞の製造可能な最大投与量である、〜１．２ｘ１０９個の有核細胞／ｍ２を、第０、２および４週の第３日目に３０分間かけて静注輸血によって投与された。輸血の３０分間前に、患者はアセトアミノフェン６５０ｍｇおよびジフェンヒドラミン５０ｍｇを経口投与で前処置された。ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、９０分間かけて静注）が（ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞の輸血の後）第０、２および４週とその後２週間ごとの第３日目に投与された。
【０１７０】
ＰＳＡの変動
ＰＳＡの変化は前記患者のそれぞれについて監視された。ＰＳＡレベルの減少が３名の患者で検出された（１２％減少、３３％減少および６４％減少）。ＰＳＡ基線量のメジアンは１．８８ｎｇ／ｍＬ（範囲は０．５−５．０８ｎｇ／ｍＬ）であった。応答について評価できた９名の患者のうち、３名はＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ、時間に対するＰＳＡの傾きを用いて推定される）が減少し、１名の患者は、治験参加時の２．７４ｎｇ／ｍＬから（第１２週に５．６ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ値に達した後）、１．４３ｎｇ／ｍＬまでＰＳＡの減少を示した。
【０１７１】
表１０は、処置前および処置中のＰＳＡの動態を要約する。処置前および処置中の両方のＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）は、ＰＳＡ対時間の曲線の傾きによって除算されたＬｎ２の関係を用いて推定された。ＰＳＡ倍加時間は、処置中ＰＳＡ対時間の曲線の傾きが正の患者について計算された。３名の患者は、ＰＳＡ値が減少したため処置中ＰＳＡの倍加時間を計算できなかった。３名の患者はＰＳＡ倍加時間が増大し、３名の患者はＰＳＡ倍加時間に変化がなかった。客観的な疾患の進行があった患者はいなかった。
【０１７２】
【表１０】
【０１７３】
末梢血リンパ球は各患者から基線量、第８週および第１２週に単離された。９６穴Ｕ底プレート中に１ｘ１０５個のＰＢＭＣがＲＰＭＩ−１０％ヒト血清培地中で滴定されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦに添加された。ポークウィードマイトジェンが陽性対照として用いられた。アッセイは３７°Ｃのウオーター・ジャケット式インキュベータで５％ＣＯ２、６日間インキュベーションされた。前記アッセイはインキュベーションの最後の１８時間３Ｈチミジン（アマシャム、ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）でパルス標識され、Ｔｏｍｔｅｃプレートハーベスターを使ってフィルターマットに回収された。シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）を添加した後、前記アッセイはＷａｌｌａｃベータ・シンチレーションカウンタを用いて計測された。読み取り値は１分間当たりのカウント数（ＣＰＭ）単位で報告された。
【０１７４】
これらの実験結果は、異なる濃度のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ（２μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまで）に応答する代表的な患者のＴ細胞増殖を示す図４に示される。この患者は、５０％を超える持続的なＰＳＡ減少がみられる。テストした４名のうち２名はＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦに応答して第８および１２週でＴ細胞増殖の証明可能な増大がみられた。
【０１７５】
ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ
マルチスクリーン−ＨＡプレートのウェルは、Ｄ−ＰＢＳ中１５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＮＦ−γ抗体１００μＬで終夜４°Ｃにてコーティングされた。プレートはＰＢＳＴで洗浄され、２００μＬのＤ−ＰＢＳ＋１０％ＨＳで２時間３７°Ｃでブロッキングされた。３ｘ１０５個のＰＢＭＣがＲＰＭＩ−１０％ＨＳ中で滴定されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦとともに添加された。前記アッセイは３７°Ｃで４０−４８時間インキュベーションされた。２日後、細胞および抗原はＰＢＳＴを用いて前記プレートから洗浄された。検出用抗体であるビオチン化抗ヒトＩＦＮγ１００μＬがＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬでウェルに添加された。プレートはＰＢＳＴで６回洗浄され、ＰＢＳＴで１：１０００に希釈されたストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（ＭａｂＴｅｃｈ、オハイオ州、Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）１００μＬがアッセイウェルに添加された。前記アッセイは１．５時間インキュベーションされ、ＰＢＳＴで６回洗浄された。ワンステップＢＣＩＰ／ＮＢＴ液がウェル当たり１００μＬでウェルに添加され、スポットを発色するために１２分間インキュベーションされた。プレートは、ＩｍｍｕｎｏＳｃａｎアナライザーおよびソフトウェアを用いて、スキャニングされたスポットが計測された。
【０１７６】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＩＦＮ−γ産生は、異なるＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ濃度でのＥＬＩＳＰＯＴ解析を用いて患者から測定された。テストした３名の患者のうち３名とも基線と比較して第８週ではＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞が証明可能な増大を示した。１名の患者はＴ細胞が分析するのに十分なかった。
【０１７７】
これらのデータは、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦとｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂとの組み合わせが、血清学的に進行した前立腺がんの治療に有効であること、すなわち、ＰＳＡを変動させる活性があることを証明する。免疫学的な解析は、本治療方式からＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ特異的な免疫応答が起こること、および、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦと抗ＶＥＧＦ抗体との併用免疫療法は安全で十分に受け入れられることを証明した。
【０１７８】
本発明は理解の明確さのために図面と実施例とによってある程度詳細に説明されたが、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される、本発明の範囲から逸脱することなく変更および修飾を行うことができる。
【０１７９】
配列番号１は、配列番号２のｃＤＮＡ配列にエンコードされるヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ｈｕＰＡＰ）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、配列番号１のヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ｈｕＰＡＰ）をエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、配列番号４のｃＤＮＡ配列にエンコードされるヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、配列番号３のヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）をエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、配列番号６のｃＤＮＡ配列にエンコードされるヒト前立腺酸性フォスファターゼ／ヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＰＡＰ／ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６は、配列番号５のヒト前立腺酸性フォスファターゼ／ヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＰＡＰ／ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）／顆粒球−マクロファージ 投与前にコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質（ＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞か、あるいは、無刺激の抗原提示細胞（プラセボ）かで処置されたホルモン抵抗性前立腺腫瘍患者全員についての客観的な疾患の進行までの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示すグラフ。
【図２】投与前にＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞か、あるいは、無刺激の抗原提示細胞（プラセボ）かで処置されたホルモン抵抗性でグリーソン指数８以上の前立腺腫瘍患者全員についての客観的な疾患の進行までの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示すグラフ。
【図３】投与前にＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞か、あるいは、無刺激の抗原提示細胞（プラセボ）かで処置されたホルモン抵抗性でグリーソン指数７以下の前立腺腫瘍患者全員についての客観的な疾患の進行までの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示すグラフ。
【図４】末梢血単核細胞の集団中のＴ細胞の増殖に対するＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦの効果を示す棒グラフ。
【図５】ＡＰＣ８０１５が、前立腺がん患者において、プラセボを投与された患者集団と比較して著しいＴ細胞性免疫応答を誘導することを証明するデータを提供する棒グラフ。
【図６】ＡＰＣ８０１５が、グリーソン指数７以下の前立腺がん患者において、グリーソン指数８以上の前立腺がん患者と比較して著しいＴ細胞性免疫応答を誘導することを証明するデータを提供する棒グラフ。
【図７】ＡＰＣ８０１５またはプラセボ処置されたグリーソン指数７以下の前立腺がん患者対ＡＰＣ８０１５またはプラセボ処置されたグリーソン指数８以上の前立腺がん患者について疾患関連痛を発症するまでの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示す棒グラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療用組成物および治療方法に関する。より具体的には本発明は、中ないし高度に分化したがんの患者におけるがん細胞増殖を阻害する免疫学的治療用組成物および治療方法を提供する。さらに本発明は、免疫学的治療用組成物を用いる治療方式（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｇｉｍｅｎｓ）に対する感受性をがん患者について評価する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、異常細胞の無制御な増殖および転移を特徴とする一群の疾患であり、米国では心臓疾患に次ぐ第２位の死亡原因である。２００１年には、約１，２６８，０００人の新たな患者が診断され、約５５３，４００人が死亡すると予測された。米国における生涯発がんリスクは、男性で約２人に１人、女性で約３人に１人である。
【０００３】
前立腺がんは米国男性で最も多く診断される新生物である。２００１年には、推定で１９８，１００人の前立腺がんの新患者の診断が下され、これは、がんの診断が下された男性の新患者全体の約２９％に相当した。２００１年には、約３１，５００人の死亡原因が前立腺がんであった。１９８８年から１９９２年の間に前立腺がんの発症率が劇的に増大したが、これは、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血液検査の利用の増大を通じて無症状の男性についてより早期に診断できるようになったためである。前立腺がんの発症率はその後減少して安定してきた。男性の６人に１人は生涯のある時点で前立腺がんを発症する。
【０００４】
いずれかのがんについて適当な治療法を決定するためには、ある治療のモダリティの治療としての有効性を予測しようとするさまざまな因子の評価が必要である。従来のがん治療方式は、がんの型にもよるが、外科療法、放射線療法、化学療法、ホルモン療法またはこれらの組み合わせを含むことがしばしばある。
【０００５】
前立腺がんという特定の場合では、患者の年齢、がんの進行段階その他の医学的な条件を考慮すると、外科療法および／または放射線療法が治療の一般的なアプローチである。ホルモン療法および化学療法は転移疾患に頻繁に用いられる。ホルモン療法は、腫瘍のサイズを縮小させて痛みその他の徴候を軽減することによって、長期にわたり前立腺がんを制御する場合がある。場合によっては、特に、低悪性度および／または初期の腫瘍を有する高齢者については、当面積極的な治療を施すことなく注意深く観察すること（経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ ｗａｉｔｉｎｇ））が適切な場合がある。
【０００６】
最近がん研究の進歩が、さまざまながん治療用の免疫療法組成物をもたらしてきた。がん治療の免疫療法的アプローチは、がん細胞が異常あるいは外来の細胞および分子に対する生体防御をしばしばかいくぐることができ、これらの防御は治療によって失地回復するように刺激される場合があるという認識に基づく。非特許文献１を参照せよ。
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ、“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学）、”ｐｇｓ．６２３−６４８（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）
【０００７】
さまざまな免疫エフェクターが直接または間接に腫瘍の成長を阻害できるという最近の観察が、がん療法に対するこのアプローチへの関心を新たにすることにつながった。非特許文献２および３。現代的な免疫療法は、例えば、抗体療法、ポリペプチドワクチンおよび多数の細胞免疫療法を含む。これらの免疫療法の治療モダリティのそれぞれは、がん細胞の監視および根絶を司る患者の免疫システムの要素の増強を共有する。
【非特許文献２】Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６０（１）：１−７（２００１）
【非特許文献３】Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ７９（１２）：６５１−９（２０００）
【０００８】
がんの特定のタイプに関係なく、臨床的な予後は、がん細胞の分化状態を決定することによって予想されることがよくある。ある腫瘍の分化の程度と、その生物学的な挙動との関係は、１世紀以上前から知られてきた。１９２０年代という昔に、組織学的な「等級」、すなわち、分化の数量的表現の患者の予後への影響が初めて分析された。高分化型がん細胞は高い生存率と相関するが、低分化型がん細胞の存在は臨床的予後の悪さを示す。低分化型腫瘍は、高分化型腫瘍よりも攻撃的な経過をたどるという基本的な結論は、その後繰り返し支持されてきた。
【０００９】
腫瘍の等級は、等級１が高分化型でゆっくりと分裂する細胞を有するがんを表し、等級２が中程度の分化型細胞を有するがんを表し、等級３が低分化型で速く分裂する細胞を有するがんを表し、等級４が未分化細胞を有するがんを表す、１ないし３か、１ないし４かのスケールで示されることがしばしばある。がんの予後は等級が大きいほど低下する。
【００１０】
もともと扁平上皮がんについて開発されたＢｒｏｄｅｒの等級法は今日でも用いられている。この方法によって腫瘍は不完全な分化を示す腫瘍の割合に従って４つの等級のうちの１つに分類される。非特許文献４−６。等級が低い高分化型腫瘍は良性腫瘍によく似ているが、等級が高い低分化型腫瘍はほとんど似ていない。正式な等級システムは、近年、基準のより厳格な標準化で改善された。非特許文献７．
【非特許文献４】Ｂｒｏｄｅｒｓ、ＪＡＭＡ ６５６−６５４（１９２０）
【非特許文献５】Ｂｒｏｄｅｒｓ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．７３：１４１−６０（１９２１）
【非特許文献６】Ｂｒｏｄｅｒｓ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂｌ Ｍｅｄ．２：３７６−８１（１９２６）
【非特許文献７】Ｅｌｓｔｏｎ、Ａｕｓｔ ＮＺ Ｊ．Ｓｕｒｇ．５４：１１−１５（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
等級化ががんの予後を予想するうえで価値が大きいことは証明されたが、免疫療法の治療方式を施されている患者の臨床的な予後を将来的に評価するのに追うようできるかもしれないことは理解されていない。したがって、免疫療法に基づくがん治療方式の治療予後を予測するのに利用可能な方法の必要性は本発明の技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、中ないし高分化型がんの患者のがん細胞増殖を阻害する免疫療法用組成物および治療方法を提供することによってこれらおよびその他の関連する必要性に応える。免疫療法用組成物に対するがん患者のがん細胞の感受性を評価する方法も提供される。本明細書で提示される免疫療法用組成物および治療方法のそれぞれは、がん細胞の分化状態の目安となるがん細胞の等級が、免疫療法の治療方式を施されているがん患者の臨床的予後を予想するという知見に基づく。
【００１３】
一部の実施態様では、本発明は、中ないし高分化型がんの患者から得られる、単離された活性化抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣｓ）を含む免疫療法用組成物を提供する。前記抗原提示細胞は、腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）に生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で曝露することによって刺激される。前記腫瘍関連抗原は、腫瘍特異抗原（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）の場合がある。前記腫瘍関連抗原および／または腫瘍特異抗原は、Ｎ末端部分（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｏｉｅｔｙ）およびＣ末端部分（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｏｉｅｔｙ）を含むタンパク質コンジュゲートの構成部分の場合がある。本発明に従って刺激された前記抗原提示細胞は、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分に対する細胞傷害性細胞免疫応答を起こすＴ細胞の活性化に有効である。Ｔ細胞活性化レベルは、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分のいずれか単独に曝露されるときに前記抗原提示細胞により生じるＴ細胞活性化レベルより高い。特定の好ましい実施態様は、前記抗原提示細胞が樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣｓ）であることを示す。
【００１４】
本発明の免疫療法用組成物は、例えば、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとのような、がんの治療に特に適する。その他のがんも治療できる場合がある。本明細書で例示されるのは、前立腺がんの治療用の免疫療法用組成物である。
【００１５】
前記がんが前立腺がんである実施態様では、前記がんの分化状態は、例えば、グリーソン指数（Ｇｌｅａｓｏｎ ｓｃｏｒｅ）によって決定される場合がある。免疫療法用組成物は、中ないし高分化型がん細胞の存在を示す７以下のグリーソン指数を有する前立腺がんと診断された患者から単離された抗原提示細胞を含む場合がある。一部の実施態様では抗原提示細胞は、ホルモン除去療法（ｈｏｒｍｏｎｅ ａｂｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に抵抗性の前立腺がん患者から単離される。他の実施態様は、前記抗原提示細胞がホルモン除去療法に抵抗性でない患者から単離されることを示す。
【００１６】
本発明のある面は、抗原提示細胞が融合タンパク質であるタンパク質コンジュゲートによって刺激される免疫療法用組成物を提供する。本発明のこれらの面によると、前記融合タンパク質は、Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含み、さらに、１個または２個以上のアミノ酸のリンカーペプチドを含む場合がある。Ｎ末端かＣ末端かのいずれかの原子団は、配列番号１に示す配列（ヒトＰＡＰ）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する配列を含む場合があるか、あるいは、ヒトＰＡＰの活性断片、誘導体または変異体を含む場合がある。他の実施態様は、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分が配列番号１に示す配列を有する免疫療法用組成物を提供する。
【００１７】
他の実施態様では、本発明の免疫療法用組成物は、配列番号３に示す配列（ヒトＧＭ−ＣＳＦ）か、ヒトＧＭ−ＣＳＦの活性断片、誘導体または変異体かと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性があるＣ末端部分またはＮ末端部分を有するタンパク質コンジュゲートで刺激された抗原提示細胞を含む。他の実施態様は、Ｃ末端部分またはＮ末端部分が配列番号３に示される配列を含む免疫療法用組成物を提供する。
【００１８】
より好ましいのは、前記抗原提示細胞が、配列番号１に示す配列（ヒトＰＡＰ）か、ヒトＰＡＰの活性断片、誘導体または変異体かと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性があるＮ末端部分と、配列番号３に示す配列（ヒトＧＭ−ＣＳＦ）か、ヒトＧＭ−ＣＳＦの活性断片、誘導体または変異体かと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性があるＣ末端部分かを含むタンパク質コンジュゲートで刺激される、免疫療法用組成物である。最も好ましいのは、配列番号５に示される配列を含むタンパク質コンジュゲートで刺激される、中ないし高分化型のがん細胞を有する患者から得られた抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物である。
【００１９】
本発明は、中ないし高分化型のがん患者のがん細胞増殖を阻害する方法にも向けられる。１つの実施態様では前記方法は、（ａ）免疫療法用組成物を用いる治療に感受性のある患者であることを示す、中ないし高分化型がん細胞の患者の体内での存在を決定するステップと、（ｂ）前記中ないし高分化型がん細胞の患者に免疫療法用組成物の治療上有効な投与量を投与するステップとを含む。これらの方法によって前記がんの進行が１０％、２５％または５０％減退することは、前記がん細胞の成長阻害を示す。
【００２０】
一部の好ましい実施態様では、本発明は、上記の免疫療法用組成物の１つを用いる、中ないし高分化型がん患者のがん細胞の成長を阻害する方法を提供する。
【００２１】
代替的な関連する実施態様は、（ａ）免疫療法用組成物を用いる治療に感受性のある患者であることを示す、中ないし高分化型がん細胞の患者の体内での存在を決定するステップと、（ｂ）前記中ないし高分化型がんの患者から抗原提示細胞を単離するステップと、（ｃ）Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含むタンパク質コンジュゲートに生体外で曝露することによって前記抗原提示細胞を刺激するステップと、（ｄ）刺激された前記抗原提示細胞の治療上の有効投与量を前記患者に投与するステップとを含み、前記抗原提示細胞は前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分のいずれかに対する細胞傷害性の細胞応答を生じるようにＴ細胞を活性化するのに有効で、前記Ｔ細胞の活性化レベルは、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分を単独で曝露された抗原提示細胞によって生じる活性化レベルより高い、中ないし高分化型がん細胞の患者のがん細胞の成長を阻害する方法を提供する。これらの方法によって前記がんの進行が１０％、２５％または５０％減退することは、前記がん細胞の成長阻害を示す。
【００２２】
これらの方法の一部の面では、前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される。他のがんが本発明の方法によって治療される場合もある。好ましい方法では前記がんは前立腺がんである。前記がんが前立腺がんである実施態様では、前記がんの等級は、例えば、指数が７以下であることが免疫療法用組成物を用いる治療方式に感受性がある患者であることを示すグリーソン指数によって決定される場合がある。
【００２３】
本発明は、免疫療法用組成物を用いる治療に対するがん患者の感受性を評価する方法にも向けられる。代表的な方法は、（ａ）前記患者からがん細胞を含む試料を単離するステップと、（ｂ）前記がん細胞の分化および／または成長速度の特性を決定するステップとを含み、中ないし高分化型がん細胞の存在が、免疫療法用組成物を用いる治療に対する前記がん細胞の感受性を示す。
【００２４】
添付図面とともに以下の詳細な説明を参照することによって、本発明の上記およびその他の特徴と該特徴を実現するやり方とは明らかになり、本発明は最もよく理解されるであろう。本明細書に開示された全ての引用文献は、それらの全体が個別に取り込まれたかのように引用によってここに取り込まれる。
【００２５】
発明の詳細な説明
上記のとおり本発明は、中ないし高分化型がんの患者におけるがん細胞の成長を阻害する免疫療法用組成物および治療方法を提供する。免疫療法用組成物に対するがん細胞の感受性をがん患者で評価する方法も提供される。ここに提示される前記免疫療法用組成物および治療方法のそれぞれは、がん細胞の分化状態の目安であるがん細胞の等級が、免疫療法用組成物を用いる治療方式を施されるがん患者の臨床的予後を予想するといる知見に基づく。低分化型がん細胞は免疫療法の治療方式に抵抗性であることがわかったが、中ないし高分化型細胞は、免疫療法用組成物を用いる治療に対する感受性が高かった。
【００２６】
ここで用いられるところの「分化」という用語は、がん細胞は、同じ組織タイプの正常細胞の外観と類似する程度をいう。分化の程度は、特定のがんの臨床的な挙動と、予後とに相関することがしばしばある。がん細胞の分化状態は、一般的には組織学的な等級化方法で評価される。世界保健機関（ＷＨＯ）と米国がん合同委員会（ＡＪＣＣ）とは、組織学的なパラメータに基づくがん細胞分化評価のための４つの等級からなる同様のシステムを独立に提唱した。等級１（Ｇ１）のがんの細胞は、低い等級の腫瘍を形成する、低分化型で成長の遅い細胞であり、等級１のがんは最も攻撃性が弱い挙動を示す。等級２（Ｇ２）のがん細胞は、やや高分化型で、中程度の攻撃性の挙動を示す腫瘍を形成する。逆に、等級３（Ｇ３）または等級４（Ｇ４）のがんの細胞は、それぞれ低分化型または未分化型で、速く分裂し、最も攻撃性の強い挙動を示す高い等級の腫瘍を形成する。
【００２７】
組織学的な等級は、疾患、特に、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんのようながんの将来の経過および予後を推測するための予後指数としてたびたび利用されるが、組織学的な等級は免疫療法の治療方式の有効性の信頼できる指数として利用してもよいことが既に認識されている。Ｃａｒｒｉａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐ．７５（１）：４０６−４２１（１９９４）。本発明の一部として、高分化型（Ｇ１）および中分化型（Ｇ２）がん細胞は、免疫療法の治療方式に感受性があるが、低分化型（Ｇ３）または未分化型（Ｇ４）細胞は、免疫療法用組成物を用いる治療に抵抗性がある。
【００２８】
１つの実施態様では、前立腺がん細胞の組織病理学的等級を評価し、免疫療法の治療方式で治療される前立腺がん患者の臨床的予後を予想して判定するためのグリーソン指数の応用を提供される。９５％を超える前立腺がんは前立腺上皮細胞由来の腺がんである。粘液腫（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ）または印環細胞腫（ｓｉｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、腺様嚢胞がん、カルチノイド、（内膜型を含む）大前立腺導管がん、腺がんおよび小細胞未分化がんを含む他の稀少な組織学的特徴が記載されてきた。多くの研究が、前立腺腺がんの組織学的分化度の臨床的意義（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ）を確認した。分化の程度は、腺形成パターンにより等級化されるのが典型的で、あまり重要ではないが細胞学的な詳細によって等級化されることもある。前立腺腺がんについて最も広範に受け入れられた等級化法は、グリーソンによって開発された方法である。Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．５０：１２５−１２８（１９６６）、引用によりここにその全体が取り込まれる。グリーソンの原報は、高いグリーソン指数と高い死亡率との相関を証明し、これは他の研究者が確認した。グリーソン指数は、今なお最も広範に適用可能で臨床上有用な組織学的等級化システムである。Ｇｌｅａｓｏｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１１１：５８−６４（１９７４）、Ｇｌｅａｓｏｎ、Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ７：１５（１９８８）、およびＢｏｓｔｗｉｃｋ、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４７：２９７−３１９（１９９７）。
【００２９】
グリーソンの前立腺腫瘍分類システムは、前立腺がんの不均一な分化を認識した２つのレベルの指数化に基づく。標本の支配的な形態と、その正常な外観からの逸脱とに基づいて主要な分化パターンは１ないし５のグリーソン等級に分類される。第２のパターン（すなわち、次に最もありふれたパターン）も１ないし５の等級に分類され、組織構築のパターンに基づいて２から１０までの範囲の指数になる。比較的低いグリーソン指数（すなわち２−４）は高分化型で攻撃性の低いがん細胞を表し、中間のグリーソン指数（すなわち５−７）は中分化型がん細胞と分類され、比較的高いグリーソン指数（すなわち８−１０）は低分化型で攻撃性の高い腫瘍を表す。本発明の一部として、７以下のグリーソン指数を有する前立腺がん細胞、すなわち、中ないし高分化型がん細胞は、一般的に免疫療法の治療方式を用いる治療に感受性があるが、８以上のグリーソン指数を示すがん細胞は一般的にかかる治療モダリティに抵抗性がある。
【００３０】
前立腺腺がんについて組織病理学的パラメータを評価するグリーソンシステムに加えて、広くさまざまながんのタイプの分化状態を記録するための多数の他の相似の組織学的な等級化法が存在する。広範ながんを等級化する方法は当業者に周知で、予後の評価を行うための日常的に利用される。本発明はここに提示されるがんの等級化法の実施例の説明に限定されないことを理解すべきであろう。むしろ、ここに開示される免疫療法の使用方法と、免疫療法の治療方式をに対するがん細胞の感受性を評価する方法とは、中ないし高分化型の等級のがんという特徴を有するがんの治療および評価に広範に利用される場合がある。
【００３１】
膀胱に発生するたいていのがんは、移行細胞がん（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＴＣＣｓ）である。一部の移行細胞がんは、扁平な特徴または腺状の構成部分を有する混合パターンを示す。Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４２：２５０−２５３（１９８９）。これより一般性がない病理学的特徴は、腺がん、扁平上皮がんおよび小細胞がんで、これらはそれぞれ膀胱腫瘍の約６％、２％および１％未満である。腫瘍等級化（典型的には等級ＩないしＩＩＩ）は、分裂像の数、核の異常の有無および異型性に基づく。有意な相関が等級と予後との間に存在する。Ｈｅｎｅｙら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３０：１０８３−１０８６（１９８３）。
【００３２】
産婦人科学国際連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ）は、子宮内膜がんの等級化法を採用した（ＦＩＧＯ等級化システム）。Ｍｉｋｕｔａ、Ｃａｎｃｅｒ ７１：１４６０−３（１９９３）、Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｐｐ ４８−５５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ｔｈｉｒｄ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｆａｓｃｉｃｌｅ ３、１９９２）。古典的な子宮内膜腺がんでは腫瘍等級は独立な予後因子として非常に有意である。低分化型腫瘍は子宮筋層深部への侵入、血管隙（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）への浸潤および悪性度の上昇を含む他の悪い予後因子と相関する。Ｍｏｒｒｏｗら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．４０：５５−６５（１９９１）、ＡａｌｄｅｒｓらＯｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．５６：４１９−４２７（１９８０）、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２７：１８０−１８８（１９８７）、Ｓｕｔｔｏｎら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １６０：１３８５−１３９１（１９８９）、および、Ｗｈａｒｔｏｎら、Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１６２：５１５−５２０（１９８６）。内体（ｃｏｒｐｕｓ）のがん腫は、腺がんの分化度に関して以下のとおり分類される。Ｇ１等級の腺がんは、高分化型で、５％以下の非扁平または非桑実状の固形成長パターンという特徴を有する。Ｇ２等級の腺がんは、中分化型で、６−５０％の非扁平または非桑実状の固形成長パターンという特徴を有する。Ｇ３等級の腺がんは、低分化型で、５０％を超える非扁平または非桑実状の固形成長パターンという特徴を有する。
【００３３】
複数の方法論が子宮がんの等級化に適用された。Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ７０：２−１２（１９９８）。典型的には、等級化は、細胞構築、核多形性および分裂像の計測の評価を通じて達成される場合がある。構築の等級化を通じて、腺状、乳頭状または充実性の腫瘍成長の割合が評価され、腫瘍の５０％を超える部分が組織構築上、腺状、乳頭状または充実性のとき、それぞれ等級１、２または３と分類される。核の多形性は、核の大きさおよび形状と、染色質のテクスチャと、核：細胞質の比と、核小体の数および大きさとの変動を計測することによって決定される。等級１は、胞状の核に比較的均一性があり、核：細胞質の比が小さく、染色質の凝集または著大な核小体がないことを示す。等級２は、核の大きさ（２：１ないし４：１）および形態にのばらつきがあり、核小体が小さいが識別可能で、一部の染色質は凝集し、変形細胞（ｂｉｚａｒｒｅ ｃｅｌｌ）が存在しない場合である。等級３は、核の大きさ（４：１を超える）および形態に著しいばらつきがあり、核：細胞質の比が大きく、著大な染色質の凝集があり、角膜が肥厚し、好酸球の核小体が肥大し、変形細胞が存在することを示す。分裂像の計測は、核分裂像（ＭＦ）の存在に焦点を当て、中期、後期または終期の明確な形態学的特徴を幽する核が高倍率顕微鏡視野（ＨＰＦ）で数えられる。９ＭＦ／１０ＨＰＦ（１０枚の高倍率顕微鏡視野あたり９個の分裂像）以下が等級１に分類され、１０ないし２４ＭＦ／１０ＨＰＦが等級２に分類され、２５ＭＦ／１０ＨＰＦが等級３に分類される。代替的には、内膜腺がん（上記参照）に由来するＦＩＧＯ等級は、婦人科がんグループの病理委員会（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＧＯＧ））によって採用されたとおりに利用される場合がある。Ｂｅｎｄａら、ＧＯＧ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂｕｆｆａｌｏ、１９９４）。ＦＩＧＯ等級は、腺状または乳頭状の構造対充実型腫瘍成長の比に基づく（等級１は充実性腫瘍が５％未満、等級２は充実性腫瘍が６−５０％、等級３は充実性腫瘍が５０％を超える）。
【００３４】
乳がんは、腺および管の形成と、細胞の大きさと、核の大きさおよび分化度（核の多形性）と、核過染症の程度と、分裂活性とに応じて、３段階の組織学的悪性度に分類されてきた。Ｂｌｏｏｍら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１：３５９（１９５７）、および、Ｓｃｈａｒｆら、Ｌａｎｃｅｔ ２：５８２（１９３８）。組織学等級１の乳がんは高分化型、等級２は中分化型、そして、等級３は低分化型として識別される。より具体的には、腫瘍領域の少なくとも７５％に明確な管形成が認められるときにはスコア１点が与えられ、腫瘍領域の１０％未満に明確な管形成が認められるときにはスコア３点が割り当てられ、これらの中間のカテゴリーにはスコア２点が与えられる。さらに、核の多形性および／または分裂速度が、乳がんに組織学等級を割り当てるために評価される場合がある。ばらつきがほとんどなく、核が外観上全く規則正しい場合には、スコア１点が割り当てられる場合があり、複数の核小体が存在する場合にはスコア３点が与えられる。１０枚の高倍率視野あたり１０個の分裂像未満であるという特徴がある乳がんはスコア１点が割り当てられ、１０枚の高倍率視野あたり２０個の分裂像を超えることはスコア３点であることを示す。これらの３種類のスコアが合計されて等級が決まる。等級１のがんは、スコア合計が３点（可能な最低スコア）、４点または５点で、等級２は６または７点のスコア合計に割り当てられ、等級３（高い合計組織学等級）が合計８または９点のスコアの症例に与えられる。
【００３５】
軟組織肉腫は国立がん研究所によって提唱された方法論に従って等級化されるのが一般的である。Ｃｏｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ ５３：５３０−４１（１９８４）。一般に、多形性があって、細胞が多くて、分化度が低い腫瘍ほど予後が悪い。がんの等級を評価するために測定されるパラメータのなかには、分裂像の数、粘液様領域の有無、ネクローシスの程度および腫瘍の分化度がある。代替的には、ＥＯＲＴＣ等級システムが軟組織肉腫のがん等級をつけるために利用される場合がある。ＥＯＲＴＣシステムでは、分裂像の計測数とネクローシス値が以下の式で関係づけられる。
スコア＝（０．７３２ｘネクローシス）＋（０．８７３ｘ分裂像の数）
Ｖａｎ Ｕｎｎｉｋ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎ．ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ９（３）：６７７−７００（１９９５）、ａｎｄ Ｃｏｉｎｄｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９Ａ：２０８９−２０９３（１９９３）。このシステムによって、ＩないしＩＶの等級がつけられるが、このうち等級ＩおよびＩＩはそれぞれ高分化型および中分化型がん細胞に対応し、等級ＩＩＩは低分化型がん細胞に対応し、等級ＩＶは未分化型がん細胞に対応する。
【００３６】
骨肉腫は、病巣細胞の細胞学的特徴または産物に依存するメイヨー・クリニックによって提唱された案に従って分類されるのが一般的である。Ｄａｈｌｉｎら、Ｂｏｎｅ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｄａｔａ ｏｎ ８５４２ Ｃａｓｅｓ、ｅｄ．４．（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＩＬ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ、１９８６）。骨肉腫、繊維肉腫および悪性繊維性組織球腫は１ないし４のスケールで等級化される。軟骨肉症および悪性脈管腫は１ないし３のスケールで等級化される。骨肉腫は、等級３または４で等級の高い腫瘍であることが一般的で、本発明の免疫療法の治療方式に向かない場合がある。免疫療法の治療方式に適する等級１および２の骨肉腫は稀である。かかるがんは、わずかな程度の低細胞性でかつ細胞学的な退形成で特徴づけられる。軟骨肉腫は、主に細胞充実性、核の大きさおよび過染色症に基づいて等級化される。利用された他の計測値は、分裂速度と、（１個の小腔内に２個または３個以上の核がある）多核腫瘍細胞の割合とである。等級１の高分化型がんは、核の大きさがわずかないしやや増大し、形態にばらつきがある、軟骨細胞を含む。たまに多核細胞が存在し、分裂活性はほぼない。軟骨様マトリクスは豊富でネクローシスはほとんどない。等級２の中分化型の病巣は、細胞がもっと多く、等級１の腫瘍に比べて核の異型性および過染色症の程度が高い。多核細胞がより頻繁に存在し、たまに分裂像が認められる場合がある。これらの腫瘍は、等級１の病巣よりも軟骨様マトリクスが少ない。粘液様の間質の変化とネクローシスとが共通して認められる特許球３の低分化型のがんは、（特に腫瘍葉（ｔｕｍｏｒ ｌｏｂｅｓ）の辺縁で）細胞数が多く、多形性で、容易に同定可能な核の退形成を示す。軟骨肉腫の大多数は当局面μ１または２である。Ｉｎｗａｒｄｓら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、９（３）：５４５−５６９（１９９５）を参照せよ。
【００３７】
ＷＨＯ分類の悪性度スケールは、星状細胞腫の組織学的等級化について最も一般的に受け入れられたものである。Ｋｌｅｉｈｕｅｓら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．３：２５５−２６８（１９９３）、Ｋｌｅｉｈｕｅｓら、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９３）、Ｄａｕｍａｓ−Ｄｕｐｏｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ ６２：２１５２−６５（１９８８）、および、Ｋｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：２７−３７（１９９１）。等級１の高分化型星状細胞腫は、双極性で「毛様（ｐｉｌｏｉｄ）」の細胞と、Ｒｏｓｅｎｔａｌ繊維と、好エオジン性顆粒状体を有する。等級２の中分化型星状細胞腫は、腫瘍性繊維状または大円形星細胞と核の多形性とを特徴とする。等級３の低分化型星状細胞腫は、等級２の星状細胞腫に分裂活性の存在が加わる。等級４の未分化型星状細胞腫は、細胞退形成、核の多形性、分裂像、脈管増殖およびネクローシスを示す。
【００３８】
免疫療法用組成物
本発明の一部の実施態様では、上記の定義の等級１または２を示すがん細胞のような中ないし高分化型がん細胞を特徴とするがんの治療葉の免疫療法用組成物が提供される。一部の実施態様では、ここで代表的な免疫療法用組成物は、中ないし高分化型がんと診断された患者から得られた、活性化され単離された抗原提示細胞を含む。抗原提示細胞は、該抗原提示細胞がＴ細胞を活性化してＮ末端部分またはＣ末端部分のいずれかに対する細胞傷害性細胞応答を起こすのに効果があるようなＮ末端部分およびＣ末端部分を含むタンパク質コンジュゲートに対して生体外で曝露されることによって刺激される。免疫療法用組成物によって達成されるＴ細胞活性化レベルは、Ｎ末端部分またはＣ末端部分いずれか単独に曝露された抗原提示細胞によって生じるレベルよりも高い。
【００３９】
（ａ）抗原提示細胞および樹状細胞
ここで用いられるところの「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、Ｔ細胞を活性化することができる細胞を指し、ある種のマクロファージと、Ｂ細胞と、最も好ましくは、樹状細胞（ＤＣｓ）とを含むがこれらに限られない。「強力な（ｐｏｔｅｎｔ）抗原提示細胞」は、抗原にパルス刺激された後、ナイーブなＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を一次免疫応答で活性化できる細胞である。「樹状細胞」または「ＤＣｓ」は、リンパ組織または非リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞タイプの多様な集団の構成員である。これらの細胞は、独特な形態と、表面ＭＨＣ−クラスＩＩの高レベル発現とを特徴とする。引用によりここに取り込まれる、Ｓｔｅｉｎｍａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１（１９９１）。抗原提示細胞および樹状細胞は、多数の組織供給源から単離可能で、ここに説明される末梢血から単離することが便利である。本発明の好ましい免疫療法用組成物は、中ないし高分化型がんと診断されたがん患者から単離された抗原提示細胞または樹状細胞を用いる。
【００４０】
抗原提示細胞および樹状細胞は、当業者に容易に利用可能な日常的な方法論によって単離される場合がある。樹状細胞を単離するための代表的な適当な方法論は、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に開示される。簡潔に、バフィー・コート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）が末梢血から調製される場合がある。細胞は、ロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）から回収され、遠心管または遠心器具中の（引用によりここに取り込まれるＤｏｒｎの米国特許第４，９２７，７４９号明細書に記載のとおり調製された）１．０７７０ｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの密度の有機シラン化コロイドシリカ（ＯＣＳ）分離メディウムのカラム上に重層される場合がある。前記ＯＣＳメディウムは、コロイドシリカ（約１０−２０ｎｍの粒径）のシラノール基をアルキルトリメトキシシラン試薬と反応させてブロッキングすることにより調製されることが好ましい。
【００４１】
１つの実施態様では、前記ＯＣＳ密度勾配材料は、シグマ・ケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）から入手可能なＰＶＰ−１０のようなポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加した生理食塩水中で希釈される。前記試験管は遠心され、界面に存在する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が回収される。
【００４２】
末梢血単核細胞は、再懸濁され、結晶板を除去するために再度遠心され、任意的に、ＯＣＳカラム（密度１．０６５０ｇ／ｍＬ、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ）を通過するように遠心される場合がある。得られた界面およびペレットのＴ細胞は回収され、遠心によりＤ−ＰＢＳで洗浄される。前記ペレットの分画は、細胞培養液中に再懸濁され、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ中で４０時間培養される。インキュベーション後、非接着性のＴ細胞が回収される。前記界面の樹状細胞の精製度はＦＡＣＳ分析によって定量化される場合がある。
【００４３】
前記細胞の形態は、光学顕微鏡を用いて評価できる。樹状細胞濃縮分画は、樹状細胞の特徴である、細胞表面から伸びる細胞質突起がある大型のヴェール細胞を含む。
【００４４】
（ｂ）タンパク質コンジュゲート
上記のとおり、本発明の代表的な免疫療法用組成物は、タンパク質コンジュゲートを用いて生体外で刺激された抗原提示細胞または樹状細胞を含む場合がある。好ましいタンパク質コンジュゲートは、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」または「がん遺伝子産物」の少なくとも一部を含むＮ末端部分と、「抗原提示細胞結合タンパク質」か、より好ましくは、「樹状細胞結合タンパク質」の少なくとも一部を含むＣ末端部分とを含む。同等に好ましいのは、「腫瘍関連抗原」または「がん遺伝子産物」の少なくとも一部を含むＣ末端部分と、「抗原提示細胞結合タンパク質」または「樹状細胞結合タンパク質」の少なくとも一部を含むＮ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートである。
【００４５】
ここで用いられるところの「腫瘍関連抗原」という用語は、特定の腫瘍組織を含む、組織タイプに特徴的な抗原を指す。腫瘍組織によって発現される腫瘍関連抗原の例は、全前立腺腫瘍の９０％を超える腫瘍に存在する、前立腺酸性フォスファターゼ抗原である。「がん遺伝子産物」という用語は、細胞のトランスフォメーションに関連する遺伝子によってエンコードされるいずれかのタンパク質を指す。がん遺伝子産物の例は、例えば、Ｈｅｒ２、ｐ２１ＲＡＳおよびｐ５３を含む。
【００４６】
「抗原提示細胞結合タンパク質」および「樹状細胞結合タンパク質」という用語は、いずれかのタンパク質であって、該タンパク質に対するレセプターがそれぞれ、抗原提示細胞または樹状細胞に発現するタンパク質を指す。抗原提示細胞結合タンパク質および樹状細胞結合タンパク質の例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８およびＦＬＴ−３リガンドを含むがこれらに限られない。
【００４７】
ここで開示される「タンパク質コンジュゲート」は、Ｎ末端部分とＣ末端部分との間に形成される共有結合複合体を指す。腫瘍関連抗原／腫瘍特異抗原／がん遺伝子産物と、抗原提示細胞結合タンパク質／樹状細胞結合タンパク質との間のタンパク質コンジュゲートは、化学的に複合体を形成するか、あるいは、以下に詳細に説明されるとおりの融合タンパク質として複合体を形成する。
【００４８】
ここの例示される免疫療法用組成物は、中ないし高分化型の前立腺がんと診断された患者から得られた活性化され単離された抗原提示細胞を含む。前記抗原提示細胞は、前記粒子Ｃ末端は、前立腺腫瘍関連タンパク質のヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ｈｕＰＡＰ）の一部を含むＮ末端部分と、抗原提示細胞／樹状細胞結合タンパク質のヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）の一部を含むＣ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートに生体外で曝露することによって刺激された。このようにして刺激された抗原提示細胞は、Ｔ細胞を活性化してＮ末端のＰＡＰ原子団に対する細胞傷害性の細胞応答を生じさせるうえで効果があった。この代表的な免疫療法用組成物によって達成されたＴ細胞活性化のレベルは、ＰＡＰ単独に曝露された抗原提示細胞によって生じるＴ細胞活性化レベルより高かった。
【００４９】
ここに開示される代表的なＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦタンパク質コンジュゲートは、既に米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に説明され、本明細書で配列番号５として提供される。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。このタンパク質コンジュゲートは、ＰＡＰのＮ末端側３８６個のアミノ酸部分と、Ｃ末端側１２７個のアミノ酸部分との融合タンパク質である。ｈｕＰＡＰおよびｈｕＧＭ−ＣＳＦの完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および３としてここに提供される。さらに、配列番号５のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦタンパク質コンジュゲートは、Ｎ末端部分とＣ末端部分との間に、ｇｌｙ−ｓｅｒという配列を有する２個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを含む。
【００５０】
本発明の実施に同等に適するのは、ＰＡＰおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの部分のアミノ酸配列内に配列の変異を含む融合タンパク質を含むＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦタンパク質コンジュゲートである。例えば本発明は、ＰＡＰおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの部分がそれぞれ配列番号１および３に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質コンジュゲートを意図する。より好ましいのは、それぞれ配列番号１および３に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０、９０、９５および９８％の同一性を有するＰＡＰおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの部分である。
【００５１】
上記に指摘されたとおり、タンパク質の複合体は、従来の結合技術のような化学的な手段で形成される場合もあれば、ＤＮＡコンストラクトの発現によって生成される融合タンパク質として形成される場合もある。化学的結合か融合タンパク質かを問わず、タンパク質複合体を生成する方法は周知で当業者には容易に利用可能である。例えば、Ｎ末端およびＣ末端の原子団は、２つのペプチドの間にペプチド結合を形成させるために、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）のような脱水試薬を用いて結合させる場合がある。代替的には、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いる、スルフヒドリル基、エプシロンアミノ基、カルボキシル基その他のポリペプチドに存在する官能基で形成される場合がある。
【００５２】
融合タンパク質を作成するための従来の分子生物学および組換えＤＮＡ技術は、文献に全て説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ、編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ、編、１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照せよ。これらの刊行物は引用によりその全体がここに取り込まれる。
【００５３】
簡潔には、前記ポリペプチドの構成部分をエンコードするＤＮＡ配列が別々に組み立てられ、適当な発現ベクターに連結される場合がある。１個のポリペプチド構成部分をエンコードするＤＮＡ配列の３‘末端は、ペプチドリンカーとともに、あるいはペプチドリンカーなしで、第２のポリペプチド構成部分をエンコードするＤＮＡ配列の５’末端と、前記配列読み枠が合うように連結される。これは、両方の構成部分のポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質になるように翻訳することを可能にする。
【００５４】
ペプチドリンカー配列は、第１および第２のポリペプチド構成部分を、各ポリペプチドが２次構造および３次構造をとるようにフォールディングすることを担保するのに十分な距離を隔てて離すために用いられる場合がある。かかるペプチドリンカー配列は、当業者に周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に取り込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、（１）柔軟な拡張コンホメーションをとることができること、（２）第１および第２のポリペプチドの機能エピトープと相互作用できる２次構造をとることができないこと、および、（３）前記ポリペプチドの機能エピトープと反応するかもしれない疎水残基または荷電残基がないことという要因に基づいて選択される場合がある。好ましいペプチドリンカー配列は、グリシン、アスパラギンおよびセリン残基を含む。スレオニンおよびアラニンのようなタンパク質および中性アミノ酸が前記リンカー配列に用いられる場合もある。リンカーとして有用に利用される場合があるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６（１９８５）、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２（１９８６）、米国特許第４，９３５，２３３号明細書および米国特許第４，７５１，１８０号明細書に開示されたものを含む。前記リンカー配列は、１から約５０個のアミノ酸の長さであるのが一般的である。リンカー配列は、機能性ドメインを分離して立体障害を防止するための用いることができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有するときには必要がない。
【００５５】
連結された前記ＤＮＡ配列は、適当な転写または翻訳の調節エレメントに操作可能に連結される。ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントは、第１のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の５’側だけに位置する。同様に、翻訳を終了させるのに必要な停止コドンと、転写ターミネータ信号は、第２のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の３’側だけに存在する。
【００５６】
一般に、ここで説明される（融合タンパク質を含む）ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、もともとの環境から除去されたものをいう。例えば、天然タンパク質は、天然のシステム中に共存する材料の一部または全てから分離される場合に単離されるという。好ましくは、かかるポリペプチドは少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも約９５％純粋であり、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないベクターにクローン化される場合に単離されていると考えられる。
【００５７】
Ｎ末端部分およびＣ末端部分の間のタンパク質複合体は、前立腺がんの株細胞からヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）をクローン化し、ＰＢＭＮＣライブラリからヒトＧＭ−ＣＳＦをクローン化することによって作成されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質によってここに代表されるような融合タンパク質として組換えによって作成される場合がある。ＰＡＰのコーディング領域の３’末端の停止コドンは、標準的な突然変異誘発法によって除去され、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に置換されて、ＰＡＰをエンコードするＤＮＡをＧＭ−ＣＳＦをエンコードするＤＮＡに読み枠が合うように融合して、Ｎ末端のＰＡＰとＣ末端のＧＭ−ＣＳＦの部分の間に並置されたポリペプチドリンカーのｇｌｙ−ｓｅｒをエンコードする６個のヌクレオチド領域を生成することを促進した。
【００５８】
ここで例示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の文脈で以上のとおり説明されたように、本発明のタンパク質複合体は、腫瘍関連抗原、がん遺伝子産物または抗原提示細胞／樹状細胞結合タンパク質の機能特性に悪影響を伴わないＮ末端および／またはＣ末端部分の変異体を含む。ここで用いられるポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」とは、該ポリペプチドまたはタンパク質の機能活性が実質的に減少しないような、１個または２個以上の置換、欠失、付加および／または挿入によって天然のポリペプチドまたはタンパク質と異なる、ポリペプチドまたはタンパク質をいう。換言すると、抗原提示細胞または樹状細胞と反応し、あるいは、抗原提示細胞または樹状細胞によって処理される変異体の能力は、天然タンパク質と比較して増強されるか変化しない場合があり、あるいは、得られる免疫療法用組成物の有効性に影響を与えることなく、天然タンパク質と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満に減少する場合がある。
【００５９】
かかる変異体は、前記Ｎ末端および／またはＣ末端の部分のアミノ酸配列の改変をすること、前記改変を行ったポリペプチドの、抗原提示細胞／樹状細胞との反応性か、天然の腫瘍関連抗原またはがん遺伝子産物に対して作成された抗血清との反応性かを評価することによって同定されるのが一般的である。かかる改変および評価は、当業者に周知の分子細胞生物学の技術の日常的な応用を通じて端正される場合がある。
【００６０】
好ましい変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメインのような１個または２個以上の部分が除去された変異体を含む。その他の好ましい変異体は、小さい部分（例えば、１−３０個、好ましくは５−１５個のアミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された変異体を含む。ポリペプチド変異体は、天然のポリペプチドまたはタンパク質との配列の同一性が、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％または９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％または９８％である。
【００６１】
変異体は、１個のアミノ酸が類似の特性を有する他のアミノ酸に置換されて、ペプチド化学の当業者が当該ペプチドの２次構造および親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）は実質的に変化しないと予測するような置換として定義される、「保存的アミノ酸置換」を含むのが好ましい。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行われる場合がある。例えば、負荷電を有するアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸で、正荷電を有するアミノ酸はリジンおよびアルギニンで、類似の親水性度を有する荷電をもたない極性側鎖（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリンと、グリシンおよびアラニンと、アスパラギンおよびグルタミンと、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンとである。宿主村的変化を表す他のグループのアミノ酸は、（１）アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニンと、（２）システイン、セリン、チロシン、スレオニンと、（３）バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニンと、（４）リジン、アルギニン、ヒスチジンと、（５）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンとを含む。変異体は、また、あるいは、代替的に、非保存的な変化を含む場合がある。
【００６２】
変異体は、追加的に、あるいは、代替的に、例えば、当該ペプチドの免疫原性、２次構造および親水性に最小限の影響しか及ぼさないアミノ酸の欠失または付加によって改変される場合がある。
【００６３】
上記のとおり、ポリペプチドまたはタンパク質は、翻訳中（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に該タンパク質の輸送を導くタンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列を含む場合がある。
【００６４】
ポリペプチドは、さまざまな周知技術のいずれかを用いて調製される場合がある。上記のＤＮＡ配列にエンコードされる組換えポリペプチドは、当業者にしられたさまざまな発現ベクターのいずれかを用いて前記ＤＮＡ配列から容易に調製される場合がある。発現は、組換えポリペプチドをエンコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターでトランスフォメーションまたはトランスフェクションされたいずれかの適当な宿主細胞において達成される場合がある。適当な宿主細胞は原核生物、酵母および高等真核細胞を含む。利用される宿主細胞は、大腸菌か、酵母か、ＣＯＳまたはＣＨＯのようなほ乳類の株細胞かであることが好ましい。組換えタンパク質またはポリペプチドを培養液中に分泌する適当な宿主／ベクター系からの上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮される場合がある。濃縮に続いて、濃縮液はアフィニティマトリクスまたはイオン交換樹脂のような適当な精製マトリクスに適用される場合がある。最後に、１回または２回以上の逆相ＨＰＬＣのステップが組換えポリペプチドをさらに精製するために用いられる場合がある。
【００６５】
約１００個未満のアミノ酸、一般的には約５０個未満のアミノ酸を有する部分その他の変異体は、当業者に周知の技術を用いて合成手段によって作成される場合もある。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が順次成長するアミノ酸鎖に付加される、メリーフィールド固相合成法のような市販の固相法のいずれかを用いて合成される場合がある。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６(１９６３）を参照せよ。ポリペプチドの自動合成葉装置は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ部門（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）のような業者から市販されており、製造者の指示書に従って運転される場合がある。
【００６６】
一部の特定の実施態様では、ポリペプチドは、ここで説明する複数のポリペプチドを含む融合タンパク質か、ここで説明する少なくとも１個のポリペプチドと既知の腫瘍タンパク質のような無関係の配列とを含む融合タンパク質かの場合がある。融合のパートナーは、例えば、Ｔヘルパーのエピトープ提供し（免疫学的融合パートナー）、好ましくは、ヒトに認識されるＴヘルパーエピトープを提供することについて補助する場合があり、あるいは、天然の組換えタンパク質よりも高収量で該タンパク質を発現することについて補助する（発現エンハンサー）場合がある。ある種の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現エンハンサーとの両方である。他の融合パートナーは、前記タンパク質の溶解度を増大させるか、所望の細胞内コンパートメントにターゲティングすることを可能にするように選択される場合がある。さらに別の融合パートナーは、前記タンパク質の精製を容易にするアフィニティタグを含む。
【００６７】
代替的な免疫療法用組成物
上記のとおり、一部の実施態様では本発明は、中ないし高分化型のがん細胞を有するがん患者の治療に１個または２個以上の免疫療法用組成物を用いる方法を提供する。上記の免疫療法用組成物に加えて、これらの方法は、当業者が容易に利用できるか、日常的な実験作業で調製できる他の免疫療法用組成物を用いる場合がある。
【００６８】
一部の実施態様では免疫療法用組成物は、治療が、（ここに提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドのような）免疫応答修飾剤の投与で腫瘍に対して反応するように内在する宿主免疫系を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で刺激することに依存する、能動的な免疫療法剤を含む場合がある。
【００６９】
他の実施態様では、免疫療法用組成物は、治療が、抗腫瘍効果を直接的または間接的に仲介することができ、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）の宿主免疫系に必ずしも依存しない、（エフェクター細胞または抗体のような）確立された腫瘍免疫活性を有する薬剤を送達することを伴う、受動的な免疫療法剤を含む場合がある。エフェクター細胞の例は、上記のＴ細胞と、（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球のような）Ｔリンパ球と、（ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞のような）キラー細胞と、Ｂ細胞と、ここに提供されるポリペプチドを発現する（樹状細胞およびマクロファージのような）抗原提示細胞とを含む。ここに列挙されるポリペプチドに対して特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、獲得免疫療法のためにクローン化され発現されて他のベクターまたはエフェクター細胞に導入される場合がある。
【００７０】
ここに説明される免疫療法用組成物は、がんに対する免疫応答を刺激するために用いられる場合がある。免疫療法用組成物は、原発腫瘍の外科的除去および／または放射線療法または従来の化学療法剤のような治療の前か、後かのいずれかに投与される場合がある。前記免疫療法用組成物の投与は、静注、腹腔内注射、筋注、皮下注射、経鼻、皮内、経肛門、経膣、局所および経口の経路での投与を含む、いずれかの適当な方法によって投与される場合がある。
【００７１】
これらの方法に用いられるのに適当な免疫療法用組成物は、例えば、免疫療法用ポリペプチド、免疫療法用抗体、ポリヌクレオチド利用抗がんワクチン、細胞利用免疫療法剤と、１個または２個以上のポリペプチド利用、抗体利用、ポリヌクレオチド利用および／または細胞利用免疫療法剤を含む組み合わせ組成物を含む。ここに提供される免疫療法用組成物のそれぞれは、免疫応答の増幅および／または抗原特異的トレランスの打破のうちの１つまたは２つ以上の特性を共有する。
【００７２】
（ａ）免疫療法用ポリペプチド
上記のタンパク質複合体に加えて、本発明は、中ないし高分化型がん細胞を特徴とするがんの治療用の免疫療法用ポリペプチドの使用を意図する。したがって、本方法に使用するのに適するポリペプチドは免疫原性ポリペプチドを含むが、ここで免疫原性とは、前記ポリペプチドが、がん患者から単離された抗血清および／またはＴ細胞を用いる、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞刺激アッセイのような免疫アッセイで検出可能なように反応する前記ポリペプチドの能力として定義される。免疫原活性についてスクリーニングするための方法は、当業者に周知である。例えば代表的なスクリーニング方法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）に開示されている。したがってポリペプチドは、固相支持体に固定され患者の血清と反応させられて、該血清中の抗体と固定化された前記ポリペプチドとの結合ができる場合がある。未結合の血清は除去され、結合した抗体は、例えば検出可能な標識付きのプロテインＡを用いて検出される場合がある。
【００７３】
本発明で用いるのに適当な代表的なポリペプチドは、例えば、軟組織肉腫か、リンパ腫か、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、遺伝子、卵巣、膵臓、副腎または前立腺のがんかのようながんの患者から単離された試料を含む、組織および／または腫瘍の試料での発現レベルの上昇を示すポリペプチドのような腫瘍関連および／または腫瘍特異ポリペプチドを含むのが最も典型的である。他のがんで発現を上昇させるものとして同定されたポリペプチドも用いるのに適する場合がある。腫瘍試料のかなりの部分、例えば、検査された試料中の約２０％を超えるか、約３０％を超えるか、約５０％を超えるか、それ以上かの試料において、正常組織での発現レベルの少なくとも２倍、最もありふれたものでは少なくとも５倍を超えるレベルで発現するポリペプチドも含まれる。
【００７４】
かかる腫瘍関連および／または腫瘍特異ポリペプチドの免疫原性部分が、本発明の方法で利用される場合があることが当業者には理解されるであろう。「免疫原性部分」とは、ここでは、免疫原性ポリペプチドと特異的に結合するＢ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターと免疫学的に反応する、免疫原性ポリペプチドの断片として定義される。免疫原性部分は、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ ｅｄ．、２４３−２４７(Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３）に提示される方法を含む日常的な方法を用いて同定できる場合がある。代表的な技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることを含む。
【００７５】
ポリペプチドの免疫原性部分は、完全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで抗血清および／またはＴ細胞と反応する配列を含む。前記免疫原性部分の免疫原活性レベルは、典型的には、前記完全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％、より典型的には少なくとも約７０％、最も典型的には約９０％を超える。
【００７６】
したがって、本発明の方法で有用な免疫療法用ポリペプチドは、上記の１個または２個以上の腫瘍特異的および／または腫瘍関連ポリペプチドと免疫学的に反応するＴ細胞および／または抗体を誘発できる。
【００７７】
腫瘍特異的および／または腫瘍関連ポリペプチドは患者の免疫系によって「自己」ポリペプチドとして認識される場合があり、したがって、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の刺激剤としてはよくない場合があることは当業者に明らかであろう。したがって本発明は、異種ポリペプチド特に前記腫瘍関連および／または腫瘍特異的ポリペプチドの免疫原性部分を含む異種ポリペプチドが本発明の方法において代替的に使用される場合があることも意図する。したがって、かかる異種ポリペプチドの使用は、特定の自己ポリペプチドに対する免疫トレランスを克服するために用いられる場合がある。代表的な異種ポリペプチドは、マウス、ラット、サル、ブタおよび／またはその他のヒト以外の動物から単離されたポリペプチドを含む。
【００７８】
上記の融合タンパク質と同様に、本発明のポリペプチドは、当業者に用意に利用可能なさまざまな周知の合成および／または組換え技術のいずれかを用いて調製される場合がある。約１５０個のアミノ酸未満のポリペプチド、部分その他の変異体は、例えば、上記のメリーフィールド固相合成法のような市販の固相技術のいずれかを用いて、合成手段によって作成される場合がある。
【００７９】
（ｂ）ポリヌクレオチドおよびポリペプチド利用療法剤
ここに提供される中ないし高分化型がんの治療法は１個または２個以上の抗がんワクチンを用いる場合があり、該ワクチンの最もありふれたものはポリヌクレオチド利用抗がんワクチンである。特定の抗がんワクチンの具体的な特徴に関係なく、これらは全て抗がん免疫応答を刺激する能力を共有する。前記ワクチンの抗原性のある部分は、上記に開示されたペプチド、タンパク質および融合タンパク質の形状で送達される場合および／または例えばＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスその他の当業者に知られたウイルスのようなポリヌクレオチドの形状で送達される場合がある。
【００８０】
したがって、本発明の方法は、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを用いる場合があり、（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡのような）ＤＮＡか、（ＨｎＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）ＲＮＡかの場合がある。適当なポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドおよび部分を含む、免疫原性ポリペプチドまたはその部分をエンコードする内在配列を含むのが最も典型的である。
【００８１】
免疫療法用ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローン化部位、その他のコーディングセグメント等のような、前記ポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドの発現を増強および／または促進するその他のＤＮＡ配列とともに組み合わされる場合がある。
【００８２】
ポリヌクレオチドは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて普通に実行されるような、化学的手段によって断片を直接合成することによって、容易に調製される場合がある。代替的には、断片は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書のＰＣＲ（商標）技術のような核酸複製技術を応用すること、選択された配列を組換え産生用の組換えベクターに導入すること、その他の当業者に一般的に知られた組換えＤＮＡ技術によって得られる場合がある。一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）を参照せよ。
【００８３】
免疫療法用ポリペプチドを発現する適当なポリヌクレオチドは、例えば、腫瘍関連および／または腫瘍特異的な発現（すなわち、別の組織および／または正常組織での発現よりも少なくとも２倍の発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって同定される場合がある。代表的な適当なマイクロアレイスクリーニング技術は、アフィメトリクス社（カリフォルニア州、サンタクララ）の技術を含み、製造者の指示書に従って利用される場合がある。Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９(１９９６）および、Ｈｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５(１９９７）を参照せよ。
【００８４】
所望のポリペプチドの発現は、対応するポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することによって達成される場合がある。免疫療法用ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの発現を達成する代表的な技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、同上、および、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同上に提供される。
【００８５】
さまざまな発現ベクター／宿主細胞系が腫瘍関連および／または腫瘍特異的なポリヌクレオチドを発現するために用いられる場合がある。発現システムは、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物か、酵母発現ベクターで形質転換された酵母か、ウイルス発現ベクターを感染した昆虫細胞系か、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系か、動物細胞系かを含む。
【００８６】
関心のある免疫療法用ポリペプチドを発現することに加えて、かかるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが、当業者に知られたさまざまな送達システムのうちのいずれか１つを利用することによって患者に投与される場合がある。代表的な遺伝子送達技術は、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３−１９８(１９９８）およびその引用文献に記載される。適当な発現システムは、前記患者における発現のためのＤＮＡ調節配列（すなわち、プロモーターおよび転写終結シグナル）を含むであろう。最もありふれている患者でポリヌクレオチドを発現するシステムは、ウイルスを利用するシステムである。例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルスおよびアルファウイルスを利用したシステムは全て記載されている。
【００８７】
適当なレトロウイルス利用遺伝子発現システムは、米国特許第５，２１９，７４０号明細書、Ｍｉｌｌｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０(１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４(１９９０）；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２(１９９１）；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７(１９９３）；および Ｂｏｒｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９(１９９３）に記載されている。
【００８８】
代表的なアデノウイルス利用システムは、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４(１９８６）；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１(１９９３）；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９(１９９４）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８−９３３−９４０(１９９４）；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８(１９９４）；Ｂｅｒｋｎｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９(１９８８）；および Ｒｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６(１９９３）に提示される。
【００８９】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）利用遺伝子発現システムは、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号明細書、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６(１９８８）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５３３−５３９(１９９２）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９(１９９２）；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１(１９９４）；Ｓｈｅｌｌｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９(１９９４）；および Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５(１９９４）に開示される。
【００９０】
（ｃ）免疫療法用抗体
免疫療法用抗体は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体が典型的である。例えばＰＡＰに対する免疫は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルスワクチンを用いるワクチン処理によるＰＡＰに対する免疫応答の誘導と同様に、ＰＡＰ特異的なモノクローナル抗体の注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によっても誘導できる。かかる抗体は、生体内で前記抗原と結合して抗原提示細胞を該抗原に導く。抗原提示細胞が前記腫瘍内にこのように誘導されて侵入した後、前記抗体はワクチンと同様の腫瘍特異的免疫を誘導する。かかる腫瘍特異的抗体の他の標的は、当業者に周知のである。前記標的は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＶＥＧＦその他の腫瘍関連抗原を含む。
【００９１】
したがって、本発明の方法は、前記抗原に特異的に結合して、免疫応答を誘導する、１個または２個以上の抗体または該抗体の抗原結合断片を利用する場合がある。より具体的には抗体および／または抗原結合断片は、腫瘍関連抗原および／または腫瘍特異抗原への免疫学的結合および／またはこれらの異種変異体への免疫学的結合を示す。抗体またはその抗原結合断片がある免疫療法用ポリペプチド抗原と「特異的な結合」および／または「免疫学的な反応」を行うといえるのは、前記抗体またはその抗原結合断片が前記ポリペプチドとは（例えばＥＬＩＳＡアッセイによって）検出可能なレベルで反応するが、同様の条件下では無関係のポリペプチドとは検出可能な反応をしない場合である。
【００９２】
免疫学的結合とは、抗体と、免疫グロブリンが特異的な抗原との間での非共有結合を指す。免疫学的結合相互作用のアフィニティは、該相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表現されるのが一般的で、Ｋｄが小さいほどアフィニティが高いことを表す。抗体と、そのコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）なポリペプチドとの免疫学的結合特性は、当業者に周知の方法を用いて定量化される場合がある。１つの代表的な方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを含み、これらの速度は、前記複合体のパートナーの濃度と、前記相互作用のアフィニティと、両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的なパラメータとに依存する。「結合速度定数（ｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｏｎ）」および「解離速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｏｆｆ）」の両方が濃度と実際の結合および解離速度との計算によって決定できる。Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆの比は、アフィニティに関係しない全てのパラメータを消去できるので、解離定数Ｋｄに等しい。Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ．５９：４３９−４７３(１９９０）を参照せよ。
【００９３】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）のＮ末端の可変領域（Ｖ領域）のアミノ酸残基によって形成される。前記重鎖および軽鎖のＶ領域内の３カ所の非常に多様性のある部分は「超可変領域」といい、「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」として知られる、より保存された隣接部分に挟まれて配置される。「ＦＲ」という用語は、天然には免疫グロブリンの超可変領域（ＣＤＲｓ）の間に隣接して存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３カ所の超可変領域と重鎖の３カ所の超可変領域とは、互いに対して３次元空間で抗原結合表面を形成するように配置される。前記抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的で、重鎖および軽鎖のそれぞれの３カ所の超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲｓ」と呼ばれる。
【００９４】
抗体は、当業者に周知のさまざまな技術によって調製される場合がある。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、同上を参照せよ。一般に、抗体はここに記載されるモノクローナル抗体の作成と、組換え抗体の産生を可能にする、適当な細菌またはほ乳類細胞宿主へに抗体遺伝子のトランスフェクションとを含み細胞培養技術によって産生できる。１つの技術では、前記ポリペプチドを含み免疫原がまず広範囲のほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。このステップでは、上記の免疫原性ポリペプチドはなんら改変されることなく使用される場合がある。代替的には、前記ポリペプチドがウシ血清アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニンのような担体タンパク質に連結されるとき、優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原性ポリペプチドは動物宿主に注射され、該動物は定期的に採血される。前記ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適当な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって抗血清から精製される場合がある。
【００９５】
免疫原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９(１９７６）の技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性（すなわち、関心のある免疫原性ポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生できる不死化株細胞の作成を含む。かかる株細胞は、例えば上記のとおり免疫された動物から得られた脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種であることが好ましいミエローマ細胞の融合パートナーとの融合によって不死化される。例えば、前記脾臓細胞およびミエローマ細胞は数分間非イオン性デタージェントと混合され、ハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地中に低濃度でプレーティングされる。好ましい選択技術は、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）選択を用いる。前記細胞ハイブリッドの単一コロニーが選択され、培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性および特異性が高いハイブリドーマが好ましい。モノクローナル抗体は増殖中のハイブリドーマのコロニーの上清から単離され、前記抗体を作成するための免疫原として用いられた、免疫原性の前記ポリペプチドか、その免疫原性のある部分かを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される場合がある。
【００９６】
多数の治療上有用な分子は、前記抗体分子の免疫療法活性を示すことができる抗原結合部位を含む。タンパク分解酵素パパインはＩｇＧ分子を優先的に切断して複数の断片を精製するが、前記断片のうちの２個（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ１個の無傷な抗原結合部位を含む共有結合のヘテロ２量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含む複数の断片を提供することができる。
【００９７】
Ｆｖ断片は、ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク分解切断によって産生できる。しかしＦｖ断片は、当業者に知られた組換え技術を用いて作成されるのがもっと一般的である。前記Ｆｖ断片は、天然の抗体の抗原認識および抗原結合能力の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合のＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体を含む。Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２(１９７２）；Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７０６−２７１０(１９７６）；および Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：４０９１−４０９６(１９８０）。
【００９８】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをエンコードするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬをエンコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される共有結合で連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体である。Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９−５８８３(１９８８）。抗原結合部位の構造とほぼ類似する３次元構造にフォールディングするｓｃＦｖ分子の作成を容易にする複数の方法が記載されている。米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号および第４，９４６，７７８号明細書。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【００９９】
ヒト以外の抗体をヒトに投与する場合に該抗体に対する免疫応答を低減するために、本発明の免疫療法用抗体はヒト以外の免疫グロブリンの抗原結合部位の可変ドメインおよび相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をそれぞれ含む「キメラ」および「ヒト化」モノクローナル抗体を含む。キメラ抗体の調製はＣａｂｉｌｌｙに付与された米国特許第４，８１６，５６７号明細書に説明され、ヒト化抗体はＱｕｅｅｎに付与された米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号明細書と、Ａｄａｉｒに付与された米国特許第５，８５９，２０５号明細書と、Ｗｉｎｔｅｒに付与された米国特許第５，２２５，５３９号明細書とに説明される。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【０１００】
抗体の可変ドメインのそれぞれは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられた３個の超可変ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み、前記フレームワーク領域は、ＣＤＲ領域に支持を提供し、ＣＤＲ領域相互間の空間的関係を規定する。抗原結合部位は、重鎖可変領域由来の３個のＣＤＲと軽鎖可変領域由来の３個との６個のＣＤＲを含む。ＣＤＲのアミノ酸残基は前記結合した抗原と接触し、最も強い接触は重鎖ＣＤＲ３を通じて提供される。
【０１０１】
重鎖および軽鎖の可変ドメインのそれぞれには４カ所のフレームワーク領域がある。フレームワーク領域の一部のアミノ酸残基は結合した抗原と接触する場合があるが、フレームワーク領域は可変領域を抗原結合部位にフォールディングさせる役割を主に担う。フレームワーク領域内では、一部のアミノ酸残基と一部の構造的な特徴とが非常によく保存される。例えば、全ての可変領域は約９０個のアミノ酸残基のジスルフィド結合による内部ループを含む。前記可変領域が結合部位にフォールディングするとき、ＣＤＲは抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。フレームワーク領域内の保存された構造領域は、ＣＤＲループのフォールディングした形状に影響を与えて、正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ある種の「カノニカルな」構造を形成させる。そして、一部のフレームワーク領域の残基は、抗原重鎖および軽鎖の相互作用を安定化させる非共有結合のドメイン間接触に参加する。
【０１０２】
ヒト化および／またはキメラ免疫療法用抗体は、天然のフレームワーク領域ポリペプチドフォールディング構造のほぼ全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、前記フレームワーク領域内のアミノ酸残基がヒトフレームワーク領域残基で置換される、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）処理を通じてさらに改変される。ベニア化技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性は、抗原結合表面内での重鎖および軽鎖のＣＤＲの構造および相対的配置によって主に決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３(１９９０）。したがって抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造と、ＣＤＲ構造どうしの相互作用と、ＣＤＲと可変領域ドメインの他の部分との相互作用とが注意深く維持される場合にのみヒト化抗体において保存できる。ベニア化技術を用いることによって、免疫系に容易に遭遇するフレームワーク領域の残基は、免疫原性が弱いか、あるいは、ほぼ非免疫原性かのベニア化表面を含むハイブリッド分子を提供するためにヒトの残基で選択的に置換される。
【０１０３】
他の実施態様では、本発明の方法は、１個または２個以上の完全ヒト化（ｆｕｌｌｙ−ｈｕｍａｎ）免疫療法用抗体を利用するのがより適当である。例えば、上記指摘のとおり、ヒト化およびキメラ抗体を含む非ヒト抗体は、ヒトに生体内で投与されるとき、抗免疫グロブリン免疫応答を誘発することがよくある。
【０１０４】
完全ヒト化抗体の作成法は当業者に容易に利用可能であり、（１）抗体レパートリーがヒトの抗体レパートリーに置換されたトランスジェニック動物を免疫原性ポリペプチドで免疫するか、（２）ファージディスプレイ抗体ライブラリを免疫原性ポリペプチドでスクリーニングして、ヒト抗体重鎖および軽鎖をエンコードするポリヌクレオチドを単離することによって最も頻繁に達成させる。
【０１０５】
本発明の方法に用いる免疫療法用抗体を作成するのに適当なトランスジェニック動物システムは、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，１６２，９６３号、第６，０７５，１８１号および第５，７７０，４２９号明細書に開示される。ファージディスプレイ法は米国特許第６，２４８，５１６号、第６，２９１，１５８号、第６，２９１，１５９号、第６，２９１，１６０号、第６，２９１，１６１号、第５，９６９，１０８号、第６，１７２，１９７号、第５，８８５，７９３号、第６，２６５，１５０号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６９８号、第５，８３７，５００号および第６，３００，０６４号明細書に提示される。これらの特許のそれぞれは、引用によりここに取り込まれる。
【０１０６】
本発明の方法に用いるのに適当な免疫療法用抗体は、例えば、放射性同位元素、分化誘導剤、薬物、毒素および／またはこれらの誘導体のような治療用試薬の１個または２個以上をさらに含む場合がある。代表的な放射性同位元素は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉを含む。適当な薬物は、メトトレキセートおよびピリミジン／プリン類似体を含む。分化誘導剤は、フォルボールエステルおよび酪酸を含む。そして毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
【０１０７】
治療用試薬は、免疫療法用抗体と、直接的か、あるいは間接的（すなわちリンカー原子団を介して）かのいずれかで連結される場合がある。治療用試薬を抗体に結合する方法は当業者に周知である。例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌに付与された米国特許第４，６７１，９５８号明細書は、適当な２価および多価リンカーシステムおよび方法論を開示する。
【０１０８】
切断可能なリンカーは、連結されない治療用試薬の毒性が抗体に結合されたときの毒性を上回るときに、代替的に使用される場合がある。本発明の方法のために治療用試薬を抗体に連結するのに適当な切断可能なリンカーは、例えば、（１）ジスルフィド結合の還元（米国特許第４，４８９，７１０号明細書）、光分解性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）結合の照射（米国特許第４，６２５，０１４号明細書）、（３）誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解（米国特許第４，６３８，０４５号明細書）、（４）血清補体触媒加水分解（米国特許第４，６７１，９５８号明細書）および（５）酸触媒加水分解（米国特許第４，５６９，７８９号明細書）によって切断可能なリンカー基を含む。これらの特許のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【０１０９】
（ｄ）細胞利用免疫療法剤
細胞利用免疫療法用組成物は、上記以外の方法で調製された抗原提示細胞（ＡＰＣ）および樹状細胞（ＤＣ）ワクチンを含む。代替的に、あるいは、追加的に、本発明の方法に用いるのに適当な細胞利用組成物は、上記の腫瘍関連ポリペプチドおよび／または腫瘍特異ポリペプチドに特異的なＴ細胞の１個または２個以上の集団を含む場合がある。
【０１１０】
かかるＡＰＣ／ＤＣ調製物の代表的なものは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのようなサイトカイン中で培養された細胞から調製された、ＡＰＣ／ＤＣワクチンを含むがこれらに限られない。また前記ＡＰＣまたはＤＣは、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡのような核酸、またはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスのいずれかの形状その他の当業者に周知の方法の腫瘍特異抗原に曝露される場合がある。さらに、中ないし高分化型がん細胞に特異的な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞が使用される場合がある。ＴＩＬ集団は、がんから単離され、ＩＬ−２存在下で生体外で増殖され、標準的な養子移植（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）法で前記がんの患者に再投与されつ場合がある。適当なＴＩＬ集団は、ＣＤ４＋かつＣＤ８＋のＴ細胞を含むＴリンパ球を主に含む。
【０１１１】
１個または２個以上のポリペプチドに特異的なＴ細胞は、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて培養下または生体内で調製される場合がある。例えばＴ細胞は、骨髄、末梢血またはがん患者から単離された骨髄または末梢血の分画から、ＩｓｏｌｅｘＴＭ（Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、Ｉｒｖｉｎｅ）のような市販の細胞分離システムか、米国特許第５，２４０，８５６号および第５，２１５，９２６号明細書と、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ８９／０６２８０号、第ＷＯ９１／１６１１６号および第ＷＯ９２／０７２４３号明細書とに記載されたシステムかを使って単離される場合がある。これらの特許文献のそれぞれは引用によりここに取り込まれる。
【０１１２】
Ｔ細胞は、免疫療法用ポリペプチド、かかるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドおよび／または前記免疫療法用ポリペプチドの少なくとも一部を提示する抗原提示細胞または樹状細胞で刺激される場合がある。かかる刺激は、関心のある免疫療法用ポリペプチドに特異的なＴ細胞を生成することを可能にするのに十分な条件および時間実行される場合がある。
【０１１３】
Ｔ細胞がある免疫療法用ポリペプチドに特異的といえるのは、該Ｔ細胞が、特異的な増殖、サイトカイン分泌および／または前記ポリペプチドでコーティングされり、前記ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現する標的細胞を殺す場合である。Ｔ細胞の特異性は、例えば、増殖クロム放出アッセイまたは増殖アッセイのような当業者に知られた複数の方法のいずれかを用いて評価される場合があるが、陰性対照と比較した細胞溶解および／または増殖の２倍以上の増大といる刺激指数がＴ細胞特異性を示す。かかるアッセイは、例えばＣｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０(１９９４）に記載されるように実施される場合がある。
【０１１４】
代替的に、Ｔ細胞の増殖の検出は、例えば、（例えば、ＤＮＡに取り込まれるトリチウムチミジン量によって）ＤＮＡ合成速度の増大を測定することによって達成される場合がある。免疫療法用ポリペプチドとの接触は、Ｔ細胞の増殖を少なくとも２倍増大させる結果になるのが典型的である。Ｔ細胞の活性化は、ＴＮＦまたはＩＮＦ−γの放出のような標準的なサイトカインアッセイを用いて測定される場合がある。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１(Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８）を参照せよ。一般的には、現行の方法で免疫療法用の目的に適するＴ細胞は、免疫療法用ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣ／ＤＣに応答して増殖するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１１５】
（ｅ）併用免疫療法剤
一部の実施態様では本発明は、上記の免疫療法用試薬または組成物を２個または３個以上含む併用免疫療法剤を提供する。個々の免疫療法用試薬のそれぞれは、個別に投与される場合もあれば、前記免疫療法用試薬を２個または３個以上含む併用免疫療法剤単一の組成物に混合される場合もある。例えば本発明は、前期のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質またはコンジュゲートを含む免疫療法用組成物を、例えば治療用抗体、抗がんワクチンおよび／または細胞利用治療剤のような１個または２個以上の追加の免疫療法剤とともに提供する。代表的な治療用抗体は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＶＥＧＦおよび／またはその他の腫瘍関連抗原と結合するモノクローナル抗体のような抗体を含むが、これらに限られない。
【０１１６】
ここに提供される代表的な併用免疫療法用組成物は、抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）モノクローナル抗体と組み合わされたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦを含む。例えば、適当な抗ＶＥＧＦ抗体は、腫瘍血管形成の阻害に有効であることが知られているヒト化マウスモノクローナル抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ、ジェネンテク、カリフォルニア州、サンフランシスコ）である。
【０１１７】
免疫療法
他の実施態様では本発明は、上記の免疫療法用組成物を利用してがん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法は、中ないし高分化型を示し、その分化型に相当する増殖特性を有するがん細胞は、免疫療法の治療方式をに独特の感受性があるという観察に基づく。したがって本発明の方法は、（ａ）がん患者におけるがんの文化度を決定するステップと、（ｂ）免疫療法用組成物の治療上の有効量を前記患者に投与するステップと、（ｃ）前記がんの進行を監視するステップとを含む。
【０１１８】
これらの方法による免疫療法の治療方式は、中ないし高分化型のがんの患者の場合に用いられる。１個または２個以上のがん細胞を含む試料が患者から単離され、これらの細胞の分化度が上記のとおり決定される。中ないし高分化型のがん患者が免疫療法用組成物を用いる治療のために選択される。前記免疫療法用組成物の治療上の有効量が投与され、がんの進行が治療効果を確認するために監視される。１０％、２５％または５０％の腫瘍の進行の低減が、本発明の方法によるがんの治療が有効であることを示す。
【０１１９】
本発明の代替的な実施態様は、免疫療法用試薬を２個または３個以上投与することを含む免疫療法の治療方式を提供する。ここに例示するとおり、適当な治療方式は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理した樹状細胞を含む第１の免疫療法用試薬を投与するステップと、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂのような抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含む第２の免疫療法用試薬を投与するステップとを含む。これらの方法によってＰＡＰでパルス処理された樹状細胞は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の投与と同時に患者に投与される。代替的には、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理された樹状細胞は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の投与と独立に投与される場合がある。例えば本発明の特定の実施態様では、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理された樹状細胞は、第０、２および４週に静脈注射で投与される場合があり、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂは第０、２および４週と、その後毒性、病気の進行および／または転移の発生のような事象が起こるまで２週置きに投与される場合がある。
【０１２０】
上記の免疫療法用組成物の投与の経路および頻度と、投与量とは個人ごとに異なるが、標準的な技術を用いて容易に確立できるであろう。一般に前記免疫療法用組成物は、注射（例えば、皮内注射、筋注、静注または皮下）、経鼻（例えば吸引）または経口により投与される場合がある。５２週の期間内に１ないし１０回投与されるのが好ましい。代替的なプロトコールが個々の患者について適当である場合がある。
【０１２１】
適当な投与量は、上記のとおり投与されるとき、抗腫瘍免疫応答を促進できる組成物の量で、基本レベル（すなわち未治療のレベル）の少なくとも１０−５０％を超えるレベルである。かかる応答は、患者の腫瘍細胞を生体外で殺すことができる細胞傷害性エフェクター細胞または患者の抗腫瘍抗体を測定することによって監視できる。かかる免疫療法用組成物は、未治療の患者と比較して、治療された患者で治療結果の改善（例えば、より頻繁な寛解、完全または部分的なあるいはより長期にわたるがんでない状態での生存）につながる免疫応答を起こすことができるはずである。一般に、１個または２個以上のポリペプチドを含む免疫療法用組成物について、１回投与量に存在するそれぞれのポリペプチドの量は、宿主の体重のｋｇあたり約２５ｍｇから５ｍｇまでの範囲である。適当な投与量サイズは、患者のサイズに応じて変わるが、約０．１ｍＬから約５ｍＬまでの範囲が典型的である。
【０１２２】
一般に、適当な投与量および治療方式は、治療の利益を与えるのに十分な量の前記免疫療法用組成物を提供する。かかる応答は、未治療の患者と比較して、治療された患者における治療結果の改善（例えば、より頻繁な寛解、完全または部分的なあるいはより長期にわたるがんでない状態での生存）を確立することによって監視できる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増大は、治療結果の改善と一般的には相関する。一般的にかかる免疫応答は、治療の前後の患者から得られた試料を用いて実施される、標準的な増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを用いて評価される場合がある。
【０１２３】
がん細胞の免疫療法に対する感受性を評価する方法
本発明は、免疫療法用組成物に対する感受性を評価する方法を提供する。上記のとおり、本発明の一部として中ないし高分化型がん細胞は免疫療法のモダリティに独特な感受性がある。
【０１２４】
したがって本発明は、がん患者において免疫療法用組成物に対するがんの感受性を評価する方法であって、（ａ）前記患者から前記がん細胞を含む試料を単離するステップと、（ｂ）前記がん細胞の分化状態を決定するステップとを含み、中ないし高分化型がんが、前記がん細胞は免疫療法用組成物を用いる治療に対して感受性があることを示す、がんの感受性を評価する方法を提供する。
【０１２５】
ここに説明するとおり、がん細胞の分化状態はその等級を評価することによって定義される場合がある。高分化型がんは等級１に分類され、中分化型がんは等級２に分類され、低分化型がんは等級３に分類される。
【０１２６】
本発明に従う評価方法に適する代表的ながんは、例えば、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／結腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとを含む。しかし本発明の評価方法は、高分化型および中分化型がん細胞を低分化型がん細胞から鑑別する十分に確立した基準が存在する、いかなるがん、全てのがんに等しく適合することが了解されるであろう。
【０１２７】
上記のとおり高分化型または中分化型と同定されたがんは、ここに開示され、あるいは、当業者に容易に入手可能な免疫療法用組成物のいずれかを用いる治療に対する感受性がある。前立腺がんという具体的なケースでは、本発明は、例えば７以下のグリーソン指数によって証明された高分化型または中分化型の細胞を有しここに開示されたタンパク質コンジュゲートによって刺激される樹状細胞のような刺激された樹状細胞を用いる免疫療法用組成物の１つを用いる治療に対して感受性がある、患者を同定するために用いられる場合がある。一部の好ましい実施態様では、前記免疫療法用組成物が上記に開示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を用いて生体外で刺激された樹状細胞を含む、前立腺がん細胞の治療に対する感受性を評価する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
以下の実施例は例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
【実施例１】
【０１２９】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の構築
本実施例は、既に米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に開示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＰＡ２０２４）をエンコードするｃＤＮＡの構築を説明する。
【０１３０】
ヒトＰＡＰは前立腺がん株細胞ＬｎＣａＰ．ＦＧＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ、メリーランド州、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）からクローン化された。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な方法に従ってＫｅｙｓｔｏｎｅ Ｌａｂｓ（カリフォルニア州、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ）によって注文生産で合成された。これらのプライマーは配列番号２としてここに提示される既知のＰＡＰｃＤＮＡ配列の５’末端に相同性があった。使用する個々の発現ベクターの必要に応じてＨｉｎｄ ＩＩＩ、Ｍｕｎ ＩまたはＸｈｏ Ｉ制限部位が取り付けられた。３’末端には、ＰＡＰ配列の停止コドン用のＢａｍＨ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を置換してグリシンおよびセリンコドンを生成するオリゴヌクレオチドが構築された。このＢａｍＨ Ｉ部位は、ＰＡＰのｃＤＮＡ（配列番号２）を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）からクローン化されたＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ（配列番号４）に融合するための用いられた。前記ＧＭ−ＣＳＦの５’末端には、ＢａｍＨ Ｉ部位が、ＧＭ−ＣＳＦ配列のアミノ酸１８−２３をコーディングヌクレオチドに相同性のあるオリゴヌクレオチドに取り付けられた。ＧＭ−ＣＳＦの３’末端は、ＧＭ−ＣＳＦの読み枠の停止コドンの後まで含み、Ｘｂａ Ｉクローン化部位を生成するオリゴヌクレオチドを用いて作成された。
【０１３１】
ポリＡ＋ＲＮＡは、Ｍｉｃｒｏ Ｆａｓｔ ｔｒａｃｋキット（インビトロジェン）を用いて、製造者の供給するマニュアルに従って、株細胞ＬｎＣａＰ．ＦＧＣおよびＰＢＭＮＣからタンパク質（登録商標）にされた。前記ポリＡ＋ＲＮＡは、ｃＤＮＡサイクルキット（インビトロジェン）を用いて、添付されるマニュアルに記載された手順に従って逆転写された。第１鎖ｃＤＮＡは上記のプライマーを用いて２５回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供された。前記ＰＣＲの産物はベクターｐＣＲ３、ｐＣＥＰ４（ともにインビトロジェン）およびｐＢａｃＰａｃ８（クロンテク）にクローン化されて、それぞれｐＣＲ３−ＰＡＰ−ＧＭ、ｐＣＥＰ４−ＰＡＰ ＧＭおよびＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣが構築された。クローン化されたコンストラクトのＤＮＡ配列は、蛍光シーケンサーモデルＡＢＩ ３７３Ａ（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）で標準的な方法を用いて確認された。ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号６および５として提示される。
【０１３２】
ｐＣＲ３−ＰＡＰ−ＧＭは一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現をさせるためにＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）にエレクトロポレーション処理された。予測されるサイズ、免疫学的同一性および機能のタンパク質がＣＯＳ−７細胞および２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン）で一過性に発現できることが確認された後、安定的なトランスフェクタントが、エピソーム発現ベクターのｐＣＥＰ４（インビトロジェン、カリフォルニア州、サンジエゴ）を用いてヒト胚腎臓細胞株２９３−ＥＢＮＡで作成された。エレクトロポレーションとハイグロマイシンでの選択との後、組換えクローンが、限界希釈条件下で細胞をプレーティングし該細胞の組織培養上清中のＰＡＰの生物活性についてスクリーニングすることによって作成された。産生量の最も大きいクローンが無タンパク質培地に馴化され、ＣｅｌｌＭａｘ中空繊維バイオリアクタ（ギブコ、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）中で増殖された。使用済みの前記培地が回収され、プールされて、遠心によって清澄化された。その後前記培地は、ヒトＰＡＰ特異的モノクローナル抗体ＡＴＣＣＨＢ８５２６（ＡＴＣＣ）をセファロース樹脂に結合することによって作成された免疫アフィニティカラムを通された。洗浄の後、結合した物質は低ｐＨで溶出され、中和されて、生理的バッファーに対して透析された。溶出された分画は、還元条件下での変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。得られたゲルは、完全にグリコシル化されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦの予測サイズに対応する７５ｋＤの単一タンパク質のバンドを示した。
【０１３３】
ＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣは、ＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣとＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡ（クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）との相同組換えによって組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ、バキュロウイルス）を作成するのにも用いられた。ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現システム（クロンテク）からの試薬が用いられ、基本的にその製品マニュアルに記載のとおり手順が実行された。ＰＡＰＨＧＭ−ＢＡＣおよびＢａｃＰＡＫ６はリポフェクションによってＳＦ２１細胞（クロンテク）にコトランスフェクションされた。使用済みの組織培養上清は第５日に回収された。前記上清は新鮮なＳＦ２１細胞上に滴定され、該細胞は半固形培地中で４日間培養された。単層培養が中性赤で染色された後、ウイルスのプラークが同定され、パスツールピペットで拾われた。プラークで精製された組換えウイルスは、新鮮な培養に溶出され、新鮮なＳＦ２１細胞でのＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ産生についてスクリーニングするのに用いられた。陽性のプラークが同定され、ウイルスのストックと組換えタンパク質をその後複数回の新鮮なＳＦ２１細胞感染で作成するために用いられた。産生培養の培地は感染後３日目に回収された。前記培地は２９３−ＥＢＮＡ細胞由来のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦについて説明されたとおりに処理された。免疫アフィニティ精製されたタンパク質の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色後６４ｋＤの単一タンパク質のバンドを示した。
【実施例２】
【０１３４】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の生物活性
本実施例は、米国特許第５，９７６，５４６号、第６，０８０，４０９号および第６，２１０，６６２号明細書に既に開示されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の生物活性を説明する。
【０１３５】
実施例１に記載の全ての発現システムからのＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ依存Ｔ細胞株の増殖を支持する能力について分析された。前記タンパク質は酸性フォスファターゼアッセイでの酵素活性についても分析された。標準的なバイオアッセイが前記ＧＭ−ＣＳＦ生物活性を決定するために用いられた。
【０１３６】
ＧＭ−ＣＳＦ活性
ＧＭ−ＣＳＦ依存ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１（ＡＴＣＣ、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）と、単球白血病細胞株ＡＭＬ−１９３（ＡＴＣＣ）とが、ＰＡＰとの融合の後でもＧＭ−ＣＳＦがその生物活性を保持するかどうか分析するために用いられた。ＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で日常的に培養される前記細胞株は、アッセイの前２４時間通常の培地中で飢餓状態におかれた。前記細胞は、組織培養培地中で３重に重複してウェル当たり１５００個の細胞の割合でプレーティングされた。テスト用上清または陽性対照として組換えＧＭ−ＣＳＦが前記細胞に添加された。細胞は７２時間培養され、その後、ＤＮＡ合成速度を決定するためにウェル当たり１マイクロキュリーのトリチウム標識チミジンでパルス標識された。
【０１３７】
酸性フォスファターゼ活性
前記融合タンパク質の第２の成分の生物活性は、酸性フォスファターゼ活性の酵素アッセイで決定された。酸性フォスファターゼは、酸性ｐＨでパラ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を加水分解する前記タンパク質の能力として測定された。簡潔には、テスト液は５０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．８中で希釈された。ｐＮＰＰは最終濃度２ｍｇ／ｍＬで添加された。３７°Ｃ３０分間のインキュベーションの後、等量の１Ｍ ＮａＯＨが反応液に添加された。これらの条件下で加水分解されたｐＮＰＰは黄色を呈し、４０５ｎｍの分光光度計で定量することができる。
【実施例３】
【０１３８】
前立腺酸性フォスファターゼ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物を用いるホルモン抵抗性前立腺がん患者の治療
本実施例は、前立腺酸性フォスファターゼ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物（ＡＰＣ８０１５）を用いるホルモン抵抗性前立腺がん患者の治療についての無作為化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）されたプラセボ対照付き第ＩＩＩ相臨床治験に用いられた方法論を開示する。
【０１３９】
１２７名の患者が、（１）アンドロジェン欠乏にもかかわらず病気の進行の証拠がある、組織学的に確認された前立腺腺がんであること、（２）Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ分類のステージＤの転移疾患が存在すること（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５０（６）：１０２７−１０２８(１９９７））、（３）がん関連痛がなく、鎮痛剤を使用していないこと、（４）免疫組織学によりＰＡＰ陽性の腫瘍であること、（５）テストステロンが去勢レベルである５０ｎｇ／ｄＬ未満であること、（６）ＰＳＡが５ｎｇ／ｍｌを超えること、（７）化学療法の治療方式の終了から６ヶ月経過していること（あるいは、４００を超えるＣＤ４カウントが３ヶ月未満であること）、および（８）ホルモン療法後に腫瘍が進行していること、という基準に基づいて第ＩＩＩ相臨床治験のために選択された。腫瘍の進行は、ＣＴか、あるいは、骨のスキャニングで少なくとも２カ所の新たなホットスポットがあることかのいずれかによって放射線写真での進行によって評価され、ＰＳＡの進行は、去勢療法時の少なくとも５０％以上のレベルで、現在の治療でＰＳＡが安定かまたは上昇中であることによって評価された。
【０１４０】
ＡＰＣ８０１５は、各治療コースのたびに新たに調製された。樹状細胞前駆体は標準的な１．５ないし２．０血液体積の単核球の除去血輸血（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって末梢血から回収された。コロニー刺激因子を用いる動員は不要である。前記除去血輸血産物は地元の血液銀行で調製され、Ｄｅｎｄｒｅｏｎの細胞処理工場まで輸送される。樹状細胞前駆体は、Ｈｓｕら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：５２−５８(１９９６）；Ｋｕｎｄｕら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：５１−５６０(１９９８）；および Ｐｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−１３８(１９９８）の方法の変法によって２回の逐次的な浮遊密度遠心のステップによって集められた。
【０１４１】
簡潔には、前記除去血輸血製品は浮遊密度溶液（比重＝１．０７７ｇ／ｍＬ）に重層され、赤血球および顆粒球を除去するために１，０００ｇで２０分間遠心した。界面細胞が集められ、洗浄され、第２の浮遊密度溶液（比重＝１．０６５ｇ／ｍＬ）に重層され、血小板と低密度の単球およびリンパ球とを除去するために８０５ｇで３０分間遠心された。
【０１４２】
以上に詳細に説明されるとおり、ＡＰＣ８０１５の標的抗原である、ＰＡ２０２４は、ヒトＰＡＰとヒトＧＭ−ＣＳＦとの間の融合タンパク質である。前記融合タンパク質は、バキュロウイルスシステムにクローン化され、無血清培地に馴化されたＳｆ２１昆虫細胞で発現された。ＰＡ２０２４は、３段階の逐次的なカラムクロマトグラフィーステップによって９５％を超える純度まで精製された。ＰＡＰの酵素活性と、ＧＭ−ＣＳＦの増殖促進活性によって証明されるとおり、両方のタンパク質の成分は適切な生物活性を保持していた（ＰＡＰおよびＧＭ−ＣＳＦの活性のアッセイの説明は実施例２を参照せよ。）
【０１４３】
樹状細胞前駆体を含む細胞ペレットは洗浄され、１０μｇ／ｍＬの標的抗原ＰＡ２０２４を添加したＡＩＭ培地（ＡＰＣ８０１５処理された患者用）または標的抗原ＰＡ２０２４無添加のＡＩＭ培地（プラセボ処理された患者用）でインキュベーションされた。前記培地は、血清または外在性のサイトカインを含まなかった。４０時間３７°Ｃで５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベーションした後、前記細胞は、洗浄され、２５０ｍＬの乳酸リンゲル液（ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に所望の臨床量で処方された。
【０１４４】
灌流用免疫療法用ＡＰＣ８０１５組成物を放出する基準は、（１）工程内無菌性試験で４０時間内に増殖がないこと、（２）エンドトキシンが１．４ＥＵ／ｍＬ未満であること、（３）Ｔ＝０の値より上の３ＳＤを超えるＣＤ５４発現であること、および、（４）細胞の生存性が７２％を超えることを含む。さらに、表現型は抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５４、ＣＤ６６ｂおよびＣＤ８６モノクローナル抗体（ベクトン・ディキンソン、カリフォルニア州、サンホセ、コールター、フロリダ州、マイアミ）を用いるフロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定された。結果が灌流後に利用可能な追加のテストは、最終製品の無菌性およびマイコプラズマであった。最終的なＡＰＣ８０１５製品またはプラセボ製品は、４°Ｃで元の病院に送り返され、処方８時間以内に患者に輸血された。ＡＰＣ８０１５およびプラセボは、それぞれ３０分間を超える時間をかけて別々に輸血された。患者は輸血前にルーティン化した前処置はされない。患者は輸血後３０分間観察され、帰宅を許された。予め精巣切除されていない患者は黄体形成ホルモン放出ホルモンのアゴニストを用いる生殖腺抑制を継続した。
【０１４５】
ＡＰＣ８０１５を投与された患者８２名と、ＰＡ２０２４ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質で予め刺激されない樹状細胞を含むプラセボで処理された患者４５名について、除去血輸血が−２、１２および２６日目に実施され、それぞれ輸血が０、１４および２８日目に実施された。
【０１４６】
患者は、客観的な疾患の進行か１年間経過かのいずれか早い時点まで観察された。診療上のエンドポイントは、（１）８週間ごとのスキャニングによる疾患の進行と、（２）疾患関連痛の発症という基準によって評価された。血清ＰＳＡレベルは、疾患が進行するまで４週間ごとに測定された。進行するまでの時間は、登録の日から客観的な疾患の進行が記録された日までの時間として定義された。客観的な疾患の進行（例えば、ＰＳＡの上昇）が起こらないのに治験を止めることに決めた患者は、治験からの脱退時に疾患の進行があったものとみなされた。第１のエンドポイントは、（１）骨スキャニング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴映像（ＭＲＩ）によって測定される客観的な疾患の進行と、（２）安全性とを含む。第２のエンドポイントは、疾患関連痛の進行および反応速度を含む。
【実施例４】
【０１４７】
免疫療法用組成物の治療上の有効性は前立腺がんの分化状態と相関する
本実施例は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（すなわちＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物の治療上の有効性は、前立腺がん細胞の分化状態と相関することを証明する。
【０１４８】
上記のＡＰＣ８０１５またはプラセボを用いる免疫療法の治療方式を開始する前に、患者は疾患特性の基線量について評価された。前立腺がん細胞の分化状態を決定するために、前立腺組織試料が各患者から単離され、Ｇｌｅａｓｏｎ、Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ、ｐｐ．１７１−１９７(Ｔａｐｐｅｎｈａｕｍ、編、Ｌｅｅ ＆ Ｆｅｈｉｇｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、１９７７）に記載のグリーソン指数化法による分析に供された。この評価の結果は表１に示される。
【０１４９】
客観的な疾患の進行までの時間は、骨スキャニングまたはＸ線での進行か、あるいは、臨床的な悪化かとして定義され、データはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法による統計解析に供された。ＰＳＡは疾患の進行を決定するためには用いられなかった。表２に示されるとおり、ＡＰＣ８０１５で処理された患者集団についての疾患進行時間のメジアン（中央値）は１１．０週間で、プラセボ処理された患者集団についての疾患進行時間のメジアンは９．１週間であった。表３および図１は、進行のない生存の百分率をＡＰＣ８０１５またはプラセボの投与後の時間の関数として示す。２つの集団についての時間対疾患進行の曲線の比較によって導かれたｐ値は０．０８５であった。
【０１５０】
表４および６は、それぞれ、低分化型（グリーソン指数８以上）の前立腺がん細胞の患者と、中ないし高分化型（グリーソン指数７以下）の前立腺がん細胞の患者についての時間対疾患進行を開示する。表５および図２と、表７および図３とは、それぞれ、低分化型がん細胞の患者集団と、中ないし高分化型がん細胞の患者集団とに対するＡＰＣ８０１５またはプラセボの投与後の時間の関数として進行のない生存の百分率を示す。
【０１５１】
これらのデータは、低分化型前立腺がん細胞を有する患者は、プラセボ処理患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処理患者集団についての客観的な疾患の進行までの時間において統計的に有意な差がないこと（ｐ値＝０．４３１）を証拠として、低分化型前立腺がん細胞の患者はＡＰＣ８０１５を用いる治療に抵抗性があったことを証明した。これに対し、中ないし高分化型前立腺がん細胞（グリーソン指数７以下）の患者について得られた結果は、プラセボ処理患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処理患者集団についての客観的な疾患の進行までの時間において統計的に有意な差がないこと（ｐ値＝０．００２）を証拠として、かかる患者が免疫療法用組成物を用いる治療に感受性があったことを示す。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
【表２】
ａ ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋテストを用いて処置群の疾患進行までの時間の曲線を比較する。
＊ 途中打ち切り（ｃｅｎｓｏｒｅｄ）された観察例
【０１５４】
【表３】
【０１５５】
【表４】
ａ ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋテストを用いて処置群の疾患進行までの時間の曲線を比較する。
＊ 途中打ち切りされた観察例
【０１５６】
【表５】
【０１５７】
【表６】
ａ ｐ値はｌｏｇ−ｒａｎｋテストを用いて処置群の疾患進行までの時間の曲線を比較する。
＊ 途中打ち切りされた観察例
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
図５は、ＡＰＣ８０１５を投与された患者が、プラセボを投与された患者と比較して、Ｔ細胞性免疫応答のメジアンにおける統計的に有意な（ｐ値＝０．０００３）増強を示すことを証明するデータを提供する。図６は、グリーソン指数が７以下でＡＰＣ８０１５を投与された患者集団は、グリーソン指数が８以上でＡＰＣ８０１５を投与された患者集団と比較して、Ｔ細胞性免疫応答のメジアンにおける統計的に有意な（ｐ値＝０．００６５）増強を示すことを証明するデータを提供する。
【実施例５】
【０１６０】
本実施例は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（すなわちＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞を含む免疫療法用組成物を投与された患者における疾患関連痛発症までの時間は、グリーソン指数７以下の前立腺がん患者では、プラセボ投与患者での疾患関連痛発症までの時間より延長されるが、グリーソン指数８以上の前立腺がん患者では疾患関連痛発症までの時間はほとんど影響がなかったことを証明する。
【０１６１】
疾患関連痛は、がん関連痛の質および一貫性があり、治験参加後に発症し、痛みの場所が放射線撮影手段によって客観的に確認される疾患部位と対応する痛みとして定義された。疾患関連痛発症までの時間は、患者の無作為化から痛みの発症までの時間である。痛みは２つのやり方で測定された。患者は、十分にバリデーションされた痛みの評価ツールであるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｒｉｅｆ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙに基づく痛みの毎週の記録を記入し、医師が診察の際に評価する。盲検外部評価者（すなわち患者を診察した医師以外の者）が上記の証拠を評価した。痛みは、場所が疾患の撮像された部位に対応するときにだけがん関連痛とされた。上記の痛みのデータはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法による統計解析を用いて時間事象（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ）分析で解析された。図７に示すとおり、プラセボ処置されたグリーソン指数７以下（中ないし高分化型前立腺がん細胞）の患者集団の疾患関連痛発症までのメジアン時間は１８．７週間であった。ＡＰＣ８０１５処置群の治験終了時には痛み発症までのメジアン時間はまだ到来してなかった。ＡＰＣ８０１５処置群とプラセボ処置群との差は、統計上有意であった（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｐ＝０．０１６）。対照的に、グリーソン指数８以上（低分化型前立腺がん細胞）の患者集団の疾患関連痛発症までのメジアン時間についてＡＰＣ８０１５処置群とプラセボ処置群との差は有意ではなかった（ｐ＝０．３０４）。
【０１６２】
これらのデータは、プラセボ処置患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処置群の疾患関連痛発症までの時間に統計上有意な差がないこと（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｐ＝０．３０４）を証拠として、低分化型前立腺がん細胞の患者はＡＰＣ８０１５処置によって疾患関連痛発症までの時間にほとんど影響がなかったことを証明する。対照的に、中ないし高分化型（グリーソン指数７以下）前立腺がん細胞の患者について得られた結果は、プラセボ処置患者集団と比較して、ＡＰＣ８０１５処置患者集団のついての疾患関連痛発症までの時間に統計上高度な有意性があること（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｐ＝０．０１６）を証拠として、かかる患者はＡＰＣ８０１５処置が有益であったことを示す。
【０１６３】
さらに表８に示されるデータは、ＡＰＣ８０１５は、プラセボ投与患者集団と比較して、前立腺がん患者に好ましく受け入れられたこと（１０％以上の患者で発症、ｐ値０．０５以上）を証明する。
【０１６４】
【表８】
副作用のあった患者数（％）
【実施例６】
【０１６５】
局所利用法後血清学的な進行所見のある前立腺がん患者におけるｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂと併用されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞
本実施例は、血清学的な進行所見のある前立腺がん患者におけるヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの投与と併用してＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞の投与することを含む併用免疫療法用治療方式の有効性を開示する。
【０１６６】
簡潔には、アンドロジェン依存性（ホルモン感受性）前立腺がんで、確定的な外科または放射線療法を既に受け、０．４ｎｇ／ｍｌないし６．０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ増大で示される非転移性の再発疾患の患者が第ＩＩ相臨床治験に登録された。ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理された患者の樹状細胞が、第０、２および４週目に静注によって投与された。ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、第０、２および４週目と、その後、基線ＰＳＡ値の倍増（少なくとも４ｎｇ／ｍＬ）または転移の発症によって定義される疾患の進行か、毒性がみられるまで２週間ごとに静注によって投与された。Ｔ細胞増殖と、ＰＡＰに応答するサイトカイン産生と、樹状細胞の同時刺激／活性化マーカー発現とが検定された。表９は、第ＩＩ相臨床治験への患者の適格性についての登録および除外の基準を示す。
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
１４名の患者がこの第ＩＩ相臨床治験に参加した。１名の患者は同意を取り下げ、６名の患者は治療後期間メジアン２８週間（範囲は１２−４８週間）でＰＳＡ異常のため治験から除外され、１名の患者は、プロトコールの処置と関係があるかもしれないグレード３の心不全（ＣＨＦ）の後でＰＳＡは安定していたが前記治験から除外された。６名の患者が治験に残り、メジアン２８週間（範囲は２ないし６０週間）でＰＳＡは安定していた。処置を受けた患者の年齢のメジアンは６１歳（範囲は６０−７６歳）であった。前記患者のうち１１名のグリーソン指数は、５（患者２名）、６（患者５名）、７（患者２名）および８（患者２名）であった。
【０１６９】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞およびｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの投与
樹状細胞（ＤＣ）前駆体は、第０、２および４週の第１日目に、４時間の除去血輸血によって末梢血から回収された。樹状細胞前駆体は、前記除去血輸血の製品から浮遊密度遠心法によって単離された。前駆体細胞は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦとともに４０時間培養された。患者は、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦでパルス処理された樹状細胞の製造可能な最大投与量である、〜１．２ｘ１０９個の有核細胞／ｍ２を、第０、２および４週の第３日目に３０分間かけて静注輸血によって投与された。輸血の３０分間前に、患者はアセトアミノフェン６５０ｍｇおよびジフェンヒドラミン５０ｍｇを経口投与で前処置された。ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、９０分間かけて静注）が（ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦパルス処理樹状細胞の輸血の後）第０、２および４週とその後２週間ごとの第３日目に投与された。
【０１７０】
ＰＳＡの変動
ＰＳＡの変化は前記患者のそれぞれについて監視された。ＰＳＡレベルの減少が３名の患者で検出された（１２％減少、３３％減少および６４％減少）。ＰＳＡ基線量のメジアンは１．８８ｎｇ／ｍＬ（範囲は０．５−５．０８ｎｇ／ｍＬ）であった。応答について評価できた９名の患者のうち、３名はＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ、時間に対するＰＳＡの傾きを用いて推定される）が減少し、１名の患者は、治験参加時の２．７４ｎｇ／ｍＬから（第１２週に５．６ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ値に達した後）、１．４３ｎｇ／ｍＬまでＰＳＡの減少を示した。
【０１７１】
表１０は、処置前および処置中のＰＳＡの動態を要約する。処置前および処置中の両方のＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）は、ＰＳＡ対時間の曲線の傾きによって除算されたＬｎ２の関係を用いて推定された。ＰＳＡ倍加時間は、処置中ＰＳＡ対時間の曲線の傾きが正の患者について計算された。３名の患者は、ＰＳＡ値が減少したため処置中ＰＳＡの倍加時間を計算できなかった。３名の患者はＰＳＡ倍加時間が増大し、３名の患者はＰＳＡ倍加時間に変化がなかった。客観的な疾患の進行があった患者はいなかった。
【０１７２】
【表１０】
【０１７３】
末梢血リンパ球は各患者から基線量、第８週および第１２週に単離された。９６穴Ｕ底プレート中に１ｘ１０５個のＰＢＭＣがＲＰＭＩ−１０％ヒト血清培地中で滴定されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦに添加された。ポークウィードマイトジェンが陽性対照として用いられた。アッセイは３７°Ｃのウオーター・ジャケット式インキュベータで５％ＣＯ２、６日間インキュベーションされた。前記アッセイはインキュベーションの最後の１８時間３Ｈチミジン（アマシャム、ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）でパルス標識され、Ｔｏｍｔｅｃプレートハーベスターを使ってフィルターマットに回収された。シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）を添加した後、前記アッセイはＷａｌｌａｃベータ・シンチレーションカウンタを用いて計測された。読み取り値は１分間当たりのカウント数（ＣＰＭ）単位で報告された。
【０１７４】
これらの実験結果は、異なる濃度のＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ（２μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまで）に応答する代表的な患者のＴ細胞増殖を示す図４に示される。この患者は、５０％を超える持続的なＰＳＡ減少がみられる。テストした４名のうち２名はＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦに応答して第８および１２週でＴ細胞増殖の証明可能な増大がみられた。
【０１７５】
ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ
マルチスクリーン−ＨＡプレートのウェルは、Ｄ−ＰＢＳ中１５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＮＦ−γ抗体１００μＬで終夜４°Ｃにてコーティングされた。プレートはＰＢＳＴで洗浄され、２００μＬのＤ−ＰＢＳ＋１０％ＨＳで２時間３７°Ｃでブロッキングされた。３ｘ１０５個のＰＢＭＣがＲＰＭＩ−１０％ＨＳ中で滴定されたＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦとともに添加された。前記アッセイは３７°Ｃで４０−４８時間インキュベーションされた。２日後、細胞および抗原はＰＢＳＴを用いて前記プレートから洗浄された。検出用抗体であるビオチン化抗ヒトＩＦＮγ１００μＬがＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬでウェルに添加された。プレートはＰＢＳＴで６回洗浄され、ＰＢＳＴで１：１０００に希釈されたストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（ＭａｂＴｅｃｈ、オハイオ州、Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）１００μＬがアッセイウェルに添加された。前記アッセイは１．５時間インキュベーションされ、ＰＢＳＴで６回洗浄された。ワンステップＢＣＩＰ／ＮＢＴ液がウェル当たり１００μＬでウェルに添加され、スポットを発色するために１２分間インキュベーションされた。プレートは、ＩｍｍｕｎｏＳｃａｎアナライザーおよびソフトウェアを用いて、スキャニングされたスポットが計測された。
【０１７６】
ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＩＦＮ−γ産生は、異なるＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ濃度でのＥＬＩＳＰＯＴ解析を用いて患者から測定された。テストした３名の患者のうち３名とも基線と比較して第８週ではＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞が証明可能な増大を示した。１名の患者はＴ細胞が分析するのに十分なかった。
【０１７７】
これらのデータは、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦとｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂとの組み合わせが、血清学的に進行した前立腺がんの治療に有効であること、すなわち、ＰＳＡを変動させる活性があることを証明する。免疫学的な解析は、本治療方式からＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦ特異的な免疫応答が起こること、および、ＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦと抗ＶＥＧＦ抗体との併用免疫療法は安全で十分に受け入れられることを証明した。
【０１７８】
本発明は理解の明確さのために図面と実施例とによってある程度詳細に説明されたが、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される、本発明の範囲から逸脱することなく変更および修飾を行うことができる。
【０１７９】
配列番号１は、配列番号２のｃＤＮＡ配列にエンコードされるヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ｈｕＰＡＰ）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、配列番号１のヒト前立腺酸性フォスファターゼ（ｈｕＰＡＰ）をエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、配列番号４のｃＤＮＡ配列にエンコードされるヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、配列番号３のヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）をエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、配列番号６のｃＤＮＡ配列にエンコードされるヒト前立腺酸性フォスファターゼ／ヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＰＡＰ／ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６は、配列番号５のヒト前立腺酸性フォスファターゼ／ヒト顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子（ｈｕＰＡＰ／ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）／顆粒球−マクロファージ 投与前にコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質（ＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞か、あるいは、無刺激の抗原提示細胞（プラセボ）かで処置されたホルモン抵抗性前立腺腫瘍患者全員についての客観的な疾患の進行までの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示すグラフ。
【図２】投与前にＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞か、あるいは、無刺激の抗原提示細胞（プラセボ）かで処置されたホルモン抵抗性でグリーソン指数８以上の前立腺腫瘍患者全員についての客観的な疾患の進行までの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示すグラフ。
【図３】投与前にＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＡＰＣ８０１５）で刺激された抗原提示細胞か、あるいは、無刺激の抗原提示細胞（プラセボ）かで処置されたホルモン抵抗性でグリーソン指数７以下の前立腺腫瘍患者全員についての客観的な疾患の進行までの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示すグラフ。
【図４】末梢血単核細胞の集団中のＴ細胞の増殖に対するＰＡＰ／ＧＭ−ＣＳＦの効果を示す棒グラフ。
【図５】ＡＰＣ８０１５が、前立腺がん患者において、プラセボを投与された患者集団と比較して著しいＴ細胞性免疫応答を誘導することを証明するデータを提供する棒グラフ。
【図６】ＡＰＣ８０１５が、グリーソン指数７以下の前立腺がん患者において、グリーソン指数８以上の前立腺がん患者と比較して著しいＴ細胞性免疫応答を誘導することを証明するデータを提供する棒グラフ。
【図７】ＡＰＣ８０１５またはプラセボ処置されたグリーソン指数７以下の前立腺がん患者対ＡＰＣ８０１５またはプラセボ処置されたグリーソン指数８以上の前立腺がん患者について疾患関連痛を発症するまでの時間（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）を示す棒グラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中ないし高分化型のがんと診断された患者から得られ、腫瘍関連抗原に生体外で曝露されることによって刺激された活性化単離抗原提示細胞を含む、免疫療法用組成物。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原は腫瘍特異抗原である、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項３】
前記腫瘍関連抗原は、Ｎ末端部分とＣ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートの構成部分である、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項４】
前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項５】
前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項６】
前記がんは前立腺がんである、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項７】
前記がんはグリーソン指数が７以下である、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項８】
前記患者は、ホルモン抑制療法に抵抗性ではない、請求項７に記載の免疫療法用組成物。
【請求項９】
前記Ｎ末端部分は抗原提示細胞と結合するタンパク質で、前記Ｃ末端部分は腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１０】
前記Ｃ末端部分は抗原提示細胞と結合するタンパク質で、前記Ｎ末端部分は腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質コンジュゲートは融合タンパク質である、請求項３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は、前記Ｎ末端部分とＣ末端部分との間にリンカーペプチドを含む、請求項１１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１３】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１４】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１５】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１６】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１７】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は、配列番号３の配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物。
【請求項１８】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は、配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物。
【請求項１９】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は、配列番号３の配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物。
【請求項２０】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は配列番号３の配列である、請求項３ないし１６のいずれか１つの免疫療法用組成物。
【請求項２１】
中ないし高分化型がん細胞を有するがん患者を免疫療法用組成物を用いて治療する方法であって、
（ａ）前記患者について前記がん細胞の分化状態を決定するステップと、
（ｂ）前記患者に免疫原性のある組成物の治療上の有効量を投与するステップとを含み、
中ないし高分化型がん細胞が存在することは、免疫療法用組成物を用いる治療に感受性があることを意味し、１０％の減少が前記がんの有効な治療を意味する、中ないし高分化型がん細胞を有するがん患者を免疫療法用組成物を用いて治療する方法。
【請求項２２】
前記免疫療法用組成物は請求項１−１８のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
中ないし高分化型がんの患者におけるがん細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ａ）前記がん細胞の等級を前記患者について決定するステップと、
（ｂ）中ないし高分化型がんの患者から抗原提示細胞を単離するステップと、
（ｃ）Ｎ末端部分とＣ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートを含む免疫療法用組成物に生体外で曝露することによって前記抗原提示細胞を刺激するステップと、
（ｄ）前記刺激された抗原提示細胞の治療上の有効量を前記患者に投与するステップとを含み、
中ないし高分化型がんの等級は前記患者は治療に感受性があることを意味し、前記抗原提示細胞は前記Ｎ末端部分かＣ末端部分かのいずれかに対する細胞傷害性細胞応答を起こすためにＴ細胞を活性化するうえで有効であり、前記Ｔ細胞の活性化のレベルは、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分だけに曝露された抗原提示細胞によって起こされるＴ細胞の活性化のレベルより高く、１０％の減少が前記がんの有効な治療を意味する、中ないし高分化型がんの患者におけるがん細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２４】
前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記がんは前立腺がんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記がんの等級はグリーソン指数によって決定され、該グリーソン指数は７以下である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫療法用組成物は、請求項３−１８のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
がん患者について該がんの免疫療法用組成物に対する感受性を評価する方法であって、
（ａ）前記患者から前記がん細胞を含み試料を単離するステップと、
（ｂ）前記がん細胞の分化状態を決定するステップとを含み、
中ないし高分化型がんの等級は、前記がん細胞が免疫療法用組成物を用いる治療に感受性があることを意味する、がんの免疫療法用組成物に対する感受性を評価する方法。
【請求項２９】
前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫療法用組成物は、請求項１−２０のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
中ないし高分化型のがんと診断された患者から得られ、腫瘍関連抗原に生体外で曝露されることによって刺激された活性化単離抗原提示細胞を含む、免疫療法用組成物。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原は腫瘍特異抗原である、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項３】
前記腫瘍関連抗原は、Ｎ末端部分とＣ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートの構成部分である、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項４】
前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項５】
前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項６】
前記がんは前立腺がんである、請求項１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項７】
前記がんはグリーソン指数が７以下である、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項８】
前記患者は、ホルモン抑制療法に抵抗性ではない、請求項７に記載の免疫療法用組成物。
【請求項９】
前記Ｎ末端部分は抗原提示細胞と結合するタンパク質で、前記Ｃ末端部分は腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１０】
前記Ｃ末端部分は抗原提示細胞と結合するタンパク質で、前記Ｎ末端部分は腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質コンジュゲートは融合タンパク質である、請求項３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は、前記Ｎ末端部分とＣ末端部分との間にリンカーペプチドを含む、請求項１１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１３】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１４】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１５】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１６】
前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分は、配列番号１の配列を含む、請求項６に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１７】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は、配列番号３の配列と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物。
【請求項１８】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は、配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物。
【請求項１９】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は、配列番号３の配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物。
【請求項２０】
前記Ｃ末端部分またはＮ末端部分は配列番号３の配列である、請求項３ないし１６のいずれか１つの免疫療法用組成物。
【請求項２１】
中ないし高分化型がん細胞を有するがん患者を免疫療法用組成物を用いて治療する方法であって、
（ａ）前記患者について前記がん細胞の分化状態を決定するステップと、
（ｂ）前記患者に免疫原性のある組成物の治療上の有効量を投与するステップとを含み、
中ないし高分化型がん細胞が存在することは、免疫療法用組成物を用いる治療に感受性があることを意味し、１０％の減少が前記がんの有効な治療を意味する、中ないし高分化型がん細胞を有するがん患者を免疫療法用組成物を用いて治療する方法。
【請求項２２】
前記免疫療法用組成物は請求項１−１８のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
中ないし高分化型がんの患者におけるがん細胞の増殖を阻害する方法であって、
（ａ）前記がん細胞の等級を前記患者について決定するステップと、
（ｂ）中ないし高分化型がんの患者から抗原提示細胞を単離するステップと、
（ｃ）Ｎ末端部分とＣ末端部分とを含むタンパク質コンジュゲートを含む免疫療法用組成物に生体外で曝露することによって前記抗原提示細胞を刺激するステップと、
（ｄ）前記刺激された抗原提示細胞の治療上の有効量を前記患者に投与するステップとを含み、
中ないし高分化型がんの等級は前記患者は治療に感受性があることを意味し、前記抗原提示細胞は前記Ｎ末端部分かＣ末端部分かのいずれかに対する細胞傷害性細胞応答を起こすためにＴ細胞を活性化するうえで有効であり、前記Ｔ細胞の活性化のレベルは、前記Ｎ末端部分またはＣ末端部分だけに曝露された抗原提示細胞によって起こされるＴ細胞の活性化のレベルより高く、１０％の減少が前記がんの有効な治療を意味する、中ないし高分化型がんの患者におけるがん細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２４】
前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記がんは前立腺がんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記がんの等級はグリーソン指数によって決定され、該グリーソン指数は７以下である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫療法用組成物は、請求項３−１８のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
がん患者について該がんの免疫療法用組成物に対する感受性を評価する方法であって、
（ａ）前記患者から前記がん細胞を含み試料を単離するステップと、
（ｂ）前記がん細胞の分化状態を決定するステップとを含み、
中ないし高分化型がんの等級は、前記がん細胞が免疫療法用組成物を用いる治療に感受性があることを意味する、がんの免疫療法用組成物に対する感受性を評価する方法。
【請求項２９】
前記がんは、軟組織肉腫と、リンパ腫と、脳、食道、子宮頸部、骨、肺、子宮内膜、膀胱、乳房、喉頭、大腸／直腸、胃、卵巣、膵臓、副腎および前立腺のがんとからなるグループから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫療法用組成物は、請求項１−２０のいずれか１つに記載の免疫療法用組成物である、請求項２８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５１７９１４（Ｐ２００６−５１７９１４Ａ）
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６８９３５（Ｐ２００４−５６８９３５）
【出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９１７６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２６２３８
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０００７２７１４）デンドレオン コーポレイション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９１７６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２６２３８
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０００７２７１４）デンドレオン コーポレイション (11)
【Ｆターム（参考）】
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