中和エピトープベースの増殖増強性ワクチン
【課題】抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための改善された抗原および免疫原、ならびにＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改善されたＧＤＦ８抗体を提供すること。
【解決手段】抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための改善された抗原および免疫原、ならびにＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改善されたＧＤＦ８抗体に対する、長期にわたる必要性が存在する。本発明は、タンパク質ＧＤＦ８由来の、新規な特異的抗原性ペプチドを提供する。本発明はまた、この新規ペプチドを含む融合タンパク質、この新規ペプチドおよび／または融合タンパク質に基づく免疫原およびワクチン、ＧＤＦ８の新規ペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに、本発明のワクチンまたは抗体を利用してＧＤＦ８の活性を調節するために動物を処置する方法を提供する。
【解決手段】抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための改善された抗原および免疫原、ならびにＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改善されたＧＤＦ８抗体に対する、長期にわたる必要性が存在する。本発明は、タンパク質ＧＤＦ８由来の、新規な特異的抗原性ペプチドを提供する。本発明はまた、この新規ペプチドを含む融合タンパク質、この新規ペプチドおよび／または融合タンパク質に基づく免疫原およびワクチン、ＧＤＦ８の新規ペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに、本発明のワクチンまたは抗体を利用してＧＤＦ８の活性を調節するために動物を処置する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、米国特許仮出願番号６０／５３３，７１９（２００３年１２月３１日出願；この内容は、その全体が本明細書によって参考として援用される）の優先権を主張する非仮出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質成長分化因子８、および成長分化因子８の抗原性ペプチドフラグメント、ならびに関連する免疫原、ワクチン、および成長分化因子８の活性を調節するために動物を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
成長分化因子８は、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）スーパーファミリーとともに分類されるタンパク質である。一般的に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質は、最初に、タンパク質Ｃ末端から約１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基の一団においてタンパク質分解性の切断を受ける前駆体（別名プロホルモン）として発現される。各々の場合において、活性または成熟ＴＧＦ−β種は、切断された前駆体タンパク質Ｃ末端領域のジスルフィド結合されたダイマーであると考えられている。
【０００４】
成長分化因子８（本明細書においてこれ以降、ＧＤＦ８）はまた、ＧＤＦ−８またはミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）として当該分野で公知である。ＧＤＦ８の前駆体（本明細書においてこれ以降、「前駆体ＧＤＦ８」）をコードする遺伝子は、多岐にわたる生物体からクローニングされている。これらとしては、ヒトおよびマウス前駆体ＧＤＦ８が挙げられる［非特許文献１；特許文献１（これらの内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）］。ＧＤＦ８免疫反応性が、ヒト骨格筋において、Ｉ型線維およびＩＩ型線維の両方において検出可能であることが、また報告されている。ＧＤＦ８を検出するための抗体およびアッセイは、例えば、特許文献２によって記載されている。
【０００５】
ＧＤＦ８ノックアウトマウスによって確認されたように、ＧＤＦ８が骨格筋の成長および発達をダウンレギュレートまたは阻害することに役割を果たすことが、さらに報告されている（非特許文献２）。この理由のため、特に動物管理の分野において、種々の食用動物の成長および／または相対的な筋の質量を増強するためにＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせることを目標として、数種の手段によって動物中のＧＤＦ８活性を調節する試みがこれまでになされてきた。
【０００６】
例えば、特許文献３は、前駆体ＧＤＦ８遺伝子プロモーターおよびアッセイを記載し、このアッセイが、そのプロモーターの理論的インヒビターを同定するために使用されることを提唱する。特許文献４は、細胞を、ＧＤＦ８レセプターに対して競合するＧＤＦ８プロドメインと接触させることによって、その細胞上でＧＤＦ８の効果を阻害する方法を記載し、そして成熟ＧＤＦ８のＣ末端が変動し得ることを報告する。特許文献５は、ＧＤＦ８の可能性のあるアンタゴニストとしてのフォリスタチンの使用を記載する。これらの方法からは、動物管理の分野における実際的な適用、または臨床適用（ヒトでも獣医学的にも）という結果は得られなかった。
【０００７】
他はまた、ＧＤＦ８機能をダウンレギュレートするために抗体およびワクチン技術を利用することを試みた。例えば、特許文献６［その内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］は、抗ＧＤＦ８抗体を誘発するためのペプチド（すなわち、ＧＤＦ８タンパク質のフラグメント）およびワクチンを記載する。この特許はまた、数種の報告されたＧＤＦ８ペプチドフラグメントで免疫されたげっ歯類における、コントロールに対して明らかでない程度の成長および重量の増加を報告した。
【０００８】
ＧＤＦ８に関する他の生理学的役割もまた記載されている。例えば、特許文献７［その内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］は、ＧＤＦ８機能を阻害すること（例えば、この状態を有する患者に抗ＧＤＦ８抗体または抗ＧＤＦ８ワクチンを投与することによって）は、ＩＩ型糖尿病を処置するために有用であることが示唆している。
【０００９】
それにもかかわらず、当該分野において、抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための改善された抗原および免疫原、ならびにＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改善されたＧＤＦ８抗体に対する、長期にわたる必要性が未だ存在する。
【００１０】
本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，８２７，７３３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０９６，５０６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３９９，３１２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６５６，４７５号明細書
【特許文献５】米国特許第６，００４，９３７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３６９，２０１号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３６８，５９７号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎｅｓｔｏｒら，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」，１９９８年，９５：１４９３８−４３
【非特許文献２】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら，「Ｎａｔｕｒｅ」，１９９７年，３８７：８３−９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ＧＤＦ８に関する特異的中和エピトープを含むＧＤＦ８ペプチド（例えば、５０残基以下のＧＤＦ８のペプチドフラグメント）を提供することによって、当該分野におけるこれらの欠点および他の欠点を解決する。
【００１４】
本発明の一実施形態において、例えば、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）の残基約３１２〜残基約３６１を含む単離されたペプチドを含む、ＧＤＦ８ペプチドが提供される。好ましくは、本発明のＧＤＦ８ペプチドは、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８の残基約３２０〜残基約３５０を含み、より好ましくは残基約３２１〜残基約３４６を含み、最も好ましくは残基約３２７〜残基約３４６を含む。例示的なＧＤＦ８ペプチドは、本明細書においてこれ以後ＤＪ５と標識され、以下のように、便宜上配列番号１の前駆体ＧＤＦ８に基づく残基番号付けに従って、１文字コードおよび３文字コードの両方で示される。
【００１５】
【化１】
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、ＧＤＦ８ペプチドは、必要に応じて、保存的単一アミノ酸置換を含む。単純に例として、これらは、上記ペプチド内の１〜少なくとも５アミノ酸位置にわたり得る。特定の実施形態において、例えばＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が存在する。別の実施形態において、ＧＤＦ８ペプチドは、上記ペプチド内のわずか５アミノ酸位置において、保存的アミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に２つの保存的アミノ酸置換が存在する。なお別の実施形態において、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に３つの保存的アミノ酸置換が存在する。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に４つの保存的アミノ酸置換が存在する。
【００１７】
好ましくは、アミノ酸残基置換は、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）に対して１つ以上の位置にあり、これは、図２の種間アラインメントのアミノ酸変異によって特徴付けられる。これらは、残基３２８、残基３２９、残基３３１、残基３３３および残基３３５、ならびにそれらの組み合わせにおいて存在し、ここで、
（ａ）アミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、ＬｅｕもしくはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９は、ＧｌｎもしくはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１は、ＡｓｎもしくはＳｅｒであり；
（ｄ）アミノ酸残基３３３は、ＡｒｇもしくはＬｙｓであり；そして／または
（ｅ）アミノ酸残基３３５は、Ｓｅｒ、ＰｒｏもしくはＴｈｒである。
【００１８】
好ましくは、このような改変ＧＤＦ８ペプチドは、抗ＧＤＦ８抗体についての特異的中和エピトープを含み、したがって、本明細書において以下に例示されるように、抗ＧＤＦ８抗体（この抗体は、ｍＡｂ ７８８および／またはヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ分画である）に特異的に結合する特性を保持する。
【００１９】
本発明のなおさらなる実施形態において、上述のＧＤＦ８ペプチドをコードする核酸分子（すなわち、ポリヌクレオチド）が提供される。
【００２０】
好ましくは、この核酸分子は、天然に存在するヒト前駆体ＧＤＦ８遺伝子の一部分、（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２５９，ヒトＧＤＦ８遺伝子；配列番号２）のおよそヌクレオチド１１１２〜およそヌクレオチド１１７１を含む。この部分は、上記のとおり、ペプチドＤＪ５をコードする。ＮＭ＿００５２５９の記録が、実際のコード領域に隣接する大量の配列を含むことに注意すること。当業者はまた、ＤＪ５が、ＧＤＦ８プロホルモンの実際のコード領域のヌクレオチド９７９〜１０３８に対応することを理解する。
【００２１】
上記核酸分子を含む複製可能なクローニングベクターおよび原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞もまた、ＧＤＦ８ペプチドを生成する方法に従って提供される。上記方法は、以下の工程を包含する：宿主細胞を培養する工程；そのコードされたペプチドを発現させる工程；および、そのペプチドを回収する工程。当業者はまた、本発明のＧＤＦ８ペプチドがまた、標準的な当該分野で公知の化学合成方法によって容易に生成されること理解する。
【００２２】
本発明のなおさらなる実施形態において、本発明のＧＤＦ８ペプチド（またはその融合タンパク質）を含むワクチン組成物が、また提供される。
これは、例えば好ましくは、１種以上のアジュバンド、および他の当該分野で標準的なペプチドベースもしくはタンパク質ベースのワクチン組成物の構成要素を含む。動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発する方法もまた提供され、この方法は、その動物に有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する。
【００２３】
別のさらなる実施形態において、複数の抗体または抗体フラグメントの中から抗ＧＤＦ８抗体または抗体フラグメントを選択するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、ペプチドと１つまたは複数の抗体または抗体フラグメントとを接触させて、このペプチドに選択的に結合する抗体または抗体フラグメントを検出する工程を包含する。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法を提供する。一つのこのような実施形態において、この方法は、抗体または抗体フラグメントを、動物においてＧＤＦ８活性を（抗体がこのペプチドに特異的に結合するか、または本明細書において記載されるようにワクチン組成物でこの動物を免疫することによって）ダウンレギュレートするのに有効な量および期間、その動物に投与する工程を包含する。この動物は、好ましくは、脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物、鳥類または魚類である。好ましくは、この哺乳動物は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ）動物（例えば、家畜業（ａｎｉｍａｌ ｈｕｓｂａｎｄｒｙ）に使用される動物、あるいは、コンパニオン動物）であるが、必要に応じて、このようなＧＤＦ８ダウンレギュレーションを必要とするヒトであり得る。
【００２５】
本発明はまた、本発明のＧＤＦ８ペプチドを組み込んだ融合タンパク質を企図する。この融合タンパク質は、ＧＤＦ８融合タンパク質の分泌もしくは細胞表面発現を増強し、そして／または選択的結合システムによる精製を可能にするシグナルペプチドであるドメインを含み得る。さらに、この融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドドメインの免疫原性を増強するために、シグナルキャリアタンパク質中の１つ以上のＧＤＦ８ペプチドに結合することを企図される。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６を含む５０以下のアミノ酸残基からなるＧＤＦ８ペプチドを含む。この型の関連する実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドの免疫原性サブフラグメン（例えば、ＤＪ５（配列番号８）由来の約１０個の保存的連続するアミノ酸残基を含むＧＤＦ８ペプチド）を含む。
【００２６】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
５０以下のアミノ酸残基からなる単離されたペプチドであって、該アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残３２７〜３４６基を含む、単離されたペプチド。
（項目２）
配列番号１のアミノ酸残基３２１〜３４６を含む、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目３）
配列番号１のアミノ酸残基３２０〜３５０を含む、項目２に記載の単離されたペプチド。
（項目４）
配列番号１のアミノ酸残基３１２〜３６１を含む、項目３に記載の単離されたペプチド。
（項目５）
５０以下のアミノ酸残基からなる単離されたペプチドであって、該アミノ酸残基は、アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６を含み、
ここで、アミノ酸残基３２７〜アミノ酸残基３４６の間にわずかに５個のアミノ酸置換が存在し；そして
ここで、該ペプチドは、ラットモノクローナル抗体７８８に特異的に結合する、
単離されたペプチド。
（項目６）
項目５に記載の単離されたペプチドであって、以下：
残基３２８、残基３２９、残基３３１、残基３３３および残基３３５、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、ここで、
（ａ）アミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、ＬｅｕもしくはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９は、ＧｌｎもしくはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１は、ＡｓｎもしくはＳｅｒであり
（ｄ）アミノ酸残基３３３は、ＡｒｇもしくはＬｙｓであり；そして／または
（ｅ）アミノ酸残基３３５は、Ｓｅｒ、ＰｒｏもしくはＴｈｒである、
単離されたペプチド。
（項目７）
項目６に記載の単離されたペプチドであって、前駆体ＧＤＦ８の残基３２７〜残基３４６の間にわずか１個のアミノ酸置換を含み、ただし、該ペプチドは、ラットモノクローナル抗体７８８に特異的に結合する、単離されたペプチド。
（項目８）
抗ＧＤＦ８抗体に対する特異的中和エピトープを含む、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目９）
前記抗体が、ラット抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体７８８およびヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ分画からなる群より選択される、項目８に記載の単離されたペプチド。
（項目１０）
項目１に記載のペプチドまたは該ペプチドの抗原性サブフラグメントを含む、融合タンパク質。
（項目１１）
項目１０に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
（項目１２）
項目６に記載のペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１３）
項目１に記載のペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１４）
配列番号２のヌクレオチド１１１２〜ヌクレオチド１１７１の核酸配列を含む、項目１３に記載の核酸分子。
（項目１５）
項目１３に記載の核酸分子を含む、複製可能なクローニングベクター。
（項目１６）
項目１５に記載の複製可能なクローニングベクターを含む、宿主細胞。
（項目１７）
前記クローニングベクターによって形質転換された、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１８）
真核生物細胞である、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１９）
ＧＤＦ８ペプチドを生成する方法であって、項目１８に記載の宿主細胞を培養する工程、コードされたペプチドを発現させる工程、および該ペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目２０）
項目１に記載のペプチドを含む、ワクチン組成物。
（項目２１）
項目１０に記載の融合タンパク質を含む、ワクチン組成物。
（項目２２）
アジュバントをさらに含む、項目２０に記載のワクチン組成物。
（項目２３）
動物における抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発する方法であって、該動物に、有効量の項目２０に記載のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
複数の抗体または抗体フラグメント中から抗ＧＤＦ８抗体または抗体フラグメントを選択するためのスクリーニング方法であって、項目１に記載のペプチドと１種もしくは複数の抗体または抗体フラグメントを含むサンプルとを接触させる工程、ならびに該ペプチドに選択的に結合する抗体または抗体フラグメントを検出する工程を包含する、方法。
（項目２５）
動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法であって、該動物に、該動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせるのに有効な量および有効な期間、抗体または抗体フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、該抗体は、項目１に記載のペプチドに特異的に結合する、方法。
（項目２６）
動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法であって、有効量の項目２０に記載のワクチン組成物で該動物を免疫する工程を包含する、方法。
（項目２７）
動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法であって、有効量の項目２１に記載のワクチン組成物で該動物を免疫する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＧＤＦ８活性領域（すなわち、成熟ＧＤＦ８）中の重複ペプチドＤＪ１〜ＤＪ７を示す。これは、前駆体ＧＤＦ８配列の残基２６６〜３７５である。
【図２】図２は、記載されたさらなる動物種の前駆体ＧＤＦ８タンパク質中に配置された場合の、類似する２０残基ペプチドと比較したヒトＤＪ５ペプチド配列（配列番号８）のアラインメントを示す。アミノ酸残基位置３２１〜３４７は、ヒト前駆体ＧＤＦ８に基づく。Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号（本明細書において参考として援用される）は、その種に関する全体が公開されたタンパク質配列を識別する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
アラインメントされたペプチドは、以下の配列番号を有する。
【００２９】
【化２】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
したがって、本発明は、ポリクローナル抗ＧＤＦ８ヤギ抗血清について、および他の特異的抗ＧＤＦ８抗体についての特異的中和エピトープとして役立つＧＤＦ８ドメインを同定する。これらのエピトープはまた、ＧＤＦ８タンパク質に対する活性かつ特異的な免疫応答を、インビトロ（例えば、ＧＤＦ８タンパク質の検出のため）およびインビボ（ＧＤＦ８活性をダウンレギュレートするため）の両方において誘発するために有用な、ＧＤＦ８タンパク質のフラグメントを提供するために役立つ。これらのフラグメントは、概して、本明細書においてＧＤＦ８ペプチドまたはＧＤＦ８ペプチドフラグメントと称される。これらのＧＤＦ８ペプチドの有用性は、動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための免疫原としての使用、およびＧＤＦ８関連アッセイにおける高度に特異的な抗体結合標的としての使用を包含する。
【００３１】
ＧＤＦ８の特異的結合エピトープを、抗ＧＤＦ８抗血清を一連の重複ＧＤＦ８ペプチドと接触させて、ペプチドと抗血清ＩｇＧ抗体との間の結合活性の程度を決定することによって同定した。発現および抗原性に関して最適化された構造を有する前駆体ＧＤＦ８タンパク質で免疫されたヤギから、抗ＧＤＦ８抗血清を得た。
【００３２】
本発明をより十分に理解するために、以下の定義が提供される。説明中の便宜的な単数形の使用は、そのように限定することを決して意図しない。従って例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物への参照は、１以上のそのようなポリペプチドに対する参照を包含する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」と交換可能に使用され、示された値の２０％以内の値を意味する。すなわち、「およそ」５０アミノ酸残基を含むペプチドは、４０と６０との間のアミノ酸残基を含み得る。
【００３４】
本発明が、本明細書中で開示された特定の構成、プロセス工程、および材料に限定されず、したがって、そのような構成、プロセス工程、および材料がいくらか変動し得ることが、また理解されるべきである。本明細書中で利用される用語法が、特定の実施形態を説明する目的のみのために使用されること、そして限定のために意図されるのではないことが、また理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるからである。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と交換可能に使用され、そしてペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸を含むポリマーを指す。好ましくは、本明細書において他に述べられない限り、用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合の用語「ペプチド」と、サイズおよび鎖の長さによって区別される。ここで、「ペプチド」とは、約５０以下のアミノ酸のポリマー鎖をいい、ポリペプチドまたはタンパク質とは、約５０アミノ酸より長いポリマー鎖をいう。必要に応じて、ペプチドまたはポリペプチドは、遺伝子またはｍＲＮＡによってコードされた特定のアミノ酸残基を欠いていてもよい。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終タンパク質から切断され、したがって最終タンパク質の一部ではない可能性がある、ポリペプチドのＮ末端上のアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードし得る。
【００３６】
本発明による「ＧＤＦ８ペプチド」は、ＧＤＦ８タンパク質に由来する相対的に短いフラグメントである。そのようなペプチドのサブフラグメントでも、ＧＤＦ８ペプチドと称され得る。本発明のＧＤＦ８ペプチドの最大サイズを限定することを意図しないが、ペプチドの最大サイズは、約５０残基であることが好ましく、より好ましくは、最大サイズは約４０残基であり、さらにより好ましくは、最大サイズは約３０残基であり、なおより好ましくは、最大サイズは約２５残基である。より一般的には、ＧＤＦ８ペプチドは、好ましくは、約１０〜約５０アミノ酸残基長のサイズの範囲であり、より好ましくは、約１５〜約３０アミノ酸残基であり、特に、約２０アミノ酸残基長である。本発明の他のＧＤＦ８ペプチドのより小さなサブフラグメントであるＧＤＦ８ペプチド（例えば、ＤＪ５（配列番号８）由来の約１０個の連続するアミノ酸残基を含むＧＤＦ８ペプチドは、好ましくは、より大きなＧＤＦ８ペプチド由来の抗原性部分（例えば、エピトープ）を含む。
【００３７】
特定の実施形態において、ＧＤＦ８ペプチドは、天然に存在するＧＤＦ８（配列番号１）のヒト前駆体の残基番号３２７〜３４６（配列番号８）によって規定されるペプチドに対して約５０％相同〜約１００％相同の範囲に及ぶ相同の程度を有する、ペプチドドメインを含む。上記の相同性の変動は、好ましくは、特定の特異的抗ＧＤＦ８抗体によって特異的に認識される本発明の抗原性構造を保有する、保存的置換および／または保存的変動である。これらの保存された置換は、種間相同性比較（例えば、図２参照）によってＧＤＦ８機能を保存することが示される残基置換を表し、そして／または、類似の化学的（例えば、物理学的）および電気的構造のアミノ酸の間における、したがって、本発明のＧＤＦ８ペプチドの抗体結合特異性を保存するおよび／もしくは最適化する残基置換を表す。このような保存的アミノ酸置換の例としては、以下が挙げられる：１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン）の別のものに対する置換；または、１つの等電荷の極性残基の別のものに対する置換（例えば、リジンに対するアルギニンの置換、アスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換、もしくはアスパラギンに対するグルタミンの置換）。
【００３８】
特に、本発明のＧＤＦ８ペプチドはまた、抗ＧＤＦ８抗体に対する特異的中和エピトープ（すなわち、以下の実施例によって記載される、ＰＧＡ 抗ＧＤＦ８ ＩｇＧポリクローナル抗体に特異的に結合する、および／または市販のラットモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）［Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ７８８（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）］に特異的に結合する、エピトープまたは抗原ドメイン）を含む。
【００３９】
本明細書において利用される場合、用語「精製された」または「単離された」とは、関係のない物質（すなわち、夾雑物、上記物質が得られるネイティブの物質を含む）の存在を減少もしくは消失させる条件下で分離された物質をいう。例えば、精製されたタンパク質または単離されたタンパク質は、好ましくは、細胞内でともに見出され得る他のタンパク質または核酸を含まない。精製された物質は、元々関連していた細胞成分の、約５０％未満、好ましくは約７５％未満、そして最も好ましくは約９０％未満を含み得る。精製は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、成分分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法によって評価され得る。機能的局面から、本発明の単離されたＧＤＦ８ペプチドは、前駆体ＧＤＦ８タンパク質および／もしくは成熟ＧＤＦ８タンパク質を含む他の物質から十分に分離され、その結果、ＧＤＦ８ペプチドに対して特異的な免疫応答を誘発し得るものである。
【００４０】
精製のための方法は、当該分野で周知である。例えば、核酸は、沈殿、クロマトグラフィー、超遠心、および他の手段によって精製され得る。タンパク質およびポリペプチド、ならびにペプチドは、種々の方法によって精製され得る。この方法としては、分取ディスクゲル電気泳動（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｃ−ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの目的のためには、タンパク質が精製を容易にするさらなる配列タグを含む組み換え系においてポリペプチドを精製することが、好ましい。このような配列タグは、例えば、ポリヒスチジン配列または抗体に特異的に結合する配列（例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）およびＧＳＴ）であるが、これらに限定されない。次いで、ポリペプチドは、宿主細胞の粗溶解物から、適切な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、上記ポリペプチドに対して生成された抗体またはその結合フラグメントが、精製試薬として使用され得る。
【００４１】
用語「実質的に純粋」は、当該分野で公知の従来の精製技術を用いて達成され得る最高度の純度を示し、そして、元の供給源の生物体または組み換えＤＮＡ発現系に由来する夾雑タンパク質、核酸および他の生物学的物質を含まない核酸、ポリペプチド、ペプチドまたは他の物質を意味する。実質的純度は、標準的な方法によってアッセイされ得、そして代表的に、少なくとも約７５％の純度、好ましくは少なくとも約９０％の純度の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の純度を超える。純度の評価は、質量ベースまたはモル濃度ベースで行われ得る。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、ヌクレオチドを含む分子であり、これらとしては、ＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列そしてさらに合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の当該分野で公知の塩基アナログを含む核酸分子を包含することを企図される。
【００４３】
「ベクター」または「複製ベクター」は、レプリコン（例えば、プラスミド、ファージ、もしくはコスミド）であり、そこに別のＤＮＡセグメントが結合するかまたは組み込まれて、結合されたセグメントの複製を生じ得る。この用語はまた、組み込まれたかまたは結合された、目的のＤＮＡセグメントを含むレプリコンを包含する。
【００４４】
本発明で使用される得るベクターとしては、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノムへの核酸の組み込みを促進し得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターである。しかし、等価な機能を果たし、かつ当該分野で公知のあらゆる他の形態のベクターが、本明細書における使用に適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００４５】
本発明のＧＤＦ８ペプチドをコードするＤＮＡのベクターへの挿入は、ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が適合性のある制限部位を含む場合、容易に達成される。これができない場合、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成される単鎖化されたＤＮＡ突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を消化して、もとの平滑末端を生成することによってＤＮＡおよび／もしくはベクターの末端を修飾すること、または適切なＤＮＡポリメラーゼを用いて上記単鎖化した末端を充填することによって同じ結果を達成することが必要であり得る。あるいは、所望される部位が、例えば、ヌクレオチド配列（リンカー）を末端に連結することによって作製され得る。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特異的オリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて生成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）を参照のこと。切断されたベクターおよびＤＮＡ フラグメントはまた、必要な場合、ホモポリマーのテイルで修飾され得る。
【００４６】
本発明で使用される組み換え発現ベクターは、代表的に、本発明のＧＤＦ８ペプチドの１つをコードする核酸を含み、通常、宿主細胞の核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子制御エレメントに作動可能に連結された、自己複製性のＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系もしくは真核生物プロモーター発現制御系であり得、そして代表的に、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意的なオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終止させる配列を含む。発現ベクターはまた、ベクターを宿主細胞とは独立に複製させる複製起点を含み得る。
【００４７】
本発明のＧＤＦ８ペプチドをコードする核酸の発現は、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて従来の方法で行われ得る。
【００４８】
ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質もしくはペプチドを「コードする配列」は、適切な調節エレメントの制御下で配置される場合にインビボもしくはインビトロで転写されて、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’末端における開始コドンおよび３’末端における終止コドンによって決定される。コード配列としては、懸隔生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）由来のゲノムＤＮＡ配列、そしてさらに合成ＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。転写末端配列は、通常、コード配列に対して３’に配置される。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」および「融合ペプチド」は、交換可能に使用され、そして「キメラタンパク質および／またはキメラペプチド」、ならびに融合「インテインタンパク質／ペプチド」を包含する。融合タンパク質は、ペプチド結合を介して別のタンパク質の少なくとも一部分に結合された本発明のＧＤＦ８ペプチドの少なくとも一部分を包含する。例えば、融合タンパク質は、マーカータンパク質もしくはマーカーペプチド、または本発明のＧＤＦ８ペプチド単離および／もしくは精製および／もしくは抗原性を補助するタンパク質もしくはペプチドを含み得る。ＧＤＦ８融合タンパク質は、ペプチド結合を介してＧＤＦ８ポリペプチドの少なくとも一部分に対して結合された、非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部分を含み得る。好ましい実施形態において、ＧＤＦ８の一部分は、機能性である（すなわち、その抗原性を保有する）。非ＧＤＦ８配列は、ＧＤＦ８配列に対するアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００５０】
そのような融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子は、ＧＤＦ８コード配列に対してインフレームに結合された非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部をコードする配列を含み、特異的プロテアーゼ（例えば、トロンビンもしくはＸａ因子）のための切断部位を、好ましくは、ＧＤＦ８配列と非ＧＤＦ８配列との間の接合部、またはその近くにコードし得る。特定の実施形態において、融合タンパク質はＣＨＯ細胞中で発現される。そのような融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドに融合されたタンパク質および／またはタグに特異的なアフィニティーカラムの使用を通じて、本発明のＧＤＦ８ペプチドを単離するために使用され得る。精製されたＧＤＦ８ペプチドは、例えば、次に、上記に参照したようなタンパク質分解酵素および切断部位の使用を通じて、融合タンパク質から放出され得る。
【００５１】
そのような一実施形態において、キメラＧＤＦ８ペプチドが調製され得る（例えば、任意の細胞または無細胞系における発現のための、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、マルトース結合（ＭＢＰ）タンパク質融合タンパク質、またはポリ−ヒスチジン−タグ化融合タンパク質）。例えば、ＧＳＴは、固体支持体マトリックスに結合したグルタチオンに結合し、ＭＢＰは、マルトースマトリックスに結合し、そしてポリ−ヒスチジンは、Ｎｉ−キレート化支持マトリックスにキレート化する。融合タンパク質は、適切な緩衝液によってか、以下に例示されるようなまたはＧＤＦ８ペプチドと融合パートナー（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ（登録商標））との間に通常設計される切断部位に特異的なプロテアーゼで処理することによって、または上記のポリ−Ｈｉｓのように、特異的マトリックスから溶出され得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」は、組み換え法によって本発明のヌクレオチド配列に付加されて、天然においては自然に形成されない核酸を形成するヌクレオチド配列である。このような核酸は、融合（例えば、キメラ）タンパク質をコードし得る。したがって、異種ヌクレオチド配列は、調節的特性および／または構造的特性を含むペプチドおよび／またはタンパク質をコードし得る。このような別の実施形態について、異種ヌクレオチド配列は、組み換え核酸が発現された後、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードし得る。さらに別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能し得る。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどの非コード配列を含み得る。
【００５３】
「宿主細胞」は、外来核酸分子を、一過性または永久的に、含むかまたは含み得、そして発現する細胞である。細胞は、外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合、そのような外来ＤＮＡによって「形質転換」されている。外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に（共有結合性に）組み込まれていてもいなくてもよい。原核生物および酵母においては、例えば、外来ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラスミド）上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外来ＤＮＡが染色体に組み込まれて、その結果、染色体複製を介して娘細胞により遺伝されるものである。この安定性は、真核生物細胞の、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団で構成される細胞株またはクローンを確立する能力によって示される。
【００５４】
原核生物は、グラム陰性生物体およびグラム陽性生物体の両方（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類）と哺乳動物起源（ヒト、霊長類およびげっ歯類）との両方）から確立された組織培養細胞株を包含する。
【００５５】
原核生物宿主ベクター系は、多くの異なる種に関する、多岐にわたるベクターを含む。本明細書中で使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターは、他の原核生物において使用される等価なベクターを含むように一般的に使用される。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体である。ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ８ペプチドを発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）のようなハイブリッドプロモーターを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６）を参照のこと。
【００５６】
酵母は、高等真核生物組織培養細胞は、本発明のＧＤＦ８ペプチド、ならびに／または抗ＧＤＦ８抗体および／もしくはこれらの抗体のフラグメントの組み換え産物のための、好ましい宿主である。任意の高等真核組織培養細胞が使用され得るが（昆虫ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系を含む）、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクション、および増殖は、慣習的な手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、新生仔ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、トリ細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。
【００５７】
このような細胞株のための発現ベクターとしては通常、例えば、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライシング部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、そして転写終止部位が挙げられる。これらのベクターはまた、通常、選択的遺伝子または複製遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターを保有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ［Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６（１９８５）］、ｐＭＣ１ｎｅｏポリ−Ａ［Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７）］、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ ３７３もしくはｐＡＣ ６１０）が挙げられる。
【００５８】
代表的に使用される原核生物発現制御配列としては、プロモーター（β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターに［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６（１９７７）］、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）］、λＰＬプロモーター系［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８（１９８１）］およびｔａｃプロモーター［Ｄｅ Ｂｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２９２：１２８（１９８３）］由来するものを含む）が挙げられる。このような制御配列を含む多数の発現ベクターは、当該分野で公知であり、市販されている。
【００５９】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分がそれらの通常の機能を行うように構成されたエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現に影響し得る。制御エレメントは、それらが制御配列の発現に関するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在性の、翻訳されないが転写される配列がプロモーターとコード配列との間に存在し得、そしてプロモーターはなお、コード配列に対して「作動可能に連結されている」とみなされる。
【００６０】
本発明はまた、本発明のＧＤＦ８ペプチドに特異的に結合されたポリクローナル抗体およびモノクローナル（ｍＡｂ）抗体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリンおよび／またはそのフラグメントをいう。天然に存在する免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドから構成される。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。本発明の抗体（単数または複数）はまた、抗体フラグメント（すなわち、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２）、操作された単鎖結合タンパク質（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）、これらは、本明細書中によってその全体が参考として援用される）、ならびに二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，Ｅｕｒ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を包含する。［全体的には、Ｈｏｏｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，第２版（１９８４）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）、これら全ての内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【００６１】
例えば、本発明のＧＤＦ８ペプチドによって免疫された動物から、標準的な方法を用いて生成された血清は、直接的に使用され得るか、またはＩｇＧ分画が、標準的な方法（例えば、プラスマフェレーシス（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）、もしくはＩｇＧ特異的吸着体（例えば、固定されたプロテインＡおよびプロテインＧ）を用いた吸着クロマトグラフィー）を用いて血清から分離され得る。あるいは、モノクローナル抗体が調製され得る（および必要に応じて、そのようなｍＡｂに由来するフラグメントまたは組み換え結合タンパク質）。そのようなＭＡｂまたはそのフラグメントは、必要に応じて、当該分野で公知の方法によってヒト化され得る。
【００６２】
本発明のＧＤＦ８ペプチドに選択的に結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマは、周知の技術によって産生される。通常、このプロセスは、不死化細胞株と、所望の抗体を産生するＢリンパ球との融合を包含する。あるいは、不死の抗体産生細胞株を生成するための非融合技術が使用され得る（例えば、ウイルス誘導性形質転換［Ｃａｓａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：４７６（１９８６）］）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞（特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞）である。最も頻繁には、ラットまたはマウスミエローマ細胞株が、便宜上および利用可能性の点で、利用される。
【００６３】
抗原を注射された哺乳動物から抗体産生性リンパ球を得るための技術は、周知である。一般的に、ヒト起源の細胞が利用される場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物供給源からは脾臓またはリンパ節の細胞が使用される。宿主動物は、精製抗原の反復投薬を用いて注射され（ヒト細胞は、インビトロで感作され）、そしてその動物は、それの細胞が不死化細胞株との融合のために収集される前に、所望の抗体産生性細胞を作らされる。融合のための技術は、当該分野で周知であり、一般的に、細胞を融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）と混合する工程を包含する。
【００６４】
ハイブリドーマは、標準的手順（例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択）によって選択される。所望の抗体を分泌するものは、標準的イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、ＲＩＡ（放射免疫アッセイ）など）を用いて選択される。抗体は、標準的タンパク質生成技術を用いて培地から回収される［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ
Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］．
多くの参考文献が利用可能であり、上記技術の適用における指針を提供する ［Ｋｏｈｌｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）； Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）］。モノクローナル抗体はまた、周知のファージライブラリ系を用いて生成され得る。例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４（１９８９）を参照のこと。
【００６５】
したがって、ポリクローナルかモノクローナルかのいずれかで生成された抗体は、例えば、周知の方法によって固体支持体に結合された固定形態で使用されて、イムノアフィニティークロマトグラフィーによってＧＤＦ８ペプチドを精製し得る。
【００６６】
ＧＤＦ８ペプチドに対する抗体もまた、イムノアッセイの基準として使用され（標識されないかまたは標準的方法で標識され）、ＧＤＦ８を検出または定量化し得る。使用される特定の標識は、イムノアッセイの型に依存する。使用され得る標識の例としては、が挙げられるが、放射性標識（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃ）；蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルおよびアンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ））；化学ルミネッサー（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）（例えば、ルシフェリア（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）および２，３−ジヒドロフタラジンジオン）；ならびに酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース−６−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ）これらに限定されない。
【００６７】
抗体は、公知の方法によって、このような標識でタグ化され得る。例えば、カップリング剤（例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジンなど）が、蛍光、化学発光、または酵素標識で抗体をタグ化するために使用され得る。関連する一般的な方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬに記載される。このようなイムノアッセイは、例えば、レセプターの精製の間に得られた分画で実行され得る。
【００６８】
本発明の抗体はまた、発現クローニング系において、ＧＤＦ８関連ペプチドを発現する特定のｃＤＮＡクローンを同定するために使用され得る。レセプターのリガンド結合部位に対して特異的な中和抗体は、ＧＤＦ８機能をブロックまたはダウンレギュレートするアンタゴニスト（インヒビター）として使用され得る。そのような中和抗体は、以下の実施例によって例示されるような慣習的な実験を通じて、容易に同定され得る。
【００６９】
ＧＤＦ８活性の拮抗作用は、完全な抗体分子、または周知の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖフラグメント）を用いて達成され得る。このようなフラグメントの定義は、本明細書において上述されるように、またはＫｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）；Ｐａｒｈａｍ，第１４章、Ｗｅｉｒ編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）において見出され得る。抗体フラグメントの使用および生成もまた記載されている、例えば：Ｆａｂフラグメント［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］、Ｆｖフラグメント［Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら，米国特許第４，３５５，０２３号］、および抗体半分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号）。公知の抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列に基づく組み換えＦｖフラグメントを作製する方法が、さらに記載されている（例えば、Ｍｏｏｒｅら（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５（１９９１）］。あるいは、これらは、標準的な方法によって化学的に合成され得る。
【００７０】
本発明はまた、抗イディオタイプ抗体（ポリクローナルとモノクローナルの両方）を包含する。これらは、上述の抗体を抗原として使用して生成される。これらの抗体は、リガンドの構造を模倣し得るので、有用である。
【００７１】
（ペプチド合成）
本発明のＧＤＦ８ペプチド（例えば、本明細書において以下に例示されるＤＪ５ペプチド）は、比較的短く（例えば、好ましくは５０アミノ酸残基以下）、ペプチド合成の公知の方法によって調製され得る。合成ペプチドまたはポリペプチド（周知の固相技術、液相技術もしくはペプチド縮合技術，またはそれらの任意の組み合わせを用いて調製される）は、天然もしくは非天然のアミノ酸を含み得る。ペプチド合成のために使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）］の元々の固相手順の、標準的脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコールを用いた標準的Ｂｏｃ（Ｎα−アミノ保護化Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、またはＣａｒｐｉｎｏおよびＨａｎ［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７：３４０３−３４０９（１９７２）］によって最初に記載された、塩基不安定Ｎα−アミノ保護化９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であり得る。ＦｍｏｃもＢｏｃ Ｎα−保護化アミノ酸も、Ｆｌｕｋａ，Ｂａｃｈｅｍ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ＢａｃｈｅｍまたはＰｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ、または当業者が精通する他の化学企業から得ることができる。さらに、本発明の方法は、当業者が精通する他のＮα−保護基とともに使用され得る。固相ペプチド合成は、当業者が精通する技術によって達成され得、そして、例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８４）；ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０）において、またはＡＢＳ［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４ ＵＳＡ］によって販売されるような自動合成機を用いて提供され得る。したがって、本発明のＧＤＦ８ペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との組み合わせ、および種々の「娘」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸など）を含み、特定の特性を伝え得る。合成アミノ酸としては、リジンに対するオルニチン、フェニルアラニンに対するフルオロフェニルアラニン、そしてロイシンもしくはイソロイシンに対するノルロイシンが挙げられる。さらに、特定のカップリング工程において特定のアミノ酸を割り当てることによって、α−ヘリックス、β−ターン、β−シート、γ−ターン、および環状ペプチドが生成され得る。
【００７２】
（抗ＧＤＦ８抗血清）
本発明の方法は、ポリクローナル抗ＧＤＦ８抗血清に対するＧＤＦ８ペプチドをスクリーニングするプロセスを含んだ。このプロセスは、特定の抗ＧＤＦ８抗体が高度に特異的な様式で結合するエピトープを同定した。抗ＧＤＦ８抗血清は、前駆体ＧＤＦ８で動物を免疫することによって得られた。前駆体ＧＤＦ８遺伝子は、発現および免疫原性について最適化された形態を提供するように改変された。例えば、ＧＤＦ８プロホルモンの天然のＤＮＡ配列（配列番号２）は、哺乳動物中での発現およびウイルス発現系に関して最適化された。さらに、ウイルス宿主遮断機構のネガティブな効果を回避するように変更がなされた。代表的に、ウイルス宿主遮断機構は、転写制御、ＲＮＡ安定性（スプライシング）などに関する。これらの変更は、核酸をより宿主様でなくし、そしてよりウイルス様にした。
【００７３】
さらに、ＤＮＡ配列は、好ましくは、哺乳動物核酸配列からできるだけ相違するように設計された。例えば、前駆体ＧＤＦ８のアミノ酸配列は、酵母好適コドン（ｙｅａｓｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ）を用いて逆翻訳された。得られた配列を、ヒトＧＤＦ８核酸配列に対して相同性を保持していたコドンに関して調査した。可能であれば、これらのコドンは、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換されていた。
【００７４】
得られた最適な遺伝子（配列番号３）は、任意の適切な宿主系（公知の昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルス、および酵母発現系が挙げられる）において発現され得る。例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）によって記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料および方法は、ｉｎｔｅｒ ａｌｉａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．からキット形態で市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。同様に、細菌細胞発現系および哺乳動物細胞発現系は当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）によって記載されている。酵母発現系もまた当該分野で公知であり、例えば、ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｂａｒｒら（編），１９８９），Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎによって記載されている。多くの他のこのような発現系は、当該分野で公知であり、キットの形態で市販されている。本明細書において例示されるように、改変前駆体ＧＤＦ８遺伝子（配列番号３）は、以下の実施例１において詳述されるように、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において発現された。
【００７５】
前駆体ＧＤＦ８タンパク質、および成熟ＧＤＦ８タンパク質のペプチドは、任意のタンパク質もしくはペプチドの適合性ワクチン組成物に組み込まれ得る。このようなワクチン組成物は、当該分野で周知であり、そして例えば、本明細書において以下に詳述されるように、生理学的に適合性の緩衝液および生理食塩水など、ならびにアジュバントを含む。前駆体ＧＤＦ８タンパク質を含むワクチン組成物は、抗ＧＤＦ８抗体に対する特異的中和エピトープをスクリーニングおよび同定するための抗血清を誘発するために利用される。
【００７６】
本明細書において例示されるように、配列番号３を含むベクターによって発現される精製前駆体ＧＤＦ８タンパク質は、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化された１ｇの前駆体ＧＤＦ８タンパク質を含有するワクチン組成物中において、ヤギに注射される。このワクチン組成物は、好ましくは、ヤギの皮下に皮下（ＳＣ）注射される。この後の追加免疫が好ましい。これらは、同じもしくは低下したタンパク質の量（ｄｏｓａｇｅ）を用いて適切なさらなる間隔で（例えば、最初の注射後２〜５週間の範囲の間隔で）投与され得る。
【００７７】
最初の注射後の約２週間から始めて、好ましくは、より長期間（例えば、３〜１５週間以上）の後で開始して、免疫された動物から、必要に応じて、血清が回収される。次いで、回収された血清は、好ましくは、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、プロテインＧ−アガロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーなど）によって精製および／もしくは分画される。本明細書において例示されるように、血清のＩｇＧ分画は、プロテインＧ−アガロースカラム上でさらに分画化される。
【００７８】
抗ＧＤＦ８抗血清ＩｇＧ分画は、本明細書において以下の実施例３で詳述されるように、成熟ＧＤＦ８のある範囲のペプチドに対してスクリーニングするために利用可能である。
【００７９】
（ＧＤＦ８結合エピトープ）
適切な抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、抗体がタンパク質に選択的に結合するために十分な時間、ＧＤＦ８タンパク質と接触させた。その後、ＧＤＦ８バイオアッセイは、その抗体がＧＤＦ８タンパク質活性の実質的に全てを中和したことを確証した。任意のＧＤＦ８バイオアッセイが、この目的のために使用され得るが、本明細書において以下の実施例３で例示されるように、Ｔｈｉｅｓら，２００１，（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１）によるインビトロ転写活性アッセイが好ましい。
【００８０】
一般的に、本発明の、抗原または結合エピトープとして有用なＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８（配列番号１）のおよそ残基３１２〜およそ残基３６１を含む。特に、本発明のペプチドは、ＧＤＦ８（配列番号１）のおよそ残基３２０〜およそ残基３５０を含む。このペプチドは、好ましくは、ＧＤＦ８（配列番号１）のおよそ残基３２７〜およそ残基３４６を含む。
【００８１】
当業者は、本発明のＧＤＦ８ペプチドが、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むように、任意の位置で容易に改変され得ることを理解する。好ましくは、ペプチドは、本明細書において以下に例示されるように、ラットモノクローナル抗体７８８に特異的に結合する。このような保存的置換としては、例えば、残基３２８、残基３２９および残基３３５、およびそれらの組み合わせにおける改変が挙げられる（ここで、アミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＡｓｎもしくはＶａｌであり、；アミノ酸残基３２９は、Ｌｙｓもしくは Ｌｅｕであり；そしてアミノ酸残基３３５は、ＳｅｒもしくはＰｒｏもしくはＴｈｒである）。前駆体ＧＤＦ８の残基３２８、残基３２９および残基３３５は、図２に示されるように、ＧＤＦ８タンパク質配列内で、種にわたって変動するが、それにもかかわらず、成熟ＧＤＦ８は機能を残している。
【００８２】
図１は、その前駆体タンパク質の状態における、（成熟タンパク質を形成する）ＧＤＦ８活性領域の地図を示す。ＧＤＦ８活性領域の地図上に重ねられているのは、７つの重複するペプチドの位置である。これらの重複するペプチドは、ＧＤＦ８の抗体結合エピトープ（単数または複数）を同定するための標的を提供するために設計された。ＤＪ５として標識されたペプチドは、例示された抗血清に対する唯一の有意なＧＤＦ８の結合エピトープとして例示された、ヤギ抗ＧＤＦ８抗血清のＩｇＧ分画を用いたスクリーニングによって同定された。このペプチドは、前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）の残基３２７〜残基３４６に対応する配列（配列番号８）を有する。
【００８３】
（ＧＤＦ８ペプチドワクチン組成物）
上記のＧＤＦ８ペプチドは、好ましくは、ワクチン組成物へと処方され得る。これらのワクチン組成物は、高度に特異的な抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発する目的で動物を免疫するために利用され得る。免疫化の結果は、免疫された動物におけるＧＤＦ８機能のダウンレギュレーションである。このようなワクチン組成物は、当該分野で周知であり、例えば、生理学的に適合性のある緩衝液、保存剤、および生理食塩水など、ならびにアジュバントを含む。
【００８４】
「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増大させ、それによって、所与のワクチンにおいて必要な抗原の量、および／または目的の抗原に対する適切な免疫応答を生じるために必要な注入の頻度を低減させる因子である。動物のワクチン接種のために適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（ピーナッツ油、マンニドモノオレエート（ｍａｎｎｉｄｅ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）およびアルミニウムモノステアレートを含有する；フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント；鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ
ｐｏｌｙｏｌ）；ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポール）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン；ならびに油乳濁液。タンパク質またはペプチドはまた、リポソ−ムまたは他のマイクロキャリア中への組み込みの後に投与され得る。アジュバントおよびイムノアッセイの種々の局面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版（１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によるシリーズ（本明細書において参考として援用される）に開示されている。
【００８５】
ワクチン組成物は、免疫応答を誘発するのに十分な量の所望される免疫原（例えば、本発明のＧＤＦ８ペプチド）を含む。投与される量は、動物の質量に対して、約０．０００１ｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇの範囲であり得る。任意の適切な獣医学的動物が、ポリクローナル抗血清を得るために容易に利用され得る。好ましくは、動物は、哺乳動物であり、これには、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヤギおよびヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、霊長類（例えば、サル、大型類人猿およびヒト）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
ワクチン組成物は、任意の標準的経路（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、卵内（特に家禽に対して）、および／または経口が挙げられる）によって容易に投与される。魚類の種については、ワクチン組成物または免疫原性組成物を投与する方法は、上述、ならびに抗原性濃度のペプチドを含む水に魚を浸す工程、魚を水から短時間離している間に抗原性濃度のペプチドを魚に噴霧する工程、などを包含する。当業者は、ワクチン組成物が、各型のレシピエント動物および各型の投与経路に対して適切に処方されることが好ましいことを理解する。
【００８７】
適切な動物被験体としては、野生のもの、家畜（例えば、肉、乳、バター、卵、毛皮、皮革、羽毛、および／もしくは羊毛のために育てられたもの）、荷役用の動物、研究用動物、コンパニオン動物、ならびに動物園用／動物園内、野生生息環境用／野生生息環境内、および／またはサーカス用／サーカス内で育てられた動物が挙げられ得る。特定の実施形態において、動物は、大型類人猿（例えば、ゴリラ）またはヒトである。
【００８８】
１つの好ましい実施形態において、動物は、「食物生産用」動物であり、免疫の結果、この動物の重量、特に筋肉量は、免疫されない動物に対して増加する。本発明の目的に関して、用語「食物生産用」動物は、ヒトおよび／もしくは他の動物によって消費されるため、または消耗品（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ）（例えば、卵または乳）を生産するために繁殖させられるあらゆる動物を含むと理解されねばならない。このような動物の非限定的な列挙としては、以下が挙げられる：トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ）、ウシ（例えば、肉牛（ｂｅｅｆ／ｖｅａｌ ｃａｔｔｌｅ）、乳牛、繁殖用の種ウシ、バッファロー）、ブタ（例えば、雄ブタ（ｈｏｇ）もしくはブタ（ｐｉｇ））、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヤギもしくはヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ））、ならびに水生動物（甲殻類およびマスもしくはサケのような魚を含む）、そしてヒト消費のために生育もしくは収穫される他の種。
【００８９】
本発明の目的に関して、用語「魚」は、限定されることなく、魚の真骨下綱（Ｔｅｌｅｏｓｔｉ）群（すなわち、硬骨魚（ｔｅｌｅｏｓｔ））を包含することが理解されねばならない。サケ目（サケ科を含む）およびスズキ目（クロマス科を含む）は、真骨下綱群に含まれる。
【００９０】
考えられる魚レシピエントの例としては、サケ科、ハタ科、タイ科、カワスズメ科、クロマス科、イサキ（ｔｈｒｅｅ−Ｌｉｎｅ Ｇｒｕｎｔ）（Ｐａｒａｐｒｉｓｔｉｐｏｍａ ｔｒｉｌｉｎｅａｔｕｍ）、およびブルーアイ・プレコストマス（Ｂｌｕｅ−Ｅｙｅｄ Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ）（Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ種）が挙げられる。
【００９１】
【化３】
【００９２】
【化４】
【００９３】
さらなる好ましい実施形態において、動物は、コンパニオン動物またはヒトであり、ワクチンは、ＧＤＦ８の長期ダウンレギュレーションを提供するように、そのようなＧＤＦ８ダウンレギュレーションに応答する任意の獣医学的目的または医療目的のために、投与される。本発明の目的に関して、用語「コンパニオン」動物が、あらゆる動物−ウマ（ｈｏｒｓｅ（ｅｑｕｉｎｅ））、ネコ（ｃａｔ（ｆｅｌｉｎｅ））、イヌ（ｄｏｇ（ｃａｎｉｎｅ））、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットを含む）、ウサギ種、およびトリ（例えば、ハト、オウムなど）−を含むことが理解されねばならない。
【００９４】
このようなワクチン接種または抗体を受容する他の鳥類は、販売されている鳥類飼養または販売されていない鳥類飼養のいずれかに関連し得る。これらとしては、例えば、ガンカモ類（例えば、ハクチョウ）、ハト科（Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ）（例えば、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ）（例えばドバト））、キジ科（例えば、ヤマウズラおよびライチョウ）、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ，Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ（例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム（例えば、ペットもしくは収集家の市場のために生育されたもの））、ならびに平胸類の科の任意のメンバーが挙げられる。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、任意の上記の動物（好ましくは、非ヒト）が、 本発明のペプチドに特異的に結合する抗ＧＤＦ８抗体を得るために免疫され、そして誘発された抗体は、アッセイ、および／または獣医学もしくはヒト医療において、例えば、ＧＤＦ８のダウンレギュレーションに応答する任意の獣医学的もしくは医学的目的のためにＧＤＦ８のダウンレギュレーションを提供する目的で使用するために、収集される。
【００９６】
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的な実施例を参照することによって、よりよく理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施形態をより十分に説明するために提示され、決して、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
（材料および方法）
（Ａ．前駆体ＧＤＦ８（ＧＤＦ８プロホルモン）の発現および精製）
前駆体ＧＤＦ８またはプロホルモンの天然ＤＮＡ配列（配列番号２）を、哺乳動物発現系およびウイルス発現系における発現のために最適化した。ウイルス宿主遮断機構のネガティブな効果を回避するため、ＤＮＡ配列を、哺乳動物核酸とはできる限り相違するように設計した。これを達成するため、ＧＤＦ８プロホルモンのアミノ酸配列を、酵母好適コドンを使用して逆翻訳した。得られた配列を、ヒトＧＤＦ８核酸配列に対する相同性を保持しているコドンに関して調査した。可能であれば、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換した。得られた核酸分子（配列番号３）を、適切な発現ベクター中に組み込むために、業者に合成させた。
【００９８】
Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、最適化されたＧＤＦ８プロホルモンを発現させた。簡単にいうと。Ｃ末端ＦＬＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）エピトープ融合体を含むＧＤＦ８プロホルモン構築物を、改変ＧＤＦ８プロホルモンをコードする遺伝子をプラスミドｐＣＭＶｔａｇ４Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）に挿入することによって構築した。ＦＬＡＧ融合タグは、抗ＦＬＡＧ（登録商標）ゲルカラム上でのＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質の分離を容易にする。次いで、改変ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子を含むＰＣＲ ＤＮＡフラグメントをプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質を発現するＦｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ細胞株の生成を、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ細胞株の、ＧＤＦ８−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子を含むＦｌｐ−ＩｎＴＭ発現ベクターとＦｌｐリコンビナーゼ発現プラスミドＰＯＧ４４との同時トランスフェクションによって達成した。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的ＤＮＡ組み換えによって、組み込まれたＦＲＴ部位におけるＦｌｐ−Ｉｎ発現カセットのゲノムへの挿入を媒介する。ハイグロマイシンＢ選択を用いて、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープを含むＧＤＦ８プロホルモンを発現および分泌する安定細胞株を得た。
【００９９】
ＦＬＡＧ（登録商標）タグを含むＧＤＦ８プロホルモンを発現する安定ＣＨＯ細胞株を、標準的技術を用いて、無血清培地中での懸濁培養に適応化した。分泌ＧＤＦ８プロホルモンを含む条件培地を、ＷＡＶＥバイオリアクターシステム（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ＬＬＣ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を使用して作製した。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ化ＧＤＦ８プロホルモンの精製を、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって達成した。
【０１００】
（Ｂ．ＤＪ５特異的抗体の精製）
ＤＪ５（配列番号８；以下の表２を参照のこと）特異的抗体分画を、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。アフィニティーカラムを、１０ｍｇのＤＪ５合成ペプチドを０．８ｇの臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）に結合させることによって調製した。このカラムを、ＰＢＳで洗浄し、平衡化した。およそ１１ｍｌのヤギＩｇＧ分画（１０ｍｇ／ｍｌ）をこのアフィニティーカラムに適用し、そして２５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。１．０ｍｌの分画を収集し、２８０ｎｍでの吸光についてモニタリングした。結合した材料を、およそ１０ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ １．８５）で溶出した。１．０ｍｌの分画を収集し、０．２５ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．７５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．４）で中和した。未結合分画１〜１０および結合分画２５〜３５のおよそ２５μｌのアリコートを、ＤＪ５ペプチドに対するＥＬＩＳＡ反応性についてアッセイした。未結合分画が、ＤＪ５反応性に関してネガティブであることを見出した。結合分画は、ＤＪ５ペプチドに対する反応性の強いピークを示した。未結合分画１〜１１および結合分画２６〜３４をプールした。プールしたサンプルを濃縮し、それらの緩衝液を、以下に示されるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。サンプル濃縮物を、ＯＤ２８０法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．２．７．３，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって判定した。以後の使用のために、未結合サンプルを１０ｍｇ／ｍｌに調整し、結合サンプルを１ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１０１】
（実施例２）
（ヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナルＩｇＧ血清）
以下の方法によって免疫したヤギから、ヤギ抗前駆体ＧＤＦ８ ＩｇＧを得た。
【０１０２】
（Ａ．ヤギの免疫化）
ザーネン（Ｓａａｎｅｎ）（乳）ヤギ（およそ２歳の雄）を、精製した組み換えＧＤＦ８プロホルモン（上記の実施例１に記載するように得たもの）で、以下のように免疫した。０．５ｍｇのタンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化し、そしてヤギの皮膚の下に皮下（ＳＣ）注射した。続いて、３週、６週、および１０週において追加免疫をＳＣに投与し、これはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に乳化した０．３ｍｇのタンパク質を含んだ。シリンジと針とによって頚静脈から血液を採取し、そして真空瓶および真空管に採った。この血液を抗凝固剤を含む瓶に集め、２５００ＲＰＭで２０分間遠心分離して、赤血球を除去した。血漿を再石灰化して、血清を生成した。最初の免疫の１５週後に集めた血清サンプルを、さらなる分析に使用した。
【０１０３】
（Ｂ．ヤギポリクローナルＩｇＧの収集および精製）
１５週後、ヤギから血清を回収し、この血清から、以下のようにＩｇＧ分画を精製した。ヤギ血清のＩｇＧ分画を、プロテインＧアガロースカラム上で、製造者（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のプロトコールに従って精製した。溶出分画をプールし、濃縮し、そして緩衝液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心分離フィルター（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を利用してリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。サンプル濃縮物を、ＯＤ２８０法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，同上）で判定し１０ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１０４】
（実施例３）
（ヤギ抗血清の特徴付け）
上記の実施例２によって提供されたヤギ抗血清を、ＰＧＡと称する。ＰＧＡ ＩｇＧ分画がＧＤＦ８プロホルモン分子上の種々のエピトープに指向する抗体を含むことが、予測される。ＰＧＡ抗血清を、以下のように、インビトロ転写活性アッセイによって特徴付けた。ＧＤＦ８生体中和を定量的に測定するために使用されるインビトロ転写活性アッセイは、本質的に、Ｔｈｉｅｓら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１（２００１））のアッセイである。９６ウェル組織培養処理されたルミノメーターＶｉｅｗＰｌａｔｅＴＭアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に、１．０×１０５細胞／ウェルのＡ２０４横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿されたチャンバー内でインキュベートした。完全Ａ２０４培養培地は、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、１０％ウシ胎仔血清、２％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンから構成される。８０％を超えるコンフルエンスに達した場合、ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の製造者によって推奨されるプロトコールを用いて、プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼとＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺとの混合物で細胞を一過性にトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿されたチャンバー内で１６時間インキュベートした。プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼは、４コピーのヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ−１）に由来するＣＡＧＡボックスを含む（これは、異種プロモーターレポーター構築物にＧＤＦ８反応性を与える）。
【０１０５】
プラスミドＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺは、構成的ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この遺伝子は、トランスフェクション効果を標準化するためのコントロールとして、添加される。次いで、細胞を１００ｎｇ／ウェルのＧＤＦ８タンパク質（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理し、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿されたチャンバー内で１６時間さらにインキュベートした。処理細胞において、Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用して、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを定量化した。
【０１０６】
各サンプルを２つ組（２ウェル）で実行した。各ウェルのシグナルを、ルシフェラーゼのシグナル÷β−ガラクトシダーゼシグナル×１００として計算した。サンプルシグナルを２つのウェルの平均として計算した。
【０１０７】
抗体サンプルの生体中和活性を試験するため、細胞の処理の前に、種々の濃度の精製ＩｇＧ分画をＧＤＦ８タンパク質とともに（およそ１６時間、４℃で）インキュベートした。パーセント阻害を、１００−（１００×サンプルシグナル）／（ＧＤＦ８単独でのシグナル−ＧＤＦ８添加なしのシグナル）として計算した。このインビトロ転写活性アッセイの結果を、以下の表１にまとめる。
【０１０８】
（表１）
（ヤギ血清ＰＧＡに関するＧＤＦ８中和力価）
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
中和アッセイは、回収されたヤギ血清のＩｇＧ分画が、この活性アッセイにおいて使用されたＧＤＦ８の少なくとも９５％を中和し得る抗体を含むことを確証した。
【０１１１】
（実施例４）
（ヤギポリクローナル抗体は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的中和エピトープを規定する）
中和性免疫応答の特異性を決定するために、ＰＧＡ ＩｇＧ分画を、活性ＧＤＦ８タンパク質の全コード領域にわたる７つの重複ペプチドのセット（ＤＪ１〜７、表２および図１を参照のこと）を用いて、その反応性についてアッセイした。各個別のペプチドに対するヤギＰＧＡ ＩｇＧの反応性を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＧＤＦ８ペプチドＥＬＩＳＡを、本質的に、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｅｔｅｃｔｏｒＴＭＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＨＲＰ ＡＢＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において記載されるように行った。このアッセイにおいて、以下の改変を用いた。合成ペプチドＤＪ１〜７（以下の表２を参照のこと）は、本発明者らの指示の下、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｗａｙ，ＣＡ）によって注文合成された。プレートを５００ｎｇ／ウェルの合成ペプチドおよび２５０ｎｇ／ウェルの精製ＧＤＦ８プロホルモンによってコーティングした。一次抗体は、種々のサンプル由来のＩｇＧ分画であった。二次抗体を、１：２０００希釈で使用した。ヤギ一次抗体サンプルに対しては、二次抗体は、ヤギＩｇＧに対するウサギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ラット一次抗体サンプルに対しては、二次抗体は、ラットＩｇＧに対するヤギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ＯＤ４０５ｎｍをＥＬＩＳＡプレートリーダーで１５分間読み取った。ＥＬＩＳＡ反応性をＯＤ４０５／分×１０００として計算した。
【０１１２】
（表２）
（ＧＤＦ８活性領域ペプチド）
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
＊ヒトＧＤＦ８プロホルモン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５２５０）に対して
ＥＬＩＳＡの結果を以下の表３にまとめる。
【０１１５】
（表３）
（ＧＤＦ８活性領域ペプチドに対するＰＧＡ ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）のＥＬＩＳＡ反応性）
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
＊ペプチド、＊＊プロホルモン
ＰＧＡ ＩｇＧ分画は、精製ＧＤＦ８プロホルモンおよびＤＪ５ペプチドの両方に特異的に反応した。ＧＤＦ８活性領域ペプチドの中でも、ＩｇＧ分画は、特異的かつ排他的にＤＪ５ペプチドに反応する。これは、この結成の中和能がＤＪ５ペプチドによって規定されるエピトープに対して指向することを強く示す。この仮説を確認するため、ＰＧＡ ＩｇＧのＤＪ５特異的分画を精製した。材料および方法において記載されるようなアフィニティークロマトグラフィーによって、これを達成した。ＰＧＡ抗体を、ＤＪ５ペプチド結合分画とＤＪ５ペプチド未結合分画とに分離した。両分画を、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性についてアッセイした。
【０１１８】
表４の結果は、大部分のＧＤＦ８中和能が、ＤＪ５ペプチドに特異的に結合する抗体とともに存在することを示す。このことは、ＤＪ５ペプチドがＧＤＦ８タンパク質の中和エピトープを規定することを、明確に実証する。
【０１１９】
（表４）
（ＤＪ５特異的抗体のＧＤＦ８中和活性）
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
＊＊正常ヤギＩｇＧは、非免疫ヤギ血清（業者から購入）から精製されたネガティブコントロールであった。
【０１２２】
興味あることに、予備実験において、２羽のウサギをキーホールリンペットヘモシニアンに結合したヒトＤＪ５抗原を用いて注射した場合、中和ＧＤＦ８抗体は得られなかった。図２において見ることができるように、ウサギについてのＤＪ５に対応するアミノ酸配列とヒトＧＤＦ８に対応するアミノ酸配列とは、同一であるが、一方、ヤギＤＪ５のアミノ酸配列は異なっている。したがって、ヤギについて上記で提供されたデータに関して、予備的なウサギのデータは、宿主動物ＧＤＦ８の対応する領域／部分のアミノ酸配列異なるアミノ酸配列を含むＤＪ５抗原を使用することが有利であり得ることを示唆する。したがって、この場合、組み換えヒトＧＤＦ８プロホルモンの、ヤギにおいて生体中和抗体を誘導する能力は、少なくとも部分的に、使用された抗原が、ＧＤＦ８のＤＪ５領域／部分における一アミノ酸置換によって、宿主配列のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含んだという事実に起因し得る［図２のアミノ酸残基３３３を参照のこと］。より詳細には、図２に示すように、ヒト配列におけるＡｒｇ３３３は、ヤギ配列においてＬｙｓ３３３残基によって置換されている。この孤立した保存的アミノ酸置換は、ヤギの免疫学的監視系に対してタンパク質の「外来性」を与えるのに十分に有意な変更を構成し得る。
【０１２３】
（実施例５）
（ＧＤＦ８中和性Ｒａｔ ｍＡＢ ７８８は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的中和エピトープを規定する）
ラットモノクローナル抗体 ７８８がマウスＧＤＦ８生物活性を中和することが報告されている（Ｒ ＆ Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ７８８，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。この結果を確認するために、本発明者らは、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性について、モノクローナル抗体をアッセイした。抗体を上記の実施例２に記載されるように特徴付けた。このアッセイの結果を、以下の表５にまとめる。
【０１２４】
（表５）
（モノクローナル抗体 ７８８に対するＧＤＦ８中和力価）
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
表５は、この抗体が、ＧＤＦ８タンパク質の活性を中和し得ることを確証する。この中和免疫応答の特異性を決定するため、ラットモノクローナル抗体を、活性ＧＤＦ８タンパク質のコード領域全体にわたる７つの重複ペプチドのセット（ＤＪ１〜７、表２および図１を参照のこと）との、その反応性に関してアッセイした。各個別のペプチドに対するモノクローナル抗体の反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した（材料および方法を参照のこと）。
【０１２７】
（表６）
（Ｒａｔ ＭＡＢ ７８８（１０ｍｇ／ｍｌ）のＧＤＦ８活性領域ペプチドに対するＥＬＩＳＡ反応性）
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
＊ペプチド、＊＊タンパク質
ラットモノクローナル抗体は、精製ＧＤＦ８プロホルモンとＤＪ５ペプチドとの両方に特異的に反応した。代表的に、モノクローナル抗体は、単一のエピトープに対する単特異性（ｍｏｎｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する。ＧＤＦ８活性領域ペプチドの中で、このモノクローナル抗体は、ＤＪ５ペプチドと特異的かつ排他的に反応する。この結果は、ＤＪ５ペプチドがＧＤＦ８タンパク質の中和エピトープを規定するというさらなる独立した証拠を提供する。
【０１３０】
本発明の多くの改変および変更は、当業者に理解されるように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書において記載される特定の実施形態は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲の条件、合わせてそのような特許請求の範囲が権利付与する等価物の全範囲の条件によってのみ限定されるべきである。本明細書において、刊行された、および／もしくはインターネットで公開された核酸配列およびポリペプチド／タンパク質配列のＧｅｎｅｂａｎｋ登録番号を含む、多くの参考文献が引用される。これらの開示は、その全体が、参考として援用される。
【０１３１】
（配列表）
【０１３２】
【数１】
【０１３３】
【数２】
【０１３４】
【数３】
【０１３５】
【数４】
【０１３６】
【数５】
【０１３７】
【数６】
【０１３８】
【数７】
【０１３９】
【数８】
【０１４０】
【数９】
【０１４１】
【数１０】
【０１４２】
【数１１】
【０１４３】
【数１２】
【０１４４】
【数１３】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、米国特許仮出願番号６０／５３３，７１９（２００３年１２月３１日出願；この内容は、その全体が本明細書によって参考として援用される）の優先権を主張する非仮出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質成長分化因子８、および成長分化因子８の抗原性ペプチドフラグメント、ならびに関連する免疫原、ワクチン、および成長分化因子８の活性を調節するために動物を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
成長分化因子８は、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）スーパーファミリーとともに分類されるタンパク質である。一般的に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質は、最初に、タンパク質Ｃ末端から約１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基の一団においてタンパク質分解性の切断を受ける前駆体（別名プロホルモン）として発現される。各々の場合において、活性または成熟ＴＧＦ−β種は、切断された前駆体タンパク質Ｃ末端領域のジスルフィド結合されたダイマーであると考えられている。
【０００４】
成長分化因子８（本明細書においてこれ以降、ＧＤＦ８）はまた、ＧＤＦ−８またはミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）として当該分野で公知である。ＧＤＦ８の前駆体（本明細書においてこれ以降、「前駆体ＧＤＦ８」）をコードする遺伝子は、多岐にわたる生物体からクローニングされている。これらとしては、ヒトおよびマウス前駆体ＧＤＦ８が挙げられる［非特許文献１；特許文献１（これらの内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）］。ＧＤＦ８免疫反応性が、ヒト骨格筋において、Ｉ型線維およびＩＩ型線維の両方において検出可能であることが、また報告されている。ＧＤＦ８を検出するための抗体およびアッセイは、例えば、特許文献２によって記載されている。
【０００５】
ＧＤＦ８ノックアウトマウスによって確認されたように、ＧＤＦ８が骨格筋の成長および発達をダウンレギュレートまたは阻害することに役割を果たすことが、さらに報告されている（非特許文献２）。この理由のため、特に動物管理の分野において、種々の食用動物の成長および／または相対的な筋の質量を増強するためにＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせることを目標として、数種の手段によって動物中のＧＤＦ８活性を調節する試みがこれまでになされてきた。
【０００６】
例えば、特許文献３は、前駆体ＧＤＦ８遺伝子プロモーターおよびアッセイを記載し、このアッセイが、そのプロモーターの理論的インヒビターを同定するために使用されることを提唱する。特許文献４は、細胞を、ＧＤＦ８レセプターに対して競合するＧＤＦ８プロドメインと接触させることによって、その細胞上でＧＤＦ８の効果を阻害する方法を記載し、そして成熟ＧＤＦ８のＣ末端が変動し得ることを報告する。特許文献５は、ＧＤＦ８の可能性のあるアンタゴニストとしてのフォリスタチンの使用を記載する。これらの方法からは、動物管理の分野における実際的な適用、または臨床適用（ヒトでも獣医学的にも）という結果は得られなかった。
【０００７】
他はまた、ＧＤＦ８機能をダウンレギュレートするために抗体およびワクチン技術を利用することを試みた。例えば、特許文献６［その内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］は、抗ＧＤＦ８抗体を誘発するためのペプチド（すなわち、ＧＤＦ８タンパク質のフラグメント）およびワクチンを記載する。この特許はまた、数種の報告されたＧＤＦ８ペプチドフラグメントで免疫されたげっ歯類における、コントロールに対して明らかでない程度の成長および重量の増加を報告した。
【０００８】
ＧＤＦ８に関する他の生理学的役割もまた記載されている。例えば、特許文献７［その内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］は、ＧＤＦ８機能を阻害すること（例えば、この状態を有する患者に抗ＧＤＦ８抗体または抗ＧＤＦ８ワクチンを投与することによって）は、ＩＩ型糖尿病を処置するために有用であることが示唆している。
【０００９】
それにもかかわらず、当該分野において、抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための改善された抗原および免疫原、ならびにＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改善されたＧＤＦ８抗体に対する、長期にわたる必要性が未だ存在する。
【００１０】
本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，８２７，７３３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０９６，５０６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３９９，３１２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６５６，４７５号明細書
【特許文献５】米国特許第６，００４，９３７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３６９，２０１号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３６８，５９７号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎｅｓｔｏｒら，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」，１９９８年，９５：１４９３８−４３
【非特許文献２】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら，「Ｎａｔｕｒｅ」，１９９７年，３８７：８３−９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ＧＤＦ８に関する特異的中和エピトープを含むＧＤＦ８ペプチド（例えば、５０残基以下のＧＤＦ８のペプチドフラグメント）を提供することによって、当該分野におけるこれらの欠点および他の欠点を解決する。
【００１４】
本発明の一実施形態において、例えば、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）の残基約３１２〜残基約３６１を含む単離されたペプチドを含む、ＧＤＦ８ペプチドが提供される。好ましくは、本発明のＧＤＦ８ペプチドは、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８の残基約３２０〜残基約３５０を含み、より好ましくは残基約３２１〜残基約３４６を含み、最も好ましくは残基約３２７〜残基約３４６を含む。例示的なＧＤＦ８ペプチドは、本明細書においてこれ以後ＤＪ５と標識され、以下のように、便宜上配列番号１の前駆体ＧＤＦ８に基づく残基番号付けに従って、１文字コードおよび３文字コードの両方で示される。
【００１５】
【化１】
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、ＧＤＦ８ペプチドは、必要に応じて、保存的単一アミノ酸置換を含む。単純に例として、これらは、上記ペプチド内の１〜少なくとも５アミノ酸位置にわたり得る。特定の実施形態において、例えばＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が存在する。別の実施形態において、ＧＤＦ８ペプチドは、上記ペプチド内のわずか５アミノ酸位置において、保存的アミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に２つの保存的アミノ酸置換が存在する。なお別の実施形態において、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に３つの保存的アミノ酸置換が存在する。さらに別の実施形態において、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に４つの保存的アミノ酸置換が存在する。
【００１７】
好ましくは、アミノ酸残基置換は、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）に対して１つ以上の位置にあり、これは、図２の種間アラインメントのアミノ酸変異によって特徴付けられる。これらは、残基３２８、残基３２９、残基３３１、残基３３３および残基３３５、ならびにそれらの組み合わせにおいて存在し、ここで、
（ａ）アミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、ＬｅｕもしくはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９は、ＧｌｎもしくはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１は、ＡｓｎもしくはＳｅｒであり；
（ｄ）アミノ酸残基３３３は、ＡｒｇもしくはＬｙｓであり；そして／または
（ｅ）アミノ酸残基３３５は、Ｓｅｒ、ＰｒｏもしくはＴｈｒである。
【００１８】
好ましくは、このような改変ＧＤＦ８ペプチドは、抗ＧＤＦ８抗体についての特異的中和エピトープを含み、したがって、本明細書において以下に例示されるように、抗ＧＤＦ８抗体（この抗体は、ｍＡｂ ７８８および／またはヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ分画である）に特異的に結合する特性を保持する。
【００１９】
本発明のなおさらなる実施形態において、上述のＧＤＦ８ペプチドをコードする核酸分子（すなわち、ポリヌクレオチド）が提供される。
【００２０】
好ましくは、この核酸分子は、天然に存在するヒト前駆体ＧＤＦ８遺伝子の一部分、（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２５９，ヒトＧＤＦ８遺伝子；配列番号２）のおよそヌクレオチド１１１２〜およそヌクレオチド１１７１を含む。この部分は、上記のとおり、ペプチドＤＪ５をコードする。ＮＭ＿００５２５９の記録が、実際のコード領域に隣接する大量の配列を含むことに注意すること。当業者はまた、ＤＪ５が、ＧＤＦ８プロホルモンの実際のコード領域のヌクレオチド９７９〜１０３８に対応することを理解する。
【００２１】
上記核酸分子を含む複製可能なクローニングベクターおよび原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞もまた、ＧＤＦ８ペプチドを生成する方法に従って提供される。上記方法は、以下の工程を包含する：宿主細胞を培養する工程；そのコードされたペプチドを発現させる工程；および、そのペプチドを回収する工程。当業者はまた、本発明のＧＤＦ８ペプチドがまた、標準的な当該分野で公知の化学合成方法によって容易に生成されること理解する。
【００２２】
本発明のなおさらなる実施形態において、本発明のＧＤＦ８ペプチド（またはその融合タンパク質）を含むワクチン組成物が、また提供される。
これは、例えば好ましくは、１種以上のアジュバンド、および他の当該分野で標準的なペプチドベースもしくはタンパク質ベースのワクチン組成物の構成要素を含む。動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発する方法もまた提供され、この方法は、その動物に有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する。
【００２３】
別のさらなる実施形態において、複数の抗体または抗体フラグメントの中から抗ＧＤＦ８抗体または抗体フラグメントを選択するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、ペプチドと１つまたは複数の抗体または抗体フラグメントとを接触させて、このペプチドに選択的に結合する抗体または抗体フラグメントを検出する工程を包含する。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法を提供する。一つのこのような実施形態において、この方法は、抗体または抗体フラグメントを、動物においてＧＤＦ８活性を（抗体がこのペプチドに特異的に結合するか、または本明細書において記載されるようにワクチン組成物でこの動物を免疫することによって）ダウンレギュレートするのに有効な量および期間、その動物に投与する工程を包含する。この動物は、好ましくは、脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物、鳥類または魚類である。好ましくは、この哺乳動物は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ）動物（例えば、家畜業（ａｎｉｍａｌ ｈｕｓｂａｎｄｒｙ）に使用される動物、あるいは、コンパニオン動物）であるが、必要に応じて、このようなＧＤＦ８ダウンレギュレーションを必要とするヒトであり得る。
【００２５】
本発明はまた、本発明のＧＤＦ８ペプチドを組み込んだ融合タンパク質を企図する。この融合タンパク質は、ＧＤＦ８融合タンパク質の分泌もしくは細胞表面発現を増強し、そして／または選択的結合システムによる精製を可能にするシグナルペプチドであるドメインを含み得る。さらに、この融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドドメインの免疫原性を増強するために、シグナルキャリアタンパク質中の１つ以上のＧＤＦ８ペプチドに結合することを企図される。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６を含む５０以下のアミノ酸残基からなるＧＤＦ８ペプチドを含む。この型の関連する実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドの免疫原性サブフラグメン（例えば、ＤＪ５（配列番号８）由来の約１０個の保存的連続するアミノ酸残基を含むＧＤＦ８ペプチド）を含む。
【００２６】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
５０以下のアミノ酸残基からなる単離されたペプチドであって、該アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残３２７〜３４６基を含む、単離されたペプチド。
（項目２）
配列番号１のアミノ酸残基３２１〜３４６を含む、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目３）
配列番号１のアミノ酸残基３２０〜３５０を含む、項目２に記載の単離されたペプチド。
（項目４）
配列番号１のアミノ酸残基３１２〜３６１を含む、項目３に記載の単離されたペプチド。
（項目５）
５０以下のアミノ酸残基からなる単離されたペプチドであって、該アミノ酸残基は、アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６を含み、
ここで、アミノ酸残基３２７〜アミノ酸残基３４６の間にわずかに５個のアミノ酸置換が存在し；そして
ここで、該ペプチドは、ラットモノクローナル抗体７８８に特異的に結合する、
単離されたペプチド。
（項目６）
項目５に記載の単離されたペプチドであって、以下：
残基３２８、残基３２９、残基３３１、残基３３３および残基３３５、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、ここで、
（ａ）アミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、ＬｅｕもしくはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９は、ＧｌｎもしくはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１は、ＡｓｎもしくはＳｅｒであり
（ｄ）アミノ酸残基３３３は、ＡｒｇもしくはＬｙｓであり；そして／または
（ｅ）アミノ酸残基３３５は、Ｓｅｒ、ＰｒｏもしくはＴｈｒである、
単離されたペプチド。
（項目７）
項目６に記載の単離されたペプチドであって、前駆体ＧＤＦ８の残基３２７〜残基３４６の間にわずか１個のアミノ酸置換を含み、ただし、該ペプチドは、ラットモノクローナル抗体７８８に特異的に結合する、単離されたペプチド。
（項目８）
抗ＧＤＦ８抗体に対する特異的中和エピトープを含む、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目９）
前記抗体が、ラット抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体７８８およびヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ分画からなる群より選択される、項目８に記載の単離されたペプチド。
（項目１０）
項目１に記載のペプチドまたは該ペプチドの抗原性サブフラグメントを含む、融合タンパク質。
（項目１１）
項目１０に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
（項目１２）
項目６に記載のペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１３）
項目１に記載のペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１４）
配列番号２のヌクレオチド１１１２〜ヌクレオチド１１７１の核酸配列を含む、項目１３に記載の核酸分子。
（項目１５）
項目１３に記載の核酸分子を含む、複製可能なクローニングベクター。
（項目１６）
項目１５に記載の複製可能なクローニングベクターを含む、宿主細胞。
（項目１７）
前記クローニングベクターによって形質転換された、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１８）
真核生物細胞である、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１９）
ＧＤＦ８ペプチドを生成する方法であって、項目１８に記載の宿主細胞を培養する工程、コードされたペプチドを発現させる工程、および該ペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目２０）
項目１に記載のペプチドを含む、ワクチン組成物。
（項目２１）
項目１０に記載の融合タンパク質を含む、ワクチン組成物。
（項目２２）
アジュバントをさらに含む、項目２０に記載のワクチン組成物。
（項目２３）
動物における抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発する方法であって、該動物に、有効量の項目２０に記載のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
複数の抗体または抗体フラグメント中から抗ＧＤＦ８抗体または抗体フラグメントを選択するためのスクリーニング方法であって、項目１に記載のペプチドと１種もしくは複数の抗体または抗体フラグメントを含むサンプルとを接触させる工程、ならびに該ペプチドに選択的に結合する抗体または抗体フラグメントを検出する工程を包含する、方法。
（項目２５）
動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法であって、該動物に、該動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせるのに有効な量および有効な期間、抗体または抗体フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、該抗体は、項目１に記載のペプチドに特異的に結合する、方法。
（項目２６）
動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法であって、有効量の項目２０に記載のワクチン組成物で該動物を免疫する工程を包含する、方法。
（項目２７）
動物においてＧＤＦ８活性をダウンレギュレートさせる方法であって、有効量の項目２１に記載のワクチン組成物で該動物を免疫する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＧＤＦ８活性領域（すなわち、成熟ＧＤＦ８）中の重複ペプチドＤＪ１〜ＤＪ７を示す。これは、前駆体ＧＤＦ８配列の残基２６６〜３７５である。
【図２】図２は、記載されたさらなる動物種の前駆体ＧＤＦ８タンパク質中に配置された場合の、類似する２０残基ペプチドと比較したヒトＤＪ５ペプチド配列（配列番号８）のアラインメントを示す。アミノ酸残基位置３２１〜３４７は、ヒト前駆体ＧＤＦ８に基づく。Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号（本明細書において参考として援用される）は、その種に関する全体が公開されたタンパク質配列を識別する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
アラインメントされたペプチドは、以下の配列番号を有する。
【００２９】
【化２】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
したがって、本発明は、ポリクローナル抗ＧＤＦ８ヤギ抗血清について、および他の特異的抗ＧＤＦ８抗体についての特異的中和エピトープとして役立つＧＤＦ８ドメインを同定する。これらのエピトープはまた、ＧＤＦ８タンパク質に対する活性かつ特異的な免疫応答を、インビトロ（例えば、ＧＤＦ８タンパク質の検出のため）およびインビボ（ＧＤＦ８活性をダウンレギュレートするため）の両方において誘発するために有用な、ＧＤＦ８タンパク質のフラグメントを提供するために役立つ。これらのフラグメントは、概して、本明細書においてＧＤＦ８ペプチドまたはＧＤＦ８ペプチドフラグメントと称される。これらのＧＤＦ８ペプチドの有用性は、動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発するための免疫原としての使用、およびＧＤＦ８関連アッセイにおける高度に特異的な抗体結合標的としての使用を包含する。
【００３１】
ＧＤＦ８の特異的結合エピトープを、抗ＧＤＦ８抗血清を一連の重複ＧＤＦ８ペプチドと接触させて、ペプチドと抗血清ＩｇＧ抗体との間の結合活性の程度を決定することによって同定した。発現および抗原性に関して最適化された構造を有する前駆体ＧＤＦ８タンパク質で免疫されたヤギから、抗ＧＤＦ８抗血清を得た。
【００３２】
本発明をより十分に理解するために、以下の定義が提供される。説明中の便宜的な単数形の使用は、そのように限定することを決して意図しない。従って例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物への参照は、１以上のそのようなポリペプチドに対する参照を包含する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」と交換可能に使用され、示された値の２０％以内の値を意味する。すなわち、「およそ」５０アミノ酸残基を含むペプチドは、４０と６０との間のアミノ酸残基を含み得る。
【００３４】
本発明が、本明細書中で開示された特定の構成、プロセス工程、および材料に限定されず、したがって、そのような構成、プロセス工程、および材料がいくらか変動し得ることが、また理解されるべきである。本明細書中で利用される用語法が、特定の実施形態を説明する目的のみのために使用されること、そして限定のために意図されるのではないことが、また理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるからである。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と交換可能に使用され、そしてペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸を含むポリマーを指す。好ましくは、本明細書において他に述べられない限り、用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合の用語「ペプチド」と、サイズおよび鎖の長さによって区別される。ここで、「ペプチド」とは、約５０以下のアミノ酸のポリマー鎖をいい、ポリペプチドまたはタンパク質とは、約５０アミノ酸より長いポリマー鎖をいう。必要に応じて、ペプチドまたはポリペプチドは、遺伝子またはｍＲＮＡによってコードされた特定のアミノ酸残基を欠いていてもよい。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終タンパク質から切断され、したがって最終タンパク質の一部ではない可能性がある、ポリペプチドのＮ末端上のアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードし得る。
【００３６】
本発明による「ＧＤＦ８ペプチド」は、ＧＤＦ８タンパク質に由来する相対的に短いフラグメントである。そのようなペプチドのサブフラグメントでも、ＧＤＦ８ペプチドと称され得る。本発明のＧＤＦ８ペプチドの最大サイズを限定することを意図しないが、ペプチドの最大サイズは、約５０残基であることが好ましく、より好ましくは、最大サイズは約４０残基であり、さらにより好ましくは、最大サイズは約３０残基であり、なおより好ましくは、最大サイズは約２５残基である。より一般的には、ＧＤＦ８ペプチドは、好ましくは、約１０〜約５０アミノ酸残基長のサイズの範囲であり、より好ましくは、約１５〜約３０アミノ酸残基であり、特に、約２０アミノ酸残基長である。本発明の他のＧＤＦ８ペプチドのより小さなサブフラグメントであるＧＤＦ８ペプチド（例えば、ＤＪ５（配列番号８）由来の約１０個の連続するアミノ酸残基を含むＧＤＦ８ペプチドは、好ましくは、より大きなＧＤＦ８ペプチド由来の抗原性部分（例えば、エピトープ）を含む。
【００３７】
特定の実施形態において、ＧＤＦ８ペプチドは、天然に存在するＧＤＦ８（配列番号１）のヒト前駆体の残基番号３２７〜３４６（配列番号８）によって規定されるペプチドに対して約５０％相同〜約１００％相同の範囲に及ぶ相同の程度を有する、ペプチドドメインを含む。上記の相同性の変動は、好ましくは、特定の特異的抗ＧＤＦ８抗体によって特異的に認識される本発明の抗原性構造を保有する、保存的置換および／または保存的変動である。これらの保存された置換は、種間相同性比較（例えば、図２参照）によってＧＤＦ８機能を保存することが示される残基置換を表し、そして／または、類似の化学的（例えば、物理学的）および電気的構造のアミノ酸の間における、したがって、本発明のＧＤＦ８ペプチドの抗体結合特異性を保存するおよび／もしくは最適化する残基置換を表す。このような保存的アミノ酸置換の例としては、以下が挙げられる：１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン）の別のものに対する置換；または、１つの等電荷の極性残基の別のものに対する置換（例えば、リジンに対するアルギニンの置換、アスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換、もしくはアスパラギンに対するグルタミンの置換）。
【００３８】
特に、本発明のＧＤＦ８ペプチドはまた、抗ＧＤＦ８抗体に対する特異的中和エピトープ（すなわち、以下の実施例によって記載される、ＰＧＡ 抗ＧＤＦ８ ＩｇＧポリクローナル抗体に特異的に結合する、および／または市販のラットモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）［Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ７８８（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）］に特異的に結合する、エピトープまたは抗原ドメイン）を含む。
【００３９】
本明細書において利用される場合、用語「精製された」または「単離された」とは、関係のない物質（すなわち、夾雑物、上記物質が得られるネイティブの物質を含む）の存在を減少もしくは消失させる条件下で分離された物質をいう。例えば、精製されたタンパク質または単離されたタンパク質は、好ましくは、細胞内でともに見出され得る他のタンパク質または核酸を含まない。精製された物質は、元々関連していた細胞成分の、約５０％未満、好ましくは約７５％未満、そして最も好ましくは約９０％未満を含み得る。精製は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、成分分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法によって評価され得る。機能的局面から、本発明の単離されたＧＤＦ８ペプチドは、前駆体ＧＤＦ８タンパク質および／もしくは成熟ＧＤＦ８タンパク質を含む他の物質から十分に分離され、その結果、ＧＤＦ８ペプチドに対して特異的な免疫応答を誘発し得るものである。
【００４０】
精製のための方法は、当該分野で周知である。例えば、核酸は、沈殿、クロマトグラフィー、超遠心、および他の手段によって精製され得る。タンパク質およびポリペプチド、ならびにペプチドは、種々の方法によって精製され得る。この方法としては、分取ディスクゲル電気泳動（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｃ−ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの目的のためには、タンパク質が精製を容易にするさらなる配列タグを含む組み換え系においてポリペプチドを精製することが、好ましい。このような配列タグは、例えば、ポリヒスチジン配列または抗体に特異的に結合する配列（例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）およびＧＳＴ）であるが、これらに限定されない。次いで、ポリペプチドは、宿主細胞の粗溶解物から、適切な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、上記ポリペプチドに対して生成された抗体またはその結合フラグメントが、精製試薬として使用され得る。
【００４１】
用語「実質的に純粋」は、当該分野で公知の従来の精製技術を用いて達成され得る最高度の純度を示し、そして、元の供給源の生物体または組み換えＤＮＡ発現系に由来する夾雑タンパク質、核酸および他の生物学的物質を含まない核酸、ポリペプチド、ペプチドまたは他の物質を意味する。実質的純度は、標準的な方法によってアッセイされ得、そして代表的に、少なくとも約７５％の純度、好ましくは少なくとも約９０％の純度の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の純度を超える。純度の評価は、質量ベースまたはモル濃度ベースで行われ得る。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、ヌクレオチドを含む分子であり、これらとしては、ＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列そしてさらに合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の当該分野で公知の塩基アナログを含む核酸分子を包含することを企図される。
【００４３】
「ベクター」または「複製ベクター」は、レプリコン（例えば、プラスミド、ファージ、もしくはコスミド）であり、そこに別のＤＮＡセグメントが結合するかまたは組み込まれて、結合されたセグメントの複製を生じ得る。この用語はまた、組み込まれたかまたは結合された、目的のＤＮＡセグメントを含むレプリコンを包含する。
【００４４】
本発明で使用される得るベクターとしては、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノムへの核酸の組み込みを促進し得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターである。しかし、等価な機能を果たし、かつ当該分野で公知のあらゆる他の形態のベクターが、本明細書における使用に適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００４５】
本発明のＧＤＦ８ペプチドをコードするＤＮＡのベクターへの挿入は、ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が適合性のある制限部位を含む場合、容易に達成される。これができない場合、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成される単鎖化されたＤＮＡ突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を消化して、もとの平滑末端を生成することによってＤＮＡおよび／もしくはベクターの末端を修飾すること、または適切なＤＮＡポリメラーゼを用いて上記単鎖化した末端を充填することによって同じ結果を達成することが必要であり得る。あるいは、所望される部位が、例えば、ヌクレオチド配列（リンカー）を末端に連結することによって作製され得る。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特異的オリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて生成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）を参照のこと。切断されたベクターおよびＤＮＡ フラグメントはまた、必要な場合、ホモポリマーのテイルで修飾され得る。
【００４６】
本発明で使用される組み換え発現ベクターは、代表的に、本発明のＧＤＦ８ペプチドの１つをコードする核酸を含み、通常、宿主細胞の核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子制御エレメントに作動可能に連結された、自己複製性のＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系もしくは真核生物プロモーター発現制御系であり得、そして代表的に、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意的なオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終止させる配列を含む。発現ベクターはまた、ベクターを宿主細胞とは独立に複製させる複製起点を含み得る。
【００４７】
本発明のＧＤＦ８ペプチドをコードする核酸の発現は、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて従来の方法で行われ得る。
【００４８】
ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質もしくはペプチドを「コードする配列」は、適切な調節エレメントの制御下で配置される場合にインビボもしくはインビトロで転写されて、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’末端における開始コドンおよび３’末端における終止コドンによって決定される。コード配列としては、懸隔生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）由来のゲノムＤＮＡ配列、そしてさらに合成ＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。転写末端配列は、通常、コード配列に対して３’に配置される。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」および「融合ペプチド」は、交換可能に使用され、そして「キメラタンパク質および／またはキメラペプチド」、ならびに融合「インテインタンパク質／ペプチド」を包含する。融合タンパク質は、ペプチド結合を介して別のタンパク質の少なくとも一部分に結合された本発明のＧＤＦ８ペプチドの少なくとも一部分を包含する。例えば、融合タンパク質は、マーカータンパク質もしくはマーカーペプチド、または本発明のＧＤＦ８ペプチド単離および／もしくは精製および／もしくは抗原性を補助するタンパク質もしくはペプチドを含み得る。ＧＤＦ８融合タンパク質は、ペプチド結合を介してＧＤＦ８ポリペプチドの少なくとも一部分に対して結合された、非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部分を含み得る。好ましい実施形態において、ＧＤＦ８の一部分は、機能性である（すなわち、その抗原性を保有する）。非ＧＤＦ８配列は、ＧＤＦ８配列に対するアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００５０】
そのような融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子は、ＧＤＦ８コード配列に対してインフレームに結合された非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部をコードする配列を含み、特異的プロテアーゼ（例えば、トロンビンもしくはＸａ因子）のための切断部位を、好ましくは、ＧＤＦ８配列と非ＧＤＦ８配列との間の接合部、またはその近くにコードし得る。特定の実施形態において、融合タンパク質はＣＨＯ細胞中で発現される。そのような融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドに融合されたタンパク質および／またはタグに特異的なアフィニティーカラムの使用を通じて、本発明のＧＤＦ８ペプチドを単離するために使用され得る。精製されたＧＤＦ８ペプチドは、例えば、次に、上記に参照したようなタンパク質分解酵素および切断部位の使用を通じて、融合タンパク質から放出され得る。
【００５１】
そのような一実施形態において、キメラＧＤＦ８ペプチドが調製され得る（例えば、任意の細胞または無細胞系における発現のための、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、マルトース結合（ＭＢＰ）タンパク質融合タンパク質、またはポリ−ヒスチジン−タグ化融合タンパク質）。例えば、ＧＳＴは、固体支持体マトリックスに結合したグルタチオンに結合し、ＭＢＰは、マルトースマトリックスに結合し、そしてポリ−ヒスチジンは、Ｎｉ−キレート化支持マトリックスにキレート化する。融合タンパク質は、適切な緩衝液によってか、以下に例示されるようなまたはＧＤＦ８ペプチドと融合パートナー（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ（登録商標））との間に通常設計される切断部位に特異的なプロテアーゼで処理することによって、または上記のポリ−Ｈｉｓのように、特異的マトリックスから溶出され得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」は、組み換え法によって本発明のヌクレオチド配列に付加されて、天然においては自然に形成されない核酸を形成するヌクレオチド配列である。このような核酸は、融合（例えば、キメラ）タンパク質をコードし得る。したがって、異種ヌクレオチド配列は、調節的特性および／または構造的特性を含むペプチドおよび／またはタンパク質をコードし得る。このような別の実施形態について、異種ヌクレオチド配列は、組み換え核酸が発現された後、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードし得る。さらに別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能し得る。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどの非コード配列を含み得る。
【００５３】
「宿主細胞」は、外来核酸分子を、一過性または永久的に、含むかまたは含み得、そして発現する細胞である。細胞は、外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合、そのような外来ＤＮＡによって「形質転換」されている。外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に（共有結合性に）組み込まれていてもいなくてもよい。原核生物および酵母においては、例えば、外来ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラスミド）上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外来ＤＮＡが染色体に組み込まれて、その結果、染色体複製を介して娘細胞により遺伝されるものである。この安定性は、真核生物細胞の、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団で構成される細胞株またはクローンを確立する能力によって示される。
【００５４】
原核生物は、グラム陰性生物体およびグラム陽性生物体の両方（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類）と哺乳動物起源（ヒト、霊長類およびげっ歯類）との両方）から確立された組織培養細胞株を包含する。
【００５５】
原核生物宿主ベクター系は、多くの異なる種に関する、多岐にわたるベクターを含む。本明細書中で使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターは、他の原核生物において使用される等価なベクターを含むように一般的に使用される。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体である。ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ８ペプチドを発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）のようなハイブリッドプロモーターを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６）を参照のこと。
【００５６】
酵母は、高等真核生物組織培養細胞は、本発明のＧＤＦ８ペプチド、ならびに／または抗ＧＤＦ８抗体および／もしくはこれらの抗体のフラグメントの組み換え産物のための、好ましい宿主である。任意の高等真核組織培養細胞が使用され得るが（昆虫ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系を含む）、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクション、および増殖は、慣習的な手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、新生仔ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、トリ細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。
【００５７】
このような細胞株のための発現ベクターとしては通常、例えば、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライシング部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、そして転写終止部位が挙げられる。これらのベクターはまた、通常、選択的遺伝子または複製遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターを保有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ［Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６（１９８５）］、ｐＭＣ１ｎｅｏポリ−Ａ［Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７）］、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ ３７３もしくはｐＡＣ ６１０）が挙げられる。
【００５８】
代表的に使用される原核生物発現制御配列としては、プロモーター（β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターに［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６（１９７７）］、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）］、λＰＬプロモーター系［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８（１９８１）］およびｔａｃプロモーター［Ｄｅ Ｂｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２９２：１２８（１９８３）］由来するものを含む）が挙げられる。このような制御配列を含む多数の発現ベクターは、当該分野で公知であり、市販されている。
【００５９】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分がそれらの通常の機能を行うように構成されたエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現に影響し得る。制御エレメントは、それらが制御配列の発現に関するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在性の、翻訳されないが転写される配列がプロモーターとコード配列との間に存在し得、そしてプロモーターはなお、コード配列に対して「作動可能に連結されている」とみなされる。
【００６０】
本発明はまた、本発明のＧＤＦ８ペプチドに特異的に結合されたポリクローナル抗体およびモノクローナル（ｍＡｂ）抗体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリンおよび／またはそのフラグメントをいう。天然に存在する免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドから構成される。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。本発明の抗体（単数または複数）はまた、抗体フラグメント（すなわち、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２）、操作された単鎖結合タンパク質（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）、これらは、本明細書中によってその全体が参考として援用される）、ならびに二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，Ｅｕｒ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を包含する。［全体的には、Ｈｏｏｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，第２版（１９８４）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）、これら全ての内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【００６１】
例えば、本発明のＧＤＦ８ペプチドによって免疫された動物から、標準的な方法を用いて生成された血清は、直接的に使用され得るか、またはＩｇＧ分画が、標準的な方法（例えば、プラスマフェレーシス（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）、もしくはＩｇＧ特異的吸着体（例えば、固定されたプロテインＡおよびプロテインＧ）を用いた吸着クロマトグラフィー）を用いて血清から分離され得る。あるいは、モノクローナル抗体が調製され得る（および必要に応じて、そのようなｍＡｂに由来するフラグメントまたは組み換え結合タンパク質）。そのようなＭＡｂまたはそのフラグメントは、必要に応じて、当該分野で公知の方法によってヒト化され得る。
【００６２】
本発明のＧＤＦ８ペプチドに選択的に結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマは、周知の技術によって産生される。通常、このプロセスは、不死化細胞株と、所望の抗体を産生するＢリンパ球との融合を包含する。あるいは、不死の抗体産生細胞株を生成するための非融合技術が使用され得る（例えば、ウイルス誘導性形質転換［Ｃａｓａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：４７６（１９８６）］）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞（特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞）である。最も頻繁には、ラットまたはマウスミエローマ細胞株が、便宜上および利用可能性の点で、利用される。
【００６３】
抗原を注射された哺乳動物から抗体産生性リンパ球を得るための技術は、周知である。一般的に、ヒト起源の細胞が利用される場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物供給源からは脾臓またはリンパ節の細胞が使用される。宿主動物は、精製抗原の反復投薬を用いて注射され（ヒト細胞は、インビトロで感作され）、そしてその動物は、それの細胞が不死化細胞株との融合のために収集される前に、所望の抗体産生性細胞を作らされる。融合のための技術は、当該分野で周知であり、一般的に、細胞を融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）と混合する工程を包含する。
【００６４】
ハイブリドーマは、標準的手順（例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択）によって選択される。所望の抗体を分泌するものは、標準的イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、ＲＩＡ（放射免疫アッセイ）など）を用いて選択される。抗体は、標準的タンパク質生成技術を用いて培地から回収される［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ
Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］．
多くの参考文献が利用可能であり、上記技術の適用における指針を提供する ［Ｋｏｈｌｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）； Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）］。モノクローナル抗体はまた、周知のファージライブラリ系を用いて生成され得る。例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４（１９８９）を参照のこと。
【００６５】
したがって、ポリクローナルかモノクローナルかのいずれかで生成された抗体は、例えば、周知の方法によって固体支持体に結合された固定形態で使用されて、イムノアフィニティークロマトグラフィーによってＧＤＦ８ペプチドを精製し得る。
【００６６】
ＧＤＦ８ペプチドに対する抗体もまた、イムノアッセイの基準として使用され（標識されないかまたは標準的方法で標識され）、ＧＤＦ８を検出または定量化し得る。使用される特定の標識は、イムノアッセイの型に依存する。使用され得る標識の例としては、が挙げられるが、放射性標識（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃ）；蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルおよびアンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ））；化学ルミネッサー（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）（例えば、ルシフェリア（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）および２，３−ジヒドロフタラジンジオン）；ならびに酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース−６−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ）これらに限定されない。
【００６７】
抗体は、公知の方法によって、このような標識でタグ化され得る。例えば、カップリング剤（例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジンなど）が、蛍光、化学発光、または酵素標識で抗体をタグ化するために使用され得る。関連する一般的な方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬに記載される。このようなイムノアッセイは、例えば、レセプターの精製の間に得られた分画で実行され得る。
【００６８】
本発明の抗体はまた、発現クローニング系において、ＧＤＦ８関連ペプチドを発現する特定のｃＤＮＡクローンを同定するために使用され得る。レセプターのリガンド結合部位に対して特異的な中和抗体は、ＧＤＦ８機能をブロックまたはダウンレギュレートするアンタゴニスト（インヒビター）として使用され得る。そのような中和抗体は、以下の実施例によって例示されるような慣習的な実験を通じて、容易に同定され得る。
【００６９】
ＧＤＦ８活性の拮抗作用は、完全な抗体分子、または周知の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖフラグメント）を用いて達成され得る。このようなフラグメントの定義は、本明細書において上述されるように、またはＫｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）；Ｐａｒｈａｍ，第１４章、Ｗｅｉｒ編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）において見出され得る。抗体フラグメントの使用および生成もまた記載されている、例えば：Ｆａｂフラグメント［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］、Ｆｖフラグメント［Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら，米国特許第４，３５５，０２３号］、および抗体半分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号）。公知の抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列に基づく組み換えＦｖフラグメントを作製する方法が、さらに記載されている（例えば、Ｍｏｏｒｅら（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５（１９９１）］。あるいは、これらは、標準的な方法によって化学的に合成され得る。
【００７０】
本発明はまた、抗イディオタイプ抗体（ポリクローナルとモノクローナルの両方）を包含する。これらは、上述の抗体を抗原として使用して生成される。これらの抗体は、リガンドの構造を模倣し得るので、有用である。
【００７１】
（ペプチド合成）
本発明のＧＤＦ８ペプチド（例えば、本明細書において以下に例示されるＤＪ５ペプチド）は、比較的短く（例えば、好ましくは５０アミノ酸残基以下）、ペプチド合成の公知の方法によって調製され得る。合成ペプチドまたはポリペプチド（周知の固相技術、液相技術もしくはペプチド縮合技術，またはそれらの任意の組み合わせを用いて調製される）は、天然もしくは非天然のアミノ酸を含み得る。ペプチド合成のために使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）］の元々の固相手順の、標準的脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコールを用いた標準的Ｂｏｃ（Ｎα−アミノ保護化Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、またはＣａｒｐｉｎｏおよびＨａｎ［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７：３４０３−３４０９（１９７２）］によって最初に記載された、塩基不安定Ｎα−アミノ保護化９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であり得る。ＦｍｏｃもＢｏｃ Ｎα−保護化アミノ酸も、Ｆｌｕｋａ，Ｂａｃｈｅｍ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ＢａｃｈｅｍまたはＰｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ、または当業者が精通する他の化学企業から得ることができる。さらに、本発明の方法は、当業者が精通する他のＮα−保護基とともに使用され得る。固相ペプチド合成は、当業者が精通する技術によって達成され得、そして、例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８４）；ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０）において、またはＡＢＳ［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４ ＵＳＡ］によって販売されるような自動合成機を用いて提供され得る。したがって、本発明のＧＤＦ８ペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との組み合わせ、および種々の「娘」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸など）を含み、特定の特性を伝え得る。合成アミノ酸としては、リジンに対するオルニチン、フェニルアラニンに対するフルオロフェニルアラニン、そしてロイシンもしくはイソロイシンに対するノルロイシンが挙げられる。さらに、特定のカップリング工程において特定のアミノ酸を割り当てることによって、α−ヘリックス、β−ターン、β−シート、γ−ターン、および環状ペプチドが生成され得る。
【００７２】
（抗ＧＤＦ８抗血清）
本発明の方法は、ポリクローナル抗ＧＤＦ８抗血清に対するＧＤＦ８ペプチドをスクリーニングするプロセスを含んだ。このプロセスは、特定の抗ＧＤＦ８抗体が高度に特異的な様式で結合するエピトープを同定した。抗ＧＤＦ８抗血清は、前駆体ＧＤＦ８で動物を免疫することによって得られた。前駆体ＧＤＦ８遺伝子は、発現および免疫原性について最適化された形態を提供するように改変された。例えば、ＧＤＦ８プロホルモンの天然のＤＮＡ配列（配列番号２）は、哺乳動物中での発現およびウイルス発現系に関して最適化された。さらに、ウイルス宿主遮断機構のネガティブな効果を回避するように変更がなされた。代表的に、ウイルス宿主遮断機構は、転写制御、ＲＮＡ安定性（スプライシング）などに関する。これらの変更は、核酸をより宿主様でなくし、そしてよりウイルス様にした。
【００７３】
さらに、ＤＮＡ配列は、好ましくは、哺乳動物核酸配列からできるだけ相違するように設計された。例えば、前駆体ＧＤＦ８のアミノ酸配列は、酵母好適コドン（ｙｅａｓｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ）を用いて逆翻訳された。得られた配列を、ヒトＧＤＦ８核酸配列に対して相同性を保持していたコドンに関して調査した。可能であれば、これらのコドンは、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換されていた。
【００７４】
得られた最適な遺伝子（配列番号３）は、任意の適切な宿主系（公知の昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルス、および酵母発現系が挙げられる）において発現され得る。例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）によって記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料および方法は、ｉｎｔｅｒ ａｌｉａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．からキット形態で市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。同様に、細菌細胞発現系および哺乳動物細胞発現系は当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）によって記載されている。酵母発現系もまた当該分野で公知であり、例えば、ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｂａｒｒら（編），１９８９），Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎによって記載されている。多くの他のこのような発現系は、当該分野で公知であり、キットの形態で市販されている。本明細書において例示されるように、改変前駆体ＧＤＦ８遺伝子（配列番号３）は、以下の実施例１において詳述されるように、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において発現された。
【００７５】
前駆体ＧＤＦ８タンパク質、および成熟ＧＤＦ８タンパク質のペプチドは、任意のタンパク質もしくはペプチドの適合性ワクチン組成物に組み込まれ得る。このようなワクチン組成物は、当該分野で周知であり、そして例えば、本明細書において以下に詳述されるように、生理学的に適合性の緩衝液および生理食塩水など、ならびにアジュバントを含む。前駆体ＧＤＦ８タンパク質を含むワクチン組成物は、抗ＧＤＦ８抗体に対する特異的中和エピトープをスクリーニングおよび同定するための抗血清を誘発するために利用される。
【００７６】
本明細書において例示されるように、配列番号３を含むベクターによって発現される精製前駆体ＧＤＦ８タンパク質は、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化された１ｇの前駆体ＧＤＦ８タンパク質を含有するワクチン組成物中において、ヤギに注射される。このワクチン組成物は、好ましくは、ヤギの皮下に皮下（ＳＣ）注射される。この後の追加免疫が好ましい。これらは、同じもしくは低下したタンパク質の量（ｄｏｓａｇｅ）を用いて適切なさらなる間隔で（例えば、最初の注射後２〜５週間の範囲の間隔で）投与され得る。
【００７７】
最初の注射後の約２週間から始めて、好ましくは、より長期間（例えば、３〜１５週間以上）の後で開始して、免疫された動物から、必要に応じて、血清が回収される。次いで、回収された血清は、好ましくは、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、プロテインＧ−アガロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーなど）によって精製および／もしくは分画される。本明細書において例示されるように、血清のＩｇＧ分画は、プロテインＧ−アガロースカラム上でさらに分画化される。
【００７８】
抗ＧＤＦ８抗血清ＩｇＧ分画は、本明細書において以下の実施例３で詳述されるように、成熟ＧＤＦ８のある範囲のペプチドに対してスクリーニングするために利用可能である。
【００７９】
（ＧＤＦ８結合エピトープ）
適切な抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、抗体がタンパク質に選択的に結合するために十分な時間、ＧＤＦ８タンパク質と接触させた。その後、ＧＤＦ８バイオアッセイは、その抗体がＧＤＦ８タンパク質活性の実質的に全てを中和したことを確証した。任意のＧＤＦ８バイオアッセイが、この目的のために使用され得るが、本明細書において以下の実施例３で例示されるように、Ｔｈｉｅｓら，２００１，（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１）によるインビトロ転写活性アッセイが好ましい。
【００８０】
一般的に、本発明の、抗原または結合エピトープとして有用なＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８（配列番号１）のおよそ残基３１２〜およそ残基３６１を含む。特に、本発明のペプチドは、ＧＤＦ８（配列番号１）のおよそ残基３２０〜およそ残基３５０を含む。このペプチドは、好ましくは、ＧＤＦ８（配列番号１）のおよそ残基３２７〜およそ残基３４６を含む。
【００８１】
当業者は、本発明のＧＤＦ８ペプチドが、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むように、任意の位置で容易に改変され得ることを理解する。好ましくは、ペプチドは、本明細書において以下に例示されるように、ラットモノクローナル抗体７８８に特異的に結合する。このような保存的置換としては、例えば、残基３２８、残基３２９および残基３３５、およびそれらの組み合わせにおける改変が挙げられる（ここで、アミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＡｓｎもしくはＶａｌであり、；アミノ酸残基３２９は、Ｌｙｓもしくは Ｌｅｕであり；そしてアミノ酸残基３３５は、ＳｅｒもしくはＰｒｏもしくはＴｈｒである）。前駆体ＧＤＦ８の残基３２８、残基３２９および残基３３５は、図２に示されるように、ＧＤＦ８タンパク質配列内で、種にわたって変動するが、それにもかかわらず、成熟ＧＤＦ８は機能を残している。
【００８２】
図１は、その前駆体タンパク質の状態における、（成熟タンパク質を形成する）ＧＤＦ８活性領域の地図を示す。ＧＤＦ８活性領域の地図上に重ねられているのは、７つの重複するペプチドの位置である。これらの重複するペプチドは、ＧＤＦ８の抗体結合エピトープ（単数または複数）を同定するための標的を提供するために設計された。ＤＪ５として標識されたペプチドは、例示された抗血清に対する唯一の有意なＧＤＦ８の結合エピトープとして例示された、ヤギ抗ＧＤＦ８抗血清のＩｇＧ分画を用いたスクリーニングによって同定された。このペプチドは、前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）の残基３２７〜残基３４６に対応する配列（配列番号８）を有する。
【００８３】
（ＧＤＦ８ペプチドワクチン組成物）
上記のＧＤＦ８ペプチドは、好ましくは、ワクチン組成物へと処方され得る。これらのワクチン組成物は、高度に特異的な抗ＧＤＦ８免疫応答を誘発する目的で動物を免疫するために利用され得る。免疫化の結果は、免疫された動物におけるＧＤＦ８機能のダウンレギュレーションである。このようなワクチン組成物は、当該分野で周知であり、例えば、生理学的に適合性のある緩衝液、保存剤、および生理食塩水など、ならびにアジュバントを含む。
【００８４】
「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増大させ、それによって、所与のワクチンにおいて必要な抗原の量、および／または目的の抗原に対する適切な免疫応答を生じるために必要な注入の頻度を低減させる因子である。動物のワクチン接種のために適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（ピーナッツ油、マンニドモノオレエート（ｍａｎｎｉｄｅ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）およびアルミニウムモノステアレートを含有する；フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント；鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ
ｐｏｌｙｏｌ）；ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポール）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン；ならびに油乳濁液。タンパク質またはペプチドはまた、リポソ−ムまたは他のマイクロキャリア中への組み込みの後に投与され得る。アジュバントおよびイムノアッセイの種々の局面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版（１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によるシリーズ（本明細書において参考として援用される）に開示されている。
【００８５】
ワクチン組成物は、免疫応答を誘発するのに十分な量の所望される免疫原（例えば、本発明のＧＤＦ８ペプチド）を含む。投与される量は、動物の質量に対して、約０．０００１ｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇの範囲であり得る。任意の適切な獣医学的動物が、ポリクローナル抗血清を得るために容易に利用され得る。好ましくは、動物は、哺乳動物であり、これには、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヤギおよびヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、霊長類（例えば、サル、大型類人猿およびヒト）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
ワクチン組成物は、任意の標準的経路（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、卵内（特に家禽に対して）、および／または経口が挙げられる）によって容易に投与される。魚類の種については、ワクチン組成物または免疫原性組成物を投与する方法は、上述、ならびに抗原性濃度のペプチドを含む水に魚を浸す工程、魚を水から短時間離している間に抗原性濃度のペプチドを魚に噴霧する工程、などを包含する。当業者は、ワクチン組成物が、各型のレシピエント動物および各型の投与経路に対して適切に処方されることが好ましいことを理解する。
【００８７】
適切な動物被験体としては、野生のもの、家畜（例えば、肉、乳、バター、卵、毛皮、皮革、羽毛、および／もしくは羊毛のために育てられたもの）、荷役用の動物、研究用動物、コンパニオン動物、ならびに動物園用／動物園内、野生生息環境用／野生生息環境内、および／またはサーカス用／サーカス内で育てられた動物が挙げられ得る。特定の実施形態において、動物は、大型類人猿（例えば、ゴリラ）またはヒトである。
【００８８】
１つの好ましい実施形態において、動物は、「食物生産用」動物であり、免疫の結果、この動物の重量、特に筋肉量は、免疫されない動物に対して増加する。本発明の目的に関して、用語「食物生産用」動物は、ヒトおよび／もしくは他の動物によって消費されるため、または消耗品（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ）（例えば、卵または乳）を生産するために繁殖させられるあらゆる動物を含むと理解されねばならない。このような動物の非限定的な列挙としては、以下が挙げられる：トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ）、ウシ（例えば、肉牛（ｂｅｅｆ／ｖｅａｌ ｃａｔｔｌｅ）、乳牛、繁殖用の種ウシ、バッファロー）、ブタ（例えば、雄ブタ（ｈｏｇ）もしくはブタ（ｐｉｇ））、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヤギもしくはヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ））、ならびに水生動物（甲殻類およびマスもしくはサケのような魚を含む）、そしてヒト消費のために生育もしくは収穫される他の種。
【００８９】
本発明の目的に関して、用語「魚」は、限定されることなく、魚の真骨下綱（Ｔｅｌｅｏｓｔｉ）群（すなわち、硬骨魚（ｔｅｌｅｏｓｔ））を包含することが理解されねばならない。サケ目（サケ科を含む）およびスズキ目（クロマス科を含む）は、真骨下綱群に含まれる。
【００９０】
考えられる魚レシピエントの例としては、サケ科、ハタ科、タイ科、カワスズメ科、クロマス科、イサキ（ｔｈｒｅｅ−Ｌｉｎｅ Ｇｒｕｎｔ）（Ｐａｒａｐｒｉｓｔｉｐｏｍａ ｔｒｉｌｉｎｅａｔｕｍ）、およびブルーアイ・プレコストマス（Ｂｌｕｅ−Ｅｙｅｄ Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ）（Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ種）が挙げられる。
【００９１】
【化３】
【００９２】
【化４】
【００９３】
さらなる好ましい実施形態において、動物は、コンパニオン動物またはヒトであり、ワクチンは、ＧＤＦ８の長期ダウンレギュレーションを提供するように、そのようなＧＤＦ８ダウンレギュレーションに応答する任意の獣医学的目的または医療目的のために、投与される。本発明の目的に関して、用語「コンパニオン」動物が、あらゆる動物−ウマ（ｈｏｒｓｅ（ｅｑｕｉｎｅ））、ネコ（ｃａｔ（ｆｅｌｉｎｅ））、イヌ（ｄｏｇ（ｃａｎｉｎｅ））、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットを含む）、ウサギ種、およびトリ（例えば、ハト、オウムなど）−を含むことが理解されねばならない。
【００９４】
このようなワクチン接種または抗体を受容する他の鳥類は、販売されている鳥類飼養または販売されていない鳥類飼養のいずれかに関連し得る。これらとしては、例えば、ガンカモ類（例えば、ハクチョウ）、ハト科（Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ）（例えば、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ）（例えばドバト））、キジ科（例えば、ヤマウズラおよびライチョウ）、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ，Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ（例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム（例えば、ペットもしくは収集家の市場のために生育されたもの））、ならびに平胸類の科の任意のメンバーが挙げられる。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、任意の上記の動物（好ましくは、非ヒト）が、 本発明のペプチドに特異的に結合する抗ＧＤＦ８抗体を得るために免疫され、そして誘発された抗体は、アッセイ、および／または獣医学もしくはヒト医療において、例えば、ＧＤＦ８のダウンレギュレーションに応答する任意の獣医学的もしくは医学的目的のためにＧＤＦ８のダウンレギュレーションを提供する目的で使用するために、収集される。
【００９６】
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的な実施例を参照することによって、よりよく理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施形態をより十分に説明するために提示され、決して、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
（材料および方法）
（Ａ．前駆体ＧＤＦ８（ＧＤＦ８プロホルモン）の発現および精製）
前駆体ＧＤＦ８またはプロホルモンの天然ＤＮＡ配列（配列番号２）を、哺乳動物発現系およびウイルス発現系における発現のために最適化した。ウイルス宿主遮断機構のネガティブな効果を回避するため、ＤＮＡ配列を、哺乳動物核酸とはできる限り相違するように設計した。これを達成するため、ＧＤＦ８プロホルモンのアミノ酸配列を、酵母好適コドンを使用して逆翻訳した。得られた配列を、ヒトＧＤＦ８核酸配列に対する相同性を保持しているコドンに関して調査した。可能であれば、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換した。得られた核酸分子（配列番号３）を、適切な発現ベクター中に組み込むために、業者に合成させた。
【００９８】
Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、最適化されたＧＤＦ８プロホルモンを発現させた。簡単にいうと。Ｃ末端ＦＬＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）エピトープ融合体を含むＧＤＦ８プロホルモン構築物を、改変ＧＤＦ８プロホルモンをコードする遺伝子をプラスミドｐＣＭＶｔａｇ４Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）に挿入することによって構築した。ＦＬＡＧ融合タグは、抗ＦＬＡＧ（登録商標）ゲルカラム上でのＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質の分離を容易にする。次いで、改変ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子を含むＰＣＲ ＤＮＡフラグメントをプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質を発現するＦｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ細胞株の生成を、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＣＨＯ細胞株の、ＧＤＦ８−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子を含むＦｌｐ−ＩｎＴＭ発現ベクターとＦｌｐリコンビナーゼ発現プラスミドＰＯＧ４４との同時トランスフェクションによって達成した。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的ＤＮＡ組み換えによって、組み込まれたＦＲＴ部位におけるＦｌｐ−Ｉｎ発現カセットのゲノムへの挿入を媒介する。ハイグロマイシンＢ選択を用いて、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープを含むＧＤＦ８プロホルモンを発現および分泌する安定細胞株を得た。
【００９９】
ＦＬＡＧ（登録商標）タグを含むＧＤＦ８プロホルモンを発現する安定ＣＨＯ細胞株を、標準的技術を用いて、無血清培地中での懸濁培養に適応化した。分泌ＧＤＦ８プロホルモンを含む条件培地を、ＷＡＶＥバイオリアクターシステム（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ＬＬＣ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を使用して作製した。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ化ＧＤＦ８プロホルモンの精製を、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって達成した。
【０１００】
（Ｂ．ＤＪ５特異的抗体の精製）
ＤＪ５（配列番号８；以下の表２を参照のこと）特異的抗体分画を、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。アフィニティーカラムを、１０ｍｇのＤＪ５合成ペプチドを０．８ｇの臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）に結合させることによって調製した。このカラムを、ＰＢＳで洗浄し、平衡化した。およそ１１ｍｌのヤギＩｇＧ分画（１０ｍｇ／ｍｌ）をこのアフィニティーカラムに適用し、そして２５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。１．０ｍｌの分画を収集し、２８０ｎｍでの吸光についてモニタリングした。結合した材料を、およそ１０ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ １．８５）で溶出した。１．０ｍｌの分画を収集し、０．２５ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．７５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．４）で中和した。未結合分画１〜１０および結合分画２５〜３５のおよそ２５μｌのアリコートを、ＤＪ５ペプチドに対するＥＬＩＳＡ反応性についてアッセイした。未結合分画が、ＤＪ５反応性に関してネガティブであることを見出した。結合分画は、ＤＪ５ペプチドに対する反応性の強いピークを示した。未結合分画１〜１１および結合分画２６〜３４をプールした。プールしたサンプルを濃縮し、それらの緩衝液を、以下に示されるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。サンプル濃縮物を、ＯＤ２８０法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．２．７．３，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって判定した。以後の使用のために、未結合サンプルを１０ｍｇ／ｍｌに調整し、結合サンプルを１ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１０１】
（実施例２）
（ヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナルＩｇＧ血清）
以下の方法によって免疫したヤギから、ヤギ抗前駆体ＧＤＦ８ ＩｇＧを得た。
【０１０２】
（Ａ．ヤギの免疫化）
ザーネン（Ｓａａｎｅｎ）（乳）ヤギ（およそ２歳の雄）を、精製した組み換えＧＤＦ８プロホルモン（上記の実施例１に記載するように得たもの）で、以下のように免疫した。０．５ｍｇのタンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化し、そしてヤギの皮膚の下に皮下（ＳＣ）注射した。続いて、３週、６週、および１０週において追加免疫をＳＣに投与し、これはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に乳化した０．３ｍｇのタンパク質を含んだ。シリンジと針とによって頚静脈から血液を採取し、そして真空瓶および真空管に採った。この血液を抗凝固剤を含む瓶に集め、２５００ＲＰＭで２０分間遠心分離して、赤血球を除去した。血漿を再石灰化して、血清を生成した。最初の免疫の１５週後に集めた血清サンプルを、さらなる分析に使用した。
【０１０３】
（Ｂ．ヤギポリクローナルＩｇＧの収集および精製）
１５週後、ヤギから血清を回収し、この血清から、以下のようにＩｇＧ分画を精製した。ヤギ血清のＩｇＧ分画を、プロテインＧアガロースカラム上で、製造者（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のプロトコールに従って精製した。溶出分画をプールし、濃縮し、そして緩衝液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心分離フィルター（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を利用してリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。サンプル濃縮物を、ＯＤ２８０法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，同上）で判定し１０ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１０４】
（実施例３）
（ヤギ抗血清の特徴付け）
上記の実施例２によって提供されたヤギ抗血清を、ＰＧＡと称する。ＰＧＡ ＩｇＧ分画がＧＤＦ８プロホルモン分子上の種々のエピトープに指向する抗体を含むことが、予測される。ＰＧＡ抗血清を、以下のように、インビトロ転写活性アッセイによって特徴付けた。ＧＤＦ８生体中和を定量的に測定するために使用されるインビトロ転写活性アッセイは、本質的に、Ｔｈｉｅｓら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８，２５１（２００１））のアッセイである。９６ウェル組織培養処理されたルミノメーターＶｉｅｗＰｌａｔｅＴＭアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に、１．０×１０５細胞／ウェルのＡ２０４横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿されたチャンバー内でインキュベートした。完全Ａ２０４培養培地は、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、１０％ウシ胎仔血清、２％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンから構成される。８０％を超えるコンフルエンスに達した場合、ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の製造者によって推奨されるプロトコールを用いて、プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼとＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺとの混合物で細胞を一過性にトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿されたチャンバー内で１６時間インキュベートした。プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼは、４コピーのヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ−１）に由来するＣＡＧＡボックスを含む（これは、異種プロモーターレポーター構築物にＧＤＦ８反応性を与える）。
【０１０５】
プラスミドＨＣＭＶ ＩＥ−ｌａｃＺは、構成的ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この遺伝子は、トランスフェクション効果を標準化するためのコントロールとして、添加される。次いで、細胞を１００ｎｇ／ウェルのＧＤＦ８タンパク質（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理し、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿されたチャンバー内で１６時間さらにインキュベートした。処理細胞において、Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用して、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを定量化した。
【０１０６】
各サンプルを２つ組（２ウェル）で実行した。各ウェルのシグナルを、ルシフェラーゼのシグナル÷β−ガラクトシダーゼシグナル×１００として計算した。サンプルシグナルを２つのウェルの平均として計算した。
【０１０７】
抗体サンプルの生体中和活性を試験するため、細胞の処理の前に、種々の濃度の精製ＩｇＧ分画をＧＤＦ８タンパク質とともに（およそ１６時間、４℃で）インキュベートした。パーセント阻害を、１００−（１００×サンプルシグナル）／（ＧＤＦ８単独でのシグナル−ＧＤＦ８添加なしのシグナル）として計算した。このインビトロ転写活性アッセイの結果を、以下の表１にまとめる。
【０１０８】
（表１）
（ヤギ血清ＰＧＡに関するＧＤＦ８中和力価）
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
中和アッセイは、回収されたヤギ血清のＩｇＧ分画が、この活性アッセイにおいて使用されたＧＤＦ８の少なくとも９５％を中和し得る抗体を含むことを確証した。
【０１１１】
（実施例４）
（ヤギポリクローナル抗体は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的中和エピトープを規定する）
中和性免疫応答の特異性を決定するために、ＰＧＡ ＩｇＧ分画を、活性ＧＤＦ８タンパク質の全コード領域にわたる７つの重複ペプチドのセット（ＤＪ１〜７、表２および図１を参照のこと）を用いて、その反応性についてアッセイした。各個別のペプチドに対するヤギＰＧＡ ＩｇＧの反応性を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＧＤＦ８ペプチドＥＬＩＳＡを、本質的に、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｅｔｅｃｔｏｒＴＭＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＨＲＰ ＡＢＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において記載されるように行った。このアッセイにおいて、以下の改変を用いた。合成ペプチドＤＪ１〜７（以下の表２を参照のこと）は、本発明者らの指示の下、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｗａｙ，ＣＡ）によって注文合成された。プレートを５００ｎｇ／ウェルの合成ペプチドおよび２５０ｎｇ／ウェルの精製ＧＤＦ８プロホルモンによってコーティングした。一次抗体は、種々のサンプル由来のＩｇＧ分画であった。二次抗体を、１：２０００希釈で使用した。ヤギ一次抗体サンプルに対しては、二次抗体は、ヤギＩｇＧに対するウサギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ラット一次抗体サンプルに対しては、二次抗体は、ラットＩｇＧに対するヤギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ＯＤ４０５ｎｍをＥＬＩＳＡプレートリーダーで１５分間読み取った。ＥＬＩＳＡ反応性をＯＤ４０５／分×１０００として計算した。
【０１１２】
（表２）
（ＧＤＦ８活性領域ペプチド）
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
＊ヒトＧＤＦ８プロホルモン（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５２５０）に対して
ＥＬＩＳＡの結果を以下の表３にまとめる。
【０１１５】
（表３）
（ＧＤＦ８活性領域ペプチドに対するＰＧＡ ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）のＥＬＩＳＡ反応性）
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
＊ペプチド、＊＊プロホルモン
ＰＧＡ ＩｇＧ分画は、精製ＧＤＦ８プロホルモンおよびＤＪ５ペプチドの両方に特異的に反応した。ＧＤＦ８活性領域ペプチドの中でも、ＩｇＧ分画は、特異的かつ排他的にＤＪ５ペプチドに反応する。これは、この結成の中和能がＤＪ５ペプチドによって規定されるエピトープに対して指向することを強く示す。この仮説を確認するため、ＰＧＡ ＩｇＧのＤＪ５特異的分画を精製した。材料および方法において記載されるようなアフィニティークロマトグラフィーによって、これを達成した。ＰＧＡ抗体を、ＤＪ５ペプチド結合分画とＤＪ５ペプチド未結合分画とに分離した。両分画を、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性についてアッセイした。
【０１１８】
表４の結果は、大部分のＧＤＦ８中和能が、ＤＪ５ペプチドに特異的に結合する抗体とともに存在することを示す。このことは、ＤＪ５ペプチドがＧＤＦ８タンパク質の中和エピトープを規定することを、明確に実証する。
【０１１９】
（表４）
（ＤＪ５特異的抗体のＧＤＦ８中和活性）
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
＊＊正常ヤギＩｇＧは、非免疫ヤギ血清（業者から購入）から精製されたネガティブコントロールであった。
【０１２２】
興味あることに、予備実験において、２羽のウサギをキーホールリンペットヘモシニアンに結合したヒトＤＪ５抗原を用いて注射した場合、中和ＧＤＦ８抗体は得られなかった。図２において見ることができるように、ウサギについてのＤＪ５に対応するアミノ酸配列とヒトＧＤＦ８に対応するアミノ酸配列とは、同一であるが、一方、ヤギＤＪ５のアミノ酸配列は異なっている。したがって、ヤギについて上記で提供されたデータに関して、予備的なウサギのデータは、宿主動物ＧＤＦ８の対応する領域／部分のアミノ酸配列異なるアミノ酸配列を含むＤＪ５抗原を使用することが有利であり得ることを示唆する。したがって、この場合、組み換えヒトＧＤＦ８プロホルモンの、ヤギにおいて生体中和抗体を誘導する能力は、少なくとも部分的に、使用された抗原が、ＧＤＦ８のＤＪ５領域／部分における一アミノ酸置換によって、宿主配列のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含んだという事実に起因し得る［図２のアミノ酸残基３３３を参照のこと］。より詳細には、図２に示すように、ヒト配列におけるＡｒｇ３３３は、ヤギ配列においてＬｙｓ３３３残基によって置換されている。この孤立した保存的アミノ酸置換は、ヤギの免疫学的監視系に対してタンパク質の「外来性」を与えるのに十分に有意な変更を構成し得る。
【０１２３】
（実施例５）
（ＧＤＦ８中和性Ｒａｔ ｍＡＢ ７８８は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的中和エピトープを規定する）
ラットモノクローナル抗体 ７８８がマウスＧＤＦ８生物活性を中和することが報告されている（Ｒ ＆ Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ７８８，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。この結果を確認するために、本発明者らは、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性について、モノクローナル抗体をアッセイした。抗体を上記の実施例２に記載されるように特徴付けた。このアッセイの結果を、以下の表５にまとめる。
【０１２４】
（表５）
（モノクローナル抗体 ７８８に対するＧＤＦ８中和力価）
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
表５は、この抗体が、ＧＤＦ８タンパク質の活性を中和し得ることを確証する。この中和免疫応答の特異性を決定するため、ラットモノクローナル抗体を、活性ＧＤＦ８タンパク質のコード領域全体にわたる７つの重複ペプチドのセット（ＤＪ１〜７、表２および図１を参照のこと）との、その反応性に関してアッセイした。各個別のペプチドに対するモノクローナル抗体の反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した（材料および方法を参照のこと）。
【０１２７】
（表６）
（Ｒａｔ ＭＡＢ ７８８（１０ｍｇ／ｍｌ）のＧＤＦ８活性領域ペプチドに対するＥＬＩＳＡ反応性）
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
＊ペプチド、＊＊タンパク質
ラットモノクローナル抗体は、精製ＧＤＦ８プロホルモンとＤＪ５ペプチドとの両方に特異的に反応した。代表的に、モノクローナル抗体は、単一のエピトープに対する単特異性（ｍｏｎｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する。ＧＤＦ８活性領域ペプチドの中で、このモノクローナル抗体は、ＤＪ５ペプチドと特異的かつ排他的に反応する。この結果は、ＤＪ５ペプチドがＧＤＦ８タンパク質の中和エピトープを規定するというさらなる独立した証拠を提供する。
【０１３０】
本発明の多くの改変および変更は、当業者に理解されるように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書において記載される特定の実施形態は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲の条件、合わせてそのような特許請求の範囲が権利付与する等価物の全範囲の条件によってのみ限定されるべきである。本明細書において、刊行された、および／もしくはインターネットで公開された核酸配列およびポリペプチド／タンパク質配列のＧｅｎｅｂａｎｋ登録番号を含む、多くの参考文献が引用される。これらの開示は、その全体が、参考として援用される。
【０１３１】
（配列表）
【０１３２】
【数１】
【０１３３】
【数２】
【０１３４】
【数３】
【０１３５】
【数４】
【０１３６】
【数５】
【０１３７】
【数６】
【０１３８】
【数７】
【０１３９】
【数８】
【０１４０】
【数９】
【０１４１】
【数１０】
【０１４２】
【数１１】
【０１４３】
【数１２】
【０１４４】
【数１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−８３２９０（Ｐ２０１１−８３２９０Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１０２７９（Ｐ２０１１−１０２７９）
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【分割の表示】特願２００６−５４７３０９（Ｐ２００６−５４７３０９）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２１日（２００４．１２．２１）
【出願人】（５０３４４２０９７）シェーリング−プラウ・リミテッド (47)
【住所又は居所原語表記】Ｗｅｙｓｔｒａｓｓｅ２０，Ｌｕｃｅｒｎｅ６，ＣＨ−６０００，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０２７９（Ｐ２０１１−１０２７９）
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【分割の表示】特願２００６−５４７３０９（Ｐ２００６−５４７３０９）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２１日（２００４．１２．２１）
【出願人】（５０３４４２０９７）シェーリング−プラウ・リミテッド (47)
【住所又は居所原語表記】Ｗｅｙｓｔｒａｓｓｅ２０，Ｌｕｃｅｒｎｅ６，ＣＨ−６０００，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
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