中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤
【課題】高い中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有する成分を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供することを課題とする。
【解決手段】キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤。
【解決手段】キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼは、基質特異性が低く、種々のペプチド類の分解を通して様々な生体への作用を起こすことが知られている。近年、中性エンドペプチターゼ活性を阻害する物質が、老化によって生じる皮膚のしわ、たるみ等の症状を改善する作用を有することが報告されている（特許文献１参照）。
皮膚が老化することにより生じる外観変化の代表例としては、しわ、たるみの発生、はりの減少などがある。かかるしわ、たるみの発生、はりの減少などの皮膚の形態的変化に対して、例えばコラーゲンを配合した化粧料が用いられているが、充分なしわ発生等の防止効果は得られていない。
【０００３】
また、中性エンドペプチターゼ活性を阻害することで体毛の成長を抑制出来ることが報告されている（特許文献２参照）。
最近では、手足の体毛は美的外観上できるだけ少ない方が好まれる傾向にあり、特に女性においては、手足等の体毛を除去することが盛んに行われている。また、男性においても、従来から髭処理が一般的に行われている。体毛を除去する除毛・脱毛方法としては、シェーバー等の器具を用いるもの、電気やレーザー等を用いるもの又は皮膚に脱毛剤を塗布して化学的に処理するものが一般的である。しかしながら、これらの方法は皮膚表面を傷つける、皮膚に炎症が起こる、薬剤によって皮膚がかぶれる等の弊害がある。また、処理に痛みを伴うという問題もある。発毛抑制効果を謳った発毛抑制剤や化粧料等も提案されているが、効果等の面で十分とは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１０９４８号公報
【特許文献２】特開２０００−３５１７１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することを課題とする。また、本発明は、中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有するしわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題に鑑み、皮膚老化によるしわ・たるみ等の改善或いは体毛の成長抑制に有用なものとして、中性エンドペプチターゼ活性を阻害しうる物質について鋭意検討を行った。その結果、キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物が中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する作用を有することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００７】
本発明は、キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
また、本発明は、キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有するしわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、優れた活性阻害効果を奏する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することができる。また、本発明によれば、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有するしわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供することができる。
キクバフウロは生薬の原料として長年使用されてきている植物である。したがって、本発明により、安全性の高い中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について、その好ましい実施態様の基づき詳細に説明する。
キクバフウロは、フウロソウ科エロディウム属に属する植物で、学名はエロディウム ステファニアヌム ウイルド（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）である。キクバフウロは別名、老鸛草（ロウカンソウ）又はセリバフウロとも呼ばれる。キクバフウロの抽出物には、止瀉作用、抗菌作用、抗ウイルス作用があることが知られている。しかしながら、キクバフウロの抽出物が中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することは全く知られていない。
【００１０】
本発明におけるキクバフウロの抽出物は、キクバフウロの任意の部位、例えば、全草、果実、花などから抽出することができるが、全草から抽出するのが好ましい。
本発明において、キクバフウロの抽出物の調製に、上記植物の各部位をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもでき、また、市販品を用いることもできる。上記植物の部位又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１１】
本発明において、キクバフウロの抽出物を得る方法は特に限定されず、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
抽出に用いる溶媒としては、植物成分の抽出に通常用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；及びピリジン類等が挙げられ、これら２種以上混合溶媒であってもよい。本発明において、抽出に用いる溶媒は水性アルコールが好ましく、９０質量％以上の水性アルコールがより好ましく、９５質量％以上の水性アルコールがさらに好ましく、９５質量％以上のエタノールが特に好ましい。
また、抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば抽出物が抽出される材料を３〜１００℃で数時間〜数週間浸漬又は加熱還流するのが好ましく、室温付近の温度で１日〜３週間浸漬するのが特に好ましい。
また、本発明におけるキクバフウロの抽出物は、市販の抽出物であってもよい。
【００１２】
本発明の中性エンドぺプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤の有効成分は、上記のように抽出されたキクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、上記のように抽出されたキクバフウロの抽出物をさらに適当な分離手段、例えばゲル濾過カラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーや精密蒸留等により分画したものであってもよい。また、本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤の有効成分は、前記抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状にしたものであってもよい。すなわち、本発明におけるキクバフウロの抽出物には、前記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液の他、その希釈液、濃縮液や乾燥末等も含まれる。
【００１３】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、キクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤に含まれるキクバフウロの抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００１４】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができる。
【００１５】
前述のように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する物質は、老化によって生じる皮膚のしわ、たるみ等の症状を改善する作用を有することが知られている。後述の実施例で実証しているように、キクバフウロの抽出物を有効成分として含有する本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する。そのため、前記キクバフウロの抽出物を有効成分として含有する本発明のしわ抑制剤は、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害し、老化によって生じる皮膚のしわ形成を抑制することができる。
【００１６】
本発明のしわ抑制剤は、キクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明のしわ抑制剤に含まれるキクバフウロの抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００１７】
本発明のしわ抑制剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができるが、皮膚外用剤の剤形をとることが好ましい。本発明のしわ抑制剤を皮膚外用剤として皮膚に直接塗布することで、老化によって生じる皮膚のしわ、たるみ等の症状を予防したり改善したりすることができる。前記皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品及び化粧料でありうるが、通常は医薬部外品や化粧料として用いられる。
【００１８】
本発明のしわ抑制剤を皮膚外用剤とする場合には、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態を取りうる。
【００１９】
本発明のしわ抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合の使用量は、有効成分であるキクバフウロの抽出物の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり１〜２０ｍｇ、液状製剤の場合、１〜２０ｍｇ使用するのが好ましい。
【００２０】
また、前述のように、中性エンドペプチターゼ活性を阻害することで、体毛の成長を抑制できることが知られている。皮膚組織内における中性エンドペプチダーゼの活性の上昇は、毛包形成およびその成長にとって重要な影響を及ぼしており、皮膚組織内の中性エンドペプチダーゼ活性を抑制することで、体毛の成長を抑制できると考えられる。後述の実施例で実証しているように、キクバフウロの抽出物を有効成分として含有する本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する。そのため、前記抽出物を有効成分として含有する本発明の発毛抑制剤は、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害し体毛の成長を抑えることができる。
【００２１】
本発明の発毛抑制剤は、キクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の発毛抑制剤に含まれるキクバフウロの抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００２２】
本発明の発毛抑制剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができるが、皮膚外用剤の剤形をとることが好ましい。本発明の発毛抑制剤を皮膚外用剤として皮膚に直接塗布することで、発毛を抑制したい部位のみに発毛抑制剤を効果的に作用させることができる。前記皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品及び化粧料でありうるが、通常は医薬部外品や化粧料として用いられ、除毛、脱毛、又は髭剃り関連化粧料とすることが好ましい。
【００２３】
本発明の発毛抑制剤を皮膚外用剤とする場合には、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態を取りうる。例えば、ペースト状、クリーム状、エアゾール状等の除毛剤、ワックス状、ジェル上、シート状等の脱毛剤、除毛又は脱毛の後処理に用いるローション、クリーム等の後処理剤、プレシェーブローション等の髭剃り前処理料、シェービングクリーム等の髭剃り料、アフターシェーブローション等の髭剃り後処理料などが挙げられる。
【００２４】
本発明の発毛抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合の使用量は、有効成分であるキクバフウロの抽出物の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり１〜２０ｍｇ、液状製剤の場合、１〜２０ｍｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
製造例１ キクバフウロ抽出液の調製
キクバフウロ（全草）（老鸛草、新和物産より入手）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で１８日間浸漬した。これを桐山漏斗でろ過し、キクバフウロ抽出液を得た。このキクバフウロ抽出液を濃縮したところ、その固形分は１．１８ｇであり、抽出液の固形分濃度は０．３７％（ｗ／ｖ）であった。
【００２７】
実施例 中性エンドペプチダーゼ活性抑制試験
Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継代培養し、以下の試験に供した。試験方法は、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６（３４）， ２３０４１−２３０４７（１９９１）に記載の方法を参照した。
【００２８】
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）に浮遊させ、超音波粉砕し、これをヒト線維芽細由来酵素液とした。
ヒト線維芽細由来酵素液１００μＬに、蒸発残分０．５％（ｗ／ｖ）に調整した前記キクバフウロ抽出液（評価サンプル）を２．０μＬ又は０．６μＬ、中性エンドペプチダーゼ基質（１０ｍＭグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−β−ナフチルアミン）を２．０μＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ヒト線維芽細胞由来酵素液に含まれる中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）が基質をＡｌａ−Ｐｈｅ間で切断してＮＥＰ分解産物を生じる。その後、ホスホラミドン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）を最終濃度１μＭとなるように添加して反応を停止させた。
続いて、反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を最終濃度が０．５０ｍＵ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これにより、ＮＥＰ分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断され、４−メトキシ−２−ナフチルアミンを生じる。生じた４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いて、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍにて測定した。
コントロールとして、上記反応系において、評価サンプルの代わりに９５％エタノール水溶液を２μＬ又は０．６μＬ加え、同様の操作を行った。
得られた測定値をもとに、以下の式から評価サンプルの中性エンドペプチダーゼ活性阻害率を求めた。
中性エンドペプチダーゼ活性阻害率（％）＝１００−｛（評価サンプル添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）／（コントロール添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）｝×１００
結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１から明らかなように、キクバフウロの抽出物が優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有することがわかった。
前述のように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害すると、皮膚のしわ、たるみ等の症状が抑制されることや、体毛の成長が抑制されることが知られている。したがって、表１の結果から、キクバフウロの抽出物が優れたしわ抑制作用や発毛抑制作用を有することがわかる。
【００３１】
（処方例）
本発明のしわ抑制剤及び発毛抑制剤の形態の例として、下記に示す組成のローション、クリーム、パック剤を常法により各々調製した。
【００３２】
１．皮膚老化改善用ローションの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ ポリオキシエチレン硬化ひまし油 ０．８
エタノール ３０．０
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
ドデシル硫酸ナトリウム ０．１２
ドデシルメチルアミンオキシド ０．１８
イソプロピルアルコール １５．０
ベンジルアルコール １５．０
グリセリン ２．０
精製水 バランス
【００３３】
２．皮膚老化改善用クリームの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ 流動パラフィン １０．０
スクワラン ７．０
ホホバ油 ３．０
固形パラフィン ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル ２．０
ソルビタンセスキオレエート １．０
水酸化カリウム ０．１
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
グリセリン ３．０
エチルパラベン ０．１
精製水 バランス
【００３４】
３．皮膚老化改善用パック剤の調製
下記の組成のパック剤を常法により調製する。
（組成） （配合：質量％）
キクバフウロ抽出物 ３．０
ポリビニルアルコール ２０．０
グリセリン ５．０
エタノール １６．０
香料 微量
色素 微量
精製水 バランス
【００３５】
４．発毛抑制ローションの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ ポリオキシエチレン硬化ひまし油 ０．８
エタノール ３０．０
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
ドデシル硫酸ナトリウム ０．１２
ドデシルメチルアミンオキシド ０．１８
イソプロピルアルコール １５．０
ベンジルアルコール １５．０
グリセリン ２．０
精製水 バランス
【００３６】
５．発毛抑制クリームの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ 流動パラフィン １０．０
スクワラン ７．０
ホホバ油 ３．０
固形パラフィン ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル ２．０
ソルビタンセスキオレエート １．０
水酸化カリウム ０．１
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
グリセリン ３．０
エチルパラベン ０．１
精製水 バランス
【００３７】
６．発毛抑制パック剤の調製
下記の組成のパック剤を常法により調製する。
（組成） （配合：質量％）
キクバフウロ抽出物 ３．０
ポリビニルアルコール ２０．０
グリセリン ５．０
エタノール １６．０
香料 微量
色素 微量
精製水 バランス
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼは、基質特異性が低く、種々のペプチド類の分解を通して様々な生体への作用を起こすことが知られている。近年、中性エンドペプチターゼ活性を阻害する物質が、老化によって生じる皮膚のしわ、たるみ等の症状を改善する作用を有することが報告されている（特許文献１参照）。
皮膚が老化することにより生じる外観変化の代表例としては、しわ、たるみの発生、はりの減少などがある。かかるしわ、たるみの発生、はりの減少などの皮膚の形態的変化に対して、例えばコラーゲンを配合した化粧料が用いられているが、充分なしわ発生等の防止効果は得られていない。
【０００３】
また、中性エンドペプチターゼ活性を阻害することで体毛の成長を抑制出来ることが報告されている（特許文献２参照）。
最近では、手足の体毛は美的外観上できるだけ少ない方が好まれる傾向にあり、特に女性においては、手足等の体毛を除去することが盛んに行われている。また、男性においても、従来から髭処理が一般的に行われている。体毛を除去する除毛・脱毛方法としては、シェーバー等の器具を用いるもの、電気やレーザー等を用いるもの又は皮膚に脱毛剤を塗布して化学的に処理するものが一般的である。しかしながら、これらの方法は皮膚表面を傷つける、皮膚に炎症が起こる、薬剤によって皮膚がかぶれる等の弊害がある。また、処理に痛みを伴うという問題もある。発毛抑制効果を謳った発毛抑制剤や化粧料等も提案されているが、効果等の面で十分とは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１０９４８号公報
【特許文献２】特開２０００−３５１７１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することを課題とする。また、本発明は、中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有するしわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題に鑑み、皮膚老化によるしわ・たるみ等の改善或いは体毛の成長抑制に有用なものとして、中性エンドペプチターゼ活性を阻害しうる物質について鋭意検討を行った。その結果、キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物が中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する作用を有することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００７】
本発明は、キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
また、本発明は、キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有するしわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、優れた活性阻害効果を奏する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することができる。また、本発明によれば、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有するしわ抑制剤及び発毛抑制剤を提供することができる。
キクバフウロは生薬の原料として長年使用されてきている植物である。したがって、本発明により、安全性の高い中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について、その好ましい実施態様の基づき詳細に説明する。
キクバフウロは、フウロソウ科エロディウム属に属する植物で、学名はエロディウム ステファニアヌム ウイルド（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）である。キクバフウロは別名、老鸛草（ロウカンソウ）又はセリバフウロとも呼ばれる。キクバフウロの抽出物には、止瀉作用、抗菌作用、抗ウイルス作用があることが知られている。しかしながら、キクバフウロの抽出物が中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することは全く知られていない。
【００１０】
本発明におけるキクバフウロの抽出物は、キクバフウロの任意の部位、例えば、全草、果実、花などから抽出することができるが、全草から抽出するのが好ましい。
本発明において、キクバフウロの抽出物の調製に、上記植物の各部位をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもでき、また、市販品を用いることもできる。上記植物の部位又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１１】
本発明において、キクバフウロの抽出物を得る方法は特に限定されず、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
抽出に用いる溶媒としては、植物成分の抽出に通常用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；及びピリジン類等が挙げられ、これら２種以上混合溶媒であってもよい。本発明において、抽出に用いる溶媒は水性アルコールが好ましく、９０質量％以上の水性アルコールがより好ましく、９５質量％以上の水性アルコールがさらに好ましく、９５質量％以上のエタノールが特に好ましい。
また、抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば抽出物が抽出される材料を３〜１００℃で数時間〜数週間浸漬又は加熱還流するのが好ましく、室温付近の温度で１日〜３週間浸漬するのが特に好ましい。
また、本発明におけるキクバフウロの抽出物は、市販の抽出物であってもよい。
【００１２】
本発明の中性エンドぺプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤の有効成分は、上記のように抽出されたキクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、上記のように抽出されたキクバフウロの抽出物をさらに適当な分離手段、例えばゲル濾過カラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーや精密蒸留等により分画したものであってもよい。また、本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤、しわ抑制剤及び発毛抑制剤の有効成分は、前記抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状にしたものであってもよい。すなわち、本発明におけるキクバフウロの抽出物には、前記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液の他、その希釈液、濃縮液や乾燥末等も含まれる。
【００１３】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、キクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤に含まれるキクバフウロの抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００１４】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができる。
【００１５】
前述のように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する物質は、老化によって生じる皮膚のしわ、たるみ等の症状を改善する作用を有することが知られている。後述の実施例で実証しているように、キクバフウロの抽出物を有効成分として含有する本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する。そのため、前記キクバフウロの抽出物を有効成分として含有する本発明のしわ抑制剤は、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害し、老化によって生じる皮膚のしわ形成を抑制することができる。
【００１６】
本発明のしわ抑制剤は、キクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明のしわ抑制剤に含まれるキクバフウロの抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００１７】
本発明のしわ抑制剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができるが、皮膚外用剤の剤形をとることが好ましい。本発明のしわ抑制剤を皮膚外用剤として皮膚に直接塗布することで、老化によって生じる皮膚のしわ、たるみ等の症状を予防したり改善したりすることができる。前記皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品及び化粧料でありうるが、通常は医薬部外品や化粧料として用いられる。
【００１８】
本発明のしわ抑制剤を皮膚外用剤とする場合には、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態を取りうる。
【００１９】
本発明のしわ抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合の使用量は、有効成分であるキクバフウロの抽出物の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり１〜２０ｍｇ、液状製剤の場合、１〜２０ｍｇ使用するのが好ましい。
【００２０】
また、前述のように、中性エンドペプチターゼ活性を阻害することで、体毛の成長を抑制できることが知られている。皮膚組織内における中性エンドペプチダーゼの活性の上昇は、毛包形成およびその成長にとって重要な影響を及ぼしており、皮膚組織内の中性エンドペプチダーゼ活性を抑制することで、体毛の成長を抑制できると考えられる。後述の実施例で実証しているように、キクバフウロの抽出物を有効成分として含有する本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する。そのため、前記抽出物を有効成分として含有する本発明の発毛抑制剤は、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害し体毛の成長を抑えることができる。
【００２１】
本発明の発毛抑制剤は、キクバフウロの抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の発毛抑制剤に含まれるキクバフウロの抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００２２】
本発明の発毛抑制剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができるが、皮膚外用剤の剤形をとることが好ましい。本発明の発毛抑制剤を皮膚外用剤として皮膚に直接塗布することで、発毛を抑制したい部位のみに発毛抑制剤を効果的に作用させることができる。前記皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品及び化粧料でありうるが、通常は医薬部外品や化粧料として用いられ、除毛、脱毛、又は髭剃り関連化粧料とすることが好ましい。
【００２３】
本発明の発毛抑制剤を皮膚外用剤とする場合には、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態を取りうる。例えば、ペースト状、クリーム状、エアゾール状等の除毛剤、ワックス状、ジェル上、シート状等の脱毛剤、除毛又は脱毛の後処理に用いるローション、クリーム等の後処理剤、プレシェーブローション等の髭剃り前処理料、シェービングクリーム等の髭剃り料、アフターシェーブローション等の髭剃り後処理料などが挙げられる。
【００２４】
本発明の発毛抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合の使用量は、有効成分であるキクバフウロの抽出物の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり１〜２０ｍｇ、液状製剤の場合、１〜２０ｍｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
製造例１ キクバフウロ抽出液の調製
キクバフウロ（全草）（老鸛草、新和物産より入手）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で１８日間浸漬した。これを桐山漏斗でろ過し、キクバフウロ抽出液を得た。このキクバフウロ抽出液を濃縮したところ、その固形分は１．１８ｇであり、抽出液の固形分濃度は０．３７％（ｗ／ｖ）であった。
【００２７】
実施例 中性エンドペプチダーゼ活性抑制試験
Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継代培養し、以下の試験に供した。試験方法は、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６（３４）， ２３０４１−２３０４７（１９９１）に記載の方法を参照した。
【００２８】
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）に浮遊させ、超音波粉砕し、これをヒト線維芽細由来酵素液とした。
ヒト線維芽細由来酵素液１００μＬに、蒸発残分０．５％（ｗ／ｖ）に調整した前記キクバフウロ抽出液（評価サンプル）を２．０μＬ又は０．６μＬ、中性エンドペプチダーゼ基質（１０ｍＭグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−β−ナフチルアミン）を２．０μＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ヒト線維芽細胞由来酵素液に含まれる中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）が基質をＡｌａ−Ｐｈｅ間で切断してＮＥＰ分解産物を生じる。その後、ホスホラミドン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）を最終濃度１μＭとなるように添加して反応を停止させた。
続いて、反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を最終濃度が０．５０ｍＵ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これにより、ＮＥＰ分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断され、４−メトキシ−２−ナフチルアミンを生じる。生じた４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いて、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍにて測定した。
コントロールとして、上記反応系において、評価サンプルの代わりに９５％エタノール水溶液を２μＬ又は０．６μＬ加え、同様の操作を行った。
得られた測定値をもとに、以下の式から評価サンプルの中性エンドペプチダーゼ活性阻害率を求めた。
中性エンドペプチダーゼ活性阻害率（％）＝１００−｛（評価サンプル添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）／（コントロール添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）｝×１００
結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１から明らかなように、キクバフウロの抽出物が優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有することがわかった。
前述のように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害すると、皮膚のしわ、たるみ等の症状が抑制されることや、体毛の成長が抑制されることが知られている。したがって、表１の結果から、キクバフウロの抽出物が優れたしわ抑制作用や発毛抑制作用を有することがわかる。
【００３１】
（処方例）
本発明のしわ抑制剤及び発毛抑制剤の形態の例として、下記に示す組成のローション、クリーム、パック剤を常法により各々調製した。
【００３２】
１．皮膚老化改善用ローションの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ ポリオキシエチレン硬化ひまし油 ０．８
エタノール ３０．０
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
ドデシル硫酸ナトリウム ０．１２
ドデシルメチルアミンオキシド ０．１８
イソプロピルアルコール １５．０
ベンジルアルコール １５．０
グリセリン ２．０
精製水 バランス
【００３３】
２．皮膚老化改善用クリームの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ 流動パラフィン １０．０
スクワラン ７．０
ホホバ油 ３．０
固形パラフィン ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル ２．０
ソルビタンセスキオレエート １．０
水酸化カリウム ０．１
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
グリセリン ３．０
エチルパラベン ０．１
精製水 バランス
【００３４】
３．皮膚老化改善用パック剤の調製
下記の組成のパック剤を常法により調製する。
（組成） （配合：質量％）
キクバフウロ抽出物 ３．０
ポリビニルアルコール ２０．０
グリセリン ５．０
エタノール １６．０
香料 微量
色素 微量
精製水 バランス
【００３５】
４．発毛抑制ローションの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ ポリオキシエチレン硬化ひまし油 ０．８
エタノール ３０．０
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
ドデシル硫酸ナトリウム ０．１２
ドデシルメチルアミンオキシド ０．１８
イソプロピルアルコール １５．０
ベンジルアルコール １５．０
グリセリン ２．０
精製水 バランス
【００３６】
５．発毛抑制クリームの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得る。
（組成） （配合：質量％）
Ａ 流動パラフィン １０．０
スクワラン ７．０
ホホバ油 ３．０
固形パラフィン ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル ２．０
ソルビタンセスキオレエート １．０
水酸化カリウム ０．１
Ｂ キクバフウロ抽出物 １．０
グリセリン ３．０
エチルパラベン ０．１
精製水 バランス
【００３７】
６．発毛抑制パック剤の調製
下記の組成のパック剤を常法により調製する。
（組成） （配合：質量％）
キクバフウロ抽出物 ３．０
ポリビニルアルコール ２０．０
グリセリン ５．０
エタノール １６．０
香料 微量
色素 微量
精製水 バランス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項２】
キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有するしわ抑制剤。
【請求項３】
キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する発毛抑制剤。
【請求項１】
キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項２】
キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有するしわ抑制剤。
【請求項３】
キクバフウロ（Ｅｒｏｄｉｕｍ ｓｔｅｐｈａｎｉａｎｕｍ Ｗｉｌｌｄ）の抽出物を有効成分として含有する発毛抑制剤。
【公開番号】特開２０１１−１９０２１１（Ｐ２０１１−１９０２１１Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５７５５１（Ｐ２０１０−５７５５１）
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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