中性エンドペプチダーゼ阻害剤
【課題】モルヒネ系物質の代謝物質、すなわち鎮痛剤として、あるいは降圧剤として有用である、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤の提供。
【解決手段】植物生薬であり、タデ科のダイオウの抽出物及び／又はマメ科エンジュ属に属する植物で、別名黄藤（キフジ）とも呼ばれるエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【解決手段】植物生薬であり、タデ科のダイオウの抽出物及び／又はマメ科エンジュ属に属する植物で、別名黄藤（キフジ）とも呼ばれるエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼは、エンケファリンなどのオピオイドペプチド、サブスタンスＰ、ブラジキニンなどの神経ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドなどの血管作動性ペプチドを分解する酵素として知られている。そのため、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する作用を持った物質は、モルヒネ系物質の代謝物質、すなわち鎮痛剤（非特許文献１参照）として、あるいは降圧剤（非特許文献２参照）として有用であることが報告されている。
このように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害することで得られる効果は多岐にわたるが、従来知られている中性エンドペプチダーゼ阻害剤は安全性に問題があるものが多く、また、阻害効果が十分とはいえない等の問題点を有していた。そのため、新たな中性エンドペプチダーゼ阻害剤の探索が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｌｆｒｏｙ Ｂ，Ｓｗｅｒｔｓ ＪＰ，Ｇｕｙｏｎ Ａ，Ｒｏｑｕｅｓ ＢＰ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＣ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ，２７６，５２３−５２６．
【非特許文献２】Ｋｕｂｏｔａ Ｅ，Ｄｅａｎ ＲＧ，Ｂａｌｄｉｎｇ ＬＣ，Ｂｕｒｒｅｌｌ ＬＭ．（２００２） Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８，１２９−１３９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ダイオウの抽出物及びエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物が共に、優れた中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明は、ダイオウの抽出物及び／又はエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、優れた活性阻害効果を奏する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することができる。
ダイオウは生薬として、エンジュは生薬の原料として長年使用されてきている。したがって、本発明により、安全性の高い中性エンドペプチダーゼ阻害剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明について、その好ましい実施態様の基づき詳細に説明する。
【０００９】
ダイオウは植物生薬であり、タデ科（Ｐｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）のレウム パルマツム エル．（Ｒｈｅｕｍ ｐａｌｍａｔｕｍ Ｌ．）、レウム タングチクム マキシム（Ｒｈｅｕｍ ｔａｎｇｕｔｉｃｕｍ Ｍａｘｉｍ）、レウム オフィシナレ バイロン（Ｒｈｅｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｂａｉｌｌｏｎ）もしくはレウム コレアヌム ナカイ（Ｒｈｅｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ Ｎａｋａｉ）又はこれらの種間雑種の根茎を意味する。ダイオウが中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することは全く知られていない。
【００１０】
エンジュは、マメ科エンジュ属に属する植物で、学名はソフォラ ジャポニカ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）である。エンジュは別名、黄藤（キフジ）とも呼ばれ、その蕾を乾燥させたものは槐花とも呼ばれる。エンジュの抽出物が中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することは全く知られていない。
【００１１】
本発明におけるダイオウの抽出物は、レウム パルマツム エル．（Ｒｈｅｕｍ ｐａｌｍａｔｕｍ Ｌ．）、レウム タングチクム マキシム（Ｒｈｅｕｍ ｔａｎｇｕｔｉｃｕｍ Ｍａｘｉｍ.）、レウム オフィシナレ バイロン（Ｒｈｅｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｂａｉｌｌｏｎ）もしくはレウム コレアヌム ナカイ（Ｒｈｅｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ Ｎａｋａｉ）又はこれらの種間雑種の根茎から抽出することができる。
また、本発明におけるエンジュの抽出物は、エンジュの任意の部位、例えば、花、樹皮、葉などから抽出することができるが、花から抽出することが好ましい。
【００１２】
本発明において、ダイオウの抽出物の調製に、ダイオウをそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもできる。また、ダイオウの抽出物の調製に市販品を用いることもできる。ダイオウそのもの又はダイオウの水蒸気蒸留物もしくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１３】
本発明において、エンジュの抽出物の調製に、エンジュの前記各部位をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもできる。また、エンジュの抽出物の調製に市販品を用いることもできる。エンジュの各部位又はその水蒸気蒸留物もしくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
本発明における抽出物は、ダイオウから得られる抽出物及びエンジュから得られる抽出物の混合物であってもよい。
【００１５】
本発明において、ダイオウの抽出物及びエンジュの抽出物を得る方法は特に限定されず、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
抽出に用いる溶媒としては、植物成分の抽出に通常用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；及びピリジン類等が挙げられ、これら２種以上混合溶媒であってもよい。本発明において、抽出に用いる溶媒は水性アルコールが好ましく、９０質量％以上の水性アルコールがより好ましく、９５質量％以上の水性アルコールがさらに好ましく、９５質量％以上のエタノールが特に好ましい。
また、抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば抽出物が抽出される材料を３〜１００℃で数時間〜数週間浸漬又は加熱還流するのが好ましく、室温付近の温度で１日〜４週間浸漬するのが特に好ましい。
また、本発明における抽出物は、市販の抽出物であってもよい。
【００１６】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の有効成分は、上記のように抽出された抽出物そのものであってもよいし、上記のように抽出された抽出物をさらに適当な分離手段、例えばゲル濾過カラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーや精密蒸留等により分画したものであってもよい。また、本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の有効成分は、前記抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状にしたものであってもよい。すなわち、本発明における抽出物には、前記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液の他、その希釈液、濃縮液や乾燥末等も含まれる。
【００１７】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、本発明における抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤に含まれる抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００１８】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は効果的に中性エンドペプチダーゼ活性を阻害することができ、その用途としては、抗圧剤、鎮痛剤等が挙げられる。
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
製造例１ ダイオウ抽出液の調製
ダイオウ（根茎）（大黄、新和物産より入手）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で２１日間浸漬した。これを桐山漏斗でろ過し、ろ液をダイオウ抽出液とした。この抽出液を濃縮したところ、その固形分は１１．８６ｇであり、抽出液の固形分濃度は３．４０％（ｗ／ｖ）であった。
【００２１】
製造例２ エンジュ抽出液の調製
エンジュ（花）（槐花、新和物産より入手）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で２３日間浸漬した。これを桐山漏斗でろ過し、ろ液をエンジュ抽出液とした。この抽出液を濃縮したところ、その固形分は４．８０ｇであり、抽出液の固形分濃度は１．４８％（ｗ／ｖ）であった。
【００２２】
実施例１ 中性エンドペプチダーゼ活性抑制試験
Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継体培養し、以下の試験に供した。試験方法は、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６（３４）， ２３０４１−２３０４７（１９９１）に記載の方法を参照した。
【００２３】
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）に浮遊させ、超音波粉砕し、これをヒト線維芽細由来酵素液とした。
ヒト線維芽細由来酵素液１００μＬに、蒸発残分０．５％（ｗ／ｖ）に調整した前記各抽出液（評価サンプル）を２．０μＬ又は０．６μＬ、中性エンドペプチダーゼ基質（１０ｍＭグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−β−ナフチルアミン）を２．０μＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ヒト線維芽細胞由来酵素液に含まれる中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）が基質をＡｌａ−Ｐｈｅ間で切断してＮＥＰ分解産物を生じる。その後、ホスホラミドン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）を最終濃度１μＭとなるように添加して反応を停止させた。
続いて、反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を最終濃度が０．５０ｍＵ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これにより、ＮＥＰ分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断され、４−メトキシ−２−ナフチルアミンを生じる。生じた４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いて、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍにて測定した。
コントロールとして、上記反応系において、評価サンプルの代わりに９５％エタノール水溶液を２μＬ又は０．６μＬ加え、同様の操作を行った。
得られた測定値をもとに、以下の式から評価サンプルの中性エンドペプチダーゼ活性阻害率を求めた。
中性エンドペプチダーゼ活性阻害率（％）＝１００−｛（評価サンプル添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）／（コントロール添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）｝×１００
結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１から明らかなように、本発明における抽出物が優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有することがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼは、エンケファリンなどのオピオイドペプチド、サブスタンスＰ、ブラジキニンなどの神経ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドなどの血管作動性ペプチドを分解する酵素として知られている。そのため、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する作用を持った物質は、モルヒネ系物質の代謝物質、すなわち鎮痛剤（非特許文献１参照）として、あるいは降圧剤（非特許文献２参照）として有用であることが報告されている。
このように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害することで得られる効果は多岐にわたるが、従来知られている中性エンドペプチダーゼ阻害剤は安全性に問題があるものが多く、また、阻害効果が十分とはいえない等の問題点を有していた。そのため、新たな中性エンドペプチダーゼ阻害剤の探索が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｌｆｒｏｙ Ｂ，Ｓｗｅｒｔｓ ＪＰ，Ｇｕｙｏｎ Ａ，Ｒｏｑｕｅｓ ＢＰ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＣ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ，２７６，５２３−５２６．
【非特許文献２】Ｋｕｂｏｔａ Ｅ，Ｄｅａｎ ＲＧ，Ｂａｌｄｉｎｇ ＬＣ，Ｂｕｒｒｅｌｌ ＬＭ．（２００２） Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８，１２９−１３９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害作用を有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ダイオウの抽出物及びエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物が共に、優れた中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明は、ダイオウの抽出物及び／又はエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、優れた活性阻害効果を奏する中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することができる。
ダイオウは生薬として、エンジュは生薬の原料として長年使用されてきている。したがって、本発明により、安全性の高い中性エンドペプチダーゼ阻害剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明について、その好ましい実施態様の基づき詳細に説明する。
【０００９】
ダイオウは植物生薬であり、タデ科（Ｐｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）のレウム パルマツム エル．（Ｒｈｅｕｍ ｐａｌｍａｔｕｍ Ｌ．）、レウム タングチクム マキシム（Ｒｈｅｕｍ ｔａｎｇｕｔｉｃｕｍ Ｍａｘｉｍ）、レウム オフィシナレ バイロン（Ｒｈｅｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｂａｉｌｌｏｎ）もしくはレウム コレアヌム ナカイ（Ｒｈｅｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ Ｎａｋａｉ）又はこれらの種間雑種の根茎を意味する。ダイオウが中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することは全く知られていない。
【００１０】
エンジュは、マメ科エンジュ属に属する植物で、学名はソフォラ ジャポニカ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）である。エンジュは別名、黄藤（キフジ）とも呼ばれ、その蕾を乾燥させたものは槐花とも呼ばれる。エンジュの抽出物が中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有することは全く知られていない。
【００１１】
本発明におけるダイオウの抽出物は、レウム パルマツム エル．（Ｒｈｅｕｍ ｐａｌｍａｔｕｍ Ｌ．）、レウム タングチクム マキシム（Ｒｈｅｕｍ ｔａｎｇｕｔｉｃｕｍ Ｍａｘｉｍ.）、レウム オフィシナレ バイロン（Ｒｈｅｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｂａｉｌｌｏｎ）もしくはレウム コレアヌム ナカイ（Ｒｈｅｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ Ｎａｋａｉ）又はこれらの種間雑種の根茎から抽出することができる。
また、本発明におけるエンジュの抽出物は、エンジュの任意の部位、例えば、花、樹皮、葉などから抽出することができるが、花から抽出することが好ましい。
【００１２】
本発明において、ダイオウの抽出物の調製に、ダイオウをそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもできる。また、ダイオウの抽出物の調製に市販品を用いることもできる。ダイオウそのもの又はダイオウの水蒸気蒸留物もしくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１３】
本発明において、エンジュの抽出物の調製に、エンジュの前記各部位をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもできる。また、エンジュの抽出物の調製に市販品を用いることもできる。エンジュの各部位又はその水蒸気蒸留物もしくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
本発明における抽出物は、ダイオウから得られる抽出物及びエンジュから得られる抽出物の混合物であってもよい。
【００１５】
本発明において、ダイオウの抽出物及びエンジュの抽出物を得る方法は特に限定されず、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
抽出に用いる溶媒としては、植物成分の抽出に通常用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；及びピリジン類等が挙げられ、これら２種以上混合溶媒であってもよい。本発明において、抽出に用いる溶媒は水性アルコールが好ましく、９０質量％以上の水性アルコールがより好ましく、９５質量％以上の水性アルコールがさらに好ましく、９５質量％以上のエタノールが特に好ましい。
また、抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば抽出物が抽出される材料を３〜１００℃で数時間〜数週間浸漬又は加熱還流するのが好ましく、室温付近の温度で１日〜４週間浸漬するのが特に好ましい。
また、本発明における抽出物は、市販の抽出物であってもよい。
【００１６】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の有効成分は、上記のように抽出された抽出物そのものであってもよいし、上記のように抽出された抽出物をさらに適当な分離手段、例えばゲル濾過カラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーや精密蒸留等により分画したものであってもよい。また、本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の有効成分は、前記抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状にしたものであってもよい。すなわち、本発明における抽出物には、前記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液の他、その希釈液、濃縮液や乾燥末等も含まれる。
【００１７】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、本発明における抽出物そのものであってもよいし、さらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例として、酸化チタン、炭酸カルシウム、精製水、乳糖、デンプン、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤に含まれる抽出物の量に特に制限はないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれるのが特に好ましい。
【００１８】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は効果的に中性エンドペプチダーゼ活性を阻害することができ、その用途としては、抗圧剤、鎮痛剤等が挙げられる。
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の剤形に特に制限はなく、用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等の剤形をとることができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
製造例１ ダイオウ抽出液の調製
ダイオウ（根茎）（大黄、新和物産より入手）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で２１日間浸漬した。これを桐山漏斗でろ過し、ろ液をダイオウ抽出液とした。この抽出液を濃縮したところ、その固形分は１１．８６ｇであり、抽出液の固形分濃度は３．４０％（ｗ／ｖ）であった。
【００２１】
製造例２ エンジュ抽出液の調製
エンジュ（花）（槐花、新和物産より入手）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で２３日間浸漬した。これを桐山漏斗でろ過し、ろ液をエンジュ抽出液とした。この抽出液を濃縮したところ、その固形分は４．８０ｇであり、抽出液の固形分濃度は１．４８％（ｗ／ｖ）であった。
【００２２】
実施例１ 中性エンドペプチダーゼ活性抑制試験
Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継体培養し、以下の試験に供した。試験方法は、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６（３４）， ２３０４１−２３０４７（１９９１）に記載の方法を参照した。
【００２３】
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）に浮遊させ、超音波粉砕し、これをヒト線維芽細由来酵素液とした。
ヒト線維芽細由来酵素液１００μＬに、蒸発残分０．５％（ｗ／ｖ）に調整した前記各抽出液（評価サンプル）を２．０μＬ又は０．６μＬ、中性エンドペプチダーゼ基質（１０ｍＭグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−β−ナフチルアミン）を２．０μＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ヒト線維芽細胞由来酵素液に含まれる中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）が基質をＡｌａ−Ｐｈｅ間で切断してＮＥＰ分解産物を生じる。その後、ホスホラミドン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）を最終濃度１μＭとなるように添加して反応を停止させた。
続いて、反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を最終濃度が０．５０ｍＵ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これにより、ＮＥＰ分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断され、４−メトキシ−２−ナフチルアミンを生じる。生じた４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いて、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍにて測定した。
コントロールとして、上記反応系において、評価サンプルの代わりに９５％エタノール水溶液を２μＬ又は０．６μＬ加え、同様の操作を行った。
得られた測定値をもとに、以下の式から評価サンプルの中性エンドペプチダーゼ活性阻害率を求めた。
中性エンドペプチダーゼ活性阻害率（％）＝１００−｛（評価サンプル添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）／（コントロール添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミン量）｝×１００
結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１から明らかなように、本発明における抽出物が優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有することがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオウの抽出物及び／又はエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項１】
ダイオウの抽出物及び／又はエンジュ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【公開番号】特開２０１１−１９０２１３（Ｐ２０１１−１９０２１３Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５７５５３（Ｐ２０１０−５７５５３）
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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