乳酸生産菌

【課題】乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を提供する。
【解決手段】異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクスであり、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを組み込む方法。更に、上記方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳酸生産菌に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子組換えにより乳酸生産性を付与したモーレラ属細菌に関する。
【背景技術】
【0002】
モーレラ属(Moorella)細菌は、炭水化物、メタノール等で有機栄養的に、または水素(H)および二酸化炭素(CO)、もしくは一酸化炭素(CO)で無機栄養的に生育することができる、嫌気性好熱性酢酸生産菌である(非特許文献1)。モーレラ属の基準種モーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica)は、ホモアセトゲンであり、化学量論的に、グルコース1モルから酢酸3モルを生産することができるという特徴を有する(非特許文献2)。これは、ピルビン酸をアセチルCoAに変換する際に生じる二酸化炭素を利用して、さらにアセチルCoAを合成する経路(Wood−Ljungdahl経路,下記化学式を参照)が存在するためである。また、他のモーレラ属細菌、酢酸生産性を持つクロストリジウム属細菌、メタン生成古細菌等でもこの経路を持つものがある(非特許文献2)。
【0003】
【化1】

【0004】
近年、糖化の難しいリグノセルロース系バイオマスの利用法として、ガス化が期待されている。リグノセルロース系バイオマスのガス化により得られた合成ガスは、主に二酸化炭素、一酸化炭素および水素を含んでいる。そのため、モーレラ属細菌は、合成ガスからの有用物質生産における宿主として有望であると考えられている。
【0005】
合成ガスからの有用物質生産を工業的に実用化するためには、分子育種による宿主の改良が必要となるが、モーレラ属細菌は、基準種モーレラ・サーモアセティカについて既に全ゲノムDNAの塩基配列が解析されており(非特許文献3)、分子育種による改良が期待できる細菌である。
【0006】
しかしながら、モーレラ属細菌の遺伝学的性質は、他の細菌と比べて特異的で、しかも十分に解明されておらず、形質転換をして有用物質の生産性を改善し、または付与することは困難であった(特許文献1)。
【0007】
そのため、モーレラ属細菌の遺伝子組換えによって乳酸その他の有用物質の生産を成功させた例は、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開2010−17131号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Collins, M. D.、外7名、「The phylogeny of the genus Clostridium: Proposal of five new genera and eleven new species combinations」、International Journal of Systematic Bacteriology、国際微生物学連合(IUMS)、1994年10月、第44巻、第4号、p.812−826
【非特許文献2】Ragsdale, S. W. and Pierce, E.、「Acetogenesis and Wood-Ljungdahl pathway of CO2 fixation」、Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins & Proteomics、エルゼビア、2008年12月、第1784巻、第12号、p.1873−1898
【非特許文献3】Pierce, E.、外10名、「The Complete Genome Sequence of Moorella thermoacetica (f. Clostridium thermoaceticum)」、Environmental Microbiology、ワイリー−ブラックウェル、2008年10月、第10巻、第10号、p.2550−2573
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
そこで、本発明は、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をモーレラ属細菌に導入し、かつ該遺伝子が発現すると、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を得られること、より詳細には、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株(野生株)のウラシル生合成経路のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を破壊することにより得たウラシル要求性株(dpyrF株)に、pyrFを選択マーカーとして、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)39E株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(T−ldh)を、その上流に野生株由来のグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター(G3PDプロモーター)を連結して導入すると、NADHを補酵素とした場合に、野生株およびdpyrF株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性が大幅に上昇し、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌株(C31株(MTA−T−ldh株))を得られることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下に掲げる(1)〜(37)を提供する。
【0012】
(1)異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(2)上記LDH遺伝子が相同組換えによってゲノムに組み込まれた、上記(1)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(3)上記LDH遺伝子が同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)によって発現している、上記(1)または(2)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(4)上記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
(5)上記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
【0013】
(6)乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)がオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流域または下流域に組み込まれ、上記LDH遺伝子が上記G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、上記G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(7)上記LDH遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来する、上記(6)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(8)上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記(6)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(9)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記(6)〜(8)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(10)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記(6)〜(9)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(11)上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記(6)〜(10)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(12)上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記(6)〜(10)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(13)NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE AP−1154で寄託されている、上記(6)〜(12)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【0014】
(14)異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
(15)上記工程が相同組換えにより行われる、上記(14)に記載の方法。
(16)上記LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を組み込む、上記(14)または(15)に記載の方法。
(17)上記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、上記(14)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(18)上記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、上記(14)〜(16)のいずれかに記載の方法。
【0015】
(19)オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、上記G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、上記pyrFおよび上記G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、上記LDH遺伝子がフィルミクテス(Firmicutes)門クロストリジウム(Clostridia)綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクトを構築する工程と、
上記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程と
を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
(20)上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、上記(19)に記載の方法。
(21)上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記(19)に記載の方法。
(22)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記(19)〜(21)のいずれかに記載の方法。
(23)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記(19)〜(21)のいずれかに記載の方法。
(24)上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記(19)〜(23)のいずれかに記載の方法。
(25)上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記(19)〜(23)のいずれかに記載の方法。
(26)モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊する工程
をさらに備える、上記(19)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(27)上記pyrF破壊株がモーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica) ATCC 39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られる、上記(19)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(28)上記pyrF破壊株がNITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE P−1057で寄託されている株である、上記(27)に記載の方法。
(29)上記(19)〜(28)のいずれかに記載の方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【0016】
(30)オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、上記G3PDプロモーターが上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、上記pyrFおよび上記G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、上記LDH遺伝子がフィルミクテス(Firmicutes)門クロストリジウム(Clostridia)綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクト。
(31)上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、上記(30)に記載のDNAコンストラクト。
(32)上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記(30)に記載のDNAコンストラクト。
(33)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記(30)〜(32)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
(34)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記(30)〜(32)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
(35)上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記(30)〜(34)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
(36)上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記(30)〜(34)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【0017】
(37)上記(1)〜(13)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌または上記(14)〜(28)のいずれかに記載の方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌およびその製造方法が提供される。
また、本発明によれば、乳酸生産性を付与した遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養して乳酸を製造する方法が提供される。
【0019】
モーレラ属細菌を乳酸等の有用物質の生産に利用することの利点としては、(1)培養が高温、無酸素の状態で行われるため、コンタミネーションの危険が非常に少ない、(2)芽胞形成菌であるため有用菌株を保存・維持しやすい、(3)好熱性のモーレラ属細菌の培養温度(50〜60℃)に加熱するコストの方が酵母等の培養温度に冷却するコストに比べて安い、(4)培養温度が高温であるため、自然条件に左右されにくく、安定したオペレーションが可能になる、等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図1はpyrF近傍でのプライマーの位置を表す図である。
【図2】図2はPCRによるC31株(MTA−T−ldh株)のpyrFおよびT−ldhの挿入の確認結果を示すアガロースゲル電気泳動像である(レーン1:ATCC39073株(1.6kb)、レーン2:dpyrF株(0.87kb)、レーン3:C31株(MTA−T−ldh株)(2.8kb)、レーンM:分子量マーカー)。
【図3】図3はフルクトースを炭素源として培養した際の、各株のT−ldh遺伝子の転写量を示す。
【図4】図4は野生株およびC31株(MTA−T−ldh株)をフルクトースとリン酸bufferを含む完全合成培地で培養した際の(A)OD600およびpHを[C31株(MTA−T−ldh株) OD600(●)、野生株 OD600(○)、C31株(MTA−T−ldh株) pH(■)、野生株 pH(□)]、(B)フルクトース消費量、乳酸および酢酸の生成量の経時変化を[C31株(MTA−T−ldh株) フルクトース濃度(●)、野生株 フルクトース濃度(○)、C31株(MTA−T−ldh株) 酢酸濃度(▲)、野生株 酢酸濃度(△)、C31株(MTA−T−ldh株) 乳酸濃度(■)、野生株 乳酸濃度(□)]、それぞれ示す
【発明を実施するための形態】
【0021】
I.乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌
本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、「異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌」である。
上記LDH遺伝子をモーレラ属細菌のホストに組み込む方法は、特に限定されないが、相同組換えを用いることが好ましい。
上記ホストに組み込まれた上記LDH遺伝子を発現するプロモーターは、特に限定されないが、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)が好ましい。
上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクター(Thermoanaerobacter)属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)がさらに好ましい。
【0022】
より詳細には、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、「乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)がオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流域または下流域に組み込まれ、該LDH遺伝子が該G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌」である。
以下、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌について詳細に説明する。
【0023】
1.モーレラ属細菌
遺伝子組換えを行うモーレラ属細菌(「ホストのモーレラ属細菌」ともいう。)は、モーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica)、モーレラ・サーモオートトロフィカ(M. thermoautotrophica)、モーレラ・グリセリニ(M. glycerini)もしくはモーレラ・ムルデリ(M. mulderi)に分類される細菌または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されないが、モーレラ・サーモアセティカが好ましく、なかでも、ATCC 39073株またはその変異株がより好ましく、ATCC 39073株のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を破壊して作出したウラシル要求性変異株である、NITE P−1057株がさらに好ましい。
【0024】
ここで、細菌分類学的にモーレラ(Moorella)属に分類される細菌とは、IJSEM(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)誌にモーレラ(Moorella)属として発表された細菌またはバージェイズ・マニュアル(De Vos, Paul、外7名編、"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"、第2版、第3巻、米国、シュプリンガー、2009年)に従って分類した場合にモーレラ属に分類することが適当であると認められる細菌をいう。
【0025】
本発明において、ホストのモーレラ属細菌に遺伝子組換えを行った結果作出されるモーレラ属細菌は、形態、資化性、醗酵性その他の表現形質が種の定義に合致しない場合であっても、ホストのモーレラ属細菌と同種とみなす。
【0026】
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌としては、後記する本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌の製造方法に従って作出された形質転換株であって、NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に寄託された、受託番号NITE AP−1154をもつ細菌株が特に好ましい。
【0027】
2.乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子
モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれる乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来するもの、または配列番号2のDNA塩基配列からなるものが好ましい。
【0028】
配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)は、NAD依存型L−乳酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.27)であり、下記式の反応を触媒する。
【0029】
【化2】

【0030】
なお、本発明において、遺伝コードは標準コードと一部異なり、翻訳開始コドンとして、ATG(AUG)の他、TTG(UUG)、CTG(CUG)、GTG(GUG)、ATT(AUU)、ATC(AUC)、ATA(AUA)も使用され得る。翻訳開始コドンとして使用されるときはメチオニン(Met,M)をコードするが、翻訳開始コドン以外として使用されるときは、標準コードと同じく、TTG(UUG)およびCTG(CUG)はロイシン(Leu,L)を、ATT(AUU)、ATC(AUC)およびATA(AUA)はイソロイシン(Ile,I)を、GTG(GUG)はバリン(Val,V)を、それぞれコードする。
【0031】
また、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌においては、上記LDH遺伝子は、その上流に組み込まれたグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)により発現される。
【0032】
3.グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(リン酸化)(GAPDH,EC 1.1.1.12)は、解糖系/糖新生に関与する酵素であり、D−グリセルアルデヒド−3−リン酸と1,3−ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し(下記反応式)、常時発現している。
【0033】
【化3】

【0034】
モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれるグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)は、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一であるもの、が好ましい。
【0035】
上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列は、配列番号3のDNA塩基配列に含まれるものが好ましい。
【0036】
上記G3PDプロモーターは、その周辺の領域とともにホストのモーレラ属細菌のゲノムに組み込まれてもよく、G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に直接連結されてホストのモーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流域または下流域に組み込まれることが好ましい。
【0037】
上記G3PDプロモーターを含む領域は、上記G3PDプロモーターが上記LDH遺伝子を発現しうるものであれば、G3PDプロモーター部分以外のDNA塩基配列は特に限定されないが、上記G3PDプロモーターを含む領域のDNA塩基配列としては、そのG3PDプロモーターが由来する菌株のG3PDプロモーターおよびその周辺領域のDNA塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号3のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。
【0038】
4.オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)
オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(OMPデカルボキシラーゼ,EC 4.1.1.23)をコードする遺伝子である。
【0039】
OMPデカルボキシラーゼは、ピリミジンの生合成に関与する酵素であり、オロチジンモノリン酸(OMP)を脱炭酸してウリジンモノリン酸(UMP)に変換する反応を触媒する(下記化学式)。この酵素はウリジン三リン酸およびシチジン三リン酸のde novoの生合成に不可欠である。したがって、pyrFが破壊された菌株は、ウラシル要求性変異株となる。
【0040】
【化4】

【0041】
上記オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)は、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のpyrFであってもよい。
【0042】
外来性のpyrFとしては、ホストのモーレラ属細菌種と同一種の細菌に由来するものが好ましく、ホストのモーレラ属菌株と同一株またはその野生株に由来するものがより好ましい。
【0043】
上記pyrFとしては、配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするものが好ましく、そのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。
【0044】
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌のゲノムにおいては、pyrFの上流域または下流域に、G3PDプロモーター領域およびLDH遺伝子が配置されるが、pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置は、G3PDおよびLDHがpyrFの上流域または下流域に挿入された配置であって、pyrFおよびLDHが正常に発現する配置であれば特に限定されない。
【0045】
5.乳酸生産性
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において、乳酸生産性は、有機栄養的に培養した場合に乳酸を生産する能力があることをいう。有機栄養的に培養する場合の炭素源としては、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌が資化できるものであれば特に限定はされないが、例えば、グルコース、フルクトース等のヘキソース類が挙げられる。
【0046】
II.乳酸生産性を持つモーレラ属細菌の製造方法
本発明において、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造する方法は、特に限定されないが、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によることが好ましい。
【0047】
上記工程において、LDH遺伝子を組み込む方法は特に限定されないが、相同組換えにより行うことが好ましい。
【0048】
LDH遺伝子を組み込む際に、LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を組み込むことが好ましい。
【0049】
上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクター(Thermoanaerobacter)属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)がさらに好ましい。
【0050】
また、本発明において、G3PDプロモーターおよびLDH遺伝子を、pyrFの上流域または下流域に組み込んで乳酸生産性を持つモーレラ属細菌を製造する方法は特に限定されないが、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAコンストラクトを構築する工程と、前記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程とを備える方法が好ましい。
【0051】
1.DNAコンストラクト(ターゲティングベクター)
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造するためのDNAコンストラクト(ターゲティングベクター)は、骨格となるプラスミドベクターおよび相同組換え領域を含むものが好ましく、さらに薬剤耐性(感受性)遺伝子を含んでもよい。
【0052】
1−1.相同組換え領域
上記相同組換え領域は、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、上記G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたものが好ましい。
【0053】
1−1−2.LDH遺伝子
前記LDH遺伝子としては、配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来するもの、または配列番号2のDNA塩基配列からなるものが好ましい。
【0054】
1−1−3.G3PDプロモーター
前記G3PDプロモーターとしては、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一であるもの、が好ましい。
【0055】
上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列は、配列番号3のDNA塩基配列に含まれるものが好ましい。
【0056】
上記G3PDプロモーターを含む領域は、上記G3PDプロモーターが上記LDH遺伝子を発現しうるものであれば、G3PDプロモーター部分以外のDNA塩基配列は特に限定されないが、上記G3PDプロモーターを含む領域のDNA塩基配列としては、そのG3PDプロモーターが由来する菌株のG3PDプロモーターおよびその周辺領域のDNA塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号3のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。
【0057】
1−1−4.pyrF
上記pyrFは、モーレラ属細菌のpyrF破壊株に導入したとき正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のpyrFであってもよい。
【0058】
外来性のpyrFとしては、モーレラ属細菌のpyrF破壊株と同一種の細菌に由来するものが好ましく、モーレラ属細菌のpyrF破壊株と同一株またはその野生株に由来するものがより好ましい。
【0059】
上記pyrFとしては、配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.23)をコードするものが好ましく、そのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。
【0060】
上記pyrFの上流域は、そのpyrFが由来するモーレラ属細菌株のゲノムにおけるpyrF翻訳領域の上流域をいい、長さは特に限定されないが、約2kb以下が好ましく、約1kb程度がより好ましい。
【0061】
上記pyrFの下流域は、そのpyrFが由来するモーレラ属細菌株のゲノムにおけるpyrF翻訳領域の下流域をいい、長さは特に限定されないが、約2kb以下が好ましく、約1kb程度がより好ましい。
【0062】
1−1−6.pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置
pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置は、G3PDおよびLDHがpyrFの上流域または下流域に挿入された配置であって、pyrFおよびLDHが正常に発現する配置であれば特に限定されない。
【0063】
1−2.DNAコンストラクト(ターゲティングベクター)の構築方法
DNAコンストラクト(ターゲティングベクター)の構築方法としては、特に限定されず、適当なプラスミドベクターに上記相同組換え領域を組み込む方法が挙げられる。
【0064】
プラスミドベクターに相同組換え領域を組み込む方法としては、従来公知の方法を使用することができ、例えば、相同組換え領域の全部を含むDNAフラグメントを作製し、リニア化したプラスミドベクターにDNAリガーゼ等を用いて連結する方法、pyrF、その上流域および下流域を組み込んだ組換えベクターを作製しておき、pyrFの上流域または下流域を制限酵素等で切断してプラスミドベクターをリニア化し、G3PD領域に対応するDNA断片およびLDH遺伝子に対応するDNA断片をG3PD領域がLDH遺伝子の上流に連結されるように、DNAリガーゼ等を用いて連結する方法等が挙げられる。
【0065】
プラスミドベクターは、相同組換えに利用することができるものであれば特に限定されず、用いることができ、例えば、プラスミドpK18mobが挙げられる。
【0066】
DNAコンストラクトの構築は、例えば、Gatewayシステム(インビトロジェン)、Red/ETリコンビネーションシステム(オープンバイオシステムズ)、In−Fusion PCR(クロンテック)等を用いて行うことができる。
【0067】
2.オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(pyrF)破壊株
pyrF破壊株の作出方法は特に限定されないが、モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊したものが好ましい。
【0068】
前記pyrF破壊株としては、モーレラ属細菌株のpyrFを破壊したものであれば特に限定はされないが、モーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica) ATCC 39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られるものが好ましく、NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE P−1057で寄託されているものがより好ましい。
【0069】
3.形質転換
上記DNAコンストラクト(ターゲティングベクター)を上記pyrF破壊株に形質転換をする方法は特に限定されず、DNAコンストラクトの骨格となるプラスミドベクターに合わせて適宜選択することが好ましい。大腸菌およびモーレラ属細菌の両方で複製するシャトルベクターでない場合には、pyrF破壊株への導入方法としては、エレクトロポレーションが好ましい方法の一つである。
【0070】
上記方法によって形質転換をして製造されたモーレラ属細菌としては、NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE AP−1154で寄託されているものが挙げられる。
【0071】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【0072】
本実施例では、モーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica) ATCC 39073株(「野生株」または「WT」ともいう。)のpyrF破壊、ウラシル要求性変異株(dpyrF株)に、当該ATCC 39073株由来のpyrF、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus) 39E株由来のL−乳酸デヒドロゲナーゼ(T−LDH)遺伝子(T−ldh)、およびT−ldhを発現するための当該ATCC 39073株由来のグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を導入して、ウラシル要求性の除去および乳酸生産性の付与を行い、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌(C31株(MTA−T−ldh株))を作製した。
【0073】
さらに、作製したC31株(MTA−T−ldh株)、dpyrF株および野生株(WT)について、フルクトースを炭素源として培養した場合のldh転写量、LDH酵素活性、乳酸および酢酸の生産量を対比した。
【0074】
1.pyrF破壊株(dpyrF株)の作製
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のpyrFを破壊し、ウラシル要求性変異株を作製した。
【0075】
(1)遺伝子破壊ベクターpK18−dpyrFの構築
以下の手順でモーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFを破壊するためのベクターを構築した。
【0076】
[遺伝子破壊ベクターpK18−dpyrFの構築]
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株を完全合成培地(改変ATCC 1754 PETC Medium、表22Aを参照)に植菌し、55℃で嫌気的に培養した。
培養後、NucleoSpin Tissue(MACHEREY−NAGEL社製)を用いてトータルDNAを抽出した。
【0077】
まず、表1に示したプライマーpyrF−up−F1(配列番号6:5'-tgacgttctagaccctacctctccaagattacc-3')とpyrF−up−R1(配列番号7:5'-tgacgtactagtggcaagcaggccagaag-3')との組合せ、およびpyrF−dn−F1(配列番号8:5'-tgacgtactagtaacttcggcctgctttcatgc-3')とpyrF−dn−R1(配列番号9:5'-tgacctgatatctgtccaagcttatgcaccttcc-3')との組合せを用いて、表2に示す反応液の組成で、表3に示す条件でPCRを行い、pyrFの上流域および下流域のそれぞれ約1000bpを増幅した。表2において、プライマーFとプライマーRとの組合せは、上記組合せである。また、テンプレートDNAは、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のトータルDNAである。なお、KOD−Plus−Neo(PCR酵素)、10×PCR Buffer for KOD−Plus−Neo、2mM dNTPsおよび25mM MgSOは、KOD−Plus−Neo(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0078】
【表1】

【0079】
【表2】

【0080】
【表3】

【0081】
図1に示すとおり、プライマーpyrF−up−F1(配列番号6)およびpyrF−up−R1(配列番号7)は、pyrFの上流の隣接領域を増幅し、pyrF−dn−F1(配列番号8)およびpyrF−dn−R1(配列番号9)は、pyrFの下流の隣接領域を増幅する。
【0082】
得られたPCR産物を、制限酵素SpeIで処理した後に、MagExtracter Kit(東洋紡)を用いて精製を行い、pyrF上流域のPCR産物を5μL、下流域のPCR産物を5μL、Ligation high Ver.2(東洋紡)を10μL混合し、16℃で30分間インキュベートし、ライゲーション産物をテンプレートDNAとして、プライマーpyrF−up−F1(配列番号6)およびpyrF−up−R1(配列番号7)を用いて、表4に示す反応液組成で、表5に示す条件でPCRを行った。なお、KOD−Plus−Neo(PCR酵素)、10×PCR Buffer for KOD−Plus−Neo、2mM dNTPsおよび25mM MgSOは、KOD−Plus−Neo(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0083】
【表4】

【0084】
【表5】

【0085】
得られたPCR産物をMagExtractor Kit(東洋紡製)を用いてゲル抽出を行った後、2μLのSmaI処理をしたプラスミドpK18mobを、8μLのゲル抽出したPCR産物、10μLのLigation high Ver.2(東洋紡製)と混合し、16℃で1時間インキュベートし、Escherichia coli HST08 Premiumコンビテントセル(タカラバイオ製)にライゲーション溶液10μLを添加して軽く撹拌した後、氷中に10分静置し、42℃で1分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【0086】
SOC培地を1mL加え、37℃で1時間インキュベート後、LB寒天培地(カナマイシン、X−gal、IPTG含有)に塗沫し、37℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【0087】
[遺伝子破壊ベクターの確認]
上記「遺伝子破壊ベクターpk18−dpyrFの構築」で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したLB培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表1に示すpyrF−up−Fl(配列番号6)、pyrF−dn−R1(配列番号9)を用いた。コロニーダイレクトPCRの反応液組成を表6に、反応条件を表7に示す。コロニーを反応液に入れてPCRを行った。なお、SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2×Premix)および滅菌蒸留水は、SapphireAmp(R) PCR Master Mix(タカラバイオ社製)に含まれるものを用いた。
【0088】
【表6】

【0089】
【表7】

【0090】
得られたPCR産物について、電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【0091】
吸光度による濃度測定および電気泳動による確認後、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的の遺伝子破壊ベクターpk18−dpyrFが構築できていることを確認した。
【0092】
(2)pyrF破壊株(dpyrF株)の作製
上記(1)で構築した遺伝子破壊ベクターpK18−dpyrFを、以下の手順で、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってpyrFが破壊された株(dpyrF株)を選抜した。
【0093】
[ATCC 39073株への遺伝子破壊ベクターの導入]
272mMスクロース、16mM HEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH7に合わせたHS緩衝液を調製し、20分間Nガスで溶存酸素を置換した。
【0094】
80%の水素、20%の二酸化炭素の混合ガスを基質とし、改変型ATCC 1754 PETC培地、またはグリシンを終濃度5g/Lになるように添加した改変型ATCC 1754 PETC培地で、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株を培養した。
【0095】
菌体濃度がOD600で約0.3になるまで培養し、培養液約100mL分を集菌した後、HS緩衝液で菌体を2回洗浄した。
【0096】
洗浄した菌体を適当な量のHS緩衝液(約3mL)に懸濁し、懸濁液380μLとプラスミド20μLとを混合した。
【0097】
Gene Pulser XcellTMエレクトロポレーションシステム(バイオ・ラッド ラボラトリーズ)および電極間距離(ギャップ)0.2cmのエレクトロポレーションキュベット(バイオ・ラッド ラボラトリーズ)を用いて、1.5kV、500Ω、50μFでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の懸濁液を、ピルビン酸40mMの終濃度で添加した5mLの培地に植菌し、55℃で2日間培養後に、ウラシル10μg/mL、5−フルオロオロチン酸(5−FOA)0.2%の終濃度で添加した寒天培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【0098】
[ダイレクトPCRによるpyrF破壊株(dpyrF株)の確認]
上記寒天培地に形成された20個のコロニーを、5mLのウラシル10μg/mL、5−FOA 0.2%の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養3日目に培地が濁っていることが確認できた6株を選択し、培養液1mLを集菌した。
【0099】
アクロモペプチダーゼ(20mg/mL)+リゾチーム(20mg/mL)の入ったTE緩衝液 20μLで懸濁し、37℃で5分間インキュベートし、DMSOを20μL添加して懸濁し、PCRの鋳型とした。
【0100】
下記表に示すプライマーのうち、pyrF−up−F2(配列番号10:5'-tgtcctcaacaccctcacc-3')とpyrF−dn−R2(配列番号11:5'-tcttcccaggtcctgtagg-3')、pyrF−up−F3(配列番号12:5'-tgtcctcaacaccctcacc-3')とpyrF−dn−R3(配列番号13:5'-tcttcccaggtcctgtagg-3')、またはpyrF−F(配列番号14:5'-acctgaagttccacgacatcc-3')とpyrF−R(配列番号15:5'-ggtcacgatgacgaactc-3')との組合せを用い、各々の組合せについて、表9に示す反応液組成で、表10に示す反応条件でコロニーダイレクトPCRを行い、電気泳動によりバンドを確認した。表9において、プライマーFとプライマーRとの組合せは、上記組合せである。また、コロニーを反応液に入れてPCRを行った。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0101】
【表8】

【0102】
【表9】

【0103】
【表10】

【0104】
ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを20株選択し、液体培地(10μg/mL ウラシル、0.2% 5−FOA)にて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトPCRによる確認を行った。
【0105】
培養3日目に増殖が確認できた6株について、プライマーpyrF−up−F2(配列番号10)とpyrF−dn−R2(配列番号11)との組合せ、またはpyrF−up−F3(配列番号12)とpyr−dn−R3(配列番号13)との組合せを用いて、pyrFの外側からPCRを行ったところ、6株中1株において、野生株よりも短いバンドが確認できた。
【0106】
さらに、プライマーpyr−F(配列番号14)とpyrF−R(配列番号15)との組合せを用いて、pyrFの内側をPCRしたところ、前述の株においてはバンドが確認できなかった。
【0107】
これらの結果から、野生株よりも短いバンドを確認できた株がpyrF破壊株(dpyrF株)である可能性があると判断し、ゲノムDNA抽出を行った後に、もう一度PCRを行った。その結果、ダイレクトPCRの際と同様のバンドパターンが得られた。
【0108】
さらに、pyrFが破壊された部分には、制限酵素SpeIサイトが1カ所付与されることから(プライマーpyrF−up−R1、pyrF−dn−F1参照)、上記のPCR産物についてSpeIで消化したところ、SpeIサイトで切断が起こり、バンドが2本になることを確認した。
【0109】
次に、pyrF破壊候補株についてウラシル要求性試験を行った。酵母エキスを除いた改変型ATCC 1754 PETC培地に、pyrF破壊株を植菌し、10μg/mLの終濃度でウラシルを添加した場合と添加しなかった場合とで増殖の確認を行った。
【0110】
その結果、ウラシルを添加したサンプルでは、培養2日目には菌体の増殖が確認できたが、ウラシルを添加しなかったサンプルにおいては、増殖が確認できなかった。これらの結果から、pyrFの破壊が確認できた。
【0111】
このpyrF破壊株は、受託番号「NITE P−1057」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD)に寄託されている。
【0112】
2.T−ldh導入株の作製
(1)pyrF相補ベクターpK18−epyrFの構築
[pyrF相補ベクターpK18−epyrFの構築]
以下に示すプライマーpyrF−up−F1(配列番号6)とpyrF−dn−R1(配列番号9)との組み合わせを用いて、以下の条件でPCRを行い、pyrF遺伝子翻訳領域とその5’側の約1000bp、3’側の約1000bpを含む約2.7kbの遺伝子断片を増幅した。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0113】
【表11】

【0114】
【表12】

【0115】
得られたPCR産物についてMagExtractor Kit(東洋紡製)を用いてゲル抽出を行った。
2μLのSmaI処理をしたプラスミドpK18mobを、8μLのゲル抽出したPCR産物、10μLのLigation high Ver.2(東洋紡製)と混合し、16°Cで1時間インキュベートした。
Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル(タカラバイオ製)にライゲーション溶液10μLを添加して軽く攪拌した。
氷中に10分静置した。
42℃で1分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
SOC培地を1ml加え、37℃で1時間インキュベート後、LB寒天培地(カナマイシン、X−gal、IPTG含有)に塗沫した。
37℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【0116】
[pyrF相補ベクターの確認]
上記(1)で生育が見られたコロニーをカナマイシン添加LB寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーはpyrF−up−F1(配列番号6)、pyrF−dn−R1(配列番号9)を用いた。コロニーダイレクトPCRの条件を以下に示す。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0117】
【表13】

【0118】
【表14】

【0119】
電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびEcoRIまたはPstI処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のpyrF遺伝子相補ベクターpK18−epyrFが構築できていることを確認した。
【0120】
(2)T−ldh導入用相補ベクターpK18−ldhの構築
T. pseudethanolicus 39E株の乳酸脱水素酵素遺伝子(T−ldh)を取得し、上記(2)で構築したpyrF遺伝子相補ベクターpK18−epyrFのpyrF遺伝子領域へ挿入し、T−ldh遺伝子導入用相補ベクターpK18−ldhを構築することを目的とした。
形質転換のためのホストは、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のpyrF遺伝子破壊株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した NITE P−1057 株を用いた。
【0121】
[In−Fusion PCRによるT−ldh導入用相補ベクターpK18−ldhの構築]
T. pseudethanolicus 39E株のTotal DNA、およびプライマーpyrF−1765−F(配列番号16:5'-tcggcctgctttcatgcttg-3')とpyrF−1764−R(配列番号17:5'-agttattatttcaccatctctatttc-3')とを用いて、pyrF相補ベクターpK18−epyrFを鋳型として、pyrF領域を含むベクター領域をPCR増幅した。PCRの条件は以下の通りである。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0122】
【表15】

【0123】
【表16】

【0124】
プライマーG3PD−F11(配列番号18:5'-ggtgaaataataactggacggttgccaagtacc-3')とG3PD−SD−R12(配列番号19:5'-tatgtactcctccttatatttattgtaacg-3')とを用いて、ATCC 39073株由来のグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のSD配列を含むプロモーター領域(G3PDプロモーター領域)を増幅した。PCRの条件は以下の通りである。なお、KOD−Plus−Neo(PCR酵素)、10×PCR Buffer for KOD−Plus−Neo、2mM dNTPsおよび25mM MgSOは、KOD−Plus−Neo(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0125】
【表17】

【0126】
【表18】

【0127】
T. pseudethanolicus 39E株のTotal DNA、およびプライマーldh−F−1(配列番号20:5'-aaggaggagtacataatgaacaaaatatctataataggttc-3')とldh−R−1(配列番号21:5'-atgaaagcaggccgattatatatcaagctcttgtattacac-3')との組合せを用いて、T. pseudethanolicus 39E株の乳酸脱水素酵素遺伝子(T−ldh)を増幅した。PCRの条件は以下の通りである。PCR反応終了後、各PCR産物をゲル抽出した。なお、KOD−Plus−Neo(PCR酵素)、10×PCR Buffer for KOD−Plus−Neo、2mM dNTPsおよび25mM MgSOは、KOD−Plus−Neo(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0128】
【表19】

【0129】
【表20】

【0130】
下記表に記載の反応溶液でIn−Fusion PCRを行った。反応条件は、37℃30分→50℃15分とした。なお、5× In−Fusion Reaction BufferおよびIn−Fusion Enzymeは、In−Fusion(R) Advantage PCR Cloning Kit(タカラバイオ社製)に含まれるものを用いた。
【0131】
【表21】

【0132】
In−Fusionサンプルに滅菌水を50μl加えて希釈した。
希釈したサンプル10μlを形質転換に用いた。
ダイレクトPCRによりコロニーを選択した。
【0133】
In−Fusion PCRおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。
ldh−F−1およびldh−R−1をプライマーとしたコロニーダイレクトPCRの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から3株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素(EcoRI、EcoRV、またはPstI)処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてT−Idhの挿入が確認できた。
【0134】
(3)T−ldh導入用相補ベクターpK18−ldhによるdpyrF株の形質転換
宿主としては、M. thermoacetica ATCC 39073のpyrF破壊株として、先に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託したdpyrF株(登録名MTA−D−pF株 受託番号NITE P−1057)を用いた。ここでは、上記(2)で構築したT−ldh導入用相補ベクターpK18−ldhをdpyrF株の細胞内にエレクトロポレーション法によって導入し、ダブルクロスオーバーの相同組換えによって、dpyrF株の染色体にT−ldhを組み込むことを目的とした。
【0135】
[dpyrF株の培養]
dpyrF株は完全合成培地+終濃度0.01g/Lのウラシルに植菌し、H+COを炭素源として55℃で培養した。OD600=0.1前後まで培養し、エレクトロポレーション用のサンプルとした。
【0136】
完全合成培地の組成を表22Aに示す。炭素源としてフルクトースを添加する場合には終濃度5g/Lで、ウラシルを添加する場合には終濃度0.01g/Lで、それぞれ添加した(特に断りがある場合を除く)。また、ロールチューブ法に用いる場合には、Agar高温用20g/Lを添加した。
【0137】
【表22】

【0138】
[エレクトロポレーションによるpK18−ldhの導入]
培養液を272mMスクロースbufferで2回洗浄した。
洗浄後のペレットにスクロースbufferを4ml加えて懸濁した。
エレクトロポレーション用のキュベット(2mmギャップ)に懸濁液を380μl、形質転換用プラスミドを20μl加えた。この際、プラスミド量が1μg〜2μgとなるように調整した。
1.5kV、500Ω、50μFでパルスを与えた。
パルスを与えた懸濁液を、5mlの完全合成培地+終濃度0.01g/Lのウラシル+終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
55℃で48時間培養した。
ロールチューブ法により、コロニー形成を試みた。
培養5〜7日で得られたコロニーを、5mlの完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
増殖が確認できた3株を50mlの完全合成培地+H+COの入ったバイアルへ移し、T−ldh遺伝子導入株候補とした。
【0139】
[T−ldh遺伝子導入株の確認]
3株のT−ldh導入株候補からTotal DNAを抽出した。抽出キットにはNucleoSpin Tissue(MACHEREY−NAGEL)を使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。
【0140】
染色体上(pyrF周辺領域)への遺伝子の挿入は、プライマーpyrF−up−F2(配列番号10)とpyrF−dn−R2(配列番号11)との組合せを用いて、PCRにより確認した。PCRの条件を以下に示す。なお、KOD FX Neo(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FX Neoおよび2mM dNTPsは、KOD FX Neo(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
【0141】
【表23】

【0142】
【表24】

【0143】
pK18−ldhを用いてdpyrF株を形質転換した。ロールチューブ法により形質転換体のコロニー形成を試みた結果、コロニーが得られた。コロニーを分離して培養し、生育が見られた3つのT−ldh導入候補株からTotal DNAを抽出した。染色体上の遺伝子挿入周辺領域をPCRにより増幅した。その結果、全ての株においてpyrFおよびT−ldhの挿入が確認できた。それらの株の中からC31株(MTA−T−ldh株)を選択し、以降の実験に用いた。C31株(MTA−T−ldh株)のpyrFおよびT−ldhの挿入の確認結果を図2に示す。野生株のATCC39073株では、pyrF遺伝子が存在するので、1.6kbの位置にバンドが見られる。dpyrF株では、0.73kbのpyrF遺伝子が欠失しているので、0.87kbの位置にバンドが見られる。C31株(MTA−T−ldh株)では、0.73kbのpyrFに加えて、1.2kbのT−ldhが挿入されていることから2.8kbの位置にバンドが見られる。
【0144】
(3)C31株(MTA−T−ldh株)のT−ldh遺伝子の転写量測定
上記(2)で構築したC31株(MTA−T−ldh株)に導入されたT−ldhが転写されているか、定量RT−PCRを用いて調べた。
【0145】
[Total RNAの抽出と定量RT−PCR]
C31株(MTA−T−ldh株)およびATCC39073株を完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトースで、dpyrF株を完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトース+終濃度0.01g/Lのウラシルで、それぞれ培養した。
【0146】
Total RNAの抽出にはNucleo Spin RNA II(MACHEREY−NAGEL)を使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。
【0147】
定量RT−PCRのキットにはOne Step SYBR PrimeScript PLUS RT−PCR Kit(タカラバイオ)を用いた。方法は添付のマニュアルに従った。反応条件を以下に記す。
【0148】
【表25】

【0149】
図3はフルクトースを炭素源として培養した際の、各株のT−ldh遺伝子の転写量を示した。ATCC39073株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子M−ldhの転写量はすべての株において、ほぼ同程度の転写量だった。
【0150】
T. pseudethanolicus 39E 株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子T−ldhの転写はC31株(MTA−T−ldh株)でのみ観察された。C31株(MTA−T−ldh株)において、フルクトースを炭素源として培養した場合は約19倍強く転写されていた。なお、gyrBの転写量を内部標準とした。
【0151】
(4)LDHの酵素活性測定
上記(3)でT−ldhの転写が確認できた。そこで、T−ldhの転写産物から乳酸デヒドロゲナーゼが合成され、機能しているかを確認するために乳酸デヒドロゲナーゼの比活性を測定した。
【0152】
ATCC39073株およびC31株(MTA−T−ldh株)を完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトースで、dpyrF株を完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトース+終濃度0.01g/Lのウラシルで、それぞれ培養した。OD600=0.5前後で菌体を回収し、超音波破砕した。破砕した菌体溶液を20400×Gで30分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液として酵素活性測定に用いた。乳酸生成のLDH活性は、50mM リン酸バッファー(pH6.0)中に1mM ピルビン酸、0.2mM NADH or NADPH、0.2mM フルクトース−1,6−ビスリン酸(FBP)を含む反応液で、55℃における吸光度A340を測定することで求めた。ピルビン酸生成のLDH活性は、50mM リン酸バッファー(pH 7.5)中に50mM L−乳酸、1mM NAD or NADP、0.2mM FBPを含む反応液を用いて、55℃で測定した。1分あたり1mMのNADHを酸化または1mMのNADを還元する酵素量を1Uとした。タンパク質濃度はBSAをスタンダードとして用いて、Bradford法により決定した。
【0153】
LDH比活性を下記表26に示した。全ての反応において、野生株とdpyrF株の比活性は同程度であった。NADHを補酵素とした際の乳酸生成反応は、C31株(MTA−T−ldh株)が高い活性を示した。C31株(MTA−T−ldh株)のLDH比活性は野生株やdpyrF株と比較して約10倍高かった。NADPHを補酵素とした場合の乳酸生成反応は、すべての株においてほぼ同じであった。
【0154】
【表26】

【0155】
(5)C31株(MTA−T−ldh株)による乳酸生産
完全合成培地にリン酸buffer(pH6.5)を50mMとなるように添加した。炭素源としてフルクトースを60mMとなるように加えた。
C31株(MTA−T−ldh株)、ATCC39073株を上述の培地に10%植菌した。
OD600、pH、フルクトース濃度(HPLC分析)、乳酸濃度(HPLC分析)、酢酸濃度(HPLC分析)を経時的に測定した。HPLCの条件を以下に示す。
・装置名: 日本分光製 LC−2000Plus シリーズ(ポンプ:PU−2080Plus、オートサンプラー:AS−2057Plus、カラムオーブン:CO−2065Plus、検出器:RI−2031Plus)
・カラム: BIO−RAD製 発酵モニタリングカラム(カタログNo.125−0115)
・カラム温度: 65℃
・使用バッファー: 1mM HSO
・流速: 1ml/min
・検出器: RI
【0156】
野生株(ATCC39073株)とC31株(MTA−T−ldh株)を酢酸生成によるpH低下を防ぐために50mMリン酸bufferを含んだ完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトースで培養した。
図4(A)には野生株とC31株(MTA−T−ldh株)をフルクトースとリン酸bufferを含んだ完全合成培地で培養した際のOD600とpH、図4(B)にはフルクトース消費量、乳酸および酢酸の生成量の経時変化を示した。
C31株(MTA−T−ldh株)と野生株は増殖に伴い、フルクトースが消費され、酢酸が生成され、pHが低下した。pHはリン酸bufferの影響で、pH5程度までしか下がらなかった。野生株は乳酸を蓄積しなかったが、C31株(MTA−T−ldh株)は酢酸の生成と同様に、増殖と連動して乳酸を蓄積し、定常期に入ると生成は止まった。C31株(MTA−T−ldh株)は最終的には0.7g/L(6.8mM)の乳酸を蓄積した。
【産業上の利用可能性】
【0157】
本発明は、モーレラ属細菌の遺伝子組み換え技術を開発し、さらに外来遺伝子を発現させることに初めて成功したものである。dpyrF株を用いて本発明に係る技術を用いれば、モーレラ属細菌で機能する抗生物質マーカーの探索や、モーレラ−大腸菌シャトルベクターの構築も可能になると考えられる。本発明に係る技術は、今後、モーレラ属細菌を用いた合成ガスからの有用物質生産のプラットフォームを整備するための分子育種技術の開発に大きな貢献をすることが期待される。
【受託番号】
【0158】
識別の表示:MTA-D-pF
受託番号:NITE P-1057
寄託日:2011年2月15日
受託機関:独立行政法人製品技術評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)

識別の表示:MTA-T-ldh
受領番号:NITE AP-1154
受領日:2011年10月24日
受託機関:独立行政法人製品技術評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)

【特許請求の範囲】
【請求項1】
異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項2】
前記LDH遺伝子が相同組換えによってゲノムに組み込まれた、請求項1に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項3】
前記LDH遺伝子が同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)によって発現している、請求項1または2に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項4】
前記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、請求項1〜3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
【請求項5】
前記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、請求項1〜3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
【請求項6】
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)がオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流域または下流域に組み込まれ、該LDH遺伝子が該G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項7】
前記LDH遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来する、請求項6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項8】
前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項9】
前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項6〜8のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項10】
前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項6〜9のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項11】
前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項6〜10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項12】
前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項6〜10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項13】
NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE AP−1154で寄託されている、請求項6〜12のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項14】
異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項15】
前記工程が相同組換えにより行われる、請求項14に記載の方法。
【請求項16】
前記LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を組み込む、請求項14または15に記載の方法。
【請求項17】
前記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAコンストラクトを構築する工程と、
前記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程と
を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
【請求項20】
前記LDH遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来する、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項19に記載の方法。
【請求項22】
前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項19〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項19〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊する工程
をさらに備える、請求項19〜25のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
前記pyrF破壊株がモーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica) ATCC 39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られる、請求項19〜25のいずれかに記載の方法。
【請求項28】
前記pyrF破壊株がNITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE P−1057で寄託されている株である、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
請求項19〜28のいずれかに記載の方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
【請求項30】
オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子がフィルミクテス(Firmicutes)門クロストリジウム(Clostridia)綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクト。
【請求項31】
前記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、請求項30に記載のDNAコンストラクト。
【請求項32】
前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項30に記載のDNAコンストラクト。
【請求項33】
前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項30〜32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【請求項34】
前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項30〜32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【請求項35】
前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項30〜34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【請求項36】
前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項30〜34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【請求項37】
請求項1〜13のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌または請求項14〜28のいずれかに記載の方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【公開番号】特開2013−90600(P2013−90600A)
【公開日】平成25年5月16日(2013.5.16)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−235485(P2011−235485)
【出願日】平成23年10月26日(2011.10.26)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 第63回日本生物工学会大会講演要旨集、2011年8月25日発行、公益社団法人日本生物工学会発行 第63回日本生物工学会大会トピックス集、2011年9月2日発行、第63回日本生物工学会大会 大会実行委員会発行
【出願人】(000005902)三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】(504136568)国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Fターム(参考)】