乾燥加熱によるウイルス不活化方法
【課題】不十分なウイルスの不活化と、十分なウイルスの不活化を区別する閾値を提供できる、測定可能な多因子性の物理化学的パラメータを提供すること。
【解決手段】乾燥状態の生物学的製剤に存在するか若しくは存在すると考えられるウイルスを乾燥加熱し、ターゲッティングすることによる、ウイルスの不活化方法であって、ａ）処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇを測定する工程と、ｂ）工程ａ）において測定したガラス転移温度Ｔｇ以上の乾燥加熱温度Ｔで、工程ａ）に係る、処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤を加熱する工程を含んでなる方法。
【解決手段】乾燥状態の生物学的製剤に存在するか若しくは存在すると考えられるウイルスを乾燥加熱し、ターゲッティングすることによる、ウイルスの不活化方法であって、ａ）処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇを測定する工程と、ｂ）工程ａ）において測定したガラス転移温度Ｔｇ以上の乾燥加熱温度Ｔで、工程ａ）に係る、処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤を加熱する工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乾燥加熱によるウイルス不活化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いかなる固体状の生体物質にもウイルスによる汚染リスクが伴い、かかる物質又はその方法による誘導生成物（この種の材料が用いられる）は治療若しくは予防用のウイルスの不活化方法に供される必要がある。
【０００３】
治療及び予防の領域において、生物学的給源から生じる活性物質が用いられるが、それらは製造工程において生物学的給源に由来する物質により汚染されるおそれもある。
【０００４】
これらの活性物質としてはタンパク、ペプチド、ポリペプチド、抗体であり、おそらく脂質又は炭水化物、核酸、ＤＮＡ、リボ核酸、多糖、細菌、ウイルス粒子などにより置換されうる。
【０００５】
それらを生じさせる、又はそれらの製造工程において汚染源となりうる生物学的給源は、たとえばヒト若しくは動物の組織、血液、血漿、骨、植物組織、あるいは微生物、細胞、ウイルス、菌類、酵母、カビ又は真菌類用の培地であることも考えられる。
【０００６】
従って、ウイルスの減少又は不活化工程は通常、この種の生物学的給源から生じる活性物質の抽出工程中に含まれる。
【０００７】
本発明では、生物学的副産物とは、前記生物学的給源から生じる活性物質、及び前記活性物質の製造工程から生じる他の化合物又は賦形剤を含有する生成物のことを意味する。
【０００８】
化学物質及び／又は熱による処理に基づくウイルスの不活化方法は従来公知である。これらの大多数は、ウイルスの不活化の有効性が重要である輸血分野に由来するものであり、その理由は、ドナーから得られる生成物に由来すると考えられる汚染をなくすために不可欠だからである。
【０００９】
ＨＩＶの不活化には加熱が推奨されるが、その理由は、ウイルス源が、特に通常血液、血漿、並びに血液及び血漿由来の生成物であることが公知だからである。乾燥加熱（一定時間ｔにおける温度Ｔによる乾燥生成物の加熱）が、例えば、凍結乾燥された凝固因子の濃縮物（液状では加熱されなかった）の場合には推奨される。例えば、血中の凝固因子ＶＩＩＩの場合、ヒト血漿から抽出した後、７２〜９６時間、６０℃で凍結乾燥された形で加熱工程に供することにより、血友病患者の治療用のこの生物学的活性物質の安全性を担保する。しかしながら、かかる熱非働化にもかかわらず、血友病患者においてＨＩＶ感染による汚染のケースが報告されているため、乾燥加熱によるウイルスの不活化工程では不十分であることが明らかとなっている。
【００１０】
ゆえに、これらの生成物をいわゆる「シビア」な加熱条件（８０℃の温度で７２時間、乾燥加熱）に供することが提案されている。
【００１１】
このウイルスの不活化方法はその後、この方法で処理された因子ＶＩＩＩにおいて得られた臨床成績に基づき、ＨＩＶ（エンベロープ型ウイルス）において有効性が確認されている（非特許文献１）。
【００１２】
精製タンパクを溶媒及び界面活性剤の混合物で処理することが、生物学的給源に由来するタンパクによる、エンベロープ型ウイルスによる感染防止において通常用いられている（非特許文献２）。かかる処理は、脂質エンベロープを有するウイルスに対して効果的であるが、この種の構造を有さないウイルスに対しては効果が少ない。最近、溶媒／界面活性剤で処理された生物学的製剤の使用による、非エンベロープ型ウイルスの感染への使用に関して報告がなされている。すなわち、Ａ型肝炎ウイルス（非エンベロープ型ＲＮＡウイルス）では、溶媒／界面活性剤で処理された第ＶＩＩ因子の使用においても、患者におけるウイルス感染が検出されている（非特許文献３）。第ＶＩＩＩ因子はまた、非エンベロープ型のパルボウイルス（Ｂ１９）の感染にも関与していることが報告されている（非特許文献４）。
【００１３】
精製されたタンパク質の熱処理は、ウイルス不活化スペクトラムを非エンベロープ型のウイルスまで広げるために推薦されている。しかしながら、非エンベロープ型のウイルスの熱非働化は、エンベロープ型ウイルスの場合より通常困難であり、しばしば長い処理時間及び／又は高い温度が、良好な不活化のためには必要となる。Ｂ１９は、１００℃で３０分間乾燥加熱した因子ＶＩＩＩを介して、患者に感染することが報告されている（非特許文献５）。
【００１４】
したがって、ウイルスの不活化方法をいかに改善することにより、生物学的製剤の安全性を維持又は強化できるかを解明することが何より重要である。
【００１５】
（背景技術）
多くの研究者は、乾燥加熱によるウイルスの不活化に影響しうる主要パラメータの発見をこれまで行ってきた。その目的は、ある種の処理方法が、その処理を受けた固体成分に適するか否かに関する予測を可能にするための物理化学パラメータを定義すること、すなわち、当該方法により、生成物の良好な安定性を維持しつつ、充分な効力でウイルスを非働化できるか否かを判定できるパラメータを定義することである。更に、このパラメータがウイルスの不活化若しくは生成物の安定性を維持するために調節可能でありえる場合、それは極めて興味深いと考えられる。
【００１６】
ウイルスの不活性化工程におけるウイルス減少係数は、乾燥加熱によるウイルスの不活化が減少する際の因子と定義され、すなわち、不活化工程前における乾燥加熱によるウイルスの不活化と、不活化工程後における乾燥加熱によるウイルスの不活化との比率の常用対数として表される。
【００１７】
含水量は、生成物１００ｇに含まれる水の重量として定義される。ゆえに、それは全重量に対するパーセンテージとして表される。従来の測定方法は、１００℃以上の温度で加熱した後で、その重量が一定となるまでの間の、生成物重量の減少を測定することに基づくものである。
【００１８】
Ｗｉｌｋｏｍｍｅｎ（パウル エールリッヒ研究所）らは、低い含水量（＜０．８％）を含有する凍結乾燥物の場合、８０℃、７２時間の加熱によって得られたＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の減少係数が０〜０．４ｌｏｇ１０であり、一方、比較的高い含水量（０．８％＞）を有する凍結乾燥物の場合、同じ条件において、得られたＡ型肝炎ウイルスの減少係数が４．３ｌｏｇ１０以上であることを示している。
【００１９】
Ｂｕｎｃｈらは（Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ社）、８０℃で７２時間加温したときに、２つの組換えＶＩＩＩ因子中のＡ型肝炎ウイルスのサンプルの減少係数が≧６．９ｌｏｇ１０であったことを報告している。
【００２０】
Ｒｏｂｅｒｔｓ ＰＬらは、生物学的製剤の組成、並びに、因子ＶＩＩＩの２つの凍結乾燥濃縮物を８０℃で７２時間加熱して２つのパルボウイルス（ウシ及びイヌ）を不活化させたときのウイルス抵抗性による影響に関して開示している（非特許文献６）。
【００２１】
Ｈａｒｔ ＨＦらは、８０℃で２４時間、又は９０℃で２時間の加熱した因子ＶＩＩＩの凍結乾燥物において、同様の、Ａ型肝炎ウイルスの減少係数を得ている（非特許文献７）。
【００２２】
Ｔｏｍｏｋｉｙｏら（非特許文献８）は、各種ウイルスの不活化（因子ＶＩＩａの凍結乾燥物中の、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＶＤＶ（ウシウイルス性下痢症ウイルス）、ＰＰＶ（ブタパルボウイルス））を行い、凍結乾燥物中のそれらのウイルスの不活化は６５℃で可能であることを示している。すなわち、ＰＰＶを除く全てのウイルスでは、＜１．７％の含水量の生成物の、６５℃で９６時間にわたる加熱により、＞４ｌｏｇ１０という、致命的な減少係数を示した。
【００２３】
特許文献１では、７２〜７７時間の８０℃の乾燥加熱工程によるウイルスの不活化の有効性において重要な要素は、処理済みの乾燥状態の生物学的製剤中の含水量であることを開示している。試験したウイルスは、ＨＡＶ、ブタパルボウイルス及び仮性狂犬病ウイルスである。その発明者らは、この工程を使用して≧４ｌｏｇ１０のウイルス減少係数とするためには、残留水分含量が０．８％以上でなければならないことを示している。残留水分含量が≦０．８％では、平均ウイルス減少係数は０．１２ｌｏｇ１０である。
【００２４】
（技術的課題）
これらの断片的な結果を総合すると、パラメータは確定しなかったが、言い換えると、その決定により、処理される生物学的製剤に応じて使用される乾燥加熱に基づく、ウイルス不活化工程において、操作上の変数を確実に決定することが可能となると考えられる。
【００２５】
にもかかわらず、処理される生成物の水分含量が非常に重要な役割を演ずるという事実に関しては、上記研究者間でもある程度のコンセンサスが得られているようであるが、良好なウイルスの不活化を得る閾値として残留水分含量に関してはコンセンサスが得られていない。実際、この数値が数桁減少するだけで、不完全な不活化となることもしばしば生じる。
【００２６】
しかしながら、ある研究者が報告する内容とは対照的に、本発明者らは、ウイルスの不活化は、水分含量のきわめて少ない凍結乾燥物において効率的に行われうることを示した。すなわち、０．１％の残留水分を有するヒト線維素原の冷凍乾燥製剤を、７７℃で７２時間乾燥加熱し、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）及びプバパルボウイルス（ＰＰＶ）で得られた減少係数を以下の表１に示す。
【００２７】
表１：
ウイルス 減少係数
ＨＡＶ ４．１０±０．３０
３．７５±０．２６
ＨＩＶ ４．５３±０．３６
４．６２±０．３０
４．８８±０．２８
ＢＶＤＶ ５．９６±０．４０
５．２１±０．３８
ＰＰＶ ２．９７±０．４３
２．８８±０．３７
【００２８】
しかしながら、これらの結果から観察されるデータの散乱より、以下の結論しか導き出すことができなかった：処理された生成物の残留水分は、乾燥加熱によるウイルスの不活化の結果にとっては決定的な因子でないが、但し、その決定因子が深く関与するものとして考えれば、重要な因子であると考えられる。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０８４４００５号公報
【非特許文献１】Ｌ．Ｗｉｎｋｅｌｍａｎら、Ｓｅｖｅｒｅ Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｕｒｒ．Ｓｔｕｄ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．［１９８９］５６：５５−６９
【非特許文献２】Ｐｉｅｔら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ［１９９０］３０：５９２−９８
【非特許文献３】Ｐｕｒｃｅｌｌら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ［１９９４］６７：２−７
【非特許文献４】Ｌｅｆｒｅｒｅら、Ｌａｎｃｅｔ［１９９４］３４３：２１１−１２
【非特許文献５】Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏら、Ｌａｎｃｅｔ［１９９４］３４３：７９８
【非特許文献６】Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ［２０００］Ｓｅｐｔ、２８（３）：１８５−８ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ ａｎｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ ａｎｄ Ｄｒｙ−Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｔｗｏ Ｈｉｇｈ−Ｐｕｒｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ
【非特許文献７】Ｖｏｘ Ｓａｎｇ［１９９４］６７（４）：３４５−５０ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ （Ｄｒｙ） Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ Ｎｏｎ−Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ
【非特許文献８】Ｖｏｘ Ｓａｎｇ［２００３］ Ｊａｎ、８４（１）：５４−６４ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
以上より、本発明の課題は、不十分なウイルスの不活化と、十分なウイルスの不活化を区別する閾値を提供できる、測定可能な多因子性の物理化学的パラメータを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
驚くべきことに、発明者らは、この測定可能な物理化学パラメータが、処理しようとする生物学的製剤のガラス転移温度であることを見出した。
【００３１】
ガラス転移は二次転移であり、すなわち、潜熱でない、熱容量変化を伴う熱的転移のことである。それは、結晶化を防止するために迅速に低温に冷却され、それにより、ガラス若しくはアモルファスポリマー、又は結晶性高分子のアモルファスの一部を形成する、硬い脆弱な状態から、柔軟な状態に転移する際の、いわゆる過冷却された液体に見られる特徴である。
【００３２】
ガラス転移温度又はＴｇは、ガラス転移が発生する温度である。
【００３３】
ポリマーがこの温度以下に冷却されると、ガラスのように硬く脆い状態になり、それはれはガラス状態と呼ばれる状態である。
【００３４】
ポリイソプレン及びポリイソブチレンのような弾力性ゴムは、すなわちそれらがゴム状の柔軟な状態のとき、それらのガラス転移温度以上の温度で用いられる。
【００３５】
当業者にとり、ガラス転移温度は、ある具体的なパラメータセットに依存することが公知である。ポリマーの場合、それはそれらの分子量、鎖の化学構造及び含まれる可塑剤の量に依存する。
【００３６】
可塑剤は小分子（塩など）であり、ポリマー間の分子をインターカレートし、それらが互いに摺動するのを補助し、それによりそれらの分子運動を促進する。すなわち、可塑剤の添加によってガラス転移温度を低下させることができる。
【００３７】
対照的に、高分子量分子はそれらポリマー分子間の運動をブロックし、ガラス転移温度を上昇させる。
【００３８】
更に、発明者らは、ガラス転移温度が、フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）中の所与の凍結乾燥物の残留含水量に直接関連することを見出した。
【００３９】
凍結乾燥物のガラス転移温度と、その残留含水量との関係を、図１に示す。
【００４０】
したがって生物学的製剤のガラス転移温度は、活性物質の性質及び賦形剤の性質、可塑剤の有無、結晶状であるかアモルファス形状であるか、賦形剤の分子量、生物学的製剤中の残留含水量などに依存する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、乾燥状態の生物学的製剤に存在するか若しくは存在すると考えられるウイルスを乾燥加熱し、ターゲッティングすることによる、ウイルスの不活化方法であって、
ａ）処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇを測定する工程と、
ｂ）工程ａ）において測定したガラス転移温度Ｔｇ以上の乾燥加熱温度Ｔで、工程ａ）に係る、処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤を加熱する工程を含んでなる方法の提供に関する。
【００４２】
乾燥生成物とは、当業者に公知の方法（例えば凍結乾燥、真空乾燥、浸透気化法又は噴霧乾燥法）を使用して乾燥させた生成物である。
【００４３】
特に乾燥生成物は、冷凍乾燥生成物であり、すなわち、最初に生成物を凍結させ、その後、少なくとも一部の含有水分を真空条件下で昇華させることにより得られた生成物である。
【００４４】
発明者らは、加熱がＴｇ以上のとき、ウイルス減少係数及びウイルス不活化の動態が強化されることを見出している。
【００４５】
したがって、ガラス転移温度の値をあらかじめ把握することにより、不活性化工程が良好であるか、あるいは、必要に応じて当該工程を調整する必要があるか否かを予測することが可能となる。
【００４６】
乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度の測定は、この生成物のサンプルを、−５０℃〜１００℃の温度で徐々に、プログラム制御しながら増加させる試験に供し、ガラス転移を含むその状態変化を観察することにより実施される。
【００４７】
このようにして、乾燥状態の生物学的製剤のサーモグラム、及び特にそのガラス転移温度を測定する。
【００４８】
ガラス転移温度の測定の後、従来の熱ベースのウイルス不活化方法を使用する当業者であれば、Ｔ≧Ｔｇの要件を満たすにあたり：
− Ｔｇが対象となるウイルスにとり良好である（温度Ｔ＞−Ｔｇを選択）か、又は、
− 検討しているウイルスの失活及び生成物の安定性が十分となることが確実となるＴを選択することができるようにＴｇを調整する必要があるか否かを判断することが可能となる。
【００４９】
例えば、当業者が、目的のウイルスの不活化温度Ｔｇが低すぎる（例えばＴｇ≦Ｔ）と考え、また安定性を向上させたいと考える場合には、その当業者は、Ｔが当該ウイルスの不活化が可能であることが公知の温度範囲になり、またＴとＴｇとの差が、生成物の分解をもたらさない程度となるようにＴｇを上昇させることができる。
【００５０】
一方では、当業者が、そのＴｇが高すぎる（Ｔ≧Ｔｇ）と考え、また生成物の安定性を維持したと考える場合には、Ｔが選択される前にＴｇを低下させることができる。
【００５１】
本発明に係る、乾燥加熱による生物学的製剤のウイルスの不活化方法は、特に非エンベロープ型のウイルスの場合に好適である。
【００５２】
この工程は、乾燥状態の生物学的製剤として、１つ以上の血液−血漿から抽出されたタンパク質を含有する組成物を処理する際に用いることができる。
【００５３】
具体的実施形態では、乾燥加熱温度Ｔは、非エンベロープ型のウイルスの不活化を可能にする態様で選択される。
【００５４】
好適な方法では、生物学的製剤に対する高分子量賦形剤の添加によって、又は生物学的製剤の含水量を減少させることによってガラス転移温度を上昇させる。一方、生物学的製剤に塩又は低分子量の賦形剤を添加することによって、又は、生物学的製剤中の含水量を増加させることによってガラス転移温度を低下させる。
【００５５】
特に、ガラス転移温度は、スキャン差動的な温度アナライザ（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒｍｏａｎａｌｙｓｅｒ）を使用して測定される。状態変化とは、測定の際の温度領域では状態変化を起こさない不活性生成物に関して測定した場合の、熱容量の変化として定義される。
【００５６】
本発明の方法に係る加熱温度Ｔは、生成物の安定性を良好に維持するためには、Ｔｇ〜Ｔｇ＋２０℃の範囲であることが好適である。この範囲において、Ｔｇ〜Ｔ（最大Ｔｇ＋２０℃）の差が増加し、ウイルス減少係数及びウイルスの不活化の動態が促進されるようにＴを選択してもよく、又は、Ｔｇ〜Ｔの差が減少し、生成物の安定性が維持されるようにＴを選択してもよい。
【００５７】
特に好適な方法では、ウイルス減少係数≧３ｌｏｇ１０（好ましくは４ｌｏｇ１０）となるように乾燥加熱温度Ｔを選択する。
【００５８】
具体的実施形態では、最終工程において、乾燥され、処理された生物学的製剤のウイルス不活化効率を測定し、前記有効性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔ〜前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化を実施する。
【００５９】
他の具体的実施形態では、最終工程において、乾燥された処理済みの生物学的製剤の安定性を評価し、前記安定性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔ〜前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化を実施する。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞：乾燥加熱による凍結乾燥物中のバクテリオファージＰＲ７７２の不活性化
凍結乾燥物の物理的性質を修飾し、ガラス転移温度（ｔｇ）を調整した。
【００６１】
ガラス転移温度を、スキャン差動的温度測定器を使用して測定した。スキャン差動的温度測定器の温度を、インジウム（Ｔｍ＝１５６．６℃）及びｎ−オクタデカン（Ｔｍ＝２８．２℃）を使用して校正した。サンプルを、２０℃／分の温度変化率で、−５０℃〜１３０℃の温度変化に供した。液体窒素を用い、室温以下の温度での試験を実施した。ガラス転移温度は、見かけの比熱における、吸熱変化のメジアン温度とした。測定を２度実施し、平均値をＴｇとした。
【００６２】
加熱は、Ｔｇ（すなわち固体（ガラス）状態）以下の温度、又はＴｇ（すなわち粘弾性（ゴム状）状態）から約２０℃高い温度で行った。
【００６３】
全ての凍結乾燥物は、１％未満の水分含量であった。
【００６４】
水分含量はカールフィッシャー法を使用して測定した（水とヨウ素の反応に基づく、当業者に公知の方法）。
【００６５】
生成物Ａの組成（ｐＨ７．０±０．５）
− グリシン：７．５ｇ／ｌ
− リシン塩酸：５．５ｇ／ｌ
− ＣａＣｌ２：０．１５ｇ／ｌ
− マンニトール：４０ｇ／ｌ
− スクロース５０ｇ／ｌ
− ＦＶＩＩＩ：１００ＩＵ／ｍｌ。
生成物Ａは６２℃のＴｇであった。
【００６６】
生成物Ｂは、ＮａＣｌを添加した以外、生成物Ａと同じ組成とした。これにより、Ｔｇが〜約４０℃に減少した（同じ湿度ＲＭ）。
【００６７】
Ｃは冷凍乾燥させたｖＷＦ濃縮物であり、Ｄは冷凍乾燥させたヒト線維素原である。
【００６８】
生成物Ｃの組成（ｐＨ７．０±０．５）
− クエン酸三ナトリウム：１０ｍＭ
− ＣａＣｌ２：１ｍＭ
− グリシン：５ｇ／ｌ
− アルギニン塩酸：４０ｇ／ｌ
− アルブミン：１０ｇ／ｌ
− ｖＷＦ：１００ＩＵ／ｍｌ。
【００６９】
生成物Ｄの組成（６．８＜ｐＨ＜７．２）
− フィブリノーゲン：１１〜２０ｇ／ｌ
− 塩酸アルギニン：４０ｇ／ｌ
− イソロイシン：１０ｇ／ｌ
− グリシン：２ｇ／ｌ
− リシン一塩酸塩：２ｇ／ｌ
− クエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ：２．５ｇ／ｌ。
生成物Ｃ及びＤは、それぞれ８０℃及び９０℃のＴｇ値であった。
【００７０】
バクテリオファージＰＲ７７２の減少係数は、６２℃及び８０℃で、１２、２４及び７２時間加熱し、測定した。
【００７１】
乾燥加熱によるウイルスの不活化は、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｇａｚｅｔｔｅ Ｎｏ８４，Ｍａｙ ４ １９９４、及びＳｃｈｍｉｄｔ，Ｎ．Ｊ．＆ Ｅｍｍｏｎｓ，Ｒ．Ｗ．（１９８９） ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに記載のように、Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｋａｒｂｅｒ式を使用して算出した。
【００７２】
減少係数を、不活化工程前における乾燥加熱によるウイルスの不活化（ｍｌ当たり）と、不活化工程後における乾燥加熱によるウイルスの不活化（ｍｌ当たり）との比率として表した。
【００７３】
結果を、図２及び３においてグラフとして示す。
【００７４】
試験の結果Ｔ＝８０℃で加熱した場合、
１．生成物Ａ（Ｔｇ＝６２℃（Ｔ−Ｔｇ≒２０℃））では、不活化は非常に急速であり、減少係数は、２４時間以内に４ｌｏｇ１０に到達した。
２．生成物Ｃ（Ｔｇ＝Ｔ）では、減少係数は７２時間後に４ｌｏｇ１０に到達した。
３．生成物Ｄ（Ｔｇ＝９０℃）では、減少係数は、７２時間後に４ｌｏｇ１０に到達した。
Ｔ＝６２℃で加温した場合、
１．生成物Ａ（Ｔｇ＝Ｔ）では、減少係数は７２時間後に４ｌｏｇ１０に到達した。
２．生成物Ｂ（Ｔｇ＝４０℃（Ｔ−Ｔｇ≒２０℃））では、不活化の動態が非常に迅速であり、減少係数は２４時間以内に４ｌｏｇ１０に到達した。
【００７５】
＜実施例２＞：乾燥加熱による、凍結乾燥物中のＰＰＶの不活化
Ｔｇ＝８０℃又は９０℃の凍結乾燥物を、８０℃で、１２、２４及び７２時間加熱し、ＰＰＶ減少係数を測定した。
【００７６】
結果を、図４でグラフとして示す。
【００７７】
Ｔ＝８０℃で加熱した場合、Ｔ＝Ｔｇのとき、減少係数は約４ｌｏｇ１０であり、Ｔ＜Ｔｇのとき、減少係数は比較的低く、２ｌｏｇ１０のオーダーであった。
【００７８】
＜実施例３＞：Ｔ＝Ｔｇの乾燥加熱による、凍結乾燥物中のＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２及びＰｈｉ１７４の不活化
ＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２及びバクテリオファージＰｈｉ１７４の減少係数を、Ｔ＝Ｔｇ＝８０℃（Ｔｇ＝８０℃の凍結乾燥物の場合）で、又はＴ＝Ｔｇ＝６２℃（Ｔｇ＝６２℃の凍結乾燥物の場合）で、１２、２４及び７２時間加熱し、測定した。
【００７９】
結果を、図５及び６でグラフとして示す。
【００８０】
耐性の弱いウイルス（すなわちＨＡＶ、ＢＶＤＶ、Ｐｈｉ１７４）では、Ｔ＝Ｔｇでの加熱により、２４時間以内に４ｌｏｇ１０の減少係数に到達するのに十分であることが分かった。
【００８１】
一方、耐性の強いウイルス（すなわちＰＰＶ及びＰＲ７７２）では、約４ｌｏｇ１０に減少係数を到達させるためには、加熱時間を７２時間まで延長する必要があることが分かった。
【００８２】
その結果、これらの耐性の強いウイルスでは、目的がそれらの不活化であるため、ウイルス減少係数及びウイルスの不活化率は、加熱温度Ｔを増加させるか、又は生成物のＴｇを低下させることにより強化することができ、それによりＴとＴｇとの差が増加する。
【００８３】
更に好ましくは、Ｔ−Ｔｇの範囲を≧２０℃とすることによりウイルスの不活化率が向上し、また、Ｔ−Ｔｇの範囲を≦２０℃とすることにより生成物安定性が強化される。
【００８４】
＜実施例４＞：ガラス転移温度の関数としての、ｖＷＦ凍結乾燥物の物理化学的特性に与える、８０℃で７２時間にわたる加熱の影響
異なるガラス転移温度を有する３つのｖＷＦ凍結乾燥物を、８０℃で７２時間加熱した。様々なパラメータ（凍結乾燥物の外観、溶解時間及び得られる溶液の外観）に関して観察を行った。
【００８５】
結果を表２に示す。
【００８６】
表２
【表１】
【００８７】
加熱温度Ｔ≧Ｔｇ及びＴ−Ｔｇ≦２０℃により、生成物の安定性が一定に保持され、一方、選択された温度により、ガラス状態からゴム状態への状態変化が行われたことが示された。
【００８８】
また、加熱温度とＴｇとの更に大きな差（本試験では３８℃）は、生成物の安定性にとって好ましくないことが明らかとなった。
【００８９】
結論として、Ｔｇに近いＴを選択することにより、生成物の安定性がより好適に維持される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】Ｔｇ及びＲＭ間の相関：Ｔｇ＝ガラス遷移温度、ＲＭ＝残余物の含水量。
【図２】６２℃の乾燥加熱の後のＰＲ７７２減少係数（Ｔｇに依存する）。
【図３】８０℃の乾燥加熱の後のＰＲ７７２減少係数（Ｔｇに依存する）。
【図４】８０℃の乾燥加熱の後のＰＰＶ減少係数（Ｔｇに依存する）。
【図５】Ｔ＝Ｔｇ＝８０℃における、ＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２、Ｐｈｉ１７４減少係数。
【図６】Ｔ＝Ｔｇ＝６２℃における、ＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２、Ｐｈｉ１７４減少係数。
【技術分野】
【０００１】
本発明は乾燥加熱によるウイルス不活化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いかなる固体状の生体物質にもウイルスによる汚染リスクが伴い、かかる物質又はその方法による誘導生成物（この種の材料が用いられる）は治療若しくは予防用のウイルスの不活化方法に供される必要がある。
【０００３】
治療及び予防の領域において、生物学的給源から生じる活性物質が用いられるが、それらは製造工程において生物学的給源に由来する物質により汚染されるおそれもある。
【０００４】
これらの活性物質としてはタンパク、ペプチド、ポリペプチド、抗体であり、おそらく脂質又は炭水化物、核酸、ＤＮＡ、リボ核酸、多糖、細菌、ウイルス粒子などにより置換されうる。
【０００５】
それらを生じさせる、又はそれらの製造工程において汚染源となりうる生物学的給源は、たとえばヒト若しくは動物の組織、血液、血漿、骨、植物組織、あるいは微生物、細胞、ウイルス、菌類、酵母、カビ又は真菌類用の培地であることも考えられる。
【０００６】
従って、ウイルスの減少又は不活化工程は通常、この種の生物学的給源から生じる活性物質の抽出工程中に含まれる。
【０００７】
本発明では、生物学的副産物とは、前記生物学的給源から生じる活性物質、及び前記活性物質の製造工程から生じる他の化合物又は賦形剤を含有する生成物のことを意味する。
【０００８】
化学物質及び／又は熱による処理に基づくウイルスの不活化方法は従来公知である。これらの大多数は、ウイルスの不活化の有効性が重要である輸血分野に由来するものであり、その理由は、ドナーから得られる生成物に由来すると考えられる汚染をなくすために不可欠だからである。
【０００９】
ＨＩＶの不活化には加熱が推奨されるが、その理由は、ウイルス源が、特に通常血液、血漿、並びに血液及び血漿由来の生成物であることが公知だからである。乾燥加熱（一定時間ｔにおける温度Ｔによる乾燥生成物の加熱）が、例えば、凍結乾燥された凝固因子の濃縮物（液状では加熱されなかった）の場合には推奨される。例えば、血中の凝固因子ＶＩＩＩの場合、ヒト血漿から抽出した後、７２〜９６時間、６０℃で凍結乾燥された形で加熱工程に供することにより、血友病患者の治療用のこの生物学的活性物質の安全性を担保する。しかしながら、かかる熱非働化にもかかわらず、血友病患者においてＨＩＶ感染による汚染のケースが報告されているため、乾燥加熱によるウイルスの不活化工程では不十分であることが明らかとなっている。
【００１０】
ゆえに、これらの生成物をいわゆる「シビア」な加熱条件（８０℃の温度で７２時間、乾燥加熱）に供することが提案されている。
【００１１】
このウイルスの不活化方法はその後、この方法で処理された因子ＶＩＩＩにおいて得られた臨床成績に基づき、ＨＩＶ（エンベロープ型ウイルス）において有効性が確認されている（非特許文献１）。
【００１２】
精製タンパクを溶媒及び界面活性剤の混合物で処理することが、生物学的給源に由来するタンパクによる、エンベロープ型ウイルスによる感染防止において通常用いられている（非特許文献２）。かかる処理は、脂質エンベロープを有するウイルスに対して効果的であるが、この種の構造を有さないウイルスに対しては効果が少ない。最近、溶媒／界面活性剤で処理された生物学的製剤の使用による、非エンベロープ型ウイルスの感染への使用に関して報告がなされている。すなわち、Ａ型肝炎ウイルス（非エンベロープ型ＲＮＡウイルス）では、溶媒／界面活性剤で処理された第ＶＩＩ因子の使用においても、患者におけるウイルス感染が検出されている（非特許文献３）。第ＶＩＩＩ因子はまた、非エンベロープ型のパルボウイルス（Ｂ１９）の感染にも関与していることが報告されている（非特許文献４）。
【００１３】
精製されたタンパク質の熱処理は、ウイルス不活化スペクトラムを非エンベロープ型のウイルスまで広げるために推薦されている。しかしながら、非エンベロープ型のウイルスの熱非働化は、エンベロープ型ウイルスの場合より通常困難であり、しばしば長い処理時間及び／又は高い温度が、良好な不活化のためには必要となる。Ｂ１９は、１００℃で３０分間乾燥加熱した因子ＶＩＩＩを介して、患者に感染することが報告されている（非特許文献５）。
【００１４】
したがって、ウイルスの不活化方法をいかに改善することにより、生物学的製剤の安全性を維持又は強化できるかを解明することが何より重要である。
【００１５】
（背景技術）
多くの研究者は、乾燥加熱によるウイルスの不活化に影響しうる主要パラメータの発見をこれまで行ってきた。その目的は、ある種の処理方法が、その処理を受けた固体成分に適するか否かに関する予測を可能にするための物理化学パラメータを定義すること、すなわち、当該方法により、生成物の良好な安定性を維持しつつ、充分な効力でウイルスを非働化できるか否かを判定できるパラメータを定義することである。更に、このパラメータがウイルスの不活化若しくは生成物の安定性を維持するために調節可能でありえる場合、それは極めて興味深いと考えられる。
【００１６】
ウイルスの不活性化工程におけるウイルス減少係数は、乾燥加熱によるウイルスの不活化が減少する際の因子と定義され、すなわち、不活化工程前における乾燥加熱によるウイルスの不活化と、不活化工程後における乾燥加熱によるウイルスの不活化との比率の常用対数として表される。
【００１７】
含水量は、生成物１００ｇに含まれる水の重量として定義される。ゆえに、それは全重量に対するパーセンテージとして表される。従来の測定方法は、１００℃以上の温度で加熱した後で、その重量が一定となるまでの間の、生成物重量の減少を測定することに基づくものである。
【００１８】
Ｗｉｌｋｏｍｍｅｎ（パウル エールリッヒ研究所）らは、低い含水量（＜０．８％）を含有する凍結乾燥物の場合、８０℃、７２時間の加熱によって得られたＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の減少係数が０〜０．４ｌｏｇ１０であり、一方、比較的高い含水量（０．８％＞）を有する凍結乾燥物の場合、同じ条件において、得られたＡ型肝炎ウイルスの減少係数が４．３ｌｏｇ１０以上であることを示している。
【００１９】
Ｂｕｎｃｈらは（Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ社）、８０℃で７２時間加温したときに、２つの組換えＶＩＩＩ因子中のＡ型肝炎ウイルスのサンプルの減少係数が≧６．９ｌｏｇ１０であったことを報告している。
【００２０】
Ｒｏｂｅｒｔｓ ＰＬらは、生物学的製剤の組成、並びに、因子ＶＩＩＩの２つの凍結乾燥濃縮物を８０℃で７２時間加熱して２つのパルボウイルス（ウシ及びイヌ）を不活化させたときのウイルス抵抗性による影響に関して開示している（非特許文献６）。
【００２１】
Ｈａｒｔ ＨＦらは、８０℃で２４時間、又は９０℃で２時間の加熱した因子ＶＩＩＩの凍結乾燥物において、同様の、Ａ型肝炎ウイルスの減少係数を得ている（非特許文献７）。
【００２２】
Ｔｏｍｏｋｉｙｏら（非特許文献８）は、各種ウイルスの不活化（因子ＶＩＩａの凍結乾燥物中の、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＶＤＶ（ウシウイルス性下痢症ウイルス）、ＰＰＶ（ブタパルボウイルス））を行い、凍結乾燥物中のそれらのウイルスの不活化は６５℃で可能であることを示している。すなわち、ＰＰＶを除く全てのウイルスでは、＜１．７％の含水量の生成物の、６５℃で９６時間にわたる加熱により、＞４ｌｏｇ１０という、致命的な減少係数を示した。
【００２３】
特許文献１では、７２〜７７時間の８０℃の乾燥加熱工程によるウイルスの不活化の有効性において重要な要素は、処理済みの乾燥状態の生物学的製剤中の含水量であることを開示している。試験したウイルスは、ＨＡＶ、ブタパルボウイルス及び仮性狂犬病ウイルスである。その発明者らは、この工程を使用して≧４ｌｏｇ１０のウイルス減少係数とするためには、残留水分含量が０．８％以上でなければならないことを示している。残留水分含量が≦０．８％では、平均ウイルス減少係数は０．１２ｌｏｇ１０である。
【００２４】
（技術的課題）
これらの断片的な結果を総合すると、パラメータは確定しなかったが、言い換えると、その決定により、処理される生物学的製剤に応じて使用される乾燥加熱に基づく、ウイルス不活化工程において、操作上の変数を確実に決定することが可能となると考えられる。
【００２５】
にもかかわらず、処理される生成物の水分含量が非常に重要な役割を演ずるという事実に関しては、上記研究者間でもある程度のコンセンサスが得られているようであるが、良好なウイルスの不活化を得る閾値として残留水分含量に関してはコンセンサスが得られていない。実際、この数値が数桁減少するだけで、不完全な不活化となることもしばしば生じる。
【００２６】
しかしながら、ある研究者が報告する内容とは対照的に、本発明者らは、ウイルスの不活化は、水分含量のきわめて少ない凍結乾燥物において効率的に行われうることを示した。すなわち、０．１％の残留水分を有するヒト線維素原の冷凍乾燥製剤を、７７℃で７２時間乾燥加熱し、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）及びプバパルボウイルス（ＰＰＶ）で得られた減少係数を以下の表１に示す。
【００２７】
表１：
ウイルス 減少係数
ＨＡＶ ４．１０±０．３０
３．７５±０．２６
ＨＩＶ ４．５３±０．３６
４．６２±０．３０
４．８８±０．２８
ＢＶＤＶ ５．９６±０．４０
５．２１±０．３８
ＰＰＶ ２．９７±０．４３
２．８８±０．３７
【００２８】
しかしながら、これらの結果から観察されるデータの散乱より、以下の結論しか導き出すことができなかった：処理された生成物の残留水分は、乾燥加熱によるウイルスの不活化の結果にとっては決定的な因子でないが、但し、その決定因子が深く関与するものとして考えれば、重要な因子であると考えられる。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０８４４００５号公報
【非特許文献１】Ｌ．Ｗｉｎｋｅｌｍａｎら、Ｓｅｖｅｒｅ Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｕｒｒ．Ｓｔｕｄ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．［１９８９］５６：５５−６９
【非特許文献２】Ｐｉｅｔら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ［１９９０］３０：５９２−９８
【非特許文献３】Ｐｕｒｃｅｌｌら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ［１９９４］６７：２−７
【非特許文献４】Ｌｅｆｒｅｒｅら、Ｌａｎｃｅｔ［１９９４］３４３：２１１−１２
【非特許文献５】Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏら、Ｌａｎｃｅｔ［１９９４］３４３：７９８
【非特許文献６】Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ［２０００］Ｓｅｐｔ、２８（３）：１８５−８ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ ａｎｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ ａｎｄ Ｄｒｙ−Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｔｗｏ Ｈｉｇｈ−Ｐｕｒｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ
【非特許文献７】Ｖｏｘ Ｓａｎｇ［１９９４］６７（４）：３４５−５０ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ （Ｄｒｙ） Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ Ｎｏｎ−Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ
【非特許文献８】Ｖｏｘ Ｓａｎｇ［２００３］ Ｊａｎ、８４（１）：５４−６４ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
以上より、本発明の課題は、不十分なウイルスの不活化と、十分なウイルスの不活化を区別する閾値を提供できる、測定可能な多因子性の物理化学的パラメータを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
驚くべきことに、発明者らは、この測定可能な物理化学パラメータが、処理しようとする生物学的製剤のガラス転移温度であることを見出した。
【００３１】
ガラス転移は二次転移であり、すなわち、潜熱でない、熱容量変化を伴う熱的転移のことである。それは、結晶化を防止するために迅速に低温に冷却され、それにより、ガラス若しくはアモルファスポリマー、又は結晶性高分子のアモルファスの一部を形成する、硬い脆弱な状態から、柔軟な状態に転移する際の、いわゆる過冷却された液体に見られる特徴である。
【００３２】
ガラス転移温度又はＴｇは、ガラス転移が発生する温度である。
【００３３】
ポリマーがこの温度以下に冷却されると、ガラスのように硬く脆い状態になり、それはれはガラス状態と呼ばれる状態である。
【００３４】
ポリイソプレン及びポリイソブチレンのような弾力性ゴムは、すなわちそれらがゴム状の柔軟な状態のとき、それらのガラス転移温度以上の温度で用いられる。
【００３５】
当業者にとり、ガラス転移温度は、ある具体的なパラメータセットに依存することが公知である。ポリマーの場合、それはそれらの分子量、鎖の化学構造及び含まれる可塑剤の量に依存する。
【００３６】
可塑剤は小分子（塩など）であり、ポリマー間の分子をインターカレートし、それらが互いに摺動するのを補助し、それによりそれらの分子運動を促進する。すなわち、可塑剤の添加によってガラス転移温度を低下させることができる。
【００３７】
対照的に、高分子量分子はそれらポリマー分子間の運動をブロックし、ガラス転移温度を上昇させる。
【００３８】
更に、発明者らは、ガラス転移温度が、フォン・ウィルブラント因子（ｖＷＦ）中の所与の凍結乾燥物の残留含水量に直接関連することを見出した。
【００３９】
凍結乾燥物のガラス転移温度と、その残留含水量との関係を、図１に示す。
【００４０】
したがって生物学的製剤のガラス転移温度は、活性物質の性質及び賦形剤の性質、可塑剤の有無、結晶状であるかアモルファス形状であるか、賦形剤の分子量、生物学的製剤中の残留含水量などに依存する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、乾燥状態の生物学的製剤に存在するか若しくは存在すると考えられるウイルスを乾燥加熱し、ターゲッティングすることによる、ウイルスの不活化方法であって、
ａ）処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇを測定する工程と、
ｂ）工程ａ）において測定したガラス転移温度Ｔｇ以上の乾燥加熱温度Ｔで、工程ａ）に係る、処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤を加熱する工程を含んでなる方法の提供に関する。
【００４２】
乾燥生成物とは、当業者に公知の方法（例えば凍結乾燥、真空乾燥、浸透気化法又は噴霧乾燥法）を使用して乾燥させた生成物である。
【００４３】
特に乾燥生成物は、冷凍乾燥生成物であり、すなわち、最初に生成物を凍結させ、その後、少なくとも一部の含有水分を真空条件下で昇華させることにより得られた生成物である。
【００４４】
発明者らは、加熱がＴｇ以上のとき、ウイルス減少係数及びウイルス不活化の動態が強化されることを見出している。
【００４５】
したがって、ガラス転移温度の値をあらかじめ把握することにより、不活性化工程が良好であるか、あるいは、必要に応じて当該工程を調整する必要があるか否かを予測することが可能となる。
【００４６】
乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度の測定は、この生成物のサンプルを、−５０℃〜１００℃の温度で徐々に、プログラム制御しながら増加させる試験に供し、ガラス転移を含むその状態変化を観察することにより実施される。
【００４７】
このようにして、乾燥状態の生物学的製剤のサーモグラム、及び特にそのガラス転移温度を測定する。
【００４８】
ガラス転移温度の測定の後、従来の熱ベースのウイルス不活化方法を使用する当業者であれば、Ｔ≧Ｔｇの要件を満たすにあたり：
− Ｔｇが対象となるウイルスにとり良好である（温度Ｔ＞−Ｔｇを選択）か、又は、
− 検討しているウイルスの失活及び生成物の安定性が十分となることが確実となるＴを選択することができるようにＴｇを調整する必要があるか否かを判断することが可能となる。
【００４９】
例えば、当業者が、目的のウイルスの不活化温度Ｔｇが低すぎる（例えばＴｇ≦Ｔ）と考え、また安定性を向上させたいと考える場合には、その当業者は、Ｔが当該ウイルスの不活化が可能であることが公知の温度範囲になり、またＴとＴｇとの差が、生成物の分解をもたらさない程度となるようにＴｇを上昇させることができる。
【００５０】
一方では、当業者が、そのＴｇが高すぎる（Ｔ≧Ｔｇ）と考え、また生成物の安定性を維持したと考える場合には、Ｔが選択される前にＴｇを低下させることができる。
【００５１】
本発明に係る、乾燥加熱による生物学的製剤のウイルスの不活化方法は、特に非エンベロープ型のウイルスの場合に好適である。
【００５２】
この工程は、乾燥状態の生物学的製剤として、１つ以上の血液−血漿から抽出されたタンパク質を含有する組成物を処理する際に用いることができる。
【００５３】
具体的実施形態では、乾燥加熱温度Ｔは、非エンベロープ型のウイルスの不活化を可能にする態様で選択される。
【００５４】
好適な方法では、生物学的製剤に対する高分子量賦形剤の添加によって、又は生物学的製剤の含水量を減少させることによってガラス転移温度を上昇させる。一方、生物学的製剤に塩又は低分子量の賦形剤を添加することによって、又は、生物学的製剤中の含水量を増加させることによってガラス転移温度を低下させる。
【００５５】
特に、ガラス転移温度は、スキャン差動的な温度アナライザ（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒｍｏａｎａｌｙｓｅｒ）を使用して測定される。状態変化とは、測定の際の温度領域では状態変化を起こさない不活性生成物に関して測定した場合の、熱容量の変化として定義される。
【００５６】
本発明の方法に係る加熱温度Ｔは、生成物の安定性を良好に維持するためには、Ｔｇ〜Ｔｇ＋２０℃の範囲であることが好適である。この範囲において、Ｔｇ〜Ｔ（最大Ｔｇ＋２０℃）の差が増加し、ウイルス減少係数及びウイルスの不活化の動態が促進されるようにＴを選択してもよく、又は、Ｔｇ〜Ｔの差が減少し、生成物の安定性が維持されるようにＴを選択してもよい。
【００５７】
特に好適な方法では、ウイルス減少係数≧３ｌｏｇ１０（好ましくは４ｌｏｇ１０）となるように乾燥加熱温度Ｔを選択する。
【００５８】
具体的実施形態では、最終工程において、乾燥され、処理された生物学的製剤のウイルス不活化効率を測定し、前記有効性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔ〜前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化を実施する。
【００５９】
他の具体的実施形態では、最終工程において、乾燥された処理済みの生物学的製剤の安定性を評価し、前記安定性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔ〜前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化を実施する。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞：乾燥加熱による凍結乾燥物中のバクテリオファージＰＲ７７２の不活性化
凍結乾燥物の物理的性質を修飾し、ガラス転移温度（ｔｇ）を調整した。
【００６１】
ガラス転移温度を、スキャン差動的温度測定器を使用して測定した。スキャン差動的温度測定器の温度を、インジウム（Ｔｍ＝１５６．６℃）及びｎ−オクタデカン（Ｔｍ＝２８．２℃）を使用して校正した。サンプルを、２０℃／分の温度変化率で、−５０℃〜１３０℃の温度変化に供した。液体窒素を用い、室温以下の温度での試験を実施した。ガラス転移温度は、見かけの比熱における、吸熱変化のメジアン温度とした。測定を２度実施し、平均値をＴｇとした。
【００６２】
加熱は、Ｔｇ（すなわち固体（ガラス）状態）以下の温度、又はＴｇ（すなわち粘弾性（ゴム状）状態）から約２０℃高い温度で行った。
【００６３】
全ての凍結乾燥物は、１％未満の水分含量であった。
【００６４】
水分含量はカールフィッシャー法を使用して測定した（水とヨウ素の反応に基づく、当業者に公知の方法）。
【００６５】
生成物Ａの組成（ｐＨ７．０±０．５）
− グリシン：７．５ｇ／ｌ
− リシン塩酸：５．５ｇ／ｌ
− ＣａＣｌ２：０．１５ｇ／ｌ
− マンニトール：４０ｇ／ｌ
− スクロース５０ｇ／ｌ
− ＦＶＩＩＩ：１００ＩＵ／ｍｌ。
生成物Ａは６２℃のＴｇであった。
【００６６】
生成物Ｂは、ＮａＣｌを添加した以外、生成物Ａと同じ組成とした。これにより、Ｔｇが〜約４０℃に減少した（同じ湿度ＲＭ）。
【００６７】
Ｃは冷凍乾燥させたｖＷＦ濃縮物であり、Ｄは冷凍乾燥させたヒト線維素原である。
【００６８】
生成物Ｃの組成（ｐＨ７．０±０．５）
− クエン酸三ナトリウム：１０ｍＭ
− ＣａＣｌ２：１ｍＭ
− グリシン：５ｇ／ｌ
− アルギニン塩酸：４０ｇ／ｌ
− アルブミン：１０ｇ／ｌ
− ｖＷＦ：１００ＩＵ／ｍｌ。
【００６９】
生成物Ｄの組成（６．８＜ｐＨ＜７．２）
− フィブリノーゲン：１１〜２０ｇ／ｌ
− 塩酸アルギニン：４０ｇ／ｌ
− イソロイシン：１０ｇ／ｌ
− グリシン：２ｇ／ｌ
− リシン一塩酸塩：２ｇ／ｌ
− クエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ：２．５ｇ／ｌ。
生成物Ｃ及びＤは、それぞれ８０℃及び９０℃のＴｇ値であった。
【００７０】
バクテリオファージＰＲ７７２の減少係数は、６２℃及び８０℃で、１２、２４及び７２時間加熱し、測定した。
【００７１】
乾燥加熱によるウイルスの不活化は、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｇａｚｅｔｔｅ Ｎｏ８４，Ｍａｙ ４ １９９４、及びＳｃｈｍｉｄｔ，Ｎ．Ｊ．＆ Ｅｍｍｏｎｓ，Ｒ．Ｗ．（１９８９） ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに記載のように、Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｋａｒｂｅｒ式を使用して算出した。
【００７２】
減少係数を、不活化工程前における乾燥加熱によるウイルスの不活化（ｍｌ当たり）と、不活化工程後における乾燥加熱によるウイルスの不活化（ｍｌ当たり）との比率として表した。
【００７３】
結果を、図２及び３においてグラフとして示す。
【００７４】
試験の結果Ｔ＝８０℃で加熱した場合、
１．生成物Ａ（Ｔｇ＝６２℃（Ｔ−Ｔｇ≒２０℃））では、不活化は非常に急速であり、減少係数は、２４時間以内に４ｌｏｇ１０に到達した。
２．生成物Ｃ（Ｔｇ＝Ｔ）では、減少係数は７２時間後に４ｌｏｇ１０に到達した。
３．生成物Ｄ（Ｔｇ＝９０℃）では、減少係数は、７２時間後に４ｌｏｇ１０に到達した。
Ｔ＝６２℃で加温した場合、
１．生成物Ａ（Ｔｇ＝Ｔ）では、減少係数は７２時間後に４ｌｏｇ１０に到達した。
２．生成物Ｂ（Ｔｇ＝４０℃（Ｔ−Ｔｇ≒２０℃））では、不活化の動態が非常に迅速であり、減少係数は２４時間以内に４ｌｏｇ１０に到達した。
【００７５】
＜実施例２＞：乾燥加熱による、凍結乾燥物中のＰＰＶの不活化
Ｔｇ＝８０℃又は９０℃の凍結乾燥物を、８０℃で、１２、２４及び７２時間加熱し、ＰＰＶ減少係数を測定した。
【００７６】
結果を、図４でグラフとして示す。
【００７７】
Ｔ＝８０℃で加熱した場合、Ｔ＝Ｔｇのとき、減少係数は約４ｌｏｇ１０であり、Ｔ＜Ｔｇのとき、減少係数は比較的低く、２ｌｏｇ１０のオーダーであった。
【００７８】
＜実施例３＞：Ｔ＝Ｔｇの乾燥加熱による、凍結乾燥物中のＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２及びＰｈｉ１７４の不活化
ＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２及びバクテリオファージＰｈｉ１７４の減少係数を、Ｔ＝Ｔｇ＝８０℃（Ｔｇ＝８０℃の凍結乾燥物の場合）で、又はＴ＝Ｔｇ＝６２℃（Ｔｇ＝６２℃の凍結乾燥物の場合）で、１２、２４及び７２時間加熱し、測定した。
【００７９】
結果を、図５及び６でグラフとして示す。
【００８０】
耐性の弱いウイルス（すなわちＨＡＶ、ＢＶＤＶ、Ｐｈｉ１７４）では、Ｔ＝Ｔｇでの加熱により、２４時間以内に４ｌｏｇ１０の減少係数に到達するのに十分であることが分かった。
【００８１】
一方、耐性の強いウイルス（すなわちＰＰＶ及びＰＲ７７２）では、約４ｌｏｇ１０に減少係数を到達させるためには、加熱時間を７２時間まで延長する必要があることが分かった。
【００８２】
その結果、これらの耐性の強いウイルスでは、目的がそれらの不活化であるため、ウイルス減少係数及びウイルスの不活化率は、加熱温度Ｔを増加させるか、又は生成物のＴｇを低下させることにより強化することができ、それによりＴとＴｇとの差が増加する。
【００８３】
更に好ましくは、Ｔ−Ｔｇの範囲を≧２０℃とすることによりウイルスの不活化率が向上し、また、Ｔ−Ｔｇの範囲を≦２０℃とすることにより生成物安定性が強化される。
【００８４】
＜実施例４＞：ガラス転移温度の関数としての、ｖＷＦ凍結乾燥物の物理化学的特性に与える、８０℃で７２時間にわたる加熱の影響
異なるガラス転移温度を有する３つのｖＷＦ凍結乾燥物を、８０℃で７２時間加熱した。様々なパラメータ（凍結乾燥物の外観、溶解時間及び得られる溶液の外観）に関して観察を行った。
【００８５】
結果を表２に示す。
【００８６】
表２
【表１】
【００８７】
加熱温度Ｔ≧Ｔｇ及びＴ−Ｔｇ≦２０℃により、生成物の安定性が一定に保持され、一方、選択された温度により、ガラス状態からゴム状態への状態変化が行われたことが示された。
【００８８】
また、加熱温度とＴｇとの更に大きな差（本試験では３８℃）は、生成物の安定性にとって好ましくないことが明らかとなった。
【００８９】
結論として、Ｔｇに近いＴを選択することにより、生成物の安定性がより好適に維持される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】Ｔｇ及びＲＭ間の相関：Ｔｇ＝ガラス遷移温度、ＲＭ＝残余物の含水量。
【図２】６２℃の乾燥加熱の後のＰＲ７７２減少係数（Ｔｇに依存する）。
【図３】８０℃の乾燥加熱の後のＰＲ７７２減少係数（Ｔｇに依存する）。
【図４】８０℃の乾燥加熱の後のＰＰＶ減少係数（Ｔｇに依存する）。
【図５】Ｔ＝Ｔｇ＝８０℃における、ＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２、Ｐｈｉ１７４減少係数。
【図６】Ｔ＝Ｔｇ＝６２℃における、ＰＰＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶ、ＰＲ７７２、Ｐｈｉ１７４減少係数。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥状態の生物学的製剤に存在するか若しくは存在すると考えられるウイルスを乾燥加熱し、ターゲッティングすることによる、ウイルスの不活化方法であって、
ａ）処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇを測定する工程と、
ｂ）工程ａ）において測定したガラス転移温度Ｔｇ以上の乾燥加熱温度Ｔで、工程ａ）に係る、処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤を加熱する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇが、乾燥加熱の前に調整される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥状態の生物学的製剤が凍結乾燥物である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記乾燥状態の生物学的製剤が、血漿から抽出される１つ以上のタンパク質を含有する組成物である、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記乾燥加熱温度Ｔが、非エンベロープ型のウイルスの不活化を可能にするように選択される、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ガラス転移温度が、高分子量の賦形剤を生物学的製剤に添加するか、又は生物学的製剤の含水量を減少させることによって上昇する、請求項２から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ガラス転移温度が、生物学的製剤に対する塩若しくは低分子量賦形剤の添加によって、又は、生物学的製剤の含水量を増加させることによって低下する、請求項２から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔｇが、スキャニング・ディファレンシャル・アナライザを使用して測定される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ＴがＴｇ〜Ｔｇ＋２０℃の間の温度である、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記乾燥加熱温度Ｔが、ウイルス減少係数≧３ｌｏｇ１０となるように選択される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記乾燥加熱温度Ｔが、ウイルス減少係数≧４ｌｏｇ１０となるように選択される、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔが、Ｔｇ〜Ｔ（Ｔｇ＋２０℃）の差を増加させ、ウイルス減少係数及びウイルス不活化率を強化させることができるように選択される、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔが、Ｔｇ〜Ｔの差を減少させ、生成物安定性を維持することができるように選択される、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれか１項記載の方法であって、最終工程において、処理された乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化の有効性が測定され、前記有効性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔと前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化が、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法に従って実施される方法。
【請求項１５】
請求項９から１３のいずれかに１項記載の方法であって、最終工程におて、処理された乾燥状態の生物学的製剤の安定性が測定され、前記安定性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔと前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化が、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法に従って実施される方法。
【請求項１】
乾燥状態の生物学的製剤に存在するか若しくは存在すると考えられるウイルスを乾燥加熱し、ターゲッティングすることによる、ウイルスの不活化方法であって、
ａ）処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇを測定する工程と、
ｂ）工程ａ）において測定したガラス転移温度Ｔｇ以上の乾燥加熱温度Ｔで、工程ａ）に係る、処理しようとする乾燥状態の生物学的製剤を加熱する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記乾燥状態の生物学的製剤のガラス転移温度Ｔｇが、乾燥加熱の前に調整される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥状態の生物学的製剤が凍結乾燥物である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記乾燥状態の生物学的製剤が、血漿から抽出される１つ以上のタンパク質を含有する組成物である、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記乾燥加熱温度Ｔが、非エンベロープ型のウイルスの不活化を可能にするように選択される、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ガラス転移温度が、高分子量の賦形剤を生物学的製剤に添加するか、又は生物学的製剤の含水量を減少させることによって上昇する、請求項２から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ガラス転移温度が、生物学的製剤に対する塩若しくは低分子量賦形剤の添加によって、又は、生物学的製剤の含水量を増加させることによって低下する、請求項２から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔｇが、スキャニング・ディファレンシャル・アナライザを使用して測定される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ＴがＴｇ〜Ｔｇ＋２０℃の間の温度である、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記乾燥加熱温度Ｔが、ウイルス減少係数≧３ｌｏｇ１０となるように選択される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記乾燥加熱温度Ｔが、ウイルス減少係数≧４ｌｏｇ１０となるように選択される、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔが、Ｔｇ〜Ｔ（Ｔｇ＋２０℃）の差を増加させ、ウイルス減少係数及びウイルス不活化率を強化させることができるように選択される、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔが、Ｔｇ〜Ｔの差を減少させ、生成物安定性を維持することができるように選択される、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれか１項記載の方法であって、最終工程において、処理された乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化の有効性が測定され、前記有効性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔと前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化が、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法に従って実施される方法。
【請求項１５】
請求項９から１３のいずれかに１項記載の方法であって、最終工程におて、処理された乾燥状態の生物学的製剤の安定性が測定され、前記安定性が不十分であると考えられる場合、前記加熱温度Ｔと前記ガラス転移温度Ｔｇとの間の差を増加させた後に、乾燥状態の生物学的製剤のウイルスの不活化が、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法に従って実施される方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５１９９２０（Ｐ２００９−５１９９２０Ａ）
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５０４８（Ｐ２００８−５４５０４８）
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２８１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７１８４５
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０８１６８８１５）ラボラトワール フランセ デュ フラクションヌメント エ デ バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２８１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７１８４５
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０８１６８８１５）ラボラトワール フランセ デュ フラクションヌメント エ デ バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (5)
【Ｆターム（参考）】
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