二相反応媒体におけるパラ−ヒドロキシケイ皮酸の生体触媒的脱炭酸によってパラ−ヒドロキシスチレンを製造するための方法
パラ−ヒドロキシケイ皮酸からパラ−ヒドロキシスチレンを製造するための生体触媒的方法について記載する。本方法では、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用し、二相反応媒体においてパラ−ヒドロキシケイ皮酸の脱炭酸を触媒して、パラ−ヒドロキシスチレンを製造させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の有機相中に抽出する。本方法では、酵素供給源の阻害産物への暴露が減少するため、高収量のパラ−ヒドロキシスチレンが生じる。産物は、抽出剤から容易に回収されるか、または回収前に、抽出剤において直接化学的に誘導体化してもよい。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００３年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／４６２，８２７号明細書および２００４年２月１７日に出願された米国仮出願第６０／ 号明細書の利益を主張し、その内容全体は参照として本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、二相反応媒体において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸からパラ−ヒドロキシスチレンを製造させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
パラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）は、広範な産業アプリケーションにおいて潜在的有用性を有する芳香族化合物である。例えば、ｐＨＳおよびそのアセチル化誘導体、パラ−アセトキシスチレン（ｐＡＳ）は、樹脂の生成のためのモノマー、エラストマー、粘着剤、被覆剤、自動車用仕上げ剤、インクおよび電子材料、ならびにエラストマーおよび樹脂処方における添加物としてのアプリケーションを有する。
【０００４】
ｐＨＳの化学合成のための多くの方法が公知である。例えば、ｐＨＳは、５工程プロセスにおいてエチルベンゼンから（特許文献１）または２工程プロセスにおいてパラ−ヒドロキシアセトフェノールから（特許文献２）製造することができる。これらの方法によって、ｐＨＳを作製することも可能であるが、それらは、典型的に、強力な酸性または塩基性反応条件、高い反応温度を要し、大量の所望されない副産物を生じる。さらに、化学的方法は、高価な出発物質を要し、ｐＨＳを製造するためのコストを引き上げる。ｐＨＳの広範な用途にもかかわらず、安価な材料供給源は開発されていない。
【０００５】
グルコースなどの簡単な炭素源からのｐＨＳの製造のための生物学的プロセスは、ベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）ら（特許文献３）によって記載されている。該開示では、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子かまたはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子のいずれか一方と組み合わせた、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する組換え宿主細胞を使用して、ｐＨＳを製造する。ＰＡＬ活性は、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ［ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）およびＰ−４５０レダクターゼ］系の存在下で、フェニルアラニンをパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）に変換する。高いＴＡＬ活性を有する酵素は、中間工程をなんら伴うことなく、チロシンを直接ｐＨＣＡに変換する。次いで、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）は、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換する。しかし、ｐＨＳの生物学的製造によって遭遇する問題は、最終産物の阻害であって、製造収量が制限される。具体的には、産物の濃度が上昇すると、微生物による産物の製造率は減少する。さらに、発酵培地において所定の臨界濃度に到達すると、産物によってＰＤＣ酵素および微生物が不活化される。
【０００６】
ｐＨＳによる最終産物阻害を軽減するための１つのアプローチは、二相抽出発酵を使用することであり、ここで、同時係属中の特許文献４においてベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）らにより記載のように、ｐＨＳが決して阻害または臨界濃度に到達することがないように、組換え製造宿主によって製造されるｐＨＳは、発酵中に非混和性有機相に抽出される。該開示に記載の方法は、ｐＨＳの改善された収量を生じた。しかし、商業的アプリケーションでは、さらに高い収量が求められる。
【０００７】
哲士（Ｔｅｔｓｕｊｉ）ら（特許文献５）は、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）から単離されたＰＤＣを使用して、ｐＨＣＡから、ビニル位に重水素原子を有するｐＨＳを製造するための方法を記載している。デカルボキシラーゼ反応は、重水素を含む水を含有する水性緩衝液中で行われる。特許文献６においてアゴ（Ａｇｏ）らは、フェルラ酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用し、水性緩衝液において、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）から４−ビニルグアイアコール（４−ヒドロキシ−３−メトキシスチレン）、ｐＨＳの誘導体を製造するための方法について記載している。これらの両方の方法における製造収量は、酵素の産物阻害によって制限される。さらに、産物は、基質、生体触媒、および緩衝液の塩から単離しなければならないため、産物の回収は複雑になる。
【０００８】
二相反応媒体においてｐＨＣＡからｐＨＳを製造させるための生体触媒的方法は、ｐＨＣＡおよびｐＨＳの製造を切り離し、従って、独立して、両方のプロセスの最適化を確実にする。生体触媒における、水相および水非混和性有機相よりなる二相反応媒体の使用は、動力学および熱力学的利点の両方を提供することができる（非特許文献１）。有機溶媒を適切に選択すれば、産物は水相から継続的に取り出され、従って、産物阻害が減少し、より高い製造収量が生じる。さらに、産物を有機相から容易に単離できるため、産物の回収は顕著に簡便化される。非特許文献２は、二相生体触媒プロセスを使用して、フェルラ酸デカルボキシラーゼ活性を有するバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）の細胞を休止させることによる、フェルラ酸の脱炭酸を介する４−ビニルグアイアコール（４−ヒドロキシ−３−メトキシスチレン）、ｐＨＳの誘導体の製造について記載している。クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、エチルエーテル、石油エーテル、シクロヘキサン、およびＣ５〜Ｃ８アルカンを含むいくらかの溶媒が評価された。ヘキサンは好適な溶媒として選択された。しかし、二相反応媒体においてＰＤＣ活性を有する酵素供給源を使用するｐＨＣＡからのｐＨＳの製造については、該開示には記載されていない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，５０３，２７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５２３，３７８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００１８６００号明細書
【特許文献４】米国特許出願第６０／４６２８２７号明細書
【特許文献５】特開平１１−１８７８７０号公報
【特許文献６】米国特許第５，９５５，１３７号明細書
【非特許文献１】ブルース（Ｂｒｕｃｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．７：１１６−１２４（１９９１）
【非特許文献２】リー（Ｌｅｅ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２３：２６１−２６６（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、高収量でｐＨＳを製造させるための方法の必要性が存在する。生体触媒の活性が保存されるｐＨＳを製造させるための生体触媒方法の必要性もまた存在する。商業的に実行可能であるべき方法のために、複数の反応サイクルにわたって生体触媒を再利用することが可能であることも所望される。
【００１１】
本出願人らは、二相反応媒体においてパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用し、ｐＨＣＡのｐＨＳへの生体触媒変換を使用して、ｐＨＳを高収量で製造させるための方法を発見することによって、上記の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、二相反応媒体におけるパラ−ヒドロキシケイ皮酸の生体触媒的脱炭酸によって、パラ−ヒドロキシスチレンを製造させるための方法を提供する。１つの実施態様では、本発明は、
ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を準備し；
ｂ）水相、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノールおよびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、該酵素供給源と、パラ−ヒドロキシケイ皮酸とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｃ）水相から抽出剤を分離し；そして
ｄ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法を提供する。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造する製造宿主を準備し；
ｂ）発酵培地中で製造宿主を増殖させ、ここで、製造宿主は、発酵培地中にパラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造し；
ｃ）発酵培地、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノール、およびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、工程（ｂ）由来の発酵培地と、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｄ）発酵培地から抽出剤を分離し；そして
ｅ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法を提供する。
【００１４】
配列の説明
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００１５】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００１６】
配列番号１は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｄｃ１）のヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号２は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１）のアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号３は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｄｃ２）のヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号４は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ２）のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号５〜８は、実施例１に記載のように、ｐｄｃ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号９〜１２は、実施例６に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８を構築するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号１３および１４は、実施例６に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８の首尾よい構築物を確認するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、二相反応媒体において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する酵素供給源を使用する、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）からのパラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）の製造のための方法を提供する。二反応媒体の有機相に抽出される酵素供給源の阻害産物への暴露の減少のため、この方法は、ｐＨＳの高い製造収量を生じる。さらに、方法は、酵素活性の優れた保存および多くの反応サイクルのための酵素供給源の再利用を提供する。ｐＨＳおよびそのアセチル化誘導体、パラ−アセトキシスチレンは、樹脂の生成のためのモノマー、エラストマー、粘着剤、被覆剤、自動車用仕上げ剤、インクおよび電子材料、ならびにエラストマーおよび樹脂処方における添加物としてのアプリケーションを有するため、該方法が使用される。
【００２４】
以下の定義が本明細書において使用され、特許請求の範囲および明細書の解釈のために照会されるべきである。
【００２５】
「ＣＡ」は、ケイ皮酸に使用される略語である。
【００２６】
「ｐＨＣＡ」は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸塩またはｐ−クマル酸としても公知であるパラ−ヒドロキシケイ皮酸に使用される略語である。
【００２７】
「ｐＨＳ」は、４−ビニルフェノールとしても公知であるパラ−ヒドロキシスチレンに使用する略語である。
【００２８】
「ＰＤＣ」は、ｐＨＣＡデカルボキシラーゼに使用される略語である。
【００２９】
「ＰＤＣ１」は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐＨＣＡデカルボキシラーゼに使用される略語である。
【００３０】
「ＰＤＣ２」は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐＨＣＡデカルボキシラーゼに使用される略語である。
【００３１】
「ｐｄｃ」は、ＰＤＣ活性を伴う酵素をコードする遺伝子に使用される略語である。
【００３２】
「ｐｄｃ１」は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ遺伝子の略語である。
【００３３】
「ｐｄｃ２」は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ遺伝子の略語である。
【００３４】
「ＴＡＬ」は、チロシンアンモニアリアーゼに使用される略語である。
【００３５】
「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼに使用される略語である。
【００３６】
「ＰＡＨ」は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼに使用される略語である。
【００３７】
用語「ＴＡＬ活性」は、チロシンからｐＨＣＡへの直接変換を触媒するタンパク質の能力を指す。
【００３８】
用語「ＰＡＬ活性」は、フェニルアラニンからケイ皮酸への変換を触媒するタンパク質の能力を指す。
【００３９】
「ｐａｌ」は、ＰＡＬ活性を伴う酵素をコードする遺伝子を表す。
【００４０】
「ｔａｌ」は、ＴＡＬ活性を伴う酵素をコードする遺伝子を表す。
【００４１】
用語「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」は、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の両方を含有するタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、酵素基質として、チロシンおよびフェニルアラニンの両方に少なくともいくつかの特異性を有する。
【００４２】
用語「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの触媒的変換を担うタンパク質系を指す。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ機能を実施する当該分野において既知のいくらかの酵素または酵素系の１つである。本明細書において使用する用語「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの変換を生じる一般的な酵素活性を指し、ここで、用語「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する特定のバイナリータンパク質を指す。
【００４３】
用語「二相反応媒体」は、水相および適切な量の抽出剤を含んでなる媒体を指す。
【００４４】
用語「水相」は、水性緩衝液、非緩衝化水溶液、発酵培地、または発酵上清を含むがこれらに限定されない水溶液を指す。
【００４５】
用語「抽出剤」は、ｐＨＳを溶解することができる溶媒を指す。本発明の典型的な抽出剤は水非混和性有機溶媒である。
【００４６】
用語「有機溶媒」は、二反応媒体において抽出剤としての役割を果たす有機溶媒を指す。
【００４７】
用語「増殖培地」および「発酵培地」は本明細書において交換可能に使用され、微生物を培養するための栄養物を含有する水溶液を指す。増殖培地は、さらに、微生物、微生物によって製造される産物、代謝中間体、ならびに塩、ビタミン、アミノ酸、補因子、および抗生物質などの他の成分を含有することができる。
【００４８】
用語「発酵上清」は、発酵が完了した後の発酵培地を指し、ここで、製造宿主および不溶生産物は、遠心分離またはろ過を含むがこれらに限定されない既知の方法によって取り出される。
【００４９】
用語「分配係数」とは、産物の有機溶媒への抽出のための平衡定数、具体的には、Ｋ＝［産物］有機相／［産物］水相を指す。
【００５０】
溶媒の「ｌｏｇＰ値」は、標準的なオクタノール：水混合物における溶媒の分配係数の対数を指す。ｌｏｇＰ値は、溶媒の極性の量的測定値を提供する。
【００５１】
用語「発酵可能な炭素基質」は、本発明の宿主生物体により代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖、オリゴ糖、多糖、および単炭素基質および／またはこれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。
【００５２】
「核酸」は、糖、ホスフェートおよびプリンもしくはピリミジンのいずれか一方を含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成される一本鎖または二本鎖であり得る分子を指す。細菌、下等真核生物、および高等動物および植物では、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は遺伝子材料を指す一方、「リボ核酸」（ＲＮＡ）はＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与する。
【００５３】
所定の部位での化学的に等価なアミノ酸の生成を生じるが、コードされるタンパク質の機能的目的には影響を及ぼさない遺伝子の変更は一般的であることが、当該分野において周知であるため、本発明は、特定の例示的配列以上のことを包含する。本発明の目的のために、置換が、以下の５つのグループのうちの１つの交換として規定される：
１．小さな脂肪族、非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性、負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；ならびに
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００５４】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンを、（グリシンのような）別の疎水性のより小さな残基、または（バリン、ロイシンもしくはイソロイシンのような）より疎水性の大きな残基をコードするコドンにより置換してよい。同様に、（グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような）１個の負に荷電した残基の別のものへ、または（アルギニンの代わりにリジンのような）１個の正に荷電した残基の別のものへの置換をもたらす変化もまた、機能的に等価な産物を生じさせることを期待することも可能である。多くの場合、タンパク質のＮ末端およびＣ末端部分の変更をもたらすヌクレオチド変化もまた、該タンパク質の活性を変更しないことが期待される。
【００５５】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。本明細書において使用する遺伝子は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含んでもまたは含んでいなくてもよい。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかし、これは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００５６】
「コード配列」は特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００５７】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対し３’側に配置される。プロモーターはそっくりそのまま生来の遺伝子に由来してよいか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の多様なエレメントから構成されてよいか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含んでなることができる。多様なプロモーターは、多様な組織もしくは細胞型において、または発生の多様な段階で、あるいは多様な環境もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることが、当業者に理解される。大部分の時間で大部分の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは普遍的に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、多様な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００５８】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現を影響することができる（即ち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結されている。コード配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結することができる。
【００５９】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体のゲノムへの変換を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と称される。
【００６０】
「野生型宿主細胞」または「生来の宿主細胞」は、生物体の本来または生来のバージョンである宿主生物体、即ち、形質転換されていない生物体を指す。
【００６１】
用語「酵素供給源」は、精製されたまたは部分的に精製された酵素自体、酵素活性を有する野生型または組換え宿主細胞、当該分野において公知の手段によってそのような細胞から得られる無細胞抽出物、および酵素活性を有する処置された野生型または組換え宿主細胞を含むがこれらに限定されないＰＤＣ活性を有する供給源を指す。
【００６２】
用語「処置された野生型宿主細胞」および「処置された組換え宿主細胞」は、それぞれ、野生型宿主および組換え宿主細胞を指し、洗浄、凍結乾燥、アセトンによる処置、または臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などの界面活性剤；トルエン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒；ならびに抗生物質による浸透化処理を含むがこれらに限定されない手段によって処置されている。
【００６３】
用語「生体触媒」は、特定の反応を触媒するために必要とされる活性を有する酵素供給源を指す。本発明では、用語「生体触媒」は、ｐＨＣＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を指す。
【００６４】
用語「生体触媒反応」は、酵素供給源によって触媒される反応を指す。本発明では、用語「生体触媒反応」は、ｐＨＣＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源によって触媒されるｐＨＳを生じるｐＨＣＡの脱炭酸を指す。
【００６５】
本明細書において使用する用語「発現」とは、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産物への転写および翻訳を意味することが意図される。発現では、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖が、最初に、しばしばメッセンジャーＲＮＡである相補ＲＮＡに転写され、次いで、遺伝子産物がタンパク質である場合、転写されたメッセンジャーＲＮＡは上記の遺伝子産物に翻訳される。
【００６６】
「過剰発現株」または「過剰製造株」は、野生株または非形質転換微生物における製造のレベルを超えるレベルで遺伝子産物を製造する組換え微生物を指す。
【００６７】
本明細書において使用する用語「製造宿主」は、本発明の方法における使用のためにｐＨＣＡを製造する能力を有する微生物を指す。本明細書において規定するように、製造宿主は、野生型であってもまたは組換え宿主細胞であってもよい。
【００６８】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または再結合されている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えてエレメントを有し、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、外来宿主における該遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特異的ベクターを指す。
【００６９】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの複製のために使用される技術である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，８００，１５９号明細書）。
【００７０】
本明細書において与えられたすべての範囲は、範囲の終端、およびまた中間の範囲にあるすべての要点をも含むものとする。
【００７１】
本明細書において使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）；ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニュージャージー州ホーボーケン（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）から出版されたたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【００７２】
本発明は、二相反応媒体において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する酵素供給源を使用する、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）からパラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）を製造させるための方法を提供する。ＰＤＣ酵素に対して阻害的である、製造されるｐＨＳは、二相反応媒体の有機相に抽出され、従って、水相において極めて低い濃度を維持する。ｐＨＳは、抽出剤から容易に回収するか、または回収前に抽出剤において化学的に誘導体化することができる。
【００７３】
ｐＨＣＡの供給源
本発明の方法のための出発材料、即ち、ｐＨＣＡ基質は、多くの方法によって得ることができる。例えば、トランス型が支配的であるｐＨＣＡは、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））およびＴＣＩアメリカ（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）（オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ））などの会社から市販されている。さらに、ｐＨＣＡは、当該分野において公知の任意の方法を使用して、化学合成によって製造することができる。例えば、ｐＨＣＡは、米国特許第４，３１６，９９５号明細書におけるピタット（Ｐｉｔｔｅｔ）ら、または米国特許第５，９９０，３３６号明細書におけるアレクサンドラトス（Ａｌｅｘａｎｄｒａｔｏｓ）によって記載のように、マロン酸とパラ−ヒドロキシベンズアルデヒドとを反応させることによって、得ることができる。あるいは、植物からｐＨＣＡを単離してもよい（Ｒ．ベンリーフ（Ｒ．Ｂｅｎｒｉｅｆ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：８２５−８３２（１９９８）および米国特許出願公開第２００２／０１８７２０７号明細書）。１つの実施態様では、ｐＨＣＡの供給源は、製造宿主を使用する生物生産由来である。別の実施態様では、製造宿主は、標準的なＤＮＡ技術を使用して製造することができる組換え宿主細胞である。これらの組換えＤＮＡ技術については、本明細書において参照として援用されているサンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）に記載されている。
【００７４】
ｐＨＣＡの製造のための適切な製造宿主としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様では、ｐＨＣＡの製造のための宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｉ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である。別の実施態様では、ｐＨＣＡの製造のための宿主細胞は、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかを過剰製造するこれらの細菌の変異株である。以下に記載のように、ｐＨＣＡの製造がチロシンに関与する経路を介して行われる場合、チロシン過剰製造株が使用される一方、ｐＨＣＡがフェニルアラニンに関与する経路を介して製造される場合、フェニルアラニン過剰製造株が使用される。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ならびに他の細菌のチロシン過剰製造株については、当該分野において公知である（マイチ（Ｍａｉｔｉ）ら、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ３７：５１−６５（１９９５））。使用することができるエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）チロシン過剰製造株の例は、オムニジーン・バイオプロダクツ・インク（ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．）マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から市販されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１である。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ならびに他の細菌のフェニルアラニン過剰製造株についても、当該分野において公知である（マイチ（Ｍａｉｔｉ）ら、上掲およびボンガーテス（Ｂｏｎｇａｅｒｔｅｓ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：２８９−３００（２００１））。使用することができるフェニルアラニン過剰製造株の例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＳＴ７４であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から株ＡＴＣＣ番号３１８８４として利用することができる。
【００７５】
１つの実施態様では、本明細書において参照として援用される米国特許出願公開第２００３／００７９２５５号明細書におけるチィ（Ｑｉ）らによる記載のように、ｐＨＣＡが製造される。該開示に従えば、ｐＨＣＡは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現するように操作された組換え微生物を使用して、製造させることができる。この形質転換された微生物は、グルコースなどの発酵可能な炭素源をフェニルアラニンに代謝し、該フェニルアラニンは、ＰＡＨによってチロシンに変換される。製造されるチロシンはＴＡＬ酵素によってｐＨＣＡに変換される。ＴＡＬをプロセシングする任意の適切な酵素を、使用することができる。例えば、ＰＡＬおよびＴＡＬ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）活性の両方を有する酵素を使用してもよい。また、米国特許第６，３６８，８３７号明細書におけるゲイテンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）らによって記載されているように、増強されたＴＡＬ活性を有するための野生型酵母ＰＡＬ酵素の変異を介して製造されるＴＡＬ酵素を使用してもよい。あるいは、ブリーニグ（Ｂｒｅｉｎｉｇ）ら（米国特許出願公開第２００４／００２３３５７号明細書）に記載の酵母トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）由来の誘導性ＴＡＬ酵素またはカイント（Ｋｙｎｄｔ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２：２４０−２４４（２００２））もしくはホワン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属中の米国特許出願第６０／３９７８２０号明細書、国際公開第２００４／００９７９５号パンフレット）により記載されているような細菌性ＴＡＬ酵素を使用することができる。
【００７６】
別の実施態様では、パラ−ヒドロキシケイ皮酸は、本明細書において参照として援用されるゲイテンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）ら、上掲によって開示される方法のいずれか１つによって製造される。例えば、酵母ＰＡＬ活性をコードする遺伝子および植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子を発現するように操作された組換え微生物を使用して、ｐＨＣＡを製造させることができる。この形質転換された微生物は、グルコースなどの発酵可能な炭素源をフェニルアラニンに代謝し、該フェニルアラニンは、ＰＡＬ酵素によってケイ皮酸（ＣＡ）に変換される。続いて、ＣＡは、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系の作用によってｐＨＣＡに変換される。あるいは、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を発現する組換え微生物を使用して、ｐＨＣＡを発現させてもよい。ＴＡＬ酵素は、チロシンを直接ｐＨＣＡに変換する。上掲に記載されるように、任意の適切なＴＡＬ酵素を使用することができる。
【００７７】
ｐＨＣＡの生物生産のために、使用すべき微生物を、適切な増殖培地中、発酵槽において培養する。撹拌式タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、バブル式発酵槽、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の適切な発酵槽を使用することができる。微生物培養の維持および増殖のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版は、マグロー・ヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９８６を参照のこと）。特定の遺伝子発現のための微生物の特定の要件に依存して、適切な増殖培地、ｐＨ、温度および好気的、微好気、または嫌気的条件のための要件について、考慮しなければならない。使用する増殖培地はそれほど重要ではないが、該培地は、使用する微生物の増殖を支持し、所望される産物を製造するのに必要な酵素的経路を促進しなければならない。酵母抽出物またはペプトンなどの有機性窒素および発酵可能な炭素源を含有する複合培地；無機培地；ならびに規定培地を含むがこれらに限定されない従来の増殖培地を使用することができる。適切な発酵可能な炭素源としては、グルコースまたはフルクトースなどの単糖、ラクトースまたはスクロースなどの二糖、オリゴ糖およびデンプンまたはセルロースなどの多糖、一炭素基質ならびに／あるいはそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。適切な炭素源に加えて、増殖培地は、当業者に公知のアンモニウム塩、酵母抽出物またはペプトンなどの適切な窒素源；鉱物、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有してもよい（ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、上掲）。
【００７８】
バッチまたは流加培養発酵を使用してもよい。当該分野において周知であるバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、プロセス中に人工的に変更されることはない閉鎖系である。流加培養発酵は標準的なバッチ系のバリエーションであって、ここで、栄養物、例えば、グルコースが発酵中に漸増される。栄養物の添加の量および速度は、日常的実験によって決定することができる。例えば、発酵ブロスにおける極めて重要な栄養物の濃度を発酵中にモニターしてもよい。あるいは、ｐＨ、溶存酸素、および二酸化炭素などの排出気体の分圧などのより容易に測定される因子をモニターしてもよい。これらの測定されるパラメータから、栄養物の添加速度を決定することができる。
【００７９】
ＰＤＣ活性を有する酵素供給源
ＰＤＣ活性を有する酵素は、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（ハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：２６０４−２６１２（２００１））、エルビニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）（ハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２１５−２１９（１９９３））、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、およびラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）などのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種（ファン・ビーク（Ｖａｎ Ｂｅｅｋ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５３２２−５３２８（２０００））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびハフニア（Ｈａｆｎｉａ）の種（リンドセイ（Ｌｉｎｄｓａｙ）ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．３９：１８１−１８７（１９７５））および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（キャビン（Ｃａｖｉｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１４６６−１４７１（１９９８））を含む様々な細菌において見出すことができる。１つの実施態様では、ＰＤＣ酵素の供給源は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である。別の実施態様では、ＰＤＣ酵素の供給源は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＰＤＣ２）である。
【００８０】
ＰＤＣ活性を有する有用な酵素供給源としては、精製されたまたは部分的に精製された酵素自体、酵素活性を有する野生型または組換え宿主細胞、および当該分野において公知の手段によってそのような細胞から得られる無細胞抽出物が挙げられる。１つの実施態様では、ＰＤＣ活性を有する野生型細胞は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００８１】
別の実施態様では、酵素供給源は、当該分野において公知である方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲）を使用して、ＰＤＣ酵素をコードする遺伝子で適切な宿主細胞を形質転換することによって、構築することができるＰＤＣ活性を有する組換え宿主細胞である。１つの実施態様では、ｐｄｃ遺伝子はラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）から単離され、配列番号１として付与される。別の実施態様では、ｐｄｃ遺伝子は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離され、配列番号３として付与され、使用される。ｐｄｃ遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主の細胞において製造させてもよい。
【００８２】
酵素供給源としての細菌宿主細胞
細菌の発現系および外来性タンパク質の高レベルの発現を指令する調節配列を含有する発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれも、ｐｄｃ遺伝子の製造のためのキメラ遺伝子を構築するために使用し得る。次いで、これらのキメラ遺伝子は、酵素の高レベルの発現を提供するために、形質転換を介して、適切な微生物に導入し得る。
【００８３】
従って、例えば、適切なプロモーターの制御下でのＰＤＣ酵素をコードするキメラ遺伝子の導入が、酵素の製造の増加を実証することが期待される。生来の宿主細胞ならびに異種宿主の両方においてｐｄｃ遺伝子を発現させることが有用であろうと考えられる。本発明の遺伝子の生来の宿主への導入は、ＰＤＣ酵素の現存の製造のレベルを上昇させる。さらに、ｐｄｃ遺伝子はまた、非生来の宿主細菌に導入してもよい。
【００８４】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該分野において周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自己複製もしくは染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の制御を有する遺伝子の５’側領域および転写の終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’側領域を含んでなる。両方の制御領域とも組換え宿主細胞に相同な遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、そのような制御領域は、製造宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことを理解すべきである。
【００８５】
所望の宿主細胞において、ｐｄｃの発現を駆動するのに有用である、開始制御領域またはプロモーターは多数あり、かつ当業者に馴染みである。事実上、この遺伝子を駆動することができるいかなるプロモーターも本発明に適し、これらは、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に有用）；ならびにｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での発現に有用な多様なファージプロモーターを含むが、これらに制限されない。
【００８６】
終了制御領域もまた、好適な宿主に生来の多様な遺伝子由来であり得る。場合により、終了部位は必要ではないが、しかし、含まれている場合が最も好ましい。
【００８７】
１つの実施態様では、ｐｄｃ遺伝子の発現のための好適な異種宿主細胞は、菌類または細菌ファミリー内において広範に見出すことができ、広範な範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性で増殖する微生物宿主である。例えば、任意の細菌、酵母、または糸状菌は、ｐｄｃ遺伝子の発現に適切な宿主であろうと考えられる。細胞の供給材料にかかわらず、転写、翻訳およびタンパク質の生合成装置は同じであるため、細胞バイオマスを作製するのに使用される炭素供給材料にかかわらず、機能的遺伝子が発現される。大規模微生物増殖および機能的遺伝子発現は、広範な単純あるいは複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、および／またはメタンなどの飽和炭化水素あるいは光合成もしくは化学合成独立栄養宿主の場合の二酸化炭素を利用することができる。しかし機能的遺伝子は、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素もしくは小さな無機イオンを含む任意の微量栄養物の形態および量を含み得る特定の増殖条件によって、調節、抑制または低下させることができる。さらに、機能的遺伝子の調節は、培養物に添加され、典型的に栄養またはエネルギー源とはみなされない特定の調節分子の有無によって達成することができる。増殖速度もまた、遺伝子の発現において重要な調節因子である。
【００８８】
好適な宿主株の例としては、腸内細菌（例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌；ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などのシアノバクテリア；サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母；アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアーソロボトリーズ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの糸状菌；ならびにスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）などの藻類が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様では、宿主株はエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、またはピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）である。組換え微生物細胞は上記のように培養することができる。
【００８９】
酵素供給源としての植物細胞宿主
別の実施態様では、ｐｄｃ遺伝子を含有する植物細胞を使用する。ｐｄｃ遺伝子を使用して、ＰＤＣの発現のための微生物遺伝子を発現する能力を有するトランスジェニック植物を作製することができる。好適な植物宿主は高製造レベルのＰＤＣを支持するあらゆる種類である。適切な緑色植物としては：ダイズ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、トウガラシ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ，Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＤＣ酵素の過剰製造は、最初に、発生の所望の段階で所望の組織におけるある遺伝子の発現を指令することが可能なプロモーターにコード領域が操作可能に連結されている、本発明のキメラ遺伝子を構築することにより達成することができる。便宜的理由上、キメラ遺伝子は、同一の遺伝子由来のプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなることができる。転写終了シグナルをコードする３’の非コード配列もまた提供しなければならない。キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を助長するために、１個もしくはそれ以上のイントロンを含んでなることもできる。
【００９０】
コード領域の発現を含むことが可能ないかなるプロモーターおよびいかなるターミネーターのいかなる組み合わせも、キメラ遺伝子配列に使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例として、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーターが挙げられる。使用することができる効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と操作可能に連結されているそのようなプロモーターは、本発明の遺伝子産物の発現を促進することが可能であるべきである。本発明において使用することができる高レベル植物プロモーターとして、例えば、ダイズ由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：４８３−４９８ １９８２）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが既知である（例えばＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャシュモア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、ニューヨーク州プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ，ＮＹ）（１９８３）、２９〜３８頁；コルジ，Ｇ．（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１３９９（１９８３）、およびダンスムイル，Ｐ．（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【００９１】
次いで、キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用されるであろう方法に依存する。当業者であれば、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、そして増殖させるためにプラスミドベクターに存在しなければならない遺伝子エレメントを十分に知っている。また当業者であれば、異なる独立の形質転換事象が異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすこと（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８（１９８５）；デアルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６（１９８９））、そして従って、複数の事象が、所望の発現レベルおよびパターンを表す株を得るためにスクリーニングされなければならないことも認識するであろう。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３，（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロックゼクＪ．（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析により成し遂げられ得る。
【００９２】
アプリケーションによっては、ＰＤＣ酵素を異なる細胞区画に向かわせることが有用である。従って、輸送配列（キーグストラ，Ｋ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ，Ｋ）Ｃｅｌｌ ５６：２４７−２５３（１９８９））、シグナル配列もしくは小胞体局在化をコードする配列（クリスピールズ，Ｊ．Ｊ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３（１９９１））または核局在化シグナル（ライクヘル，Ｎ（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２（１９９２））のような適切な細胞内ターゲッティング配列が付加されおよび／または既に存在するターゲッティング配列を除去した酵素をコードするようにコード配列を改変することにより、上述されたキメラ遺伝子をさらに補うことができることが予見される。引用された参照文献はこれらのそれぞれの例を与えるが、該一覧は全てを掲載しているわけではなく、そして、本発明において有用である有用性を有するより多くのターゲッティングシグナルが将来発見されてもよい。
【００９３】
植物細胞の培養は、通常、通気条件下、例えば、１５℃〜４０℃の間の温度で、１〜３０日間、振盪培養または液内通気培養によって、行われる。
【００９４】
ＰＤＣ活性を有する酵素供給源のタイプ
培養の完了後、野生型または組換え宿主細胞を、任意の既知の方法、例えば、遠心分離またはろ過によって回収し、次いで、本発明の方法におけるＰＤＣ活性の酵素供給源として使用することができる。場合により、細胞を、洗浄、凍結乾燥、または使用前のアセトンによる処置によって処置してもよい。また、細胞を、浸透化剤で処置し、それらの細胞膜を、有機化学物質に対してより浸透可能にすることもできる。適切な浸透化剤は当該分野において周知であり、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などの界面活性剤；トルエン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒；ならびに抗生物質を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
別の実施態様では、宿主細胞によって細胞内または細胞外で製造されるＰＤＣ酵素は、当該分野において周知の方法によって単離および精製される。例えば、細胞内で製造されるＰＤＣ酵素の場合、単離および精製は以下の様式で行われる。細胞を、遠心分離またはろ過を含むがこれらに限定されない既知の方法を使用して、培養培地から分離する。細胞を洗浄し、次いで、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレス、超音波破砕、ホモジナイザー、ダイノ・ミル（Ｄｙｎｏ Ｍｉｌｌ）、または当該分野において既知の他の手段を使用して破砕し、無細胞抽出物を得る。無細胞抽出物を遠心分離し、細胞破砕物を取り出す。１つの実施態様では、無細胞抽出物を、ＰＤＣ酵素活性の酵素供給源として使用する。
【００９６】
別の実施態様では、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動などを含むがこれらに限定されない当該分野において既知の方法を使用して、ＰＤＣ酵素を無細胞抽出物から精製する。ＰＤＣ酵素が細胞外で製造される場合、無細胞抽出物についての記載と同じ様式で培養細胞を処置し、精製された酵素を得ることができる。
【００９７】
別の実施態様では、野生型もしくは組換え宿主細胞、無細胞抽出物、またはＰＤＣ活性を有する精製された酵素は、使用前に固定化される。細胞および酵素の固定化の方法については、当該分野において周知である（例えば、ウィータル（Ｗｅｅｔａｌ）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第ＸＬＩＶ巻、Ｋ．モーズバッハ（Ｋ． Ｍｏｓｂａｃｈ）編、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９７６）、ビカスタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、ヒューマナ出版（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）（１９９７）、およびテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９１）を参照のこと）。例えば、ＰＤＣ活性を有する酵素供給源は、ポリマーゲルにおける包括、固体支持体上への吸着、二官能性試薬を使用する共有架橋、あるいはガラス、ポリスチレン、ナイロン、またはポリアクリル酸誘導体などの不溶性マトリックスに対する共有結合によって、固定化することができる。１つの実施態様では、無細胞抽出物または精製された酵素を、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手可能なオキシランアクリルビーズへの共有性付着によって固定する。別の実施態様では、ビカスタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）、上掲に記載のように、野生型または組換え宿主細胞を、アルギン酸カルシウムビーズにおける包括によって固定化する。場合により、包括された細胞を、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドまたは当該分野において公知の他の適切な架橋剤によって、架橋してもよい。
【００９８】
抽出剤
ＰＤＣ活性を有する酵素供給源を使用するｐＨＣＡからｐＨＳへの生体触媒変換に有用な抽出剤の選択は重要である。抽出剤は、好ましくは、本発明の方法における使用のための次の要件を満たすべきである：水における低い溶解度、産物ｐＨＳに対する大きな分配係数、基質ｐＨＣＡに対する低い分配係数、高い化学および熱安定性、非生分解性、低コスト、大量に利用できること、および産物の回収に対する好ましい特性。さらに、抽出剤は酵素供給源の酵素活性を阻害すべきではなく、酵素を回収し、複数回の変換サイクルで再使用できるように、酵素供給源は、水相および抽出剤よりなる二相反応媒体において安定であるべきである。抽出剤は、典型的に水非混和性有機溶媒である。生細胞を使用する抽出生体触媒のための溶媒選択ストラテジーについては、記載されている（ブルース（Ｂｒｕｃｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．７：１１６−１２４（１９９１））。該開示では、溶媒の生物学的適合性を、標準的なオクタノール：水混合物における溶媒の分配係数の対数であるそのｌｏｇＰ値に基づいて予測する。ｌｏｇＰ値は、溶媒の極性の量的測定値を提供する。しかし、溶媒のｌｏｇＰ値と本明細書において使用されるＰＤＣ活性の酵素供給源とのその生物学的適合性との間の相関関係は見出されなかった。本発明の方法における使用のための溶媒の生物学的適合性は、ＰＤＣ活性を有する酵素供給源を有機溶媒に暴露し、暴露後、ＰＤＣ酵素の活性を測定することによって、経験的に決定しなければならない。これらの実験では、溶媒が、阻害的であり得るいかなる不純物をも含有しないことを確実にするように配慮すべきである。適切な溶媒として、トルエン（ＣＡＳ番号１０８−８８−３、ｌｏｇＰ＝２．８）、デカン酸メチル（ＣＡＳ番号１１０−４２−９、ｌｏｇＰ＝４．４１）、２−ウンデカノン（ＣＡＳ番号１１２−１２−９、ｌｏｇＰ＝４．２１）、ヘキサン（ＣＡＳ番号１１０−５４−３、ｌｏｇＰ＝３．９）、ジクロロメタン（ＣＡＳ番号７５−０９−２、ＬｏｇＰ＝１．２５）、２−デカノール（ＣＡＳ番号１１２０−０６−５、ｌｏｇＰ＝３．７１）、４−デカノール（ＣＡＳ番号２０５１−３１−２、ｌｏｇＰ＝３．７１）、３−デカノン（ＣＡＳ番号９２８−８０−３、ｌｏｇＰ＝３．２）、４−デカノン（ＣＡＳ番号６２４−１６−８、ｌｏｇＰ＝３．２）、１−ノナノール（ＣＡＳ番号１４３−０８−８、ｌｏｇＰ＝３．３）、２−ノナノール（ＣＡＳ番号６２８−９９−９、ｌｏｇＰ＝３．２２）、２−ヘプタノール（ＣＡＳ番号５４３−４９−７、ｌｏｇＰ＝２．２４）およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のすべての溶媒は、例えば、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））から市販されている。
【００９９】
１つの実施態様では、ＰＤＣ１活性を有する酵素供給源は、デカン酸メチル、トルエン、ジクロロメタン、４−デカノール、またはそれらの混合物と共に使用される。別の実施態様では、ＰＤＣ２活性を有する酵素供給源は、トルエン、デカン酸メチル、２−デカノール、４−デカノン、２−ノナノール、ジクロロメタンまたはそれらの混合物と共に使用される。
【０１００】
ｐＨＳおよびその誘導体を製造させるための方法
上記のようにして得られるｐＨＣＡ基質は、二相反応媒体の水相としての役割を果たす適切な緩衝溶液に添加される。使用される緩衝液は、ＰＤＣ酵素の活性を維持する当該分野において公知の任意の緩衝液であり得、所望のｐＨ、典型的に、ｐＨ３．５〜８で緩衝能を提供する（キャビン（Ｃａｖｉｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１４６６−１４７１（１９９８））。１つの実施態様では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．２Ｍリン酸緩衝液が使用される。ｐＨＳの大規模製造に関与する別の実施態様では、低濃度緩衝液または緩衝液を伴わない水溶液が水相として使用される。この場合、所望のｐＨは反応経過中の酸または塩基の添加によって維持される。生物生産されたｐＨＣＡの場合、水相は、生体触媒的反応に直接使用することができるｐＨＣＡを含有する発酵培地であり得る。緩衝液の添加によって、発酵培地のｐＨおよび緩衝能を調整する必要もあり得る。あるいは、上記のようにして、反応中の酸または塩基の添加によって、所望のｐＨを維持してもよい。１つの実施態様では、不溶性材料のために存在する細胞および任意の固体が発酵培地から取り出され、生体触媒的反応の水相として使用される発酵上清を与える。細胞および不溶性材料は、遠心分離またはろ過を含むがこれに限定されない当該分野において公知の任意の方法によって、取り出すことができる。典型的に、ｐＨＣＡは、約３０〜約２００ｍＭの濃度で水相に存在する。
【０１０１】
上記のＰＤＣ活性を有する酵素供給源は、典型的に、緩衝水溶液から添加される。酵素供給源は、典型的に、二相反応媒体において、水相の１ミリリットルあたり約０．０１〜約１００単位のＰＤＣ活性の濃度で使用される。ＰＤＣ活性の量は、２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０、３０℃でｐＨＣＡを基質として使用して、１単位が溶液の１ｍＬあたり１分間あたり１μｍｏｌのｐＨＳを放出する単位で表される。
【０１０２】
上記の抽出剤を水性緩衝液に添加して、約５重量％〜約７０重量％、さらに約２０重量％〜約５０重量％の抽出剤を含有する二相反応媒体を生じさせる。抽出剤は、酵素供給源の添加のまえ、同時、または後に水相に添加することができる。酵素供給源の添加の後に抽出剤を添加する場合、産物の濃度が阻害レベルに到達しないように、できるだけ直ぐに該抽出剤を添加すべきである。
【０１０３】
生体触媒的反応は、任意の適切なリアクターにおいて、約４℃〜約６０℃、さらに、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度で行われる。生体触媒的反応のための適切なリアクターは、当該分野において周知である（例えば、ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅａｃｔｏｒｓ、ラルフ・メッシング（Ｒａｌｐｈ Ａ． Ｍｅｓｓｉｎｇ）編、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９７５、第９章、１５１〜１５６頁；チーサム（Ｃｈｅｅｔｈａｍ）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、アラン・ワイズマン（Ａｌａｎ Ｗｉｓｅｍａｎ）編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９８５、パートＡ、第３章、１０７〜１１６頁；ケント（Ｋｅｎｔ）ら、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻、アラン・ワイズマン（Ａｌａｎ Ｗｉｓｅｍａｎ）編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９７８、第２章、６３〜７０頁；および本明細書における参照文献を参照のこと）。例として、撹拌式タンクリアクター、充填床リアクター、流動床リアクター、チューブ式リアクター、ホローファイバー型リアクターおよびバイオフィルムリアクターが挙げられる。１つの実施態様では、撹拌式タンクリアクターが使用される。リアクターは、バッチまたは連続態様で操作することができる。バッチ態様では、培地の組成が稼動開始時に設定されプロセス中に変更されない。連続態様では、基質および抽出剤が稼働中にリアクターに添加され、二相反応媒体が取り出される。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、分光光度法、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または当該分野において公知の他の方法を使用して、時間の関数としてｐＨＳの濃度を測定することによって、追跡される。
【０１０４】
バッチ態様を使用した反応の完了後、重力式沈殿槽または遠心分離を含むがこれに限定されない当該分野において既知の手段によって、２つの相が分離される。場合によって、エマルジョンが形成し得る。エマルジョンは、ろ過または遠心分離などの当該分野において公知の方法を使用して破壊することができる。酵素供給源は、限外ろ過、ナノろ過などを含むが、これらに限定されない当該分野において公知の方法を使用して、水相から回収し、次いで、以後の反応において再使用する。固定化された酵素供給源を使用するか、または酵素供給源が無傷（ｉｎｔａｃｔ）な細胞である場合、生体触媒の回収は簡素化される。この場合、固定化された酵素供給源は、ろ過、遠心分離、または当該分野において公知の他の方法を使用して、水相から回収することができる。産物ｐＨＳは、エバポレーション、蒸留、または樹脂もしくはモレキュラーシーブによる吸着を含むがこれらに限定されない当該分野において周知の方法を使用して、抽出剤から回収することができる。
【０１０５】
連続態様では、二相反応媒体はリアクターから連続的または定期的に取り出すことができる。２つの相は、重力式沈殿槽、遠心分離器、またはハイドロサイクロンを含むがこれらに限定されない当該分野において公知の手段によって、分離される。重力式沈殿槽の例については、本明細書において参照として援用される米国特許第４，８６５，９７３号明細書におけるコレルプ（Ｋｏｌｌｅｒｕｐ）らにより記載されている。遠心分離およびハイドロサイクロンの使用については、産業的プロセシングの分野において周知である（例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、エルバス（Ｅｌｖｅｒｓ）ら編、ＶＣＨパブリッシャーズ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）第Ｂ２巻、１１章、１９８８を参照のこと）。分離後、酵素供給源を含有する水相をリアクターに再循環させることができる。あるいは、新鮮な酵素供給源をリアクターに添加してもよい。固定化された酵素供給源を使用する場合、リアクター内の酵素供給源を補充する必要はない。抽出剤を処置して、上記の手段によって産物を回収する。次いで、産物のさらなる抽出のために、抽出剤をリアクターに戻して再循環させてもよい。あるいは、新鮮な抽出剤を連続的にリアクターに添加し、取り出された抽出剤を取り換えてもよい。
【０１０６】
連続態様の別の実施態様では、ｐＨＣＡ基質および酵素供給源を含んでなる水素がリアクターに含有され、水相が連続的に取り出され、外部の抽出カラムにおいて、抽出剤、即ち、有機溶媒と接触される。上記のリアクターのいずれを使用してもよい。この態様では、二相反応媒体は、外部カラムにおいて形成される。発酵および生体触媒反応における外部抽出カラムの使用については、当該分野において周知である（例えば、イートマン（Ｅｉｔｅｍａｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：６１４−６１８（１９８９））。水相および抽出剤は、上記の方法のいずれかを使用して二相反応媒体から分離され、水相はリアクターに戻される。あるいは、新鮮な水相をリアクターに添加してもよい。抽出剤を処置して、上記の手段によって産物を回収する。抽出剤を再循環させてもよく、または新鮮な抽出剤を連続的に抽出カラムに添加してもよい。産物ｐＨＳがリアクターにおいて阻害レベルに到達しないように、条件を調整しなければならない。
【０１０７】
１つの実施態様では、ｐＨＳは、回収される前に、抽出剤において化学的に誘導体化してもよい。当該分野において公知の任意の適切な化学的誘導体化方法を使用することができる。ｐＨＳの適切な誘導体は、多様なエーテルおよびエステルを含むがこれらに限定されない。ｐＨＳから誘導されるエーテルおよびエステルの例は、以下に示す一般式を有する化合物を含むが、これらに限定されない：
【０１０８】
【化１】
【０１０９】
［式中、Ｒ４は、メチル（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１：４４２４−４４２５（１９５９））、ｔ−ブチル（ゲーブル（Ｇａｂｌｅ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：３９７０−３９７９（２００２））、アルキル（ハッサネイン（Ｈａｓｓａｎｅｉｎ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３１０６−３１１３（１９８９））、シリルエーテル（ナカハマ（Ｎａｋａｈａｍａ）ら、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１５：２９９−３３５（１９９０））、アリル（ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）ら、米国特許第５，６３３，４１１号明細書）、ｔ−ブトキシカルボニル（ネーダー（Ｎａｄｅｒ）ら、米国特許第５，０８２，９６５号明細書）、ヒドロキシエトキシ（イノクマ（Ｉｎｏｋｕｍａ）ら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ ４０：４０１−４１１（１９９５））、アセトキシ（スーニク（Ｓｏｕｎｉｋ）ら、米国特許第５，４６３，１０８号明細書）、ホルメート（テシアー（Ｔｅｓｓｉｅｒ）ら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ： Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ２６６、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、１９８４）、グリシジル（エリクソン（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ）ら、米国特許第６，２５５，３８５号明細書）、ベンゾエート（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１：４４２４−４４２５（１９５９））、フェニルカーボネート（ウィットコーム（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：７１０５−７１１１））、テトラヒドロピラン（メンズラー（Ｍｅｎｚｌｅｒ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０：３４５−３４８（２０００））、ベンジル（コーテチャ（Ｋｏｔｅｃｈａ）ら、Ｓｙｎｌｅｔｔ．１９９２：３９５）、またはポリ（エチレンオキシド）（イノクマ（Ｉｎｏｋｕｍａ）ら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ５４：１２３−１３０（２００１））である］。括弧内に記載の参照文献（これらはすべて、本明細書において参照として援用される）は、引用された誘導体を合成するために使用することができる方法を記載している。別の実施態様では、ｐＨＳは、米国特許第５，９５９，０５１号明細書および同第６，２５８，９０１号明細書（両方とも、本明細書において参照として援用される）におけるカネコ（Ｋａｎｅｋｏ）らにより記載の方法を使用して、ポリ（パラ−ヒドロキシスチレン）および他のコポリマーに高分子化される。別の実施態様では、ｐＨＳ誘導体はパラ−アセトキシスチレンであり、米国特許第５，４６３，１０８号明細書におけるスーニク（Ｓｏｕｎｉｋ）らにより記載の方法を使用して、製造することができる。誘導体化後、上記の方法を使用して、誘導体化された産物を抽出剤から回収する。
【実施例】
【０１１０】
本発明を以下の実施例でさらに規定する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、具体的説明のみとして示されることを理解すべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【０１１１】
略語の意味は次のようである：「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｒｐｍ」は１分間あたりの回転数を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はμメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長での光学密度を意味し、「ＯＤ５５０」は５５０ｎｍの波長での光学密度を意味し、「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを意味し、「Ｒｆ」は移動率、即ち、ＴＬＣにおいてゾーンの中心が移動した距離対同時に移動相が移動した距離の割合を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＵＶ／ＶＩＳ」は紫外および可視波長範囲における分光光度法を意味し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味し、「ＭＨｚ」はメガヘルツを意味し、「Ａ３１５」は３１５ｎｍの波長で測定された吸収を意味し、「ΔＡ３１５」は３１５ｎｍの波長で測定された吸収の変化を意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「Ｘ−ｇａｌ」は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチあたりのポンドを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｋＶ」はキロボルトを意味し、「μＦ」はマイクロファラッドを意味し、「ｗ／ｖ」は溶液の重量あたりの溶質の重量を意味する。
【０１１２】
一般的方法
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．ムレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーク（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、アメリカン・ソサイエティ・フォア・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）（１９９４））またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウエル・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９）に記載の通りに見ることができる。すべての試薬ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、他に特定しない限りアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ＢＤダイアグノスティクス・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（（メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、旧ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、旧ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））より入手した。
【０１１３】
すべての化学物質は試薬用であり、製造者または販売者から受け取ったままの状態で使用した。他に示さない限り、生化学物質はシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手し、乾燥培地はＢＤダイアグノスティクス・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）より入手した。すべての溶媒は、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。水は、ＥＭサイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ニュージャージー州ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））またはアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製の瓶入りの分光分析用の水であった。本発明者らは、多様な製造者由来の供給物を交換可能に使用した。すべてのクロマトグラフィー樹脂は、製造者によって提供された指示に従って製造および維持した。
【０１１４】
実施例において使用したＬＢ培養培地は、培地１リットルあたり、以下、即ち、バクト（Ｂａｃｔｏ）−トリプトン（１０ｇ）、バクト（Ｂａｃｔｏ）−酵母抽出物（５ｇ）およびＮａＣｌ（１０ｇ）を含有する。
【０１１５】
本発明において使用する非組換え生物体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））から入手した。これらの培養物を、凍結乾燥状態から、適切な培地の懸濁培養物に移し、−８０℃での長期間保存のために１５％グリセロール中に維持した。
【０１１６】
生物体の増殖に関与するすべての操作は、他に示さない限り、３７℃で、ニュー・ブランスウィック・インキュベーター・シェーカー・モデルＧ２５ ３（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｓｈａｋｅｒ Ｍｏｄｅｌ Ｇ２５ ３）（ニュー・ブランスウィック・サイエンティフィック・コ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）（ニュージャージー州エジソン（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））において実施した。無細胞抽出物は、細胞を、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中１ｍＬあたり３５または７０光学密度（ＯＤ６００）単位の光学密度に再懸濁し、フレンチ・プレッシャー・プレス（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｒｅｓｓ）を介する通過により細胞を溶解することによって、製造した。
【０１１７】
ｐＨＣＡおよびｐＨＳの分析
以下の技術、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法、およびＨＰＬＣのうち１つもしくはそれ以上を使用して、ｐＨＣＡおよびｐＨＳの混合物の分析を実施した。固体支持体としてシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、独国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））および移動相として酢酸エチルを使用して、ＴＬＣを実施した。ＨＰＬＣは、ダイオードアレイ検出器およびゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）３００ステイブル・ボンド・アナライティカル（Ｓｔａｂｌｅ Ｂｏｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、アギレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を伴って実施した。ＨＰＬＣ分離は、２つの溶媒を組み合わせた勾配：溶媒Ａ、ＨＰＬＣ用水中０．１％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸を組み合わせた勾配を使用して、達成した。移動相の流速は１．０ｍＬ／分であった。使用した溶媒の勾配を表１に示す。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
単離されたｐＨＳは、５００ＭＨｚでの１Ｈ ＮＭＲ分光分析によって分析した。
【０１２０】
ｐＨＣＡデカルボキシラーゼ活性の決定：
デカルボキシラーゼ活性は、原理について、先にＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４７：２９１−２９５（１９９７）においてキャビン（Ｃａｖｉｎ）らによって記載されたアッセイを使用して、測定した。ｐＨＣＡの変換に続いて、空気の対照ビームに対する３１５ｎｍでの吸収（Ａ３１５）を記録した。アッセイ緩衝液は、サーモスタットで３０℃に調温した１．０ｃｍセミマイクロキュベットにおける２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液中０．２ｍＭ ｐＨＣＡよりなる。酵素抽出物を添加して、脱炭酸反応を開始した。Ａ３１５の変化（ΔＡ３１５）として初速度を記録し、単位／ｍＬ（ここで、１単位は溶液の１ｍＬあたり１分間あたり１μｍｏｌの産物を放出する）における酵素活性を、以下の変換式によって算出した。
【０１２１】
【数１】
【０１２２】
ｐＨＣＡのモル吸光係数は、経験的に３１５ｎｍで１０ｃｍ−１ｍＭ−１と決定された。
【０１２３】
タンパク質濃度は、タンパク質決定のためのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）キット（バイオラッド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して決定した。１００〜８００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液の範囲の５種のタンパク質標準物質を使用してタンパク質の標準曲線を作成した。１６０μＬのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）試薬に１０μＬのサンプルを添加することを要する、マイクロタイタープレートアッセイ形式を使用した。
【０１２４】
実施例１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株由来のＰＤＣ１およびＰＤＣ２酵素の無細胞抽出物の生成
本実施例の目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株から、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ酵素（ＰＤＣ１）（ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ））およびＰＤＣ２（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の無細胞抽出物を生成することであった。それぞれ、ＰＤＣ１およびＰＤＣ２酵素を過剰発現する２つのプラスミド、ｐＥＴ１７．ｐｄｃ１およびｐＥＴ１７．ｐｄｃ２を構築した。これらのプラスミドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１を形質転換し、高い百分率のデカルボキシラーゼタンパク質および活性を有する２種の過剰発現株を生成した。フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレスを使用して、細胞を溶解することによって、無細胞抽出物を得た。
【０１２５】
ＰＤＣ１およびＰＤＣ２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株の構築：
それぞれ、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより、ｐｄｃ遺伝子、ｐｄｃ１（配列番号１）およびｐｄｃ２（配列番号３）を増幅した。ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、ＭＲＳ培地上で増幅させたＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびＬＢ培地上で増殖させた枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からゲノムＤＮＡを単離した。Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ１遺伝子、パラ−ケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｕ６３８２７）に使用するオリゴヌクレチドプライマーは、配列番号５に示される５’−ＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡ−３’および配列番号６に示される５’−ＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＡＴＴ−３’であり、ＮｄｅＩ（下線を付したヌクレオチド）を含んだ。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｄｃ２、フェノール酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ−１７１１７）に使用するオリゴヌクレチドプライマーは、配列番号７に示される５’−ＧＴＧＴＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴ−３’および配列番号８に示される５’−ＴＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴ−３’であり、これもＮｄｅＩ（下線を付したヌクレオチド）を含んだ。両方のｐｄｃ１およびｐｄｃ２遺伝子の予想される５５０ｂｐＤＮＡフラグメントをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲクリーン・アップ・キット（Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｋｉｔ）を使用して精製し、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＴＡクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）キット（Ｋｉｔ）を使用して、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターに連結させた。形質転換は、２×ＹＴ培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をＳＯＣの代わりに使用したことを除いて、製造者の指示に従い、ワン・ショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）ケミカリー・コンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して、行った。形質転換された細胞を、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する５０μｇ／ｍＬアンピシリンプレート上に広げた。これらのプレートのそれぞれから、１０個の白色コロニーを選択し、アンピシリンプレート上に再画線した。ｐｄｃ１で形質転換した細胞およびｐｄｃ２遺伝子で形質転換した細胞を使用して、以下の手順を行った。
【０１２６】
それぞれのコロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地上で１晩増殖させた。キアゲン・ミニプレップ・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を使用して、細胞からプラスミドを精製した。プラスミドを、１時間、３７℃、ＥｃｏＲＩで消化し、挿入物の存在のための試験をした。消化物を、キロベースマーカーと共に１％アガロースゲルに充填し、電気泳動を実施した。得られたゲル上で２つのバンドが観察され、一方は約５５０ｂｐで挿入物に対応し、一方は３．９ｋｂｐでベクターに対応した。
【０１２７】
ミニプレップの１つから由来するベクターを含有する細胞を、１晩、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する５０ｍＬ培養物中で増殖させた。製造者の指示に従い、キアゲン・ミニプレップ・ＱＩＡフィルター（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ）を使用して、これらの細胞からベクターを精製した。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｐｄｃ遺伝子から生じるプラスミドをｐＤＣ１を命名する一方、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｄｃ遺伝子遺伝子から生じるプラスミドをｐＤＣ２と命名した。ベクター内のＭ１３前方および後方プライマーを使用し、デュポン・シークエンシング・ファシリティー（ＤｕＰｏｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で挿入物を配列決定し、配列を確認した。ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ＮＴＩ（インフォルマックス・インク（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．）メリーランド州フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ））ソフトウェアを使用することによって、配列のコンピュータ解析を行った。
【０１２８】
プラスミドｐＤＣ１を、４時間、３７℃で、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用して消化した。プラスミドｐＤＣ２を、４時間、３７℃で、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを使用して消化した。消化物を、キロベースマーカーと共に１％アガロースゲルに充填し、電気泳動を実施した。挿入物に対応する５５５ｂｐのバンドおよびベクターに対応する３．９ｋｂｐのバンドが、ｐＤＣ１の消化物について観察された。挿入物に対応する５８３ｂｐのバンドおよびベクターに対応する３．９ｋｂｐのバンドが、ｐＤＣ２の消化物について観察された。挿入物のバンドをゲルから切り出し、製造者のプロトコルに従い、キアゲン・ゲル・エクストラクション・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、精製した。ノバゲン・インク（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から入手したｐＥＴ−１７ｂベクターを、上記のように消化し、１％アガロースゲル上で稼動させた。切断ベクターに対応する３．３ｋｂｐでのベクターバンドをゲルから切り出し、製造者のプロトコルに従い、キアゲン・ゲル・エクストラクション・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、精製した。
【０１２９】
ｐＤＣ１挿入物および切断ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結させた。同様に、ｐＤＣ２挿入物および切断ベクターを連結させた。反応物を、１時間、室温でインキュベートした。得られたプラスミドは、本明細書において、ｐＥＴ１７．ｐｄｃ１およびｐＥＴ１７．ｐｄｃ２と称される。プラスミドｐＥＴ１７．ｐｄｃ１およびｐＥＴ１７．ｐｄｃ２は、それぞれ、Ｔ７プロモーターの制御下で、ＰＤＣ１およびＰＤＣ２酵素を過剰発現する。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））から入手した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）［遺伝子型：ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｆ８０ｌａｃＺ ｄＭ１５ ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９（ＤＥ３）］を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに基づく発現系を使用する高レベル発現のための宿主株として使用した。ＤＰＤ５００４と命名された株は、プラスミドｐＥＴ１７．ｐｄｃ１をＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することによって構築し；ＤＰＤ５００５と命名された株は、プラスミドｐＥＴ１７．ｐｄｃ２をＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することよって構築した。株ＤＰＤ５００４を構築するために、プラスミドｐＥＴ１７ｂ．ｐｄｃ１（０．１μｇ）を５０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）ケミカル・コンピテント・セル（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に添加した。この混合物を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で、４５ｓ、熱ショックにより処置し、氷上に２分間戻し、次いで、ＳＯＣ培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地上にプレート化する前に、細胞を３７℃で１時間、インキュベートした。同様に、株ＤＰＤ５００５は、ｐＥＴｂ．ｐｄｃ２をＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することよって構築した。ＰＤＣ酵素の発現は、酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を開始し、次いで、Ｔ７プロモーターにより制御されるｐｄｃ１およびｐｄｃ２遺伝子の遺伝子転写を活性化するＩＰＴＧによって誘導される。
【０１３０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株の増殖ならびにＰＤＣ１およびＰＤＣ２の無細胞抽出物の製造
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ５００４およびＤＰＤ５００５の１晩培養物を、１５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢブロス（ＬＢ−ａｍｐ）中−８０℃グリセロールストックから増殖させた。代表的な実験では、２ｍＬの１晩培養物を使用して、１００ｍＬのＬＢ−ａｍｐを含有する４本の０．５Ｌフラスコのそれぞれに播種した。培養物を０．５のＯＤ６００まで増殖させ、０．５ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加によって誘導した。遠心分離（２０分間、１０，０００×ｇ、４℃）によって細胞を回収し、１．１ｇの細胞ペーストを与える前に、培養物を６０分間、増殖させた。細胞ペーストは、さらなる使用まで、４℃で保存した。
【０１３１】
無細胞抽出物を製造するために、融解した細胞ペーストを標準的な稼動緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液）に、７０ＯＤ６００／ｍＬの密度まで再懸濁し、懸濁液をフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）（１２００ｐｓｉ）を介して通過させることによって、溶解した。溶解物を遠心分離し、上清を保持した。全タンパク質における得られる酵素の百分率を、クマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）で染色した１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質バンドの密度を測定することによって、決定した。デカルボキシラーゼ活性は、上記の一般的方法のセクションに記載のように測定した。これらの結果を表２にまとめる。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
実施例２
二相反応媒体におけるＰＤＣ２無細胞抽出物のデカルボキシラーゼ活性
本実施例の目的は、二相反応媒体においてｐＨＳを製造させるために、ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用することの利点を実証することであった。ＰＤＣ２酵素活性の保持を、水相／トルエン、水相／ジクロロメタン、および水相／デカン酸メチル二相反応媒体において測定した。
【０１３４】
小さな撹拌子を含有するガラス製シンチレーションバイアルに、以下の水非混和性有機溶媒、スペクトル分析用のトルエン、ジクロロメタン、またはデカン酸メチルのうち１つの５ｍＬを充填した。次いで、１０ｍＬのｐＨＣＡ基質溶液（１．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを伴う０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０〜１２０ｍＭ ｐＨＣＡ溶液）および実施例１に記載のように製造した１５μＬのＰＤＣ２無細胞抽出物（１５０μｇタンパク質；１５単位）を添加した。バイアルに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、激しく撹拌した。ｐＨＣＡからｐＨＳへの変換に十分な時間、反応を進行させた。反応の経過中、上記の一般的方法のセクションに記載のように、反応の進行を、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ、およびＨＰＬＣによってモニターした。ｐＨＣＡおよびｐＨＳは、ＴＬＣプレート上でそれぞれ、０．４および０．７のＲｆ値で移動した。反応が完了したら、内容物を６０ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させた。水層を回収し、直ちに、ＹＭ−１０膜（ミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を使用する限外ろ過によってろ過し、酵素を分離および回収した。この第１の水性ろ過物を保持し、ＨＰＬＣによって分析して、ｐＨＣＡ基質の枯渇を確認した。タンパク質およびデカルボキシラーゼ含有保持物を、限外ろ過膜を使用して、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で２回洗浄し、２日目の洗浄物由来の保持物を、本来の反応容積まで再懸濁した。上記の一般的方法のセクションに記載のｐＨＣＡデカルボキシラーゼアッセイを使用し、５０μＬ容積の懸濁液を使用して、残留酵素活性を決定した。
【０１３５】
酵素アッセイ後、サンプルを限外ろ過によって処置し、ＰＤＣ２酵素を、前回の反応の終了時の水相の容積に等価な容積のｐＨＣＡ含有緩衝溶液に再懸濁した。保存された酵素溶液を、直ちに、消費されていない有機溶媒の容量に添加し、懸濁液を撹拌した。ｐＨＣＡからｐＨＳへの完全な変換のための反応時間が最初の反応時間と比べて２倍になるまで、上記の工程を反復した。各サイクル後に実施した酵素アッセイの結果を表３に示す。表中のデータから認められ得るように、酵素活性の保持は、水相／トルエン系が最も高かった。さらに、酵素活性の保持は、比較例３において見られるように、単一層の水性系において得られる保持よりかなり高かった。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
２つのトルエン反応由来の有機層を、ＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。次いで、２つの有機層をプールし、２５ｍＬのナシ型丸底フラスコに移した。微量の高分子化阻害剤、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチル−フェノール（ＣＡＳ９８−２９−３；アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）１２，４２４−９）を澄明な無色のトルエン溶液に添加した。象牙色の結晶固体（４４ｍｇ）を、減圧（２００ｍｍＨｇ）下、穏やかな加熱（４５℃）を伴うロータリーエバポレーションによって回収した。単離された固体を、プロトンＮＭＲ（４ｍｇを０．８ｍＬの完全重水素化メタノールに溶解した）によって特徴付けた。製造されたｐＨＳの純度は、９８パーセントより大きいと決定された。産物のさらなる精製を、ヘキサンからの再結晶化によって達成し、白色結晶固体を回収した。この結果は、製造されたｐＨＳの有機層からの単離が簡便であることを実証する。
【０１３８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ４−ＭｅＯＨ）：７．３ｐｐｍ，２重線，２Ｈ，（芳香環の５，６−プロトン）；６．７８ｐｐｍ，２重線，２Ｈ，（芳香環の２，３−プロトン）；６．６５ｐｐｍ，多重線，１Ｈ（Ａｒ−ＨＣ＝ＣＨ２）；５．６ｐｐｍ，２重線，１Ｈ，（Ａｒ−Ｃ＝ＣＨ，シス）；５．０５ｐｐｍ，２重線，１Ｈ（Ａｒ−Ｃ＝ＣＨ，トランス）。
【０１３９】
実施例３
単一相水性反応媒体におけるＰＤＣ２無細胞抽出物のデカルボキシラーゼ活性の比較例
本実施例の目的は、単一相水性反応媒体におけるＰＤＣ２無細胞の酵素活性の保持を測定し、実施例２に記載の二相反応媒体に対する比較の役割を果たすことであった。
【０１４０】
小さな撹拌子を含有するガラス製シンチレーションバイアルに、１０ｍＬのｐＨＣＡ溶液（１．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを伴う０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０ｍＭ ｐＨＣＡ溶液）を充填した。次いで、実施例１に記載のように製造した１５μＬのＰＤＣ２無細胞抽出物（１５０μｇタンパク質；１５単位）を添加し、反応を開始した。バイアルに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、激しく撹拌した。ｐＨＣＡからｐＨＳへの完全な変換に十分な時間、反応を進行させた。反応の経過中、上記の一般的方法のセクションに記載のように、反応の進行を、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ、およびＨＰＬＣによってモニターした。３つの条件下で、ｐＨＣＡおよびｐＨＳのＲｆ値は、それぞれ、０．４および０．７であった。反応が完了したかまたはそれ以上進行しなくなったら、実施例２に記載のように、酵素をＹＭ−１０膜によって回収した。ろ過物を数回洗浄して、残留ｐＨＣＡおよびｐＨＳを取り出した。洗浄後、ろ過物をその最終反応容積で保存し、残留活性を、実施例２に記載のように決定し、次いで、検出可能なデカルボキシラーゼ活性が存在しなくなるまで、上記で概略した工程を反復した。各サイクル後に実施した酵素アッセイの結果を表４に示す。表中のデータから認められ得るように、酵素活性の保持は、二相反応媒体を使用した実施例２で概略した保持よりもかなり低かった。本実施例は、二相反応媒体においてｐＨＳを製造させるためにＰＤＣ２酵素を使用することの利点を実証する。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
実施例４
二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造を実証することであった。ＰＤＣ１酵素活性の保持を、水相／トルエン、水相／ジクロロメタン、水相／デカン酸メチル、および水相／２−ウンデカノン二相反応媒体において測定した。
【０１４３】
小さな撹拌子を含有するガラス製シンチレーションバイアルに、以下の水非混和性有機溶媒、スペクトル分析用のトルエン、ジクロロメタン、デカン酸メチル、または２−ウンデカノンのうち１つの５ｍＬを充填した。次いで、１０ｍＬのｐＨＣＡ基質溶液（１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０〜１２０ｍＭ ｐＨＣＡ溶液）および実施例１に記載のように製造した５００μＬのＰＤＣ１無細胞抽出物（２．１５ｍｇタンパク質；１５単位）を添加した。バイアルに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、激しく撹拌した。反応の経過中、上記の一般的方法のセクションに記載のように、反応の進行を、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ、およびＨＰＬＣによってモニターした。反応が完了したら、内容物を６０ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させた。水層を直ちに、限外ろ過によってろ過し、産物および反応物から酵素を分離および回収した。生体触媒反応は、実施例２に記載のものと同一の様式で数サイクル反復した。各サイクル後に実施した酵素アッセイの結果を表５に示す。表中のデータから認められ得るように、酵素活性の保持は、水相／トルエン二相媒体および水相／デカン酸メチル二相媒体の両方で高かった。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
実施例５
二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＣＡからのｐＨＳの製造を実証し、有機相からのｐＨＳの簡便な回収を実証することであった。
【０１４６】
０．５Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクター（ウィートン・サイエンス・プロダクツ（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ニュージャージー州ミルビル（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ））に、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中０．２８０ＬのｐＨＣＡ（５ｇ／Ｌ）および１５ｍＬのウシ血清アルブミン（２０ｍｇ／ｍＬ）を充填した。実施例１に記載のように製造したＰＤＣ１を含有する無細胞抽出物（２．５ｍＬ、１３ｍｇタンパク質、６９．５単位）を、０．１５Ｌのトルエンと共に添加した。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌した。反応温度を３３℃に設定した。反応を３０分間進行させ、その後、ＴＬＣによって完了したことが認められたため、反応を終了した。製造されたｐＨＳを実施例４に記載のように単離した。象牙色の残渣（１．１ｇ）を再結晶化し、バイアルに回収して、一定の乾燥状態になるまで高減圧（６０ｍｍＨｇ）下で乾燥させ、完全重水素化メタノールにおいて１Ｈ ＮＭＲ分析により特徴付けた。プロトンＮＭＲの結果は化学シフト値がｐＨＳと一致し、純度を９８％と評価した。本実施例は、二相反応媒体におけるＰＤＣ１によって触媒された反応の有機相からのｐＨＳの簡便な回収を実証する。
【０１４７】
実施例６
二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物および生物生産されたｐＨＣＡ含有発酵培地を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体を使用して、発酵培地に含有されるＰＤＣ１無細胞抽出物およびｐＨＣＡを使用するｐＨＳの製造を実証することであった。まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株（ＤＰＤ４００９）を使用する発酵によって、ｐＨＣＡを製造させた。次いで、ＰＤＣ１無細胞抽出物を使用して、発酵上清およびトルエンよりなる二相反応媒体において、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換させた。
【０１４８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００９の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００９は、チロシン過剰発現、プラスミド欠損、フェニルアラニン栄養要求性であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１（ＤＧＬ４３０）、オムニジーン・バイオプロダクツ・インク（ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手したチロシン過剰製造株から数段階で誘導された。まず、ＴＹ１からプラスミドを取り除き、ＴＳ５と呼ばれるテトラサイクリン感受性株を生じるようにした。続いて、ＴＳ５は、ドナーとして、ｐｈｅＡ１８：：Ｔｎ１０を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＡＧ１２１５８を使用するＰ１仲介形質導入において、レシピエントであった。１つのテトラサイクリン耐性形質導入体はＢＮＴ５６５．２と呼ばれた。
【０１４９】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を介する米国特許出願第６０／４３４６０２号明細書（本明細書において参照として援用される）におけるサ（Ｓｕｈ）により記載の２種ＰＣＲフラグメント組込み方法を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８を構築した。部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）によって隣接されるカナマイシン選択マーカーを含有する第１の線状ＤＮＡフラグメント（１５８１ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）（５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号９）（これは、ａｒｏＦ終止コドンおよびプライミング配列（２０ｂｐ）の上流領域の配列に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、４６ｂｐ）を含有する）、およびＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）（５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号１０）（これは、ＰｔｒｃプロモーターＤＮＡフラグメントおよびプライミング配列（２２ｂｐ）の５’末端領域の配列に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、４２ｂｐ）を含有する）によるプラスミドｐＫＤ４（ダセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびバンネル（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６６４０−６６４５（２０００））からのＰＣＲによって合成した。−１０および−３５コンセンサス配列よりなるＰｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、ならびにリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含有する第２の線状ＤＮＡフラグメント（１６３ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ−ｔｒｃ（ｋａｎ）（５’−ＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴ−３’）（配列番号１１）（これは、ｋａｎオープンリーディングフレームおよびプライミング配列（２２ｂｐ）の下流領域の配列に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、１８ｂｐ）を含有する）、およびＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）（５’−ＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡ−３’）（配列番号１２）（これは、ｔｙｒＡ開始コドンおよびプライミング配列（２０ｂｐ）の下流領域に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、４６ｂｐ）を含有する）によるプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＰＣＲによって合成した。下線を付した配列は、それぞれのホモロジーアームを例示する一方、残りの部分は、ＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡに対する相補的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションのためのプライミング配列である。標準的なＰＣＲ条件を使用して、マスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）ＴＭエキストラ−ロング（Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ）ＰＣＲキット（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用し、以下のように線状ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのプラスミドＤＮＡ、２５μＬの２×ＰＣＲ緩衝液番号１、１μＬの５’プライマー（２０μＭ）、１μＬの３’プライマー（２０μＭ）、０．５μＬのマスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）ＴＭエキストラ−ロング（Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、および２１．５μＬの滅菌済み、脱イオン化Ｈ２Ｏを含有した。ＰＣＲ反応条件は：９４℃で３分間；２５サイクルの９３℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間；続いて、７２℃で５分間であった。ＰＣＲ反応完了後、ミニ−エリュートＱＩＡクイック・ゲル・エクストラクション・キット（Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）ＴＭ（キアゲン・インク（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。高速で２回、遠心分離することによって、１０μＬの蒸留水により、ＤＮＡを溶出させた。単離したＰＣＲ産物の濃度は約０．５〜１．０μｇ／μＬであった。
【０１５０】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドを担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株を、ＰＣＲフラグメントの組換えのための宿主株として使用した。この株は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（ダセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびバンネル（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１（コリ・ジェネティクス・ストック・センター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、エール大学（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、番号６６４９）への形質転換によって、構築された。ｐＫＤ４６のλ−Ｒｅｄリコンビナーゼは、アラビノース誘導性プロモーターの制御下で発現される３つの遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍよりなる。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを３０℃で含有するＬＢ培地上で選択した。ｐＫＤ４６を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株のエレクトロコンピテント細胞は、以下のようにして製造した。ｐＫＤ４６を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１Ｍ Ｌ−アラビノースを伴うＳＯＢ培地（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｍ．グローバー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬ出版（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、１９８５、１０９〜１２５頁）において、３０℃で、０．５のＯＤ６００まで増殖させ、続いて、氷上で２０分間、冷却した。細菌細胞を、４，５００ｒｐｍで、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＴ７ ＰＬＵＳ（ケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、コネチカット州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ））を使用し、１０分間、４℃で遠心分離した。上清をデカントした後、ペレットを氷冷水に懸濁し、再度、遠心分離を行った。このプロセスを２回反復し、細胞ペレットを１／１００容積の氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。
【０１５１】
カナマイシンマーカーＰＣＲ産物（約１μｇ）およびＰｔｒｃプロモーターＰＣＲ産物（約１μｇ）の両方を、５０μＬのコンピテント細胞と混合し、氷上で予め冷却しておいたエレクトロポレーションキュベット（０．１ｃｍ）にピペッティングした。２００オームに設定したパルスコントローラーを備えた１．８ｋＶ、２５μＦに設定したジーン・パルサー・システム（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して、エレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、ＳＯＣ培地（１ｍＬ）を添加した。細胞を、３７℃で、１時間、インキュベートした。細胞の約半分を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地上に拡げた。プレートを３７℃で１晩、インキュベートした後、６個のカナマイシン形質転換体を選択した。
【０１５２】
カナマイシン選択マーカーおよびｔｙｒＡ遺伝子の前のＰｔｒｃプロモーターの両方の染色体組込みを、ＰＣＲ分析によって確認した。形質転換体のコロニーは、２３μＬのスーパーミックス（ＳｕｐｅｒＭｉｘ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、５’−プライマーＴ−ｔｙ（テスト）（５’−ＣＡＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧ−３’）（配列番号１３）および１μＬの３’−プライマーＢ−ｔｙ（テスト）（５’−ＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣ−３’）（配列番号１４）を含有するＰＣＲ反応混合物２５μＬに再懸濁した。テストプライマーを選択して、組込み領域の付近に位置する領域を増幅させた。Ｔ−ｔｙ（テスト）およびＢ−ｔｙ（テスト）プライマー対によるＰＣＲ分析は、１％アガロースゲル上で、予想されるサイズのフラグメント、即ち、１，９２８ｂｐを示した。得られた組換え体を、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８と命名する。
【０１５３】
次いで、上記のように製造した株ＢＮＴ５６５．２を、Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ［ＫａｎＲ］、ｔｙｒＡ発現を駆動する強力なｔｒｃプロモーターを生じる染色体修飾を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８上で増殖させたファージによる別のＰ１仲介形質導入において、レシピエントとして使用した。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子は染色体上で緊密に連結されており、そのため、テトラサイクリンおよびカナマイシンの両方に対して耐性である稀な形質導入体の選択を行った。１つのそのような形質導入体をＤＰＤ４００９と呼ばれ、これは増殖に対してフェニルアラニンを要求し、チロシンを排出することが示された。
【０１５４】
ｐＨＣＡの生物生産
ｐＨＣＡの生物生産を、１４Ｌブラウン（Ｂｒａｕｎ）発酵槽、バイオスタット（ＢｉｏＳｔａｔ）Ｃ．Ｂ．（ブラウン・バイオテック・インターナショナル（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、独国メレスンゲン（Ｍｅｌｅｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））において行った。発酵の稼動は、上記のようにして構築された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００９を使用して行った。発酵培地は、表６に示すような塩、ビタミンおよびグルコースを含有する規定培地である。微量栄養素の組成を表７に示す。温度を３５℃に維持し、溶存酸素は２５％の設定値を標的とした。ｐＨの設定値は６．５であり、塩基性および酸性の調整のために、それぞれ４０％（ｗ／ｖ）水酸化アンモニウムおよび２０％（ｗ／ｖ）リン酸の添加によって一定を維持した。細胞密度が１０ＯＤ５５０単位に達したら、培地に、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加し、プラスミド上のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ｐａｌ）遺伝子を発現するように細胞を誘導して、チロシンからｐＨＣＡへの変換を生じさせた。流加培養態様では、一旦、濃度が５ｇ／Ｌ未満に低下したら追加のグルコースを添加した。グルコース溶液６０％（ｗ／ｗ）を、０．４５ｇ／分の速度で添加し、０．５ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を保持した。一旦、グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌを超えたら、稼動の終了付近でより低い速度を使用した。発酵は典型的に７２時間後に終了した。
【０１５５】
発酵培地を遠心分離して、細胞と他の不溶性産物とを分離することによって、ｐＨＳへの生体触媒変換における使用のためのｐＨＣＡ豊富上清を製造した。ペレットを廃棄し、暗褐色の上清を新しい保存ビンに移し、蓋を取り付けて、ＰＤＣ生体触媒反応における使用まで４℃で保存した。
【０１５６】
【表６】
【０１５７】
【表７】
【０１５８】
ＰＤＣ１無水抽出物を使用するｐＨＳの製造
０．５Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクターに、上記のｐＨＣＡ発酵由来の０．１Ｌの発酵上清を充填した。保存中、いくつかの不溶性副産物が、発酵上清から沈殿し得る。不溶性材料を妨害しないように注意しながら、上清を目盛り付きシリンダーにデカントした。発酵上清はｐＨＣＡ（３．３ｇ／Ｌ）、ケイ皮酸（ＣＡ）、フェニルアラニン、チロシン（これらはすべて組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって製造される）および塩をｐＨ６．８で含有した。緩衝能およびｐＨＣＡ濃度は、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中２５ｇ／Ｌ ｐＨＣＡの０．２Ｌを添加することによって、増加させた。水相におけるｐＨＣＡの最終濃度は約１７．７ｇ／Ｌであった。
【０１５９】
実施例１に記載のように製造したＰＤＣ１を含有する無細胞抽出物（０．５ｍＬ、１．１ｍｇタンパク質、１２単位）を、０．１５Ｌのトルエンと共に添加した。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌した。反応温度を３３℃に設定した。終了前に、反応を１５時間、進行させた。水相は、本来の発酵培地の深暗褐色を保持した。残留する乳化した有機相は淡黄色であった。中等度の孔サイズのガラスフリットを備えた漏斗を介するろ過によってエマルジョンを破壊し、有機層と水層とを再度分離した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、実施例４および５に記載のようにｐＨＳを単離した。約２ｇの粗固体を単離した。固体をヘキサンから再結晶化し、小孔ガラスフリットを備えた漏斗を介してろ過し、バイアルに回収して、一定の乾燥状態になるまで高減圧（６０ｍｍＨｇ）下で乾燥させた（１．１０２ｇ）。この反応物の全収量は、無細胞抽出物の１ｇあたり製造された１０１０ｇのｐＨＳであった。本実施例は、ＰＤＣ１デカルボキシラーゼが、粗発酵成分および高ｐＨＣＡ濃度の存在下において高い生産性でｐＨＳ形成を触媒する能力を例示する。
【０１６０】
実施例７
二相反応媒体においてＰＤＣ２無細胞抽出物および生物生産されたｐＨＣＡ含有発酵培地を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体を使用して、発酵培地に含有されるＰＤＣ２無細胞抽出物およびｐＨＣＡを使用するｐＨＳの製造を実証することであった。まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株を使用する発酵によって、ｐＨＣＡを製造させた。次いで、ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用して、発酵上清およびトルエンよりなる二相反応媒体において、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換させた。
【０１６１】
ｐＨＣＡの生物生産は実施例６に記載の通りに行った。１．０Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクターに、実施例６に記載のｐＨＣＡ発酵から得られる０．４Ｌの発酵上清を充填した。発酵上清はｐＨＣＡ（３．３ｇ／Ｌ）、ケイ皮酸（ＣＡ）、フェニルアラニン、チロシン（これらはすべて組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって製造される）および塩をｐＨ６．０で含有した。緩衝能およびｐＨＣＡ濃度は、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中２５ｇ／Ｌ ｐＨＣＡの０．４Ｌを添加することによって、増加させた。ｐＨＣＡの最終濃度は約１４．１５ｇ／Ｌであった。実施例１に記載のように製造したＰＤＣ２を含有する無細胞抽出物（０．２０ｍＬ、３６単位；２．０２ｍｇタンパク質）を、高分子化阻害剤として５ｍｇのプロステイブ（ＰｒｏＳｔａｂ）（登録商標）５４１５（チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ニューヨーク州タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ））を含有する０．２０Ｌの試薬用トルエンと共に添加した。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌した。反応温度を３３℃に設定した。終了前に、反応を１５時間、進行させた。反応の内容物を５００ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させた。有機層（上層）は、エマルジョンを含有し、これは、中等度の孔サイズのガラスフリットを備えたブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）漏斗を介してろ過することによって破壊した。ろ過物は、２つの非混和層、無色の有機層および黄色の水層を有した。相分離セルロースフィルターペーパーを通過させることによって層を分離し、有機層を選択的に受けフラスコに通過させた。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、ロータリーエバポレーションによってトルエンを回収した。ｐＨＳを、実施例６に記載のように単離して、４．５ｇの粗灰白色結晶残渣を生じた。固体をヘキサンで再結晶および洗浄し、一定の乾燥状態まで減圧下（６０ｍｍＨｇ）で乾燥させたところ、ｐＨＳ標準品と同一の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する２．８７ｇの細かな白色結晶生成物を得た。この反応物の全収量は、無細胞触媒の１ｇあたり製造された１４２１ｇのｐＨＳであった。本実施例は、粗発酵成分および少量の高分子化阻害剤の存在下でＰＤＣ２デカルボキシラーゼによって達成される高い生産性を実証する。
【０１６２】
実施例８
オキシランアクリルビーズ上に固定化されたＰＤＣ２無細胞抽出物を使用する二相反応媒体におけるｐＨＳの製造
本実施例の目的は、オキシランアクリルビーズ上に固定化されたＰＤＣ２無細胞抽出物を使用する、水性緩衝液およびトルエンよりなる二相反応媒体におけるｐＨＳの製造を実証することであった。
【０１６３】
オキシランアクリルビーズを使用する無細胞抽出物の固定
ガラス製シンチレーションバイアルに、１００ｍｇのオキシランアクリルビーズ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＣＡＳ番号９３３５６−７５−３；１５０ミクロン、マクロ多孔性；活性化８００μｍｏｌ／ｇ）および８ｍＬ ５０ｎＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液を充填した。実施例１に記載のように製造したＰＤＣ２無細胞抽出物（０．１００ｍＬ、０．５９ｍｇタンパク質、１５単位）を、シェーカー上で、１晩、周囲温度で穏やかに振盪した。混合物を遠心分離し、次いで、上清をデカントした。ビーズ上の未反応のエポキシド部位を処置するために、ビーズを、０．８３Ｍエタノールアミンを含有する１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に、２時間、周囲温度で再懸濁した。ビーズを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液の１０ｍＬ部で３回洗浄し、使用まで、周囲温度で０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中に保存した。
【０１６４】
凍結乾燥した無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造
ガラス容器（テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）およびガラス成分を有するオーバーヘッド撹拌機を含有する）に０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０ｍＭ ｐＨＣＡの５ｍＬを充填した。ＰＤＣ２−オキシランアクリルビーズ（４０ｍｇ）および３ｍＬのトルエンを容器に添加した。内容物を室温で撹拌した。脱炭酸反応の進行をＴＬＣによってモニターし、反応の進行を評価した。８時間後、ＴＬＣプレート上の単一のスポットが認められ、このスポットはｐＨＳに対応するＲｆ値を有した。トルエン溶液からのｐＨＳの回収は試みなかった。本実施例は、二相反応媒体においてオキシランビーズ固定ＰＤＣ２デカルボキシラーゼを使用するｐＨＳ製造を実証する。
【０１６５】
実施例９
ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用して二相反応媒体において製造したパラ−ヒドロキシスチレンの誘導体化の予測実施例
本予測実施例の目的は、誘導体化された化合物パラ−アセトキシスチレンを形成するための二相反応媒体由来の有機性抽出剤におけるｐＨＳの化学的誘導体化を実証することである。ｐＨＣＡは、最初に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株を使用する発酵によって製造される。次いで、生物生産されるｐＨＣＡは、発酵上清およびトルエンよりなる二相反応媒体において、ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用して、ｐＨＳに変換される。トルエン層が、ｐＨＣＡ枯渇発酵上清から分離された後、生物生産されるｐＨＳを無水酢酸と反応させ、パラ−アセトキシスチレンを形成させる。
【０１６６】
ｐＨＣＡの生物生産
実施例６に記載のように、ｐＨＣＡの生物生産を行う。
【０１６７】
生物生産されるｐＨＣＡの生体触媒によるｐＨＳの製造
１．０Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクターに、実施例６に記載のｐＨＣＡ発酵から得られる０．３３５Ｌの発酵上清を充填する。発酵上清はｐＨＣＡ、ケイ皮酸（ＣＡ）、フェニルアラニン、チロシン（これらはすべて組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって製造される）および塩をｐＨ６．０で含有する。ｐＨＣＡ含有発酵上清のｐＨを、酵素的脱炭酸のために、濃硫酸を使用して、ｐＨ６．０に調整する。実施例１に記載のように製造されるＰＤＣ２を含有する無細胞抽出物（０．３０ｍＬ、５５単位；２．２ｍｇタンパク質）を、高分子化阻害剤として４２ｍｇのプロステイブ（ＰｒｏＳｔａｂ）（登録商標）５４１５（チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ニューヨーク州タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ））を含有する０．１５Ｌの試薬用トルエンと共に添加する。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌する。反応温度を４０℃に設定する。終了前に、反応を２時間進行させる。反応の内容物を５００ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させる。有機層がエマルジョンを含有する場合、これを中等度の孔サイズのガラスフリットを備えたブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）漏斗を介してろ過することによって破壊する。ろ過物は、２つの非混和層、無色の有機層および黄色の水層を有する。相分離セルロースフィルターペーパーを通過させることによって層を分離し、有機層を選択的に受けフラスコに通過させる。有機層を回収し、直ちに、撹拌子を含有する２５０ｍＬ丸底フラスコに移す。フラスコに、ピリジン（ＣＡＳ１１０−８６−１、０．３００ｍＬ、３．７１ｍｍｏｌ）および無水酢酸（ＣＡＳ１０８−２４−７、４．０ｍＬ、４２．４ｍｍｏｌ）を充填する。アセチル化反応の進行は、すべてのｐＨＳが変換され、ただ単一のスポットがＴＬＣプレート上に出現するまでＴＬＣによってモニターする。減圧（１３．３ｋＰａ）下、穏やかな加熱（３０℃）を伴うロータリーエバポレーションによって、黄色オイルを回収する。単離されるオイル（１．４１ｇ）を、ガスクロマトグラフィーによって特徴付ける。アセトキシスチレン産物のさらなる精製は、既知の方法（例えば、チョスネック（Ｃｈｏｓｎｅｋ）ら、米国特許第５，１３６，０８３号明細書を参照のこと）によって、達成することができる。本予測実施例は、二相反応混合物の有機媒体に抽出されるｐＨＳが如何にして誘導体化され、パラ−アセトキシスチレンなどの誘導体化された産物を付与するかを実証する。
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００３年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／４６２，８２７号明細書および２００４年２月１７日に出願された米国仮出願第６０／ 号明細書の利益を主張し、その内容全体は参照として本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、二相反応媒体において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸からパラ−ヒドロキシスチレンを製造させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
パラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）は、広範な産業アプリケーションにおいて潜在的有用性を有する芳香族化合物である。例えば、ｐＨＳおよびそのアセチル化誘導体、パラ−アセトキシスチレン（ｐＡＳ）は、樹脂の生成のためのモノマー、エラストマー、粘着剤、被覆剤、自動車用仕上げ剤、インクおよび電子材料、ならびにエラストマーおよび樹脂処方における添加物としてのアプリケーションを有する。
【０００４】
ｐＨＳの化学合成のための多くの方法が公知である。例えば、ｐＨＳは、５工程プロセスにおいてエチルベンゼンから（特許文献１）または２工程プロセスにおいてパラ−ヒドロキシアセトフェノールから（特許文献２）製造することができる。これらの方法によって、ｐＨＳを作製することも可能であるが、それらは、典型的に、強力な酸性または塩基性反応条件、高い反応温度を要し、大量の所望されない副産物を生じる。さらに、化学的方法は、高価な出発物質を要し、ｐＨＳを製造するためのコストを引き上げる。ｐＨＳの広範な用途にもかかわらず、安価な材料供給源は開発されていない。
【０００５】
グルコースなどの簡単な炭素源からのｐＨＳの製造のための生物学的プロセスは、ベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）ら（特許文献３）によって記載されている。該開示では、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子かまたはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子のいずれか一方と組み合わせた、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する組換え宿主細胞を使用して、ｐＨＳを製造する。ＰＡＬ活性は、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ［ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）およびＰ−４５０レダクターゼ］系の存在下で、フェニルアラニンをパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）に変換する。高いＴＡＬ活性を有する酵素は、中間工程をなんら伴うことなく、チロシンを直接ｐＨＣＡに変換する。次いで、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）は、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換する。しかし、ｐＨＳの生物学的製造によって遭遇する問題は、最終産物の阻害であって、製造収量が制限される。具体的には、産物の濃度が上昇すると、微生物による産物の製造率は減少する。さらに、発酵培地において所定の臨界濃度に到達すると、産物によってＰＤＣ酵素および微生物が不活化される。
【０００６】
ｐＨＳによる最終産物阻害を軽減するための１つのアプローチは、二相抽出発酵を使用することであり、ここで、同時係属中の特許文献４においてベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）らにより記載のように、ｐＨＳが決して阻害または臨界濃度に到達することがないように、組換え製造宿主によって製造されるｐＨＳは、発酵中に非混和性有機相に抽出される。該開示に記載の方法は、ｐＨＳの改善された収量を生じた。しかし、商業的アプリケーションでは、さらに高い収量が求められる。
【０００７】
哲士（Ｔｅｔｓｕｊｉ）ら（特許文献５）は、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）から単離されたＰＤＣを使用して、ｐＨＣＡから、ビニル位に重水素原子を有するｐＨＳを製造するための方法を記載している。デカルボキシラーゼ反応は、重水素を含む水を含有する水性緩衝液中で行われる。特許文献６においてアゴ（Ａｇｏ）らは、フェルラ酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用し、水性緩衝液において、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）から４−ビニルグアイアコール（４−ヒドロキシ−３−メトキシスチレン）、ｐＨＳの誘導体を製造するための方法について記載している。これらの両方の方法における製造収量は、酵素の産物阻害によって制限される。さらに、産物は、基質、生体触媒、および緩衝液の塩から単離しなければならないため、産物の回収は複雑になる。
【０００８】
二相反応媒体においてｐＨＣＡからｐＨＳを製造させるための生体触媒的方法は、ｐＨＣＡおよびｐＨＳの製造を切り離し、従って、独立して、両方のプロセスの最適化を確実にする。生体触媒における、水相および水非混和性有機相よりなる二相反応媒体の使用は、動力学および熱力学的利点の両方を提供することができる（非特許文献１）。有機溶媒を適切に選択すれば、産物は水相から継続的に取り出され、従って、産物阻害が減少し、より高い製造収量が生じる。さらに、産物を有機相から容易に単離できるため、産物の回収は顕著に簡便化される。非特許文献２は、二相生体触媒プロセスを使用して、フェルラ酸デカルボキシラーゼ活性を有するバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）の細胞を休止させることによる、フェルラ酸の脱炭酸を介する４−ビニルグアイアコール（４−ヒドロキシ−３−メトキシスチレン）、ｐＨＳの誘導体の製造について記載している。クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、エチルエーテル、石油エーテル、シクロヘキサン、およびＣ５〜Ｃ８アルカンを含むいくらかの溶媒が評価された。ヘキサンは好適な溶媒として選択された。しかし、二相反応媒体においてＰＤＣ活性を有する酵素供給源を使用するｐＨＣＡからのｐＨＳの製造については、該開示には記載されていない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，５０３，２７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５２３，３７８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００１８６００号明細書
【特許文献４】米国特許出願第６０／４６２８２７号明細書
【特許文献５】特開平１１−１８７８７０号公報
【特許文献６】米国特許第５，９５５，１３７号明細書
【非特許文献１】ブルース（Ｂｒｕｃｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．７：１１６−１２４（１９９１）
【非特許文献２】リー（Ｌｅｅ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２３：２６１−２６６（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、高収量でｐＨＳを製造させるための方法の必要性が存在する。生体触媒の活性が保存されるｐＨＳを製造させるための生体触媒方法の必要性もまた存在する。商業的に実行可能であるべき方法のために、複数の反応サイクルにわたって生体触媒を再利用することが可能であることも所望される。
【００１１】
本出願人らは、二相反応媒体においてパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を使用し、ｐＨＣＡのｐＨＳへの生体触媒変換を使用して、ｐＨＳを高収量で製造させるための方法を発見することによって、上記の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、二相反応媒体におけるパラ−ヒドロキシケイ皮酸の生体触媒的脱炭酸によって、パラ−ヒドロキシスチレンを製造させるための方法を提供する。１つの実施態様では、本発明は、
ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を準備し；
ｂ）水相、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノールおよびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、該酵素供給源と、パラ−ヒドロキシケイ皮酸とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｃ）水相から抽出剤を分離し；そして
ｄ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法を提供する。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造する製造宿主を準備し；
ｂ）発酵培地中で製造宿主を増殖させ、ここで、製造宿主は、発酵培地中にパラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造し；
ｃ）発酵培地、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノール、およびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、工程（ｂ）由来の発酵培地と、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｄ）発酵培地から抽出剤を分離し；そして
ｅ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法を提供する。
【００１４】
配列の説明
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００１５】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００１６】
配列番号１は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｄｃ１）のヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号２は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１）のアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号３は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｄｃ２）のヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号４は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ２）のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号５〜８は、実施例１に記載のように、ｐｄｃ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号９〜１２は、実施例６に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８を構築するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号１３および１４は、実施例６に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８の首尾よい構築物を確認するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、二相反応媒体において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する酵素供給源を使用する、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）からのパラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）の製造のための方法を提供する。二反応媒体の有機相に抽出される酵素供給源の阻害産物への暴露の減少のため、この方法は、ｐＨＳの高い製造収量を生じる。さらに、方法は、酵素活性の優れた保存および多くの反応サイクルのための酵素供給源の再利用を提供する。ｐＨＳおよびそのアセチル化誘導体、パラ−アセトキシスチレンは、樹脂の生成のためのモノマー、エラストマー、粘着剤、被覆剤、自動車用仕上げ剤、インクおよび電子材料、ならびにエラストマーおよび樹脂処方における添加物としてのアプリケーションを有するため、該方法が使用される。
【００２４】
以下の定義が本明細書において使用され、特許請求の範囲および明細書の解釈のために照会されるべきである。
【００２５】
「ＣＡ」は、ケイ皮酸に使用される略語である。
【００２６】
「ｐＨＣＡ」は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸塩またはｐ−クマル酸としても公知であるパラ−ヒドロキシケイ皮酸に使用される略語である。
【００２７】
「ｐＨＳ」は、４−ビニルフェノールとしても公知であるパラ−ヒドロキシスチレンに使用する略語である。
【００２８】
「ＰＤＣ」は、ｐＨＣＡデカルボキシラーゼに使用される略語である。
【００２９】
「ＰＤＣ１」は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐＨＣＡデカルボキシラーゼに使用される略語である。
【００３０】
「ＰＤＣ２」は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐＨＣＡデカルボキシラーゼに使用される略語である。
【００３１】
「ｐｄｃ」は、ＰＤＣ活性を伴う酵素をコードする遺伝子に使用される略語である。
【００３２】
「ｐｄｃ１」は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ遺伝子の略語である。
【００３３】
「ｐｄｃ２」は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ遺伝子の略語である。
【００３４】
「ＴＡＬ」は、チロシンアンモニアリアーゼに使用される略語である。
【００３５】
「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼに使用される略語である。
【００３６】
「ＰＡＨ」は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼに使用される略語である。
【００３７】
用語「ＴＡＬ活性」は、チロシンからｐＨＣＡへの直接変換を触媒するタンパク質の能力を指す。
【００３８】
用語「ＰＡＬ活性」は、フェニルアラニンからケイ皮酸への変換を触媒するタンパク質の能力を指す。
【００３９】
「ｐａｌ」は、ＰＡＬ活性を伴う酵素をコードする遺伝子を表す。
【００４０】
「ｔａｌ」は、ＴＡＬ活性を伴う酵素をコードする遺伝子を表す。
【００４１】
用語「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」は、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の両方を含有するタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、酵素基質として、チロシンおよびフェニルアラニンの両方に少なくともいくつかの特異性を有する。
【００４２】
用語「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの触媒的変換を担うタンパク質系を指す。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ機能を実施する当該分野において既知のいくらかの酵素または酵素系の１つである。本明細書において使用する用語「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの変換を生じる一般的な酵素活性を指し、ここで、用語「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する特定のバイナリータンパク質を指す。
【００４３】
用語「二相反応媒体」は、水相および適切な量の抽出剤を含んでなる媒体を指す。
【００４４】
用語「水相」は、水性緩衝液、非緩衝化水溶液、発酵培地、または発酵上清を含むがこれらに限定されない水溶液を指す。
【００４５】
用語「抽出剤」は、ｐＨＳを溶解することができる溶媒を指す。本発明の典型的な抽出剤は水非混和性有機溶媒である。
【００４６】
用語「有機溶媒」は、二反応媒体において抽出剤としての役割を果たす有機溶媒を指す。
【００４７】
用語「増殖培地」および「発酵培地」は本明細書において交換可能に使用され、微生物を培養するための栄養物を含有する水溶液を指す。増殖培地は、さらに、微生物、微生物によって製造される産物、代謝中間体、ならびに塩、ビタミン、アミノ酸、補因子、および抗生物質などの他の成分を含有することができる。
【００４８】
用語「発酵上清」は、発酵が完了した後の発酵培地を指し、ここで、製造宿主および不溶生産物は、遠心分離またはろ過を含むがこれらに限定されない既知の方法によって取り出される。
【００４９】
用語「分配係数」とは、産物の有機溶媒への抽出のための平衡定数、具体的には、Ｋ＝［産物］有機相／［産物］水相を指す。
【００５０】
溶媒の「ｌｏｇＰ値」は、標準的なオクタノール：水混合物における溶媒の分配係数の対数を指す。ｌｏｇＰ値は、溶媒の極性の量的測定値を提供する。
【００５１】
用語「発酵可能な炭素基質」は、本発明の宿主生物体により代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖、オリゴ糖、多糖、および単炭素基質および／またはこれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。
【００５２】
「核酸」は、糖、ホスフェートおよびプリンもしくはピリミジンのいずれか一方を含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成される一本鎖または二本鎖であり得る分子を指す。細菌、下等真核生物、および高等動物および植物では、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は遺伝子材料を指す一方、「リボ核酸」（ＲＮＡ）はＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与する。
【００５３】
所定の部位での化学的に等価なアミノ酸の生成を生じるが、コードされるタンパク質の機能的目的には影響を及ぼさない遺伝子の変更は一般的であることが、当該分野において周知であるため、本発明は、特定の例示的配列以上のことを包含する。本発明の目的のために、置換が、以下の５つのグループのうちの１つの交換として規定される：
１．小さな脂肪族、非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性、負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；ならびに
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００５４】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンを、（グリシンのような）別の疎水性のより小さな残基、または（バリン、ロイシンもしくはイソロイシンのような）より疎水性の大きな残基をコードするコドンにより置換してよい。同様に、（グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような）１個の負に荷電した残基の別のものへ、または（アルギニンの代わりにリジンのような）１個の正に荷電した残基の別のものへの置換をもたらす変化もまた、機能的に等価な産物を生じさせることを期待することも可能である。多くの場合、タンパク質のＮ末端およびＣ末端部分の変更をもたらすヌクレオチド変化もまた、該タンパク質の活性を変更しないことが期待される。
【００５５】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。本明細書において使用する遺伝子は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含んでもまたは含んでいなくてもよい。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかし、これは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００５６】
「コード配列」は特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００５７】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対し３’側に配置される。プロモーターはそっくりそのまま生来の遺伝子に由来してよいか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の多様なエレメントから構成されてよいか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含んでなることができる。多様なプロモーターは、多様な組織もしくは細胞型において、または発生の多様な段階で、あるいは多様な環境もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることが、当業者に理解される。大部分の時間で大部分の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは普遍的に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、多様な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００５８】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現を影響することができる（即ち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結されている。コード配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結することができる。
【００５９】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体のゲノムへの変換を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と称される。
【００６０】
「野生型宿主細胞」または「生来の宿主細胞」は、生物体の本来または生来のバージョンである宿主生物体、即ち、形質転換されていない生物体を指す。
【００６１】
用語「酵素供給源」は、精製されたまたは部分的に精製された酵素自体、酵素活性を有する野生型または組換え宿主細胞、当該分野において公知の手段によってそのような細胞から得られる無細胞抽出物、および酵素活性を有する処置された野生型または組換え宿主細胞を含むがこれらに限定されないＰＤＣ活性を有する供給源を指す。
【００６２】
用語「処置された野生型宿主細胞」および「処置された組換え宿主細胞」は、それぞれ、野生型宿主および組換え宿主細胞を指し、洗浄、凍結乾燥、アセトンによる処置、または臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などの界面活性剤；トルエン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒；ならびに抗生物質による浸透化処理を含むがこれらに限定されない手段によって処置されている。
【００６３】
用語「生体触媒」は、特定の反応を触媒するために必要とされる活性を有する酵素供給源を指す。本発明では、用語「生体触媒」は、ｐＨＣＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を指す。
【００６４】
用語「生体触媒反応」は、酵素供給源によって触媒される反応を指す。本発明では、用語「生体触媒反応」は、ｐＨＣＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源によって触媒されるｐＨＳを生じるｐＨＣＡの脱炭酸を指す。
【００６５】
本明細書において使用する用語「発現」とは、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産物への転写および翻訳を意味することが意図される。発現では、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖が、最初に、しばしばメッセンジャーＲＮＡである相補ＲＮＡに転写され、次いで、遺伝子産物がタンパク質である場合、転写されたメッセンジャーＲＮＡは上記の遺伝子産物に翻訳される。
【００６６】
「過剰発現株」または「過剰製造株」は、野生株または非形質転換微生物における製造のレベルを超えるレベルで遺伝子産物を製造する組換え微生物を指す。
【００６７】
本明細書において使用する用語「製造宿主」は、本発明の方法における使用のためにｐＨＣＡを製造する能力を有する微生物を指す。本明細書において規定するように、製造宿主は、野生型であってもまたは組換え宿主細胞であってもよい。
【００６８】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または再結合されている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えてエレメントを有し、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、外来宿主における該遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特異的ベクターを指す。
【００６９】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの複製のために使用される技術である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，８００，１５９号明細書）。
【００７０】
本明細書において与えられたすべての範囲は、範囲の終端、およびまた中間の範囲にあるすべての要点をも含むものとする。
【００７１】
本明細書において使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）；ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニュージャージー州ホーボーケン（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）から出版されたたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【００７２】
本発明は、二相反応媒体において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する酵素供給源を使用する、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）からパラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）を製造させるための方法を提供する。ＰＤＣ酵素に対して阻害的である、製造されるｐＨＳは、二相反応媒体の有機相に抽出され、従って、水相において極めて低い濃度を維持する。ｐＨＳは、抽出剤から容易に回収するか、または回収前に抽出剤において化学的に誘導体化することができる。
【００７３】
ｐＨＣＡの供給源
本発明の方法のための出発材料、即ち、ｐＨＣＡ基質は、多くの方法によって得ることができる。例えば、トランス型が支配的であるｐＨＣＡは、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））およびＴＣＩアメリカ（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）（オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ））などの会社から市販されている。さらに、ｐＨＣＡは、当該分野において公知の任意の方法を使用して、化学合成によって製造することができる。例えば、ｐＨＣＡは、米国特許第４，３１６，９９５号明細書におけるピタット（Ｐｉｔｔｅｔ）ら、または米国特許第５，９９０，３３６号明細書におけるアレクサンドラトス（Ａｌｅｘａｎｄｒａｔｏｓ）によって記載のように、マロン酸とパラ−ヒドロキシベンズアルデヒドとを反応させることによって、得ることができる。あるいは、植物からｐＨＣＡを単離してもよい（Ｒ．ベンリーフ（Ｒ．Ｂｅｎｒｉｅｆ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：８２５−８３２（１９９８）および米国特許出願公開第２００２／０１８７２０７号明細書）。１つの実施態様では、ｐＨＣＡの供給源は、製造宿主を使用する生物生産由来である。別の実施態様では、製造宿主は、標準的なＤＮＡ技術を使用して製造することができる組換え宿主細胞である。これらの組換えＤＮＡ技術については、本明細書において参照として援用されているサンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）に記載されている。
【００７４】
ｐＨＣＡの製造のための適切な製造宿主としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様では、ｐＨＣＡの製造のための宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｉ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である。別の実施態様では、ｐＨＣＡの製造のための宿主細胞は、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかを過剰製造するこれらの細菌の変異株である。以下に記載のように、ｐＨＣＡの製造がチロシンに関与する経路を介して行われる場合、チロシン過剰製造株が使用される一方、ｐＨＣＡがフェニルアラニンに関与する経路を介して製造される場合、フェニルアラニン過剰製造株が使用される。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ならびに他の細菌のチロシン過剰製造株については、当該分野において公知である（マイチ（Ｍａｉｔｉ）ら、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ３７：５１−６５（１９９５））。使用することができるエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）チロシン過剰製造株の例は、オムニジーン・バイオプロダクツ・インク（ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．）マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から市販されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１である。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ならびに他の細菌のフェニルアラニン過剰製造株についても、当該分野において公知である（マイチ（Ｍａｉｔｉ）ら、上掲およびボンガーテス（Ｂｏｎｇａｅｒｔｅｓ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：２８９−３００（２００１））。使用することができるフェニルアラニン過剰製造株の例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＳＴ７４であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から株ＡＴＣＣ番号３１８８４として利用することができる。
【００７５】
１つの実施態様では、本明細書において参照として援用される米国特許出願公開第２００３／００７９２５５号明細書におけるチィ（Ｑｉ）らによる記載のように、ｐＨＣＡが製造される。該開示に従えば、ｐＨＣＡは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現するように操作された組換え微生物を使用して、製造させることができる。この形質転換された微生物は、グルコースなどの発酵可能な炭素源をフェニルアラニンに代謝し、該フェニルアラニンは、ＰＡＨによってチロシンに変換される。製造されるチロシンはＴＡＬ酵素によってｐＨＣＡに変換される。ＴＡＬをプロセシングする任意の適切な酵素を、使用することができる。例えば、ＰＡＬおよびＴＡＬ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）活性の両方を有する酵素を使用してもよい。また、米国特許第６，３６８，８３７号明細書におけるゲイテンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）らによって記載されているように、増強されたＴＡＬ活性を有するための野生型酵母ＰＡＬ酵素の変異を介して製造されるＴＡＬ酵素を使用してもよい。あるいは、ブリーニグ（Ｂｒｅｉｎｉｇ）ら（米国特許出願公開第２００４／００２３３５７号明細書）に記載の酵母トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）由来の誘導性ＴＡＬ酵素またはカイント（Ｋｙｎｄｔ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２：２４０−２４４（２００２））もしくはホワン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属中の米国特許出願第６０／３９７８２０号明細書、国際公開第２００４／００９７９５号パンフレット）により記載されているような細菌性ＴＡＬ酵素を使用することができる。
【００７６】
別の実施態様では、パラ−ヒドロキシケイ皮酸は、本明細書において参照として援用されるゲイテンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）ら、上掲によって開示される方法のいずれか１つによって製造される。例えば、酵母ＰＡＬ活性をコードする遺伝子および植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子を発現するように操作された組換え微生物を使用して、ｐＨＣＡを製造させることができる。この形質転換された微生物は、グルコースなどの発酵可能な炭素源をフェニルアラニンに代謝し、該フェニルアラニンは、ＰＡＬ酵素によってケイ皮酸（ＣＡ）に変換される。続いて、ＣＡは、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系の作用によってｐＨＣＡに変換される。あるいは、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を発現する組換え微生物を使用して、ｐＨＣＡを発現させてもよい。ＴＡＬ酵素は、チロシンを直接ｐＨＣＡに変換する。上掲に記載されるように、任意の適切なＴＡＬ酵素を使用することができる。
【００７７】
ｐＨＣＡの生物生産のために、使用すべき微生物を、適切な増殖培地中、発酵槽において培養する。撹拌式タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、バブル式発酵槽、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の適切な発酵槽を使用することができる。微生物培養の維持および増殖のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版は、マグロー・ヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９８６を参照のこと）。特定の遺伝子発現のための微生物の特定の要件に依存して、適切な増殖培地、ｐＨ、温度および好気的、微好気、または嫌気的条件のための要件について、考慮しなければならない。使用する増殖培地はそれほど重要ではないが、該培地は、使用する微生物の増殖を支持し、所望される産物を製造するのに必要な酵素的経路を促進しなければならない。酵母抽出物またはペプトンなどの有機性窒素および発酵可能な炭素源を含有する複合培地；無機培地；ならびに規定培地を含むがこれらに限定されない従来の増殖培地を使用することができる。適切な発酵可能な炭素源としては、グルコースまたはフルクトースなどの単糖、ラクトースまたはスクロースなどの二糖、オリゴ糖およびデンプンまたはセルロースなどの多糖、一炭素基質ならびに／あるいはそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。適切な炭素源に加えて、増殖培地は、当業者に公知のアンモニウム塩、酵母抽出物またはペプトンなどの適切な窒素源；鉱物、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有してもよい（ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、上掲）。
【００７８】
バッチまたは流加培養発酵を使用してもよい。当該分野において周知であるバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、プロセス中に人工的に変更されることはない閉鎖系である。流加培養発酵は標準的なバッチ系のバリエーションであって、ここで、栄養物、例えば、グルコースが発酵中に漸増される。栄養物の添加の量および速度は、日常的実験によって決定することができる。例えば、発酵ブロスにおける極めて重要な栄養物の濃度を発酵中にモニターしてもよい。あるいは、ｐＨ、溶存酸素、および二酸化炭素などの排出気体の分圧などのより容易に測定される因子をモニターしてもよい。これらの測定されるパラメータから、栄養物の添加速度を決定することができる。
【００７９】
ＰＤＣ活性を有する酵素供給源
ＰＤＣ活性を有する酵素は、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（ハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：２６０４−２６１２（２００１））、エルビニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）（ハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２１５−２１９（１９９３））、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、およびラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）などのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種（ファン・ビーク（Ｖａｎ Ｂｅｅｋ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５３２２−５３２８（２０００））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびハフニア（Ｈａｆｎｉａ）の種（リンドセイ（Ｌｉｎｄｓａｙ）ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．３９：１８１−１８７（１９７５））および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（キャビン（Ｃａｖｉｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１４６６−１４７１（１９９８））を含む様々な細菌において見出すことができる。１つの実施態様では、ＰＤＣ酵素の供給源は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である。別の実施態様では、ＰＤＣ酵素の供給源は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＰＤＣ２）である。
【００８０】
ＰＤＣ活性を有する有用な酵素供給源としては、精製されたまたは部分的に精製された酵素自体、酵素活性を有する野生型または組換え宿主細胞、および当該分野において公知の手段によってそのような細胞から得られる無細胞抽出物が挙げられる。１つの実施態様では、ＰＤＣ活性を有する野生型細胞は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００８１】
別の実施態様では、酵素供給源は、当該分野において公知である方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲）を使用して、ＰＤＣ酵素をコードする遺伝子で適切な宿主細胞を形質転換することによって、構築することができるＰＤＣ活性を有する組換え宿主細胞である。１つの実施態様では、ｐｄｃ遺伝子はラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）から単離され、配列番号１として付与される。別の実施態様では、ｐｄｃ遺伝子は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離され、配列番号３として付与され、使用される。ｐｄｃ遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主の細胞において製造させてもよい。
【００８２】
酵素供給源としての細菌宿主細胞
細菌の発現系および外来性タンパク質の高レベルの発現を指令する調節配列を含有する発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれも、ｐｄｃ遺伝子の製造のためのキメラ遺伝子を構築するために使用し得る。次いで、これらのキメラ遺伝子は、酵素の高レベルの発現を提供するために、形質転換を介して、適切な微生物に導入し得る。
【００８３】
従って、例えば、適切なプロモーターの制御下でのＰＤＣ酵素をコードするキメラ遺伝子の導入が、酵素の製造の増加を実証することが期待される。生来の宿主細胞ならびに異種宿主の両方においてｐｄｃ遺伝子を発現させることが有用であろうと考えられる。本発明の遺伝子の生来の宿主への導入は、ＰＤＣ酵素の現存の製造のレベルを上昇させる。さらに、ｐｄｃ遺伝子はまた、非生来の宿主細菌に導入してもよい。
【００８４】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該分野において周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自己複製もしくは染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の制御を有する遺伝子の５’側領域および転写の終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’側領域を含んでなる。両方の制御領域とも組換え宿主細胞に相同な遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、そのような制御領域は、製造宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことを理解すべきである。
【００８５】
所望の宿主細胞において、ｐｄｃの発現を駆動するのに有用である、開始制御領域またはプロモーターは多数あり、かつ当業者に馴染みである。事実上、この遺伝子を駆動することができるいかなるプロモーターも本発明に適し、これらは、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に有用）；ならびにｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での発現に有用な多様なファージプロモーターを含むが、これらに制限されない。
【００８６】
終了制御領域もまた、好適な宿主に生来の多様な遺伝子由来であり得る。場合により、終了部位は必要ではないが、しかし、含まれている場合が最も好ましい。
【００８７】
１つの実施態様では、ｐｄｃ遺伝子の発現のための好適な異種宿主細胞は、菌類または細菌ファミリー内において広範に見出すことができ、広範な範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性で増殖する微生物宿主である。例えば、任意の細菌、酵母、または糸状菌は、ｐｄｃ遺伝子の発現に適切な宿主であろうと考えられる。細胞の供給材料にかかわらず、転写、翻訳およびタンパク質の生合成装置は同じであるため、細胞バイオマスを作製するのに使用される炭素供給材料にかかわらず、機能的遺伝子が発現される。大規模微生物増殖および機能的遺伝子発現は、広範な単純あるいは複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、および／またはメタンなどの飽和炭化水素あるいは光合成もしくは化学合成独立栄養宿主の場合の二酸化炭素を利用することができる。しかし機能的遺伝子は、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素もしくは小さな無機イオンを含む任意の微量栄養物の形態および量を含み得る特定の増殖条件によって、調節、抑制または低下させることができる。さらに、機能的遺伝子の調節は、培養物に添加され、典型的に栄養またはエネルギー源とはみなされない特定の調節分子の有無によって達成することができる。増殖速度もまた、遺伝子の発現において重要な調節因子である。
【００８８】
好適な宿主株の例としては、腸内細菌（例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌；ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などのシアノバクテリア；サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母；アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアーソロボトリーズ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの糸状菌；ならびにスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）などの藻類が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様では、宿主株はエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、またはピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）である。組換え微生物細胞は上記のように培養することができる。
【００８９】
酵素供給源としての植物細胞宿主
別の実施態様では、ｐｄｃ遺伝子を含有する植物細胞を使用する。ｐｄｃ遺伝子を使用して、ＰＤＣの発現のための微生物遺伝子を発現する能力を有するトランスジェニック植物を作製することができる。好適な植物宿主は高製造レベルのＰＤＣを支持するあらゆる種類である。適切な緑色植物としては：ダイズ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、トウガラシ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ，Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＤＣ酵素の過剰製造は、最初に、発生の所望の段階で所望の組織におけるある遺伝子の発現を指令することが可能なプロモーターにコード領域が操作可能に連結されている、本発明のキメラ遺伝子を構築することにより達成することができる。便宜的理由上、キメラ遺伝子は、同一の遺伝子由来のプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなることができる。転写終了シグナルをコードする３’の非コード配列もまた提供しなければならない。キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を助長するために、１個もしくはそれ以上のイントロンを含んでなることもできる。
【００９０】
コード領域の発現を含むことが可能ないかなるプロモーターおよびいかなるターミネーターのいかなる組み合わせも、キメラ遺伝子配列に使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例として、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーターが挙げられる。使用することができる効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と操作可能に連結されているそのようなプロモーターは、本発明の遺伝子産物の発現を促進することが可能であるべきである。本発明において使用することができる高レベル植物プロモーターとして、例えば、ダイズ由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：４８３−４９８ １９８２）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが既知である（例えばＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャシュモア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、ニューヨーク州プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ，ＮＹ）（１９８３）、２９〜３８頁；コルジ，Ｇ．（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１３９９（１９８３）、およびダンスムイル，Ｐ．（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【００９１】
次いで、キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用されるであろう方法に依存する。当業者であれば、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、そして増殖させるためにプラスミドベクターに存在しなければならない遺伝子エレメントを十分に知っている。また当業者であれば、異なる独立の形質転換事象が異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすこと（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８（１９８５）；デアルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６（１９８９））、そして従って、複数の事象が、所望の発現レベルおよびパターンを表す株を得るためにスクリーニングされなければならないことも認識するであろう。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３，（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロックゼクＪ．（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析により成し遂げられ得る。
【００９２】
アプリケーションによっては、ＰＤＣ酵素を異なる細胞区画に向かわせることが有用である。従って、輸送配列（キーグストラ，Ｋ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ，Ｋ）Ｃｅｌｌ ５６：２４７−２５３（１９８９））、シグナル配列もしくは小胞体局在化をコードする配列（クリスピールズ，Ｊ．Ｊ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３（１９９１））または核局在化シグナル（ライクヘル，Ｎ（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２（１９９２））のような適切な細胞内ターゲッティング配列が付加されおよび／または既に存在するターゲッティング配列を除去した酵素をコードするようにコード配列を改変することにより、上述されたキメラ遺伝子をさらに補うことができることが予見される。引用された参照文献はこれらのそれぞれの例を与えるが、該一覧は全てを掲載しているわけではなく、そして、本発明において有用である有用性を有するより多くのターゲッティングシグナルが将来発見されてもよい。
【００９３】
植物細胞の培養は、通常、通気条件下、例えば、１５℃〜４０℃の間の温度で、１〜３０日間、振盪培養または液内通気培養によって、行われる。
【００９４】
ＰＤＣ活性を有する酵素供給源のタイプ
培養の完了後、野生型または組換え宿主細胞を、任意の既知の方法、例えば、遠心分離またはろ過によって回収し、次いで、本発明の方法におけるＰＤＣ活性の酵素供給源として使用することができる。場合により、細胞を、洗浄、凍結乾燥、または使用前のアセトンによる処置によって処置してもよい。また、細胞を、浸透化剤で処置し、それらの細胞膜を、有機化学物質に対してより浸透可能にすることもできる。適切な浸透化剤は当該分野において周知であり、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などの界面活性剤；トルエン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒；ならびに抗生物質を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
別の実施態様では、宿主細胞によって細胞内または細胞外で製造されるＰＤＣ酵素は、当該分野において周知の方法によって単離および精製される。例えば、細胞内で製造されるＰＤＣ酵素の場合、単離および精製は以下の様式で行われる。細胞を、遠心分離またはろ過を含むがこれらに限定されない既知の方法を使用して、培養培地から分離する。細胞を洗浄し、次いで、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレス、超音波破砕、ホモジナイザー、ダイノ・ミル（Ｄｙｎｏ Ｍｉｌｌ）、または当該分野において既知の他の手段を使用して破砕し、無細胞抽出物を得る。無細胞抽出物を遠心分離し、細胞破砕物を取り出す。１つの実施態様では、無細胞抽出物を、ＰＤＣ酵素活性の酵素供給源として使用する。
【００９６】
別の実施態様では、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動などを含むがこれらに限定されない当該分野において既知の方法を使用して、ＰＤＣ酵素を無細胞抽出物から精製する。ＰＤＣ酵素が細胞外で製造される場合、無細胞抽出物についての記載と同じ様式で培養細胞を処置し、精製された酵素を得ることができる。
【００９７】
別の実施態様では、野生型もしくは組換え宿主細胞、無細胞抽出物、またはＰＤＣ活性を有する精製された酵素は、使用前に固定化される。細胞および酵素の固定化の方法については、当該分野において周知である（例えば、ウィータル（Ｗｅｅｔａｌ）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第ＸＬＩＶ巻、Ｋ．モーズバッハ（Ｋ． Ｍｏｓｂａｃｈ）編、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９７６）、ビカスタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、ヒューマナ出版（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）（１９９７）、およびテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９１）を参照のこと）。例えば、ＰＤＣ活性を有する酵素供給源は、ポリマーゲルにおける包括、固体支持体上への吸着、二官能性試薬を使用する共有架橋、あるいはガラス、ポリスチレン、ナイロン、またはポリアクリル酸誘導体などの不溶性マトリックスに対する共有結合によって、固定化することができる。１つの実施態様では、無細胞抽出物または精製された酵素を、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手可能なオキシランアクリルビーズへの共有性付着によって固定する。別の実施態様では、ビカスタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）、上掲に記載のように、野生型または組換え宿主細胞を、アルギン酸カルシウムビーズにおける包括によって固定化する。場合により、包括された細胞を、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドまたは当該分野において公知の他の適切な架橋剤によって、架橋してもよい。
【００９８】
抽出剤
ＰＤＣ活性を有する酵素供給源を使用するｐＨＣＡからｐＨＳへの生体触媒変換に有用な抽出剤の選択は重要である。抽出剤は、好ましくは、本発明の方法における使用のための次の要件を満たすべきである：水における低い溶解度、産物ｐＨＳに対する大きな分配係数、基質ｐＨＣＡに対する低い分配係数、高い化学および熱安定性、非生分解性、低コスト、大量に利用できること、および産物の回収に対する好ましい特性。さらに、抽出剤は酵素供給源の酵素活性を阻害すべきではなく、酵素を回収し、複数回の変換サイクルで再使用できるように、酵素供給源は、水相および抽出剤よりなる二相反応媒体において安定であるべきである。抽出剤は、典型的に水非混和性有機溶媒である。生細胞を使用する抽出生体触媒のための溶媒選択ストラテジーについては、記載されている（ブルース（Ｂｒｕｃｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．７：１１６−１２４（１９９１））。該開示では、溶媒の生物学的適合性を、標準的なオクタノール：水混合物における溶媒の分配係数の対数であるそのｌｏｇＰ値に基づいて予測する。ｌｏｇＰ値は、溶媒の極性の量的測定値を提供する。しかし、溶媒のｌｏｇＰ値と本明細書において使用されるＰＤＣ活性の酵素供給源とのその生物学的適合性との間の相関関係は見出されなかった。本発明の方法における使用のための溶媒の生物学的適合性は、ＰＤＣ活性を有する酵素供給源を有機溶媒に暴露し、暴露後、ＰＤＣ酵素の活性を測定することによって、経験的に決定しなければならない。これらの実験では、溶媒が、阻害的であり得るいかなる不純物をも含有しないことを確実にするように配慮すべきである。適切な溶媒として、トルエン（ＣＡＳ番号１０８−８８−３、ｌｏｇＰ＝２．８）、デカン酸メチル（ＣＡＳ番号１１０−４２−９、ｌｏｇＰ＝４．４１）、２−ウンデカノン（ＣＡＳ番号１１２−１２−９、ｌｏｇＰ＝４．２１）、ヘキサン（ＣＡＳ番号１１０−５４−３、ｌｏｇＰ＝３．９）、ジクロロメタン（ＣＡＳ番号７５−０９−２、ＬｏｇＰ＝１．２５）、２−デカノール（ＣＡＳ番号１１２０−０６−５、ｌｏｇＰ＝３．７１）、４−デカノール（ＣＡＳ番号２０５１−３１−２、ｌｏｇＰ＝３．７１）、３−デカノン（ＣＡＳ番号９２８−８０−３、ｌｏｇＰ＝３．２）、４−デカノン（ＣＡＳ番号６２４−１６−８、ｌｏｇＰ＝３．２）、１−ノナノール（ＣＡＳ番号１４３−０８−８、ｌｏｇＰ＝３．３）、２−ノナノール（ＣＡＳ番号６２８−９９−９、ｌｏｇＰ＝３．２２）、２−ヘプタノール（ＣＡＳ番号５４３−４９−７、ｌｏｇＰ＝２．２４）およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のすべての溶媒は、例えば、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））から市販されている。
【００９９】
１つの実施態様では、ＰＤＣ１活性を有する酵素供給源は、デカン酸メチル、トルエン、ジクロロメタン、４−デカノール、またはそれらの混合物と共に使用される。別の実施態様では、ＰＤＣ２活性を有する酵素供給源は、トルエン、デカン酸メチル、２−デカノール、４−デカノン、２−ノナノール、ジクロロメタンまたはそれらの混合物と共に使用される。
【０１００】
ｐＨＳおよびその誘導体を製造させるための方法
上記のようにして得られるｐＨＣＡ基質は、二相反応媒体の水相としての役割を果たす適切な緩衝溶液に添加される。使用される緩衝液は、ＰＤＣ酵素の活性を維持する当該分野において公知の任意の緩衝液であり得、所望のｐＨ、典型的に、ｐＨ３．５〜８で緩衝能を提供する（キャビン（Ｃａｖｉｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１４６６−１４７１（１９９８））。１つの実施態様では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．２Ｍリン酸緩衝液が使用される。ｐＨＳの大規模製造に関与する別の実施態様では、低濃度緩衝液または緩衝液を伴わない水溶液が水相として使用される。この場合、所望のｐＨは反応経過中の酸または塩基の添加によって維持される。生物生産されたｐＨＣＡの場合、水相は、生体触媒的反応に直接使用することができるｐＨＣＡを含有する発酵培地であり得る。緩衝液の添加によって、発酵培地のｐＨおよび緩衝能を調整する必要もあり得る。あるいは、上記のようにして、反応中の酸または塩基の添加によって、所望のｐＨを維持してもよい。１つの実施態様では、不溶性材料のために存在する細胞および任意の固体が発酵培地から取り出され、生体触媒的反応の水相として使用される発酵上清を与える。細胞および不溶性材料は、遠心分離またはろ過を含むがこれに限定されない当該分野において公知の任意の方法によって、取り出すことができる。典型的に、ｐＨＣＡは、約３０〜約２００ｍＭの濃度で水相に存在する。
【０１０１】
上記のＰＤＣ活性を有する酵素供給源は、典型的に、緩衝水溶液から添加される。酵素供給源は、典型的に、二相反応媒体において、水相の１ミリリットルあたり約０．０１〜約１００単位のＰＤＣ活性の濃度で使用される。ＰＤＣ活性の量は、２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０、３０℃でｐＨＣＡを基質として使用して、１単位が溶液の１ｍＬあたり１分間あたり１μｍｏｌのｐＨＳを放出する単位で表される。
【０１０２】
上記の抽出剤を水性緩衝液に添加して、約５重量％〜約７０重量％、さらに約２０重量％〜約５０重量％の抽出剤を含有する二相反応媒体を生じさせる。抽出剤は、酵素供給源の添加のまえ、同時、または後に水相に添加することができる。酵素供給源の添加の後に抽出剤を添加する場合、産物の濃度が阻害レベルに到達しないように、できるだけ直ぐに該抽出剤を添加すべきである。
【０１０３】
生体触媒的反応は、任意の適切なリアクターにおいて、約４℃〜約６０℃、さらに、約３０℃〜約４５℃の範囲の温度で行われる。生体触媒的反応のための適切なリアクターは、当該分野において周知である（例えば、ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅａｃｔｏｒｓ、ラルフ・メッシング（Ｒａｌｐｈ Ａ． Ｍｅｓｓｉｎｇ）編、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９７５、第９章、１５１〜１５６頁；チーサム（Ｃｈｅｅｔｈａｍ）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、アラン・ワイズマン（Ａｌａｎ Ｗｉｓｅｍａｎ）編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９８５、パートＡ、第３章、１０７〜１１６頁；ケント（Ｋｅｎｔ）ら、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻、アラン・ワイズマン（Ａｌａｎ Ｗｉｓｅｍａｎ）編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９７８、第２章、６３〜７０頁；および本明細書における参照文献を参照のこと）。例として、撹拌式タンクリアクター、充填床リアクター、流動床リアクター、チューブ式リアクター、ホローファイバー型リアクターおよびバイオフィルムリアクターが挙げられる。１つの実施態様では、撹拌式タンクリアクターが使用される。リアクターは、バッチまたは連続態様で操作することができる。バッチ態様では、培地の組成が稼動開始時に設定されプロセス中に変更されない。連続態様では、基質および抽出剤が稼働中にリアクターに添加され、二相反応媒体が取り出される。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、分光光度法、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または当該分野において公知の他の方法を使用して、時間の関数としてｐＨＳの濃度を測定することによって、追跡される。
【０１０４】
バッチ態様を使用した反応の完了後、重力式沈殿槽または遠心分離を含むがこれに限定されない当該分野において既知の手段によって、２つの相が分離される。場合によって、エマルジョンが形成し得る。エマルジョンは、ろ過または遠心分離などの当該分野において公知の方法を使用して破壊することができる。酵素供給源は、限外ろ過、ナノろ過などを含むが、これらに限定されない当該分野において公知の方法を使用して、水相から回収し、次いで、以後の反応において再使用する。固定化された酵素供給源を使用するか、または酵素供給源が無傷（ｉｎｔａｃｔ）な細胞である場合、生体触媒の回収は簡素化される。この場合、固定化された酵素供給源は、ろ過、遠心分離、または当該分野において公知の他の方法を使用して、水相から回収することができる。産物ｐＨＳは、エバポレーション、蒸留、または樹脂もしくはモレキュラーシーブによる吸着を含むがこれらに限定されない当該分野において周知の方法を使用して、抽出剤から回収することができる。
【０１０５】
連続態様では、二相反応媒体はリアクターから連続的または定期的に取り出すことができる。２つの相は、重力式沈殿槽、遠心分離器、またはハイドロサイクロンを含むがこれらに限定されない当該分野において公知の手段によって、分離される。重力式沈殿槽の例については、本明細書において参照として援用される米国特許第４，８６５，９７３号明細書におけるコレルプ（Ｋｏｌｌｅｒｕｐ）らにより記載されている。遠心分離およびハイドロサイクロンの使用については、産業的プロセシングの分野において周知である（例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、エルバス（Ｅｌｖｅｒｓ）ら編、ＶＣＨパブリッシャーズ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）第Ｂ２巻、１１章、１９８８を参照のこと）。分離後、酵素供給源を含有する水相をリアクターに再循環させることができる。あるいは、新鮮な酵素供給源をリアクターに添加してもよい。固定化された酵素供給源を使用する場合、リアクター内の酵素供給源を補充する必要はない。抽出剤を処置して、上記の手段によって産物を回収する。次いで、産物のさらなる抽出のために、抽出剤をリアクターに戻して再循環させてもよい。あるいは、新鮮な抽出剤を連続的にリアクターに添加し、取り出された抽出剤を取り換えてもよい。
【０１０６】
連続態様の別の実施態様では、ｐＨＣＡ基質および酵素供給源を含んでなる水素がリアクターに含有され、水相が連続的に取り出され、外部の抽出カラムにおいて、抽出剤、即ち、有機溶媒と接触される。上記のリアクターのいずれを使用してもよい。この態様では、二相反応媒体は、外部カラムにおいて形成される。発酵および生体触媒反応における外部抽出カラムの使用については、当該分野において周知である（例えば、イートマン（Ｅｉｔｅｍａｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：６１４−６１８（１９８９））。水相および抽出剤は、上記の方法のいずれかを使用して二相反応媒体から分離され、水相はリアクターに戻される。あるいは、新鮮な水相をリアクターに添加してもよい。抽出剤を処置して、上記の手段によって産物を回収する。抽出剤を再循環させてもよく、または新鮮な抽出剤を連続的に抽出カラムに添加してもよい。産物ｐＨＳがリアクターにおいて阻害レベルに到達しないように、条件を調整しなければならない。
【０１０７】
１つの実施態様では、ｐＨＳは、回収される前に、抽出剤において化学的に誘導体化してもよい。当該分野において公知の任意の適切な化学的誘導体化方法を使用することができる。ｐＨＳの適切な誘導体は、多様なエーテルおよびエステルを含むがこれらに限定されない。ｐＨＳから誘導されるエーテルおよびエステルの例は、以下に示す一般式を有する化合物を含むが、これらに限定されない：
【０１０８】
【化１】
【０１０９】
［式中、Ｒ４は、メチル（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１：４４２４−４４２５（１９５９））、ｔ−ブチル（ゲーブル（Ｇａｂｌｅ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：３９７０−３９７９（２００２））、アルキル（ハッサネイン（Ｈａｓｓａｎｅｉｎ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３１０６−３１１３（１９８９））、シリルエーテル（ナカハマ（Ｎａｋａｈａｍａ）ら、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１５：２９９−３３５（１９９０））、アリル（ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）ら、米国特許第５，６３３，４１１号明細書）、ｔ−ブトキシカルボニル（ネーダー（Ｎａｄｅｒ）ら、米国特許第５，０８２，９６５号明細書）、ヒドロキシエトキシ（イノクマ（Ｉｎｏｋｕｍａ）ら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ ４０：４０１−４１１（１９９５））、アセトキシ（スーニク（Ｓｏｕｎｉｋ）ら、米国特許第５，４６３，１０８号明細書）、ホルメート（テシアー（Ｔｅｓｓｉｅｒ）ら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ： Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ２６６、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、１９８４）、グリシジル（エリクソン（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ）ら、米国特許第６，２５５，３８５号明細書）、ベンゾエート（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１：４４２４−４４２５（１９５９））、フェニルカーボネート（ウィットコーム（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：７１０５−７１１１））、テトラヒドロピラン（メンズラー（Ｍｅｎｚｌｅｒ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０：３４５−３４８（２０００））、ベンジル（コーテチャ（Ｋｏｔｅｃｈａ）ら、Ｓｙｎｌｅｔｔ．１９９２：３９５）、またはポリ（エチレンオキシド）（イノクマ（Ｉｎｏｋｕｍａ）ら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ５４：１２３−１３０（２００１））である］。括弧内に記載の参照文献（これらはすべて、本明細書において参照として援用される）は、引用された誘導体を合成するために使用することができる方法を記載している。別の実施態様では、ｐＨＳは、米国特許第５，９５９，０５１号明細書および同第６，２５８，９０１号明細書（両方とも、本明細書において参照として援用される）におけるカネコ（Ｋａｎｅｋｏ）らにより記載の方法を使用して、ポリ（パラ−ヒドロキシスチレン）および他のコポリマーに高分子化される。別の実施態様では、ｐＨＳ誘導体はパラ−アセトキシスチレンであり、米国特許第５，４６３，１０８号明細書におけるスーニク（Ｓｏｕｎｉｋ）らにより記載の方法を使用して、製造することができる。誘導体化後、上記の方法を使用して、誘導体化された産物を抽出剤から回収する。
【実施例】
【０１１０】
本発明を以下の実施例でさらに規定する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、具体的説明のみとして示されることを理解すべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【０１１１】
略語の意味は次のようである：「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｒｐｍ」は１分間あたりの回転数を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はμメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長での光学密度を意味し、「ＯＤ５５０」は５５０ｎｍの波長での光学密度を意味し、「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを意味し、「Ｒｆ」は移動率、即ち、ＴＬＣにおいてゾーンの中心が移動した距離対同時に移動相が移動した距離の割合を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＵＶ／ＶＩＳ」は紫外および可視波長範囲における分光光度法を意味し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味し、「ＭＨｚ」はメガヘルツを意味し、「Ａ３１５」は３１５ｎｍの波長で測定された吸収を意味し、「ΔＡ３１５」は３１５ｎｍの波長で測定された吸収の変化を意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「Ｘ−ｇａｌ」は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチあたりのポンドを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｋＶ」はキロボルトを意味し、「μＦ」はマイクロファラッドを意味し、「ｗ／ｖ」は溶液の重量あたりの溶質の重量を意味する。
【０１１２】
一般的方法
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．ムレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーク（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、アメリカン・ソサイエティ・フォア・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）（１９９４））またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウエル・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９）に記載の通りに見ることができる。すべての試薬ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、他に特定しない限りアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ＢＤダイアグノスティクス・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（（メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、旧ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、旧ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））より入手した。
【０１１３】
すべての化学物質は試薬用であり、製造者または販売者から受け取ったままの状態で使用した。他に示さない限り、生化学物質はシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手し、乾燥培地はＢＤダイアグノスティクス・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）より入手した。すべての溶媒は、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。水は、ＥＭサイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ニュージャージー州ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））またはアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製の瓶入りの分光分析用の水であった。本発明者らは、多様な製造者由来の供給物を交換可能に使用した。すべてのクロマトグラフィー樹脂は、製造者によって提供された指示に従って製造および維持した。
【０１１４】
実施例において使用したＬＢ培養培地は、培地１リットルあたり、以下、即ち、バクト（Ｂａｃｔｏ）−トリプトン（１０ｇ）、バクト（Ｂａｃｔｏ）−酵母抽出物（５ｇ）およびＮａＣｌ（１０ｇ）を含有する。
【０１１５】
本発明において使用する非組換え生物体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））から入手した。これらの培養物を、凍結乾燥状態から、適切な培地の懸濁培養物に移し、−８０℃での長期間保存のために１５％グリセロール中に維持した。
【０１１６】
生物体の増殖に関与するすべての操作は、他に示さない限り、３７℃で、ニュー・ブランスウィック・インキュベーター・シェーカー・モデルＧ２５ ３（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｓｈａｋｅｒ Ｍｏｄｅｌ Ｇ２５ ３）（ニュー・ブランスウィック・サイエンティフィック・コ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）（ニュージャージー州エジソン（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））において実施した。無細胞抽出物は、細胞を、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中１ｍＬあたり３５または７０光学密度（ＯＤ６００）単位の光学密度に再懸濁し、フレンチ・プレッシャー・プレス（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｒｅｓｓ）を介する通過により細胞を溶解することによって、製造した。
【０１１７】
ｐＨＣＡおよびｐＨＳの分析
以下の技術、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法、およびＨＰＬＣのうち１つもしくはそれ以上を使用して、ｐＨＣＡおよびｐＨＳの混合物の分析を実施した。固体支持体としてシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、独国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））および移動相として酢酸エチルを使用して、ＴＬＣを実施した。ＨＰＬＣは、ダイオードアレイ検出器およびゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）３００ステイブル・ボンド・アナライティカル（Ｓｔａｂｌｅ Ｂｏｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、アギレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を伴って実施した。ＨＰＬＣ分離は、２つの溶媒を組み合わせた勾配：溶媒Ａ、ＨＰＬＣ用水中０．１％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸を組み合わせた勾配を使用して、達成した。移動相の流速は１．０ｍＬ／分であった。使用した溶媒の勾配を表１に示す。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
単離されたｐＨＳは、５００ＭＨｚでの１Ｈ ＮＭＲ分光分析によって分析した。
【０１２０】
ｐＨＣＡデカルボキシラーゼ活性の決定：
デカルボキシラーゼ活性は、原理について、先にＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４７：２９１−２９５（１９９７）においてキャビン（Ｃａｖｉｎ）らによって記載されたアッセイを使用して、測定した。ｐＨＣＡの変換に続いて、空気の対照ビームに対する３１５ｎｍでの吸収（Ａ３１５）を記録した。アッセイ緩衝液は、サーモスタットで３０℃に調温した１．０ｃｍセミマイクロキュベットにおける２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液中０．２ｍＭ ｐＨＣＡよりなる。酵素抽出物を添加して、脱炭酸反応を開始した。Ａ３１５の変化（ΔＡ３１５）として初速度を記録し、単位／ｍＬ（ここで、１単位は溶液の１ｍＬあたり１分間あたり１μｍｏｌの産物を放出する）における酵素活性を、以下の変換式によって算出した。
【０１２１】
【数１】
【０１２２】
ｐＨＣＡのモル吸光係数は、経験的に３１５ｎｍで１０ｃｍ−１ｍＭ−１と決定された。
【０１２３】
タンパク質濃度は、タンパク質決定のためのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）キット（バイオラッド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して決定した。１００〜８００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液の範囲の５種のタンパク質標準物質を使用してタンパク質の標準曲線を作成した。１６０μＬのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）試薬に１０μＬのサンプルを添加することを要する、マイクロタイタープレートアッセイ形式を使用した。
【０１２４】
実施例１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株由来のＰＤＣ１およびＰＤＣ２酵素の無細胞抽出物の生成
本実施例の目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株から、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ酵素（ＰＤＣ１）（ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ））およびＰＤＣ２（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の無細胞抽出物を生成することであった。それぞれ、ＰＤＣ１およびＰＤＣ２酵素を過剰発現する２つのプラスミド、ｐＥＴ１７．ｐｄｃ１およびｐＥＴ１７．ｐｄｃ２を構築した。これらのプラスミドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１を形質転換し、高い百分率のデカルボキシラーゼタンパク質および活性を有する２種の過剰発現株を生成した。フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレスを使用して、細胞を溶解することによって、無細胞抽出物を得た。
【０１２５】
ＰＤＣ１およびＰＤＣ２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株の構築：
それぞれ、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより、ｐｄｃ遺伝子、ｐｄｃ１（配列番号１）およびｐｄｃ２（配列番号３）を増幅した。ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、ＭＲＳ培地上で増幅させたＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびＬＢ培地上で増殖させた枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からゲノムＤＮＡを単離した。Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ１遺伝子、パラ−ケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｕ６３８２７）に使用するオリゴヌクレチドプライマーは、配列番号５に示される５’−ＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡ−３’および配列番号６に示される５’−ＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＡＴＴ−３’であり、ＮｄｅＩ（下線を付したヌクレオチド）を含んだ。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｄｃ２、フェノール酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ−１７１１７）に使用するオリゴヌクレチドプライマーは、配列番号７に示される５’−ＧＴＧＴＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴ−３’および配列番号８に示される５’−ＴＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴ−３’であり、これもＮｄｅＩ（下線を付したヌクレオチド）を含んだ。両方のｐｄｃ１およびｐｄｃ２遺伝子の予想される５５０ｂｐＤＮＡフラグメントをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲクリーン・アップ・キット（Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｋｉｔ）を使用して精製し、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＴＡクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）キット（Ｋｉｔ）を使用して、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターに連結させた。形質転換は、２×ＹＴ培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をＳＯＣの代わりに使用したことを除いて、製造者の指示に従い、ワン・ショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）ケミカリー・コンピテント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して、行った。形質転換された細胞を、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する５０μｇ／ｍＬアンピシリンプレート上に広げた。これらのプレートのそれぞれから、１０個の白色コロニーを選択し、アンピシリンプレート上に再画線した。ｐｄｃ１で形質転換した細胞およびｐｄｃ２遺伝子で形質転換した細胞を使用して、以下の手順を行った。
【０１２６】
それぞれのコロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地上で１晩増殖させた。キアゲン・ミニプレップ・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を使用して、細胞からプラスミドを精製した。プラスミドを、１時間、３７℃、ＥｃｏＲＩで消化し、挿入物の存在のための試験をした。消化物を、キロベースマーカーと共に１％アガロースゲルに充填し、電気泳動を実施した。得られたゲル上で２つのバンドが観察され、一方は約５５０ｂｐで挿入物に対応し、一方は３．９ｋｂｐでベクターに対応した。
【０１２７】
ミニプレップの１つから由来するベクターを含有する細胞を、１晩、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する５０ｍＬ培養物中で増殖させた。製造者の指示に従い、キアゲン・ミニプレップ・ＱＩＡフィルター（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ）を使用して、これらの細胞からベクターを精製した。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｐｄｃ遺伝子から生じるプラスミドをｐＤＣ１を命名する一方、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｄｃ遺伝子遺伝子から生じるプラスミドをｐＤＣ２と命名した。ベクター内のＭ１３前方および後方プライマーを使用し、デュポン・シークエンシング・ファシリティー（ＤｕＰｏｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で挿入物を配列決定し、配列を確認した。ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ＮＴＩ（インフォルマックス・インク（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．）メリーランド州フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ））ソフトウェアを使用することによって、配列のコンピュータ解析を行った。
【０１２８】
プラスミドｐＤＣ１を、４時間、３７℃で、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用して消化した。プラスミドｐＤＣ２を、４時間、３７℃で、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを使用して消化した。消化物を、キロベースマーカーと共に１％アガロースゲルに充填し、電気泳動を実施した。挿入物に対応する５５５ｂｐのバンドおよびベクターに対応する３．９ｋｂｐのバンドが、ｐＤＣ１の消化物について観察された。挿入物に対応する５８３ｂｐのバンドおよびベクターに対応する３．９ｋｂｐのバンドが、ｐＤＣ２の消化物について観察された。挿入物のバンドをゲルから切り出し、製造者のプロトコルに従い、キアゲン・ゲル・エクストラクション・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、精製した。ノバゲン・インク（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から入手したｐＥＴ−１７ｂベクターを、上記のように消化し、１％アガロースゲル上で稼動させた。切断ベクターに対応する３．３ｋｂｐでのベクターバンドをゲルから切り出し、製造者のプロトコルに従い、キアゲン・ゲル・エクストラクション・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、精製した。
【０１２９】
ｐＤＣ１挿入物および切断ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結させた。同様に、ｐＤＣ２挿入物および切断ベクターを連結させた。反応物を、１時間、室温でインキュベートした。得られたプラスミドは、本明細書において、ｐＥＴ１７．ｐｄｃ１およびｐＥＴ１７．ｐｄｃ２と称される。プラスミドｐＥＴ１７．ｐｄｃ１およびｐＥＴ１７．ｐｄｃ２は、それぞれ、Ｔ７プロモーターの制御下で、ＰＤＣ１およびＰＤＣ２酵素を過剰発現する。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））から入手した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）［遺伝子型：ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｆ８０ｌａｃＺ ｄＭ１５ ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９（ＤＥ３）］を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに基づく発現系を使用する高レベル発現のための宿主株として使用した。ＤＰＤ５００４と命名された株は、プラスミドｐＥＴ１７．ｐｄｃ１をＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することによって構築し；ＤＰＤ５００５と命名された株は、プラスミドｐＥＴ１７．ｐｄｃ２をＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することよって構築した。株ＤＰＤ５００４を構築するために、プラスミドｐＥＴ１７ｂ．ｐｄｃ１（０．１μｇ）を５０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）ケミカル・コンピテント・セル（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に添加した。この混合物を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で、４５ｓ、熱ショックにより処置し、氷上に２分間戻し、次いで、ＳＯＣ培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地上にプレート化する前に、細胞を３７℃で１時間、インキュベートした。同様に、株ＤＰＤ５００５は、ｐＥＴｂ．ｐｄｃ２をＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することよって構築した。ＰＤＣ酵素の発現は、酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を開始し、次いで、Ｔ７プロモーターにより制御されるｐｄｃ１およびｐｄｃ２遺伝子の遺伝子転写を活性化するＩＰＴＧによって誘導される。
【０１３０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）過剰発現株の増殖ならびにＰＤＣ１およびＰＤＣ２の無細胞抽出物の製造
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ５００４およびＤＰＤ５００５の１晩培養物を、１５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢブロス（ＬＢ−ａｍｐ）中−８０℃グリセロールストックから増殖させた。代表的な実験では、２ｍＬの１晩培養物を使用して、１００ｍＬのＬＢ−ａｍｐを含有する４本の０．５Ｌフラスコのそれぞれに播種した。培養物を０．５のＯＤ６００まで増殖させ、０．５ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加によって誘導した。遠心分離（２０分間、１０，０００×ｇ、４℃）によって細胞を回収し、１．１ｇの細胞ペーストを与える前に、培養物を６０分間、増殖させた。細胞ペーストは、さらなる使用まで、４℃で保存した。
【０１３１】
無細胞抽出物を製造するために、融解した細胞ペーストを標準的な稼動緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液）に、７０ＯＤ６００／ｍＬの密度まで再懸濁し、懸濁液をフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）（１２００ｐｓｉ）を介して通過させることによって、溶解した。溶解物を遠心分離し、上清を保持した。全タンパク質における得られる酵素の百分率を、クマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）で染色した１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質バンドの密度を測定することによって、決定した。デカルボキシラーゼ活性は、上記の一般的方法のセクションに記載のように測定した。これらの結果を表２にまとめる。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
実施例２
二相反応媒体におけるＰＤＣ２無細胞抽出物のデカルボキシラーゼ活性
本実施例の目的は、二相反応媒体においてｐＨＳを製造させるために、ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用することの利点を実証することであった。ＰＤＣ２酵素活性の保持を、水相／トルエン、水相／ジクロロメタン、および水相／デカン酸メチル二相反応媒体において測定した。
【０１３４】
小さな撹拌子を含有するガラス製シンチレーションバイアルに、以下の水非混和性有機溶媒、スペクトル分析用のトルエン、ジクロロメタン、またはデカン酸メチルのうち１つの５ｍＬを充填した。次いで、１０ｍＬのｐＨＣＡ基質溶液（１．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを伴う０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０〜１２０ｍＭ ｐＨＣＡ溶液）および実施例１に記載のように製造した１５μＬのＰＤＣ２無細胞抽出物（１５０μｇタンパク質；１５単位）を添加した。バイアルに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、激しく撹拌した。ｐＨＣＡからｐＨＳへの変換に十分な時間、反応を進行させた。反応の経過中、上記の一般的方法のセクションに記載のように、反応の進行を、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ、およびＨＰＬＣによってモニターした。ｐＨＣＡおよびｐＨＳは、ＴＬＣプレート上でそれぞれ、０．４および０．７のＲｆ値で移動した。反応が完了したら、内容物を６０ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させた。水層を回収し、直ちに、ＹＭ−１０膜（ミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を使用する限外ろ過によってろ過し、酵素を分離および回収した。この第１の水性ろ過物を保持し、ＨＰＬＣによって分析して、ｐＨＣＡ基質の枯渇を確認した。タンパク質およびデカルボキシラーゼ含有保持物を、限外ろ過膜を使用して、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で２回洗浄し、２日目の洗浄物由来の保持物を、本来の反応容積まで再懸濁した。上記の一般的方法のセクションに記載のｐＨＣＡデカルボキシラーゼアッセイを使用し、５０μＬ容積の懸濁液を使用して、残留酵素活性を決定した。
【０１３５】
酵素アッセイ後、サンプルを限外ろ過によって処置し、ＰＤＣ２酵素を、前回の反応の終了時の水相の容積に等価な容積のｐＨＣＡ含有緩衝溶液に再懸濁した。保存された酵素溶液を、直ちに、消費されていない有機溶媒の容量に添加し、懸濁液を撹拌した。ｐＨＣＡからｐＨＳへの完全な変換のための反応時間が最初の反応時間と比べて２倍になるまで、上記の工程を反復した。各サイクル後に実施した酵素アッセイの結果を表３に示す。表中のデータから認められ得るように、酵素活性の保持は、水相／トルエン系が最も高かった。さらに、酵素活性の保持は、比較例３において見られるように、単一層の水性系において得られる保持よりかなり高かった。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
２つのトルエン反応由来の有機層を、ＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。次いで、２つの有機層をプールし、２５ｍＬのナシ型丸底フラスコに移した。微量の高分子化阻害剤、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチル−フェノール（ＣＡＳ９８−２９−３；アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）１２，４２４−９）を澄明な無色のトルエン溶液に添加した。象牙色の結晶固体（４４ｍｇ）を、減圧（２００ｍｍＨｇ）下、穏やかな加熱（４５℃）を伴うロータリーエバポレーションによって回収した。単離された固体を、プロトンＮＭＲ（４ｍｇを０．８ｍＬの完全重水素化メタノールに溶解した）によって特徴付けた。製造されたｐＨＳの純度は、９８パーセントより大きいと決定された。産物のさらなる精製を、ヘキサンからの再結晶化によって達成し、白色結晶固体を回収した。この結果は、製造されたｐＨＳの有機層からの単離が簡便であることを実証する。
【０１３８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ４−ＭｅＯＨ）：７．３ｐｐｍ，２重線，２Ｈ，（芳香環の５，６−プロトン）；６．７８ｐｐｍ，２重線，２Ｈ，（芳香環の２，３−プロトン）；６．６５ｐｐｍ，多重線，１Ｈ（Ａｒ−ＨＣ＝ＣＨ２）；５．６ｐｐｍ，２重線，１Ｈ，（Ａｒ−Ｃ＝ＣＨ，シス）；５．０５ｐｐｍ，２重線，１Ｈ（Ａｒ−Ｃ＝ＣＨ，トランス）。
【０１３９】
実施例３
単一相水性反応媒体におけるＰＤＣ２無細胞抽出物のデカルボキシラーゼ活性の比較例
本実施例の目的は、単一相水性反応媒体におけるＰＤＣ２無細胞の酵素活性の保持を測定し、実施例２に記載の二相反応媒体に対する比較の役割を果たすことであった。
【０１４０】
小さな撹拌子を含有するガラス製シンチレーションバイアルに、１０ｍＬのｐＨＣＡ溶液（１．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを伴う０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０ｍＭ ｐＨＣＡ溶液）を充填した。次いで、実施例１に記載のように製造した１５μＬのＰＤＣ２無細胞抽出物（１５０μｇタンパク質；１５単位）を添加し、反応を開始した。バイアルに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、激しく撹拌した。ｐＨＣＡからｐＨＳへの完全な変換に十分な時間、反応を進行させた。反応の経過中、上記の一般的方法のセクションに記載のように、反応の進行を、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ、およびＨＰＬＣによってモニターした。３つの条件下で、ｐＨＣＡおよびｐＨＳのＲｆ値は、それぞれ、０．４および０．７であった。反応が完了したかまたはそれ以上進行しなくなったら、実施例２に記載のように、酵素をＹＭ−１０膜によって回収した。ろ過物を数回洗浄して、残留ｐＨＣＡおよびｐＨＳを取り出した。洗浄後、ろ過物をその最終反応容積で保存し、残留活性を、実施例２に記載のように決定し、次いで、検出可能なデカルボキシラーゼ活性が存在しなくなるまで、上記で概略した工程を反復した。各サイクル後に実施した酵素アッセイの結果を表４に示す。表中のデータから認められ得るように、酵素活性の保持は、二相反応媒体を使用した実施例２で概略した保持よりもかなり低かった。本実施例は、二相反応媒体においてｐＨＳを製造させるためにＰＤＣ２酵素を使用することの利点を実証する。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
実施例４
二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造を実証することであった。ＰＤＣ１酵素活性の保持を、水相／トルエン、水相／ジクロロメタン、水相／デカン酸メチル、および水相／２−ウンデカノン二相反応媒体において測定した。
【０１４３】
小さな撹拌子を含有するガラス製シンチレーションバイアルに、以下の水非混和性有機溶媒、スペクトル分析用のトルエン、ジクロロメタン、デカン酸メチル、または２−ウンデカノンのうち１つの５ｍＬを充填した。次いで、１０ｍＬのｐＨＣＡ基質溶液（１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０〜１２０ｍＭ ｐＨＣＡ溶液）および実施例１に記載のように製造した５００μＬのＰＤＣ１無細胞抽出物（２．１５ｍｇタンパク質；１５単位）を添加した。バイアルに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、激しく撹拌した。反応の経過中、上記の一般的方法のセクションに記載のように、反応の進行を、ＴＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ、およびＨＰＬＣによってモニターした。反応が完了したら、内容物を６０ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させた。水層を直ちに、限外ろ過によってろ過し、産物および反応物から酵素を分離および回収した。生体触媒反応は、実施例２に記載のものと同一の様式で数サイクル反復した。各サイクル後に実施した酵素アッセイの結果を表５に示す。表中のデータから認められ得るように、酵素活性の保持は、水相／トルエン二相媒体および水相／デカン酸メチル二相媒体の両方で高かった。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
実施例５
二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物を使用するｐＨＣＡからのｐＨＳの製造を実証し、有機相からのｐＨＳの簡便な回収を実証することであった。
【０１４６】
０．５Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクター（ウィートン・サイエンス・プロダクツ（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ニュージャージー州ミルビル（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ））に、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中０．２８０ＬのｐＨＣＡ（５ｇ／Ｌ）および１５ｍＬのウシ血清アルブミン（２０ｍｇ／ｍＬ）を充填した。実施例１に記載のように製造したＰＤＣ１を含有する無細胞抽出物（２．５ｍＬ、１３ｍｇタンパク質、６９．５単位）を、０．１５Ｌのトルエンと共に添加した。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌した。反応温度を３３℃に設定した。反応を３０分間進行させ、その後、ＴＬＣによって完了したことが認められたため、反応を終了した。製造されたｐＨＳを実施例４に記載のように単離した。象牙色の残渣（１．１ｇ）を再結晶化し、バイアルに回収して、一定の乾燥状態になるまで高減圧（６０ｍｍＨｇ）下で乾燥させ、完全重水素化メタノールにおいて１Ｈ ＮＭＲ分析により特徴付けた。プロトンＮＭＲの結果は化学シフト値がｐＨＳと一致し、純度を９８％と評価した。本実施例は、二相反応媒体におけるＰＤＣ１によって触媒された反応の有機相からのｐＨＳの簡便な回収を実証する。
【０１４７】
実施例６
二相反応媒体においてＰＤＣ１無細胞抽出物および生物生産されたｐＨＣＡ含有発酵培地を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体を使用して、発酵培地に含有されるＰＤＣ１無細胞抽出物およびｐＨＣＡを使用するｐＨＳの製造を実証することであった。まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株（ＤＰＤ４００９）を使用する発酵によって、ｐＨＣＡを製造させた。次いで、ＰＤＣ１無細胞抽出物を使用して、発酵上清およびトルエンよりなる二相反応媒体において、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換させた。
【０１４８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００９の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００９は、チロシン過剰発現、プラスミド欠損、フェニルアラニン栄養要求性であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＹ１（ＤＧＬ４３０）、オムニジーン・バイオプロダクツ・インク（ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手したチロシン過剰製造株から数段階で誘導された。まず、ＴＹ１からプラスミドを取り除き、ＴＳ５と呼ばれるテトラサイクリン感受性株を生じるようにした。続いて、ＴＳ５は、ドナーとして、ｐｈｅＡ１８：：Ｔｎ１０を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＣＡＧ１２１５８を使用するＰ１仲介形質導入において、レシピエントであった。１つのテトラサイクリン耐性形質導入体はＢＮＴ５６５．２と呼ばれた。
【０１４９】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を介する米国特許出願第６０／４３４６０２号明細書（本明細書において参照として援用される）におけるサ（Ｓｕｈ）により記載の２種ＰＣＲフラグメント組込み方法を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８を構築した。部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）によって隣接されるカナマイシン選択マーカーを含有する第１の線状ＤＮＡフラグメント（１５８１ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ−ｋａｎ（ｔｙｒＡ）（５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号９）（これは、ａｒｏＦ終止コドンおよびプライミング配列（２０ｂｐ）の上流領域の配列に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、４６ｂｐ）を含有する）、およびＢ−ｋａｎ（ｔｒｃ）（５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号１０）（これは、ＰｔｒｃプロモーターＤＮＡフラグメントおよびプライミング配列（２２ｂｐ）の５’末端領域の配列に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、４２ｂｐ）を含有する）によるプラスミドｐＫＤ４（ダセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびバンネル（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６６４０−６６４５（２０００））からのＰＣＲによって合成した。−１０および−３５コンセンサス配列よりなるＰｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、ならびにリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含有する第２の線状ＤＮＡフラグメント（１６３ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ−ｔｒｃ（ｋａｎ）（５’−ＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴ−３’）（配列番号１１）（これは、ｋａｎオープンリーディングフレームおよびプライミング配列（２２ｂｐ）の下流領域の配列に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、１８ｂｐ）を含有する）、およびＢ−ｔｒｃ（ｔｙｒＡ）（５’−ＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡ−３’）（配列番号１２）（これは、ｔｙｒＡ開始コドンおよびプライミング配列（２０ｂｐ）の下流領域に一致するように選択されたホモロジーアーム（下線を付した部分、４６ｂｐ）を含有する）によるプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＰＣＲによって合成した。下線を付した配列は、それぞれのホモロジーアームを例示する一方、残りの部分は、ＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡに対する相補的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションのためのプライミング配列である。標準的なＰＣＲ条件を使用して、マスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）ＴＭエキストラ−ロング（Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ）ＰＣＲキット（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用し、以下のように線状ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのプラスミドＤＮＡ、２５μＬの２×ＰＣＲ緩衝液番号１、１μＬの５’プライマー（２０μＭ）、１μＬの３’プライマー（２０μＭ）、０．５μＬのマスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）ＴＭエキストラ−ロング（Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、および２１．５μＬの滅菌済み、脱イオン化Ｈ２Ｏを含有した。ＰＣＲ反応条件は：９４℃で３分間；２５サイクルの９３℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間；続いて、７２℃で５分間であった。ＰＣＲ反応完了後、ミニ−エリュートＱＩＡクイック・ゲル・エクストラクション・キット（Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）ＴＭ（キアゲン・インク（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。高速で２回、遠心分離することによって、１０μＬの蒸留水により、ＤＮＡを溶出させた。単離したＰＣＲ産物の濃度は約０．５〜１．０μｇ／μＬであった。
【０１５０】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドを担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株を、ＰＣＲフラグメントの組換えのための宿主株として使用した。この株は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（ダセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびバンネル（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１（コリ・ジェネティクス・ストック・センター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、エール大学（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、番号６６４９）への形質転換によって、構築された。ｐＫＤ４６のλ−Ｒｅｄリコンビナーゼは、アラビノース誘導性プロモーターの制御下で発現される３つの遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍよりなる。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを３０℃で含有するＬＢ培地上で選択した。ｐＫＤ４６を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株のエレクトロコンピテント細胞は、以下のようにして製造した。ｐＫＤ４６を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１Ｍ Ｌ−アラビノースを伴うＳＯＢ培地（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｍ．グローバー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬ出版（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン市（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、１９８５、１０９〜１２５頁）において、３０℃で、０．５のＯＤ６００まで増殖させ、続いて、氷上で２０分間、冷却した。細菌細胞を、４，５００ｒｐｍで、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＴ７ ＰＬＵＳ（ケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、コネチカット州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ））を使用し、１０分間、４℃で遠心分離した。上清をデカントした後、ペレットを氷冷水に懸濁し、再度、遠心分離を行った。このプロセスを２回反復し、細胞ペレットを１／１００容積の氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。
【０１５１】
カナマイシンマーカーＰＣＲ産物（約１μｇ）およびＰｔｒｃプロモーターＰＣＲ産物（約１μｇ）の両方を、５０μＬのコンピテント細胞と混合し、氷上で予め冷却しておいたエレクトロポレーションキュベット（０．１ｃｍ）にピペッティングした。２００オームに設定したパルスコントローラーを備えた１．８ｋＶ、２５μＦに設定したジーン・パルサー・システム（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して、エレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、ＳＯＣ培地（１ｍＬ）を添加した。細胞を、３７℃で、１時間、インキュベートした。細胞の約半分を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地上に拡げた。プレートを３７℃で１晩、インキュベートした後、６個のカナマイシン形質転換体を選択した。
【０１５２】
カナマイシン選択マーカーおよびｔｙｒＡ遺伝子の前のＰｔｒｃプロモーターの両方の染色体組込みを、ＰＣＲ分析によって確認した。形質転換体のコロニーは、２３μＬのスーパーミックス（ＳｕｐｅｒＭｉｘ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、５’−プライマーＴ−ｔｙ（テスト）（５’−ＣＡＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧ−３’）（配列番号１３）および１μＬの３’−プライマーＢ−ｔｙ（テスト）（５’−ＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣ−３’）（配列番号１４）を含有するＰＣＲ反応混合物２５μＬに再懸濁した。テストプライマーを選択して、組込み領域の付近に位置する領域を増幅させた。Ｔ−ｔｙ（テスト）およびＢ−ｔｙ（テスト）プライマー対によるＰＣＲ分析は、１％アガロースゲル上で、予想されるサイズのフラグメント、即ち、１，９２８ｂｐを示した。得られた組換え体を、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＳ１５８と命名する。
【０１５３】
次いで、上記のように製造した株ＢＮＴ５６５．２を、Ｐｔｒｃ−ｔｙｒＡ［ＫａｎＲ］、ｔｙｒＡ発現を駆動する強力なｔｒｃプロモーターを生じる染色体修飾を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＳ１５８上で増殖させたファージによる別のＰ１仲介形質導入において、レシピエントとして使用した。ｐｈｅＡおよびｔｙｒＡ遺伝子は染色体上で緊密に連結されており、そのため、テトラサイクリンおよびカナマイシンの両方に対して耐性である稀な形質導入体の選択を行った。１つのそのような形質導入体をＤＰＤ４００９と呼ばれ、これは増殖に対してフェニルアラニンを要求し、チロシンを排出することが示された。
【０１５４】
ｐＨＣＡの生物生産
ｐＨＣＡの生物生産を、１４Ｌブラウン（Ｂｒａｕｎ）発酵槽、バイオスタット（ＢｉｏＳｔａｔ）Ｃ．Ｂ．（ブラウン・バイオテック・インターナショナル（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、独国メレスンゲン（Ｍｅｌｅｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））において行った。発酵の稼動は、上記のようにして構築された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４００９を使用して行った。発酵培地は、表６に示すような塩、ビタミンおよびグルコースを含有する規定培地である。微量栄養素の組成を表７に示す。温度を３５℃に維持し、溶存酸素は２５％の設定値を標的とした。ｐＨの設定値は６．５であり、塩基性および酸性の調整のために、それぞれ４０％（ｗ／ｖ）水酸化アンモニウムおよび２０％（ｗ／ｖ）リン酸の添加によって一定を維持した。細胞密度が１０ＯＤ５５０単位に達したら、培地に、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加し、プラスミド上のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ｐａｌ）遺伝子を発現するように細胞を誘導して、チロシンからｐＨＣＡへの変換を生じさせた。流加培養態様では、一旦、濃度が５ｇ／Ｌ未満に低下したら追加のグルコースを添加した。グルコース溶液６０％（ｗ／ｗ）を、０．４５ｇ／分の速度で添加し、０．５ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を保持した。一旦、グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌを超えたら、稼動の終了付近でより低い速度を使用した。発酵は典型的に７２時間後に終了した。
【０１５５】
発酵培地を遠心分離して、細胞と他の不溶性産物とを分離することによって、ｐＨＳへの生体触媒変換における使用のためのｐＨＣＡ豊富上清を製造した。ペレットを廃棄し、暗褐色の上清を新しい保存ビンに移し、蓋を取り付けて、ＰＤＣ生体触媒反応における使用まで４℃で保存した。
【０１５６】
【表６】
【０１５７】
【表７】
【０１５８】
ＰＤＣ１無水抽出物を使用するｐＨＳの製造
０．５Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクターに、上記のｐＨＣＡ発酵由来の０．１Ｌの発酵上清を充填した。保存中、いくつかの不溶性副産物が、発酵上清から沈殿し得る。不溶性材料を妨害しないように注意しながら、上清を目盛り付きシリンダーにデカントした。発酵上清はｐＨＣＡ（３．３ｇ／Ｌ）、ケイ皮酸（ＣＡ）、フェニルアラニン、チロシン（これらはすべて組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって製造される）および塩をｐＨ６．８で含有した。緩衝能およびｐＨＣＡ濃度は、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中２５ｇ／Ｌ ｐＨＣＡの０．２Ｌを添加することによって、増加させた。水相におけるｐＨＣＡの最終濃度は約１７．７ｇ／Ｌであった。
【０１５９】
実施例１に記載のように製造したＰＤＣ１を含有する無細胞抽出物（０．５ｍＬ、１．１ｍｇタンパク質、１２単位）を、０．１５Ｌのトルエンと共に添加した。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌した。反応温度を３３℃に設定した。終了前に、反応を１５時間、進行させた。水相は、本来の発酵培地の深暗褐色を保持した。残留する乳化した有機相は淡黄色であった。中等度の孔サイズのガラスフリットを備えた漏斗を介するろ過によってエマルジョンを破壊し、有機層と水層とを再度分離した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、実施例４および５に記載のようにｐＨＳを単離した。約２ｇの粗固体を単離した。固体をヘキサンから再結晶化し、小孔ガラスフリットを備えた漏斗を介してろ過し、バイアルに回収して、一定の乾燥状態になるまで高減圧（６０ｍｍＨｇ）下で乾燥させた（１．１０２ｇ）。この反応物の全収量は、無細胞抽出物の１ｇあたり製造された１０１０ｇのｐＨＳであった。本実施例は、ＰＤＣ１デカルボキシラーゼが、粗発酵成分および高ｐＨＣＡ濃度の存在下において高い生産性でｐＨＳ形成を触媒する能力を例示する。
【０１６０】
実施例７
二相反応媒体においてＰＤＣ２無細胞抽出物および生物生産されたｐＨＣＡ含有発酵培地を使用するｐＨＳの製造
本実施例の目的は、二相反応媒体を使用して、発酵培地に含有されるＰＤＣ２無細胞抽出物およびｐＨＣＡを使用するｐＨＳの製造を実証することであった。まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株を使用する発酵によって、ｐＨＣＡを製造させた。次いで、ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用して、発酵上清およびトルエンよりなる二相反応媒体において、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換させた。
【０１６１】
ｐＨＣＡの生物生産は実施例６に記載の通りに行った。１．０Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクターに、実施例６に記載のｐＨＣＡ発酵から得られる０．４Ｌの発酵上清を充填した。発酵上清はｐＨＣＡ（３．３ｇ／Ｌ）、ケイ皮酸（ＣＡ）、フェニルアラニン、チロシン（これらはすべて組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって製造される）および塩をｐＨ６．０で含有した。緩衝能およびｐＨＣＡ濃度は、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中２５ｇ／Ｌ ｐＨＣＡの０．４Ｌを添加することによって、増加させた。ｐＨＣＡの最終濃度は約１４．１５ｇ／Ｌであった。実施例１に記載のように製造したＰＤＣ２を含有する無細胞抽出物（０．２０ｍＬ、３６単位；２．０２ｍｇタンパク質）を、高分子化阻害剤として５ｍｇのプロステイブ（ＰｒｏＳｔａｂ）（登録商標）５４１５（チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ニューヨーク州タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ））を含有する０．２０Ｌの試薬用トルエンと共に添加した。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌した。反応温度を３３℃に設定した。終了前に、反応を１５時間、進行させた。反応の内容物を５００ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させた。有機層（上層）は、エマルジョンを含有し、これは、中等度の孔サイズのガラスフリットを備えたブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）漏斗を介してろ過することによって破壊した。ろ過物は、２つの非混和層、無色の有機層および黄色の水層を有した。相分離セルロースフィルターペーパーを通過させることによって層を分離し、有機層を選択的に受けフラスコに通過させた。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、ロータリーエバポレーションによってトルエンを回収した。ｐＨＳを、実施例６に記載のように単離して、４．５ｇの粗灰白色結晶残渣を生じた。固体をヘキサンで再結晶および洗浄し、一定の乾燥状態まで減圧下（６０ｍｍＨｇ）で乾燥させたところ、ｐＨＳ標準品と同一の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する２．８７ｇの細かな白色結晶生成物を得た。この反応物の全収量は、無細胞触媒の１ｇあたり製造された１４２１ｇのｐＨＳであった。本実施例は、粗発酵成分および少量の高分子化阻害剤の存在下でＰＤＣ２デカルボキシラーゼによって達成される高い生産性を実証する。
【０１６２】
実施例８
オキシランアクリルビーズ上に固定化されたＰＤＣ２無細胞抽出物を使用する二相反応媒体におけるｐＨＳの製造
本実施例の目的は、オキシランアクリルビーズ上に固定化されたＰＤＣ２無細胞抽出物を使用する、水性緩衝液およびトルエンよりなる二相反応媒体におけるｐＨＳの製造を実証することであった。
【０１６３】
オキシランアクリルビーズを使用する無細胞抽出物の固定
ガラス製シンチレーションバイアルに、１００ｍｇのオキシランアクリルビーズ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＣＡＳ番号９３３５６−７５−３；１５０ミクロン、マクロ多孔性；活性化８００μｍｏｌ／ｇ）および８ｍＬ ５０ｎＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液を充填した。実施例１に記載のように製造したＰＤＣ２無細胞抽出物（０．１００ｍＬ、０．５９ｍｇタンパク質、１５単位）を、シェーカー上で、１晩、周囲温度で穏やかに振盪した。混合物を遠心分離し、次いで、上清をデカントした。ビーズ上の未反応のエポキシド部位を処置するために、ビーズを、０．８３Ｍエタノールアミンを含有する１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に、２時間、周囲温度で再懸濁した。ビーズを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液の１０ｍＬ部で３回洗浄し、使用まで、周囲温度で０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液中に保存した。
【０１６４】
凍結乾燥した無細胞抽出物を使用するｐＨＳの製造
ガラス容器（テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）およびガラス成分を有するオーバーヘッド撹拌機を含有する）に０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中３０ｍＭ ｐＨＣＡの５ｍＬを充填した。ＰＤＣ２−オキシランアクリルビーズ（４０ｍｇ）および３ｍＬのトルエンを容器に添加した。内容物を室温で撹拌した。脱炭酸反応の進行をＴＬＣによってモニターし、反応の進行を評価した。８時間後、ＴＬＣプレート上の単一のスポットが認められ、このスポットはｐＨＳに対応するＲｆ値を有した。トルエン溶液からのｐＨＳの回収は試みなかった。本実施例は、二相反応媒体においてオキシランビーズ固定ＰＤＣ２デカルボキシラーゼを使用するｐＨＳ製造を実証する。
【０１６５】
実施例９
ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用して二相反応媒体において製造したパラ−ヒドロキシスチレンの誘導体化の予測実施例
本予測実施例の目的は、誘導体化された化合物パラ−アセトキシスチレンを形成するための二相反応媒体由来の有機性抽出剤におけるｐＨＳの化学的誘導体化を実証することである。ｐＨＣＡは、最初に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株を使用する発酵によって製造される。次いで、生物生産されるｐＨＣＡは、発酵上清およびトルエンよりなる二相反応媒体において、ＰＤＣ２無細胞抽出物を使用して、ｐＨＳに変換される。トルエン層が、ｐＨＣＡ枯渇発酵上清から分離された後、生物生産されるｐＨＳを無水酢酸と反応させ、パラ−アセトキシスチレンを形成させる。
【０１６６】
ｐＨＣＡの生物生産
実施例６に記載のように、ｐＨＣＡの生物生産を行う。
【０１６７】
生物生産されるｐＨＣＡの生体触媒によるｐＨＳの製造
１．０Ｌジャケット型ウィートン・セルステア（Ｗｈｅａｔｏｎ ＣｅｌＳｔｉｒ）（登録商標）リアクターに、実施例６に記載のｐＨＣＡ発酵から得られる０．３３５Ｌの発酵上清を充填する。発酵上清はｐＨＣＡ、ケイ皮酸（ＣＡ）、フェニルアラニン、チロシン（これらはすべて組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって製造される）および塩をｐＨ６．０で含有する。ｐＨＣＡ含有発酵上清のｐＨを、酵素的脱炭酸のために、濃硫酸を使用して、ｐＨ６．０に調整する。実施例１に記載のように製造されるＰＤＣ２を含有する無細胞抽出物（０．３０ｍＬ、５５単位；２．２ｍｇタンパク質）を、高分子化阻害剤として４２ｍｇのプロステイブ（ＰｒｏＳｔａｂ）（登録商標）５４１５（チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ニューヨーク州タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ））を含有する０．１５Ｌの試薬用トルエンと共に添加する。リアクターに蓋を取り付け、磁気撹拌プレート上に置き、中等度の速度で撹拌する。反応温度を４０℃に設定する。終了前に、反応を２時間進行させる。反応の内容物を５００ｍＬ分別漏斗に移し、層を分離させる。有機層がエマルジョンを含有する場合、これを中等度の孔サイズのガラスフリットを備えたブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）漏斗を介してろ過することによって破壊する。ろ過物は、２つの非混和層、無色の有機層および黄色の水層を有する。相分離セルロースフィルターペーパーを通過させることによって層を分離し、有機層を選択的に受けフラスコに通過させる。有機層を回収し、直ちに、撹拌子を含有する２５０ｍＬ丸底フラスコに移す。フラスコに、ピリジン（ＣＡＳ１１０−８６−１、０．３００ｍＬ、３．７１ｍｍｏｌ）および無水酢酸（ＣＡＳ１０８−２４−７、４．０ｍＬ、４２．４ｍｍｏｌ）を充填する。アセチル化反応の進行は、すべてのｐＨＳが変換され、ただ単一のスポットがＴＬＣプレート上に出現するまでＴＬＣによってモニターする。減圧（１３．３ｋＰａ）下、穏やかな加熱（３０℃）を伴うロータリーエバポレーションによって、黄色オイルを回収する。単離されるオイル（１．４１ｇ）を、ガスクロマトグラフィーによって特徴付ける。アセトキシスチレン産物のさらなる精製は、既知の方法（例えば、チョスネック（Ｃｈｏｓｎｅｋ）ら、米国特許第５，１３６，０８３号明細書を参照のこと）によって、達成することができる。本予測実施例は、二相反応混合物の有機媒体に抽出されるｐＨＳが如何にして誘導体化され、パラ−アセトキシスチレンなどの誘導体化された産物を付与するかを実証する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を準備し；
ｂ）水相、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノールおよびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、該酵素供給源と、パラ−ヒドロキシケイ皮酸とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｃ）水相から抽出剤を分離し；そして
ｄ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法。
【請求項２】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源が、精製された酵素、無細胞抽出物、野生型宿主細胞、組換え宿主細胞、処置された野生型宿主細胞、および処置された組換え宿主細胞よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
野生型宿主細胞が、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組換え宿主細胞が、細菌、酵母、植物細胞、および藻類よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
組換え宿主細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアーソロボトリーズ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）よりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組換え宿主細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）よりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
組換え宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、トウガラシ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、イネ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草よりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項８】
酵素供給源が固定化される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抽出剤が、約５容量％〜約７０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抽出剤が、約２０容量％〜約５０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抽出剤が、重力式沈殿槽、遠心分離器、またはハイドロサイクロンの使用によって、水相から分離される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）の分離の後、酵素供給源が、再利用のため、二相反応媒体の水相から回収される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素供給源が、ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および遠心分離よりなる群から選択される方法を使用して水相から回収される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）の回収は、エバポレーション、蒸留、樹脂による吸着、およびモレキュラーシーブによる吸着よりなる群から選択される手段によって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）後、抽出剤が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）後の水相が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
パラ−ヒドロキシスチレンが、抽出剤中で化学的に誘導体化され、誘導体化された化合物を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
誘導体化された化合物が、一般式：
【化１】
［式中、Ｒ４が、メチル、ｔ−ブチル、アルキル、シリルエーテル、アリル、ｔ−ブトキシカルボニル、ヒドロキシエトキシ、アセトキシ、ホルメート、グリシジル、ベンゾエート、フェニルカーボネート、テトラヒドロピラン、ベンジル、およびポリ（エチレンオキシド）よりなる群から選択される］
によって規定される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
誘導体化された化合物がパラ−アセトキシスチレンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造する製造宿主を準備し；
ｂ）発酵培地中で製造宿主を増殖させ、ここで、製造宿主は、発酵培地中にパラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造し；
ｃ）発酵培地、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノール、およびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、工程（ｂ）由来の発酵培地と、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｄ）発酵培地から抽出剤を分離し；そして
ｅ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法。
【請求項２１】
製造宿主および不溶性材料が、工程（ｃ）の接触の前に、発酵培地から取り出される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
製造宿主および不溶性材料が、ろ過または遠心分離によって発酵培地から取り出される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
製造宿主が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源が、精製された酵素、無細胞抽出物、野生型宿主細胞、組換え宿主細胞、処置された野生型宿主細胞、および処置された組換え宿主細胞よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
野生型宿主細胞が、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）よりなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組換え宿主細胞が、細菌、酵母、植物細胞、および藻類よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
組換え宿主細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアーソロボトリーズ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）よりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
組換え宿主細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）よりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
組換え宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、トウガラシ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、イネ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草よりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
酵素供給源が固定化される請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
抽出剤が、約５容量％〜約７０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
抽出剤が、約２０容量％〜約５０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
抽出剤が、重力式沈殿槽、遠心分離器、またはハイドロサイクロンの使用によって、発酵培地から分離される請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｄ）の分離の後、酵素供給源が、再利用のため、発酵培地から回収される請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
酵素供給源が、ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および遠心分離よりなる群から選択される方法を使用して発酵培地から回収される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｅ）の回収が、エバポレーション、蒸留、樹脂による吸着、およびモレキュラーシーブによる吸着よりなる群から選択される手段によって達成される請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｅ）後、抽出剤が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｃ）後の発酵培地が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
パラ−ヒドロキシスチレンが、抽出剤中で化学的に誘導体化され、誘導体化された化合物を形成する請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
誘導体化された化合物がパラ−アセトキシスチレンである請求項４０に記載の方法。
【請求項１】
ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源を準備し；
ｂ）水相、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノールおよびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、該酵素供給源と、パラ−ヒドロキシケイ皮酸とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｃ）水相から抽出剤を分離し；そして
ｄ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法。
【請求項２】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源が、精製された酵素、無細胞抽出物、野生型宿主細胞、組換え宿主細胞、処置された野生型宿主細胞、および処置された組換え宿主細胞よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
野生型宿主細胞が、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組換え宿主細胞が、細菌、酵母、植物細胞、および藻類よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
組換え宿主細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアーソロボトリーズ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）よりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組換え宿主細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）よりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
組換え宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、トウガラシ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、イネ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草よりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項８】
酵素供給源が固定化される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抽出剤が、約５容量％〜約７０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抽出剤が、約２０容量％〜約５０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抽出剤が、重力式沈殿槽、遠心分離器、またはハイドロサイクロンの使用によって、水相から分離される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）の分離の後、酵素供給源が、再利用のため、二相反応媒体の水相から回収される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素供給源が、ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および遠心分離よりなる群から選択される方法を使用して水相から回収される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）の回収は、エバポレーション、蒸留、樹脂による吸着、およびモレキュラーシーブによる吸着よりなる群から選択される手段によって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）後、抽出剤が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）後の水相が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
パラ−ヒドロキシスチレンが、抽出剤中で化学的に誘導体化され、誘導体化された化合物を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
誘導体化された化合物が、一般式：
【化１】
［式中、Ｒ４が、メチル、ｔ−ブチル、アルキル、シリルエーテル、アリル、ｔ−ブトキシカルボニル、ヒドロキシエトキシ、アセトキシ、ホルメート、グリシジル、ベンゾエート、フェニルカーボネート、テトラヒドロピラン、ベンジル、およびポリ（エチレンオキシド）よりなる群から選択される］
によって規定される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
誘導体化された化合物がパラ−アセトキシスチレンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造する製造宿主を準備し；
ｂ）発酵培地中で製造宿主を増殖させ、ここで、製造宿主は、発酵培地中にパラ−ヒドロキシケイ皮酸を製造し；
ｃ）発酵培地、およびトルエン、デカン酸メチル、２−ウンデカノン、ジクロロメタン、ヘキサン、２−デカノール、４−デカノール、３−デカノン、４−デカノン、１−ノナノール、２−ノナノール、２−ヘプタノール、およびそれらの混合物よりなる群から選択される水非混和性有機溶媒である抽出剤を含んでなる二相反応媒体において、工程（ｂ）由来の発酵培地と、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなりパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源とを接触させて、パラ−ヒドロキシスチレンを形成させ、該パラ−ヒドロキシスチレンを二相反応媒体の抽出剤中に抽出し；
ｄ）発酵培地から抽出剤を分離し；そして
ｅ）場合により、抽出剤からパラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなるパラ−ヒドロキシスチレンの製造方法。
【請求項２１】
製造宿主および不溶性材料が、工程（ｃ）の接触の前に、発酵培地から取り出される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
製造宿主および不溶性材料が、ろ過または遠心分離によって発酵培地から取り出される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
製造宿主が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素供給源が、精製された酵素、無細胞抽出物、野生型宿主細胞、組換え宿主細胞、処置された野生型宿主細胞、および処置された組換え宿主細胞よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
野生型宿主細胞が、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）よりなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組換え宿主細胞が、細菌、酵母、植物細胞、および藻類よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
組換え宿主細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアーソロボトリーズ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）よりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
組換え宿主細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）よりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
組換え宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、トウガラシ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、イネ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草よりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
酵素供給源が固定化される請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
抽出剤が、約５容量％〜約７０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
抽出剤が、約２０容量％〜約５０容量％の量で二相反応媒体中に存在する請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
抽出剤が、重力式沈殿槽、遠心分離器、またはハイドロサイクロンの使用によって、発酵培地から分離される請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｄ）の分離の後、酵素供給源が、再利用のため、発酵培地から回収される請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
酵素供給源が、ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および遠心分離よりなる群から選択される方法を使用して発酵培地から回収される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｅ）の回収が、エバポレーション、蒸留、樹脂による吸着、およびモレキュラーシーブによる吸着よりなる群から選択される手段によって達成される請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｅ）後、抽出剤が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｃ）後の発酵培地が、場合により、二相反応媒体に戻されて添加される請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
パラ−ヒドロキシスチレンが、抽出剤中で化学的に誘導体化され、誘導体化された化合物を形成する請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
誘導体化された化合物がパラ−アセトキシスチレンである請求項４０に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２５９４２（Ｐ２００７−５２５９４２Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１００３３（Ｐ２００６−５１００３３）
【出願日】平成１６年４月１４日（２００４．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１５１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３４４
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１４日（２００４．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１５１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３４４
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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