二量体および三量体の核酸色素ならびに関連するシステムおよび方法
二量体および三量体の核酸色素と、関連するシステムおよび方法が提供される。このような色素は、例えば、それがリリースオンデマンド（ｒｅｌｅａｓｅ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）機構により核酸を染色することを可能にするヘアピン様構造を形成することができる。このような色素は、核酸が存在しない場合には低いバックグラウンドの蛍光を有しており、そして核酸の存在下では、例えばそれと結合する際に、高い蛍光を発する。本明細書中で提供される色素は、様々な用途（例えば、リアルタイムＰＣＲにおけるＤＮＡの定量）において有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、Ｍａｏらの米国仮特許出願第６０／６６３，６１３号（発明の名称「Ｄｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ Ｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｙｅｓ，ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００５年３月１７日出願）の優先権を主張し、かつ同時継続米国出願第＿＿／＿＿＿，＿＿＿号（本明細書と同時に２００６年３月１６日に出願し、やはり米国仮特許出願第６０／６６３，６１３号の優先権を主張する）に関連する。上述の仮出願および出願の各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（共同研究の関係者の同意に関する宣誓）
Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＣＡ））およびＡｌｌｅＬｏｇｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）は、本発明に関する共同研究の同意に対する関係者である。
【０００３】
（配列表についての参照ならびにそれに関する要請および参考文献の引用）
本明細書中に開示される配列番号１から配列番号１０の配列表が含まれている、オリジナルのＡＳＣＩＩディスケットおよび別のＡＳＣＩＩディスケット（これはオリジナルのディスケットの複製である）、さらには、配列表の紙によるコピーが提出され、記載され、そしてその内容を含むそれらの全体が米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３において引用により本明細書中に組み入れられる。配列表の紙によるコピーはそれと共に提出される。上記米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３がすでにファイルされている、適合するコンピュータで読み取ることができる配列表が、本出願と組み合わせて使用されることがここで要請される。本出願およびその内容の配列表の紙によるコピーまたはコンパクトディスクによるコピーは、上記米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３がファイルされている配列表のコンピュータで読み取ることができるコピーと同じである。配列表、それと共に提出される配列表の紙によるコピー、および上記米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３がすでにファイルされているコンピュータで読み取ることができる配列表は、その内容を含むそれらの全体が、この引用により本明細書中に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
蛍光色素は、生物学的試料の検出および分析のために使用されている。蛍光色素は感度が高いため、これは極めて少数の蛍光分子を検出するために使用することができる。例えば、このような蛍光色素を使用して、細胞と会合している５０個未満の蛍光分子を検出することができる。非特許文献１）。
【０００５】
蛍光色素は、生存している細胞または組織試料の中での画像化に使用されるプローブとして使用することができる。例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の表面上の受容体に結合させられた蛍光色素プローブは、蛍光標識されたｃＡＭＰの１つの分子の画像化において使用されている。非特許文献２。様々な蛍光波長を有しているいくつかの蛍光プローブを使用して、生存している細胞または組織試料の中での多色画像化を行うことができる。蛍光プローブは、放射性プローブと比較すると感度が高く、比較的毒性が低く、そして処理が容易である。
【０００６】
蛍光色素は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、および核酸を含む生物学的試料の検出において使用することができる。核酸ポリマー（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、１つの世代から次の世代に、そして、生存している生物の日常的な機能を伝達することに関係している。したがって、核酸は興味深く、本試験の目的である。核酸に特異的に結合し、高度な蛍光錯体を形成する蛍光核酸色素は、このような実験のための有用なツールである。これらの色素を使用して、様々な媒体（純粋な溶液、細胞抽出物、電気泳動ゲル、マイクロアレイチップ、生存している細胞または固定された細胞、死亡した細胞、および環境試料が含まれる）の中のＤＮＡおよびＲＮＡの存在および量を検出することができる。これらの色素は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）におけるＤＮＡの定量的検出に使用することができる。これは、ゲノムの検索および医学的診断において使用される技術である。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はプライマーエクステンション反応である。これにより、インビトロで特異的な核酸を増幅させるための方法が提供される。一般的には、ＰＣＲにおいては、反応溶液は３種類のそれぞれの温度（９６℃、６０℃、および７２℃）で短時間維持され、それぞれ、鎖の分離または変性、アニーリング、および鎖の伸張が行われる。これらの３種類の温度の段階は、反応混合物が含まれているチューブを極めて迅速に加熱または冷却することができる自動サーモサイクラーが使用される場合には、３０秒または４０秒間である。ＰＣＲサイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡ試料の１００万倍のコピーを、およそ１時間以内に１つの酵素反応混合物の中で生産することができ、これにより標的ＤＮＡの大きさおよび配列を決定するための研究が可能となる。このＤＮＡ増幅技術は、クローニングおよび他の分子生物学的操作に使用されている。ＰＣＲについてのさらなる議論は、非特許文献３および非特許文献４に提供されている。
【０００８】
有用な１つのＰＣＲをベースとする技術は定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。簡単に説明すると、ｑＰＣＲの機構は、指数的様式での標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅に基づく。ＰＣＲ反応を行い、増幅反応の過程の間の任意の時点でＤＮＡコピーの総数を測定することにより、出発ＤＮＡ材料の量を遡及的に計算することができる。
【０００９】
蛍光をベースとするＤＮＡの検出は、通常、感度が高く、多用途であり、そしてｑＰＣＲにおいて使用される便利な検出方法である。ｑＰＣＲにおいて使用される蛍光試薬には、２つのタイプがある。第１のタイプは、１つ以上の蛍光色素で、または、蛍光色素と消光剤色素の組み合わせで標識されたオリゴヌクレオチドをベースとする。これらの標識されたオリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズした際、またはオリゴヌクレオチドの切断の際のいずれかに蛍光を放出し、その後、存在するＤＮＡの量に比例する様式でハイブリダイゼーションする。オリゴをベースとする蛍光試薬の機構および使用は、様々な特許および刊行物に記載されている。例えば、非特許文献５；非特許文献６；および特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、および特許文献８を参照のこと。ｑＰＣＲのためのオリゴをベースとする蛍光試薬は、標的配列に対する特異性が高いという利点を有しているが、これらは、設計が非常に複雑であり、結果として、その使用は高価である。ｑＰＣＲで使用される第２のタイプの蛍光色素はＤＮＡ結合蛍光色素をベースとし、これは、一般的には、蛍光核酸色素または染色と呼ばれる。蛍光核酸色素は比較的単純な分子であるため、これらは製造することが容易であり、したがって、その使用は高価ではない。それらのｑＰＣＲにおける適用は、研究室で日常的に行われる遺伝的検出に有用である。
【００１０】
全てではないが、一般的に利用することができる蛍光核酸染色をｑＰＣＲに使用することができる。理想的には、蛍光核酸色素は、それがｑＰＣＲでの使用に適しているためには特定の基準を満たしていなければならない。第一に、これは、ＰＣＲおよび保存の間は化学的に安定でなければならない。ＰＣＲは高温で行われるため、色素は熱安定性でなければならない。加えて、ＰＣＲに使用されるＴｒｉｓ緩衝液のｐＨは、低温（４℃）でのアルカリ（ｐＨ８．５）から、高温では、中性またはわずかに酸性にまで相当に変化し得るため、色素は、酸による分解または塩基による分解に対して耐性がなければならない。第２に、色素は、ＰＣＲ溶液の中に存在する場合には、ＰＣＲプロセスを阻害してはならない。第３に、色素は、ＤＮＡが存在しない条件下では非蛍光であるかまたは最少の蛍光しか発してはならず、そしてＤＮＡの存在下では高度に蛍光を発しならなければならない。第４に、色素は、既存の機器と適合する波長を吸収および放射しなければならない。既存の機器には、通常、一般的な蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｓ）、Ｃｙ３、およびＣｙ５）について最適化させられた光チャンネルが取り付けられている。第５に、色素は、配列に好みがほとんどないかまたは全くなく、ＤＮＡと結合しなければならない。第６に、ＤＮＡ−色素錯体は、存在するＤＮＡの量に直線的に相関している蛍光強度を有していなければならない。
【００１１】
上記の基準を前提とすると、極めて少数の核酸結合色素しかｑＰＣＲに使用できないことは驚くべきことではない。エチジウムブロマイド（ＥＢ）は、ｑＰＣＲに簡単な色素を使用することの実現可能性を明らかにするために使用されているＤＮＡ色素である。非特許文献７。しかし、ＥＢには、低い感度、および望ましくない波長の問題がある。ｑＰＣＲに広く使用されている色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ（ＯＲ））によるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉである。非特許文献８。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、繰り返し置換された（ｃｙｃｌｉｃａｌｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）非対称シアニン色素である。非特許文献９；ならびに、特許文献９および特許文献１０。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの利点は、これが、ほとんどの機器と適合するＦＡＭの波長と極めて適合する励起および放射波長を有していること、およびＤＮＡに結合すると高い蛍光を発することである。最近、ＬＣ Ｇｒｅｅｎと呼ばれるＤＮＡ色素がｑＰＣＲに使用されたが、この色素の構造は開示されなかった。ＬＣ Ｇｒｅｅｎ色素はほとんどのＰＣＲ機器において一般的に使用されているＦＡＭ光チャンネルと適合する望ましい波長を有しているようであるが、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりもはるかに感度が低い。さらに最近、ＢＥＢＯと呼ばれるＤＮＡ小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒ）、およびＢＯＸＴＯと呼ばれる関連色素（これらはいずれも、非対称シアニン色素である）が、ｑＰＣＲでの使用について報告されている。非特許文献１０；および特許文献１１。ＬＣ Ｇｒｅｅｎと同様に、ＢＥＢＯおよびＢＯＸＴＯは、感度に関してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉに有意に遅れをとっている。
【００１２】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩはｑＰＣＲのためのＤＮＡ色素として広く使用されているが、いくつかの態様においてはなおも不足している。一例として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉには、ＰＣＲプロセスに対する阻害作用があり、これは色素濃度を増大させることによって得ることができる最大シグナル強度を制限する。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用するｑＰＣＲの蛍光シグナル強度は、色素濃度が、色素がＰＣＲプロセスを有意に阻害しはじめる点に達するまでは、最初は色素濃度に比例する。色素濃度のさらなる増大によっては、実際には、シグナル強度が低下する、また、ＤＮＡ増幅の減少が原因でサイクル数（Ｃｔ）が増加するであろう。別の例として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉはアルカリ条件（例えば、低温で保存された場合のＰＣＲ緩衝液のアルカリ条件）下では化学的に不安定である。４℃のＴｒｉｓ緩衝液中で保存されたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、数日の経過で有意に分解してしまうこと、および色素の分解産物がどうやら強力な阻害剤であることが報告されている。非特許文献１１。さらに別の例として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによっては、１つの蛍光色しか提供されない。多くの市販されている蛍光検出機器は、複数の光チャンネル（ＦＡＭ光チャンネルとさらに他の光チャンネル）を有しており、したがって、複数の蛍光色を検出することができる。
【特許文献１】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３８，８４８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２５８，５６９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６９１，１４６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９２５，５１７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１１８，８０１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３１２，７２８号明細書
【特許文献８】米国特許第６，６３５，４２７号明細書
【特許文献９】米国特許第５，４３６，１３４号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６５８，７５１号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／０１３２０４６号明細書
【非特許文献１】Ｂａｒａｋ，ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０，５９５（１９８１
【非特許文献２】Ｕｅｄａ，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８６４（２００１）
【非特許文献３】Ｍｕｌｌｉｓ，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）
【非特許文献４】Ｓａｉｋｉ，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）
【非特許文献５】Ｈｏｌｌａｎｄ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９１）
【非特許文献６】Ｌｅｅ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）
【非特許文献７】Ｈｉｇｕｃｈｉ，ら，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０（４），４１３（１９９２）
【非特許文献８】Ｗｉｔｔｗｅｒ，ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２（１），１３０（１９９７）
【非特許文献９】Ｚｉｐｐｅｒ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（１２）、ｅ１０３（２００４）
【非特許文献１０】Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（８），ｅ４５（２００３）
【非特許文献１１】Ｋａｒｓａｉ，ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２（４），７９０（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
蛍光色素の開発、またはその作成もしくは使用が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
有用な用途（例えば、ｑＰＣＲプロセスにおける用途）に適している蛍光色素を生産または設計する方法が提供される。この方法には、柔軟であり、そして実質的には中性（例えば、中性またはわずかに電化を有している）であり得る架橋を介して、２つまたは３つ以上の単量体色素を共有結合させることが含まれる。本明細書中で提供される色素を生産または設計する方法により、これまでは得ることができなかった波長および／または他のスペクトル特性を有している蛍光核酸色素の開発が可能となり得る。
【００１５】
有用な用途（例えば、上記に記載された用途）に適している蛍光色素が提供される。二量体または三量体色素（本明細書中に記載される方法にしたがって生産することができる）はエアピンは構造を形成することができ、これにより、本明細書中にさらに記載されるように、色素がリリースオンデマンド（ｒｅｌｅａｓｅ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）機構により核酸を染色することができるようになると考えられる。本明細書中に記載される色素は、以下の特徴の少なくとも１つ、または以下の特徴の全てを有し得る：存在するとしても、比較的低い「蛍光バックグラウンド」（核酸が存在しない条件下での蛍光）、そして理想的には、蛍光バックグランドはない；比較的低いＰＣＲ阻害、そして理想的には、ＰＣＲ阻害はない；比較的高い蛍光シグナル強度；および比較的高い安定性。色素は、これらの特徴の少なくとも１つ、またはこれらの特徴の全てに関して、既存の色素（例えば、単なる例であるが、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）よりも優れているであろう。本明細書中に記載される色素は、例えば、これまでは得ることができなかった波長および／または別のスペクトル特性のような特性を有している場合がある。
【００１６】
分子内二量体形成、またはヘアピン構造を形成することができる二量体および／または三量体核酸色素または染色が提供される。ヘアピン型の色素は、それ自体は非蛍光であるか最少にしか蛍光を発しないが、核酸の存在下では高い蛍光を生じるようになり得ると考えられる。色素の核酸への結合は、中間状態を通じて起こり得、この場合、色素は、一部が、オープンランダム立体構造（ｏｐｅｎ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を形成していると考えられる。さらに、この色素のオープンランダム立体構造は、少量で存在し得、そしてヘアピン状態と平衡状態にあると考えられる。核酸の量が増加すると、ヘアピン状態から色素の核酸に結合した状態への平衡のシフトが起こり得、その結果、得られる蛍光シグナルの強度は、存在する核酸の量に実質的に直線的に比例し得ると考えられる。
【００１７】
上記の機構は、ＤＮＡ染色のリリースオンデマンド機構と呼ぶことができ、様々な用途（例えば、定量的、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ））に望ましい場合がある。単なる説明ではあるが、ヘアピン構造の形成は、「有効色素濃度」を下げることができ、その結果、本明細書中に記載される色素は、ＰＣＲプロセスをほとんど妨害しないであろうと考えられる。したがって、以前の色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）と比較すると、本明細書中に記載される色素の高い濃度をｑＰＣＲにおいて使用することができる。色素のこの高い濃度により、ＤＮＡ検出感度が、おそらくは有意に高くなり得る。
【００１８】
試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法が提供される。試料には、標的核酸が含まれている場合も、また含まれていない場合もある。このような方法には、試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程が含まれる。この場合、蛍光核酸色素は以下の式を有する：
【００１９】
【化３８】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約８個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーである；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である。色素構成成分は、例えば、本明細書中に記載されるもののような、任意の適切な色素構成成分であり得る。単なる例としてではあるが、蛍光核酸色素構成成分は、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択することができる。Ｑ１色素構成成分とＱ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり、そして、Ｑ１色素構成成分とＱ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分である。レポーター色素構成成分と蛍光核酸色素構成成分は同じである場合も、また異なる場合もある。この方法には、標的核酸の増幅のために十分である試験溶液を使用してプロセスを実行する工程が含まれ得る。試料には、標的核酸が含まれるはずである。単なる例としてではあるが、このプロセスはＰＣＲプロセス、例えば、リアルタイムＰＣＲプロセスであり得る。この方法には、レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程が含まれ得る。
【００２０】
試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する別の方法が提供される。試料には、標的核酸が含まれる場合も、また含まれない場合もある。このような方法には、試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程が含まれる。この場合、蛍光核酸色素は以下の式を有する：
【００２１】
【化３９】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーである；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である；Ｑ３は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である。色素構成成分は、例えば、本明細書中に記載されるもののような、任意の適切な色素構成成分であり得る。単なる例としてではあるが、蛍光核酸色素構成成分は、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択することができる。Ｑ１色素構成成分、Ｑ２色素構成成分、およびＱ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり、そして、Ｑ１色素構成成分、Ｑ２色素構成成分、およびＱ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分である。レポーター色素構成成分と蛍光核酸色素構成成分は同じである場合も、また異なる場合もある。この方法には、標的核酸の増幅のために十分である試験溶液を使用してプロセスを実行する工程が含まれ得る。試料には、標的核酸が含まれるはずである。単なる例としてではあるが、このプロセスはＰＣＲプロセス、例えば、リアルタイムＰＣＲプロセスであり得る。この方法には、レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程が含まれ得る。
【００２２】
上記で提供された式においては、ＢＲＩＤＧＥは、すぐ下に示される式を有している場合がある。
【００２３】
【化４０】
【００２４】
【化４１】
この式においては、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基であり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数であり；そして、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数である。ＢＲＩＤＧＥには、適切な数の水素以外の原子、例えば、単なる例ではあるが、約８個から約１００個または約１５０個（８、１００、１５０を含む）、約１２個から約６０個（１２、６０を含む）、または約１５個から約４０個（１５、４０を含む）が含まれ得る。ＢＲＩＤＧＥは、例えば、本明細書中に記載される任意のもののような、任意の適切なリンカー分子であり得る。１つの例においては、ＢＲＩＤＧＥは以下の式を有する：
【００２５】
【化４２】
式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；αは２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり；ｂは０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、ｃは０または１である。
【００２６】
上記方法に関連する組成物もまた提供される。単なる例ではあるが、すぐ下に提供される構造のいくつかの色素が提供される。
【００２７】
【化４３】
【００２８】
【化４４】
上記の色素の構造においては、Ψは陰イオン（例えば、単なる例ではあるが、ヨウ化物または塩化物陰イオン）を示す。
【００２９】
すぐ下に示される式を有している組成物もまた提供される。
【００３０】
【化４５】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーである；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分あり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分であり；そして、Ｒｒは、反応基または官能基である。反応基または官能基は、例えば、本明細書中に記載されるもののような、適切なそのような基のいずれかであり得る。組成物は、例えば、本明細書中に記載されるものいずれかのような、任意の適切な組成物であり得る。組成物または色素を使用する方法には、組成物を基質分子（例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、および固体表面の分子から選択される基質分子）に結合させる工程が含まれ得る。
【００３１】
試料（核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある）を調製する方法もまた提供される。この方法には、試料と組成物または色素（例えば、本明細書中に記載されるもの）の混合物を提供する工程が含まれ得る。ここでは、試料中に核酸が存在する場合は、核酸−色素錯体が形成される。この方法には、さらに、混合物をインキュベートする工程が含まれる場合がある。試料中の核酸の存在またはそれが存在しないことを決定する方法もまた提供される。この方法には、試料と組成物または色素（例えば、本明細書中に記載されるもの）の混合物を提供する工程（ここでは、試料中に核酸が存在する場合は、核酸−色素錯体が形成される）；十分な波長の光で混合物を照射する工程であって、その結果、核酸錯体を形成されると、光がそれによって吸収される工程；ならびに、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程が含まれる。試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するためのキットもまた提供される。キットには、試料中の標的核酸の増幅に十分な少なくとも１つの組成物が含まれ得、試料には、標的核酸と組成物または色素（例えば、本明細書中に記載されるもの）が含まれていなければならない。
【００３２】
これら、および様々な他の態様、特徴、および実施形態が本明細書中にさらに記載される。
【００３３】
様々な態様、特徴、および実施形態の詳細な説明が、以下に簡単に記載される添付の図面を引用して本明細書中に提供される。図面は具体例であり、必ずしも同一縮尺ではない。図面は様々な態様または特徴を示しており、そして全体または一部において、１つ以上の実施形態または実施例を具体的に説明している場合がある。特定のエレメントまたは特徴をいうために１つの図面の中で使用される引用される数字、文字、および／または記号は、類似のエレメントまたは特徴をいうために別の図面の中で使用される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（説明）
様々な用途（例えば、核酸の検出）に有用であり得る蛍光色素または染色が本明細書中で記載される。このような色素は、例えば、二量体または三量体の核酸色素であり得、核酸が存在しない場合には低いバックグラウンドの蛍光を有しており、そして核酸の存在下では、高い蛍光を発するようになる。二量体および三量体の核酸色素は、様々な用途（例えば、本明細書中に記載されるような核酸の検出）に有用であり得る。蛍光色素または染色の調製ならびに使用に関する方法もまた、蛍光色素または染色を含む有用なシステムまたはキットと同様に、本明細書中に記載される。
【００３５】
本明細書中では、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、単数形で表現される用語にはその複数形の対応物が含まれ、そして複数形で表現される用語にはその単数形の対応物が含まれることが理解されるであろう。さらに、本明細書中に記載される任意の所定の成分について、その成分についての可能性のある候補または列挙される別のものの任意のものが、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、通常は、個別に、あるいは、別のものと組み合わせて使用され得ることが理解されるであろう。加えて、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、このような候補または別のものの任意のリストは単なる例にすぎず、限定ではないことが理解されるであろう。なおさらに、本明細書中に示される任意の図面または数字はおおよそであること、そして任意の数的範囲には、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、用語「包括（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）または同様の表現が存在するかしないかにはかかわらず、範囲を定義する最小数と最大数が含まれることが理解されるであろう。加えて、任意の許容される、制約のない、または制限のない言語には、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、それぞれ、制限された言語に対して任意の比較的許容されている、制約のある言語に対して比較的開かれている、または制限のない言語に対して制限のない言語が含まれる。単なる例ではあるが、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）には、「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「原則として〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および／または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」型の言語が含まれ得る。
【００３６】
様々な用語が、理解を容易にするために以下に一般的に記載されるか、または本明細書中で使用される。これらの様々な用語の対応する一般的記載が、これらの様々な用語の対応する語学上または文法上のバリエーションまたは形態に対しても適用されることが理解されるであろう。以下の任意の用語の一般的な記載は、用語が通常ではない様式またはより特異的な様式で使用される場合には適用されない場合も、また完全には適用できない場合もあることも理解されるであろう。本明細書中で使用される技術用語または本明細書中で提供される記載（例えば、様々な実施形態に関するもの）は限定ではないことも理解されるであろう。さらには、本明細書中に記載される実施形態または本明細書中に記載される用途は、これらが変化し得るため、限定ではないことが理解されるであろう。
【００３７】
一般的には、用語「染色」および「色素」は同義的に使用することができ、そして約２５０ｎｍから約１，２００ｎｍまでのスペクトル範囲の光を吸収することができる芳香族分子を意味する。通常、用語「色素」は蛍光色素、非蛍光色素、またはそれらの両方を意味することができる。一般的には、用語「蛍光色素」は、適切な波長の別の光によって励起させられると光を放射することができる色素を意味する。
【００３８】
一般的には、用語「蛍光消光剤」は、別の蛍光分子の蛍光を消光させることができる分子を意味する。蛍光の消光は、３つの方法の少なくとも１つによって起こり得る。第１のタイプの蛍光の消光は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって起こる（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．（１９４８）；およびＳｔｒｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６７））。この場合、消光剤は蛍光分子からの放射光を吸収する。ＦＲＥＴ消光剤の吸収ピークは、通常、有効な蛍光消光剤であるＦＲＥＴ消光剤についての蛍光色素の放射ピークと有意に重複している。ＦＲＥＴ消光剤は、通常は、非蛍光色素であるが、蛍光色素であってもよい。消光剤が蛍光色素である場合には、色素の吸収特性だけが利用される。第２のタイプの蛍光の消光は、光によって誘導される電子移動（ＰＥＴ）によって起こる。この場合、消光剤は、電子を多く含む分子であり、電気的に励起された色素に対して電子を移動させることによって蛍光分子の蛍光を消光させる。第３のタイプの蛍光の消光は、色素の凝集（例えば、Ｈ−二量体の形成）によって生じる。この場合、２つ以上の色素分子が互いに物理的に接触し、それによって分子の振動モードの中に電子エネルギーを消滅させる。このタイプの接触による蛍光の消光は、２つの同じ蛍光色素の間で起こる場合も、また、２つの異なる蛍光色素の間で起こる場合も、また、蛍光色素とＦＲＥＴ消光剤の間で起こる場合も、また、蛍光色素とＰＥＴ消光剤の間で起こる場合もある。他のタイプの蛍光消光剤としては、一般的には使用されていないが、安定なフリーラジカル化合物、および特定の重金属錯体が挙げられる。
【００３９】
通常、用語「核酸」は、二本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖のＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および／またはそれらの誘導体を意味する。核酸は自然界に存在しているものである場合も、また、合成のものである場合もある。
【００４０】
一般的には、用語「蛍光核酸染色」または「蛍光核酸色素」は、蛍光色素−核酸錯体を形成するように核酸に結合することができる色素を意味する。蛍光核酸色素は、通常、それ自体は非蛍光であるか弱い蛍光しか発しないが、核酸と結合すると高度に蛍光を発するようになる。一般的には、用語「非蛍光核酸結合分子」は核酸結合分子を意味し、これは色素である場合も、また、色素ではない場合もあり、そして核酸に結合しても蛍光を発するようにはならない。一般的には、用語「蛍光ＤＮＡ色素」は、ＤＮＡに結合すると蛍光を発するようになる色素を意味する。一般的には、用語「蛍光非核酸色素」は、核酸に結合しない蛍光色素を意味する。一般的には、用語「非蛍光非核酸色素」は、蛍光を発することがなく、そして核酸に結合することもない色素を意味する。このような色素は、まとめて、蛍光消光剤と呼ばれる。多くの場合、蛍光消光剤は、蛍光色素とＦＲＥＴ対を形成するように使用される。通常は、用語「レポーター色素」は、それが放射する蛍光が最終的に検出される蛍光シグナルに寄与する蛍光色素を意味する。
【００４１】
一般的には、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの量を増幅させるための技術を意味する。通常、用語「定量的リアルタイムＰＣＲ」すなわち「ｑＰＣＲ」は、ＰＣＲの過程においてＤＮＡ量の増加をモニターするための技術を意味する。
【００４２】
一般的には、蛍光核酸色素は、２つの主要なクラス（挿入剤および小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒ））に分類することができる。一般的には、蛍光挿入剤は色素であり、隣接している塩基の間にそれ自体を挿入することによって、二本鎖のＤＮＡまたは二本鎖のＲＮＡに結合する。通常、小溝結合剤は色素であり、これは二本鎖ＤＮＡの小溝に結合する。複数の形式（正電荷を有している色素と負電荷を有している核酸との間での静電気相互作用を含む）によって核酸に結合することができるさらに他の色素が存在している。
【００４３】
様々な蛍光核酸色素が市販されており、そしてｑＰＣＲ以外の使用のために色素を改良するための方法が開発されているが、全てではないが複数の核酸染色がｑＰＣＲの用途に適している。加えて、どのような構造エレメントが良好なｑＰＣＲ色素に必要であるかはほとんど知られていない。
【００４４】
一般的には、性能の観点から、ｑＰＣＲのための理想的な色素は、本明細書中に記載されるように様々な基準を満たしていなければならない。色素は、ＰＣＲ緩衝液中での高温（約６０℃から約９６℃）で熱安定性でなければならず、そして媒体がアルカリ性となる低温（約−２０℃から約４℃）では加水分解に対して安定でなければならない。色素は、ＰＣＲプロセスを阻害してはならない。これは、ＰＣＲの阻害の最も深刻な場合にはＰＣＲプロセスが開始すらされない場合があり、そしてより穏やかな場合においても、Ｃｔ数が遅れるか、または極めて低い色素濃度しか使用することができず、結果として蛍光シグナルが限られてしまうため、一般的には最も重要な基準である。色素は、ＤＮＡが存在しない条件下では非蛍光であるかまたは最少の蛍光しか発してはならないが、ＤＮＡの存在下では高度に蛍光を発するようにならなければならない。色素の吸収波長と放射波長は、ｑＰＣＲと組み合わせて使用される機器（例えば、上記に記載された既存の機器）と適合しなければならない。色素のＤＮＡ結合は、配列に好みがほとんどないか、または好みは全くなければならない。ＤＮＡ−色素錯体の蛍光強度は、存在するＤＮＡの量に直線的に相関していなければならない。本明細書中に記載される色素は、上記の基準の１つ以上を満たしている場合も、または１つ以上を満たしていない場合もある。
【００４５】
蛍光核酸色素（例えば、ｑＰＣＲに適している蛍光核酸色素）を設計するための方法が提供される。この方法には、２個または３個の単量体色素を適切なリンカーを用いて共有結合させて、二量体色素または三量体色素を形成させる工程が含まれる。本明細書中に記載される色素は、溶液中に存在する場合は、分子内二量体の形成が原因で、主にヘアピン様の立体構造をとり得る。色素のこのヘアピン様の立体構造または状態は核酸に関しては不活性であるか、または核酸と相互作用することはできない。色素は、溶液中に存在し、核酸の存在下では、オープンランダムな立体構造（ｏｐｅｎ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）または状態もとり、これは、少量でしか存在せず、ヘアピン立体構造と実質的に平衡状態にあると考えられる。色素のこのオープンランダムな立体構造または状態は、核酸に関して活性であるか、または核酸と相互作用もしくは結合できる。色素が漸増量の核酸の存在下にある場合には、ヘアピン状態から中間のオープンランダムな状態、またはＤＮＡに結合した状態への平衡のシフトが起こると考えられる。この機構は、しばしば、「リリースオンデマンドＤＮＡ結合機構」と呼ばれ、他の方法で色素が関係している可能性があるＰＣＲの阻害を減少させると考えられている。結果として、色素は、別の方法で可能であるよりも高い濃度でＰＣＲプロセスにおいて使用することができ、したがって、別の方法で可能であるよりも高い核酸検出感度を提供するであろう。ＰＣＲ阻害の減少は劇的であり得、そして核酸検出感度の増大は有意であり得る。
【００４６】
本明細書中に記載される二量体色素または三量体色素は、任意の数の望ましい特性を有し得る。例として、このような色素は、その単量体色素構成成分のバックグラウンド蛍光と比較すると低いバックグラウンド蛍光を有している場合がある。比較的低いバックグラウンド蛍光は、通常、比較的高い核酸検出感度に対応している。したがって、このような色素は、通常、高い核酸検出感度と関係している。さらなる例として、本明細書中に記載される色素は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも熱的におよび／または加水分解に対して安定である場合がある。なおさらなる例としては、本明細書中に記載される色素は、既存のｑＰＣＲ色素が関係している波長以外の吸収および放射波長を有している場合がある。
【００４７】
蛍光二量体核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造１）を有し得る。
構造１
【００４８】
【化４６】
構造１においては、色素Ｑ１および色素Ｑ２はそれぞれ独立して、蛍光核酸色素、非蛍光核酸色素、蛍光非核酸色素、および非蛍光非核酸色素から選択される。Ｑ１およびＱ２は、得られる二量体色素の所望される特性を促す、または確実にするような様式で選択され、組み合わせられ得る。色素Ｑ１および色素Ｑ２の少なくとも一方の色素はレポーター色素である。さらに、色素Ｑ１と色素Ｑ２の少なくとも一方の色素は、蛍光核酸色素または非蛍光核酸色素である。レポーター色素と蛍光核酸色素は同じである場合も、また異なる場合もある。ＢＲＩＤＧＥは比較的限られた程度の正電荷を有している場合も、また、電荷に関しては実質的には中性である場合もあり、そして二量体色素を生じるように分子内二量体の形成を促進する実質的に柔軟な構成成分であり得る。
【００４９】
蛍光三量体核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造２）を有し得る。
構造２
【００５０】
【化４７】
構造２においては、色素Ｑ１、色素Ｑ２、および色素Ｑ３はそれぞれ独立して、蛍光核酸色素、非蛍光核酸色素、蛍光非核酸色素、および非蛍光非核酸色素から選択される。Ｑ１、Ｑ２およびＱ３は、得られる三量体色素の所望される特性を促す、または確実にするような様式で選択され、組み合わせられ得る。色素Ｑ１、色素Ｑ２、および色素Ｑ３の少なくとも１つの色素はレポーター色素である。さらに、色素Ｑ１、色素Ｑ２、および色素Ｑ３の少なくとも１つの色素は、蛍光核酸色素または非蛍光核酸色素である。レポーター色素と蛍光核酸色素は同じである場合も、また異なる場合もある。ＢＲＩＤＧＥは比較的限られた程度の正電荷を有している場合も、また、電荷に関しては実質的には中性である場合もあり、そして三量体色素を生じるように分子内二量体の形成を促進する実質的に柔軟な構成成分であり得る。
【００５１】
蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造３）を有し得る。
構造３
【００５２】
【化４８】
構造３においては、色素Ｑ１、色素Ｑ２の色素はそれぞれ独立して、構造１および構造２に関して上記に記載されたものと同様であり得る；ＢＲＩＤＧＥは、先に記載されたように、実質的には脂肪族のリンカーである；そしてＲｒは、反応基または官能基であり得る。単なる例としてではあるが、Ｑ１は蛍光核酸色素構成成分であり得；Ｑ２は蛍光核酸色素構成成分であり得；ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーであり得；そしてＲｒは、本明細書中に記載されるように、反応基または官能基である。
【００５３】
ＢＲＩＤＧＥ
ＢＲＩＤＧＥは、わずかに１つの正電荷を有している、実質的に柔軟なリンカー分子であり得る。ＢＲＩＤＧＥは実質的には中性であり得、実質的には柔軟なリンカー分子であり得る。ＢＲＩＤＧＥの構成成分は、そのような限られた正電荷、またはそのような実質的な中性が得られるように選択され得る。実質的な中性（実際の中性を含む）の特性は以下でさらに議論される。実質的な柔軟性の特性は、一般的には、ＢＲＩＤＧＥの実質的な脂肪族の性質（実際の脂肪族の性質を含む）と関係している。この実質的に脂肪族の性質は、一般的には、ＢＲＩＤＧＥの非芳香性、またはＢＲＩＤＧＥの非剛性を意味する。
【００５４】
構造１においては、ＢＲＩＤＧＥは、Ｑ１およびＱ２に共有結合させられている。二量体色素の場合には、ＢＲＩＤＧＥは、例えば、約８個から約１５０個までの水素以外の原子、約８個から約１００個までの水素以外の原子、約１２個から約６０個までの水素以外の原子、または約１５個もしくは約２０個から約４０個もしくは約５０個までの水素以外の原子を有し得る。構造２においては、ＢＲＩＤＧＥは、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３に共有結合させられている。三量体色素の場合には、ＢＲＩＤＧＥは、例えば、約１５個から約１５０個までの水素以外の原子、約２０個から約１５０個までの水素以外の原子、約２０個から約１００個までの水素以外の原子、または約３０個から約７０個までの水素以外の原子を有し得る。
【００５５】
ＢＲＩＤＧＥには、少なくとも１つの無関係な核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）を組み込むことができる。ＮＡＢＥＧは、静電気相互作用、疎水性相互作用、または水素結合相互作用の形態で核酸に結合することができる部分である。単なる例としてではあるが、ＮＡＢＥＧは、第１級アミン：第２級アミン；第３級アミン；アンモニウム；アミジン；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択されるヘテロ原子が含まれているアリール基、およびそれらの任意の組み合わせ；高い電気陰性度のヘテロ原子が含まれている結合を有している部分；ならびに、それらの任意の組み合わせから選択することができる。
【００５６】
第１級、第２級、および第３級アミン、ならびにアミジンは塩基性基であり、したがって、生理学的ｐＨでは、正電荷を有しているか、または少なくとも部分的に正電荷を有している。アンモニウム基または４級化窒素基は、永久的な正電荷を有している。一般的に言えば、正電荷を有している、または部分的に正電荷を有している基は、感度が高い蛍光核酸染色の開発において利用することができる特性である、静電気相互作用による色素の核酸結合を増強させる。本発明の色素を生産するためには、過剰な正電荷を有しているＢＲＩＤＧＥを使用することは、通常は望ましくない。例えば、本発明の二量体色素または三量体色素の適切なＢＲＩＤＧＥには、わずかに１つの正電荷が含まれる場合がある。ＢＲＩＤＧＥは実質的に柔軟な、中性のリンカーであり得るか、または、実質的に中性のリンカーであり得る。この状況においては、実質的な中性は、わずかな電荷を意味する。例として、ＢＲＩＤＧＥには、弱い塩基性の構成成分（例えば、ピリジン基またはピラジン基）を含めることができ、その結果、これが水溶液中に存在する場合には、極めて少量の正電荷が存在し得る。さらなる例として、ＢＲＩＤＧＥに少なくとも１つのＮＡＢＥＧが含まれる場合（状況に応じて）は、正電荷の正確な量は、一般的には、ＮＡＢＥＧのｐＫａに関係し得る。通常、ＮＡＢＥＧのｐＫａが高ければ高いほど、ＮＡＢＥＧはより多くプロトン化され、したがって、より大きな正電荷を有する可能性がより高くなる。例として、適切な弱塩基性のＮＡＢＥＧ基は、約１１またはそれ未満、約８またはそれ未満、あるいは、約７またはそれ未満のｐＫａを有し得る。
【００５７】
分子内二量体（主に、Ｈ−二量体）を形成する傾向があり得る。これは、生産される核酸色素において特に有用な特性であり得る。例えば、本明細書中に記載される二量体色素の場合は、Ｈ−二量体の形成によりヘアピン様構造が生じ得る。ここでは、図１に模式的に示されるように、Ｈ−二量体はヘアピンのステム部分を形成し、ＢＲＩＤＧＥは湾曲した部分を形成する。特定の色素に関するＨ−二量体の形成の表現形が、Ｗｅｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９６５）；Ｒｏｈａｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９６６）；Ｒｏｈａｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．（１９７１）；およびＫｈａｉｒｕｔｄｉｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）に記載されている。分子内Ｈ−二量体の形成は、ＢＲＩＤＧＥが柔軟であり中性であるか、または実質的に中性の炭化水素リンカー（状況に応じて、１つ以上のＮＡＢＥＧが含まれている）場合に、促進され得る。
【００５８】
Ｈ−二量体の形成は、色素吸収スペクトルの大きな青色のシフトを特徴とし得る。例として、単量体色素ＡＯ（アクリジンオレンジ）および関連する二量体色素ＡＯＡＯ−７（分子内二量体を形成する）の吸収スペクトルが図２に示される。ＡＯＡＯ−７二量体に関する４７１ｎｍでのピークは、分子内Ｈ−二量体の形成を示している。単量体および二量体のいずれの吸収スペクトルも、ＤＮＡ結合が生じると同様のものとなり、これは、ヘアピン構造が開かれていることを示している。例として、図３に示されるように、ＡＯＡＯ−７二量体から４７１ｎｍでのピークが消滅することは、ＤＮＡに結合するとヘアピン構造が開かれることを示している。
【００５９】
本明細書中に記載される色素のＨ−二量体の形成は、２つの主要な利点を伴う場合がある。１つの主要な利点は、蛍光シグナルの大幅な増加によって明らかにされるように、ＤＮＡと結合した際の蛍光の実質的な増加と組み合わせた、バックグラウンドの蛍光の、多くの場合は劇的である減少である。この利点は、単量体アクリジンオレンジ色素であるＤＭＡＯ、および二量体アクリジンオレンジ色素であるＡＯＡＯ−７の蛍光スペクトルを、ＤＮＡが存在しない条件とＤＮＡの存在下で比較することによって明らかにすることができるであろう。例えば、図４に示されるように、単量体ＤＭＡＯ色素と比較すると、二量体ＡＯＡＯ−７色素は、低いバックグラウンドの蛍光と、ＤＮＡに結合した際には、高い蛍光を伴う。
【００６０】
分子内二量体による蛍光の消光は、本明細書中に記載される色素が、少なくとも１つの単量体色素（非常に望ましいとは通常は考えられない）（例えば、高いバックグラウンドの蛍光を有している少なくとも１つの単量体色素）から構築される場合があるため、効果的であり得る。１つのこの例は図４に示される。これはアクリジンオレンジ（ＡＯ）およびその二量体を特徴とする。ＡＯは最初に明らかになった核酸結合色素の１つであり。望ましい波長を有しているが、その比較的高いバックグラウンドの蛍光の理由から、核酸の検出については広くは使用されていない。図４に示されるように、単量体ＡＯ色素と比較すると、二量体色素ＡＯＡＯ−７は、はるかに低いバックグラウンドの蛍光を有する。
【００６１】
Ｈ−二量体の形成は、分子間相互作用ではなく、分子内相互作用によって起こる。Ｈ−二量体の形成は、２つまたは３つの色素（例えば、所望される単量体色素の対）の共有結合によって起こる。Ｈ−二量体の形成は比較的簡単に完成され得、これには、さらなる試薬（例えば、色素の有用な用途を妨害する可能性がある別の試薬）の添加は必要ない。例として、二量体色素は、１つの核酸結合色素構成成分と１つの非核酸結合蛍光色素構成成分を溶液の中で対合させることにより、さらなる試薬を使用することなく形成させることができる。さらなる例として、三量体色素は、溶液中の２つの核酸結合色素構成成分と１つの非核酸結合蛍光色素構成成分から、さらなる試薬を使用することなく調製することができる。Ｈ−二量体の形成によっては、非ＤＮＡ結合状態で色素を捕捉するために有用な方法が提供される。これにはＰＣＲに対する阻害作用はなく、そしてこれは、ＤＮＡが存在する場合にのみ、オープンランダムな状態またはＤＮＡ結合状態へとシフトする。したがって、有効色素濃度またはオープンランダムな状態にある色素の濃度は、高い全色素濃度がｑＰＣＲ感度を高めるために使用される場合にもなお、低く保つことができる。
【００６２】
上記のように、本明細書中に記載される色素の中でのＨ−二量体の形成は、別の主要な利点を伴う場合もある。この予想外の利点は、色素の中でのＨ−二量体の形成によって、ｑＰＣＲの用途においてＰＣＲに対する色素の阻害作用を有意に減少させることができることである。例として、通常、所定の濃度のＤＮＡ試料については、蛍光ＤＮＡ色素からの蛍光シグナルは、色素が飽和するまでは色素濃度に比例する。例として、色素濃度が高ければ高いほど、ＤＮＡ−色素錯体の形成はより多くなる。したがって、色素が飽和するまでは、より多く、またはより明るい蛍光となる。したがって、理想的には、ｑＰＣＲの用途における最大感度のためには、十分に高い色素濃度を用いて開始することが望ましいであろう。しかし、実際は、ｑＰＣＲにこれまでに使用されてきた全てのＤＮＡ色素は、様々な程度でＤＮＡの増幅プロセスを阻害する。典型的には、このようなこれまでの色素のより高い濃度は、増幅またはＰＣＲプロセスの色素によるより大きな阻害を伴う。したがって、このようなこれまでの色素の濃度は、通常、非ｑＰＣＲの用途についての濃度よりも、ｑＰＣＲの用途についてははるかに低くなってしまっている。
【００６３】
ｑＰＣＲの用途における色素濃度のこの低下によっては、ｑＰＣＲに最も広く使用されるＤＮＡ色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）の以下の議論から明確に理解できるように、終点蛍光シグナル強度の犠牲が生じる。ｑＰＣＲにおいて使用されるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １の濃度は製造業者によっては提供されておらず、結果として、他の色素との正確な比較は容易ではなく、日常的な方法で行うことはできない。しかし、色素の濃度がＢｅｅｒの法則（Ｂｅｅｒ’ｓ ｌａｗ）に従いその光学密度と直線的な関係にあるため、ｑＰＣＲにおいて使用されるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １溶液、およびｑＰＣＲにおいて使用される別の色素溶液の光学密度の特性を、それぞれの濃度を少なくとも定性的に比較するために使用することができる。例えば、ｑＰＣＲにおいて使用されるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １溶液についての典型的な光学密度は、０．０２５から０．０５であるが、一方、ｑＰＣＲに使用される本明細書中の表２のＤｙｅ Ｎｏ．１９の溶液についての光学密度は、通常は、約０．０４から約０．８、またはより典型的には、約０．１から約０．４である。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素は、色素濃度が、０．５×の濃度（これは、４９５ｎｍの吸収ピークでの０．０２５の光学密度に対応する）から１×の濃度（これは、同じ吸収ピークでの０．０５の光学密度に対応する）に増大すると有意な阻害作用を示す。図８に示されるように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは１×の濃度では０．５×濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと比較すると、より高い終点蛍光シグナルを有しているが、１×の色素濃度に付随するサイクル数、またはＣｔ値は遅れる。この遅れたＣｔ値は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが、より高い濃度ではＰＣＲを有意に阻害することを示している。二量体色素ＡＯＡＯ−１２は、色素濃度が、１×の色素濃度（これは、４７１ｎｍの吸収ピークでの０．１の光学密度に対応する）から２×の色素濃度（これは、同じ吸収ピークでの０．２の光学密度に対応する）に上昇しても、阻害をほとんど示さないか、または全く阻害を示さない。ＡＯＡＯ−１２はＰＣＲの阻害をほとんど示さないかまたは全く示さないため、これは、比較的高い濃度で使用することができ、そして図９に示されるように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光シグナルよりも数倍高くなり得る蛍光シグナルを提供する。簡単に説明すると、ＡＯＡＯ−１２は、広範な濃度においてＰＣＲ阻害をほとんど示さないかまたは全く示さず、したがって高い蛍光シグナルのためにより高い濃度で使用することができる。
【００６４】
本明細書中に記載される色素に付随する可能性があるＰＣＲ阻害が上記のように実質的にはないことにより、より高い色素濃度を使用することができ、これは、図１に模式的に示される「リリースオンデマンド」機構によって説明することができると考えられる。すなわち、溶液中では、二量体色素は、図１に示されるように、閉じたヘアピン立体構造とオープンランダムな立体構造の間での動的平行状態として存在しているト考えられる。一般的には、ヘアピン立体構造は、オープンランダムな立体構造よりもはるかに安定であり、そして優勢である。色素のヘアピン立体構造の優勢は、紫外線／可視光線スペクトルによってサポートされる。これは、単量体スペクトルと比較して、二量体スペクトルの実質的なシフトを示す。ヘアピン立体構造は色素の不活性な形態であるが、一方、オープン立体構造は色素の活性な形態であり、ＤＮＡに結合することができる。ＤＮＡが存在する場合は、オープン立体構造の色素はＤＮＡに結合した立体構造へとシフトし、ヘアピン立体構造であるより多くの色素は、オープン立体構造へとシフトする。そして、オープン立体構造の色素は非常に低い濃度のままとなる。言い換えると、色素の大部分はＤＮＡに結合していないヘアピン立体構造で捕捉され、そして、より多量のＤＮＡの存在に反応して、オープン立体構造またはＤＮＡ結合形態に対してのみ放出される。この「リリースオンデマンド」機構により、ＰＣＲプロセス自体には有害な影響を与えることなく、比較的高い濃度で色素を使用することが可能となる。本明細書中に記載される色素とは異なり、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、色素の有効濃度を下げることを助ける非ＤＮＡ結合立体構造を有してはおらず、したがって、高度な濃度依存性のＰＣＲ阻害作用を示す。
【００６５】
本明細書中に記載される核酸染色は比較的簡単であり、そして望ましい規模（例えば、数グラムから数１０グラムで測定される量）で、日常的に行われているように調製することができる。これらの核酸染色は、ＤＮＡ増幅の検出に、および比較的日常的に行われている研究の用途に、非常に広く使用することができる。例として、蛍光核酸色素は、実質的に非配列選択的様式で、または比較的一般的な様式で、ＤＮＡの存在および量を検出するために使用することができる。
【００６６】
ＢＲＩＤＧＥは、すぐ下に示される式（式１）を有し得る。
式１
【００６７】
【化４９】
式１においては、置換基Ｌ１および置換基Ｌ２（それぞれ、単純に「Ｌ」と呼ばれる場合もある）のそれぞれの置換基は、ＢＲＩＤＧＥの一部である。Ｌ１はＱ１色素構成成分およびＱ２色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており、そしてＬ２は、Ｑ１色素構成成分とＱ２色素構成成分（上記１つの色素構成成分以外のもの）の色素構成成分に共有結合させられている。Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基である。（ＣＨ２）メチレン単位の下つき文字、すなわち、α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιは同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、関連するメチレン単位の大きさを示しており、０、または１から約２０まで、または１から約１２までの整数である。式１の括弧つきの部分に伴う下つき文字、すなわち、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉは同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、式の関連する括弧つきの部分の大きさを示しており、そして、０、または１から約２０まで、または１から約１０まで、または１から約５までの整数である。
【００６８】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は同じである場合も、また異なる場合もあり、これらはそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＢＲＩＤＧＥに多くても１つの正電荷が含まれるか、またはＢＲＩＤＧＥが実質的に中性であるようなものであり得る。後者の場合には、これらの構成要素はそれぞれ独立して、それ自体が実質的に中性（実際に中性を含む）のものであり得る。ＮＡＢＥＧは、高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合（ｂｏｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ）が含まれている部分；および、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基を含む、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分から選択され得る。高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分の例としては、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている部分が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６９】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、すぐ下に示される式（式２）に示されるように、分岐Ｂ’とリンカーＬを介してＱ３に共有結合させられた分岐単位であり得る。
式２
【００７０】
【化５０】
式２においては、Ｔは、置換された炭素、置換された窒素、または状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基であり得る。Ｂ’は、すぐ下に示される式（式３）を有する。
式３
【００７１】
【化５１】
式３の−（ＣＨ２）α’は、式２のＴに共有結合させられており、そして式３のＡ１４は式２のＬ３に共有結合させられている。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、およびＡ１４はそれぞれ独立して、式１のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０のそれぞれに関して先に記載されたような、中性、または実質的に中性の核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている中性の分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり得る。（ＣＨ２）メチレン単位の下つき文字、すなわち、α’、β’、γ’、およびδ’は同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、関連するメチレン単位の大きさを示しており、そして０、または１から約２０までの整数である。式３の括弧つきの部分に伴う下つき文字、すなわち、ａ’、ｂ’、およびｃ’は同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、関連する括弧つきの部分の大きさを示しており、そして、０、または１から約２０までの整数である。
【００７２】
式２においては、Ｌ３は独立して、式１のＬ構成成分のそれぞれに関して先に記載されたような、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基であり得る。得られる分子は、三量体核酸染色である。
【００７３】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、すぐ下に示される式（式４）に示されるように、分岐Ｂ’とリンカーＬ３を介して反応基Ｒｒに共有結合させられた分岐単位であり得る。
式４
【００７４】
【化５２】
式４においては、Ｔ、Ｂ’、およびＬ３は、Ｌ３がＲｒに共有結合させられていることを除き、式２および式３に関して上記に示されたものと同様に定義される。得られる分子は、上記の構造３によって示される核酸染色であり得る。
【００７５】
反応基−Ｒｒを有している色素は、適切な官能基を含むか、または適切な官能基を含むように誘導される任意の多種多様な分子を標識するために使用することができる。用語「反応基」は、「反応基」または「官能基」を意味するように使用することができ、そして、用語「官能基」は、「反応基」または「官能基」を意味するように使用することができることが理解される。いずれかの用語は、そしていずれの用語も、色素に対して結合を形成する基、または標識される基質分子上に結合を形成する基を意味する場合がある。ここでは、便宜上（限定ではないが）、色素に対して結合を形成する基が、一般的には、反応基と呼ばれ、そして、基質分子に対して結合を形成する基が、一般的には、官能基と呼ばれるであろう。単例ではあるが、反応基または官能基−Ｒｒを有している色素は、１つまでの正電荷を有し得る。
【００７６】
一般的には、基質分子に対する色素の結合は、結合した基質分子に対する色素の核酸検出特性を付与することができる。反応基および官能基は、通常は、それぞれ、求電子試薬および求核試薬であり、これらは共有結合を形成することができる。別の場合には、反応基は、紫外線での光活性化または光分解されると、炭化水素分子と反応することができる光活性させることができる基である。さらに別の場合は、反応基は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応によって結合したジエンと反応することができる求ジエンである。なおさらに別の場合は、反応基は、求ジエンと反応することができる１，３−ジエンである。なお他の反応基／官能基の対を、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ化学反応またはアジド基と末端アルキンとの間での反応（いわゆる、Ｃｌｉｃｋ化学反応）に基づいて選択することができる。単なる例ではあるが、有用な反応基、官能基、および対応する結合の例が、以下の表１に列挙される。
【００７７】
【表１】
＊活性化エステルは、当該分野で理解されているように、通常は、式−ＣＯΩを有する。式中、Ωは、良好な離脱基（例えば、スクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）、または−１−オキシベンゾトリアゾリル（−ＯＣ６Ｈ４Ｎ３））；あるいは、活性化アリールエステルを形成させるために使用されるアリールオキシ基、または電子吸引性の置換基（例えば、ニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、またはそれらの組み合わせ）によって１回以上置換されたアリールオキシ；あるいは、あるいは、無水物または混合無水物−ＯＣＯＲａもしくはＯＣＮＲａ−ＮＨＲｂ（式中、ＲａおよびＲｂは同じである場合も、また、異なる場合もあり、これらは独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６パーフルオロアルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり得る）を形成するようにカルボジイミドによって活性化させられたカルボン酸；あるいは、シクロヘキシル、３−ジメチルアミノプロピル、あるいはＮ−モルホリノエチルである。
＊＊アジ化アシルはまた、イソシアネートの位置を変えることもできる。
【００７８】
反応基は、アミン、チオール、またはアルデヒドと反応するであろうものである場合がある。反応基は、アミノ反応基（例えば、スクシンイミジルエステル）、またはチオール反応基（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド、もしくはメタンチオ−スルホネート（ＭＴＳ））、またはアルデヒド反応基（例えば、アミン、アミノオキシ、もしくはヒドラジド）であり得る。
【００７９】
反応性色素は、任意の多種多様な基質分子に結合させることができる。例えば、適切な基質は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、固体表面（例えば、シリコンウェハーの表面、ポリプロピレン基質もしくは容器の表面など）の分子であり得る。標識される分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または核酸と相互作用することができる分子であり得る。例えば、ＤＮＡ結合色素は、ｑＰＣＲの用途のためのオリゴヌクレオチドをベースとするプローブを標識するために使用されている。Ｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４９９２−７（１９９６）。
【００８０】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は同じである場合も、また異なる場合もあり、これらは独立して、高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分；および、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基から選択されるＮＡＢＥＧであり得る。高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分の例としては、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている部分が挙げられるが、これらに限定はされない。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＢＲＩＤＧＥに多くても１つの正電荷が含まれるか、またはＢＲＩＤＧＥが実質的に中性であるようなものであり得る。後者の場合には、これらの構成要素はそれぞれ、それ自体が実質的に中性（実際に中性を含む）であり得る。
【００８１】
ＢＲＩＤＧＥには、先に記載されたように、任意の適切な数の水素以外の原子（例えば、約１０個から約１００個までの水素以外の原子、または例えば、二量体色素については、約１２個から約６０個までの水素以外の原子、そして、三量体色素については、約２０個から約１００個までの水素以外の原子）が含まれ得る。例えば、ＢＲＩＤＧＥには、二量体色素については、約１５個から約４０個の水素以外の原子が含まれ得、そして三量体色素については、約３０個から約７０個までの水素以外の原子が含まれ得る。
【００８２】
単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥは、すぐ下に示される式（式５）を有し得る。
式５
【００８３】
【化５３】
１つのこのような場合においては、例えば、ＢＲＩＤＧＥのＬ１は−（ＣＨ２）Ｘ−であり、そしてＢＲＩＤＧＥのＬ２は−（ＣＨ２）Ｘ−である。式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；ＢＲＩＤＧＥのＡ１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり；ＢＲＩＤＧＥのａは１であり、ＢＲＩＤＧＥのＡ２は−Ｏ−であり；ＢＲＩＤＧＥのＡ３は−Ｏ−であり；αは、２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり得；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり得；ｂは０または２から約２０までから選択される整数であり得；そしてｃは０または１であり得；ＢＲＩＤＧＥのｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ０であり、そしてＢＲＩＤＧＥのＡ１０は−ＮＨ（Ｏ＝Ｃ）Ｃ−である。単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥは、記載されたようなものであり得、式中、ｃは１である。さらに、単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥは、記載されたようなものであり得、式中、ｃは１であり、さらに、ｘは５であり得；αおよびγは同じであり得、そして２または３であり得；βは２であり得；そしてｂは０、１、２、または３であり得る。
【００８４】
単量体色素
二量体色素および三量体色素に使用される構成成分である単量体色素または機能性分子Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３のそれぞれは、別々に、以下から選択することができる：１）蛍光核酸色素；２）非蛍光核酸結合分子；３）蛍光非核酸色素；および４）非蛍光非核酸色素。一般的には、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３は、ＤＮＡが存在しない条件での分子内二量体の形成、ならびにＤＮＡに結合した場合の高度に蛍光を発するＤＮＡ−色素錯体の形成を促進または確実にする様式で選択され、そして、ＢＲＩＤＧＥを介して共有結合させられ得る。分子内二量体の形成は、先に記載されたように、二量体色素の有用なヘアピン立体構造を提供するために十分であり得る。このような二量体色素は望ましい特性（例えば、低いバックグラウンドの蛍光と低いＰＣＲの阻害）を有している場合がある。先に記載されたように、本明細書中に記載される二量体色素を比較的高濃度で使用して、望ましいまたは強い蛍光シグナルを生じさせることが可能である。
【００８５】
分子内二量体の形成は、水溶液中の二量体色素および三量体色素の吸収スペクトルを、これもまた水溶液中の関連する単量体色素の吸収スペクトルと比較することによって確認することができる。任意の分子内二量体形成色素は、関連する単量体色素のスペクトルと比較すると、二量体または三量体中の構成成分である単量体色素のスペクトルが有意にシフトすることを生じるはずである。これに関して、有意なシフトは、例えば、約１０ｎｍまたはそれ以上であり得る。例えば、図２においては、ＡＯＡＯ−７に付随するスペクトルは、ＤＭＡＯのスペクトルと比較すると有意にシフトする。
【００８６】
分子内二量体形成がＨ−二量体形成である場合には、スペクトルは、通常、有意な青色のシフトを受ける。これに関して、有意なシフトは、例えば、約１０ｎｍまたはそれ以上であり得る。他のタイプの分子内二量体の形成もまた可能であり、これによっては、別の方向でのスペクトルのシフト、構成成分である単量体色素のそれぞれについて異なる方向でのスペクトルのシフト、有意ではないスペクトルのシフトが生じる場合も、また、スペクトルのシフトが生じない場合もある。これに関して、有意ではないシフトは、例えば、約５ｎｍまたはそれ未満であり得る。一般的には有意なスペクトルのシフトが観察されない場合には、他の分析技術を、任意の分子内二量体の形成を確認するために使用することができる。このような分析技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル分析、赤外線スペクトル分析、および蛍光スペクトル分析が挙げられるが、これらに限定はされない。任意の分子内色素の凝集（これは、ヘアピン構造を生じる）が一般的には望ましい。
【００８７】
Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３の様々な組み合わせが有用であり得る場合も、また望ましい場合もある。単なる例ではあるが、二量体色素は、図１０に模式的に示されるように、Ｑ１とＱ２の５種類の様々な組み合わせによって構築することができる。さらなる例として、調製される色素と関連する中間体の例が、以下の表２に列挙される。
【００８８】
【表２−１】
【００８９】
【表２−２】
【００９０】
【表２−３】
【００９１】
【表２−４】
【００９２】
【表２−５】
表２に示された多くの構造は１つ以上のヨウ素陰イオン、任意の他の適切な陰イオン（例えば、本明細書中に記載されるもの）（例えば、単なる例ではあるが、塩化物陰イオン）を、示されるヨウ化物陰イオンの代わりに使用することができることを示している。
【００９３】
本発明の二量体色素には、蛍光核酸色素Ｑ１と蛍光核酸色素Ｑ２が含まれる場合がある。式中、Ｑ１およびＱ２は同じである場合も、また異なる場合もある。Ｑ１とＱ２が同じである場合には、得られる色素はホモ二量体（例えば、単なる例ではあるが、表２の色素番号６〜２２、２４〜２６、および２８〜３６のいずれか）である。Ｑ１とＱ２が、同様の吸収スペクトルおよび放射スペクトルを有している異なる蛍光核酸色素である場合には、得られる二量体はヘテロ二量体であり、例えば、単なる例ではあるが、表２の色素番号２３である。このようなヘテロ二量体は、ホモ二量体と機能的に類似している。いずれの場合にも、Ｑ１とＱ２はいずれもレポーター色素であり、結果として、ＤＮＡに結合すると、図１０の組み合わせＡに模式的に示されるように、これらはいずれも検出される蛍光シグナルに寄与する。あるいは、ヘテロ二量体色素には、実質的には異なる吸収スペクトルおよび放射スペクトルを有している２つの異なる蛍光核酸色素が含まれ得る。この場合、２つの色素の一方だけが、レポーター色素として選択される。
【００９４】
Ｑ１およびＱ２は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対を形成する場合がある。この場合は、より短い波長を有している色素が蛍光ドナー色素として作用し、一方、より長い波長を有している色素は、アクセプター色素もしくはレポーター色素として作用する。十分なＦＲＥＴを生じさせるためには、ドナー色素の放射スペクトルと吸収スペクトルは十分に重複している必要がある。ＦＲＥＴについてのさらなる議論は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．（１９４８）；およびＳｔｒｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６７）に提供されている。ＦＲＥＴをベースとする色素により、１つの波長での励起と、実質的にはそれよりも長い波長での蛍光の再放射が可能となる。
【００９５】
実質的にはスペクトルが異なるＱ１およびＱ２が含まれているヘテロ二量体がＦＲＥＴをベースとする色素ではない場合には、Ｑ１とＱ２のいずれか一方（同時に両方がそうであることはない）がレポーター色素として選択され得る。他のレポーターではない色素は、必要な分子内二量体の形成のためのパートナーとして作用し、そして二量体色素についてのさらなる核酸結合能力を提供する。１つのレポーター色素、蛍光核酸色素Ｑ１、および１つの非レポーター色素、非蛍光核酸結合分子Ｑ２を有しているヘテロ二量体色素の一例が、図１０の組み合わせＢに模式的に示される。
【００９６】
ヘテロ二量体色素には、非蛍光核酸結合分子Ｑ１と、蛍光非核酸色素Ｑ２が含まれ得る。ここでは、Ｑ２はレポーター色素であり、一方、Ｑ１はＤＮＡアンカー色素として、および必要な分子内二量体の形成のための対合パートナーとして作用する。このタイプのヘテロ二量体についてのＤＮＡ結合様式は、図１０の組み合わせＣに模式的に示される。
【００９７】
ヘテロ二量体色素には、蛍光核酸結合分子Ｑ１と、非蛍光非核酸色素Ｑ２が含まれ得る。このような場合は、Ｑ１はレポーター色素であり、そしてＱ２は、必要な分子内二量体の形成のための対合パートナーとして作用する。このタイプのヘテロ二量体についてのＤＮＡ結合様式は、図１０の組み合わせＤに模式的に示される。
【００９８】
ヘテロ二量体色素には、蛍光核酸結合分子Ｑ１と、蛍光非核酸色素Ｑ２が含まれ得る。Ｑ１とＱ２が類似する吸収スペクトルおよび放射スペクトルを有している場合には、Ｑ１およびＱ２の両方がレポーター色素であるが、Ｑ１だけが核酸に結合する。このタイプのヘテロ二量体についてのＤＮＡ結合様式は、図１０の組み合わせＥに模式的に示される。Ｑ１とＱ２がＦＲＥＴ対を形成する場合には、より短い波長を有している色素が蛍光ドナー色素として作用し、一方、より長い波長を有している色素は、アクセプターまたはレポーター色素として作用する。Ｑ１とＱ２のスペクトルが実質的に異なり、ＦＲＥＴ対ではない場合には、Ｑ１およびＱ２のいずれか一方（同時に両方がそうであることはない）がレポーター色素として選択され得る。この後者の場合の一例は、ヘテロ二量体ＡＯＲＯ−７（表２の色素番号２７）であり、図１２および１３に示されるように、これには、５０３ｎｍと５２３ｎｍ（ＤＮＡ）にそれぞれ吸収ピークと放射ピークを有しているＡＯと、６００ｎｍと約６２０ｎｍにそれぞれ吸収ピークと放射ピークを有しているロサミン色素が含まれている。図１４には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によるｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上でチャンネル番号３を使用することにより、レポーター色素として選択された蛍光非核酸ロサミン色素構成成分を用いた、ＡＯＲＯ−７を使用するＰＣＲ増幅プロットが示される。
【００９９】
二量体色素には、２つの同じ蛍光核酸色素、および２つの異なる蛍光核酸色素から選択される、単量体色素の対が含まれ得る。
【０１００】
三量体色素には、蛍光核酸色素Ｑ１、蛍光核酸色素Ｑ２、蛍光核酸色素Ｑ３が含まれ得る。この場合、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３は同じである場合も、また異なる場合もある。例えば、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３は、同じ蛍光核酸色素であり得る。三量体色素には、蛍光核酸色素Ｑ１、蛍光核酸色素Ｑ２、蛍光非核酸色素Ｑ３が含まれ得る。この場合、Ｑ１とＱ２は、ＤＮＡアンカー分子として作用し、そしてＱ３はレポーター色素である。本発明の三量体色素には、非蛍光核酸結合分子Ｑ１、非蛍光核酸結合分子Ｑ２、および第３の蛍光非核酸色素Ｑ３が含まれ得る。この場合、Ｑ１とＱ２は、ＤＮＡアンカー分子として作用し、そしてＱ３はレポーター色素として作用する。
【０１０１】
蛍光核酸色素、非蛍光核酸結合分子、蛍光非核酸色素、非蛍光非核酸色素、およびその例は、以下でさらに記載される。
【０１０２】
蛍光核酸色素
色素を構築するために適している単量体蛍光核酸色素の例としては、アクリジン色素、非対称シアニンをベースとする核酸染色、フェナントリジニウム色素、対照シアニン核酸染色、ＤＡＰＩの誘導体、およびＨｏｅｃｈｓｔ色素の誘導体が挙げられるが、これらに限定はされない。ＤＡＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ色素は、一般的には、これらは結合の形成のための反応基を有していないとの理由から、ＢＲＩＤＧＥに直接結合させることができない。この状況では、誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）は、塩基色素（例えば、ＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ色素）を意味し、これは、例えば、反応基の付加によって、結合の形成に十分であるように修飾される。
【０１０３】
アクリジン色素
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造４）を有しているアクリジン色素であり得る。
構造４
【０１０４】
【化５４】
アクリジンオレンジ（ＡＯ）は、緑色の蛍光でｄｓＤＮＡを染色し、赤色の蛍光でＲＮＡを染色するアクリジン色素である。Ｔｒａｇａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２５（１），４６（１９７７）。いくつかの他のアクリジン色素とは異なり、ＡＯは高い消散係数（＞５０，０００）と、長い吸収波長（λａｂｓ＝５００ｎｍ（ＤＮＡ結合））を有している。しかし、核酸に対するＡＯの親和性は非常に低く、色素は核酸が存在しない条件では、有意な内部蛍光を有する。これに関して、内部蛍光のレベルは、これが、色素が、低いレベル（例えば、低いナノグラム／ｍＬの範囲）で核酸を検出すること、または、脱染色工程を伴うことなくゲル中の核酸の検出することにおいて使用されることを妨げる点で有意であり得る。結果として、ＡＯ自体は、ＤＮＡまたはＲＮＡの定量に、特に、リアルタイムｑＰＣＲのような用途に付随する高感度のＤＮＡの検出にはほとんど有用性はない。
【０１０５】
アクリジン色素は、環構造上の様々な位置に任意の様々な置換基を含む場合がある。置換基の性質とその置換位置は、生じる色素のスペクトル特性に強く影響を与え得る。一般的には、３位および６位の電子供与置換基と、９位の電子吸引性置換基は、通常、色素の吸収スペクトルと放射スペクトルを赤色にシフトさせる。典型的な電子供与基の例としては、アミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびアルキルメルカプト基が挙げられるが、これらに限定はされない。典型的な電子吸引基の例としては、シアノ基、パーフルオロアルキル基、カルボキサミド基、スルホンアミド基、ニトロ基、およびハロゲン基が挙げられるが、これらに限定はされない。コア構造と縮合させられた任意のさらなる環構造もまた、生じる色素の波長を長くするであろう。
【０１０６】
構造４の様々な部分がここで記載される。構造４においては、本明細書中に提供されるかまたは記載される種々の他の単量体色素構造に見られるように、下付き文字が後に続く「Ｒ」の記号（例えば、Ｒ１）は、単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥの一部ではない構造の置換基を示す場合も、また、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。この場合は、これは構造の置換基ではない。蛍光の放射、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ４；−ＳＲ５；−ＮＲ６Ｒ７；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ８；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ９；または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０であり得る；任意の隣接するＲ１の対は、状況に応じて、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し、これにはさらに状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる；そして、Ｒ１の１つは、先に記載されたように−Ｌ−Ｒｒであるか、またはＲ１の１つは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。この場合、Ｒ１は単なる例であり、実際には、単量体色素の置換基ではない。Ｒ１に、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、および、Ｒ１０の少なくとも１つが含まれている任意の場合においては、それらのうちの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈまたは１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルであり、任意の適用可能な隣接しているＲ６とＲ７の対については、Ｒ６とＲ７は独立して、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。
【０１０７】
通常、Ｒ２は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール；ハロゲン；−ＯＲ１１；ＳＲ１２；−ＮＨＲ１３；−ＣＮ；または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。Ｒ２にＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の少なくとも１つが含まれている任意の場合においては、これらの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈ、または１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルである。
【０１０８】
通常、Ｒ３は、Ｈ；または１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。
【０１０９】
Ψは陰イオンであり、例えば、色素と会合している正電荷を平衡化させる陰イオンである。Ψは生物学的に適合するものであり得る。適切な陰イオンの例としては、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、およびヘキサフルオロリン酸塩が挙げられるが、これらに限定はされない。単なる例ではあるが、陰イオンは塩化物またはヨウ化物であり得る。
【０１１０】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さなければならない。単なる例ではあるが、Ｒ２およびＲ３の一方が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。本明細書中に記載されるように、ＢＲＩＤＧＥは、単量体アクリジン色素、例えば、本明細書中に記載される任意のそのような色素に、および、別の適切な単量体色素に共有結合させて、二量体色素を形成させることができるか、または、２つの他の適切な単量体色素に結合させて三量体色素を形成させることができる。一般的には、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の１つだけが、先に記載されたように、状況に応じて、−Ｌ−Ｒｒであり得る。二量体色素または三量体色素には、−Ｌ−Ｒｒが１つだけ含まれる場合がある。
【０１１１】
単なる例ではあるが、単量体アクリジン色素は、すぐ下に示される構造（構造５）を有し得る。
構造５
【０１１２】
【化５５】
構造５においては、一般的には、Ｒ１はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２アルキルであり、Ｒ２とＲ３の一方は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す；状況に応じて、Ｒ２とＲ３の一方は、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒであり得る；Ｒ２が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さず、そしてＬ−Ｒｒではない場合には、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＣＮ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２から選択される；Ｒ３が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さず、そしてＬ−Ｒｒではない場合には、Ｒ３は、Ｈまたは−ＣＨ３から選択され；Ｒ６とＲ７はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２アルキルであり；そして、Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。単なる例ではあるが、隣接しているＲ６またはＲ７とＲ１のそれぞれの対について、Ｒ６またはＲ７とＲ１は独立して、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。
【０１１３】
１つの例においては、構造５によって示されるような単量体アクリジン色素は、Ｒ１がそれぞれＨであり；Ｒ２がＨであり；Ｒ３が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し；Ｒ６がそれぞれ−ＣＨ３であり；Ｒ７がそれぞれ−ＣＨ３であり；そして、Ψが、先に記載されたように、陰イオンであるようなものであり得る。
【０１１４】
単なる例ではあるが、二量体色素には、同じ構造５の単量体アクリジン色素分子が２つと、式５のＢＲＩＤＧＥを含まれる場合がある。
【０１１５】
非対称シアニン色素
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造６）を有している非対称シアニン色素であり得る。
構造６
【０１１６】
【化５６】
非対称シアニン色素の一般的構造（構造６ 上記）には、置換されたベンザゾリウム環である複素環；メタンまたはポリメチン架橋；および、置換されたピリジニウムまたはキノリニウム環である複素環が含まれる。構造の中の点線は、１つ以上の縮合された芳香族環を形成するために必要な原子を示し、これには、状況に応じて、四級化されている場合も、また四級化されていない場合もある１つ以上の窒素が組み込まれている。点線が１つ以上の窒素原子を含む６員環を示す場合は、生じる縮合環は、アザベンゾール環と呼ばれる。
【０１１７】
構造６においては、一般的に、ベンザゾリウム環上のＲ１およびＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５である。単なる例ではあるが、Ｒ１およびＲ１’の一方は、Ｘに対して、またはベンザゾール窒素に対してメタである置換基であり得る。この場合、置換基によって、以下にさらに記載されるような、少なくとも１つの所望される特性が付与される。Ｒ１またはＲ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている任意の場合においては、それらのうちの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈ；または１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキルであり、これには、状況に応じて１個から１２個の窒素が組み込まれている；または、アリールであり；そして、任意の適用可能なＲ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し得、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。
【０１１８】
上記のように、構造６のＲ１およびＲ１’の一方は色素に対して少なくとも１つの望ましい特性を付与する置換基であり得る。１つの好ましい所望される特性は、ＤＮＡ小溝結合である。小溝結合分子は、通常、二本鎖ＤＮＡの小溝に適合する三日月形の形状の構造を有している。自然界に存在している分子が含まれる場合があるＤＮＡ小溝結合色素分子または非色素分子の例としては、ＤＡＰＩ，Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ジスタマイシンＡ、ネトロプシン、ならびに、Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールのポリアミドをベースとする多数の合成の小溝結合剤の任意のものが挙げられるが、これらに限定はされない。Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．のカタログ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＣＡ）），２００５−２００６；Ｂｏｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３７，６１（２００４）；およびＤｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，２２１５（２００１）。小溝結合剤の三日月形の形状は、通常、５員環または６員環の、小溝結合剤置換基でのメタ置換によって作成される。小溝結合剤置換基としては、置換されたまたは未置換のベンゾキサゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のベンズイミダゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のベンゾチアゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のイミダゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のオキサゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のチアゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のＮ−メチルピロリル−２−アミノカルボニル、置換されたまたは未置換のＮ−メチルピロリル−３−カルボキサミド、置換されたまたは未置換の１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、置換されたまたは未置換の１−メチルイミダゾール−４−アミノカルボニル、置換されたまたは未置換のフェニル、置換されたまたは未置換のピリジル、置換されたまたは未置換のピラジニル、ならびに、置換されたまたは未置換のトリアジニルが挙げられるが、これらに限定はされない。ＤＮＡ色素は、米国特許出願公開番号２００４／０１３２０４６に記載されているような小溝結合剤置換基によってメタ置換される場合がある。
【０１１９】
Ｒ１およびＲ１’の一方は、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒであり得る。Ｒ１およびＲ１’の一方は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。
【０１２０】
Ｘは、ＯおよびＳから選択される。一般に、ＸがＳである色素は、ＸがＯである類似する色素よりも長い吸収波長および放射波長を有する。
【０１２１】
Ｒ２は、メチルまたはエチルであり得るか、あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。単なる例ではあるが、Ｒ２はメチルまたはエチルであり得る。
【０１２２】
下付き文字ｎは、任意のメチン架橋における二重結合単位の数を示し、これは０、１、および２から選択される。通常、より長いメチン架橋を有している色素は、より短いメチン架橋を有している色素よりも長い波長を有するであろう。単なる例ではあるが、ｎは０または１であり得る。
【０１２３】
置換基Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、Ｈまたは−ＣＨ３である。状況に応じて、これらの置換基の任意の隣接している対は、５員環または６員環を形成する場合がある。単なる例ではあるが、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はＨであり得る。
【０１２４】
一般的に、置換基Ｒ６、Ｒ８、およびＲ８’はそれぞれ独立して、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリールであり得る。Ｒ８およびＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成する場合がある。これは、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルメルカプト、またはハロゲンで、別々にさらに１回から４回置換される場合もある。Ｒ６、Ｒ８、およびＲ８’のいずれかにＲ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意の場合には、これらのうちの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈ；または状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキルであり；そして、任意の適用可能なＲ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。
【０１２５】
Ｒ６は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。Ｒ６は、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒである場合がある。
【０１２６】
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒから選択されるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。
【０１２７】
Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１２８】
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さなければならない。本明細書中に記載されるように、ＢＲＩＤＧＥは、単量体の非対称シアニン色素、および別の適切な単量体色素に共有結合させ、二量体色素を形成させることができるか、あるいは、単量体の非対称シアニン色素と２つの他の適切な単量体色素に共有結合させ、三量体色素を形成させることもできる。一般的には、先に記載されたように、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、状況に応じて−Ｌ−Ｒｒであり得る。より通常は、二量体色素または三量体色素には、−Ｌ−Ｒｒが１つだけ含まれ得る。
【０１２９】
単なる例ではあるが、非対称シアニン色素は、すぐ下に示される構造（構造７）を有し得る。この場合、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ８’はそれぞれ、構造６に関して先に記載されているとおりである。
構造７
【０１３０】
【化５７】
例として、構造７に示されるように、非対称シアニン色素は、Ｒ１’が、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；小溝結合剤と結合した置換基；または、先に記載されたような−Ｌ−Ｒｒであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示すようなものであり得る。さらに、Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている任意の場合には、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ；または、状況に応じて１個から２個の窒素またはアリールが組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキル；または、アリールであり；そして、Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し得、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。Ｘは、ＯおよびＳから選択され得、そしてｎは、０、１、および２から選択され得る。Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒであり得るか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；あるいは、先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒであり得るか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒであり得るか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素まで（１、１０を含む）を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリールであり得る。Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成する場合がある。これは、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルメルカプト、またはハロゲンで、別々にさらに１回から４回置換される場合もある。Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、Ｒ１６およびＲ１７の任意のものが、独立して、Ｈ；または状況に応じて１個から２個の窒素もしくはアリールが組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキルであり得る。Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、そのＲ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。一般的には、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、状況に応じて、上記に記載されたような−Ｌ−Ｒｒであり得る。Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１３１】
１つの例においては、非対称シアニン色素は、すぐ下に示される構造（構造８）を有する。この場合、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示しており、そしてΨは、先に記載されたように、陰イオンである。
構造８
【０１３２】
【化５８】
単なる例ではあるが、二量体色素には、同じ構造８の単量体非対称シアニン色素が２つと、式５のＢＲＩＤＧＥが含まれる場合がある。
【０１３３】
単なる例ではあるが、例えば、構造１のような蛍光核酸色素においては、Ｑ１色素構成成分が非対称シアニン色素（例えば、構造６〜８のいずれか）であり、Ｑ２色素構成成分が非対称シアニン色素（例えば、構造６〜８のいずれか）である場合には、ＢＲＩＤＧＥ（例えば、式１のＢＲＩＤＧＥ）のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉの合計は、３よりも大きい数である場合があり、また、ＢＲＩＤＧＥ（例えば、式１のＢＲＩＤＧＥ）のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の少なくとも１つが、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、またはチオ尿素結合が含まれている少なくとも１つの連結結合を含む部分を含むＮＡＢＥＧ；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ元素が含まれているアリールでありえる場合もある。
【０１３４】
フェナントリジニウム色素
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造９）を有している、フェナントリジニウム誘導体であり得る。
構造９
【０１３５】
【化５９】
一般的には、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し得る。しかし、様々な技術（例えば、別の方法で構造に対するＢＲＩＤＧＥの結合を提供することができる合成技術または、任意の様々な所望される波長を有している色素を提供するように構造を修飾することができる合成技術）によって、上記構造９の多くのバリエーションが可能であり、本明細書中で意図されることが理解されるであろう。Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１３６】
単なる例ではあるが、式５のＢＲＩＤＧＥと組み合わせられた構造９の２つの単量体フェナントリニジウム色素分子は、二量体色素を形成することができる。
【０１３７】
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造１０）を有しているキサンテン誘導体であり得る。
構造１０
【０１３８】
【化６０】
特定の正電荷を有している（ｃａｔｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）キサンテンは、核酸に結合することが公知である。例えば、ピロニンＹ（この場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’はメチルであり、そしてＲ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’およびＡはＨである）は、ＤＮＡゲル染色に使用されている公知の蛍光ＤＮＡ結合色素である。Ａｄｋｉｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０（１），１７（１９９６）。上記構造１０に示される一般的な骨格を有している色素は、類似する核酸染色特性を有していること、そして他の蛍光色を提供することが予想される。例えば、ピロニンＹは、５４８ｎｍに最大吸収を、そして５６５ｎｍに最大放射を有しており、赤色の蛍光色を提供する。
【０１３９】
単なる例ではあるが、一般的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’はそれぞれ独立して、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ６（Ｃ１、Ｃ６を含む）、アルキルであり得、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される１個または２個のヘテロ原子が組み込まれている。さらに、単なる例ではあるが、無関係に、Ｒ１とＲ２の対、およびＲ１’とＲ２’の対の少なくとも一方は、一緒に、５員環または６員環を形成する場合があり、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される１つのヘテロ原子が含まれる。Ｒ１とＲ１’は同じである場合があり、そしてＲ２とＲ２’も同じである場合がある。
【０１４０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’の１つは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。状況によっては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’の１つは、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒである。
【０１４１】
単なる例ではあるが、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、およびＲ４’は、独立して、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ３（Ｃ１、Ｃ３を含む）、アルキルであり得る。Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、およびＲ４’は、同じである場合がある。無関係に、Ｒ３とＲ１の対、Ｒ２とＲ４の対、Ｒ３’とＲ１’の対、およびＲ４とＲ２’の対の少なくとも１つは、一緒に、５員環または６員環を形成する場合がある。これは、飽和である場合も、また不飽和である場合も、置換されている場合も、また未置換である場合もある。
【０１４２】
Ａは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル；または−Ｌ−Ｒｒであり、この場合、Ｌは、Ｃ１〜Ｃ１２脂肪族リンカーであり、そしてＲｒは、先に記載されたような反応基であるか；または、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。
【０１４３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’、およびＡの１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。
【０１４４】
Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１４５】
式５のＢＲＩＤＧＥと組み合わせられた構造１０の２つの単量体キサンテン色素分子は、二量体色素を形成することができる。
【０１４６】
他の単量体蛍光核酸染色（単なる例ではあるが、例えば、ＤＡＰＩ、ＤＩＰＩ，Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＬＤＳ７５１、ヒドロキシスチルバミジン、スチリル色素、メロシアニン色素、シアニン色素、またはＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）は、使用に適しているか、または、本明細書中に記載されるように使用に適するように誘導することができる。Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版。多数の他の単量体核酸色素が使用に適しているか、または、本明細書中に記載されるような使用に適するように誘導することができることが理解されるであろう。色素は、ＢＲＩＤＧＥに直接結合させることができるか、または、合成の知識を使用してそれらをＢＲＩＤＧＥに結合させることができるように誘導することができるかのいずれかである。
【０１４７】
非蛍光核酸色素
一般的には、非蛍光核酸結合分子は、蛍光を発しないか、または蛍光核酸色素として有用であるには弱すぎる蛍光を発する、核酸結合分子である。非蛍光核酸結合分子には、非蛍光核酸結合色素、および無色の合成もしくは天然の核酸結合分子が含まれる。
【０１４８】
多数の非蛍光色素が、比色核酸ゲル染色として使用されている。蛍光核酸染色であるエチジウムブロマイドと比較すると、これらの非蛍光色素は、通常は、はるかに低い検出感度を有しているが、例えば、ヒトに使用する際の毒性に関しては安全であるように、使用は安全であると考えられる。非蛍光核酸結合色素の例としては、ナイルブルー（Ｎｉｌｅ Ｂｌｅｕ）、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ）、チオニン（Ｔｈｉｏｎｉｎ）、メチルグリーン（Ｍｅｔｈｙｌ Ｇｒｅｅｎ）、ベーシックブルー６６（Ｂａｓｉｃ Ｂｌｕｅ ６６）、ベーシックレッド２９（Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ ２９）、インドリンブルー（Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ）、サフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ Ｇｒｅｅｎ Ｂ）、ピナシアノール（Ｐｉｎａｃｙａｎｏｌ）、およびＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌが挙げられるが、これらに限定はされない。Ａｄｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０，１７（１９９６）。これらの色素のほとんどは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から市販されている。
【０１４９】
蛍光非核酸色素
単量体色素Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３の１つは、蛍光非核酸色素であり得る。一般的に、通常は蛍光核酸色素とは考えられない全ての蛍光色素は、蛍光非核酸色素と考えられる。本明細書中では、用語「蛍光非核酸色素」は、一般的には、通常は核酸色素とは考えられない蛍光色素を意味する。例として、色素は、通常は、蛍光小溝結合剤または蛍光挿入剤とは考えることはできない。さらなる例として、いくつかの蛍光非核酸色素は、核酸といくらかの弱い相互作用を示す場合があるが、これらの挿入剤は、一般的には、色素を核酸の検出に有用とするための有意な蛍光スペクトルの変化を引き起こすには十分ではない。
【０１５０】
様々な蛍光非核酸色素が、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ，（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）のような様々な供給業者から市販されている。蛍光非核酸色素の例としては、フルオレセイン色素、スルホン酸化フルオレセイン色素、ローダミン色素、スルホン酸化ローダミン色素、シアニン色素、スルホン酸化シアニン色素、クマリン色素、ピレン色素、オキサジン色素、およびＢｏｄｉｐｙ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））が挙げられるが、これらに限定はされない。適切な蛍光非核酸色素には、先に記載されたような、反応基Ｒｒが含まれ得る。適切な蛍光非核酸色素は、これに反応基Ｒｒが含まれるように誘導することができる。適切な反応性色素は、ＲｒとＢＲＩＤＧＥに由来する適切な官能基を介してＢＲＩＤＧＥに共有結合させられる。
【０１５１】
適切な蛍光非核酸色素の選択は、他の対合する単量体色素に応じて様々であり得る。一般的には、適切な蛍光非核酸色素は、対合する色素と分子内二量体を形成することができなければならない。分子内二量体の形成は、通常は、単量体色素がＢＲＩＤＧＥにより他の対合する単量体色素に共有結合させられる前と後の、水性媒体の中の構成成分である単量体色素の少なくとも１つの吸収スペクトルの有意な変化によって確認される。
【０１５２】
非蛍光非核酸色素
一般的には、用語「非蛍光非核酸色素」は、蛍光を発することがなく、また、核酸に結合することもない色素を意味する。このような色素は、一般的には、ＦＲＥＴをベースとする用途において蛍光消光剤として使用される。例として、蛍光性ペプチダーゼ基質は、蛍光ドナー色素をペプチドの一方の末端に共有結合させ、そして、非蛍光非核酸色素である消光剤を、ドナーの蛍光を消光させるためにペプチドの他方の末端に共有結合させることによって構築されている。ペプチドが酵素によって切断されると、ドナーと消光剤は分離され、それによって、蛍光シグナルが放出される。さらなる例として、非蛍光非核酸色素は、ｑＰＣＲのための、いわゆる、ＴａｑＭａｎプローブを設計するために使用されている。ＴａｑＭａｎプローブは、標的ＤＮＡ配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの一方の末端に結合させられた蛍光ドナー色素、およびドナー色素の蛍光を消光させるためのオリゴヌクレオチドの他方の末端に共有結合させられた消光剤から構成される。リアルタイムＰＣＲの間に、標識されたオリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡに結合し、これは、オリゴヌクレオチドの酵素による切断を引き起こし、それにより蛍光シグナルが生じる。
【０１５３】
非蛍光非核酸色素は、リリースオンデマンドＤＮＡ結合機構を担っている分子内二量体の形成のための対合パートナーとして主に使用され得る。非蛍光非核酸色素は、非蛍光非核酸色素と、それがその後のＤＮＡ結合において対合する蛍光核酸色素との間でのＦＲＥＴを最少にすることを確実にするように選択されるべきである。一般的には、ＦＲＥＴが原因である蛍光核酸色素の蛍光の消失は最少でなければならず、例えば、放射される蛍光全体の約７０％を超えてはならない。非蛍光非核酸色素の選択は、蛍光核酸結合色素の放射スペクトルと非蛍光色素の吸収スペクトルの評価に基づいて行うことができる。理想的には、上記のように、ＦＲＥＴが原因で生じる蛍光シグナルの消失を最少とするためには、これらのスペクトルは最小限にしか重複していないべきである。ＦＲＥＴを最少にする別の可能な方法は、十分に長いＢＲＩＤＧＥを使用することであり、その結果、上記のように、ＦＲＥＴが原因で生じる蛍光シグナルの消失は最少となる。なぜなら、ＦＲＥＴの効率は、構成成分である色素の間での分子間分離の逆方向の第６の力（ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｉｘｔｈ ｐｏｗｅｒ）に依存するからである。
【０１５４】
有用であり得る市販されている非蛍光消光剤の例としては、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＤＡＢＣＹＬ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）によるＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）によるＥｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＤＱ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によるＩＯＷＡ Ｂｌａｃｋ（ＩＷＢ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によるＱＳＹが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５５】
使用方法
本明細書中に記載される核酸色素は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に特に有用であり得る。蛍光核酸色素を介した蛍光をベースとするＤＮＡ検出と組み合わせてＰＣＲを使用することにより、当業者は、ＰＣＲの実行を停止させることなく、またはＰＣＲの実行の間に反応物をサンプリングすることなく、ＰＣＲプロセスの産物の量を決定することができる。ｑＰＣＲを使用することにより、当業者は、ＤＮＡ試料のもとの量を定量することができるだけではなく、配列情報をもまた得ることができる。ｑＰＣＲの感度および特異性により、これは、疾患の診断および予後診断、ならびに、農業および法医学における種の特定を含む、多数の実用において非常に有用となる。
【０１５６】
ｑＰＣＲにおける色素の使用には、ＰＣＲ反応に適している色素の溶液および他の構成成分（例えば、増幅酵素、標的核酸配列の増幅に十分なプライマー、およびデオキシヌクレオシド３リン酸）を試験管中のＤＮＡ試料を含む溶液に添加する工程、ｑＰＣＲ機器の中にシールされた試験管を置く工程、および検出された蛍光シグナルを記録する工程が含まれ得る。Ｃｔ値、または蛍光シグナルが任意に決定された限界値に達するために必要なサイクル数が記録され得る。Ｃｔ値は、ＤＮＡ試料のコピー数の対数と直線的な関係にある。Ｃｔ値とＤＮＡコピー数の対数の標準的なプロットを使用することにより、当業者は、Ｃｔ値に基づいてＤＮＡ試料のＤＮＡコピー数を決定することができる。単なる例ではあるが、選択された色素を使用するＰＣＲ増幅プロットが、図８、９、１１、および１４に示される。
【０１５７】
蛍光核酸色素の他の使用には、溶液またはゲルの中でのＤＮＡの定量、肝細胞または死亡した細胞中の核酸の染色、および顕微鏡下での核酸の検出が挙げられるが、これらに限定はされない。一般的には、蛍光核酸色素の使用には、状況に応じて、任意の別の試薬と組み合わせられた色素を、核酸ポリマーを含むかもしくは核酸ポリマーが含まれていると考えられる試料と接触させる工程；色素−核酸錯体を形成させるために十分な時間の間、得られた色素と試料の混合物をインキュベートする工程；ならびに、色素−核酸錯体の蛍光シグナルを検出する工程が含まれ得る。
【０１５８】
色素は、本明細書中に記載されるように、適切な用途のために調製することができる。単なる例ではあるが、色素は、最終的な染色溶液中で使用されるよりも約１００倍高い濃度で、水性溶媒または水混和性の生物学的適合性の有機溶媒を使用して、ストック溶液にすることができる。単独で、または適切な有機溶媒と組み合わせて、色素ストック溶液を作成することにおいて使用することができる適切な水性溶媒の例としては、水、ＰＢＳ緩衝液、およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられるが、これらに限定はされない。色素ストック溶液を作成するための適切な有機溶媒の例としては、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、またはエタノールが挙げられるが、これらに限定はされない。その後、ストック溶液は適切な水性溶媒（例えば、水または生物学的緩衝液）を使用して、所望される最終的な色素濃度の染色溶液になるように希釈される。一般的には、染色溶液についての特異的な色素濃度は、分析される試料の性質、および行われる分析の性質によって決定することができる。例として、一般的には、細胞試料と組み合わせて使用される染色溶液は、約１ｎＭまたはそれ以上の色素濃度、あるいは、約１００μＭまでの色素濃度を有し得る。さらなる例として、一般的には、電気泳動用ゲルと組み合わせて使用される染色溶液は、約１μＭまたはそれ以上、あるいは、約５０μＭの色素濃度を有し得る。
【０１５９】
色素を使用して核酸を染色する方法は、行われる分析の性質によって決定することができる。細胞または組織試料中の核酸の染色においては、試料が予め固定されている場合も、また固定されていない場合もあり、試料は通常、数分間から２時間の間染色溶液の中でインキュベートされて、色素が細胞膜に浸透させられ、核酸と結合させられる。いくつかの場合は、核酸は、精製された核酸または粗細胞抽出物を含む溶液の形態で存在し得る。このような場合は、一般的には、色素ストック溶液の核酸溶液への添加によって、検出することができる蛍光シグナルが簡単に生じるはずであり、その強度は核酸の量に比例する。例として、ＤＮＡ滴定曲線が図７に示される。ＤＮＡの量と蛍光強度の間での実質的に直線的な関係を、ＤＮＡの定量に使用することができ、また、細胞抽出物が使用される場合は、細胞数の推定のために使用することができる。特定の例においては、核酸は、不活性なマトリックス（例えば、ブロット、またはゲル、試験細片）の中に包埋される場合も、また、固体表面（例えば、マイクロアレイチップもしくは任意の他の固体表面）に結合させられる場合もある。このような場合には、一般的には、染色は、核酸を含むマトリックスの表面に対して、または、マイクロアレイチップの表面、または他の固体表面に染色溶液を塗布すること、そして色素−核酸錯体を形成させるために十分な時間の間インキュベートすることによって行われる。
【０１６０】
蛍光核酸−色素錯体は、その放射または励起のいずれかによって検出することができる。例として、蛍光核酸−色素錯体は、錯体の最大吸収波長の、またはその付近の波長を有している光によって励起させることができ、そして、通常はそのような光によって励起させられる。さらなる例として、核酸−色素錯体は、３００ｎｍから４００ｎｍの波長を有しているＵＶ光によって励起させることができる。これは、ゲルの視覚化の用途に使用されるトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｔｏｒ）のほとんどについて利用することができる励起光の共通の光源である。例として、蛍光シグナルは、様々な機器（例えば、プレートリーダー、顕微鏡、蛍光光度計、量子カウンター、およびフローサイトメーター）によって検出することができる。さらなる例として、蛍光シグナルは、視覚的方法（例えば、目視検査または写真記録）によって作成することができる。
【０１６１】
合成
色素の合成は、単量体色素構成成分の合成、ＢＲＩＤＧＥの合成、および単量体色素構成成分のＢＲＩＤＧＥへの結合に関して記載され得る。単量体色素、および官能基または反応基を含む単量体色素の合成がここで記載される。
【０１６２】
単量体色素および機能性分子の合成
適切な単量体色素、および官能基または反応基を含む単量体色素は、公知の手順または任意の適切な手順によって傷をつける（ｓｃｒａｔｃｈ）ことによって、あるいは、適切なもしくは所望されるコア構造をすでに有している市販されている材料を修飾することによって、調製することができる。多くの単量体アクリジン色素を、市販されているアクリジン色素から調製することができる。合成のための適切な出発材料となり得る市販されているアクリジン色素のいくつかの例が、すぐ下に示される。
【０１６３】
【化６１】
他のアクリジンコア構造は、公知の手順または任意の適切な手順にしたがって調製することができる。Ａｌｂｅｒｔ，Ａ．，Ｔｈｅ ａｃｒｉｄｉｎｅｓ：ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃａｌ、ｃｈｅｍｉｃａｌ、ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ，Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｅｌｄｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９，４００７（１９９９）；およびＪｏｓｅｐｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５，１２３０（２００４）。アクリジンコア構造は、適切なジフェニルアミンを、適切なカルボン酸またはカルボン酸等価物と共に、ルイス酸の存在下で縮合させることによって、すぐ下の反応１に模式的に示されるように形成させることができる。
反応１
【０１６４】
【化６２】
反応１においては、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、以下にさらに記載されるような適切な置換基である。ジフェニルアミン出発材料は、市販されているものであるか、または適切なハロゲン化アリールと適切なアリールアミンから、公知の方法または任意の適切な方法を使用して合成することができる。Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．５７６，１２５（１９９９）；Ｈａｒｔｗｉｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５５７５（１９９９）；およびＷｏｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５，１１５８（２０００）。
【０１６５】
置換基の性質と、置換基が結合させられる位置によっては、色素のスペクトル特性に対して大きな効果がある場合がある。一般的には、２位、３位、６位、および７位の電子供与基は、色素の吸収波長および放射波長を長くするであろう。典型的な電子供与基は、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、チオール基、またはアルキルチオ基であり得る。より典型的な電子供与基は、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、またはアルコキシ基であり得る。一般的には、９位の電子吸引基は、色素の吸収波長および放射波長を長くするであろう。典型的な電子吸引基は、例えば、シアノ基、パーフルオロアルキル基、アミノカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、アルキルカルボニル基、アルデヒド基、アルコキシカルボニル基、アミノスルホナート基、アルキルアミノスルホナート基、またはハロゲン化物基であり得る。より典型的な電子吸引基は、シアノ基、パーフルオロアルキル基、またはハロゲン化物基であり得る。
【０１６６】
一般的には、一旦、アクリジンコア構造が構築されると、１０個の窒素が、ハロアルキル基でアルキル化され、これには通常、別の反応基、または反応基に転換させることができる官能基が含まれる。さらなる反応基は、ＢＲＩＤＧＥにアクリジン色素を結合させるように作用する。適切な反応基を用いて単量体アクリジン色素を作成するいくつかの方法が、すぐ下のスキーム１に模式的に示される。
スキーム１
【０１６７】
【化６３】
すぐ下のスキーム２に模式的に示されるように、１０−アルキル化アクリジンの９位は、シアノ基で容易に置換することができ、これはさらに、カルボキサミド基へと容易に加水分解することができる。
スキーム２
【０１６８】
【化６４】
反応性の単量体の非対称シアニン色素を調製する方法が記載されている。Ｃａｒｒｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（４），５１７（２００４）。このような色素は、すぐ下に示される構造（構造１１）を有し得る。
構造１１
【０１６９】
【化６５】
米国特許第５，８６３，７５３号には、反応性の非対称シアニン色素のシリーズの調製が開示されている。これには、キノリニウムまたはピリジニウム窒素に対してオルトに置換基を有しているものが含まれる。キノリニウムまたはピリジニウム窒素に対してオルトであるこのような置換基、特に、環状の置換基は、米国特許第５，４３６，１３４号に従うと、非対称シアニン色素に対して所望される特性を付与すると言われる。これらの環状構造で置換された非対称シアニン色素は、まとめて、ＳＹＢＲ色素と呼ばれる。Ｚｉｐｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（１２），ｅ１０３（２００４）。反応性ＳＹＢＲ色素のいくつかは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されているが、これらの色素の正確な構造はわかっていない。Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第９版。
【０１７０】
米国特許出願公開番号２００４／０１３２０４６には、小溝結合能力を有している単量体の非対称シアニン色素を調製するための方法が開示されている。一般的には、これらの色素は、色素のベンザゾリル環上にさらなるベンザゾリル置換基を有することにより、三日月型の構造を有する。適切な反応基を有している類似する単量体色素は、例えば、すぐ下のスキーム３に模式的に示されるように、同様の方法を使用して調製することができる。
スキーム３
【０１７１】
【化６６】
反応性フェナントリジニウム色素は、すぐ下のスキーム４に模式的に示されるように、市販されている３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンから調製することができる。
スキーム４
【０１７２】
【化６７】
単なる例ではあるが、表２の色素番号３５は、上記のスキーム４に示される反応基を有しているフェナントリジニウム中間体を使用して調製することができる。
【０１７３】
９位に反応基を有しているピロニン誘導体の調製は、すぐ下のスキーム５に模式的に示されるように、２等量のｍ−アミノフェノール誘導体を、１等量のジカルボン酸無水物と縮合させることによって行うことができる。
スキーム５
【０１７４】
【化６８】
多くの単量体の非蛍光核酸結合色素は、繊維産業およびインク産業において使用されている公知の顔料であり、市販されている。これらの色素の調製についての参考文献は文献に見ることができる。多くの適切な反応性の単量体蛍光非核酸色素および非蛍光非核酸色素は市販されているか、または、公知の方法を使用して容易に調製することができる。
【０１７５】
ＢＲＩＤＧＥの合成
ＢＲＩＤＧＥは、通常、単量体色素がニ官能性の基または三官能性の基（多くの場合は、市販されている）に結合させられると形成される。一般的には、ＢＲＩＤＧＥの末端部分は、単量体色素自体に由来し、一方、ＢＲＩＤＧＥの中央部分は、商業的な供給業者から入手することができる二官能性または三官能性分子に由来する。いくつかの場合には、ＢＲＩＤＧＥの有意な部分（例えば、約９０％まで）は、二量体または三量体色素の最終的なアセンブリの前に単量体色素に予め結合させられ得る。いくつかの他の場合には、ＢＲＩＤＧＥの大部分は、単量体色素が結合させられる前に別々に調製され得る。ヘテロ二量体の合成の場合には、一保護二官能性リンカー基が、通常は最初に１つの単量体色素に結合させられ、続いて、脱保護、および第２の単量体色素へのカップリングが行われる。ヘテロ三量体色素は、同様の段階的な保護−脱保護ストラテジーを使用して合成することができる。
【０１７６】
ＢＲＩＤＧＥへの単量体色素の結合
一般的には、二量体色素および三量体色素は、ホモ二量体のいくつかについては１工程のカップリング反応において、あるいは、ヘテロ二量体および三量体、または複数の架橋エレメントＡを含むホモ二量体のいくつかについては多工程の反応において、適切な反応基を有している単量体色素を、二官能性リンカーまたは三官能性リンカーと結合させることによってアセンブリさせることができる。選択されたホモ二量体およびヘテロ二量体への合成経路の例は、すぐ下のスキーム６に模式的に示される。
スキーム６
【０１７７】
【化６９】
ホモ三量体色素の調製の一例は、すぐ下のスキーム７に模式的に示される。
スキーム７
【０１７８】
【化７０】
反応基を有している二量体色素を調製するための方法の例は、すぐ下のスキーム８に示される。
スキーム８
【０１７９】
【化７１】
【実施例】
【０１８０】
（実施例１）
１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジ、ヨウ化物の調製
１等量の１，３−ジヨードプロパンを、１０ｍＬのクロロベンゼン中の５ｇのアクリジンオレンジ（Ａｌｄｒｉｃｈ）の懸濁液に添加した。得られた混合物を、９０〜１００℃で一晩攪拌した。熱い反応混合物を約２００ｍＬのＥｔＯＡｃに注いだ。オレンジ色の沈殿物を濾過によって回収し、減圧下で乾燥させると、約８ｇが得られた。
【０１８１】
（実施例２）
１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ、塩化物塩の調製
１０−（５−エトキシカルボニルペンチル）アクリジンブロマイドを、１，３−ジヨードプロパンをエチル６−ブロモヘキサン酸で置き換えたことを除き、実施例１の手順を使用して調製した。粗生成物（５ｇ）を、約１００ｍＬのメタノールと、３０ｍＬのＨ２Ｏに溶解させた３等量のＮａＯＨの中に懸濁させた。懸濁液を、室温で２４時間攪拌した。メタノールを蒸発によって除去し、そして残りの水溶液を濃ＨＣｌで酸性化させた。約５０ｍＬの飽和ＮａＣｌを生成物を沈殿させるために添加した。生成物を濾過によって回収し、その後、４５℃で２４時間、減圧下で乾燥させた。
【０１８２】
（実施例３）
ＤＭＡＯ（表２の色素番号１）の調製
１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジ、ヨウ化物（１００ｍｇ）を、シールド管の中のメタノール中の２０ｍＬの２Ｍジメチルアミンの中に懸濁させ、その後、６０℃で一晩攪拌した。混合物を室温に冷却し、その後、５０ｍＬのＥｔＯＡｃに注いだ。沈殿を遠心分離によって回収し、その後、４０℃で２４時間、減圧下で乾燥させた。
【０１８３】
（実施例４）
ＴＭＡＯ（表２の色素番号２）の調製
ＣＨ３ＯＨ（２ｍＬ）中のＤＭＡＯ（表２の色素番号１）（１１ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）とＣＨ３Ｉ（０．５ｍＬ）の混合物を、４日間穏やかに還流させた。オレンジ色の生成物（１０ｍｇ）を吸引濾過によって回収した。
【０１８４】
（実施例５）
ＰＭＡＯ（表２の色素番号５）の調製
ＣＨ３ＯＨ（１０ｍＬ）中の１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジヨウ化物塩（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（０．３ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流させた。室温に冷却した後、沈殿を吸引濾過によって回収した。沈殿をＣＨ３ＯＨ（５ｍＬ）中に再懸濁させ、一晩還流させて、そして吸引濾過によって回収した。これを、減圧下で恒量になるまで乾燥させると、濃い赤色の固形物（１４ｍｇ）が得られた。
【０１８５】
（実施例６）
ＡＯＡＯ−２Ｑ（表２の色素番号９）の調製：
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジヨウ化物塩（８１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）とＰＭＡＯ（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の混合物を、１３０℃で７時間加熱した。室温に冷却した後、ＣＨ３ＯＨ（１５ｍＬ）を添加し、懸濁液を１時間、還流させるために加熱した。吸引濾過すると、生成物が濃い赤色の固形物として得られた（８３．１ｍｇ）。
【０１８６】
（実施例７）
ＡＯＡＯ−２（表２の色素番号７）の調製
Ｅｔ３Ｎ（０．１５ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（３２０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、室温のＤＭＦ（５ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（４３８ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌し、その後、Ｅｔ３Ｎ（０．１ｍＬ）と３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（５０ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を添加して生成物を沈殿させた。粗生成物をＤＭＦの中に再度溶解させ、ＥｔＯＡｃで再び沈殿させた。固形物（２５０ｍｇ）を遠心分離によって分離した。
【０１８７】
（実施例８）
ＡＯＡＯ−３（表２の色素番号８）の調製
色素（３９３ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ（４３２ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）とエチレンジアミン（２５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０１８８】
（実施例９）
１０−（８−ブロモオクチル）アクリジンオレンジブロマイドの調製
クロロベンゼン（１５ｍＬ）中のアクリジンオレンジ（２ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）と１，８−ジブロモアセタン（１，８−ｄｉｂｒｏｍｏａｃｔａｎｅ）（１２ｍＬ、６７．８ｍｍｏｌ）の混合物を、１１０℃で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、そして懸濁液を１時間還流させた。室温に冷却させた後、吸引濾過すると、生成物がオレンジ色の固形物（３．５６ｇ）として得られた。
【０１８９】
（実施例１０）
ＡＯＡＯ−５（表２の色素番号１１）の調製
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の１０−（８−ブロモアセチル）アクリジンオレンジブロマイド（１０−（８−ｂｒｏｍｏａｃｔｙｌ）ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）（０．５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）とアクリジンオレンジ（０．３ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）の混合物を、１３０℃で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃを添加して生成物を沈殿させた。ＤＭＦとＥｔＯＡｃからの沈殿を繰り返すことにより、生成物が濃い赤色の固形物（２１４ｍｇ）として得られた。
【０１９０】
（実施例１１）
ＡＯＡＯ−７（表２の色素番号１３）の調製
色素（３０ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１２１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と１，５−ジアミノ−ペンタンジヒドロクロライド（２０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９１】
（実施例１２）
ＡＯＡＯ−８（表２の色素番号１５）の調製
色素（１８２ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（２４１ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）とピペラジン（２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９２】
（実施例１３）
ＡＯＡＯ−１１（表２の色素番号１８）の調製
色素（１１２ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１８０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）と１，８−ジアミノ−オクタン（２５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９３】
（実施例１４）
ＡＯＡＯ−１２（表２の色素番号１９）の調製
色素（７６ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１４７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）と２，２’オキシビス（エチル−アミン）ジヒドロクロライド（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９４】
（実施例１５）
ＡＯＡＯ−１３（表２の色素番号２０）の調製
色素（６４ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（９６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（２０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９５】
（実施例１６）
１，３−ジ−（（２−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ベンゼン（色素番号１０１、すぐ下に示す）の調製
【０１９６】
【化７２】
Ｅｔ３Ｎ（０．４ｍＬ、２．７１ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（８２０ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を、室温のＤＭＦ（２ｍＬ）中のイソフタル酸（２２０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で３０分間攪拌した。その後、Ｅｔ３Ｎ（１ｍＬ）とモノ−ｔＢｏｃ−エチレンジアミン（４６０ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、その後、１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）の間で分配させた。水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出し、混合した有機層を、１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）と、飽和ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で洗浄し、そして無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗生成物を、溶離液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（９：１）を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製すると、無色の固形の生成物（３５６ｍｇ）が得られた。
【０１９７】
（実施例１７）
１，３−ジ−（（２−アミノエチル）アミノカルボニル）ベンゼン、トロフルオロ酢酸塩（色素番号１０２、すぐ下に示す）の調製
【０１９８】
【化７３】
１，３−ジ−（（２−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ベンゼン（３５６ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を、０℃のＴＦＡ（５ｍＬ）に添加した。混合物を０℃で１時間攪拌し、そして溶液を減圧下で乾燥物になるまで濃縮した。無色の残渣をＣＨ３ＯＨ（２ｍＬ）中に溶解させ、そしてＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）に一滴ずつ添加した。沈殿を遠心分離によって回収し、そして、減圧下で恒量になるまで乾燥させると、固形の生成物（４２５ｍｇ）が得られた。
【０１９９】
（実施例１８）
ＡＯＡＯ−９（表２の色素番号１６）の調製
色素（５５ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１０９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）と１，３−ジ（（２−アミノエチル）アミノカルボニル）ベンゼン、トロフルオロ酢酸塩（５０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２００】
（実施例１９）
１，３−ジ（（５−’Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）ペンチル）アミノカルボニル）ベンゼン（色素番号１０３、すぐ下に示す）の調製
【０２０１】
【化７４】
色素（５５５ｍｇ）を、イソフタル酸（２５４ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）とモノ−ｔＢｏｃカダベリン（６４０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）から１，３−ジ−（（２−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ベンゼンを作成するための手順を使用して調製した。
【０２０２】
（実施例２０）
１，３−ジ（（５−アミノペンチル）アミノカルボニル）ベンゼン、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１０４、すぐ下に示す）の調製
【０２０３】
【化７５】
色素（５６０ｍｇ）を、色素番号１０２（５５５ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）についての手順にしたがって調製した。
【０２０４】
（実施例２１）
ＡＯＡＯ−１０（表２の色素番号１７）の調製
色素（２２ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（９５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と色素番号１０４（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２０５】
（実施例２２）
ＡＯＡＯ−１４（表２の色素番号２１）の調製
色素（１５０ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（１６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）とジアミド−ｄＰＥＧ−ジアミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｏｗｅｌｌ，Ｏｈｉｏ）（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２０６】
（実施例２３）
１０−（（（（３−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）プロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル）アンモニウム）プロピル）アクリジン、ニヨウ化物（色素番号１０５、すぐ下に示す）の調製
【０２０７】
【化７６】
ＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）中の１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジヨウ化物（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）と３−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）プロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（１．８ｇ，８．９ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流させた。室温に冷却したあと、沈殿を吸引濾過によって回収し、恒量になるまで乾燥させると、色素番号１０５がオレンジ色の固形物（２９２ｍｇ）として得られた。
【０２０８】
（実施例２４）
１０−（（（（３−アンモニウム）プロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル）アンモニウム）プロピル）アクリジン、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１０６、すぐ下に示す）の調製
【０２０９】
【化７７】
色素番号１０５（５０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を、０℃のＴＦＡ（２ｍＬ）に添加した。混合物を、０℃で３０分間攪拌した。溶液を減圧下で乾燥物となるまで濃縮させ、そして残渣をＣＨ３ＯＨ（３ｍＬ）の中に溶解させた。溶液をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）に一滴ずつ添加し、沈殿を遠心分離によって回収し、そして減圧下で恒量となるまで乾燥させると、色素番号１０６がオレンジ色の固形物（２８ｍｇ）として得られた。
【０２１０】
（実施例２５）
ＡＯＡＯ−４（表２の色素番号１０）の調製
色素（２３ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（３１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）と色素番号１０６（２８ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２１１】
（実施例２６）
１０−（６−（Ｎ−フタルイミド）ヘキシル）アクリジンオレンジ臭化物塩（色素番号１０７、すぐ下に示される）の調製
【０２１２】
【化７８】
クロロベンゼン（２０ｍＬ）中のアクリジンオレンジ（２ｇ、７．５４ｍｍｏｌ）とＮ−（６−ブロモヘキシル）フタルイミド（４．７ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）の混合物を、１１０℃で２日間加熱した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、そして懸濁液を、１時間、還流させるために加熱した。室温に冷却させた後、生成物である色素番号１０７を、吸引濾過によってオレンジ色の固形物（３．７６ｇ）として回収した。
【０２１３】
（実施例２７）
１０−（５−（（５−カルボキシペンチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ、ヨウ化塩（色素番号１０８、すぐ下に示される）の調製
【０２１４】
【化７９】
Ｅｔ３Ｎ（４０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）とＴＳＴＵ（８１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（１０７ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。続いて、Ｅｔ３Ｎ（０．２ｍＬ）と、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中の６−アミノヘキサン酸（６７ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をＨ２Ｏで錬和する（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）と、色素番号１０８がオレンジ色の固形物（１２５ｍｇ）として得られた。
【０２１５】
（実施例２８）
９−シアノ−１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ、塩化物（色素番号１０９、すぐ下に示す）の調製
【０２１６】
【化８０】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ（０．１５ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ）とシアン化ナトリウム（３５ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）の混合物を、大気中で２日間、室温で攪拌した。ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）を添加し、得られた懸濁液を室温で１時間攪拌した。濃い青色の沈殿を遠心分離によって回収し、減圧下で恒量となるまで乾燥させると、色素番号１０９（１３０ｍｇ）が得られた。
【０２１７】
（実施例２９）
ＡＯＡＯ−１２Ｒ（表２の色素番号２２）の調製
Ｅｔ３Ｎ（３２μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（６８ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）を、室温のＤＭＦ（２ｍＬ）中の色素番号１０９（９８．３ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、Ｅｔ３Ｎ（１００μＬ）と２，２’−オキシビス−（エチルアミン）ジヒドロクロライド（１６ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で２日間攪拌した。溶液を約１ｍＬにまで濃縮し、ＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）を添加した。沈殿を遠心分離によって回収した。生成物をＤＭＦ中に再度溶解させ、ＥｔＯＡｃで再び沈殿させると、色素番号２２が濃い青色の固形物（５４．４ｍｇ）として得られた。
【０２１８】
（実施例３０）
９−アミノカルボニル−１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジン（色素番号１１０、すぐ下に示す）の調製
【０２１９】
【化８１】
７５％のＨ２ＳＯ４（１ｍＬ）中の色素番号１０９（３０ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）の溶液を、６０℃で２日間加熱した。室温に冷却した後、混合物をＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）に添加した。沈殿を遠心分離によって回収し、ＣＨ３ＯＨ（１．５ｍＬ）中に再び溶解させた。ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を添加し、固形の沈殿を遠心分離によって回収し、そして恒量となるまで減圧下で乾燥させると、色素番号１１０が濃いピンク色の固形物（２０．４ｍｇ）として得られた。
【０２２０】
（実施例３１）
Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（すぐ下に示す）の調製
【０２２１】
【化８２】
色素を、公開されている手順（Ｃａｒｒｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔ．６（４），５１７（２００４））を使用して調製した。
【０２２２】
（実施例３２）
ＴＯＴＯ−３（表２の色素番号１４）の調製
色素（３５４ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（４６０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）とエチレンジアミン（２５ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２２３】
（実施例３３）
１０−（５−（（２−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（色素番号１１１、すぐ下に示す）の調製
【０２２４】
【化８３】
Ｅｔ３Ｎ（１０６μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（２３０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジクロライド塩化物（３０２ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。続いて、Ｅｔ３Ｎ（３５０μＬ）とモノｔ−ＢＯＣ−エチレンジアミン（１５０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、その後、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）の添加によって沈殿させた。沈殿を遠心分離によって回収し、恒量となるまで乾燥させると、色素番号１１１がオレンジ色の固形物（３６５ｍｇ）として得られた。
【０２２５】
（実施例３４）
１０−（５−（（２−アンモニウムメチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１１２、すぐ下に示す）の調製
【０２２６】
【化８４】
色素番号１１１（３４７ｍｇ、６２２ｍｍｏｌ）を、５℃のトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）の中に一度に添加した。混合物を５℃で１時間攪拌し、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣を、ＣＨ３ＯＨ（３ｍＬ）の中に溶解させ、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に一滴ずつ添加した。沈殿を遠心分離によって回収すると、色素番号１１２がオレンジ色の固形物（２９７ｍｇ）として得られた。
【０２２７】
（実施例３５）
ＡＯＴＯ−３（表２の色素番号２３）の調製
Ｅｔ３Ｎ（２０μＬ、０．１４２ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（４２．２ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（６２ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、Ｅｔ３Ｎ（７０μＬ）と色素番号１１２（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌し、その後、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をＤＭＦ（１ｍＬ）中に再度溶解させ、そしてＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）を添加した。沈殿を遠心分離によって回収した。ＤＭＦとＥｔＯＡｃからの沈殿を繰り返すと、生成物がオレンジ赤色の固形物（５０．４ｍｇ）として得られた。
【０２２８】
（実施例３６）
ＴＯＴＯ−１２（表２の色素番号２４）の調製
色素（１９．４ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（９４．５ｍｇ、０．２１４５ｍｍｏｌ）と２，２’オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド（１５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２２９】
（実施例３７）
ＴＯ（３）ＴＯ（３）−１２（表２の色素番号２５）の調製
色素（３２．６ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールブルー（Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ ｔｈａｚｏｌｅ ｂｌｕｅ）（Ｃａｒｒｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔ．６（４），５１７（２００４）；およびＢｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１（２４），５７２７（１９９３））（９９ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）と２，２’オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド（１５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３０】
（実施例３８）
ＴＯ（３）ＴＯ（３）−２（表２の色素番号２６）の調製
色素（２８．４ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールブルー（７６ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）と３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジ−プロピルアミン（１０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３１】
（実施例３９）
１０−（５−（（５−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）ペンチル）アミノカルボニル）ペンチル）−アクリジンオレンジ、塩化物（色素番号１１３、すぐ下に示す）の調製
【０２３２】
【化８５】
色素（２８０ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（２００ｍｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）とモノｔ−ＢＯＣ−カダベリン（１３０ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ）から色素番号１１１を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３３】
（実施例４０）
１０−（５−（（５−アンモニウムペンチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１１４、すぐ下に示す）の調製
【０２３４】
【化８６】
色素番号１１４（２３４ｍｇ）を、色素番号１１３（２８０ｍｇ、０．４６７ｍｍｏｌ）から色素番号１１２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３５】
（実施例４１）
ＡＯＲＯ−７（表２の色素番号２７）の調製
化合物（２９ｍｇ）を、化合物番号１１４（３５ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）とロサミン色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ））（４０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）からＡＯＴＯ−３を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３６】
（実施例４２）
ＤＭＡＯおよびＡＯＡＯ−７の吸光度および蛍光
ＤＭＡＯおよびＡＯＡＯ−７の、図２および図３に示す吸収スペクトル、ならびに図４に示す蛍光放射スペクトルを、ＰＢＳ緩衝液中で、ＤＮＡの存在を伴わずに、またはＤＮＡの存在（２ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ）を伴って、別々に測定した。色素濃度は全て、４９５ｎｍで０．０５の光学密度となるように調整した。スペクトルを、吸光度のプロットにおいては１に正規化した。ＤＭＡＯと比較すると、ＡＯＡＯ−７は、吸光度において４７１ｎｍに新しい短い波長のピークを示し、これは、ＡＯＡＯ−７の中での２つのアクリジン単量体の凝集を示している。ＤＮＡに結合すると、ＡＯＡＯ−７とＤＭＡＯの吸光度は、それぞれ、遊離の色素と比較すると５ｎｍおよび１０ｎｍの赤色のシフトを示した。遊離のＡＯＡＯ−７の蛍光は、ＤＭＡＯの蛍光よりも約５倍少ない。ＡＯＡＯ−７のより低いバックグラウンドの蛍光は、リアルタイムｑＰＣＲにおいては有利である。ＡＯＡＯ−７のアクリジン単量体１つあたりの蛍光はＤＭＡＯの蛍光に近く、これは、ＤＮＡに結合すると、ＡＯＡＯ−７の２つの単量体はもはや互いに消光することはなく、２つの間のリンカーは、量子収量に対してネガティブな作用は示さないことを示している。
【０２３７】
（実施例４３）
ＴＯＴＯ−１およびＴＯＴＯ３の吸収スペクトル
実施例４２に関して記載した様式と同様の様式において、ＴＯＴＯ−１およびＴＯＴＯ−３の吸収スペクトルを、ＰＢＳ緩衝液の中で、図５に示すようにＤＮＡの存在を伴わずに、または図６に示すように、２ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡの存在下で測定した。図５に示すように、遊離の色素のスペクトルは、中性であるかまたは実質的に正電荷を含まないＢＲＩＤＧＥを有しているＴＯＴＯ−３は分子内Ｈ二量体またはヘアピン構造を形成するが、複数の正電荷を有しているＴＯＴＯ−１は、ほとんどスペクトルがシフトしないことを示している。図６に示すように、ＤＮＡの存在下では、ＴＯＴＯ−１およびＴＯＴＯ−３のいずれの吸収スペクトルもほぼ同じ位置にシフトし、これは、ＴＯＴＯ−３二量体のヘアピン構造がＤＮＡに結合すると開くこと、およびＴＯＴＯ−１とＴＯＴＯ−３はいずれも、同様のタイプのＤＮＡ−色素錯体を形成することを示している。
【０２３８】
（実施例４４）
様々な量のＤＮＡに対して応答するＡＯＡＯ−１２の蛍光
０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、２．０、４．０、６．０、８．０、および１０μｇ／ｍＬの最終濃度のサケ精子ＤＮＡまたは一本鎖の２０マーのオリゴヌクレオチドの混合物の存在下での、２００ｍＬのＰＢＳ中の０．１μＭのＡＯＡＯ−１２の蛍光を、マイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））上で測定した。蛍光を図７に示すように、ＤＮＡの濃度に対してプロットした。蛍光が２．０μｇ／ｍＬまでのＤＮＡに対して直線的に反応したことを見ることができる（差し込み図）。さらに高いＤＮＡ濃度では、反応は、非直線的になる。ＡＯＡＯ−１２は、二本鎖のＤＮＡに結合した場合には、一本鎖のＤＮＡに結合した場合よりも強い蛍光を発する。
【０２３９】
（実施例４５）
ｑＰＣＲにおけるＡＯＡＯ−１２およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのシグナル強度の比較
本実施例では、ｑＰＣＲにおける蛍光シグナルの強度において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも優れたＡＯＡＯ−１２の特性を明らかにする。全てのリアルタイム増幅を、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および様々な濃度の蛍光をモニターするための色素を含む、２０μＬの反応溶液の中で行った。ｐＴＯＰＯプラスミド中のＡＴＰＢ断片（配列番号１）を、０．５μＭの正方向プライマー５’−ＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡ−３’（配列番号２）、０．５μＭの逆方向プライマー５’−ＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＴＣ−３’（配列番号３）を用いて増幅させた。熱によるレジュメは、９５℃で１分間、続いて、９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間のサイクルを５０サイクルと設定した。蛍光は、５５℃の段階で測定した。以前の報告（Ｎａｔｈ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ａｎｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４２，１５（２０００））と一致して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、図８に示すように、ＰＣＲ反応に対する阻害を示した。ここでは、Ｃｔは、より高いＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ濃度では遅れた。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ濃度と比較すると、より高いＡＯＡＯ−１２濃度を、阻害を示すことなく反応に添加することができた。結果として、ＡＯＡＯ−１２を用いた場合の最終的な蛍光強度は数倍高くなる場合があり、これによって、より感度の高い検出が可能となる。あるいは、ＡＯＡＯ−１２を用いた場合には、感度の低い光学デバイスを、サーマルサイクラー蛍光光度計（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）において使用することができ、それによって、より安価な機器がもたらされる。
【０２４０】
（実施例４６）
ヒトゲノムＤＮＡの滴定
ヒトゲノムＤＮＡからのＵＢＣ断片（配列番号８）の増幅を、（１）異なる正方向プライマーと逆方向プライマーのセット（５’−ＡＣＴＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号９）および５’−ＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＧＡＡ−３’（配列番号１０））を使用したこと、ならびに、（２）ヒトＤＮＡの１０倍稀釈物のシリーズを鋳型としたことを除いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（４９５ｎｍでの最終的な吸収ピークは０．０２５の光学密度に相当する、すなわち、Ａ４９５＝０．０２５）またはＡＯＡＯ−１２（最終Ａ４９５＝０．１）を用いて、実施例４５に示した条件と同様の条件下で行った。図８は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩまたはＡＯＡＯ−１２のいずれかを用いて、ヒトＤＮＡの１０５コピーで始めて１０コピーまで減少する複数の反応の増幅プロットを示す。差し込み図は、Ｃｔ値は、いずれの色素を用いた場合も、モニターした最初のコピー数の対数と逆の相関関係にあることを示している。ＡＯＡＯ−１２は、シグナル強度においてはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも明らかに優れている。
【０２４１】
（実施例４７）
ｑＰＣＲにおけるＴＯ、ＴＯＴＯ−１、およびＴＯＴＯ１２
本実施例は、ｑＰＣＲにおける、ＴＯ（チアゾールオレンジ、非対称シアニン色素）またはＴＯＴＯ−１を上回る改良されたＴＯＴＯ−１２の特性を明らかにする。リアルタイム増幅は全て、ＴＯ、ＴＯＴＯ−１、およびＴＯＴＯ−１２を使用したことを除いて、実施例５に記載したように行った。図１１に示すように、ＴＯＴＯ−１は、ＰＣＲ反応を完全に阻害したが、ＴＯＴＯ−１２は、ｑＰＣＲにおいては、ＴＯと比較すると、改善されたＣｔ値と改善された蛍光強度を生じた。ＴＯＴＯ−１２二量体色素は、ＴＯおよびＴＯＴＯ−１色素のそれぞれよりも優れている。
【０２４２】
（実施例４８）
ＡＯＲＯ−７の吸光度および蛍光
実施例４２に関して記載した様式と同様の様式において、ＡＯＲＯ−７の吸収スペクトルを、図１２に示すように、ＰＢＳ緩衝液中で単独で、または２μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡの存在下で得た。ＤＮＡに結合したＡＯＲＯ−７の放射スペクトルを図１３に示す。ヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７には単量体ＡＯ色素と、蛍光非核酸ロサミンＲＯ色素が含まれる。２つの放射ピーク（それぞれ、ＡＯ部分とＲＯ部分による）が記録された。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によるＣｈｒｏｍｏ４上での、４９０ｎｍに設定された励起と５３０ｎｍで回収される放射、すなわち、Ｅｘ４９０／Ｅｍ５３０を用いたチャンネル１において、あるいは、Ｅｘ５８０／Ｅｍ６３０を用いたチャンネル３においては、ＡＯＲＯ−７を用いてｑＰＣＲを記録することができたが、チャンネル２（Ｅｘ５２０／Ｅｍ５７０）では弱かった（データは示さない）。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効果は無視できるほどであるため、単量体色素構成成分であるＡＯまたはＲＯのいずれをも、レポーター色素として選択することができる。
【０２４３】
（実施例４９）
ｑＰＣＲにおけるヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７
本実施例は、ｑＰＣＲにおけるＡＯＲＯ−７の有用性を示す。リアルタイム増幅を、最終的な溶液中で６００ｎｍで０．０２５の光学密度を有しているＡＯＲＯ−７を使用したことを除いて、実施例５のように行った。図１４に示すように、ＡＯＲＯ−７は、ｑＰＣＲの反応経過をモニターするために、そしてアンプリコンの融解曲線（差し込み図）を検出するために、有効に使用することができる。このｑＰＣＲが、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によるｉＣｙｃｌｅ ＩＱ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍのチャンネル３（Ｅｘ５８０／Ｅｍ６３０）でモニターできたという知見は、所望される波長のほとんどの全ての色素が、本明細書中に開示される方法によるｑＰＣＲでのＤＮＡレポーター色素に合い、したがって、スペクトルの使用をｑＰＣＲのモニタリングに拡大することができることの一例を提供する。現在、ほとんどのＴａｑＭａｎプローブにはＦＡＭまたなＶＩＣが使用されている。これらは、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩと同じチャンネルを占めている。配列特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）と、異なる波長の配列非特異的色素（例えば、ＡＯＲＯ−７）をｑＰＣＲにおいて使用することが有利である。この場合、プローブによっては、配列特異性が提供され、そして色素によっては、アンプリコンの他のパラメーター（例えば、融点）が提供される。
【０２４４】
（実施例５０）
ＡＯＡＯ−１２を用いてモニターした融解ピーク
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、アンプリコンの融点をｑＰＣＲ増幅の後に検出することができるという点で有利であることが報告されている。融点は、アンプリコンについての有用な情報を提供する。なぜなら、これは、アンプリコンの大きさとＧＣ含有量の関数であるからである。融点は、ＴａｑＭａｎ反応からは得ることはできない。４種類のアンプリコン、すなわち、ＨＭＢＳ（配列番号４）、ＲＰＬ４（配列番号５）、ＳＤＨＡ（配列番号６）、およびＴＢＰ（配列番号７）による融解曲線を、ＡＯＡＯ−１２（パネルＡ）またはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（パネルＢ）の存在下で増幅させた反応から測定し、そして図１５に示す。ＡＯＡＯ−１２を用いて得られた融解ピークは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて得られたピークと相関関係があった。ＡＯＡＯ−１２は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも弱いが、高い親和性でＤＮＡに結合するため、ＡＯＡＯ−１２による融点は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによる融点よりも約２℃低い。より高い濃度のＡＯＡＯ−１２をリアルタイムＰＣＲ反応において使用することができるため、融解ピークは顕著により高い。データは、ＡＯＡＯ−１２の相対的な有用性を示している。
【０２４５】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたｑＰＣＲ反応は、プライマー−二量体を形成する傾向があり、そして、この傾向はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度と密接に関係していることが報告されている。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、そのように堅くＤＮＡに結合し、これはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの性能を妨げることが主張されている。ＡＯＡＯ−１２はＤＮＡに対する親和性がほとんどないため、妨害は少ないはずである。ＡＯＡＯ−１２のこの特性は、図１５から明らかであり、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下でのＨＭＢＳの増幅反応は、さらなるプライマー二量体のピークを有しているが、ＡＯＡＯ−１２の存在下での同じ増幅は、きれいな特異的ピークを１つだけ示すことである。
【０２４６】
（実施例５１）
ＡＯＡＯ色素の安定性
単量体ＡＯを含む二量体色素の安定性を明らかにした。具体的には、ＡＯＡＯ−１２を、ＰＣＲ産物を含むＰＣＲ反応緩衝液の中で維持した。混合物を９６℃で４０分間加熱した。加熱過程の間に、混合物を、蛍光をモニターするために一時的に６０℃に冷却した。図１６に示すように、ＡＯＡＯ−１２は、９６℃で４０分間安定であり、実質的な蛍光の消失はない。データは、ＰＣＲにおけるＡＯＡＯ−１２の構造安定性を示している。
【０２４７】
（実施例５２）
ＴＯＴＯ−１３（表２の色素番号２９）の調製
色素（１０２ｍｇ）を、Ｎカルボキシペンチルチアゾールオレンジ（１０２ｍｇ、０．２３ミリモル）（実施例３１）と４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（２３ｍｇ、０．１モル）からＡＯＡＯ−２（表２の色素番号７）を合成するための手順を使用して調製した。
【０２４８】
（実施例５３）
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−４−（４−（ジメチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロマイドの調製
エタノール（１００ｍＬ）中の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（３ｇ、２０ミリモル）、Ｎ−（５−カルボキシ−ペンチル）ピコリニウムブロマイド（５．６ｇ、２０ミリモル）、およびピペリジン（２ｍＬ）の混合物を、６０℃で一晩加熱した。混合物を減圧下で乾燥物となるまで蒸発させた。残渣をメタノールの中に再度溶解させ、その後、エーテルで沈殿させると、生成物（６．７ｇ）が得られた。
【０２４９】
（実施例５４）
ＳＴＳＴ−１９（表２の色素番号３１）の調製
色素（８５ｍｇ）を、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−４−（４−（ジメチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロマイド（実施例５３）（２００ｍｇ、０．５ミリモル）と２，２’−オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド（３６ｍｇ、０．２ミリモル）からＡＯＡＯ−２（実施例７）を調製するための手順を使用して調製した。
【０２５０】
（実施例５５）
ＳＴＳＴ−２７（表２の色素番号３０）の調製
色素（８１．８ｍｇ）を、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−４−（４−ジメチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロマイド（実施例５３）（２００ｍｇ、０．５ミリモル）と４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（４４ｍｇ、０．２ミリモル）からＡＯＡＯ−２（実施例７）を調製するための手順を使用して調製した。
【０２５１】
二量体色素または三量体色素のような有用な色素は、本明細書中に記載されている。このような色素は、多数の所望される特性（例えば、比較的低いバックグラウンドの蛍光、比較的低いＰＣＲ阻害、良好な蛍光シグナル強度、および良好な安定性）のいずれかを有している場合がある。一般的には、多くても１つの正電荷を有している色素は、任意の多数の用途（例えば、別の分子の標識における使用、および核酸の存在または核酸が存在しないことの検出における使用）を有している場合がある。さらに、一般的には、実質的には中性であるこのような色素は、任意の多数の用途（例えば、ＰＣＲプロセスにおける使用、あるいは、核酸の存在または核酸が存在しないことの検出における使用、あるいは、定量的リアルタイムＰＣＲにおける使用）を有している。
【０２５２】
多数の有用な二量体色素および三量体色素が記載されている。例として、分子に対して色素の核酸検出能力を付与するための、別の分子との供給結合または別の分子の標識に適している色素、核酸が含まれている場合もまたは含まれていない場合もある試料中の核酸の存在または核酸が存在しないことを検出するために適している色素；ならびに、試料（例えば、核酸増幅に適しているプロセスを受けた試料（試料には標的核酸が含まれているはずである））中での核酸の形成またはそれがないことを検出するために適している色素が記載されている。上記色素の任意のものを調製する方法、および上記色素の任意のものを使用する方法もまた記載されている。本明細書中に記載される組成物を使用する任意の方法が、本明細書中で意図される。本発明の適切な色素を含む、試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するために適しているキット、および標的核酸が含まれているはずである試料中の標的核酸の増幅に十分である適切な組成物が、本明細書中で意図され、同様に、有用な用途を有している本明細書中に記載される組成物が含まれている任意のキットも意図される。
【０２５３】
本明細書中の記載に関する様々な改良、プロセス、さらには多数の構造を、明細書を参照して当業者に容易に明らかであるように、適用できることができる。本明細書中で特定されている様々な参考文献、刊行物、米国仮特許出願および特許出願、または外国の特許出願、ならびに／あるいは、米国特許または外国の特許は、それらのそれぞれが、その引用によってそれらの全体が本明細書中に組み入れられる。様々な態様および特徴が、理解、意見、理論、根底にある仮定、および／または実施例もしくは机上の実験例に関して説明され、記載されているが、任意のそのような理解、意見、理論、根底にある仮定、および／または実施例もしくは机上の実験例は、拘束力のあるものではないことが理解されるであろう。様々な態様および特徴が本明細書中の様々な実施例および実施例に関して記載されているが、それらのいずれも、添付される特許請求の範囲の範囲全体にかかわる限定ではないことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】図１（ＦＩＧ．１）は、リリースオンデマンド機構によるＤＮＡの結合の模式図である。ここでは、色素の３種類の立体構造の状態は実質的に平衡状態にある。
【図２】図２（ＦＩＧ．２）は、ＰＢＳ緩衝液中の、ａ）二量体色素ＡＯＡＯ−７（○）およびｂ）単量体ＡＯ色素ＤＭＡＯ（△）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図３】図３（ＦＩＧ．３）は、緩衝液中またはＤＮＡの存在下での、ａ）二量体色素ＡＯＡＯ−７（●）およびｂ）単量体ＡＯ色素ＤＭＡＯ（▲）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図４】図４（ＦＩＧ．４）は、ＤＮＡの添加前のＰＢＳ緩衝液中のＤＭＡＯ（△）およびＡＯＡＯ−７（○）（それぞれ、ａ）およびｃ））、ならびに、ＤＮＡの添加後のＰＢＳ緩衝液中のＤＭＡＯ（▲）およびＡＯＡＯ−７（●）（それぞれ、ｂ）およびｄ））の、波長（ｎｍ）に対する相対的な蛍光、または蛍光放射スペクトルのグラフによる表示である。
【図５】図５（ＦＩＧ．５）は、緩衝液中の、ａ）ＴＯＴＯ−１（米国特許第５，５８２，９７７号にしたがって調製した）（濃い線）、およびｂ）ＴＯＴＯ−３（薄い線）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図６】図６（ＦＩＧ．６）は、緩衝液中およびＤＮＡの存在下での、ａ）米国特許第５，５８２，９７７号のＴＯＴＯ−１（濃い線）、およびｂ）ＴＯＴＯ−３（薄い線）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図７】図７（ＦＩＧ．７）には、溶液中およびＡＯＡＯ−１２（０．２μＭ）の存在下の、一本鎖ＤＮＡ（◇）および二本鎖のＤＮＡ（◆）の、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）に対する相対的な蛍光または滴定のグラフによる表示が含まれる。図７にはまた、両者の間での実質的に直線的な関係を示す、ＤＮＡ濃度に対する相対的な蛍光の差し込み図によるグラフ表示も含まれる。
【図８】図８（ＦＩＧ．８）は、低い色素濃度（△）および高い色素濃度（▲）のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ならびに、低い色素濃度（□）および高い色素濃度（■）のＡＯＡＯ−１２を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する相対的な蛍光またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示である。ここでは、Ｃｔは、一般的には、蛍光シグナルが任意の限界点に達するサイクル数を意味し、ＰＣＲ増幅プロットにおいては、通常、蛍光シグナルがベースラインから少し上昇し始める点に対応する。それぞれの色素について、相対的な色素濃度が、ＰＢＳ緩衝液中の色素の最大吸収で光学密度（ＯＤ）が測定された。４７１ｎｍでの１×および２×のＡＯＡＯ−１２の色素濃度は、それぞれ、０．１および０．２のＯＤに対応しており、そして４９５ｎｍでの０．５×および１×のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの色素濃度は、それぞれ、０．０２５および０．０５のＯＤに対応していた。
【図９】図９（ＦＩＧ．９）には、それぞれの光学濃度で蛍光プローブとしてＡＯＡＯ−１２（□）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（△）を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する相対的な蛍光またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示が含まれる。それぞれの色素について、相対的な色素濃度が、ＰＢＳ緩衝液中の色素の最大吸収で光学密度（ＯＤ）が測定された。４７１ｎｍでのＡＯＡＯ−１２の色素濃度は、０．４のＯＤに対応しており、そして４９５ｎｍでのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの色素濃度は、０．０２５のＯＤに対応していた。図９にはまた、ＡＯＡＯ−１２（■）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（▲）を使用した、ＤＮＡ試料のコピー数の対数に対するＣｔの差し込み図によるグラフ表示も含まれており、これらは、それぞれの場合において、両者の間での実質的に直線的な関係を示している。
【図１０】図１０（ＦＩＧ．１０）は、二量体色素を形成させるための単量体色素Ｑ１およびＱ２の可能性のある組み合わせＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの模式図である。組み合わせＡには、２つの同じレポーター蛍光核酸色素または同様のスペクトルを有している２つのレポーター蛍光核酸色素が含まれる。組み合わせＢには、１つのレポーター蛍光核酸色素と１つの非レポーターＤＮＡ結合分子が含まれる。組み合わせＣには、１つの非レポーターＤＮＡ結合分子と１つのレポーター非ＤＮＡ結合色素が含まれる。組み合わせＤには、１つのレポーター蛍光核酸色素と１つの非レポーター非蛍光非核酸色素が含まれる。組み合わせＥには、１つのレポーター蛍光核酸色素と１つのレポーター蛍光非核酸色素が含まれる。
【図１１】図１１（ＦＩＧ．１１）は、ＴＯ単量体色素（○）、ＴＯＴＯ−１単量体色素（△）、およびＴＯＴＯ−１２二量体色素（□）（化合物２４、表２）を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する蛍光強度またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示である。
【図１２】図１２（ＦＩＧ．１２）は、ＰＢＳ緩衝液中のヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７（○）、ならびに、ＰＢＳ緩衝液中およびＤＮＡの存在下でのヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７（＋）の、波長（ｎｍ）に対する吸光度または吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図１３】図１３（ＦＩＧ．１３）は、ヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７の波長（ｎｍ）に対する任意の蛍光強度または放射スペクトルのグラフによる提示であり、５００ｎｍ（実線、濃い線）または約５６０ｎｍ（点線、薄い線）のいずれかでの励起が別々に記録された。
【図１４】図１４（ＦＩＧ．１４）には、ヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する相対的な蛍光強度またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示が含まれる。図１４にはまた、温度（℃）に対する相対的な蛍光シグナルの差込図によるグラフ表示、また、融解曲線のプロットも含まれる。
【図１５】図１５（ＦＩＧ．１５）は、温度（℃）に対する相対的な蛍光の変化のグラフによる提示、または、融解曲線のプロットである。４種類のアンプリコンＴＢＰ（○）、ＳＤＨＡ（△）、ＲＰＬ４（◇）、およびＨＭＢＳ（□）の、Ａ）ＡＯＡＯ−１２を使用したモニタリング（点線）、およびＢ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用したモニタリング（実線）。
【図１６】図１６（ＦＩＧ．１６）は、ＡＯＡＯ−１２の、９６℃での時間（分）に対する６０℃でモニターした相対的な蛍光、または９６℃での熱安定性のグラフによる表示である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、Ｍａｏらの米国仮特許出願第６０／６６３，６１３号（発明の名称「Ｄｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ Ｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｙｅｓ，ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００５年３月１７日出願）の優先権を主張し、かつ同時継続米国出願第＿＿／＿＿＿，＿＿＿号（本明細書と同時に２００６年３月１６日に出願し、やはり米国仮特許出願第６０／６６３，６１３号の優先権を主張する）に関連する。上述の仮出願および出願の各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（共同研究の関係者の同意に関する宣誓）
Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＣＡ））およびＡｌｌｅＬｏｇｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）は、本発明に関する共同研究の同意に対する関係者である。
【０００３】
（配列表についての参照ならびにそれに関する要請および参考文献の引用）
本明細書中に開示される配列番号１から配列番号１０の配列表が含まれている、オリジナルのＡＳＣＩＩディスケットおよび別のＡＳＣＩＩディスケット（これはオリジナルのディスケットの複製である）、さらには、配列表の紙によるコピーが提出され、記載され、そしてその内容を含むそれらの全体が米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３において引用により本明細書中に組み入れられる。配列表の紙によるコピーはそれと共に提出される。上記米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３がすでにファイルされている、適合するコンピュータで読み取ることができる配列表が、本出願と組み合わせて使用されることがここで要請される。本出願およびその内容の配列表の紙によるコピーまたはコンパクトディスクによるコピーは、上記米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３がファイルされている配列表のコンピュータで読み取ることができるコピーと同じである。配列表、それと共に提出される配列表の紙によるコピー、および上記米国仮特許出願番号６０／６６３，６１３がすでにファイルされているコンピュータで読み取ることができる配列表は、その内容を含むそれらの全体が、この引用により本明細書中に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
蛍光色素は、生物学的試料の検出および分析のために使用されている。蛍光色素は感度が高いため、これは極めて少数の蛍光分子を検出するために使用することができる。例えば、このような蛍光色素を使用して、細胞と会合している５０個未満の蛍光分子を検出することができる。非特許文献１）。
【０００５】
蛍光色素は、生存している細胞または組織試料の中での画像化に使用されるプローブとして使用することができる。例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の表面上の受容体に結合させられた蛍光色素プローブは、蛍光標識されたｃＡＭＰの１つの分子の画像化において使用されている。非特許文献２。様々な蛍光波長を有しているいくつかの蛍光プローブを使用して、生存している細胞または組織試料の中での多色画像化を行うことができる。蛍光プローブは、放射性プローブと比較すると感度が高く、比較的毒性が低く、そして処理が容易である。
【０００６】
蛍光色素は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、および核酸を含む生物学的試料の検出において使用することができる。核酸ポリマー（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、１つの世代から次の世代に、そして、生存している生物の日常的な機能を伝達することに関係している。したがって、核酸は興味深く、本試験の目的である。核酸に特異的に結合し、高度な蛍光錯体を形成する蛍光核酸色素は、このような実験のための有用なツールである。これらの色素を使用して、様々な媒体（純粋な溶液、細胞抽出物、電気泳動ゲル、マイクロアレイチップ、生存している細胞または固定された細胞、死亡した細胞、および環境試料が含まれる）の中のＤＮＡおよびＲＮＡの存在および量を検出することができる。これらの色素は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）におけるＤＮＡの定量的検出に使用することができる。これは、ゲノムの検索および医学的診断において使用される技術である。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はプライマーエクステンション反応である。これにより、インビトロで特異的な核酸を増幅させるための方法が提供される。一般的には、ＰＣＲにおいては、反応溶液は３種類のそれぞれの温度（９６℃、６０℃、および７２℃）で短時間維持され、それぞれ、鎖の分離または変性、アニーリング、および鎖の伸張が行われる。これらの３種類の温度の段階は、反応混合物が含まれているチューブを極めて迅速に加熱または冷却することができる自動サーモサイクラーが使用される場合には、３０秒または４０秒間である。ＰＣＲサイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡ試料の１００万倍のコピーを、およそ１時間以内に１つの酵素反応混合物の中で生産することができ、これにより標的ＤＮＡの大きさおよび配列を決定するための研究が可能となる。このＤＮＡ増幅技術は、クローニングおよび他の分子生物学的操作に使用されている。ＰＣＲについてのさらなる議論は、非特許文献３および非特許文献４に提供されている。
【０００８】
有用な１つのＰＣＲをベースとする技術は定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。簡単に説明すると、ｑＰＣＲの機構は、指数的様式での標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅に基づく。ＰＣＲ反応を行い、増幅反応の過程の間の任意の時点でＤＮＡコピーの総数を測定することにより、出発ＤＮＡ材料の量を遡及的に計算することができる。
【０００９】
蛍光をベースとするＤＮＡの検出は、通常、感度が高く、多用途であり、そしてｑＰＣＲにおいて使用される便利な検出方法である。ｑＰＣＲにおいて使用される蛍光試薬には、２つのタイプがある。第１のタイプは、１つ以上の蛍光色素で、または、蛍光色素と消光剤色素の組み合わせで標識されたオリゴヌクレオチドをベースとする。これらの標識されたオリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズした際、またはオリゴヌクレオチドの切断の際のいずれかに蛍光を放出し、その後、存在するＤＮＡの量に比例する様式でハイブリダイゼーションする。オリゴをベースとする蛍光試薬の機構および使用は、様々な特許および刊行物に記載されている。例えば、非特許文献５；非特許文献６；および特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、および特許文献８を参照のこと。ｑＰＣＲのためのオリゴをベースとする蛍光試薬は、標的配列に対する特異性が高いという利点を有しているが、これらは、設計が非常に複雑であり、結果として、その使用は高価である。ｑＰＣＲで使用される第２のタイプの蛍光色素はＤＮＡ結合蛍光色素をベースとし、これは、一般的には、蛍光核酸色素または染色と呼ばれる。蛍光核酸色素は比較的単純な分子であるため、これらは製造することが容易であり、したがって、その使用は高価ではない。それらのｑＰＣＲにおける適用は、研究室で日常的に行われる遺伝的検出に有用である。
【００１０】
全てではないが、一般的に利用することができる蛍光核酸染色をｑＰＣＲに使用することができる。理想的には、蛍光核酸色素は、それがｑＰＣＲでの使用に適しているためには特定の基準を満たしていなければならない。第一に、これは、ＰＣＲおよび保存の間は化学的に安定でなければならない。ＰＣＲは高温で行われるため、色素は熱安定性でなければならない。加えて、ＰＣＲに使用されるＴｒｉｓ緩衝液のｐＨは、低温（４℃）でのアルカリ（ｐＨ８．５）から、高温では、中性またはわずかに酸性にまで相当に変化し得るため、色素は、酸による分解または塩基による分解に対して耐性がなければならない。第２に、色素は、ＰＣＲ溶液の中に存在する場合には、ＰＣＲプロセスを阻害してはならない。第３に、色素は、ＤＮＡが存在しない条件下では非蛍光であるかまたは最少の蛍光しか発してはならず、そしてＤＮＡの存在下では高度に蛍光を発しならなければならない。第４に、色素は、既存の機器と適合する波長を吸収および放射しなければならない。既存の機器には、通常、一般的な蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｓ）、Ｃｙ３、およびＣｙ５）について最適化させられた光チャンネルが取り付けられている。第５に、色素は、配列に好みがほとんどないかまたは全くなく、ＤＮＡと結合しなければならない。第６に、ＤＮＡ−色素錯体は、存在するＤＮＡの量に直線的に相関している蛍光強度を有していなければならない。
【００１１】
上記の基準を前提とすると、極めて少数の核酸結合色素しかｑＰＣＲに使用できないことは驚くべきことではない。エチジウムブロマイド（ＥＢ）は、ｑＰＣＲに簡単な色素を使用することの実現可能性を明らかにするために使用されているＤＮＡ色素である。非特許文献７。しかし、ＥＢには、低い感度、および望ましくない波長の問題がある。ｑＰＣＲに広く使用されている色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ（ＯＲ））によるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉである。非特許文献８。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、繰り返し置換された（ｃｙｃｌｉｃａｌｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）非対称シアニン色素である。非特許文献９；ならびに、特許文献９および特許文献１０。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの利点は、これが、ほとんどの機器と適合するＦＡＭの波長と極めて適合する励起および放射波長を有していること、およびＤＮＡに結合すると高い蛍光を発することである。最近、ＬＣ Ｇｒｅｅｎと呼ばれるＤＮＡ色素がｑＰＣＲに使用されたが、この色素の構造は開示されなかった。ＬＣ Ｇｒｅｅｎ色素はほとんどのＰＣＲ機器において一般的に使用されているＦＡＭ光チャンネルと適合する望ましい波長を有しているようであるが、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりもはるかに感度が低い。さらに最近、ＢＥＢＯと呼ばれるＤＮＡ小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒ）、およびＢＯＸＴＯと呼ばれる関連色素（これらはいずれも、非対称シアニン色素である）が、ｑＰＣＲでの使用について報告されている。非特許文献１０；および特許文献１１。ＬＣ Ｇｒｅｅｎと同様に、ＢＥＢＯおよびＢＯＸＴＯは、感度に関してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉに有意に遅れをとっている。
【００１２】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩはｑＰＣＲのためのＤＮＡ色素として広く使用されているが、いくつかの態様においてはなおも不足している。一例として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉには、ＰＣＲプロセスに対する阻害作用があり、これは色素濃度を増大させることによって得ることができる最大シグナル強度を制限する。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用するｑＰＣＲの蛍光シグナル強度は、色素濃度が、色素がＰＣＲプロセスを有意に阻害しはじめる点に達するまでは、最初は色素濃度に比例する。色素濃度のさらなる増大によっては、実際には、シグナル強度が低下する、また、ＤＮＡ増幅の減少が原因でサイクル数（Ｃｔ）が増加するであろう。別の例として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉはアルカリ条件（例えば、低温で保存された場合のＰＣＲ緩衝液のアルカリ条件）下では化学的に不安定である。４℃のＴｒｉｓ緩衝液中で保存されたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、数日の経過で有意に分解してしまうこと、および色素の分解産物がどうやら強力な阻害剤であることが報告されている。非特許文献１１。さらに別の例として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによっては、１つの蛍光色しか提供されない。多くの市販されている蛍光検出機器は、複数の光チャンネル（ＦＡＭ光チャンネルとさらに他の光チャンネル）を有しており、したがって、複数の蛍光色を検出することができる。
【特許文献１】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３８，８４８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２５８，５６９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６９１，１４６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９２５，５１７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１１８，８０１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３１２，７２８号明細書
【特許文献８】米国特許第６，６３５，４２７号明細書
【特許文献９】米国特許第５，４３６，１３４号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６５８，７５１号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／０１３２０４６号明細書
【非特許文献１】Ｂａｒａｋ，ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０，５９５（１９８１
【非特許文献２】Ｕｅｄａ，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８６４（２００１）
【非特許文献３】Ｍｕｌｌｉｓ，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）
【非特許文献４】Ｓａｉｋｉ，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）
【非特許文献５】Ｈｏｌｌａｎｄ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９１）
【非特許文献６】Ｌｅｅ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）
【非特許文献７】Ｈｉｇｕｃｈｉ，ら，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０（４），４１３（１９９２）
【非特許文献８】Ｗｉｔｔｗｅｒ，ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２（１），１３０（１９９７）
【非特許文献９】Ｚｉｐｐｅｒ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（１２）、ｅ１０３（２００４）
【非特許文献１０】Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（８），ｅ４５（２００３）
【非特許文献１１】Ｋａｒｓａｉ，ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２（４），７９０（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
蛍光色素の開発、またはその作成もしくは使用が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
有用な用途（例えば、ｑＰＣＲプロセスにおける用途）に適している蛍光色素を生産または設計する方法が提供される。この方法には、柔軟であり、そして実質的には中性（例えば、中性またはわずかに電化を有している）であり得る架橋を介して、２つまたは３つ以上の単量体色素を共有結合させることが含まれる。本明細書中で提供される色素を生産または設計する方法により、これまでは得ることができなかった波長および／または他のスペクトル特性を有している蛍光核酸色素の開発が可能となり得る。
【００１５】
有用な用途（例えば、上記に記載された用途）に適している蛍光色素が提供される。二量体または三量体色素（本明細書中に記載される方法にしたがって生産することができる）はエアピンは構造を形成することができ、これにより、本明細書中にさらに記載されるように、色素がリリースオンデマンド（ｒｅｌｅａｓｅ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）機構により核酸を染色することができるようになると考えられる。本明細書中に記載される色素は、以下の特徴の少なくとも１つ、または以下の特徴の全てを有し得る：存在するとしても、比較的低い「蛍光バックグラウンド」（核酸が存在しない条件下での蛍光）、そして理想的には、蛍光バックグランドはない；比較的低いＰＣＲ阻害、そして理想的には、ＰＣＲ阻害はない；比較的高い蛍光シグナル強度；および比較的高い安定性。色素は、これらの特徴の少なくとも１つ、またはこれらの特徴の全てに関して、既存の色素（例えば、単なる例であるが、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）よりも優れているであろう。本明細書中に記載される色素は、例えば、これまでは得ることができなかった波長および／または別のスペクトル特性のような特性を有している場合がある。
【００１６】
分子内二量体形成、またはヘアピン構造を形成することができる二量体および／または三量体核酸色素または染色が提供される。ヘアピン型の色素は、それ自体は非蛍光であるか最少にしか蛍光を発しないが、核酸の存在下では高い蛍光を生じるようになり得ると考えられる。色素の核酸への結合は、中間状態を通じて起こり得、この場合、色素は、一部が、オープンランダム立体構造（ｏｐｅｎ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を形成していると考えられる。さらに、この色素のオープンランダム立体構造は、少量で存在し得、そしてヘアピン状態と平衡状態にあると考えられる。核酸の量が増加すると、ヘアピン状態から色素の核酸に結合した状態への平衡のシフトが起こり得、その結果、得られる蛍光シグナルの強度は、存在する核酸の量に実質的に直線的に比例し得ると考えられる。
【００１７】
上記の機構は、ＤＮＡ染色のリリースオンデマンド機構と呼ぶことができ、様々な用途（例えば、定量的、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ））に望ましい場合がある。単なる説明ではあるが、ヘアピン構造の形成は、「有効色素濃度」を下げることができ、その結果、本明細書中に記載される色素は、ＰＣＲプロセスをほとんど妨害しないであろうと考えられる。したがって、以前の色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）と比較すると、本明細書中に記載される色素の高い濃度をｑＰＣＲにおいて使用することができる。色素のこの高い濃度により、ＤＮＡ検出感度が、おそらくは有意に高くなり得る。
【００１８】
試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法が提供される。試料には、標的核酸が含まれている場合も、また含まれていない場合もある。このような方法には、試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程が含まれる。この場合、蛍光核酸色素は以下の式を有する：
【００１９】
【化３８】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約８個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーである；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である。色素構成成分は、例えば、本明細書中に記載されるもののような、任意の適切な色素構成成分であり得る。単なる例としてではあるが、蛍光核酸色素構成成分は、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択することができる。Ｑ１色素構成成分とＱ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり、そして、Ｑ１色素構成成分とＱ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分である。レポーター色素構成成分と蛍光核酸色素構成成分は同じである場合も、また異なる場合もある。この方法には、標的核酸の増幅のために十分である試験溶液を使用してプロセスを実行する工程が含まれ得る。試料には、標的核酸が含まれるはずである。単なる例としてではあるが、このプロセスはＰＣＲプロセス、例えば、リアルタイムＰＣＲプロセスであり得る。この方法には、レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程が含まれ得る。
【００２０】
試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する別の方法が提供される。試料には、標的核酸が含まれる場合も、また含まれない場合もある。このような方法には、試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程が含まれる。この場合、蛍光核酸色素は以下の式を有する：
【００２１】
【化３９】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーである；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である；Ｑ３は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分である。色素構成成分は、例えば、本明細書中に記載されるもののような、任意の適切な色素構成成分であり得る。単なる例としてではあるが、蛍光核酸色素構成成分は、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択することができる。Ｑ１色素構成成分、Ｑ２色素構成成分、およびＱ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり、そして、Ｑ１色素構成成分、Ｑ２色素構成成分、およびＱ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分である。レポーター色素構成成分と蛍光核酸色素構成成分は同じである場合も、また異なる場合もある。この方法には、標的核酸の増幅のために十分である試験溶液を使用してプロセスを実行する工程が含まれ得る。試料には、標的核酸が含まれるはずである。単なる例としてではあるが、このプロセスはＰＣＲプロセス、例えば、リアルタイムＰＣＲプロセスであり得る。この方法には、レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程が含まれ得る。
【００２２】
上記で提供された式においては、ＢＲＩＤＧＥは、すぐ下に示される式を有している場合がある。
【００２３】
【化４０】
【００２４】
【化４１】
この式においては、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基であり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数であり；そして、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数である。ＢＲＩＤＧＥには、適切な数の水素以外の原子、例えば、単なる例ではあるが、約８個から約１００個または約１５０個（８、１００、１５０を含む）、約１２個から約６０個（１２、６０を含む）、または約１５個から約４０個（１５、４０を含む）が含まれ得る。ＢＲＩＤＧＥは、例えば、本明細書中に記載される任意のもののような、任意の適切なリンカー分子であり得る。１つの例においては、ＢＲＩＤＧＥは以下の式を有する：
【００２５】
【化４２】
式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；αは２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり；ｂは０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、ｃは０または１である。
【００２６】
上記方法に関連する組成物もまた提供される。単なる例ではあるが、すぐ下に提供される構造のいくつかの色素が提供される。
【００２７】
【化４３】
【００２８】
【化４４】
上記の色素の構造においては、Ψは陰イオン（例えば、単なる例ではあるが、ヨウ化物または塩化物陰イオン）を示す。
【００２９】
すぐ下に示される式を有している組成物もまた提供される。
【００３０】
【化４５】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーである；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分あり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分であり；そして、Ｒｒは、反応基または官能基である。反応基または官能基は、例えば、本明細書中に記載されるもののような、適切なそのような基のいずれかであり得る。組成物は、例えば、本明細書中に記載されるものいずれかのような、任意の適切な組成物であり得る。組成物または色素を使用する方法には、組成物を基質分子（例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、および固体表面の分子から選択される基質分子）に結合させる工程が含まれ得る。
【００３１】
試料（核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある）を調製する方法もまた提供される。この方法には、試料と組成物または色素（例えば、本明細書中に記載されるもの）の混合物を提供する工程が含まれ得る。ここでは、試料中に核酸が存在する場合は、核酸−色素錯体が形成される。この方法には、さらに、混合物をインキュベートする工程が含まれる場合がある。試料中の核酸の存在またはそれが存在しないことを決定する方法もまた提供される。この方法には、試料と組成物または色素（例えば、本明細書中に記載されるもの）の混合物を提供する工程（ここでは、試料中に核酸が存在する場合は、核酸−色素錯体が形成される）；十分な波長の光で混合物を照射する工程であって、その結果、核酸錯体を形成されると、光がそれによって吸収される工程；ならびに、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程が含まれる。試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するためのキットもまた提供される。キットには、試料中の標的核酸の増幅に十分な少なくとも１つの組成物が含まれ得、試料には、標的核酸と組成物または色素（例えば、本明細書中に記載されるもの）が含まれていなければならない。
【００３２】
これら、および様々な他の態様、特徴、および実施形態が本明細書中にさらに記載される。
【００３３】
様々な態様、特徴、および実施形態の詳細な説明が、以下に簡単に記載される添付の図面を引用して本明細書中に提供される。図面は具体例であり、必ずしも同一縮尺ではない。図面は様々な態様または特徴を示しており、そして全体または一部において、１つ以上の実施形態または実施例を具体的に説明している場合がある。特定のエレメントまたは特徴をいうために１つの図面の中で使用される引用される数字、文字、および／または記号は、類似のエレメントまたは特徴をいうために別の図面の中で使用される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（説明）
様々な用途（例えば、核酸の検出）に有用であり得る蛍光色素または染色が本明細書中で記載される。このような色素は、例えば、二量体または三量体の核酸色素であり得、核酸が存在しない場合には低いバックグラウンドの蛍光を有しており、そして核酸の存在下では、高い蛍光を発するようになる。二量体および三量体の核酸色素は、様々な用途（例えば、本明細書中に記載されるような核酸の検出）に有用であり得る。蛍光色素または染色の調製ならびに使用に関する方法もまた、蛍光色素または染色を含む有用なシステムまたはキットと同様に、本明細書中に記載される。
【００３５】
本明細書中では、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、単数形で表現される用語にはその複数形の対応物が含まれ、そして複数形で表現される用語にはその単数形の対応物が含まれることが理解されるであろう。さらに、本明細書中に記載される任意の所定の成分について、その成分についての可能性のある候補または列挙される別のものの任意のものが、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、通常は、個別に、あるいは、別のものと組み合わせて使用され得ることが理解されるであろう。加えて、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、このような候補または別のものの任意のリストは単なる例にすぎず、限定ではないことが理解されるであろう。なおさらに、本明細書中に示される任意の図面または数字はおおよそであること、そして任意の数的範囲には、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、用語「包括（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）または同様の表現が存在するかしないかにはかかわらず、範囲を定義する最小数と最大数が含まれることが理解されるであろう。加えて、任意の許容される、制約のない、または制限のない言語には、暗黙のうちにもしくは説明によって理解されるか、または別の場所に明記されていない限りは、それぞれ、制限された言語に対して任意の比較的許容されている、制約のある言語に対して比較的開かれている、または制限のない言語に対して制限のない言語が含まれる。単なる例ではあるが、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）には、「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「原則として〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および／または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」型の言語が含まれ得る。
【００３６】
様々な用語が、理解を容易にするために以下に一般的に記載されるか、または本明細書中で使用される。これらの様々な用語の対応する一般的記載が、これらの様々な用語の対応する語学上または文法上のバリエーションまたは形態に対しても適用されることが理解されるであろう。以下の任意の用語の一般的な記載は、用語が通常ではない様式またはより特異的な様式で使用される場合には適用されない場合も、また完全には適用できない場合もあることも理解されるであろう。本明細書中で使用される技術用語または本明細書中で提供される記載（例えば、様々な実施形態に関するもの）は限定ではないことも理解されるであろう。さらには、本明細書中に記載される実施形態または本明細書中に記載される用途は、これらが変化し得るため、限定ではないことが理解されるであろう。
【００３７】
一般的には、用語「染色」および「色素」は同義的に使用することができ、そして約２５０ｎｍから約１，２００ｎｍまでのスペクトル範囲の光を吸収することができる芳香族分子を意味する。通常、用語「色素」は蛍光色素、非蛍光色素、またはそれらの両方を意味することができる。一般的には、用語「蛍光色素」は、適切な波長の別の光によって励起させられると光を放射することができる色素を意味する。
【００３８】
一般的には、用語「蛍光消光剤」は、別の蛍光分子の蛍光を消光させることができる分子を意味する。蛍光の消光は、３つの方法の少なくとも１つによって起こり得る。第１のタイプの蛍光の消光は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって起こる（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．（１９４８）；およびＳｔｒｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６７））。この場合、消光剤は蛍光分子からの放射光を吸収する。ＦＲＥＴ消光剤の吸収ピークは、通常、有効な蛍光消光剤であるＦＲＥＴ消光剤についての蛍光色素の放射ピークと有意に重複している。ＦＲＥＴ消光剤は、通常は、非蛍光色素であるが、蛍光色素であってもよい。消光剤が蛍光色素である場合には、色素の吸収特性だけが利用される。第２のタイプの蛍光の消光は、光によって誘導される電子移動（ＰＥＴ）によって起こる。この場合、消光剤は、電子を多く含む分子であり、電気的に励起された色素に対して電子を移動させることによって蛍光分子の蛍光を消光させる。第３のタイプの蛍光の消光は、色素の凝集（例えば、Ｈ−二量体の形成）によって生じる。この場合、２つ以上の色素分子が互いに物理的に接触し、それによって分子の振動モードの中に電子エネルギーを消滅させる。このタイプの接触による蛍光の消光は、２つの同じ蛍光色素の間で起こる場合も、また、２つの異なる蛍光色素の間で起こる場合も、また、蛍光色素とＦＲＥＴ消光剤の間で起こる場合も、また、蛍光色素とＰＥＴ消光剤の間で起こる場合もある。他のタイプの蛍光消光剤としては、一般的には使用されていないが、安定なフリーラジカル化合物、および特定の重金属錯体が挙げられる。
【００３９】
通常、用語「核酸」は、二本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖のＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および／またはそれらの誘導体を意味する。核酸は自然界に存在しているものである場合も、また、合成のものである場合もある。
【００４０】
一般的には、用語「蛍光核酸染色」または「蛍光核酸色素」は、蛍光色素−核酸錯体を形成するように核酸に結合することができる色素を意味する。蛍光核酸色素は、通常、それ自体は非蛍光であるか弱い蛍光しか発しないが、核酸と結合すると高度に蛍光を発するようになる。一般的には、用語「非蛍光核酸結合分子」は核酸結合分子を意味し、これは色素である場合も、また、色素ではない場合もあり、そして核酸に結合しても蛍光を発するようにはならない。一般的には、用語「蛍光ＤＮＡ色素」は、ＤＮＡに結合すると蛍光を発するようになる色素を意味する。一般的には、用語「蛍光非核酸色素」は、核酸に結合しない蛍光色素を意味する。一般的には、用語「非蛍光非核酸色素」は、蛍光を発することがなく、そして核酸に結合することもない色素を意味する。このような色素は、まとめて、蛍光消光剤と呼ばれる。多くの場合、蛍光消光剤は、蛍光色素とＦＲＥＴ対を形成するように使用される。通常は、用語「レポーター色素」は、それが放射する蛍光が最終的に検出される蛍光シグナルに寄与する蛍光色素を意味する。
【００４１】
一般的には、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの量を増幅させるための技術を意味する。通常、用語「定量的リアルタイムＰＣＲ」すなわち「ｑＰＣＲ」は、ＰＣＲの過程においてＤＮＡ量の増加をモニターするための技術を意味する。
【００４２】
一般的には、蛍光核酸色素は、２つの主要なクラス（挿入剤および小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒ））に分類することができる。一般的には、蛍光挿入剤は色素であり、隣接している塩基の間にそれ自体を挿入することによって、二本鎖のＤＮＡまたは二本鎖のＲＮＡに結合する。通常、小溝結合剤は色素であり、これは二本鎖ＤＮＡの小溝に結合する。複数の形式（正電荷を有している色素と負電荷を有している核酸との間での静電気相互作用を含む）によって核酸に結合することができるさらに他の色素が存在している。
【００４３】
様々な蛍光核酸色素が市販されており、そしてｑＰＣＲ以外の使用のために色素を改良するための方法が開発されているが、全てではないが複数の核酸染色がｑＰＣＲの用途に適している。加えて、どのような構造エレメントが良好なｑＰＣＲ色素に必要であるかはほとんど知られていない。
【００４４】
一般的には、性能の観点から、ｑＰＣＲのための理想的な色素は、本明細書中に記載されるように様々な基準を満たしていなければならない。色素は、ＰＣＲ緩衝液中での高温（約６０℃から約９６℃）で熱安定性でなければならず、そして媒体がアルカリ性となる低温（約−２０℃から約４℃）では加水分解に対して安定でなければならない。色素は、ＰＣＲプロセスを阻害してはならない。これは、ＰＣＲの阻害の最も深刻な場合にはＰＣＲプロセスが開始すらされない場合があり、そしてより穏やかな場合においても、Ｃｔ数が遅れるか、または極めて低い色素濃度しか使用することができず、結果として蛍光シグナルが限られてしまうため、一般的には最も重要な基準である。色素は、ＤＮＡが存在しない条件下では非蛍光であるかまたは最少の蛍光しか発してはならないが、ＤＮＡの存在下では高度に蛍光を発するようにならなければならない。色素の吸収波長と放射波長は、ｑＰＣＲと組み合わせて使用される機器（例えば、上記に記載された既存の機器）と適合しなければならない。色素のＤＮＡ結合は、配列に好みがほとんどないか、または好みは全くなければならない。ＤＮＡ−色素錯体の蛍光強度は、存在するＤＮＡの量に直線的に相関していなければならない。本明細書中に記載される色素は、上記の基準の１つ以上を満たしている場合も、または１つ以上を満たしていない場合もある。
【００４５】
蛍光核酸色素（例えば、ｑＰＣＲに適している蛍光核酸色素）を設計するための方法が提供される。この方法には、２個または３個の単量体色素を適切なリンカーを用いて共有結合させて、二量体色素または三量体色素を形成させる工程が含まれる。本明細書中に記載される色素は、溶液中に存在する場合は、分子内二量体の形成が原因で、主にヘアピン様の立体構造をとり得る。色素のこのヘアピン様の立体構造または状態は核酸に関しては不活性であるか、または核酸と相互作用することはできない。色素は、溶液中に存在し、核酸の存在下では、オープンランダムな立体構造（ｏｐｅｎ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）または状態もとり、これは、少量でしか存在せず、ヘアピン立体構造と実質的に平衡状態にあると考えられる。色素のこのオープンランダムな立体構造または状態は、核酸に関して活性であるか、または核酸と相互作用もしくは結合できる。色素が漸増量の核酸の存在下にある場合には、ヘアピン状態から中間のオープンランダムな状態、またはＤＮＡに結合した状態への平衡のシフトが起こると考えられる。この機構は、しばしば、「リリースオンデマンドＤＮＡ結合機構」と呼ばれ、他の方法で色素が関係している可能性があるＰＣＲの阻害を減少させると考えられている。結果として、色素は、別の方法で可能であるよりも高い濃度でＰＣＲプロセスにおいて使用することができ、したがって、別の方法で可能であるよりも高い核酸検出感度を提供するであろう。ＰＣＲ阻害の減少は劇的であり得、そして核酸検出感度の増大は有意であり得る。
【００４６】
本明細書中に記載される二量体色素または三量体色素は、任意の数の望ましい特性を有し得る。例として、このような色素は、その単量体色素構成成分のバックグラウンド蛍光と比較すると低いバックグラウンド蛍光を有している場合がある。比較的低いバックグラウンド蛍光は、通常、比較的高い核酸検出感度に対応している。したがって、このような色素は、通常、高い核酸検出感度と関係している。さらなる例として、本明細書中に記載される色素は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも熱的におよび／または加水分解に対して安定である場合がある。なおさらなる例としては、本明細書中に記載される色素は、既存のｑＰＣＲ色素が関係している波長以外の吸収および放射波長を有している場合がある。
【００４７】
蛍光二量体核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造１）を有し得る。
構造１
【００４８】
【化４６】
構造１においては、色素Ｑ１および色素Ｑ２はそれぞれ独立して、蛍光核酸色素、非蛍光核酸色素、蛍光非核酸色素、および非蛍光非核酸色素から選択される。Ｑ１およびＱ２は、得られる二量体色素の所望される特性を促す、または確実にするような様式で選択され、組み合わせられ得る。色素Ｑ１および色素Ｑ２の少なくとも一方の色素はレポーター色素である。さらに、色素Ｑ１と色素Ｑ２の少なくとも一方の色素は、蛍光核酸色素または非蛍光核酸色素である。レポーター色素と蛍光核酸色素は同じである場合も、また異なる場合もある。ＢＲＩＤＧＥは比較的限られた程度の正電荷を有している場合も、また、電荷に関しては実質的には中性である場合もあり、そして二量体色素を生じるように分子内二量体の形成を促進する実質的に柔軟な構成成分であり得る。
【００４９】
蛍光三量体核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造２）を有し得る。
構造２
【００５０】
【化４７】
構造２においては、色素Ｑ１、色素Ｑ２、および色素Ｑ３はそれぞれ独立して、蛍光核酸色素、非蛍光核酸色素、蛍光非核酸色素、および非蛍光非核酸色素から選択される。Ｑ１、Ｑ２およびＱ３は、得られる三量体色素の所望される特性を促す、または確実にするような様式で選択され、組み合わせられ得る。色素Ｑ１、色素Ｑ２、および色素Ｑ３の少なくとも１つの色素はレポーター色素である。さらに、色素Ｑ１、色素Ｑ２、および色素Ｑ３の少なくとも１つの色素は、蛍光核酸色素または非蛍光核酸色素である。レポーター色素と蛍光核酸色素は同じである場合も、また異なる場合もある。ＢＲＩＤＧＥは比較的限られた程度の正電荷を有している場合も、また、電荷に関しては実質的には中性である場合もあり、そして三量体色素を生じるように分子内二量体の形成を促進する実質的に柔軟な構成成分であり得る。
【００５１】
蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造３）を有し得る。
構造３
【００５２】
【化４８】
構造３においては、色素Ｑ１、色素Ｑ２の色素はそれぞれ独立して、構造１および構造２に関して上記に記載されたものと同様であり得る；ＢＲＩＤＧＥは、先に記載されたように、実質的には脂肪族のリンカーである；そしてＲｒは、反応基または官能基であり得る。単なる例としてではあるが、Ｑ１は蛍光核酸色素構成成分であり得；Ｑ２は蛍光核酸色素構成成分であり得；ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーであり得；そしてＲｒは、本明細書中に記載されるように、反応基または官能基である。
【００５３】
ＢＲＩＤＧＥ
ＢＲＩＤＧＥは、わずかに１つの正電荷を有している、実質的に柔軟なリンカー分子であり得る。ＢＲＩＤＧＥは実質的には中性であり得、実質的には柔軟なリンカー分子であり得る。ＢＲＩＤＧＥの構成成分は、そのような限られた正電荷、またはそのような実質的な中性が得られるように選択され得る。実質的な中性（実際の中性を含む）の特性は以下でさらに議論される。実質的な柔軟性の特性は、一般的には、ＢＲＩＤＧＥの実質的な脂肪族の性質（実際の脂肪族の性質を含む）と関係している。この実質的に脂肪族の性質は、一般的には、ＢＲＩＤＧＥの非芳香性、またはＢＲＩＤＧＥの非剛性を意味する。
【００５４】
構造１においては、ＢＲＩＤＧＥは、Ｑ１およびＱ２に共有結合させられている。二量体色素の場合には、ＢＲＩＤＧＥは、例えば、約８個から約１５０個までの水素以外の原子、約８個から約１００個までの水素以外の原子、約１２個から約６０個までの水素以外の原子、または約１５個もしくは約２０個から約４０個もしくは約５０個までの水素以外の原子を有し得る。構造２においては、ＢＲＩＤＧＥは、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３に共有結合させられている。三量体色素の場合には、ＢＲＩＤＧＥは、例えば、約１５個から約１５０個までの水素以外の原子、約２０個から約１５０個までの水素以外の原子、約２０個から約１００個までの水素以外の原子、または約３０個から約７０個までの水素以外の原子を有し得る。
【００５５】
ＢＲＩＤＧＥには、少なくとも１つの無関係な核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）を組み込むことができる。ＮＡＢＥＧは、静電気相互作用、疎水性相互作用、または水素結合相互作用の形態で核酸に結合することができる部分である。単なる例としてではあるが、ＮＡＢＥＧは、第１級アミン：第２級アミン；第３級アミン；アンモニウム；アミジン；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択されるヘテロ原子が含まれているアリール基、およびそれらの任意の組み合わせ；高い電気陰性度のヘテロ原子が含まれている結合を有している部分；ならびに、それらの任意の組み合わせから選択することができる。
【００５６】
第１級、第２級、および第３級アミン、ならびにアミジンは塩基性基であり、したがって、生理学的ｐＨでは、正電荷を有しているか、または少なくとも部分的に正電荷を有している。アンモニウム基または４級化窒素基は、永久的な正電荷を有している。一般的に言えば、正電荷を有している、または部分的に正電荷を有している基は、感度が高い蛍光核酸染色の開発において利用することができる特性である、静電気相互作用による色素の核酸結合を増強させる。本発明の色素を生産するためには、過剰な正電荷を有しているＢＲＩＤＧＥを使用することは、通常は望ましくない。例えば、本発明の二量体色素または三量体色素の適切なＢＲＩＤＧＥには、わずかに１つの正電荷が含まれる場合がある。ＢＲＩＤＧＥは実質的に柔軟な、中性のリンカーであり得るか、または、実質的に中性のリンカーであり得る。この状況においては、実質的な中性は、わずかな電荷を意味する。例として、ＢＲＩＤＧＥには、弱い塩基性の構成成分（例えば、ピリジン基またはピラジン基）を含めることができ、その結果、これが水溶液中に存在する場合には、極めて少量の正電荷が存在し得る。さらなる例として、ＢＲＩＤＧＥに少なくとも１つのＮＡＢＥＧが含まれる場合（状況に応じて）は、正電荷の正確な量は、一般的には、ＮＡＢＥＧのｐＫａに関係し得る。通常、ＮＡＢＥＧのｐＫａが高ければ高いほど、ＮＡＢＥＧはより多くプロトン化され、したがって、より大きな正電荷を有する可能性がより高くなる。例として、適切な弱塩基性のＮＡＢＥＧ基は、約１１またはそれ未満、約８またはそれ未満、あるいは、約７またはそれ未満のｐＫａを有し得る。
【００５７】
分子内二量体（主に、Ｈ−二量体）を形成する傾向があり得る。これは、生産される核酸色素において特に有用な特性であり得る。例えば、本明細書中に記載される二量体色素の場合は、Ｈ−二量体の形成によりヘアピン様構造が生じ得る。ここでは、図１に模式的に示されるように、Ｈ−二量体はヘアピンのステム部分を形成し、ＢＲＩＤＧＥは湾曲した部分を形成する。特定の色素に関するＨ−二量体の形成の表現形が、Ｗｅｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９６５）；Ｒｏｈａｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９６６）；Ｒｏｈａｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．（１９７１）；およびＫｈａｉｒｕｔｄｉｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）に記載されている。分子内Ｈ−二量体の形成は、ＢＲＩＤＧＥが柔軟であり中性であるか、または実質的に中性の炭化水素リンカー（状況に応じて、１つ以上のＮＡＢＥＧが含まれている）場合に、促進され得る。
【００５８】
Ｈ−二量体の形成は、色素吸収スペクトルの大きな青色のシフトを特徴とし得る。例として、単量体色素ＡＯ（アクリジンオレンジ）および関連する二量体色素ＡＯＡＯ−７（分子内二量体を形成する）の吸収スペクトルが図２に示される。ＡＯＡＯ−７二量体に関する４７１ｎｍでのピークは、分子内Ｈ−二量体の形成を示している。単量体および二量体のいずれの吸収スペクトルも、ＤＮＡ結合が生じると同様のものとなり、これは、ヘアピン構造が開かれていることを示している。例として、図３に示されるように、ＡＯＡＯ−７二量体から４７１ｎｍでのピークが消滅することは、ＤＮＡに結合するとヘアピン構造が開かれることを示している。
【００５９】
本明細書中に記載される色素のＨ−二量体の形成は、２つの主要な利点を伴う場合がある。１つの主要な利点は、蛍光シグナルの大幅な増加によって明らかにされるように、ＤＮＡと結合した際の蛍光の実質的な増加と組み合わせた、バックグラウンドの蛍光の、多くの場合は劇的である減少である。この利点は、単量体アクリジンオレンジ色素であるＤＭＡＯ、および二量体アクリジンオレンジ色素であるＡＯＡＯ−７の蛍光スペクトルを、ＤＮＡが存在しない条件とＤＮＡの存在下で比較することによって明らかにすることができるであろう。例えば、図４に示されるように、単量体ＤＭＡＯ色素と比較すると、二量体ＡＯＡＯ−７色素は、低いバックグラウンドの蛍光と、ＤＮＡに結合した際には、高い蛍光を伴う。
【００６０】
分子内二量体による蛍光の消光は、本明細書中に記載される色素が、少なくとも１つの単量体色素（非常に望ましいとは通常は考えられない）（例えば、高いバックグラウンドの蛍光を有している少なくとも１つの単量体色素）から構築される場合があるため、効果的であり得る。１つのこの例は図４に示される。これはアクリジンオレンジ（ＡＯ）およびその二量体を特徴とする。ＡＯは最初に明らかになった核酸結合色素の１つであり。望ましい波長を有しているが、その比較的高いバックグラウンドの蛍光の理由から、核酸の検出については広くは使用されていない。図４に示されるように、単量体ＡＯ色素と比較すると、二量体色素ＡＯＡＯ−７は、はるかに低いバックグラウンドの蛍光を有する。
【００６１】
Ｈ−二量体の形成は、分子間相互作用ではなく、分子内相互作用によって起こる。Ｈ−二量体の形成は、２つまたは３つの色素（例えば、所望される単量体色素の対）の共有結合によって起こる。Ｈ−二量体の形成は比較的簡単に完成され得、これには、さらなる試薬（例えば、色素の有用な用途を妨害する可能性がある別の試薬）の添加は必要ない。例として、二量体色素は、１つの核酸結合色素構成成分と１つの非核酸結合蛍光色素構成成分を溶液の中で対合させることにより、さらなる試薬を使用することなく形成させることができる。さらなる例として、三量体色素は、溶液中の２つの核酸結合色素構成成分と１つの非核酸結合蛍光色素構成成分から、さらなる試薬を使用することなく調製することができる。Ｈ−二量体の形成によっては、非ＤＮＡ結合状態で色素を捕捉するために有用な方法が提供される。これにはＰＣＲに対する阻害作用はなく、そしてこれは、ＤＮＡが存在する場合にのみ、オープンランダムな状態またはＤＮＡ結合状態へとシフトする。したがって、有効色素濃度またはオープンランダムな状態にある色素の濃度は、高い全色素濃度がｑＰＣＲ感度を高めるために使用される場合にもなお、低く保つことができる。
【００６２】
上記のように、本明細書中に記載される色素の中でのＨ−二量体の形成は、別の主要な利点を伴う場合もある。この予想外の利点は、色素の中でのＨ−二量体の形成によって、ｑＰＣＲの用途においてＰＣＲに対する色素の阻害作用を有意に減少させることができることである。例として、通常、所定の濃度のＤＮＡ試料については、蛍光ＤＮＡ色素からの蛍光シグナルは、色素が飽和するまでは色素濃度に比例する。例として、色素濃度が高ければ高いほど、ＤＮＡ−色素錯体の形成はより多くなる。したがって、色素が飽和するまでは、より多く、またはより明るい蛍光となる。したがって、理想的には、ｑＰＣＲの用途における最大感度のためには、十分に高い色素濃度を用いて開始することが望ましいであろう。しかし、実際は、ｑＰＣＲにこれまでに使用されてきた全てのＤＮＡ色素は、様々な程度でＤＮＡの増幅プロセスを阻害する。典型的には、このようなこれまでの色素のより高い濃度は、増幅またはＰＣＲプロセスの色素によるより大きな阻害を伴う。したがって、このようなこれまでの色素の濃度は、通常、非ｑＰＣＲの用途についての濃度よりも、ｑＰＣＲの用途についてははるかに低くなってしまっている。
【００６３】
ｑＰＣＲの用途における色素濃度のこの低下によっては、ｑＰＣＲに最も広く使用されるＤＮＡ色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）の以下の議論から明確に理解できるように、終点蛍光シグナル強度の犠牲が生じる。ｑＰＣＲにおいて使用されるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １の濃度は製造業者によっては提供されておらず、結果として、他の色素との正確な比較は容易ではなく、日常的な方法で行うことはできない。しかし、色素の濃度がＢｅｅｒの法則（Ｂｅｅｒ’ｓ ｌａｗ）に従いその光学密度と直線的な関係にあるため、ｑＰＣＲにおいて使用されるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １溶液、およびｑＰＣＲにおいて使用される別の色素溶液の光学密度の特性を、それぞれの濃度を少なくとも定性的に比較するために使用することができる。例えば、ｑＰＣＲにおいて使用されるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １溶液についての典型的な光学密度は、０．０２５から０．０５であるが、一方、ｑＰＣＲに使用される本明細書中の表２のＤｙｅ Ｎｏ．１９の溶液についての光学密度は、通常は、約０．０４から約０．８、またはより典型的には、約０．１から約０．４である。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素は、色素濃度が、０．５×の濃度（これは、４９５ｎｍの吸収ピークでの０．０２５の光学密度に対応する）から１×の濃度（これは、同じ吸収ピークでの０．０５の光学密度に対応する）に増大すると有意な阻害作用を示す。図８に示されるように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは１×の濃度では０．５×濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと比較すると、より高い終点蛍光シグナルを有しているが、１×の色素濃度に付随するサイクル数、またはＣｔ値は遅れる。この遅れたＣｔ値は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが、より高い濃度ではＰＣＲを有意に阻害することを示している。二量体色素ＡＯＡＯ−１２は、色素濃度が、１×の色素濃度（これは、４７１ｎｍの吸収ピークでの０．１の光学密度に対応する）から２×の色素濃度（これは、同じ吸収ピークでの０．２の光学密度に対応する）に上昇しても、阻害をほとんど示さないか、または全く阻害を示さない。ＡＯＡＯ−１２はＰＣＲの阻害をほとんど示さないかまたは全く示さないため、これは、比較的高い濃度で使用することができ、そして図９に示されるように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光シグナルよりも数倍高くなり得る蛍光シグナルを提供する。簡単に説明すると、ＡＯＡＯ−１２は、広範な濃度においてＰＣＲ阻害をほとんど示さないかまたは全く示さず、したがって高い蛍光シグナルのためにより高い濃度で使用することができる。
【００６４】
本明細書中に記載される色素に付随する可能性があるＰＣＲ阻害が上記のように実質的にはないことにより、より高い色素濃度を使用することができ、これは、図１に模式的に示される「リリースオンデマンド」機構によって説明することができると考えられる。すなわち、溶液中では、二量体色素は、図１に示されるように、閉じたヘアピン立体構造とオープンランダムな立体構造の間での動的平行状態として存在しているト考えられる。一般的には、ヘアピン立体構造は、オープンランダムな立体構造よりもはるかに安定であり、そして優勢である。色素のヘアピン立体構造の優勢は、紫外線／可視光線スペクトルによってサポートされる。これは、単量体スペクトルと比較して、二量体スペクトルの実質的なシフトを示す。ヘアピン立体構造は色素の不活性な形態であるが、一方、オープン立体構造は色素の活性な形態であり、ＤＮＡに結合することができる。ＤＮＡが存在する場合は、オープン立体構造の色素はＤＮＡに結合した立体構造へとシフトし、ヘアピン立体構造であるより多くの色素は、オープン立体構造へとシフトする。そして、オープン立体構造の色素は非常に低い濃度のままとなる。言い換えると、色素の大部分はＤＮＡに結合していないヘアピン立体構造で捕捉され、そして、より多量のＤＮＡの存在に反応して、オープン立体構造またはＤＮＡ結合形態に対してのみ放出される。この「リリースオンデマンド」機構により、ＰＣＲプロセス自体には有害な影響を与えることなく、比較的高い濃度で色素を使用することが可能となる。本明細書中に記載される色素とは異なり、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、色素の有効濃度を下げることを助ける非ＤＮＡ結合立体構造を有してはおらず、したがって、高度な濃度依存性のＰＣＲ阻害作用を示す。
【００６５】
本明細書中に記載される核酸染色は比較的簡単であり、そして望ましい規模（例えば、数グラムから数１０グラムで測定される量）で、日常的に行われているように調製することができる。これらの核酸染色は、ＤＮＡ増幅の検出に、および比較的日常的に行われている研究の用途に、非常に広く使用することができる。例として、蛍光核酸色素は、実質的に非配列選択的様式で、または比較的一般的な様式で、ＤＮＡの存在および量を検出するために使用することができる。
【００６６】
ＢＲＩＤＧＥは、すぐ下に示される式（式１）を有し得る。
式１
【００６７】
【化４９】
式１においては、置換基Ｌ１および置換基Ｌ２（それぞれ、単純に「Ｌ」と呼ばれる場合もある）のそれぞれの置換基は、ＢＲＩＤＧＥの一部である。Ｌ１はＱ１色素構成成分およびＱ２色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており、そしてＬ２は、Ｑ１色素構成成分とＱ２色素構成成分（上記１つの色素構成成分以外のもの）の色素構成成分に共有結合させられている。Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基である。（ＣＨ２）メチレン単位の下つき文字、すなわち、α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιは同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、関連するメチレン単位の大きさを示しており、０、または１から約２０まで、または１から約１２までの整数である。式１の括弧つきの部分に伴う下つき文字、すなわち、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉは同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、式の関連する括弧つきの部分の大きさを示しており、そして、０、または１から約２０まで、または１から約１０まで、または１から約５までの整数である。
【００６８】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は同じである場合も、また異なる場合もあり、これらはそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＢＲＩＤＧＥに多くても１つの正電荷が含まれるか、またはＢＲＩＤＧＥが実質的に中性であるようなものであり得る。後者の場合には、これらの構成要素はそれぞれ独立して、それ自体が実質的に中性（実際に中性を含む）のものであり得る。ＮＡＢＥＧは、高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合（ｂｏｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ）が含まれている部分；および、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基を含む、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分から選択され得る。高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分の例としては、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている部分が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６９】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、すぐ下に示される式（式２）に示されるように、分岐Ｂ’とリンカーＬを介してＱ３に共有結合させられた分岐単位であり得る。
式２
【００７０】
【化５０】
式２においては、Ｔは、置換された炭素、置換された窒素、または状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基であり得る。Ｂ’は、すぐ下に示される式（式３）を有する。
式３
【００７１】
【化５１】
式３の−（ＣＨ２）α’は、式２のＴに共有結合させられており、そして式３のＡ１４は式２のＬ３に共有結合させられている。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、およびＡ１４はそれぞれ独立して、式１のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０のそれぞれに関して先に記載されたような、中性、または実質的に中性の核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている中性の分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり得る。（ＣＨ２）メチレン単位の下つき文字、すなわち、α’、β’、γ’、およびδ’は同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、関連するメチレン単位の大きさを示しており、そして０、または１から約２０までの整数である。式３の括弧つきの部分に伴う下つき文字、すなわち、ａ’、ｂ’、およびｃ’は同じである場合も、また異なる場合もあり、それぞれが独立して、関連する括弧つきの部分の大きさを示しており、そして、０、または１から約２０までの整数である。
【００７２】
式２においては、Ｌ３は独立して、式１のＬ構成成分のそれぞれに関して先に記載されたような、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基であり得る。得られる分子は、三量体核酸染色である。
【００７３】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、すぐ下に示される式（式４）に示されるように、分岐Ｂ’とリンカーＬ３を介して反応基Ｒｒに共有結合させられた分岐単位であり得る。
式４
【００７４】
【化５２】
式４においては、Ｔ、Ｂ’、およびＬ３は、Ｌ３がＲｒに共有結合させられていることを除き、式２および式３に関して上記に示されたものと同様に定義される。得られる分子は、上記の構造３によって示される核酸染色であり得る。
【００７５】
反応基−Ｒｒを有している色素は、適切な官能基を含むか、または適切な官能基を含むように誘導される任意の多種多様な分子を標識するために使用することができる。用語「反応基」は、「反応基」または「官能基」を意味するように使用することができ、そして、用語「官能基」は、「反応基」または「官能基」を意味するように使用することができることが理解される。いずれかの用語は、そしていずれの用語も、色素に対して結合を形成する基、または標識される基質分子上に結合を形成する基を意味する場合がある。ここでは、便宜上（限定ではないが）、色素に対して結合を形成する基が、一般的には、反応基と呼ばれ、そして、基質分子に対して結合を形成する基が、一般的には、官能基と呼ばれるであろう。単例ではあるが、反応基または官能基−Ｒｒを有している色素は、１つまでの正電荷を有し得る。
【００７６】
一般的には、基質分子に対する色素の結合は、結合した基質分子に対する色素の核酸検出特性を付与することができる。反応基および官能基は、通常は、それぞれ、求電子試薬および求核試薬であり、これらは共有結合を形成することができる。別の場合には、反応基は、紫外線での光活性化または光分解されると、炭化水素分子と反応することができる光活性させることができる基である。さらに別の場合は、反応基は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応によって結合したジエンと反応することができる求ジエンである。なおさらに別の場合は、反応基は、求ジエンと反応することができる１，３−ジエンである。なお他の反応基／官能基の対を、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ化学反応またはアジド基と末端アルキンとの間での反応（いわゆる、Ｃｌｉｃｋ化学反応）に基づいて選択することができる。単なる例ではあるが、有用な反応基、官能基、および対応する結合の例が、以下の表１に列挙される。
【００７７】
【表１】
＊活性化エステルは、当該分野で理解されているように、通常は、式−ＣＯΩを有する。式中、Ωは、良好な離脱基（例えば、スクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）、または−１−オキシベンゾトリアゾリル（−ＯＣ６Ｈ４Ｎ３））；あるいは、活性化アリールエステルを形成させるために使用されるアリールオキシ基、または電子吸引性の置換基（例えば、ニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、またはそれらの組み合わせ）によって１回以上置換されたアリールオキシ；あるいは、あるいは、無水物または混合無水物−ＯＣＯＲａもしくはＯＣＮＲａ−ＮＨＲｂ（式中、ＲａおよびＲｂは同じである場合も、また、異なる場合もあり、これらは独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６パーフルオロアルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり得る）を形成するようにカルボジイミドによって活性化させられたカルボン酸；あるいは、シクロヘキシル、３−ジメチルアミノプロピル、あるいはＮ−モルホリノエチルである。
＊＊アジ化アシルはまた、イソシアネートの位置を変えることもできる。
【００７８】
反応基は、アミン、チオール、またはアルデヒドと反応するであろうものである場合がある。反応基は、アミノ反応基（例えば、スクシンイミジルエステル）、またはチオール反応基（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド、もしくはメタンチオ−スルホネート（ＭＴＳ））、またはアルデヒド反応基（例えば、アミン、アミノオキシ、もしくはヒドラジド）であり得る。
【００７９】
反応性色素は、任意の多種多様な基質分子に結合させることができる。例えば、適切な基質は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、固体表面（例えば、シリコンウェハーの表面、ポリプロピレン基質もしくは容器の表面など）の分子であり得る。標識される分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または核酸と相互作用することができる分子であり得る。例えば、ＤＮＡ結合色素は、ｑＰＣＲの用途のためのオリゴヌクレオチドをベースとするプローブを標識するために使用されている。Ｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４９９２−７（１９９６）。
【００８０】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は同じである場合も、また異なる場合もあり、これらは独立して、高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分；および、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール基から選択されるＮＡＢＥＧであり得る。高い電気陰性度のヘテロ原子またはＳが少なくとも１つ含まれている、少なくとも１つの連結結合が含まれている部分の例としては、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている部分が挙げられるが、これらに限定はされない。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＢＲＩＤＧＥに多くても１つの正電荷が含まれるか、またはＢＲＩＤＧＥが実質的に中性であるようなものであり得る。後者の場合には、これらの構成要素はそれぞれ、それ自体が実質的に中性（実際に中性を含む）であり得る。
【００８１】
ＢＲＩＤＧＥには、先に記載されたように、任意の適切な数の水素以外の原子（例えば、約１０個から約１００個までの水素以外の原子、または例えば、二量体色素については、約１２個から約６０個までの水素以外の原子、そして、三量体色素については、約２０個から約１００個までの水素以外の原子）が含まれ得る。例えば、ＢＲＩＤＧＥには、二量体色素については、約１５個から約４０個の水素以外の原子が含まれ得、そして三量体色素については、約３０個から約７０個までの水素以外の原子が含まれ得る。
【００８２】
単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥは、すぐ下に示される式（式５）を有し得る。
式５
【００８３】
【化５３】
１つのこのような場合においては、例えば、ＢＲＩＤＧＥのＬ１は−（ＣＨ２）Ｘ−であり、そしてＢＲＩＤＧＥのＬ２は−（ＣＨ２）Ｘ−である。式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；ＢＲＩＤＧＥのＡ１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり；ＢＲＩＤＧＥのａは１であり、ＢＲＩＤＧＥのＡ２は−Ｏ−であり；ＢＲＩＤＧＥのＡ３は−Ｏ−であり；αは、２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり得；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり得；ｂは０または２から約２０までから選択される整数であり得；そしてｃは０または１であり得；ＢＲＩＤＧＥのｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ０であり、そしてＢＲＩＤＧＥのＡ１０は−ＮＨ（Ｏ＝Ｃ）Ｃ−である。単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥは、記載されたようなものであり得、式中、ｃは１である。さらに、単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥは、記載されたようなものであり得、式中、ｃは１であり、さらに、ｘは５であり得；αおよびγは同じであり得、そして２または３であり得；βは２であり得；そしてｂは０、１、２、または３であり得る。
【００８４】
単量体色素
二量体色素および三量体色素に使用される構成成分である単量体色素または機能性分子Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３のそれぞれは、別々に、以下から選択することができる：１）蛍光核酸色素；２）非蛍光核酸結合分子；３）蛍光非核酸色素；および４）非蛍光非核酸色素。一般的には、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３は、ＤＮＡが存在しない条件での分子内二量体の形成、ならびにＤＮＡに結合した場合の高度に蛍光を発するＤＮＡ−色素錯体の形成を促進または確実にする様式で選択され、そして、ＢＲＩＤＧＥを介して共有結合させられ得る。分子内二量体の形成は、先に記載されたように、二量体色素の有用なヘアピン立体構造を提供するために十分であり得る。このような二量体色素は望ましい特性（例えば、低いバックグラウンドの蛍光と低いＰＣＲの阻害）を有している場合がある。先に記載されたように、本明細書中に記載される二量体色素を比較的高濃度で使用して、望ましいまたは強い蛍光シグナルを生じさせることが可能である。
【００８５】
分子内二量体の形成は、水溶液中の二量体色素および三量体色素の吸収スペクトルを、これもまた水溶液中の関連する単量体色素の吸収スペクトルと比較することによって確認することができる。任意の分子内二量体形成色素は、関連する単量体色素のスペクトルと比較すると、二量体または三量体中の構成成分である単量体色素のスペクトルが有意にシフトすることを生じるはずである。これに関して、有意なシフトは、例えば、約１０ｎｍまたはそれ以上であり得る。例えば、図２においては、ＡＯＡＯ−７に付随するスペクトルは、ＤＭＡＯのスペクトルと比較すると有意にシフトする。
【００８６】
分子内二量体形成がＨ−二量体形成である場合には、スペクトルは、通常、有意な青色のシフトを受ける。これに関して、有意なシフトは、例えば、約１０ｎｍまたはそれ以上であり得る。他のタイプの分子内二量体の形成もまた可能であり、これによっては、別の方向でのスペクトルのシフト、構成成分である単量体色素のそれぞれについて異なる方向でのスペクトルのシフト、有意ではないスペクトルのシフトが生じる場合も、また、スペクトルのシフトが生じない場合もある。これに関して、有意ではないシフトは、例えば、約５ｎｍまたはそれ未満であり得る。一般的には有意なスペクトルのシフトが観察されない場合には、他の分析技術を、任意の分子内二量体の形成を確認するために使用することができる。このような分析技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル分析、赤外線スペクトル分析、および蛍光スペクトル分析が挙げられるが、これらに限定はされない。任意の分子内色素の凝集（これは、ヘアピン構造を生じる）が一般的には望ましい。
【００８７】
Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３の様々な組み合わせが有用であり得る場合も、また望ましい場合もある。単なる例ではあるが、二量体色素は、図１０に模式的に示されるように、Ｑ１とＱ２の５種類の様々な組み合わせによって構築することができる。さらなる例として、調製される色素と関連する中間体の例が、以下の表２に列挙される。
【００８８】
【表２−１】
【００８９】
【表２−２】
【００９０】
【表２−３】
【００９１】
【表２−４】
【００９２】
【表２−５】
表２に示された多くの構造は１つ以上のヨウ素陰イオン、任意の他の適切な陰イオン（例えば、本明細書中に記載されるもの）（例えば、単なる例ではあるが、塩化物陰イオン）を、示されるヨウ化物陰イオンの代わりに使用することができることを示している。
【００９３】
本発明の二量体色素には、蛍光核酸色素Ｑ１と蛍光核酸色素Ｑ２が含まれる場合がある。式中、Ｑ１およびＱ２は同じである場合も、また異なる場合もある。Ｑ１とＱ２が同じである場合には、得られる色素はホモ二量体（例えば、単なる例ではあるが、表２の色素番号６〜２２、２４〜２６、および２８〜３６のいずれか）である。Ｑ１とＱ２が、同様の吸収スペクトルおよび放射スペクトルを有している異なる蛍光核酸色素である場合には、得られる二量体はヘテロ二量体であり、例えば、単なる例ではあるが、表２の色素番号２３である。このようなヘテロ二量体は、ホモ二量体と機能的に類似している。いずれの場合にも、Ｑ１とＱ２はいずれもレポーター色素であり、結果として、ＤＮＡに結合すると、図１０の組み合わせＡに模式的に示されるように、これらはいずれも検出される蛍光シグナルに寄与する。あるいは、ヘテロ二量体色素には、実質的には異なる吸収スペクトルおよび放射スペクトルを有している２つの異なる蛍光核酸色素が含まれ得る。この場合、２つの色素の一方だけが、レポーター色素として選択される。
【００９４】
Ｑ１およびＱ２は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対を形成する場合がある。この場合は、より短い波長を有している色素が蛍光ドナー色素として作用し、一方、より長い波長を有している色素は、アクセプター色素もしくはレポーター色素として作用する。十分なＦＲＥＴを生じさせるためには、ドナー色素の放射スペクトルと吸収スペクトルは十分に重複している必要がある。ＦＲＥＴについてのさらなる議論は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．（１９４８）；およびＳｔｒｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６７）に提供されている。ＦＲＥＴをベースとする色素により、１つの波長での励起と、実質的にはそれよりも長い波長での蛍光の再放射が可能となる。
【００９５】
実質的にはスペクトルが異なるＱ１およびＱ２が含まれているヘテロ二量体がＦＲＥＴをベースとする色素ではない場合には、Ｑ１とＱ２のいずれか一方（同時に両方がそうであることはない）がレポーター色素として選択され得る。他のレポーターではない色素は、必要な分子内二量体の形成のためのパートナーとして作用し、そして二量体色素についてのさらなる核酸結合能力を提供する。１つのレポーター色素、蛍光核酸色素Ｑ１、および１つの非レポーター色素、非蛍光核酸結合分子Ｑ２を有しているヘテロ二量体色素の一例が、図１０の組み合わせＢに模式的に示される。
【００９６】
ヘテロ二量体色素には、非蛍光核酸結合分子Ｑ１と、蛍光非核酸色素Ｑ２が含まれ得る。ここでは、Ｑ２はレポーター色素であり、一方、Ｑ１はＤＮＡアンカー色素として、および必要な分子内二量体の形成のための対合パートナーとして作用する。このタイプのヘテロ二量体についてのＤＮＡ結合様式は、図１０の組み合わせＣに模式的に示される。
【００９７】
ヘテロ二量体色素には、蛍光核酸結合分子Ｑ１と、非蛍光非核酸色素Ｑ２が含まれ得る。このような場合は、Ｑ１はレポーター色素であり、そしてＱ２は、必要な分子内二量体の形成のための対合パートナーとして作用する。このタイプのヘテロ二量体についてのＤＮＡ結合様式は、図１０の組み合わせＤに模式的に示される。
【００９８】
ヘテロ二量体色素には、蛍光核酸結合分子Ｑ１と、蛍光非核酸色素Ｑ２が含まれ得る。Ｑ１とＱ２が類似する吸収スペクトルおよび放射スペクトルを有している場合には、Ｑ１およびＱ２の両方がレポーター色素であるが、Ｑ１だけが核酸に結合する。このタイプのヘテロ二量体についてのＤＮＡ結合様式は、図１０の組み合わせＥに模式的に示される。Ｑ１とＱ２がＦＲＥＴ対を形成する場合には、より短い波長を有している色素が蛍光ドナー色素として作用し、一方、より長い波長を有している色素は、アクセプターまたはレポーター色素として作用する。Ｑ１とＱ２のスペクトルが実質的に異なり、ＦＲＥＴ対ではない場合には、Ｑ１およびＱ２のいずれか一方（同時に両方がそうであることはない）がレポーター色素として選択され得る。この後者の場合の一例は、ヘテロ二量体ＡＯＲＯ−７（表２の色素番号２７）であり、図１２および１３に示されるように、これには、５０３ｎｍと５２３ｎｍ（ＤＮＡ）にそれぞれ吸収ピークと放射ピークを有しているＡＯと、６００ｎｍと約６２０ｎｍにそれぞれ吸収ピークと放射ピークを有しているロサミン色素が含まれている。図１４には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によるｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上でチャンネル番号３を使用することにより、レポーター色素として選択された蛍光非核酸ロサミン色素構成成分を用いた、ＡＯＲＯ−７を使用するＰＣＲ増幅プロットが示される。
【００９９】
二量体色素には、２つの同じ蛍光核酸色素、および２つの異なる蛍光核酸色素から選択される、単量体色素の対が含まれ得る。
【０１００】
三量体色素には、蛍光核酸色素Ｑ１、蛍光核酸色素Ｑ２、蛍光核酸色素Ｑ３が含まれ得る。この場合、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３は同じである場合も、また異なる場合もある。例えば、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３は、同じ蛍光核酸色素であり得る。三量体色素には、蛍光核酸色素Ｑ１、蛍光核酸色素Ｑ２、蛍光非核酸色素Ｑ３が含まれ得る。この場合、Ｑ１とＱ２は、ＤＮＡアンカー分子として作用し、そしてＱ３はレポーター色素である。本発明の三量体色素には、非蛍光核酸結合分子Ｑ１、非蛍光核酸結合分子Ｑ２、および第３の蛍光非核酸色素Ｑ３が含まれ得る。この場合、Ｑ１とＱ２は、ＤＮＡアンカー分子として作用し、そしてＱ３はレポーター色素として作用する。
【０１０１】
蛍光核酸色素、非蛍光核酸結合分子、蛍光非核酸色素、非蛍光非核酸色素、およびその例は、以下でさらに記載される。
【０１０２】
蛍光核酸色素
色素を構築するために適している単量体蛍光核酸色素の例としては、アクリジン色素、非対称シアニンをベースとする核酸染色、フェナントリジニウム色素、対照シアニン核酸染色、ＤＡＰＩの誘導体、およびＨｏｅｃｈｓｔ色素の誘導体が挙げられるが、これらに限定はされない。ＤＡＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ色素は、一般的には、これらは結合の形成のための反応基を有していないとの理由から、ＢＲＩＤＧＥに直接結合させることができない。この状況では、誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）は、塩基色素（例えば、ＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ色素）を意味し、これは、例えば、反応基の付加によって、結合の形成に十分であるように修飾される。
【０１０３】
アクリジン色素
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造４）を有しているアクリジン色素であり得る。
構造４
【０１０４】
【化５４】
アクリジンオレンジ（ＡＯ）は、緑色の蛍光でｄｓＤＮＡを染色し、赤色の蛍光でＲＮＡを染色するアクリジン色素である。Ｔｒａｇａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２５（１），４６（１９７７）。いくつかの他のアクリジン色素とは異なり、ＡＯは高い消散係数（＞５０，０００）と、長い吸収波長（λａｂｓ＝５００ｎｍ（ＤＮＡ結合））を有している。しかし、核酸に対するＡＯの親和性は非常に低く、色素は核酸が存在しない条件では、有意な内部蛍光を有する。これに関して、内部蛍光のレベルは、これが、色素が、低いレベル（例えば、低いナノグラム／ｍＬの範囲）で核酸を検出すること、または、脱染色工程を伴うことなくゲル中の核酸の検出することにおいて使用されることを妨げる点で有意であり得る。結果として、ＡＯ自体は、ＤＮＡまたはＲＮＡの定量に、特に、リアルタイムｑＰＣＲのような用途に付随する高感度のＤＮＡの検出にはほとんど有用性はない。
【０１０５】
アクリジン色素は、環構造上の様々な位置に任意の様々な置換基を含む場合がある。置換基の性質とその置換位置は、生じる色素のスペクトル特性に強く影響を与え得る。一般的には、３位および６位の電子供与置換基と、９位の電子吸引性置換基は、通常、色素の吸収スペクトルと放射スペクトルを赤色にシフトさせる。典型的な電子供与基の例としては、アミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびアルキルメルカプト基が挙げられるが、これらに限定はされない。典型的な電子吸引基の例としては、シアノ基、パーフルオロアルキル基、カルボキサミド基、スルホンアミド基、ニトロ基、およびハロゲン基が挙げられるが、これらに限定はされない。コア構造と縮合させられた任意のさらなる環構造もまた、生じる色素の波長を長くするであろう。
【０１０６】
構造４の様々な部分がここで記載される。構造４においては、本明細書中に提供されるかまたは記載される種々の他の単量体色素構造に見られるように、下付き文字が後に続く「Ｒ」の記号（例えば、Ｒ１）は、単なる例ではあるが、ＢＲＩＤＧＥの一部ではない構造の置換基を示す場合も、また、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。この場合は、これは構造の置換基ではない。蛍光の放射、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ４；−ＳＲ５；−ＮＲ６Ｒ７；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ８；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ９；または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０であり得る；任意の隣接するＲ１の対は、状況に応じて、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し、これにはさらに状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる；そして、Ｒ１の１つは、先に記載されたように−Ｌ−Ｒｒであるか、またはＲ１の１つは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。この場合、Ｒ１は単なる例であり、実際には、単量体色素の置換基ではない。Ｒ１に、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、および、Ｒ１０の少なくとも１つが含まれている任意の場合においては、それらのうちの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈまたは１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルであり、任意の適用可能な隣接しているＲ６とＲ７の対については、Ｒ６とＲ７は独立して、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。
【０１０７】
通常、Ｒ２は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリール；ハロゲン；−ＯＲ１１；ＳＲ１２；−ＮＨＲ１３；−ＣＮ；または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１４であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。Ｒ２にＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の少なくとも１つが含まれている任意の場合においては、これらの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈ、または１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルである。
【０１０８】
通常、Ｒ３は、Ｈ；または１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。
【０１０９】
Ψは陰イオンであり、例えば、色素と会合している正電荷を平衡化させる陰イオンである。Ψは生物学的に適合するものであり得る。適切な陰イオンの例としては、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、およびヘキサフルオロリン酸塩が挙げられるが、これらに限定はされない。単なる例ではあるが、陰イオンは塩化物またはヨウ化物であり得る。
【０１１０】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さなければならない。単なる例ではあるが、Ｒ２およびＲ３の一方が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。本明細書中に記載されるように、ＢＲＩＤＧＥは、単量体アクリジン色素、例えば、本明細書中に記載される任意のそのような色素に、および、別の適切な単量体色素に共有結合させて、二量体色素を形成させることができるか、または、２つの他の適切な単量体色素に結合させて三量体色素を形成させることができる。一般的には、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の１つだけが、先に記載されたように、状況に応じて、−Ｌ−Ｒｒであり得る。二量体色素または三量体色素には、−Ｌ−Ｒｒが１つだけ含まれる場合がある。
【０１１１】
単なる例ではあるが、単量体アクリジン色素は、すぐ下に示される構造（構造５）を有し得る。
構造５
【０１１２】
【化５５】
構造５においては、一般的には、Ｒ１はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２アルキルであり、Ｒ２とＲ３の一方は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す；状況に応じて、Ｒ２とＲ３の一方は、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒであり得る；Ｒ２が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さず、そしてＬ−Ｒｒではない場合には、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＣＮ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２から選択される；Ｒ３が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さず、そしてＬ−Ｒｒではない場合には、Ｒ３は、Ｈまたは−ＣＨ３から選択され；Ｒ６とＲ７はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２アルキルであり；そして、Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。単なる例ではあるが、隣接しているＲ６またはＲ７とＲ１のそれぞれの対について、Ｒ６またはＲ７とＲ１は独立して、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。
【０１１３】
１つの例においては、構造５によって示されるような単量体アクリジン色素は、Ｒ１がそれぞれＨであり；Ｒ２がＨであり；Ｒ３が、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し；Ｒ６がそれぞれ−ＣＨ３であり；Ｒ７がそれぞれ−ＣＨ３であり；そして、Ψが、先に記載されたように、陰イオンであるようなものであり得る。
【０１１４】
単なる例ではあるが、二量体色素には、同じ構造５の単量体アクリジン色素分子が２つと、式５のＢＲＩＤＧＥを含まれる場合がある。
【０１１５】
非対称シアニン色素
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造６）を有している非対称シアニン色素であり得る。
構造６
【０１１６】
【化５６】
非対称シアニン色素の一般的構造（構造６ 上記）には、置換されたベンザゾリウム環である複素環；メタンまたはポリメチン架橋；および、置換されたピリジニウムまたはキノリニウム環である複素環が含まれる。構造の中の点線は、１つ以上の縮合された芳香族環を形成するために必要な原子を示し、これには、状況に応じて、四級化されている場合も、また四級化されていない場合もある１つ以上の窒素が組み込まれている。点線が１つ以上の窒素原子を含む６員環を示す場合は、生じる縮合環は、アザベンゾール環と呼ばれる。
【０１１７】
構造６においては、一般的に、ベンザゾリウム環上のＲ１およびＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５である。単なる例ではあるが、Ｒ１およびＲ１’の一方は、Ｘに対して、またはベンザゾール窒素に対してメタである置換基であり得る。この場合、置換基によって、以下にさらに記載されるような、少なくとも１つの所望される特性が付与される。Ｒ１またはＲ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている任意の場合においては、それらのうちの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈ；または１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキルであり、これには、状況に応じて１個から１２個の窒素が組み込まれている；または、アリールであり；そして、任意の適用可能なＲ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し得、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。
【０１１８】
上記のように、構造６のＲ１およびＲ１’の一方は色素に対して少なくとも１つの望ましい特性を付与する置換基であり得る。１つの好ましい所望される特性は、ＤＮＡ小溝結合である。小溝結合分子は、通常、二本鎖ＤＮＡの小溝に適合する三日月形の形状の構造を有している。自然界に存在している分子が含まれる場合があるＤＮＡ小溝結合色素分子または非色素分子の例としては、ＤＡＰＩ，Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ジスタマイシンＡ、ネトロプシン、ならびに、Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールのポリアミドをベースとする多数の合成の小溝結合剤の任意のものが挙げられるが、これらに限定はされない。Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．のカタログ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＣＡ）），２００５−２００６；Ｂｏｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３７，６１（２００４）；およびＤｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，２２１５（２００１）。小溝結合剤の三日月形の形状は、通常、５員環または６員環の、小溝結合剤置換基でのメタ置換によって作成される。小溝結合剤置換基としては、置換されたまたは未置換のベンゾキサゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のベンズイミダゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のベンゾチアゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のイミダゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のオキサゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のチアゾール−２−イル、置換されたまたは未置換のＮ−メチルピロリル−２−アミノカルボニル、置換されたまたは未置換のＮ−メチルピロリル−３−カルボキサミド、置換されたまたは未置換の１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、置換されたまたは未置換の１−メチルイミダゾール−４−アミノカルボニル、置換されたまたは未置換のフェニル、置換されたまたは未置換のピリジル、置換されたまたは未置換のピラジニル、ならびに、置換されたまたは未置換のトリアジニルが挙げられるが、これらに限定はされない。ＤＮＡ色素は、米国特許出願公開番号２００４／０１３２０４６に記載されているような小溝結合剤置換基によってメタ置換される場合がある。
【０１１９】
Ｒ１およびＲ１’の一方は、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒであり得る。Ｒ１およびＲ１’の一方は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。
【０１２０】
Ｘは、ＯおよびＳから選択される。一般に、ＸがＳである色素は、ＸがＯである類似する色素よりも長い吸収波長および放射波長を有する。
【０１２１】
Ｒ２は、メチルまたはエチルであり得るか、あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。単なる例ではあるが、Ｒ２はメチルまたはエチルであり得る。
【０１２２】
下付き文字ｎは、任意のメチン架橋における二重結合単位の数を示し、これは０、１、および２から選択される。通常、より長いメチン架橋を有している色素は、より短いメチン架橋を有している色素よりも長い波長を有するであろう。単なる例ではあるが、ｎは０または１であり得る。
【０１２３】
置換基Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、Ｈまたは−ＣＨ３である。状況に応じて、これらの置換基の任意の隣接している対は、５員環または６員環を形成する場合がある。単なる例ではあるが、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はＨであり得る。
【０１２４】
一般的に、置換基Ｒ６、Ｒ８、およびＲ８’はそれぞれ独立して、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリールであり得る。Ｒ８およびＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成する場合がある。これは、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルメルカプト、またはハロゲンで、別々にさらに１回から４回置換される場合もある。Ｒ６、Ｒ８、およびＲ８’のいずれかにＲ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意の場合には、これらのうちの任意の適用可能なものは、独立して、Ｈ；または状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキルであり；そして、任意の適用可能なＲ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。
【０１２５】
Ｒ６は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。Ｒ６は、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒである場合がある。
【０１２６】
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒから選択されるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。
【０１２７】
Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１２８】
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示さなければならない。本明細書中に記載されるように、ＢＲＩＤＧＥは、単量体の非対称シアニン色素、および別の適切な単量体色素に共有結合させ、二量体色素を形成させることができるか、あるいは、単量体の非対称シアニン色素と２つの他の適切な単量体色素に共有結合させ、三量体色素を形成させることもできる。一般的には、先に記載されたように、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、状況に応じて−Ｌ−Ｒｒであり得る。より通常は、二量体色素または三量体色素には、−Ｌ−Ｒｒが１つだけ含まれ得る。
【０１２９】
単なる例ではあるが、非対称シアニン色素は、すぐ下に示される構造（構造７）を有し得る。この場合、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ８’はそれぞれ、構造６に関して先に記載されているとおりである。
構造７
【０１３０】
【化５７】
例として、構造７に示されるように、非対称シアニン色素は、Ｒ１’が、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；小溝結合剤と結合した置換基；または、先に記載されたような−Ｌ−Ｒｒであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示すようなものであり得る。さらに、Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている任意の場合には、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ；または、状況に応じて１個から２個の窒素またはアリールが組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキル；または、アリールであり；そして、Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し得、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。Ｘは、ＯおよびＳから選択され得、そしてｎは、０、１、および２から選択され得る。Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒであり得るか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；あるいは、先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒであり得るか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリール；先に記載されたような、−Ｌ−Ｒｒであり得るか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合もある。Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素まで（１、１０を含む）を有しているアルキルまたはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子が含まれている、置換されたまたは未置換のアリールであり得る。Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成する場合がある。これは、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルメルカプト、またはハロゲンで、別々にさらに１回から４回置換される場合もある。Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、Ｒ１６およびＲ１７の任意のものが、独立して、Ｈ；または状況に応じて１個から２個の窒素もしくはアリールが組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素を有しているアルキルであり得る。Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、そのＲ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成する場合がある。これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれる。Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。一般的には、Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、状況に応じて、上記に記載されたような−Ｌ−Ｒｒであり得る。Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１３１】
１つの例においては、非対称シアニン色素は、すぐ下に示される構造（構造８）を有する。この場合、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示しており、そしてΨは、先に記載されたように、陰イオンである。
構造８
【０１３２】
【化５８】
単なる例ではあるが、二量体色素には、同じ構造８の単量体非対称シアニン色素が２つと、式５のＢＲＩＤＧＥが含まれる場合がある。
【０１３３】
単なる例ではあるが、例えば、構造１のような蛍光核酸色素においては、Ｑ１色素構成成分が非対称シアニン色素（例えば、構造６〜８のいずれか）であり、Ｑ２色素構成成分が非対称シアニン色素（例えば、構造６〜８のいずれか）である場合には、ＢＲＩＤＧＥ（例えば、式１のＢＲＩＤＧＥ）のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉの合計は、３よりも大きい数である場合があり、また、ＢＲＩＤＧＥ（例えば、式１のＢＲＩＤＧＥ）のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の少なくとも１つが、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、またはチオ尿素結合が含まれている少なくとも１つの連結結合を含む部分を含むＮＡＢＥＧ；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ元素が含まれているアリールでありえる場合もある。
【０１３４】
フェナントリジニウム色素
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造９）を有している、フェナントリジニウム誘導体であり得る。
構造９
【０１３５】
【化５９】
一般的には、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し得る。しかし、様々な技術（例えば、別の方法で構造に対するＢＲＩＤＧＥの結合を提供することができる合成技術または、任意の様々な所望される波長を有している色素を提供するように構造を修飾することができる合成技術）によって、上記構造９の多くのバリエーションが可能であり、本明細書中で意図されることが理解されるであろう。Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１３６】
単なる例ではあるが、式５のＢＲＩＤＧＥと組み合わせられた構造９の２つの単量体フェナントリニジウム色素分子は、二量体色素を形成することができる。
【０１３７】
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造（構造１０）を有しているキサンテン誘導体であり得る。
構造１０
【０１３８】
【化６０】
特定の正電荷を有している（ｃａｔｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）キサンテンは、核酸に結合することが公知である。例えば、ピロニンＹ（この場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’はメチルであり、そしてＲ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’およびＡはＨである）は、ＤＮＡゲル染色に使用されている公知の蛍光ＤＮＡ結合色素である。Ａｄｋｉｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０（１），１７（１９９６）。上記構造１０に示される一般的な骨格を有している色素は、類似する核酸染色特性を有していること、そして他の蛍光色を提供することが予想される。例えば、ピロニンＹは、５４８ｎｍに最大吸収を、そして５６５ｎｍに最大放射を有しており、赤色の蛍光色を提供する。
【０１３９】
単なる例ではあるが、一般的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’はそれぞれ独立して、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ６（Ｃ１、Ｃ６を含む）、アルキルであり得、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される１個または２個のヘテロ原子が組み込まれている。さらに、単なる例ではあるが、無関係に、Ｒ１とＲ２の対、およびＲ１’とＲ２’の対の少なくとも一方は、一緒に、５員環または６員環を形成する場合があり、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される１つのヘテロ原子が含まれる。Ｒ１とＲ１’は同じである場合があり、そしてＲ２とＲ２’も同じである場合がある。
【０１４０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’の１つは、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。状況によっては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、およびＲ２’の１つは、先に記載されたように、−Ｌ−Ｒｒである。
【０１４１】
単なる例ではあるが、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、およびＲ４’は、独立して、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ３（Ｃ１、Ｃ３を含む）、アルキルであり得る。Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、およびＲ４’は、同じである場合がある。無関係に、Ｒ３とＲ１の対、Ｒ２とＲ４の対、Ｒ３’とＲ１’の対、およびＲ４とＲ２’の対の少なくとも１つは、一緒に、５員環または６員環を形成する場合がある。これは、飽和である場合も、また不飽和である場合も、置換されている場合も、また未置換である場合もある。
【０１４２】
Ａは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル；または−Ｌ−Ｒｒであり、この場合、Ｌは、Ｃ１〜Ｃ１２脂肪族リンカーであり、そしてＲｒは、先に記載されたような反応基であるか；または、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す。
【０１４３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’、およびＡの１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示す場合がある。
【０１４４】
Ψは、先に記載されたように、陰イオンである。
【０１４５】
式５のＢＲＩＤＧＥと組み合わせられた構造１０の２つの単量体キサンテン色素分子は、二量体色素を形成することができる。
【０１４６】
他の単量体蛍光核酸染色（単なる例ではあるが、例えば、ＤＡＰＩ、ＤＩＰＩ，Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＬＤＳ７５１、ヒドロキシスチルバミジン、スチリル色素、メロシアニン色素、シアニン色素、またはＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）は、使用に適しているか、または、本明細書中に記載されるように使用に適するように誘導することができる。Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版。多数の他の単量体核酸色素が使用に適しているか、または、本明細書中に記載されるような使用に適するように誘導することができることが理解されるであろう。色素は、ＢＲＩＤＧＥに直接結合させることができるか、または、合成の知識を使用してそれらをＢＲＩＤＧＥに結合させることができるように誘導することができるかのいずれかである。
【０１４７】
非蛍光核酸色素
一般的には、非蛍光核酸結合分子は、蛍光を発しないか、または蛍光核酸色素として有用であるには弱すぎる蛍光を発する、核酸結合分子である。非蛍光核酸結合分子には、非蛍光核酸結合色素、および無色の合成もしくは天然の核酸結合分子が含まれる。
【０１４８】
多数の非蛍光色素が、比色核酸ゲル染色として使用されている。蛍光核酸染色であるエチジウムブロマイドと比較すると、これらの非蛍光色素は、通常は、はるかに低い検出感度を有しているが、例えば、ヒトに使用する際の毒性に関しては安全であるように、使用は安全であると考えられる。非蛍光核酸結合色素の例としては、ナイルブルー（Ｎｉｌｅ Ｂｌｅｕ）、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ）、チオニン（Ｔｈｉｏｎｉｎ）、メチルグリーン（Ｍｅｔｈｙｌ Ｇｒｅｅｎ）、ベーシックブルー６６（Ｂａｓｉｃ Ｂｌｕｅ ６６）、ベーシックレッド２９（Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ ２９）、インドリンブルー（Ｉｎｄｏｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ）、サフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ Ｇｒｅｅｎ Ｂ）、ピナシアノール（Ｐｉｎａｃｙａｎｏｌ）、およびＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌが挙げられるが、これらに限定はされない。Ａｄｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０，１７（１９９６）。これらの色素のほとんどは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から市販されている。
【０１４９】
蛍光非核酸色素
単量体色素Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３の１つは、蛍光非核酸色素であり得る。一般的に、通常は蛍光核酸色素とは考えられない全ての蛍光色素は、蛍光非核酸色素と考えられる。本明細書中では、用語「蛍光非核酸色素」は、一般的には、通常は核酸色素とは考えられない蛍光色素を意味する。例として、色素は、通常は、蛍光小溝結合剤または蛍光挿入剤とは考えることはできない。さらなる例として、いくつかの蛍光非核酸色素は、核酸といくらかの弱い相互作用を示す場合があるが、これらの挿入剤は、一般的には、色素を核酸の検出に有用とするための有意な蛍光スペクトルの変化を引き起こすには十分ではない。
【０１５０】
様々な蛍光非核酸色素が、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ，（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）のような様々な供給業者から市販されている。蛍光非核酸色素の例としては、フルオレセイン色素、スルホン酸化フルオレセイン色素、ローダミン色素、スルホン酸化ローダミン色素、シアニン色素、スルホン酸化シアニン色素、クマリン色素、ピレン色素、オキサジン色素、およびＢｏｄｉｐｙ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））が挙げられるが、これらに限定はされない。適切な蛍光非核酸色素には、先に記載されたような、反応基Ｒｒが含まれ得る。適切な蛍光非核酸色素は、これに反応基Ｒｒが含まれるように誘導することができる。適切な反応性色素は、ＲｒとＢＲＩＤＧＥに由来する適切な官能基を介してＢＲＩＤＧＥに共有結合させられる。
【０１５１】
適切な蛍光非核酸色素の選択は、他の対合する単量体色素に応じて様々であり得る。一般的には、適切な蛍光非核酸色素は、対合する色素と分子内二量体を形成することができなければならない。分子内二量体の形成は、通常は、単量体色素がＢＲＩＤＧＥにより他の対合する単量体色素に共有結合させられる前と後の、水性媒体の中の構成成分である単量体色素の少なくとも１つの吸収スペクトルの有意な変化によって確認される。
【０１５２】
非蛍光非核酸色素
一般的には、用語「非蛍光非核酸色素」は、蛍光を発することがなく、また、核酸に結合することもない色素を意味する。このような色素は、一般的には、ＦＲＥＴをベースとする用途において蛍光消光剤として使用される。例として、蛍光性ペプチダーゼ基質は、蛍光ドナー色素をペプチドの一方の末端に共有結合させ、そして、非蛍光非核酸色素である消光剤を、ドナーの蛍光を消光させるためにペプチドの他方の末端に共有結合させることによって構築されている。ペプチドが酵素によって切断されると、ドナーと消光剤は分離され、それによって、蛍光シグナルが放出される。さらなる例として、非蛍光非核酸色素は、ｑＰＣＲのための、いわゆる、ＴａｑＭａｎプローブを設計するために使用されている。ＴａｑＭａｎプローブは、標的ＤＮＡ配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの一方の末端に結合させられた蛍光ドナー色素、およびドナー色素の蛍光を消光させるためのオリゴヌクレオチドの他方の末端に共有結合させられた消光剤から構成される。リアルタイムＰＣＲの間に、標識されたオリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡに結合し、これは、オリゴヌクレオチドの酵素による切断を引き起こし、それにより蛍光シグナルが生じる。
【０１５３】
非蛍光非核酸色素は、リリースオンデマンドＤＮＡ結合機構を担っている分子内二量体の形成のための対合パートナーとして主に使用され得る。非蛍光非核酸色素は、非蛍光非核酸色素と、それがその後のＤＮＡ結合において対合する蛍光核酸色素との間でのＦＲＥＴを最少にすることを確実にするように選択されるべきである。一般的には、ＦＲＥＴが原因である蛍光核酸色素の蛍光の消失は最少でなければならず、例えば、放射される蛍光全体の約７０％を超えてはならない。非蛍光非核酸色素の選択は、蛍光核酸結合色素の放射スペクトルと非蛍光色素の吸収スペクトルの評価に基づいて行うことができる。理想的には、上記のように、ＦＲＥＴが原因で生じる蛍光シグナルの消失を最少とするためには、これらのスペクトルは最小限にしか重複していないべきである。ＦＲＥＴを最少にする別の可能な方法は、十分に長いＢＲＩＤＧＥを使用することであり、その結果、上記のように、ＦＲＥＴが原因で生じる蛍光シグナルの消失は最少となる。なぜなら、ＦＲＥＴの効率は、構成成分である色素の間での分子間分離の逆方向の第６の力（ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｉｘｔｈ ｐｏｗｅｒ）に依存するからである。
【０１５４】
有用であり得る市販されている非蛍光消光剤の例としては、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＤＡＢＣＹＬ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）によるＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）によるＥｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＤＱ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によるＩＯＷＡ Ｂｌａｃｋ（ＩＷＢ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によるＱＳＹが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５５】
使用方法
本明細書中に記載される核酸色素は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に特に有用であり得る。蛍光核酸色素を介した蛍光をベースとするＤＮＡ検出と組み合わせてＰＣＲを使用することにより、当業者は、ＰＣＲの実行を停止させることなく、またはＰＣＲの実行の間に反応物をサンプリングすることなく、ＰＣＲプロセスの産物の量を決定することができる。ｑＰＣＲを使用することにより、当業者は、ＤＮＡ試料のもとの量を定量することができるだけではなく、配列情報をもまた得ることができる。ｑＰＣＲの感度および特異性により、これは、疾患の診断および予後診断、ならびに、農業および法医学における種の特定を含む、多数の実用において非常に有用となる。
【０１５６】
ｑＰＣＲにおける色素の使用には、ＰＣＲ反応に適している色素の溶液および他の構成成分（例えば、増幅酵素、標的核酸配列の増幅に十分なプライマー、およびデオキシヌクレオシド３リン酸）を試験管中のＤＮＡ試料を含む溶液に添加する工程、ｑＰＣＲ機器の中にシールされた試験管を置く工程、および検出された蛍光シグナルを記録する工程が含まれ得る。Ｃｔ値、または蛍光シグナルが任意に決定された限界値に達するために必要なサイクル数が記録され得る。Ｃｔ値は、ＤＮＡ試料のコピー数の対数と直線的な関係にある。Ｃｔ値とＤＮＡコピー数の対数の標準的なプロットを使用することにより、当業者は、Ｃｔ値に基づいてＤＮＡ試料のＤＮＡコピー数を決定することができる。単なる例ではあるが、選択された色素を使用するＰＣＲ増幅プロットが、図８、９、１１、および１４に示される。
【０１５７】
蛍光核酸色素の他の使用には、溶液またはゲルの中でのＤＮＡの定量、肝細胞または死亡した細胞中の核酸の染色、および顕微鏡下での核酸の検出が挙げられるが、これらに限定はされない。一般的には、蛍光核酸色素の使用には、状況に応じて、任意の別の試薬と組み合わせられた色素を、核酸ポリマーを含むかもしくは核酸ポリマーが含まれていると考えられる試料と接触させる工程；色素−核酸錯体を形成させるために十分な時間の間、得られた色素と試料の混合物をインキュベートする工程；ならびに、色素−核酸錯体の蛍光シグナルを検出する工程が含まれ得る。
【０１５８】
色素は、本明細書中に記載されるように、適切な用途のために調製することができる。単なる例ではあるが、色素は、最終的な染色溶液中で使用されるよりも約１００倍高い濃度で、水性溶媒または水混和性の生物学的適合性の有機溶媒を使用して、ストック溶液にすることができる。単独で、または適切な有機溶媒と組み合わせて、色素ストック溶液を作成することにおいて使用することができる適切な水性溶媒の例としては、水、ＰＢＳ緩衝液、およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられるが、これらに限定はされない。色素ストック溶液を作成するための適切な有機溶媒の例としては、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、またはエタノールが挙げられるが、これらに限定はされない。その後、ストック溶液は適切な水性溶媒（例えば、水または生物学的緩衝液）を使用して、所望される最終的な色素濃度の染色溶液になるように希釈される。一般的には、染色溶液についての特異的な色素濃度は、分析される試料の性質、および行われる分析の性質によって決定することができる。例として、一般的には、細胞試料と組み合わせて使用される染色溶液は、約１ｎＭまたはそれ以上の色素濃度、あるいは、約１００μＭまでの色素濃度を有し得る。さらなる例として、一般的には、電気泳動用ゲルと組み合わせて使用される染色溶液は、約１μＭまたはそれ以上、あるいは、約５０μＭの色素濃度を有し得る。
【０１５９】
色素を使用して核酸を染色する方法は、行われる分析の性質によって決定することができる。細胞または組織試料中の核酸の染色においては、試料が予め固定されている場合も、また固定されていない場合もあり、試料は通常、数分間から２時間の間染色溶液の中でインキュベートされて、色素が細胞膜に浸透させられ、核酸と結合させられる。いくつかの場合は、核酸は、精製された核酸または粗細胞抽出物を含む溶液の形態で存在し得る。このような場合は、一般的には、色素ストック溶液の核酸溶液への添加によって、検出することができる蛍光シグナルが簡単に生じるはずであり、その強度は核酸の量に比例する。例として、ＤＮＡ滴定曲線が図７に示される。ＤＮＡの量と蛍光強度の間での実質的に直線的な関係を、ＤＮＡの定量に使用することができ、また、細胞抽出物が使用される場合は、細胞数の推定のために使用することができる。特定の例においては、核酸は、不活性なマトリックス（例えば、ブロット、またはゲル、試験細片）の中に包埋される場合も、また、固体表面（例えば、マイクロアレイチップもしくは任意の他の固体表面）に結合させられる場合もある。このような場合には、一般的には、染色は、核酸を含むマトリックスの表面に対して、または、マイクロアレイチップの表面、または他の固体表面に染色溶液を塗布すること、そして色素−核酸錯体を形成させるために十分な時間の間インキュベートすることによって行われる。
【０１６０】
蛍光核酸−色素錯体は、その放射または励起のいずれかによって検出することができる。例として、蛍光核酸−色素錯体は、錯体の最大吸収波長の、またはその付近の波長を有している光によって励起させることができ、そして、通常はそのような光によって励起させられる。さらなる例として、核酸−色素錯体は、３００ｎｍから４００ｎｍの波長を有しているＵＶ光によって励起させることができる。これは、ゲルの視覚化の用途に使用されるトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｔｏｒ）のほとんどについて利用することができる励起光の共通の光源である。例として、蛍光シグナルは、様々な機器（例えば、プレートリーダー、顕微鏡、蛍光光度計、量子カウンター、およびフローサイトメーター）によって検出することができる。さらなる例として、蛍光シグナルは、視覚的方法（例えば、目視検査または写真記録）によって作成することができる。
【０１６１】
合成
色素の合成は、単量体色素構成成分の合成、ＢＲＩＤＧＥの合成、および単量体色素構成成分のＢＲＩＤＧＥへの結合に関して記載され得る。単量体色素、および官能基または反応基を含む単量体色素の合成がここで記載される。
【０１６２】
単量体色素および機能性分子の合成
適切な単量体色素、および官能基または反応基を含む単量体色素は、公知の手順または任意の適切な手順によって傷をつける（ｓｃｒａｔｃｈ）ことによって、あるいは、適切なもしくは所望されるコア構造をすでに有している市販されている材料を修飾することによって、調製することができる。多くの単量体アクリジン色素を、市販されているアクリジン色素から調製することができる。合成のための適切な出発材料となり得る市販されているアクリジン色素のいくつかの例が、すぐ下に示される。
【０１６３】
【化６１】
他のアクリジンコア構造は、公知の手順または任意の適切な手順にしたがって調製することができる。Ａｌｂｅｒｔ，Ａ．，Ｔｈｅ ａｃｒｉｄｉｎｅｓ：ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃａｌ、ｃｈｅｍｉｃａｌ、ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ，Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｅｌｄｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９，４００７（１９９９）；およびＪｏｓｅｐｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５，１２３０（２００４）。アクリジンコア構造は、適切なジフェニルアミンを、適切なカルボン酸またはカルボン酸等価物と共に、ルイス酸の存在下で縮合させることによって、すぐ下の反応１に模式的に示されるように形成させることができる。
反応１
【０１６４】
【化６２】
反応１においては、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、以下にさらに記載されるような適切な置換基である。ジフェニルアミン出発材料は、市販されているものであるか、または適切なハロゲン化アリールと適切なアリールアミンから、公知の方法または任意の適切な方法を使用して合成することができる。Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．５７６，１２５（１９９９）；Ｈａｒｔｗｉｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５５７５（１９９９）；およびＷｏｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５，１１５８（２０００）。
【０１６５】
置換基の性質と、置換基が結合させられる位置によっては、色素のスペクトル特性に対して大きな効果がある場合がある。一般的には、２位、３位、６位、および７位の電子供与基は、色素の吸収波長および放射波長を長くするであろう。典型的な電子供与基は、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、チオール基、またはアルキルチオ基であり得る。より典型的な電子供与基は、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、またはアルコキシ基であり得る。一般的には、９位の電子吸引基は、色素の吸収波長および放射波長を長くするであろう。典型的な電子吸引基は、例えば、シアノ基、パーフルオロアルキル基、アミノカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、アルキルカルボニル基、アルデヒド基、アルコキシカルボニル基、アミノスルホナート基、アルキルアミノスルホナート基、またはハロゲン化物基であり得る。より典型的な電子吸引基は、シアノ基、パーフルオロアルキル基、またはハロゲン化物基であり得る。
【０１６６】
一般的には、一旦、アクリジンコア構造が構築されると、１０個の窒素が、ハロアルキル基でアルキル化され、これには通常、別の反応基、または反応基に転換させることができる官能基が含まれる。さらなる反応基は、ＢＲＩＤＧＥにアクリジン色素を結合させるように作用する。適切な反応基を用いて単量体アクリジン色素を作成するいくつかの方法が、すぐ下のスキーム１に模式的に示される。
スキーム１
【０１６７】
【化６３】
すぐ下のスキーム２に模式的に示されるように、１０−アルキル化アクリジンの９位は、シアノ基で容易に置換することができ、これはさらに、カルボキサミド基へと容易に加水分解することができる。
スキーム２
【０１６８】
【化６４】
反応性の単量体の非対称シアニン色素を調製する方法が記載されている。Ｃａｒｒｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（４），５１７（２００４）。このような色素は、すぐ下に示される構造（構造１１）を有し得る。
構造１１
【０１６９】
【化６５】
米国特許第５，８６３，７５３号には、反応性の非対称シアニン色素のシリーズの調製が開示されている。これには、キノリニウムまたはピリジニウム窒素に対してオルトに置換基を有しているものが含まれる。キノリニウムまたはピリジニウム窒素に対してオルトであるこのような置換基、特に、環状の置換基は、米国特許第５，４３６，１３４号に従うと、非対称シアニン色素に対して所望される特性を付与すると言われる。これらの環状構造で置換された非対称シアニン色素は、まとめて、ＳＹＢＲ色素と呼ばれる。Ｚｉｐｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（１２），ｅ１０３（２００４）。反応性ＳＹＢＲ色素のいくつかは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されているが、これらの色素の正確な構造はわかっていない。Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第９版。
【０１７０】
米国特許出願公開番号２００４／０１３２０４６には、小溝結合能力を有している単量体の非対称シアニン色素を調製するための方法が開示されている。一般的には、これらの色素は、色素のベンザゾリル環上にさらなるベンザゾリル置換基を有することにより、三日月型の構造を有する。適切な反応基を有している類似する単量体色素は、例えば、すぐ下のスキーム３に模式的に示されるように、同様の方法を使用して調製することができる。
スキーム３
【０１７１】
【化６６】
反応性フェナントリジニウム色素は、すぐ下のスキーム４に模式的に示されるように、市販されている３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンから調製することができる。
スキーム４
【０１７２】
【化６７】
単なる例ではあるが、表２の色素番号３５は、上記のスキーム４に示される反応基を有しているフェナントリジニウム中間体を使用して調製することができる。
【０１７３】
９位に反応基を有しているピロニン誘導体の調製は、すぐ下のスキーム５に模式的に示されるように、２等量のｍ−アミノフェノール誘導体を、１等量のジカルボン酸無水物と縮合させることによって行うことができる。
スキーム５
【０１７４】
【化６８】
多くの単量体の非蛍光核酸結合色素は、繊維産業およびインク産業において使用されている公知の顔料であり、市販されている。これらの色素の調製についての参考文献は文献に見ることができる。多くの適切な反応性の単量体蛍光非核酸色素および非蛍光非核酸色素は市販されているか、または、公知の方法を使用して容易に調製することができる。
【０１７５】
ＢＲＩＤＧＥの合成
ＢＲＩＤＧＥは、通常、単量体色素がニ官能性の基または三官能性の基（多くの場合は、市販されている）に結合させられると形成される。一般的には、ＢＲＩＤＧＥの末端部分は、単量体色素自体に由来し、一方、ＢＲＩＤＧＥの中央部分は、商業的な供給業者から入手することができる二官能性または三官能性分子に由来する。いくつかの場合には、ＢＲＩＤＧＥの有意な部分（例えば、約９０％まで）は、二量体または三量体色素の最終的なアセンブリの前に単量体色素に予め結合させられ得る。いくつかの他の場合には、ＢＲＩＤＧＥの大部分は、単量体色素が結合させられる前に別々に調製され得る。ヘテロ二量体の合成の場合には、一保護二官能性リンカー基が、通常は最初に１つの単量体色素に結合させられ、続いて、脱保護、および第２の単量体色素へのカップリングが行われる。ヘテロ三量体色素は、同様の段階的な保護−脱保護ストラテジーを使用して合成することができる。
【０１７６】
ＢＲＩＤＧＥへの単量体色素の結合
一般的には、二量体色素および三量体色素は、ホモ二量体のいくつかについては１工程のカップリング反応において、あるいは、ヘテロ二量体および三量体、または複数の架橋エレメントＡを含むホモ二量体のいくつかについては多工程の反応において、適切な反応基を有している単量体色素を、二官能性リンカーまたは三官能性リンカーと結合させることによってアセンブリさせることができる。選択されたホモ二量体およびヘテロ二量体への合成経路の例は、すぐ下のスキーム６に模式的に示される。
スキーム６
【０１７７】
【化６９】
ホモ三量体色素の調製の一例は、すぐ下のスキーム７に模式的に示される。
スキーム７
【０１７８】
【化７０】
反応基を有している二量体色素を調製するための方法の例は、すぐ下のスキーム８に示される。
スキーム８
【０１７９】
【化７１】
【実施例】
【０１８０】
（実施例１）
１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジ、ヨウ化物の調製
１等量の１，３−ジヨードプロパンを、１０ｍＬのクロロベンゼン中の５ｇのアクリジンオレンジ（Ａｌｄｒｉｃｈ）の懸濁液に添加した。得られた混合物を、９０〜１００℃で一晩攪拌した。熱い反応混合物を約２００ｍＬのＥｔＯＡｃに注いだ。オレンジ色の沈殿物を濾過によって回収し、減圧下で乾燥させると、約８ｇが得られた。
【０１８１】
（実施例２）
１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ、塩化物塩の調製
１０−（５−エトキシカルボニルペンチル）アクリジンブロマイドを、１，３−ジヨードプロパンをエチル６−ブロモヘキサン酸で置き換えたことを除き、実施例１の手順を使用して調製した。粗生成物（５ｇ）を、約１００ｍＬのメタノールと、３０ｍＬのＨ２Ｏに溶解させた３等量のＮａＯＨの中に懸濁させた。懸濁液を、室温で２４時間攪拌した。メタノールを蒸発によって除去し、そして残りの水溶液を濃ＨＣｌで酸性化させた。約５０ｍＬの飽和ＮａＣｌを生成物を沈殿させるために添加した。生成物を濾過によって回収し、その後、４５℃で２４時間、減圧下で乾燥させた。
【０１８２】
（実施例３）
ＤＭＡＯ（表２の色素番号１）の調製
１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジ、ヨウ化物（１００ｍｇ）を、シールド管の中のメタノール中の２０ｍＬの２Ｍジメチルアミンの中に懸濁させ、その後、６０℃で一晩攪拌した。混合物を室温に冷却し、その後、５０ｍＬのＥｔＯＡｃに注いだ。沈殿を遠心分離によって回収し、その後、４０℃で２４時間、減圧下で乾燥させた。
【０１８３】
（実施例４）
ＴＭＡＯ（表２の色素番号２）の調製
ＣＨ３ＯＨ（２ｍＬ）中のＤＭＡＯ（表２の色素番号１）（１１ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）とＣＨ３Ｉ（０．５ｍＬ）の混合物を、４日間穏やかに還流させた。オレンジ色の生成物（１０ｍｇ）を吸引濾過によって回収した。
【０１８４】
（実施例５）
ＰＭＡＯ（表２の色素番号５）の調製
ＣＨ３ＯＨ（１０ｍＬ）中の１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジヨウ化物塩（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（０．３ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流させた。室温に冷却した後、沈殿を吸引濾過によって回収した。沈殿をＣＨ３ＯＨ（５ｍＬ）中に再懸濁させ、一晩還流させて、そして吸引濾過によって回収した。これを、減圧下で恒量になるまで乾燥させると、濃い赤色の固形物（１４ｍｇ）が得られた。
【０１８５】
（実施例６）
ＡＯＡＯ−２Ｑ（表２の色素番号９）の調製：
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジヨウ化物塩（８１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）とＰＭＡＯ（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の混合物を、１３０℃で７時間加熱した。室温に冷却した後、ＣＨ３ＯＨ（１５ｍＬ）を添加し、懸濁液を１時間、還流させるために加熱した。吸引濾過すると、生成物が濃い赤色の固形物として得られた（８３．１ｍｇ）。
【０１８６】
（実施例７）
ＡＯＡＯ−２（表２の色素番号７）の調製
Ｅｔ３Ｎ（０．１５ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（３２０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、室温のＤＭＦ（５ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（４３８ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌し、その後、Ｅｔ３Ｎ（０．１ｍＬ）と３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（５０ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を添加して生成物を沈殿させた。粗生成物をＤＭＦの中に再度溶解させ、ＥｔＯＡｃで再び沈殿させた。固形物（２５０ｍｇ）を遠心分離によって分離した。
【０１８７】
（実施例８）
ＡＯＡＯ−３（表２の色素番号８）の調製
色素（３９３ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ（４３２ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）とエチレンジアミン（２５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０１８８】
（実施例９）
１０−（８−ブロモオクチル）アクリジンオレンジブロマイドの調製
クロロベンゼン（１５ｍＬ）中のアクリジンオレンジ（２ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）と１，８−ジブロモアセタン（１，８−ｄｉｂｒｏｍｏａｃｔａｎｅ）（１２ｍＬ、６７．８ｍｍｏｌ）の混合物を、１１０℃で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、そして懸濁液を１時間還流させた。室温に冷却させた後、吸引濾過すると、生成物がオレンジ色の固形物（３．５６ｇ）として得られた。
【０１８９】
（実施例１０）
ＡＯＡＯ−５（表２の色素番号１１）の調製
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の１０−（８−ブロモアセチル）アクリジンオレンジブロマイド（１０−（８−ｂｒｏｍｏａｃｔｙｌ）ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）（０．５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）とアクリジンオレンジ（０．３ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）の混合物を、１３０℃で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃを添加して生成物を沈殿させた。ＤＭＦとＥｔＯＡｃからの沈殿を繰り返すことにより、生成物が濃い赤色の固形物（２１４ｍｇ）として得られた。
【０１９０】
（実施例１１）
ＡＯＡＯ−７（表２の色素番号１３）の調製
色素（３０ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１２１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と１，５−ジアミノ−ペンタンジヒドロクロライド（２０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９１】
（実施例１２）
ＡＯＡＯ−８（表２の色素番号１５）の調製
色素（１８２ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（２４１ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）とピペラジン（２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９２】
（実施例１３）
ＡＯＡＯ−１１（表２の色素番号１８）の調製
色素（１１２ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１８０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）と１，８−ジアミノ−オクタン（２５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９３】
（実施例１４）
ＡＯＡＯ−１２（表２の色素番号１９）の調製
色素（７６ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１４７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）と２，２’オキシビス（エチル−アミン）ジヒドロクロライド（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９４】
（実施例１５）
ＡＯＡＯ−１３（表２の色素番号２０）の調製
色素（６４ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（９６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（２０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して合成した。
【０１９５】
（実施例１６）
１，３−ジ−（（２−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ベンゼン（色素番号１０１、すぐ下に示す）の調製
【０１９６】
【化７２】
Ｅｔ３Ｎ（０．４ｍＬ、２．７１ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（８２０ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を、室温のＤＭＦ（２ｍＬ）中のイソフタル酸（２２０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で３０分間攪拌した。その後、Ｅｔ３Ｎ（１ｍＬ）とモノ−ｔＢｏｃ−エチレンジアミン（４６０ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、その後、１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）の間で分配させた。水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出し、混合した有機層を、１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）と、飽和ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で洗浄し、そして無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗生成物を、溶離液としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（９：１）を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製すると、無色の固形の生成物（３５６ｍｇ）が得られた。
【０１９７】
（実施例１７）
１，３−ジ−（（２−アミノエチル）アミノカルボニル）ベンゼン、トロフルオロ酢酸塩（色素番号１０２、すぐ下に示す）の調製
【０１９８】
【化７３】
１，３−ジ−（（２−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ベンゼン（３５６ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を、０℃のＴＦＡ（５ｍＬ）に添加した。混合物を０℃で１時間攪拌し、そして溶液を減圧下で乾燥物になるまで濃縮した。無色の残渣をＣＨ３ＯＨ（２ｍＬ）中に溶解させ、そしてＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）に一滴ずつ添加した。沈殿を遠心分離によって回収し、そして、減圧下で恒量になるまで乾燥させると、固形の生成物（４２５ｍｇ）が得られた。
【０１９９】
（実施例１８）
ＡＯＡＯ−９（表２の色素番号１６）の調製
色素（５５ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（１０９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）と１，３−ジ（（２−アミノエチル）アミノカルボニル）ベンゼン、トロフルオロ酢酸塩（５０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２００】
（実施例１９）
１，３−ジ（（５−’Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）ペンチル）アミノカルボニル）ベンゼン（色素番号１０３、すぐ下に示す）の調製
【０２０１】
【化７４】
色素（５５５ｍｇ）を、イソフタル酸（２５４ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）とモノ−ｔＢｏｃカダベリン（６４０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）から１，３−ジ−（（２−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ベンゼンを作成するための手順を使用して調製した。
【０２０２】
（実施例２０）
１，３−ジ（（５−アミノペンチル）アミノカルボニル）ベンゼン、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１０４、すぐ下に示す）の調製
【０２０３】
【化７５】
色素（５６０ｍｇ）を、色素番号１０２（５５５ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）についての手順にしたがって調製した。
【０２０４】
（実施例２１）
ＡＯＡＯ−１０（表２の色素番号１７）の調製
色素（２２ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（９５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と色素番号１０４（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２０５】
（実施例２２）
ＡＯＡＯ−１４（表２の色素番号２１）の調製
色素（１５０ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（１６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）とジアミド−ｄＰＥＧ−ジアミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｏｗｅｌｌ，Ｏｈｉｏ）（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２０６】
（実施例２３）
１０−（（（（３−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）プロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル）アンモニウム）プロピル）アクリジン、ニヨウ化物（色素番号１０５、すぐ下に示す）の調製
【０２０７】
【化７６】
ＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）中の１０−（３−ヨードプロピル）アクリジンオレンジヨウ化物（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）と３−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）プロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（１．８ｇ，８．９ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流させた。室温に冷却したあと、沈殿を吸引濾過によって回収し、恒量になるまで乾燥させると、色素番号１０５がオレンジ色の固形物（２９２ｍｇ）として得られた。
【０２０８】
（実施例２４）
１０−（（（（３−アンモニウム）プロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル）アンモニウム）プロピル）アクリジン、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１０６、すぐ下に示す）の調製
【０２０９】
【化７７】
色素番号１０５（５０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を、０℃のＴＦＡ（２ｍＬ）に添加した。混合物を、０℃で３０分間攪拌した。溶液を減圧下で乾燥物となるまで濃縮させ、そして残渣をＣＨ３ＯＨ（３ｍＬ）の中に溶解させた。溶液をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）に一滴ずつ添加し、沈殿を遠心分離によって回収し、そして減圧下で恒量となるまで乾燥させると、色素番号１０６がオレンジ色の固形物（２８ｍｇ）として得られた。
【０２１０】
（実施例２５）
ＡＯＡＯ−４（表２の色素番号１０）の調製
色素（２３ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（３１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）と色素番号１０６（２８ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を作成するための手順を使用して調製した。
【０２１１】
（実施例２６）
１０−（６−（Ｎ−フタルイミド）ヘキシル）アクリジンオレンジ臭化物塩（色素番号１０７、すぐ下に示される）の調製
【０２１２】
【化７８】
クロロベンゼン（２０ｍＬ）中のアクリジンオレンジ（２ｇ、７．５４ｍｍｏｌ）とＮ−（６−ブロモヘキシル）フタルイミド（４．７ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）の混合物を、１１０℃で２日間加熱した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、そして懸濁液を、１時間、還流させるために加熱した。室温に冷却させた後、生成物である色素番号１０７を、吸引濾過によってオレンジ色の固形物（３．７６ｇ）として回収した。
【０２１３】
（実施例２７）
１０−（５−（（５−カルボキシペンチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ、ヨウ化塩（色素番号１０８、すぐ下に示される）の調製
【０２１４】
【化７９】
Ｅｔ３Ｎ（４０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）とＴＳＴＵ（８１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（１０７ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。続いて、Ｅｔ３Ｎ（０．２ｍＬ）と、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中の６−アミノヘキサン酸（６７ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をＨ２Ｏで錬和する（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）と、色素番号１０８がオレンジ色の固形物（１２５ｍｇ）として得られた。
【０２１５】
（実施例２８）
９−シアノ−１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ、塩化物（色素番号１０９、すぐ下に示す）の調製
【０２１６】
【化８０】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ（０．１５ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ）とシアン化ナトリウム（３５ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）の混合物を、大気中で２日間、室温で攪拌した。ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）を添加し、得られた懸濁液を室温で１時間攪拌した。濃い青色の沈殿を遠心分離によって回収し、減圧下で恒量となるまで乾燥させると、色素番号１０９（１３０ｍｇ）が得られた。
【０２１７】
（実施例２９）
ＡＯＡＯ−１２Ｒ（表２の色素番号２２）の調製
Ｅｔ３Ｎ（３２μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（６８ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）を、室温のＤＭＦ（２ｍＬ）中の色素番号１０９（９８．３ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、Ｅｔ３Ｎ（１００μＬ）と２，２’−オキシビス−（エチルアミン）ジヒドロクロライド（１６ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で２日間攪拌した。溶液を約１ｍＬにまで濃縮し、ＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）を添加した。沈殿を遠心分離によって回収した。生成物をＤＭＦ中に再度溶解させ、ＥｔＯＡｃで再び沈殿させると、色素番号２２が濃い青色の固形物（５４．４ｍｇ）として得られた。
【０２１８】
（実施例３０）
９−アミノカルボニル−１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジン（色素番号１１０、すぐ下に示す）の調製
【０２１９】
【化８１】
７５％のＨ２ＳＯ４（１ｍＬ）中の色素番号１０９（３０ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）の溶液を、６０℃で２日間加熱した。室温に冷却した後、混合物をＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）に添加した。沈殿を遠心分離によって回収し、ＣＨ３ＯＨ（１．５ｍＬ）中に再び溶解させた。ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を添加し、固形の沈殿を遠心分離によって回収し、そして恒量となるまで減圧下で乾燥させると、色素番号１１０が濃いピンク色の固形物（２０．４ｍｇ）として得られた。
【０２２０】
（実施例３１）
Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（すぐ下に示す）の調製
【０２２１】
【化８２】
色素を、公開されている手順（Ｃａｒｒｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔ．６（４），５１７（２００４））を使用して調製した。
【０２２２】
（実施例３２）
ＴＯＴＯ−３（表２の色素番号１４）の調製
色素（３５４ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（４６０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）とエチレンジアミン（２５ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２２３】
（実施例３３）
１０−（５−（（２−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）エチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ塩化物塩（色素番号１１１、すぐ下に示す）の調製
【０２２４】
【化８３】
Ｅｔ３Ｎ（１０６μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（２３０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジクロライド塩化物（３０２ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。続いて、Ｅｔ３Ｎ（３５０μＬ）とモノｔ−ＢＯＣ−エチレンジアミン（１５０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、その後、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）の添加によって沈殿させた。沈殿を遠心分離によって回収し、恒量となるまで乾燥させると、色素番号１１１がオレンジ色の固形物（３６５ｍｇ）として得られた。
【０２２５】
（実施例３４）
１０−（５−（（２−アンモニウムメチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１１２、すぐ下に示す）の調製
【０２２６】
【化８４】
色素番号１１１（３４７ｍｇ、６２２ｍｍｏｌ）を、５℃のトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）の中に一度に添加した。混合物を５℃で１時間攪拌し、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣を、ＣＨ３ＯＨ（３ｍＬ）の中に溶解させ、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に一滴ずつ添加した。沈殿を遠心分離によって回収すると、色素番号１１２がオレンジ色の固形物（２９７ｍｇ）として得られた。
【０２２７】
（実施例３５）
ＡＯＴＯ−３（表２の色素番号２３）の調製
Ｅｔ３Ｎ（２０μＬ、０．１４２ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（４２．２ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（６２ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、Ｅｔ３Ｎ（７０μＬ）と色素番号１１２（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌し、その後、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をＤＭＦ（１ｍＬ）中に再度溶解させ、そしてＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）を添加した。沈殿を遠心分離によって回収した。ＤＭＦとＥｔＯＡｃからの沈殿を繰り返すと、生成物がオレンジ赤色の固形物（５０．４ｍｇ）として得られた。
【０２２８】
（実施例３６）
ＴＯＴＯ−１２（表２の色素番号２４）の調製
色素（１９．４ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ（９４．５ｍｇ、０．２１４５ｍｍｏｌ）と２，２’オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド（１５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２２９】
（実施例３７）
ＴＯ（３）ＴＯ（３）−１２（表２の色素番号２５）の調製
色素（３２．６ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールブルー（Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ ｔｈａｚｏｌｅ ｂｌｕｅ）（Ｃａｒｒｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔ．６（４），５１７（２００４）；およびＢｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１（２４），５７２７（１９９３））（９９ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）と２，２’オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド（１５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３０】
（実施例３８）
ＴＯ（３）ＴＯ（３）−２（表２の色素番号２６）の調製
色素（２８．４ｍｇ）を、Ｎ−カルボキシペンチルチアゾールブルー（７６ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）と３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジ−プロピルアミン（１０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）からＡＯＡＯ−２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３１】
（実施例３９）
１０−（５−（（５−（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノ）ペンチル）アミノカルボニル）ペンチル）−アクリジンオレンジ、塩化物（色素番号１１３、すぐ下に示す）の調製
【０２３２】
【化８５】
色素（２８０ｍｇ）を、１０−（５−カルボキシペンチル）アクリジンオレンジ塩化物（２００ｍｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）とモノｔ−ＢＯＣ−カダベリン（１３０ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ）から色素番号１１１を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３３】
（実施例４０）
１０−（５−（（５−アンモニウムペンチル）アミノカルボニル）ペンチル）アクリジンオレンジ、トリフルオロ酢酸塩（色素番号１１４、すぐ下に示す）の調製
【０２３４】
【化８６】
色素番号１１４（２３４ｍｇ）を、色素番号１１３（２８０ｍｇ、０．４６７ｍｍｏｌ）から色素番号１１２を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３５】
（実施例４１）
ＡＯＲＯ−７（表２の色素番号２７）の調製
化合物（２９ｍｇ）を、化合物番号１１４（３５ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）とロサミン色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ））（４０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）からＡＯＴＯ−３を合成するための手順を使用して調製した。
【０２３６】
（実施例４２）
ＤＭＡＯおよびＡＯＡＯ−７の吸光度および蛍光
ＤＭＡＯおよびＡＯＡＯ−７の、図２および図３に示す吸収スペクトル、ならびに図４に示す蛍光放射スペクトルを、ＰＢＳ緩衝液中で、ＤＮＡの存在を伴わずに、またはＤＮＡの存在（２ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ）を伴って、別々に測定した。色素濃度は全て、４９５ｎｍで０．０５の光学密度となるように調整した。スペクトルを、吸光度のプロットにおいては１に正規化した。ＤＭＡＯと比較すると、ＡＯＡＯ−７は、吸光度において４７１ｎｍに新しい短い波長のピークを示し、これは、ＡＯＡＯ−７の中での２つのアクリジン単量体の凝集を示している。ＤＮＡに結合すると、ＡＯＡＯ−７とＤＭＡＯの吸光度は、それぞれ、遊離の色素と比較すると５ｎｍおよび１０ｎｍの赤色のシフトを示した。遊離のＡＯＡＯ−７の蛍光は、ＤＭＡＯの蛍光よりも約５倍少ない。ＡＯＡＯ−７のより低いバックグラウンドの蛍光は、リアルタイムｑＰＣＲにおいては有利である。ＡＯＡＯ−７のアクリジン単量体１つあたりの蛍光はＤＭＡＯの蛍光に近く、これは、ＤＮＡに結合すると、ＡＯＡＯ−７の２つの単量体はもはや互いに消光することはなく、２つの間のリンカーは、量子収量に対してネガティブな作用は示さないことを示している。
【０２３７】
（実施例４３）
ＴＯＴＯ−１およびＴＯＴＯ３の吸収スペクトル
実施例４２に関して記載した様式と同様の様式において、ＴＯＴＯ−１およびＴＯＴＯ−３の吸収スペクトルを、ＰＢＳ緩衝液の中で、図５に示すようにＤＮＡの存在を伴わずに、または図６に示すように、２ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡの存在下で測定した。図５に示すように、遊離の色素のスペクトルは、中性であるかまたは実質的に正電荷を含まないＢＲＩＤＧＥを有しているＴＯＴＯ−３は分子内Ｈ二量体またはヘアピン構造を形成するが、複数の正電荷を有しているＴＯＴＯ−１は、ほとんどスペクトルがシフトしないことを示している。図６に示すように、ＤＮＡの存在下では、ＴＯＴＯ−１およびＴＯＴＯ−３のいずれの吸収スペクトルもほぼ同じ位置にシフトし、これは、ＴＯＴＯ−３二量体のヘアピン構造がＤＮＡに結合すると開くこと、およびＴＯＴＯ−１とＴＯＴＯ−３はいずれも、同様のタイプのＤＮＡ−色素錯体を形成することを示している。
【０２３８】
（実施例４４）
様々な量のＤＮＡに対して応答するＡＯＡＯ−１２の蛍光
０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、２．０、４．０、６．０、８．０、および１０μｇ／ｍＬの最終濃度のサケ精子ＤＮＡまたは一本鎖の２０マーのオリゴヌクレオチドの混合物の存在下での、２００ｍＬのＰＢＳ中の０．１μＭのＡＯＡＯ−１２の蛍光を、マイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））上で測定した。蛍光を図７に示すように、ＤＮＡの濃度に対してプロットした。蛍光が２．０μｇ／ｍＬまでのＤＮＡに対して直線的に反応したことを見ることができる（差し込み図）。さらに高いＤＮＡ濃度では、反応は、非直線的になる。ＡＯＡＯ−１２は、二本鎖のＤＮＡに結合した場合には、一本鎖のＤＮＡに結合した場合よりも強い蛍光を発する。
【０２３９】
（実施例４５）
ｑＰＣＲにおけるＡＯＡＯ−１２およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのシグナル強度の比較
本実施例では、ｑＰＣＲにおける蛍光シグナルの強度において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも優れたＡＯＡＯ−１２の特性を明らかにする。全てのリアルタイム増幅を、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および様々な濃度の蛍光をモニターするための色素を含む、２０μＬの反応溶液の中で行った。ｐＴＯＰＯプラスミド中のＡＴＰＢ断片（配列番号１）を、０．５μＭの正方向プライマー５’−ＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡ−３’（配列番号２）、０．５μＭの逆方向プライマー５’−ＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＴＣ−３’（配列番号３）を用いて増幅させた。熱によるレジュメは、９５℃で１分間、続いて、９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間のサイクルを５０サイクルと設定した。蛍光は、５５℃の段階で測定した。以前の報告（Ｎａｔｈ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ａｎｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４２，１５（２０００））と一致して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、図８に示すように、ＰＣＲ反応に対する阻害を示した。ここでは、Ｃｔは、より高いＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ濃度では遅れた。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ濃度と比較すると、より高いＡＯＡＯ−１２濃度を、阻害を示すことなく反応に添加することができた。結果として、ＡＯＡＯ−１２を用いた場合の最終的な蛍光強度は数倍高くなる場合があり、これによって、より感度の高い検出が可能となる。あるいは、ＡＯＡＯ−１２を用いた場合には、感度の低い光学デバイスを、サーマルサイクラー蛍光光度計（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）において使用することができ、それによって、より安価な機器がもたらされる。
【０２４０】
（実施例４６）
ヒトゲノムＤＮＡの滴定
ヒトゲノムＤＮＡからのＵＢＣ断片（配列番号８）の増幅を、（１）異なる正方向プライマーと逆方向プライマーのセット（５’−ＡＣＴＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号９）および５’−ＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＧＡＡ−３’（配列番号１０））を使用したこと、ならびに、（２）ヒトＤＮＡの１０倍稀釈物のシリーズを鋳型としたことを除いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（４９５ｎｍでの最終的な吸収ピークは０．０２５の光学密度に相当する、すなわち、Ａ４９５＝０．０２５）またはＡＯＡＯ−１２（最終Ａ４９５＝０．１）を用いて、実施例４５に示した条件と同様の条件下で行った。図８は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩまたはＡＯＡＯ−１２のいずれかを用いて、ヒトＤＮＡの１０５コピーで始めて１０コピーまで減少する複数の反応の増幅プロットを示す。差し込み図は、Ｃｔ値は、いずれの色素を用いた場合も、モニターした最初のコピー数の対数と逆の相関関係にあることを示している。ＡＯＡＯ−１２は、シグナル強度においてはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも明らかに優れている。
【０２４１】
（実施例４７）
ｑＰＣＲにおけるＴＯ、ＴＯＴＯ−１、およびＴＯＴＯ１２
本実施例は、ｑＰＣＲにおける、ＴＯ（チアゾールオレンジ、非対称シアニン色素）またはＴＯＴＯ−１を上回る改良されたＴＯＴＯ−１２の特性を明らかにする。リアルタイム増幅は全て、ＴＯ、ＴＯＴＯ−１、およびＴＯＴＯ−１２を使用したことを除いて、実施例５に記載したように行った。図１１に示すように、ＴＯＴＯ−１は、ＰＣＲ反応を完全に阻害したが、ＴＯＴＯ−１２は、ｑＰＣＲにおいては、ＴＯと比較すると、改善されたＣｔ値と改善された蛍光強度を生じた。ＴＯＴＯ−１２二量体色素は、ＴＯおよびＴＯＴＯ−１色素のそれぞれよりも優れている。
【０２４２】
（実施例４８）
ＡＯＲＯ−７の吸光度および蛍光
実施例４２に関して記載した様式と同様の様式において、ＡＯＲＯ−７の吸収スペクトルを、図１２に示すように、ＰＢＳ緩衝液中で単独で、または２μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡの存在下で得た。ＤＮＡに結合したＡＯＲＯ−７の放射スペクトルを図１３に示す。ヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７には単量体ＡＯ色素と、蛍光非核酸ロサミンＲＯ色素が含まれる。２つの放射ピーク（それぞれ、ＡＯ部分とＲＯ部分による）が記録された。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によるＣｈｒｏｍｏ４上での、４９０ｎｍに設定された励起と５３０ｎｍで回収される放射、すなわち、Ｅｘ４９０／Ｅｍ５３０を用いたチャンネル１において、あるいは、Ｅｘ５８０／Ｅｍ６３０を用いたチャンネル３においては、ＡＯＲＯ−７を用いてｑＰＣＲを記録することができたが、チャンネル２（Ｅｘ５２０／Ｅｍ５７０）では弱かった（データは示さない）。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効果は無視できるほどであるため、単量体色素構成成分であるＡＯまたはＲＯのいずれをも、レポーター色素として選択することができる。
【０２４３】
（実施例４９）
ｑＰＣＲにおけるヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７
本実施例は、ｑＰＣＲにおけるＡＯＲＯ−７の有用性を示す。リアルタイム増幅を、最終的な溶液中で６００ｎｍで０．０２５の光学密度を有しているＡＯＲＯ−７を使用したことを除いて、実施例５のように行った。図１４に示すように、ＡＯＲＯ−７は、ｑＰＣＲの反応経過をモニターするために、そしてアンプリコンの融解曲線（差し込み図）を検出するために、有効に使用することができる。このｑＰＣＲが、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によるｉＣｙｃｌｅ ＩＱ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍのチャンネル３（Ｅｘ５８０／Ｅｍ６３０）でモニターできたという知見は、所望される波長のほとんどの全ての色素が、本明細書中に開示される方法によるｑＰＣＲでのＤＮＡレポーター色素に合い、したがって、スペクトルの使用をｑＰＣＲのモニタリングに拡大することができることの一例を提供する。現在、ほとんどのＴａｑＭａｎプローブにはＦＡＭまたなＶＩＣが使用されている。これらは、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩと同じチャンネルを占めている。配列特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）と、異なる波長の配列非特異的色素（例えば、ＡＯＲＯ−７）をｑＰＣＲにおいて使用することが有利である。この場合、プローブによっては、配列特異性が提供され、そして色素によっては、アンプリコンの他のパラメーター（例えば、融点）が提供される。
【０２４４】
（実施例５０）
ＡＯＡＯ−１２を用いてモニターした融解ピーク
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、アンプリコンの融点をｑＰＣＲ増幅の後に検出することができるという点で有利であることが報告されている。融点は、アンプリコンについての有用な情報を提供する。なぜなら、これは、アンプリコンの大きさとＧＣ含有量の関数であるからである。融点は、ＴａｑＭａｎ反応からは得ることはできない。４種類のアンプリコン、すなわち、ＨＭＢＳ（配列番号４）、ＲＰＬ４（配列番号５）、ＳＤＨＡ（配列番号６）、およびＴＢＰ（配列番号７）による融解曲線を、ＡＯＡＯ−１２（パネルＡ）またはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（パネルＢ）の存在下で増幅させた反応から測定し、そして図１５に示す。ＡＯＡＯ−１２を用いて得られた融解ピークは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて得られたピークと相関関係があった。ＡＯＡＯ−１２は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉよりも弱いが、高い親和性でＤＮＡに結合するため、ＡＯＡＯ−１２による融点は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによる融点よりも約２℃低い。より高い濃度のＡＯＡＯ−１２をリアルタイムＰＣＲ反応において使用することができるため、融解ピークは顕著により高い。データは、ＡＯＡＯ−１２の相対的な有用性を示している。
【０２４５】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたｑＰＣＲ反応は、プライマー−二量体を形成する傾向があり、そして、この傾向はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度と密接に関係していることが報告されている。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、そのように堅くＤＮＡに結合し、これはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの性能を妨げることが主張されている。ＡＯＡＯ−１２はＤＮＡに対する親和性がほとんどないため、妨害は少ないはずである。ＡＯＡＯ−１２のこの特性は、図１５から明らかであり、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下でのＨＭＢＳの増幅反応は、さらなるプライマー二量体のピークを有しているが、ＡＯＡＯ−１２の存在下での同じ増幅は、きれいな特異的ピークを１つだけ示すことである。
【０２４６】
（実施例５１）
ＡＯＡＯ色素の安定性
単量体ＡＯを含む二量体色素の安定性を明らかにした。具体的には、ＡＯＡＯ−１２を、ＰＣＲ産物を含むＰＣＲ反応緩衝液の中で維持した。混合物を９６℃で４０分間加熱した。加熱過程の間に、混合物を、蛍光をモニターするために一時的に６０℃に冷却した。図１６に示すように、ＡＯＡＯ−１２は、９６℃で４０分間安定であり、実質的な蛍光の消失はない。データは、ＰＣＲにおけるＡＯＡＯ−１２の構造安定性を示している。
【０２４７】
（実施例５２）
ＴＯＴＯ−１３（表２の色素番号２９）の調製
色素（１０２ｍｇ）を、Ｎカルボキシペンチルチアゾールオレンジ（１０２ｍｇ、０．２３ミリモル）（実施例３１）と４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（２３ｍｇ、０．１モル）からＡＯＡＯ−２（表２の色素番号７）を合成するための手順を使用して調製した。
【０２４８】
（実施例５３）
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−４−（４−（ジメチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロマイドの調製
エタノール（１００ｍＬ）中の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（３ｇ、２０ミリモル）、Ｎ−（５−カルボキシ−ペンチル）ピコリニウムブロマイド（５．６ｇ、２０ミリモル）、およびピペリジン（２ｍＬ）の混合物を、６０℃で一晩加熱した。混合物を減圧下で乾燥物となるまで蒸発させた。残渣をメタノールの中に再度溶解させ、その後、エーテルで沈殿させると、生成物（６．７ｇ）が得られた。
【０２４９】
（実施例５４）
ＳＴＳＴ−１９（表２の色素番号３１）の調製
色素（８５ｍｇ）を、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−４−（４−（ジメチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロマイド（実施例５３）（２００ｍｇ、０．５ミリモル）と２，２’−オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド（３６ｍｇ、０．２ミリモル）からＡＯＡＯ−２（実施例７）を調製するための手順を使用して調製した。
【０２５０】
（実施例５５）
ＳＴＳＴ−２７（表２の色素番号３０）の調製
色素（８１．８ｍｇ）を、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−４−（４−ジメチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロマイド（実施例５３）（２００ｍｇ、０．５ミリモル）と４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（４４ｍｇ、０．２ミリモル）からＡＯＡＯ−２（実施例７）を調製するための手順を使用して調製した。
【０２５１】
二量体色素または三量体色素のような有用な色素は、本明細書中に記載されている。このような色素は、多数の所望される特性（例えば、比較的低いバックグラウンドの蛍光、比較的低いＰＣＲ阻害、良好な蛍光シグナル強度、および良好な安定性）のいずれかを有している場合がある。一般的には、多くても１つの正電荷を有している色素は、任意の多数の用途（例えば、別の分子の標識における使用、および核酸の存在または核酸が存在しないことの検出における使用）を有している場合がある。さらに、一般的には、実質的には中性であるこのような色素は、任意の多数の用途（例えば、ＰＣＲプロセスにおける使用、あるいは、核酸の存在または核酸が存在しないことの検出における使用、あるいは、定量的リアルタイムＰＣＲにおける使用）を有している。
【０２５２】
多数の有用な二量体色素および三量体色素が記載されている。例として、分子に対して色素の核酸検出能力を付与するための、別の分子との供給結合または別の分子の標識に適している色素、核酸が含まれている場合もまたは含まれていない場合もある試料中の核酸の存在または核酸が存在しないことを検出するために適している色素；ならびに、試料（例えば、核酸増幅に適しているプロセスを受けた試料（試料には標的核酸が含まれているはずである））中での核酸の形成またはそれがないことを検出するために適している色素が記載されている。上記色素の任意のものを調製する方法、および上記色素の任意のものを使用する方法もまた記載されている。本明細書中に記載される組成物を使用する任意の方法が、本明細書中で意図される。本発明の適切な色素を含む、試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するために適しているキット、および標的核酸が含まれているはずである試料中の標的核酸の増幅に十分である適切な組成物が、本明細書中で意図され、同様に、有用な用途を有している本明細書中に記載される組成物が含まれている任意のキットも意図される。
【０２５３】
本明細書中の記載に関する様々な改良、プロセス、さらには多数の構造を、明細書を参照して当業者に容易に明らかであるように、適用できることができる。本明細書中で特定されている様々な参考文献、刊行物、米国仮特許出願および特許出願、または外国の特許出願、ならびに／あるいは、米国特許または外国の特許は、それらのそれぞれが、その引用によってそれらの全体が本明細書中に組み入れられる。様々な態様および特徴が、理解、意見、理論、根底にある仮定、および／または実施例もしくは机上の実験例に関して説明され、記載されているが、任意のそのような理解、意見、理論、根底にある仮定、および／または実施例もしくは机上の実験例は、拘束力のあるものではないことが理解されるであろう。様々な態様および特徴が本明細書中の様々な実施例および実施例に関して記載されているが、それらのいずれも、添付される特許請求の範囲の範囲全体にかかわる限定ではないことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】図１（ＦＩＧ．１）は、リリースオンデマンド機構によるＤＮＡの結合の模式図である。ここでは、色素の３種類の立体構造の状態は実質的に平衡状態にある。
【図２】図２（ＦＩＧ．２）は、ＰＢＳ緩衝液中の、ａ）二量体色素ＡＯＡＯ−７（○）およびｂ）単量体ＡＯ色素ＤＭＡＯ（△）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図３】図３（ＦＩＧ．３）は、緩衝液中またはＤＮＡの存在下での、ａ）二量体色素ＡＯＡＯ−７（●）およびｂ）単量体ＡＯ色素ＤＭＡＯ（▲）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図４】図４（ＦＩＧ．４）は、ＤＮＡの添加前のＰＢＳ緩衝液中のＤＭＡＯ（△）およびＡＯＡＯ−７（○）（それぞれ、ａ）およびｃ））、ならびに、ＤＮＡの添加後のＰＢＳ緩衝液中のＤＭＡＯ（▲）およびＡＯＡＯ−７（●）（それぞれ、ｂ）およびｄ））の、波長（ｎｍ）に対する相対的な蛍光、または蛍光放射スペクトルのグラフによる表示である。
【図５】図５（ＦＩＧ．５）は、緩衝液中の、ａ）ＴＯＴＯ−１（米国特許第５，５８２，９７７号にしたがって調製した）（濃い線）、およびｂ）ＴＯＴＯ−３（薄い線）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図６】図６（ＦＩＧ．６）は、緩衝液中およびＤＮＡの存在下での、ａ）米国特許第５，５８２，９７７号のＴＯＴＯ−１（濃い線）、およびｂ）ＴＯＴＯ−３（薄い線）の、波長（ｎｍ）に対する正規化された吸光度、あるいは、正規化された吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図７】図７（ＦＩＧ．７）には、溶液中およびＡＯＡＯ−１２（０．２μＭ）の存在下の、一本鎖ＤＮＡ（◇）および二本鎖のＤＮＡ（◆）の、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）に対する相対的な蛍光または滴定のグラフによる表示が含まれる。図７にはまた、両者の間での実質的に直線的な関係を示す、ＤＮＡ濃度に対する相対的な蛍光の差し込み図によるグラフ表示も含まれる。
【図８】図８（ＦＩＧ．８）は、低い色素濃度（△）および高い色素濃度（▲）のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ならびに、低い色素濃度（□）および高い色素濃度（■）のＡＯＡＯ−１２を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する相対的な蛍光またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示である。ここでは、Ｃｔは、一般的には、蛍光シグナルが任意の限界点に達するサイクル数を意味し、ＰＣＲ増幅プロットにおいては、通常、蛍光シグナルがベースラインから少し上昇し始める点に対応する。それぞれの色素について、相対的な色素濃度が、ＰＢＳ緩衝液中の色素の最大吸収で光学密度（ＯＤ）が測定された。４７１ｎｍでの１×および２×のＡＯＡＯ−１２の色素濃度は、それぞれ、０．１および０．２のＯＤに対応しており、そして４９５ｎｍでの０．５×および１×のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの色素濃度は、それぞれ、０．０２５および０．０５のＯＤに対応していた。
【図９】図９（ＦＩＧ．９）には、それぞれの光学濃度で蛍光プローブとしてＡＯＡＯ−１２（□）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（△）を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する相対的な蛍光またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示が含まれる。それぞれの色素について、相対的な色素濃度が、ＰＢＳ緩衝液中の色素の最大吸収で光学密度（ＯＤ）が測定された。４７１ｎｍでのＡＯＡＯ−１２の色素濃度は、０．４のＯＤに対応しており、そして４９５ｎｍでのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの色素濃度は、０．０２５のＯＤに対応していた。図９にはまた、ＡＯＡＯ−１２（■）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（▲）を使用した、ＤＮＡ試料のコピー数の対数に対するＣｔの差し込み図によるグラフ表示も含まれており、これらは、それぞれの場合において、両者の間での実質的に直線的な関係を示している。
【図１０】図１０（ＦＩＧ．１０）は、二量体色素を形成させるための単量体色素Ｑ１およびＱ２の可能性のある組み合わせＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの模式図である。組み合わせＡには、２つの同じレポーター蛍光核酸色素または同様のスペクトルを有している２つのレポーター蛍光核酸色素が含まれる。組み合わせＢには、１つのレポーター蛍光核酸色素と１つの非レポーターＤＮＡ結合分子が含まれる。組み合わせＣには、１つの非レポーターＤＮＡ結合分子と１つのレポーター非ＤＮＡ結合色素が含まれる。組み合わせＤには、１つのレポーター蛍光核酸色素と１つの非レポーター非蛍光非核酸色素が含まれる。組み合わせＥには、１つのレポーター蛍光核酸色素と１つのレポーター蛍光非核酸色素が含まれる。
【図１１】図１１（ＦＩＧ．１１）は、ＴＯ単量体色素（○）、ＴＯＴＯ−１単量体色素（△）、およびＴＯＴＯ−１２二量体色素（□）（化合物２４、表２）を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する蛍光強度またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示である。
【図１２】図１２（ＦＩＧ．１２）は、ＰＢＳ緩衝液中のヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７（○）、ならびに、ＰＢＳ緩衝液中およびＤＮＡの存在下でのヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７（＋）の、波長（ｎｍ）に対する吸光度または吸収スペクトルのグラフによる表示である。
【図１３】図１３（ＦＩＧ．１３）は、ヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７の波長（ｎｍ）に対する任意の蛍光強度または放射スペクトルのグラフによる提示であり、５００ｎｍ（実線、濃い線）または約５６０ｎｍ（点線、薄い線）のいずれかでの励起が別々に記録された。
【図１４】図１４（ＦＩＧ．１４）には、ヘテロ二量体色素ＡＯＲＯ−７を使用した、サイクル数（Ｃｔ）に対する相対的な蛍光強度またはＰＣＲ増幅のグラフによる表示が含まれる。図１４にはまた、温度（℃）に対する相対的な蛍光シグナルの差込図によるグラフ表示、また、融解曲線のプロットも含まれる。
【図１５】図１５（ＦＩＧ．１５）は、温度（℃）に対する相対的な蛍光の変化のグラフによる提示、または、融解曲線のプロットである。４種類のアンプリコンＴＢＰ（○）、ＳＤＨＡ（△）、ＲＰＬ４（◇）、およびＨＭＢＳ（□）の、Ａ）ＡＯＡＯ−１２を使用したモニタリング（点線）、およびＢ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用したモニタリング（実線）。
【図１６】図１６（ＦＩＧ．１６）は、ＡＯＡＯ−１２の、９６℃での時間（分）に対する６０℃でモニターした相対的な蛍光、または９６℃での熱安定性のグラフによる表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法であって：
該試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程であって、該蛍光核酸色素は以下の式を有しており：
【化１】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約８個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分と該Ｑ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分と該Ｑ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じである、工程；
該標的核酸の増幅のために十分である該試験溶液を使用してプロセスを実行する工程であって、該試料には、該標的核酸が含まれるはずである、工程；ならびに、
該レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で該試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。
【請求項２】
標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法であって：
該試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程であって、該蛍光核酸色素は以下の式を有しており：
【化２】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ３は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じである、工程；
該標的核酸の増幅のために十分である該試験溶液を使用してプロセスを実行する工程であって、該試料には、該標的核酸が含まれるはずである、工程；ならびに、
該レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で該試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。
【請求項３】
前記蛍光核酸色素構成成分が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記実行工程に、リアルタイムＰＣＲプロセスを実行する工程が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造：
【化３】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ２とＲ３の一方は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ２が、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ３はＨまたは−ＣＨ３であり；
Ｒ３が、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＣＮ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２から選択され；
Ｒ６はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ７はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
隣接しているＲ６またはＲ７とＲ１のそれぞれの対について、Ｒ６またはＲ７とＲ１は独立して、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し；そして、
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１はそれぞれＨであり；Ｒ２はＨであり：Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが前記構造に結合していることを示し；Ｒ６がそれぞれ−ＣＨ３であり；そしてＲ７はそれぞれ−ＣＨ３である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造：
【化４】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、前記Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個（１、１０を含むの炭素）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造を有している、請求項１に記載の方法：
【化５】
式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである。
【請求項９】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造：
【化６】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＢＲＩＤＧＥが以下の式：
【化７】
【化８】
であって、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数である、
式を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＢＲＩＤＧＥに、約８個から約１００個（１、１００を含む）の水素以外の原子が含まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０がそれぞれ独立して、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている少なくとも１つの連結結合が含まれている部分を含むＮＡＢＥＧ；あるいは、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＲＩＤＧＥが以下の式：
【化９】
であって、式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；αは２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり；ｂは０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、ｃは０または１である、
式を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
式中、ｘが５であり；αとγが同じであり、２または３であり、；βは２であり；ｂは０、１、２、または３であり；そして、ｃは１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｑ１およびＱ２が同じである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１０】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれＨであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ６はそれぞれ−ＣＨ３であり；
Ｒ７はそれぞれ−ＣＨ３であり；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１１】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、該Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１２】
であって、式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１３】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光核酸色素が以下の構造：
【化１４】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している、請求項１および４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
以下の式：
【化１５】
であって、式中、Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分および該Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分はレポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分および該Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じであり；そして、
ＢＲＩＤＧＥには約８個から約１５０個の水素以外の原子と、１個までの正電荷が含まれており、そして以下の式を有しており：
【化１６】
式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；
式中、該Ｑ１色素構成成分が非対称シアニン色素であり、該Ｑ２色素構成成分が非対称シアニン色素である場合には、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉの合計は、３よりも大きい数であり、または、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の少なくとも１つは、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、またはチオ尿素結合が含まれている少なくとも１つの連結結合が含まれている部分を含むＮＡＢＥＧ；あるいは、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールである
式を有している組成物。
【請求項２２】
ＢＲＩＤＧＥに、約１２個から約６０個（１２、６０を含む）の水素以外の原子が含まれている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＢＲＩＤＧＥに、約１５個から約４０個（１５、４０を含む）の水素以外の原子が含まれている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｑ１が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される蛍光核酸色素構成成分であり、そしてＱ２が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される蛍光核酸色素構成成分である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記アクリジン色素が以下の構造：
【化１７】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ２とＲ３の一方は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ２がＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ３はＨまたは−ＣＨ３であり；
Ｒ３がＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＣＮ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２から選択され；
Ｒ６はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ７はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
隣接しているＲ６またはＲ７とＲ１のそれぞれの対について、Ｒ６またはＲ７とＲ１は独立して、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し；そして、
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｒ１はそれぞれＨであり；Ｒ２はＨであり：Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；Ｒ６はそれぞれ−ＣＨ３であり；そしてＲ７はそれぞれ−ＣＨ３である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記非対称シアニン色素が以下の構造：
【化１８】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、該Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子（１、３を含む）が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、そのＲ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記非対照シアニン色素が以下の構造：
【化１９】
であって、式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記フェナントリジニウム色素が以下の構造：
【化２０】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
ＢＲＩＤＧＥが以下の式：
【化２１】
であって、式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；αは２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり；ｂは０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、ｃは０または１である
式を有している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
式中、ｘが５であり；αとγが同じであり、２または３であり、；βは２であり；ｂは０、１、２、または３であり；そして、ｃは１である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｑ１およびＱ２が同じである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２２】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれＨであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ６はそれぞれ−ＣＨ３であり；
Ｒ７はそれぞれ−ＣＨ３であり；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２３】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、該Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２４】
であって、式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２５】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３７】
以下の構造：
【化２６】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項３８】
以下の構造：
【化２７】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項３９】
以下の構造：
【化２８】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項４０】
以下の構造：
【化２９】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項４１】
以下の式：
【化３０】
であって、式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ３は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じである
式を有している組成物。
【請求項４２】
ＢＲＩＤＧＥに以下：
【化３１】
が含まれており、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ１は、前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており；
Ｌ２は、該一方の色素構成成分ではないＱ１色素構成成分およびＱ２色素構成成分のうちの色素構成成分に共有結合させられており；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、以下の式を有しており：
【化３２】
式中、Ｔは、置換された炭素、置換された窒素、または状況に応じて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ３は、Ｑ３に共有結合させられており、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；そして、
Ｂ’は、以下の式を有しており：
【化３３】
式中、−（ＣＨ２）α’は、Ｔに共有結合させられており、そしてＡ１４はＬ３に共有結合させられており；
Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、およびＡ１４はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α’、β’、γ’、およびδ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数であり；そして
ａ’、ｂ’、およびｃ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数である、
請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
以下の式：
【化３４】
であって、式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分であり；そしてＲｒは、反応基または官能基である
式を有している組成物。
【請求項４４】
ＢＲＩＤＧＥに以下：
【化３５】
が含まれており、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ１は、前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており；
Ｌ２は、該一方の色素構成成分ではないＱ１色素構成成分およびＱ２色素構成成分のうちの色素構成成分に共有結合させられており；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、以下の式を有しており：
【化３６】
式中、Ｔは、置換された炭素、置換された窒素、または状況に応じて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ３は、Ｒｒに共有結合させられており、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；そして、
Ｂ’は、以下の式を有しており：
【化３７】
式中、−（ＣＨ２）α’は、Ｔに共有結合させられており、そしてＡ１４はＬ３に共有結合させられており；
Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、およびＡ１４はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α’、β’、γ’、およびδ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数であり；そして
ａ’、ｂ’、およびｃ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数である、
請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の組成物を基質分子に結合させる工程が含まれる、色素を使用する方法。
【請求項４６】
前記基質分子が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、および固体表面の分子から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある、試料を調製する方法であって：
該試料と、請求項２１、３０、および４１のいずれかに記載の組成物の組み合わせを提供する工程であって、ここでは、核酸が該試料中に存在している場合には、核酸−色素錯体が形成される工程、
が含まれる、方法。
【請求項４８】
前記組み合わせをインキュベートする工程がさらに含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
試料中の核酸の存在またはそれが存在しないことを決定する方法であって：
該試料と、請求項２１、３０、および４１のいずれかに記載の組成物の組み合わせを提供する工程であって、ここでは、核酸が該試料中に存在している場合には、核酸−色素錯体が形成される工程；ならびに、
核酸錯体が形成された場合には、それによって光が吸収されるように、十分な波長の光で該組み合わせを照射し、そして、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。
【請求項５０】
標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある、試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するためのキットであって：
該標的核酸が含まれているはずである該試料中の該標的核酸の増幅のために十分な少なくとも１つの組成物；および
請求項２１、３０、および４１のいずれかに記載の組成物
が含まれている、キット。
【請求項１】
標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法であって：
該試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程であって、該蛍光核酸色素は以下の式を有しており：
【化１】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約８個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分と該Ｑ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分と該Ｑ２色素構成成分のうち少なくとも一方の色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じである、工程；
該標的核酸の増幅のために十分である該試験溶液を使用してプロセスを実行する工程であって、該試料には、該標的核酸が含まれるはずである、工程；ならびに、
該レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で該試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。
【請求項２】
標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法であって：
該試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程であって、該蛍光核酸色素は以下の式を有しており：
【化２】
式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子を含む、実質的に脂肪族の、実質的に中性のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ３は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じである、工程；
該標的核酸の増幅のために十分である該試験溶液を使用してプロセスを実行する工程であって、該試料には、該標的核酸が含まれるはずである、工程；ならびに、
該レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で該試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。
【請求項３】
前記蛍光核酸色素構成成分が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記実行工程に、リアルタイムＰＣＲプロセスを実行する工程が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造：
【化３】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ２とＲ３の一方は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ２が、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ３はＨまたは−ＣＨ３であり；
Ｒ３が、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＣＮ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２から選択され；
Ｒ６はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ７はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
隣接しているＲ６またはＲ７とＲ１のそれぞれの対について、Ｒ６またはＲ７とＲ１は独立して、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し；そして、
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１はそれぞれＨであり；Ｒ２はＨであり：Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが前記構造に結合していることを示し；Ｒ６がそれぞれ−ＣＨ３であり；そしてＲ７はそれぞれ−ＣＨ３である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造：
【化４】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、前記Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個（１、１０を含むの炭素）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造を有している、請求項１に記載の方法：
【化５】
式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである。
【請求項９】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造：
【化６】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＢＲＩＤＧＥが以下の式：
【化７】
【化８】
であって、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数である、
式を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＢＲＩＤＧＥに、約８個から約１００個（１、１００を含む）の水素以外の原子が含まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０がそれぞれ独立して、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている少なくとも１つの連結結合が含まれている部分を含むＮＡＢＥＧ；あるいは、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＲＩＤＧＥが以下の式：
【化９】
であって、式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；αは２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり；ｂは０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、ｃは０または１である、
式を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
式中、ｘが５であり；αとγが同じであり、２または３であり、；βは２であり；ｂは０、１、２、または３であり；そして、ｃは１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｑ１およびＱ２が同じである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１０】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれＨであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ６はそれぞれ−ＣＨ３であり；
Ｒ７はそれぞれ−ＣＨ３であり；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１１】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、該Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１２】
であって、式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化１３】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光核酸色素が以下の構造：
【化１４】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している、請求項１および４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
以下の式：
【化１５】
であって、式中、Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分および該Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分はレポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分および該Ｑ２色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じであり；そして、
ＢＲＩＤＧＥには約８個から約１５０個の水素以外の原子と、１個までの正電荷が含まれており、そして以下の式を有しており：
【化１６】
式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；
式中、該Ｑ１色素構成成分が非対称シアニン色素であり、該Ｑ２色素構成成分が非対称シアニン色素である場合には、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉの合計は、３よりも大きい数であり、または、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の少なくとも１つは、少なくとも１つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、またはチオ尿素結合が含まれている少なくとも１つの連結結合が含まれている部分を含むＮＡＢＥＧ；あるいは、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールである
式を有している組成物。
【請求項２２】
ＢＲＩＤＧＥに、約１２個から約６０個（１２、６０を含む）の水素以外の原子が含まれている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＢＲＩＤＧＥに、約１５個から約４０個（１５、４０を含む）の水素以外の原子が含まれている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｑ１が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される蛍光核酸色素構成成分であり、そしてＱ２が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される蛍光核酸色素構成成分である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記アクリジン色素が以下の構造：
【化１７】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ２とＲ３の一方は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ２がＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ３はＨまたは−ＣＨ３であり；
Ｒ３がＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示す場合には、Ｒ２は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＣＮ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２から選択され；
Ｒ６はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
Ｒ７はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルであり；
隣接しているＲ６またはＲ７とＲ１のそれぞれの対について、Ｒ６またはＲ７とＲ１は独立して、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成し；そして、
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｒ１はそれぞれＨであり；Ｒ２はＨであり：Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；Ｒ６はそれぞれ−ＣＨ３であり；そしてＲ７はそれぞれ−ＣＨ３である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記非対称シアニン色素が以下の構造：
【化１８】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、該Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個のヘテロ原子（１、３を含む）が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、そのＲ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記非対照シアニン色素が以下の構造：
【化１９】
であって、式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記フェナントリジニウム色素が以下の構造：
【化２０】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
ＢＲＩＤＧＥが以下の式：
【化２１】
であって、式中、ｘはそれぞれ独立して、１から１１（１、１１を含む）から選択される整数であり；αは２から約２０（２、２０を含む）から選択される整数であり；βおよびγはそれぞれ独立して、２または３であり；ｂは０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、ｃは０または１である
式を有している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
式中、ｘが５であり；αとγが同じであり、２または３であり、；βは２であり；ｂは０、１、２、または３であり；そして、ｃは１である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｑ１およびＱ２が同じである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２２】
であって、式中、Ｒ１はそれぞれＨであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ６はそれぞれ−ＣＨ３であり；
Ｒ７はそれぞれ−ＣＨ３であり；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２３】
であって、式中、Ｒ１’は、Ｈ；１個の炭素から６個の炭素（１、６を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ９；−ＳＲ１０；−ＮＲ１１Ｒ１２；−ＣＮ；−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１３；−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１４；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１５；または小溝結合剤と結合した置換基であるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ１’に、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５の少なくとも１つが含まれている場合には、該Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、および、Ｒ１５のうちの任意のものは、独立して、Ｈ、または、状況に応じて１個から２個（１、２を含む）の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル；または、アリールであり；
Ｒ１’にＲ１１とＲ１２が含まれている場合には、Ｒ１１とＲ１２は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｘは、ＯおよびＳから選択され；
ｎは、０、１、および２から選択され；
Ｒ６は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ７は、Ｈ；状況に応じて、アリールと、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか；あるいは、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；
Ｒ８’は、Ｈ；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から１０個の炭素（１、１０を含む）を有しているアルキルもしくはアルケニル；ハロゲン；−ＯＲ１６；−ＳＲ１６；−ＮＲ１６Ｒ１７；または、状況に応じて、ハロゲン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から３個（１、３を含む）のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり；
Ｒ８とＲ８’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキル、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２（Ｃ１、Ｃ２を含む）アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに１回から４回（１回、４回を含む）置換することができ；
Ｒ１６およびＲ１７の少なくとも一方が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７の任意のものは、独立して、Ｈ；状況に応じて１個から２個の窒素が組み込まれている、１個の炭素から１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているアルキル、またはアリールであり；
Ｒ１６およびＲ１７が含まれている任意のＲ６、Ｒ８、およびＲ８’については、該Ｒ１６およびＲ１７は、一緒に、５員環または６員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、ＮおよびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれ；
Ｒ１’、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の１つだけが、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２４】
であって、式中、Ｒ７は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造：
【化２５】
であって、式中、Ｒ１は、ＢＲＩＤＧＥが該構造に結合していることを示し；そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３７】
以下の構造：
【化２６】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項３８】
以下の構造：
【化２７】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項３９】
以下の構造：
【化２８】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項４０】
以下の構造：
【化２９】
であって、式中、Ψは、Ｉ−またはＣｌ−である
構造を有している色素。
【請求項４１】
以下の式：
【化３０】
であって、式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；Ｑ３は、蛍光核酸色素構成成分、非蛍光核酸色素構成成分、蛍光非核酸色素構成成分、および非蛍光非核酸色素構成成分から選択される色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、レポーター色素構成成分であり；該Ｑ１色素構成成分、該Ｑ２色素構成成分、および該Ｑ３色素構成成分の少なくとも１つの色素構成成分は、蛍光核酸色素構成成分または非蛍光核酸色素構成成分であり；そして、該レポーター色素構成成分と該蛍光核酸色素構成成分は、状況によっては同じである
式を有している組成物。
【請求項４２】
ＢＲＩＤＧＥに以下：
【化３１】
が含まれており、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ１は、前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており；
Ｌ２は、該一方の色素構成成分ではないＱ１色素構成成分およびＱ２色素構成成分のうちの色素構成成分に共有結合させられており；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、以下の式を有しており：
【化３２】
式中、Ｔは、置換された炭素、置換された窒素、または状況に応じて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ３は、Ｑ３に共有結合させられており、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；そして、
Ｂ’は、以下の式を有しており：
【化３３】
式中、−（ＣＨ２）α’は、Ｔに共有結合させられており、そしてＡ１４はＬ３に共有結合させられており；
Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、およびＡ１４はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α’、β’、γ’、およびδ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数であり；そして
ａ’、ｂ’、およびｃ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数である、
請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
以下の式：
【化３４】
であって、式中、ＢＲＩＤＧＥは、約１５個から約１５０個の水素以外の原子と、１つまでの正電荷を含む、実質的に脂肪族のリンカーであり；Ｑ１は、蛍光核酸色素構成成分であり；Ｑ２は、蛍光核酸色素構成成分であり；そしてＲｒは、反応基または官能基である
式を有している組成物。
【請求項４４】
ＢＲＩＤＧＥに以下：
【化３５】
が含まれており、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ１は、前記Ｑ１色素構成成分および前記Ｑ２色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており；
Ｌ２は、該一方の色素構成成分ではないＱ１色素構成成分およびＱ２色素構成成分のうちの色素構成成分に共有結合させられており；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、およびｉはそれぞれ独立して、０、または１から約２０（１、２０を含む）までの整数であり；そして、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０の１つは、以下の式を有しており：
【化３６】
式中、Ｔは、置換された炭素、置換された窒素、または状況に応じて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；
Ｌ３は、Ｒｒに共有結合させられており、単結合を含む部分；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている、１個の炭素から約１２個の炭素（１、１２を含む）を有しているポリメチレン単位；または、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれているアリールであり；そして、
Ｂ’は、以下の式を有しており：
【化３７】
式中、−（ＣＨ２）α’は、Ｔに共有結合させられており、そしてＡ１４はＬ３に共有結合させられており；
Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、およびＡ１４はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基（ＮＡＢＥＧ）；状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル；あるいは、状況に応じて、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている少なくとも１つの飽和した５員環または６員環であり；
α’、β’、γ’、およびδ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数であり；そして
ａ’、ｂ’、およびｃ’はそれぞれ独立して、０、または１から約２０まで（１、２０を含む）の整数である、
請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の組成物を基質分子に結合させる工程が含まれる、色素を使用する方法。
【請求項４６】
前記基質分子が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、および固体表面の分子から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある、試料を調製する方法であって：
該試料と、請求項２１、３０、および４１のいずれかに記載の組成物の組み合わせを提供する工程であって、ここでは、核酸が該試料中に存在している場合には、核酸−色素錯体が形成される工程、
が含まれる、方法。
【請求項４８】
前記組み合わせをインキュベートする工程がさらに含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
試料中の核酸の存在またはそれが存在しないことを決定する方法であって：
該試料と、請求項２１、３０、および４１のいずれかに記載の組成物の組み合わせを提供する工程であって、ここでは、核酸が該試料中に存在している場合には、核酸−色素錯体が形成される工程；ならびに、
核酸錯体が形成された場合には、それによって光が吸収されるように、十分な波長の光で該組み合わせを照射し、そして、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。
【請求項５０】
標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある、試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するためのキットであって：
該標的核酸が含まれているはずである該試料中の該標的核酸の増幅のために十分な少なくとも１つの組成物；および
請求項２１、３０、および４１のいずれかに記載の組成物
が含まれている、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００８−５３３４９１（Ｐ２００８−５３３４９１Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０２１３３（Ｐ２００８−５０２１３３）
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９９１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９９６０５
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０７３１０３６３）バイオティウム， インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０７３１０３７４）アレロジック バイオサイエンシーズ コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９９１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９９６０５
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０７３１０３６３）バイオティウム， インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０７３１０３７４）アレロジック バイオサイエンシーズ コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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