亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法
本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視する方法に関する。方法は、酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の、少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子との反応に基づく。このレポータ分子は、その配列内に少なくとも１つの非メチル化シトシン残基を含む。非メチル化シトシン残基の、亜硫酸水素塩により媒介されるウリジン残基への変換の後、ＵＮＧは、ウラシル塩基をＤＮＡバックボーンから除去して、それを熱誘導の加水分解に敏感なものにする。最後に、この断片化プロセスの間にＤＮＡレポータ分子から解放される標識が検出される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視する方法に関する。方法は、酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の、少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子との反応に基づき、レポータ分子は、その配列に少なくとも１つの非メチル化シトシン残基を含む。非メチル化シトシン残基からウリジン残基への亜硫酸水素塩により媒介される変換の後、ＵＮＧは、ＤＮＡバックボーンからウラシル塩基を除去し、ゆえに、ＤＮＡバックボーンを、熱誘導の加水分解に敏感なものにする。最後に、この断片化プロセスの間にＤＮＡレポータ分子から解放される標識が検出される。
【０００２】
ＵＮＧ又はＵＤＧと略記されることがあるウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、同様の又は同義のものとして理解されるべきである。いずれの場合も、これらの語は、本明細書において、ＤＮＡバックボーンを熱誘導の加水分解に敏感なものにする酵素を示すために使用される。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡメチル化は、原核生物及び真核細胞の双方を含む様々な生体のゲノムに見つけられる。原核生物において、ＤＮＡメチル化は、シトシン塩基及びアデニン塩基の両方に生じ、ホスト制限システムの一部を含む。しかしながら、多細胞真核生物において、メチル化は、シトシン塩基に限られるようであり、遺伝子発現の抑制された染色質状態及び抑制に関連する（例えばWilson, G.G. and Murray, N.E. (1991) Annu. Rev. Genet. 25, 585-627において研究されている）。
【０００４】
哺乳動物細胞において、ＤＮＡメチル化は、主に、ゲノムにおいて不規則に分散され過少に示されるＣｐＧジヌクレオチドに生じる。通常は非メチル化のＣｐＧｓ（ＣｐＧアイランドと呼ばれる）のクラスタは、多くのプロモータ領域に見つけられる（例えばLi, E. (2002) Nat. Rev. Genet. 3, 662-673において研究されている）。異所性遺伝子サイレンシングにつながるＤＮＡメチル化の変化が、いくつかのヒト癌において実際に示された（例えばRobertson, K.D. and Wolffe, A.P. (2000) Nat. Rev. Genet. 1, 11-19において研究されている）。プロモータの過剰メチル化は、癌抑制遺伝子の不活性化につながるよくあるメカニズムであることが実際に示された（Bird, A.P. (2002) Genes Dev. 16, 6-21）。
【０００５】
個別の遺伝子の差動メチル化を実験的に測定するための様々な方法が存在する（例えばRein, T. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 2255-2264において研究されている）。これらの技法は、とりわけ亜硫酸水素塩シークエンシング、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ（メチライト）及びパイロシークエンシングを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の技法を実施するための１つの共通の前提条件は、解析されるべきＤＮＡの亜硫酸水素塩により媒介される変換（亜硫酸水素塩修飾とも呼ばれる）である。具体的には、非メチル化シトシン残基が、ウリジン残基に変換される。シトシンからウラシルへの亜硫酸水素塩により媒介される変換のための３ステップ反応スキームが、図１に概略的に示されている。要するに、シトシンは、弱酸性条件下で、シトシン−亜硫酸水素塩にスルホン化される。ウラシル−亜硫酸水素塩への加水分解脱アミノ化は、自発的に生じる。ウラシル−亜硫酸水素塩は、塩基性条件下で、ウラシルに脱スルホン化される。
【０００７】
亜硫酸水素塩処理の間、メチル化シトシン残基がウリジン残基に変換されないので、非メチル化ＣｐＧアイランドのＤＮＡ配列は、（ＣからＵへ）効果的に変更され、メチル化ＤＮＡはその元の配列を維持する。
【０００８】
しかしながら、ＤＮＡメチル化ステータスの解析に基づく有効な診断結果のために、ＤＮＡが最大効率で変換されることが望ましく、すなわち、理想的には、所与のＤＮＡ配列に存在する非メチル化シトシン残基の１００％がウリジン残基に変換されることが望ましい。
【０００９】
亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換は、一般に、市販されている反応キットを使用して実施される。これらのテストシステムにおいて、ＤＮＡは、しばしば比較的高い反応温度（例えば、６０℃）で、長時間（多くの場合、一晩）インキューベートされる。ＤＮＡを変性させるために、このインキュベーション時間の間、９５℃までの繰り返される加熱ステップが必要である。多くの場合、インキュベーション時間は、ＤＮＡ品質の特定のレベルを維持しつつ十分とみられる及び／又は許容可能とされるだけの長い時間単に反応をランさせることによって、最大のＤＮＡ変換効率に達すると考えられる。他方、長時間の加熱期間は、最終的に、ＤＮＡの劣化を生じさせ、ＤＮＡ収率及び完全性の低下をもたらすことも明らかである。これは、例えばサンプル中のＤＮＡ濃度が低い場合、任意の下流の解析にとって破滅的である。
【００１０】
しかしながら、解析されるべき異なるサンプルＤＮＡ又は異なるアプリケーションは、最大効率を達成するために、互いに異なる実験セットアップを必要とする可能性がある。例えば、精製されていないＤＮＡを有する粗溶解物の使用は、精製されたサンプルＤＮＡより多くの不確実さをもつ。粗溶解物には、亜硫酸水素塩と相互作用し、ゆえにＤＮＡ転換反応と干渉する可能性のある他の物質が存在する。
【００１１】
上述の検討において、変換するのが容易であるＤＮＡサンプル（例えば精製されたＤＮＡ分子）が解析される場合、「１回のインキュベーション時間がすべてに適合する」という一般的なアプローチは、それが長時間の熱への暴露のためＤＮＡ品質の不必要な低下につながるので、合理的でないことが明らかである。逆もまた同じであり、複雑なサンプル（例えば粗溶解物、体液、凍結生体組織）中のＤＮＡは、仮にあったとしても、かなり少ない程度しか変換されることができない。
【００１２】
現在、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換のパフォーマンス及び進行を能動的に監視する方法は利用可能でない。しかしながら、このような方法の提供は、各個別の反応のエンドポイント（すなわち１００％の完了）を正確に決定することを助け、それにより、汎用プロトコルからサンプル特化の反応条件に切り替えることを可能にし、不必要な及び過剰な加熱インキュベーション時間が回避されることができ、ゆえにＤＮＡ品質を改善することができる。
【００１３】
それゆえ、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の正確な監視を可能にし、上述の制限を克服する方法の継続するニーズがなお存在する。具体的には、解析される各々のサンプルＤＮＡの個別化された反応条件のセットアップを可能にし、ゆえに、差動ＤＮＡメチル化解析の結果を改善する対応する方法のニーズがある。
【００１４】
本発明の目的は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視するための新しいアプローチを提供することである。
【００１５】
より具体的には、本発明の目的は、変換のエンドポイントの精確な判定を可能にする方法を提供することである。
【００１６】
更に、本発明の目的は、用いられるサンプルＤＮＡの特定の要求に適用される反応条件の正確な制御及び整合を可能にし、得られるＤＮＡ品質の全体的な改善をもたらす方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これらの目的及び以下の記述から明らかになる他の目的は、独立請求項に記載の発明の主題によって達成される。本発明の好適な実施形態のいくつかは、従属請求項の発明の主題によって規定される。
【００１８】
１つの見地において、本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法であって、
（ａ）解析されるべきサンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するステップであって、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、（ｉ）そのヌクレオチド配列中の少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、（ｉｉ）少なくとも１つの標識と、を含み、サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される、ステップと、
（ｂ）亜硫酸水素塩を空間的に分離された反応コンパートメントに加えて、サンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するステップと、
（ｃ）ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えて、ＤＮＡバックボーンからの、ステップ（ｂ）で得られたウラシル塩基の除去を媒介するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＤＮＡを、熱処理によって断片化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の間、少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子から解放される少なくとも１つの標識を検出するステップと、
を含む。
【００１９】
一実施形態において、方法は更に、
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた結果を基準値と比較するステップ、
を含む。
【００２０】
別の実施形態において、検出ステップは、所与の時間期間中に少なくとも一回繰り返される。
【００２１】
好適には、ステップ（ｅ）で得られた結果は、ステップ（ｂ）による反応の進行を制御するために使用される。
【００２２】
好適な実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、合成オリゴヌクレオチドである。特定の好適な実施形態において、少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子は、サポートに不動化される。
【００２３】
別の好適な実施形態において、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼは熱安定性である。
【００２４】
１つの特定の実施形態において、ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられたのと同じ反応コンパートメント内で実施される。代替の実施形態において、任意の１又は複数のステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられる反応コンパートメントと流体接続される少なくとも１つの他の空間的に分離された反応コンパートメント内で実施される。
【００２５】
他の特定の実施形態において、少なくとも１つの、好適には全ての反応コンパートメントは、反応コンパートメント内の温度を制御し、調節するための１又は複数の温度制御ユニットを備える。
【００２６】
好適な実施形態において、反応コンパートメントの間の空間的な分離は、半透膜、好適にはサイズ排除メンブレン又はマイクロダイアリシスメンブレンによって達成される。
【００２７】
他の好適な実施形態において、互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントは、センサ装置、好適には連続センサ装置に組み込まれる。
【００２８】
別の見地において、本発明は、サンプルＤＮＡのメチル化ステータスを解析するための、本明細書に記述される方法の使用に関する。好適には、ＤＮＡメチル化ステータスの解析は、癌を診断するために実施される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】シトシン（左）からウラシル（右）への亜硫酸水素塩により媒介される変換の一般的な３ステップ反応スキームを概略的に示す図。
【図２】ＤＮＡ延伸のウリジン残基に対するウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の反応を概略的に示す図。
【図３】本発明による方法の原理を概略的に示す図。
【図４】互いに流体接続される少なくとも５つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の一実施形態を示す概略図。
【図５】互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置の固体サポート（すなわちビーズの表面）に不動化されるＤＮＡレポータ分子のフラクションを使用することによる、離散的なデータポイントの収集を概略的に示す図。
【図６】互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の別の実施形態を示す概略図。
【図７】互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の別の実施形態を示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１は、シトシン（左）からウラシル（右）への亜硫酸水素塩により媒介される変換の一般的な３ステップ反応スキームを概略的に示す。シトシンは、弱酸性条件下で、シトシン−亜硫酸水素塩にスルホン化される。ウラシル−亜硫酸水素塩への加水分解脱アミノ化は、自発的に生じる。ウラシル−亜硫酸水素塩は、塩基性条件下で、ウラシルに脱スルホン化される。
【００３１】
図２は、ＤＮＡ延伸のウリジン残基に対するウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の反応を概略的に示す。ウリジン残基は、シトシンがウラシルに脱アミノ化される場合にのみＤＮＡに見られることができ、これは、ＤＮＡの変異につながる。ＵＮＧは、ＤＮＡの糖−リン酸塩バックボーンから、ウラシル塩基を除去する。ＤＮＡバックボーンは損われていないままであるが、結果的に得られた脱塩基部位は、高温で加水分解に敏感である。
【００３２】
図３は、本発明による方法の原理を概略的に示す。非メチル化シトシン残基をそのヌクレオチド配列に含む少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子が提供され、非メチル化シトシン残基は、重硫酸塩を加えることによってウリジン残基に変換される（１．）。ＵＮＧによるＤＮＡの処理は、ＤＮＡバックボーンからのウラシル塩基の除去をもたらし（２．）、それにより、脱塩基部位においてこれらを熱誘導の断片化に敏感なものにする（３．）。少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子から解放される標識は、任意に分離され（４．）、適当な解析方法によって検出される。
【００３３】
図４は、互いに流体接続される少なくとも５つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の一実施形態の概略図を示す。この実施形態の詳細な説明は、実施例１に与えられる。
【００３４】
図５は、互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置の固体サポート（すなわちビーズの表面）に不動化されるＤＮＡレポータ分子のフラクションを使用することによる、離散的なデータポイントの収集を概略的に示す。パネルＡ−Ｃは、時間連続のフラクション解放を概略的に示す。パネルＤは、ＤＮＡ変換効率を決定するための適当なプロットを示す。詳細は、実施例３に与えられる。
【００３５】
図６は、互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の別の実施形態の概略図を示す。用いられる１つのＤＮＡレポータ分子は、反応コンパートメントのうち１つの表面に不動化される。パネルＡは、亜硫酸水素塩により媒介される、サンプルＤＮＡ及びＤＮＡリポータ分子の変換を示す。パネルＢは、適切な温度及び緩衝条件下のリザーバからのＵＮＧの添加を示す。パネルＣは、「変換された」ＤＮＡレポータ分子の熱誘導された断片化を示す。この実施形態の詳細な説明は、実施例４に与えられる。
【００３６】
図７は、互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の他の実施形態の概略図を示す。使用されるＵＮＧ酵素は、熱安定性であり、従って、反応コンパートメントのうち１つの表面に不動化される少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子と共に提供されることができる。この実施形態の詳細な説明は、実施例５に与えられる。
【００３７】
本発明は、少なくとも１つの非メチル化シトシン残基をその配列に含む少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子と、酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）との反応を組み入れることによって、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視するための汎用的で、正確で且つ効率的な方法が確立されることができるという、予期しない発見に基づく。
【００３８】
以下に説明的に記述される本発明は、ここに特に開示されない１又は複数の構成要素、１又は複数の制限がない場合にも、適切に実施されることができる。
【００３９】
本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図面を参照して記述されるが、本発明は、それらに制限されず、請求項によってのみ制限される。記述される図面は、概略的なものにすぎず、非制限的なものであると考えられるべきである。
【００４０】
「含む、有する（comprising）」という語は、本記述及び請求項において使用される場合、他の構成要素又はステップを除外しない。本発明の目的において、「からなる（consisting of）」という語は、「含む、有する（comprising of）」という語の好適な実施形態であると考えられる。以下、少なくとも特定の数の実施形態を含むグループが規定される場合、これは、好適にはこれらの実施形態のみからなるグループを開示するものとしても理解されることができる。
【００４１】
単数名詞に言及する際に例えば「a」又は「an」、「the」のような不定冠詞又は定冠詞が使用される場合、これは、特記されない限り、当該名詞の複数を含む。
【００４２】
本発明のコンテクストにおいて「約（about）」という語は、当業者がなお当該特徴の技術的効果を確実にすると理解する正確さの幅を示す。この語は、一般に、示された数値からの１０％の偏りを示し、好適には５％である。
【００４３】
更に、説明及び請求項における第１、第２、第３、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）等の語は、同様の構成要素を区別するために使用されており、必ずしも逐次の又は経時的な順序を記述するためではない。こうして使用される語は、適当な状況下で入れ替え可能であり、ここに記述される本発明の実施形態は、本明細書に記述され又は図示されるものとは別の順序での処理が可能であることが理解されるべきである。
【００４４】
語の他の規定は、それらの語が使用されるコンテクストにおいて後述される。
【００４５】
以下の語又は規定は、本発明の理解を助けるためにのみ提供される。これらの規定は、当業者によって理解されるものより狭い範囲をもつものとして解釈されるべきでない。
【００４６】
１つの見地において、本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法であって、
（ａ）解析されるべきサンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するステップであって、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、（ｉ）そのヌクレオチド配列中の、少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、（ｉｉ）少なくとも１つの標識と、を含み、サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される、ステップと、
（ｂ）亜硫酸水素塩を空間的に分離された反応コンパートメントに加えて、サンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するステップと、
（ｃ）ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えて、ステップ（ｂ）で得られたウラシル塩基の、ＤＮＡバックボーンからの除去を媒介するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＤＮＡを熱処理によって断片化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の間、少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子から解放される少なくとも１つの標識を検出するステップと、
を含む方法に関する。
【００４７】
本明細書において用いられる「サンプルＤＮＡ」という語は、それらのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基がウリジン残基に変換されるときにその差動メチル化ステータスが解析される、１又は複数のＤＮＡ分子を含むサンプルを示す。ＤＮＡ分子は、自然発生化合物又は（例えば組み換えＤＮＡ技術によって又は化学合成によって生成される）合成化合物でありえ、一本鎖又は二本鎖でありうる。ＤＮＡ分子は、任意の長さを有することができる。好適には、長さは、１０ｂｐ乃至１０００００ｂｐ、好適には１００ｂｐ乃至１００００ｂｐ、特に好適には５００ｂｐ乃至５０００ｂｐである。
【００４８】
サンプルＤＮＡに含まれるＤＮＡ分子は、精製された形で存在することができ（例えば当分野において知られているＴＥ又はＰＢＳのような適切なバッファ溶液に提供される）、又は精製されていない、部分的に精製された、若しくは高濃度のサンプル溶液に含まれることができる。このような精製されていないサンプルの例は、粗細胞溶解物、体液（例えば血液、血清、唾液及び尿）、可溶化組織及びその他を含む。
【００４９】
ある実施形態において、本発明による方法は、このような精製されていないサンプルに存在するＤＮＡの精製を含む。精製は、一般には、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の完了後に達成される。ＤＮＡを精製する方法及び対応する装置（任意には、自動化システム又はワーキングプラットホームの一体部分としての装置）は、当分野において良く知られており、多くのサブライヤから市販されている。
【００５０】
本明細書で用いられる「ＤＮＡレポータ分子」という語は、そのヌクレオチド配列に少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、少なくとも１つの標識とを含むＤＮＡ分子をさし、少なくとも１つの標識は、検出可能な標識の解放を生じさせる亜硫酸水素塩媒介されるＤＮＡ変換を監視するための実際の基体として使用される。本発明の方法は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子によって、すなわち１又は複数のＤＮＡレポータ分子によって、実施される。２以上のＤＮＡレポータ分子が用いられる場合、これらは一般に同じタイプである（すなわち、同じ核酸配列及び／又は標識を有する）。しかしながら、異なるタイプの（すなわち異なる核酸構造及び／又は標識を有する）ＤＮＡリポータ分子を使用することも可能でありうる。
【００５１】
概して、本発明において使用されるＤＮＡレポータ分子は、１０乃至１５０ヌクレオチド、例えば１５乃至８０ヌクレオチド、１５乃至６０ヌクレオチド、又は１５乃至４０ヌクレオチドの長さを有する核酸分子である。ＤＮＡレポータ分子は、自然発生分子又は好適には合成分子（例えば組み換えＤＮＡ技術又は化学合成によって生成される）でありうる。好適には、本発明において使用されるレポータ分子は、一本鎖の核酸分子である。しかしながら、二本鎖の分子が用いられてもよい。
【００５２】
好適な実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、合成オリゴヌクレオチド（すなわち一本鎖）である。
【００５３】
検出反応を実施するために、ＤＮＡレポータ分子は、１又は複数の検出可能な標識を含む。本明細書で用いられる「標識」という語は、１又は複数の適当な化学物質又は酵素を含む任意の化合物又はモイエティをさし、それらは、化学、物理又は酵素反応において、検出可能な化合物又は信号を直接的又は間接的に生成する。本明細書で使用される場合、この語は、検出可能な標識と、１又は複数のそのような検出可能なマーカに結合される任意の化合物との両方を含むことが理解されるべきである。更に、本発明の範囲内で、標識によって検出可能な信号の生成と干渉するモイエティ（例えば、クエンチャ及び蛍光体が互いに近くにある限り、蛍光体の励起から生じた放出を「乗っ取る」クエンチャ）が更に標識に属する。標識は、例えば、修飾された及び／又は標識化されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの形で、レポータ分子に組み込まれ又はアタッチされることができる。標識は、ＤＮＡレポータ分子の配列の中で、５'−終端及び／又は３'−終端及び／又は任意の内部ヌクレオチドにアタッチされることができる。
【００５４】
本発明により使用されることができる検出可能な標識は、化学、物理又は酵素反応において、検出可能な化合物又は信号を直接的又は間接的に生成する任意の化合物を含む。標識化は、当分野において良く知られている方法によって達成されることができる（Sambrook, J. et al. (1989) Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;、及びLottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg / Berlin, Germanyを参照）。標識は、蛍光標識、酵素標識、着色標識、色素標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属及びコロイド金から選択されることができる。すべてのこれらのタイプの標識は、当分野において良好に確立されている。このような標識によって媒介される物理的反応の例は、照射又は励起の際の蛍光又は燐光の放出であり、又は放射性標識を使用する際のＸ線の放出である。アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−ラクタマーゼは、酵素標識の例であり、これらは、色素反応生成物の形成をもたらし、本発明において使用されることができる。本発明の特定の好適な実施形態において、検出可能な標識は蛍光標識である。多数の蛍光標識は、当分野において良好に確立されており、異なるサブライヤから市販されている（例えばThe Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed. (2006), Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USAを参照）。
【００５５】
このような標識を検出するために、本発明の方法を実施するために使用される装置は、標識の存在及び／又は量を示す値を決定するのに適した検出システムを有することができる。適切な検出システムの選択は、例えば実施される検出又はそのような種類の解析のために使用されるタイプの標識のような幾つかパラメータに依存する。様々な光学及び非光学検出システムが、当分野において良好に確立されている。例えば、本発明において使用されうる蛍光検出方法は、とりわけ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）及び蛍光相関分光法を含む。
【００５６】
特定の実施形態において、検出は、蛍光又は生物発光クエンチャペアの個々の形成に基づくＦＲＥＴ又はＢＲＥＴを使用して実施される。ＦＲＥＴの使用は、例えばLiu, B. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 589-593にも記述されている。ＢＲＥＴの使用は、例えば、Xu, Y. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156に詳述されている。
【００５７】
少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、結合されない形態（すなわち溶液中の自由分子）で提供されることができる。特定の実施形態において、ＤＮＡレポータ分子は、サポートに不動化される（すなわち基質にアタッチされる）。一般に、サポートは、例えば固体の表面のような固体の部材である。サポートに対するＤＮＡレポータ分子のアタッチメントは、ＤＮＡレポータ分子と所与のサポート部材との直接的（例えばレポータ分子に含まれるアンカー基を通じて）な又は間接的（結合を媒介する捕捉分子を通じて）な相互作用によって、達成されることができる。この相互作用は、共有結合又は非共有結合でありえ、概して可逆的である。例えば、カルボジイミド化学は、ＤＮＡレポータ分子を活性化表面に共有結合させるために使用されることができる。ＤＮＡレポータ分子の５'―又は、３'−終端―の適切なアミンリンカーが、この目的のために提供される。ＤＮＡレポータ分子の不動化を達成するための様々な他の確立した化学作用が、当分野において知られている。
【００５８】
ＤＮＡレポータ分子は、好適には磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ及びラテックスビーズのようなビーズでありうる可動サポートに不動化されることができる。このような可動サポート部材は、本発明の方法を実施するために使用されるセンサ装置の流体フローの中で移動されることができる。
【００５９】
他方、ＤＮＡレポータ分子を、反応コンパートメントの内側表面上に、又は例えば反応コンパートメント内に配置されるが自由に移動されることができない顕微鏡スライド、ウエハ又はセラミック材料上に、直接的に不動化することも可能である。
【００６０】
ある実施形態において、検出反応の結果は、（例えば内部制御として提供される）例えば固定量の標識によって得られる値又は文献からのデータのような、基準値と比較される。
【００６１】
好適には、検出ステップは、例えば３０分、６０分、１２０分、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、その他の所与の時間期間内に、少なくとも１回繰り返される。複数回の繰り返しが可能であり、例えば２、５、８、１０、１５、２０、３０回及びそれ以上の繰り返しが可能である。繰り返しは、所与の時間期間にわたる固定の時間間隔中に実施されることができる。しかしながら、繰り返しの間の時間間隔は変化しても良く、例えば亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換が完了に達するにつれて、反応のエンドポイントを正確に決定するために、より短くされうる。言い換えると、検出の間に得られる結果は、ＤＮＡ変換の進行を制御するために使用される。少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、亜硫酸水素塩により媒介される変換が完了する場合、同じことがサンプルＤＮＡにも当てはまると考えられる。
【００６２】
本発明の中で、サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される。すなわち、サンプルＤＮＡは、第１の反応コンパートメントに提供され、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、第２の反応コンパートメントに提供され、２つのコンパートメントは、別個のエンティティを表す。本明細書において用いられる「反応コンパートメント」（「反応チャンバ」とも呼ばれる）という語は、液体サンプルを収容するための任意の構造を示す。（例えば直方体又は円筒状３次元形状を有する）このような構造の様々な形状が、当分野において良く知られている。
【００６３】
しかしながら、反応コンパートメントは、完全独立ではなく、互いに流体連絡されており、すなわち、コンポーネントの少なくとも一部が、コンパートメント間の流体フローの中で移動されることができる。これは、例えば、マイクロフルイディックチャネルを通じて反応コンパートメントを接続することによって、達成されることができる。好適な実施形態において、反応コンパートメントの間の空間的な分離は、半透膜によって、好適にはサイズ排除メンブレン又はマイクロダイアリシスメンブレンによって、達成される。このような半透膜は、より大きいもの（すなわちメンブレンの特性に依存する所与のサイズ制限を越える）が保持されたまま、小分子が障壁を通過することを可能にする。
【００６４】
サンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するために、空間的に分離された反応コンパートメントへの亜硫酸水素塩（例えば重硫酸ナトリウムであるが、任意の他の塩類も同様に適切である）の添加が、当分野において知られている標準プロトコルに従って実施される。試薬は、異なるサブライヤから市販されている。一般的な反応スキームが、図１に概略的に示されている。ＤＮＡ変換は、概して、４０−７０℃の間、好適には５５−６５℃の間、特に好適には６０℃の反応温度で実施される。インキュベーション期間は、数分乃至数時間（例えば一晩）又はより長い時間まで、（とりわけ解析されるべきサンプルに依存して）様々でありうる。
【００６５】
サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子のＤＮＡ変換は、空間的に分離された反応コンパートメント内で並行に（すなわち同じ実験条件下で）生じる。必要とされる個々の試薬が、特定のリザーバから、個々のＤＮＡ分子が提供されている反応コンパートメントのいずれか１つ及び／又は両方に加えられることができる。
【００６６】
特定の反応温度を調整するために、本発明を実施するのに用いられる少なくとも１つの、好適にはすべての反応コンパートメントは、反応コンパートメント内の温度を制御し、調節するための１又は複数の温度制御ユニットを備える。このような温度制御ユニットは、使用される装置の１又は複数の反応コンパートメントと直接的に接触しうる１又は複数の別個の加熱及び／又は冷却素子を含むことができる。様々な熱制御システムが、当分野において知られており、異なるサブライヤから市販されている。
【００６７】
酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）が、一般に、以前の反応からのＰＣＲ生成物を汚染する可能性のある「キャリーオーバー」を防ぐために、ＰＣＲ反応において一般に使用される。ＵＮＧは、多くのサプライヤーから市販されており、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡに対して作用する。ＵＮＧは、ウリジン残基を除去する作業を伴うセルのＤＮＡ修復装置の一部である。ウリジンは、シトシンがウラシルに脱アミノ化される場合にのみＤＮＡに見つけられることができ、これは、ＤＮＡの変異につながる。酵素は、ＤＮＡの糖−リン酸塩バックボーンからウラシル塩基を除去し、その反応は、図２に概略的に示されている。この反応は、いわゆる塩基切除修復メカニズムの一部であり、それにより、このケースではＤＮＡのシトシン脱アミノ化変異を防ぐ。
【００６８】
知られている任意のウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼが、本発明において用いられることができる。酵素は、サンプルＤＮＡにでなく、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えられる。ＤＮＡバックボーンからの酵素反応（すなわち、亜硫酸水素塩により媒介される変換の間に得られたウラシル塩基の除去）が、用いられる特定の酵素に依存して確立された標準反応条件下で生じる。
【００６９】
好適な実施形態において、熱安定性のＵＮＧ酵素が使用される、特に好熱性生体から得られるＵＮＧ酵素が使用される。このような熱安定性のＵＮＧ酵素は、当分野において知られている（例えば、Sartori, A.A. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 29979-29986; Sartori, A.A. et al (2002) EMBO J. 21, 3182-3191）。それらは、９０℃より高い温度であっても、高い活動性を維持する。
【００７０】
ＵＮＧにより媒介される酵素反応は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供されるのと同じ反応コンパートメントにおいて、又は、空間的に分離されているが、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供される１つの反応コンパートメントと流体連絡する他の（すなわち第３の）反応コンパートメントにおいて、実施されることができる。必要な試薬は、個々の反応コンパートメントと流体連絡する特定のリザーバから提供されることができる。
【００７１】
ＵＮＧ処理の後に得られるＤＮＡレポータ分子は、損われていないＤＮＡバックボーンをなお有するが、ウラシル塩基が除去された１又は複数の脱塩基部位をもつ。これらの脱塩基部位は、例えば９０℃乃至９５℃の間の温度のような高温で、加水分解に敏感である。
【００７２】
本発明において、熱誘導の断片化は、ＤＮＡのタイプ及び量に依存して、例えば１０秒、３０秒、１分、２分、５分のような様々な時間期間の中で実施されることができる。当業者であれば、インキュベーション時間を如何にして選択するかが分かる。
【００７３】
熱誘導の断片化ステップは、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供される（及び任意にはＵＮＧにより媒介される反応が行われた）のと同じ反応コンパートメント内で、又は別の空間的に分離された反応コンパートメント内で、実施されることができる。後者は、ＵＮＧにより媒介される反応が行われたのと同じ反応コンパートメント（すなわち第３）、又は空間的に分離されているが第２の及び／又は第３の反応コンパートメントと流体連絡する他の（すなわち第４の）反応コンパートメントでありうる。
【００７４】
最後に、検出ステップは、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供される（及びＵＮＧにより媒介される反応及び熱誘導された断片化が行われた）のと同じ反応コンパートメント内で、又は空間的に分離された別の反応コンパートメント内で、実施されることができる。後者は、すでに上述した第３の又は第４の反応コンパートメントでありえ、又は空間的に分離されているが第２及び／又は第３及び／又は第４の反応コンパートメントと流体連絡する他の（すなわち第５の）コンパートメントでありうる。
【００７５】
本発明による方法の原理は、図３に概略的にまとめられている。
【００７６】
ある実施形態において、互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離される反応コンパートメントが、好適には連続センサ装置であるセンサ装置に組み込まれる。センサ装置は更に、例えばＤＮＡサンプル精製のための及び／又は差動メチル化の次の解析のための手段のような、自動化プラットホーム又はワーキングステーションの一体部分（例えばＰＣＲ反応を実施するためのサーマルサイクラ）でありえる。このようなプラットホームは、当分野において知られており、市販されている。
【００７７】
別の見地において、本発明は、サンプルＤＮＡのメチル化ステータスを解析するための、本明細書に規定される方法の使用に関する。言い換えると、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の進行を監視するこの方法は、高品質の（すなわち十分に変換された）ＤＮＡを提供することによって、下流のアプリケーションの正確さ及び信頼性を確実にするために不可欠である。このような下流のアプリケーションは、亜硫酸水素塩−シークエンシング、メチル化感受性一本鎖コンフォメーション解析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー拡張（ＭＳ−ＳｎｕＰＥ）、メチル化感受性マイクロアレイアプリケーション、組み合わされた亜硫酸水素塩制限解析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化感受性リアルタイムＰＣＲアプリケーション及びその他を含む。
【００７８】
好適な実施形態において、ＤＮＡメチル化ステータスの解析は、癌を診断するために使用される。
【００７９】
本発明は、図面及び以下の例によって詳しく記述されるが、それらの図面及び例は、単に、本発明の特定の実施形態を説明するためだけにあり、いかなる形であれ本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【００８０】
実施例
実施例１：連続センサ装置における亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の監視
本実施例において、本発明による方法は、図４に概略的に示される例示の連続センサにおいて実施される。
【００８１】
このような状況において、方法のそれぞれ異なるステップが、空間的に分離されたそれぞれ異なる反応コンパートメントにおいて行われることが望ましい。センサ装置のこの構成は、異なる方法ステップの間の干渉及び反応成分の間の不適合を防ぐ。例えば、ウラシル―ＤＮＡ―グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の酵素活性は、熱断片化ステップの間、著しく減少しうる。
【００８２】
図４に示されるセンサ装置は、少なくとも５つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する。第１の反応コンパートメントには、サンプルＤＮＡが提供される。サンプルＤＮＡは、メチル化ステータスの次の解析のために、このコンパートメントから除去されうる（図示せず）。第１コンパートメントは、ＤＮＡの準備及び変換のために必要な成分（例えば重硫酸塩溶液）を含む適切な量のリザーバに接続される。
【００８３】
第１の反応コンパートメントは、第２の反応コンパートメントのすぐ隣りに位置し、第２の反応コンパートメントには、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち標識化された合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド）が提供される。
【００８４】
２つの反応コンパートメントの間の空間的な分離は、変換試薬が通過することができるが、サンプルＤＮＡが第１チャンバに保持されるようなやり方で、すなわち、半透過性バリアを通じて、例えばサイズ排除（フィルタ）メンブレンによって、達成される。言い換えると、２つの反応コンパートメントは、互いに流体連絡されている。
【００８５】
第１及び第２の反応コンパートメント内の温度は、１又は複数の加熱（及び／又は冷却）素子を用いることによって、適切な反応条件（例えば６０℃）の調整を可能にするように制御されることができる。
【００８６】
第３の反応コンパートには、ＵＮＧ酵素が提供され、「変換された」少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子からのウラシル塩基の除去が行われる。第２及び第３の反応コンパートメントの間の空間的な分離は、ＵＮＧ酵素のための最適反応条件を生成するために、バッファ成分が、例えばマイクロダイアリシス膜によって、置換され又は除去されることができるようなやり方で、達成される。
【００８７】
第３の反応コンパートメントに隣接して位置する第４の反応コンパートメントでは、ＤＮＡリポータ分子の脱塩基部位において熱誘導の加水分解が行われる。第３及び第４の反応コンパートメントの間の空間的な分離は、例えば（半透過性の）サイズ排除（フィルタ）膜によって、ＵＮＧ酵素分子は保持されるがＤＮＡレポータ分子は保持されないようなやり方で、構成される。
【００８８】
第４の反応コンパートメントに隣接して位置する第５の反応コンパートメントでは、以前の断片化ステップの間に解放された標識（例えば蛍光染料）の検出が行われる。第４及び第５の反応コンパートメントの間の空間的な分離は、例えば（半透過性の）サイズ排除（フィルタ）膜によって、標識及び断片化されたＤＮＡレポータ分子は第５の反応コンパートに通過することができるが、損なわれていないＤＮＡレポータ分子は第４の反応コンパートに保持されるようなやり方で、構成される。
【００８９】
反応スキームの開始時に第２の反応コンパートメントに提供される少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の量は、好適には、後続の反応経路に入るフラクション（割合）がアッセイの時間を通じて一定であると考えられることができるものである。検出される標識の量は、ＤＮＡの変換の尺度である。
【００９０】
標識によって生成される信号は、例えば核酸コンテントのＵＶ測定によって決定される、第３の反応コンパートメントに入るＤＮＡレポータ分子のフラクションに正規化される。
【００９１】
ＵＮＧ及び熱の総合作用によって変換されない、ゆえに断片化されないＤＮＡレポータ分子のフラクションは、第２の反応コンパートメントにへ再び向けられる。これらのＤＮＡレポータ分子は、再び変換反応に入る。これは、例えば第４及び第２の反応コンパートメント（閉ループ構造、図４に示さず）の間の接続によって達成されることができる。
【００９２】
通常のマイクロフルイディクスが、液体及び試薬の量を制限し、システムを作動させるために使用されることができる。
【００９３】
実施例２：２重に標識化されたＤＮＡレポータ分子の使用
本発明による方法の他の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、第１及び第２の標識を含む。
【００９４】
第１の標識は、様々な市販の染料から選択されることができる蛍光染料である。第２の標識は、この染料に適切したクエンチャである。代替として、第２の分子は、第１の染料と共に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のためのドナーアクセプタ対を形成する他の蛍光染料である。
【００９５】
ＤＮＡレポータ分子の熱誘導の断片化が生じるとき、第１の蛍光染料は、クェンチャ分子から分離される。代替として、ＦＲＥＴドナーアクセプタ対は、互いから分離される。蛍光信号は、熱誘導の断片化ステップにおいて既に検出可能である。
【００９６】
それゆえ、断片化及び検出ステップを組み合わせることによって、図４に示されるセンサ装置の少なくとも５つの反応コンパートメントのうちの１つが不要になり、その結果、装置の簡略化された構成を与える。
【００９７】
実施例３：ビーズに不動化されるＤＮＡレポータ分子の使用
あるアプリケーションの場合、例えば試薬の量、エネルギー消費等を制限するために、ほんの少数のデータポイントのみを生成することが好ましいことがある。このような状況では、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例えば３'−末端のような一方の終端にアタッチされる適切な標識を有し、好適には例えばポリスチレンビーズ又は磁気ビーズのようなビーズである移動表面上に、例えば５'−末端である他方の終端を通じて不動化される。
【００９８】
１つの特定の実施形態において、ビーズは例示のセンサ装置の第２の反応コンパートメントに保持され、特定の時点に、ビーズのフラクションが、他の（複数の）コンパートメントに入るために解放されることができる。
【００９９】
空間的に分離された２つの反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置の固体サポート（すなわちビーズの表面）に不動化されるＤＮＡレポータ分子のフラクションを使用することによる、離散的なデータポイントの収集が、図５に概略的に示される。パネルＡ―Ｃは、時間連続の部分的な解放を概略的に示す。パネルＤは、ＤＮＡ変換効率を決定するために使用可能なプロットを表す。
【０１００】
更に、第２の反応コンパートメント内のビーズに不動化されるＤＮＡレポータ分子の使用は、ＤＮＡレポータ分子が保持されたままで、このコンパートメント内の溶液の交換を可能にする。図５に示されるセンサ装置の第２及び第３の反応コンパートメントの間の緩衝平衡の要求は不要であり、省略されることができる。
【０１０１】
更に、（ビーズ当たりのＤＮＡレポータ分子の数及び解放当たりのビーズ数が分かっているので、）第２の反応コンパートメントからのＤＮＡレポータ分子の部分的な解放は、他の（複数の）反応コンパートメントへ移動されるＤＮＡレポータ分子の絶対数のより正確な制御を可能にする。これは、変換されない／変換されたＤＮＡレポータ分子の比率の計算を容易にする。
【０１０２】
第２の反応コンパートメント内のビーズを制限することは、例えば磁界の印加に関連して磁性ビーズを使用することによって、又は交流磁界及び誘電泳動力に関連してポリスチレンビーズを使用することによって、達成されることができる。
【０１０３】
実施例４：反応コンパートメントの内部表面に不動化されるＤＮＡレポータ分子の使用
他の実施形態において、第１及び第２の反応コンパートメントを有するセンサ装置が、本発明の方法を実行するために用いられる。センサ装置は、図６に概略的に示される。
【０１０４】
第１の反応コンパートメント（サンプルＤＮＡが提供される）は、亜硫酸水素塩変換のために必要とされる試薬を含むリザーバに接続される。
【０１０５】
第２の反応コンパートメントは、適切なバッファ中にＵＮＧ酵素を含む少なくとも１つのリザーバに接続される。少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち標識化された合成オリゴヌクレオチド）が、例えばＤＮＡレポータ分子の一方の終端においてアミノリンカー及びカルボジイミド化学を使用することによって、第２の反応コンパートメントの内部表面に不動化される。ＤＮＡレポータ分子の他方の終端は、例えば蛍光染料である適切な標識によって修飾される。
【０１０６】
第１及び第２の反応コンパートメントは、空間的に分離されているが、例えば半透過性のサイズ排除フィルタ膜によって、バッファ及び／又は変換試薬の交換は許容されるがサンプルＤＮＡ及び酵素は通過することができないように、互いに流体連絡される。
【０１０７】
両方の反応コンパートメント内の温度は、効果的な亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換を可能にするレベルに調整されることができる。しかしながら、第２の反応コンパートメント内の温度は、例えば第２の加熱（及び／又は冷却）素子を使用することにより、第１の反応コンパートメント内の温度と独立して調節されることができる。
【０１０８】
第１の方法ステップにおいて、両方の反応コンパートメントの 緩衝条件及び温度は、サンプルＤＮＡ及び不動化ＤＮＡレポータ分子を変換するのに適している（図６Ａ）。
【０１０９】
第２ステップにおいて、第２の反応コンパートメントの温度は、ＵＮＧ反応が行われることを可能にするように、例えば３７℃に低下される。リザーバからのＵＮＧ酵素が、第２のコンパートメントに与えられる（図６Ｂ）。
【０１１０】
第３のステップにおいて、第２の反応コンパートメント内の温度は、脱塩基部位でＤＮＡレポータ分子を断片化するために、例えば９５℃に上昇される（図６Ｃ）。断片化されたＤＮＡレポータ分子から解放される標識は、適当な検出器を通じて測定される。代替として、表面におけるなお損なわれていないＤＮＡレポータ分子の標識が、例えばＴＩＲＦと関連して蛍光標識を使用することによって、又は共焦点スキャナ等によって、測定されることができる。
【０１１１】
第２の反応コンパートメントにおける熱処理の後、温度は、変換反応を続けるために、第１の反応コンパートメントの温度にまで再び低下される。特定の時間ポイントに、プロトコルが繰り返され、その結果、離散的なプロットは、（図５Ｄと同様の）経時的な変換効率を示す。
【０１１２】
第２のコンパートメントにおけるＵＮＧ処理、熱誘導の断片化、及び標識検出の間、第１のコンパートメント内の温度は、一般に、サンプルＤＮＡの変換を止めるために低下される。これは、２つのコンパートメントにおいて得られる変換反応のより良好な相関関係を与える。このように、本実施形態では、不連続な測定値が取得され、より洗練された温度制御が必要であるが、複雑さ及び必要なコンパートメントの数は低減される。
【０１１３】
実施例５：熱安定性のウラシル―ＤＮＡ―グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の使用
本発明による方法の別の実施形態において、熱断片化の間、活性のままである熱安定性のＵＮＧ酵素が使用される。しかしながら、好適には、好熱性生物から導き出されたＵＮＧ酵素が使用される。このような熱安定性のＵＮＧ酵素は、当分野において知られている（例えばSartori, A.A. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 29979-29986; Sartori, A.A. et al (2002) EMBO J. 21, 3182-3191）。熱安定性のＵＮＧ酵素は、９０℃以上の温度でも高い活性を維持する。センサ装置における断片化ステップは、９０℃乃至９５℃の間の温度で実施される。このように、熱安定性のＵＮＧ酵素は、熱誘導の断片化の最中及び後にも活性のままである。
【０１１４】
本実施形態において、ＵＮＧ酵素は、コンパートメントの内部表面に不動化されるＤＮＡレポータ分子（すなわち標識化された合成オリゴヌクレオチド）と共に、第２の反応コンパートメントに提供される。酵素リザーバをもたない２コンパートメントセンサ装置が、第２の反応コンパートメントの２ステップ温度プロトコルと協力して、充分である。両方のコンパートメントは、反応コンパートメントの間の酵素及びサンプルＤＮＡの交換を防ぐために、ここでも半透過性のサイズ排除フィルタ膜によって接続される。使用されたセンサ装置の説明は、図７に与えられている。検出は、上記の実施例１―５にて説明したように、実行されることができる。
【０１１５】
実施例６：サンプルＤＮＡ精製
例えばメチル化特異的ＰＣＲ又は他の適切な技法によって、亜硫酸水素塩により媒介される変換の後にサンプルＤＮＡを更に解析するために、サンプルＤＮＡは、精製された形で提供されなければならない。
【０１１６】
こうして、例えば、適切な結合バッファ（例えば高含有量のカオトロピック塩を有する）によってＤＮＡをシリカ膜に結合し、適切なバッファ（例えば高含有量のエタノール）により結合されたＤＮＡを洗浄し、適切なバッファ（例えば水又はそのバッファ溶液）によりＤＮＡを溶離するための手段及び試薬が、本発明による方法に含められることができる。これは、前記シリカ膜を含み、第１の反応コンパートメントにアタッチされる出口と、それぞれの試薬液のためのリザーバと、を提供することによって達成されることができる。
【０１１７】
本明細書に説明的に記述される本発明は、本明細書に特に開示されないが、１又は複数の構成要素、１又は複数の限定が存在しない場合にも適切に実施されることができる。こうして、例えば、「有する、含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」という語は、制限なく、拡張的に理解されるべきである。加えて、本明細書において使用される語及び表現は、説明の語として使用されており、制限するものではなく、そのような語及び表現の使用において、図示され記述される特徴と等価なもの又はその一部を排除することを意図せず、様々な変形例が、請求項に記載の本発明の範囲内で可能であることが理解される。
【０１１８】
従って、本発明は、実施形態によって具体的に開示されているが、その中に具体化される本発明の任意の特徴、変形及び変更は、当業者によって再分類されることができ、そのような変形及び変更は、本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【０１１９】
本発明は、本明細書に広く及び一般的に記述されている。一般的な開示の中に入るよりも狭い種類及び下位の一般的なグループの各々は、本発明の一部を形成する。これは、除去される材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関係なく、概念から任意の発明の主題を除去する但し書き又は否定的な制限を有する本発明の一般的な記述を含む。
【０１２０】
他の実施形態は、添付の請求項の範囲内にある。更に、本発明の特徴又は見地は、マーカッシュ群に関して記述されているが、当業者であれば、本発明が更にマーカッシュ群の個別のメンバ又はメンバのサブグループに関しても記述されるていることが分かるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視する方法に関する。方法は、酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の、少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子との反応に基づき、レポータ分子は、その配列に少なくとも１つの非メチル化シトシン残基を含む。非メチル化シトシン残基からウリジン残基への亜硫酸水素塩により媒介される変換の後、ＵＮＧは、ＤＮＡバックボーンからウラシル塩基を除去し、ゆえに、ＤＮＡバックボーンを、熱誘導の加水分解に敏感なものにする。最後に、この断片化プロセスの間にＤＮＡレポータ分子から解放される標識が検出される。
【０００２】
ＵＮＧ又はＵＤＧと略記されることがあるウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、同様の又は同義のものとして理解されるべきである。いずれの場合も、これらの語は、本明細書において、ＤＮＡバックボーンを熱誘導の加水分解に敏感なものにする酵素を示すために使用される。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡメチル化は、原核生物及び真核細胞の双方を含む様々な生体のゲノムに見つけられる。原核生物において、ＤＮＡメチル化は、シトシン塩基及びアデニン塩基の両方に生じ、ホスト制限システムの一部を含む。しかしながら、多細胞真核生物において、メチル化は、シトシン塩基に限られるようであり、遺伝子発現の抑制された染色質状態及び抑制に関連する（例えばWilson, G.G. and Murray, N.E. (1991) Annu. Rev. Genet. 25, 585-627において研究されている）。
【０００４】
哺乳動物細胞において、ＤＮＡメチル化は、主に、ゲノムにおいて不規則に分散され過少に示されるＣｐＧジヌクレオチドに生じる。通常は非メチル化のＣｐＧｓ（ＣｐＧアイランドと呼ばれる）のクラスタは、多くのプロモータ領域に見つけられる（例えばLi, E. (2002) Nat. Rev. Genet. 3, 662-673において研究されている）。異所性遺伝子サイレンシングにつながるＤＮＡメチル化の変化が、いくつかのヒト癌において実際に示された（例えばRobertson, K.D. and Wolffe, A.P. (2000) Nat. Rev. Genet. 1, 11-19において研究されている）。プロモータの過剰メチル化は、癌抑制遺伝子の不活性化につながるよくあるメカニズムであることが実際に示された（Bird, A.P. (2002) Genes Dev. 16, 6-21）。
【０００５】
個別の遺伝子の差動メチル化を実験的に測定するための様々な方法が存在する（例えばRein, T. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 2255-2264において研究されている）。これらの技法は、とりわけ亜硫酸水素塩シークエンシング、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ（メチライト）及びパイロシークエンシングを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の技法を実施するための１つの共通の前提条件は、解析されるべきＤＮＡの亜硫酸水素塩により媒介される変換（亜硫酸水素塩修飾とも呼ばれる）である。具体的には、非メチル化シトシン残基が、ウリジン残基に変換される。シトシンからウラシルへの亜硫酸水素塩により媒介される変換のための３ステップ反応スキームが、図１に概略的に示されている。要するに、シトシンは、弱酸性条件下で、シトシン−亜硫酸水素塩にスルホン化される。ウラシル−亜硫酸水素塩への加水分解脱アミノ化は、自発的に生じる。ウラシル−亜硫酸水素塩は、塩基性条件下で、ウラシルに脱スルホン化される。
【０００７】
亜硫酸水素塩処理の間、メチル化シトシン残基がウリジン残基に変換されないので、非メチル化ＣｐＧアイランドのＤＮＡ配列は、（ＣからＵへ）効果的に変更され、メチル化ＤＮＡはその元の配列を維持する。
【０００８】
しかしながら、ＤＮＡメチル化ステータスの解析に基づく有効な診断結果のために、ＤＮＡが最大効率で変換されることが望ましく、すなわち、理想的には、所与のＤＮＡ配列に存在する非メチル化シトシン残基の１００％がウリジン残基に変換されることが望ましい。
【０００９】
亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換は、一般に、市販されている反応キットを使用して実施される。これらのテストシステムにおいて、ＤＮＡは、しばしば比較的高い反応温度（例えば、６０℃）で、長時間（多くの場合、一晩）インキューベートされる。ＤＮＡを変性させるために、このインキュベーション時間の間、９５℃までの繰り返される加熱ステップが必要である。多くの場合、インキュベーション時間は、ＤＮＡ品質の特定のレベルを維持しつつ十分とみられる及び／又は許容可能とされるだけの長い時間単に反応をランさせることによって、最大のＤＮＡ変換効率に達すると考えられる。他方、長時間の加熱期間は、最終的に、ＤＮＡの劣化を生じさせ、ＤＮＡ収率及び完全性の低下をもたらすことも明らかである。これは、例えばサンプル中のＤＮＡ濃度が低い場合、任意の下流の解析にとって破滅的である。
【００１０】
しかしながら、解析されるべき異なるサンプルＤＮＡ又は異なるアプリケーションは、最大効率を達成するために、互いに異なる実験セットアップを必要とする可能性がある。例えば、精製されていないＤＮＡを有する粗溶解物の使用は、精製されたサンプルＤＮＡより多くの不確実さをもつ。粗溶解物には、亜硫酸水素塩と相互作用し、ゆえにＤＮＡ転換反応と干渉する可能性のある他の物質が存在する。
【００１１】
上述の検討において、変換するのが容易であるＤＮＡサンプル（例えば精製されたＤＮＡ分子）が解析される場合、「１回のインキュベーション時間がすべてに適合する」という一般的なアプローチは、それが長時間の熱への暴露のためＤＮＡ品質の不必要な低下につながるので、合理的でないことが明らかである。逆もまた同じであり、複雑なサンプル（例えば粗溶解物、体液、凍結生体組織）中のＤＮＡは、仮にあったとしても、かなり少ない程度しか変換されることができない。
【００１２】
現在、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換のパフォーマンス及び進行を能動的に監視する方法は利用可能でない。しかしながら、このような方法の提供は、各個別の反応のエンドポイント（すなわち１００％の完了）を正確に決定することを助け、それにより、汎用プロトコルからサンプル特化の反応条件に切り替えることを可能にし、不必要な及び過剰な加熱インキュベーション時間が回避されることができ、ゆえにＤＮＡ品質を改善することができる。
【００１３】
それゆえ、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の正確な監視を可能にし、上述の制限を克服する方法の継続するニーズがなお存在する。具体的には、解析される各々のサンプルＤＮＡの個別化された反応条件のセットアップを可能にし、ゆえに、差動ＤＮＡメチル化解析の結果を改善する対応する方法のニーズがある。
【００１４】
本発明の目的は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視するための新しいアプローチを提供することである。
【００１５】
より具体的には、本発明の目的は、変換のエンドポイントの精確な判定を可能にする方法を提供することである。
【００１６】
更に、本発明の目的は、用いられるサンプルＤＮＡの特定の要求に適用される反応条件の正確な制御及び整合を可能にし、得られるＤＮＡ品質の全体的な改善をもたらす方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これらの目的及び以下の記述から明らかになる他の目的は、独立請求項に記載の発明の主題によって達成される。本発明の好適な実施形態のいくつかは、従属請求項の発明の主題によって規定される。
【００１８】
１つの見地において、本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法であって、
（ａ）解析されるべきサンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するステップであって、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、（ｉ）そのヌクレオチド配列中の少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、（ｉｉ）少なくとも１つの標識と、を含み、サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される、ステップと、
（ｂ）亜硫酸水素塩を空間的に分離された反応コンパートメントに加えて、サンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するステップと、
（ｃ）ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えて、ＤＮＡバックボーンからの、ステップ（ｂ）で得られたウラシル塩基の除去を媒介するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＤＮＡを、熱処理によって断片化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の間、少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子から解放される少なくとも１つの標識を検出するステップと、
を含む。
【００１９】
一実施形態において、方法は更に、
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた結果を基準値と比較するステップ、
を含む。
【００２０】
別の実施形態において、検出ステップは、所与の時間期間中に少なくとも一回繰り返される。
【００２１】
好適には、ステップ（ｅ）で得られた結果は、ステップ（ｂ）による反応の進行を制御するために使用される。
【００２２】
好適な実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、合成オリゴヌクレオチドである。特定の好適な実施形態において、少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子は、サポートに不動化される。
【００２３】
別の好適な実施形態において、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼは熱安定性である。
【００２４】
１つの特定の実施形態において、ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられたのと同じ反応コンパートメント内で実施される。代替の実施形態において、任意の１又は複数のステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられる反応コンパートメントと流体接続される少なくとも１つの他の空間的に分離された反応コンパートメント内で実施される。
【００２５】
他の特定の実施形態において、少なくとも１つの、好適には全ての反応コンパートメントは、反応コンパートメント内の温度を制御し、調節するための１又は複数の温度制御ユニットを備える。
【００２６】
好適な実施形態において、反応コンパートメントの間の空間的な分離は、半透膜、好適にはサイズ排除メンブレン又はマイクロダイアリシスメンブレンによって達成される。
【００２７】
他の好適な実施形態において、互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントは、センサ装置、好適には連続センサ装置に組み込まれる。
【００２８】
別の見地において、本発明は、サンプルＤＮＡのメチル化ステータスを解析するための、本明細書に記述される方法の使用に関する。好適には、ＤＮＡメチル化ステータスの解析は、癌を診断するために実施される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】シトシン（左）からウラシル（右）への亜硫酸水素塩により媒介される変換の一般的な３ステップ反応スキームを概略的に示す図。
【図２】ＤＮＡ延伸のウリジン残基に対するウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の反応を概略的に示す図。
【図３】本発明による方法の原理を概略的に示す図。
【図４】互いに流体接続される少なくとも５つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の一実施形態を示す概略図。
【図５】互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置の固体サポート（すなわちビーズの表面）に不動化されるＤＮＡレポータ分子のフラクションを使用することによる、離散的なデータポイントの収集を概略的に示す図。
【図６】互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の別の実施形態を示す概略図。
【図７】互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の別の実施形態を示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１は、シトシン（左）からウラシル（右）への亜硫酸水素塩により媒介される変換の一般的な３ステップ反応スキームを概略的に示す。シトシンは、弱酸性条件下で、シトシン−亜硫酸水素塩にスルホン化される。ウラシル−亜硫酸水素塩への加水分解脱アミノ化は、自発的に生じる。ウラシル−亜硫酸水素塩は、塩基性条件下で、ウラシルに脱スルホン化される。
【００３１】
図２は、ＤＮＡ延伸のウリジン残基に対するウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の反応を概略的に示す。ウリジン残基は、シトシンがウラシルに脱アミノ化される場合にのみＤＮＡに見られることができ、これは、ＤＮＡの変異につながる。ＵＮＧは、ＤＮＡの糖−リン酸塩バックボーンから、ウラシル塩基を除去する。ＤＮＡバックボーンは損われていないままであるが、結果的に得られた脱塩基部位は、高温で加水分解に敏感である。
【００３２】
図３は、本発明による方法の原理を概略的に示す。非メチル化シトシン残基をそのヌクレオチド配列に含む少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子が提供され、非メチル化シトシン残基は、重硫酸塩を加えることによってウリジン残基に変換される（１．）。ＵＮＧによるＤＮＡの処理は、ＤＮＡバックボーンからのウラシル塩基の除去をもたらし（２．）、それにより、脱塩基部位においてこれらを熱誘導の断片化に敏感なものにする（３．）。少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子から解放される標識は、任意に分離され（４．）、適当な解析方法によって検出される。
【００３３】
図４は、互いに流体接続される少なくとも５つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の一実施形態の概略図を示す。この実施形態の詳細な説明は、実施例１に与えられる。
【００３４】
図５は、互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置の固体サポート（すなわちビーズの表面）に不動化されるＤＮＡレポータ分子のフラクションを使用することによる、離散的なデータポイントの収集を概略的に示す。パネルＡ−Ｃは、時間連続のフラクション解放を概略的に示す。パネルＤは、ＤＮＡ変換効率を決定するための適当なプロットを示す。詳細は、実施例３に与えられる。
【００３５】
図６は、互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の別の実施形態の概略図を示す。用いられる１つのＤＮＡレポータ分子は、反応コンパートメントのうち１つの表面に不動化される。パネルＡは、亜硫酸水素塩により媒介される、サンプルＤＮＡ及びＤＮＡリポータ分子の変換を示す。パネルＢは、適切な温度及び緩衝条件下のリザーバからのＵＮＧの添加を示す。パネルＣは、「変換された」ＤＮＡレポータ分子の熱誘導された断片化を示す。この実施形態の詳細な説明は、実施例４に与えられる。
【００３６】
図７は、互いに流体接続される少なくとも２つの分離された反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置において実施される本発明による方法の他の実施形態の概略図を示す。使用されるＵＮＧ酵素は、熱安定性であり、従って、反応コンパートメントのうち１つの表面に不動化される少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子と共に提供されることができる。この実施形態の詳細な説明は、実施例５に与えられる。
【００３７】
本発明は、少なくとも１つの非メチル化シトシン残基をその配列に含む少なくとも１つの標識化されたＤＮＡレポータ分子と、酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）との反応を組み入れることによって、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換の進行を監視するための汎用的で、正確で且つ効率的な方法が確立されることができるという、予期しない発見に基づく。
【００３８】
以下に説明的に記述される本発明は、ここに特に開示されない１又は複数の構成要素、１又は複数の制限がない場合にも、適切に実施されることができる。
【００３９】
本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図面を参照して記述されるが、本発明は、それらに制限されず、請求項によってのみ制限される。記述される図面は、概略的なものにすぎず、非制限的なものであると考えられるべきである。
【００４０】
「含む、有する（comprising）」という語は、本記述及び請求項において使用される場合、他の構成要素又はステップを除外しない。本発明の目的において、「からなる（consisting of）」という語は、「含む、有する（comprising of）」という語の好適な実施形態であると考えられる。以下、少なくとも特定の数の実施形態を含むグループが規定される場合、これは、好適にはこれらの実施形態のみからなるグループを開示するものとしても理解されることができる。
【００４１】
単数名詞に言及する際に例えば「a」又は「an」、「the」のような不定冠詞又は定冠詞が使用される場合、これは、特記されない限り、当該名詞の複数を含む。
【００４２】
本発明のコンテクストにおいて「約（about）」という語は、当業者がなお当該特徴の技術的効果を確実にすると理解する正確さの幅を示す。この語は、一般に、示された数値からの１０％の偏りを示し、好適には５％である。
【００４３】
更に、説明及び請求項における第１、第２、第３、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）等の語は、同様の構成要素を区別するために使用されており、必ずしも逐次の又は経時的な順序を記述するためではない。こうして使用される語は、適当な状況下で入れ替え可能であり、ここに記述される本発明の実施形態は、本明細書に記述され又は図示されるものとは別の順序での処理が可能であることが理解されるべきである。
【００４４】
語の他の規定は、それらの語が使用されるコンテクストにおいて後述される。
【００４５】
以下の語又は規定は、本発明の理解を助けるためにのみ提供される。これらの規定は、当業者によって理解されるものより狭い範囲をもつものとして解釈されるべきでない。
【００４６】
１つの見地において、本発明は、ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法であって、
（ａ）解析されるべきサンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するステップであって、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、（ｉ）そのヌクレオチド配列中の、少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、（ｉｉ）少なくとも１つの標識と、を含み、サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される、ステップと、
（ｂ）亜硫酸水素塩を空間的に分離された反応コンパートメントに加えて、サンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するステップと、
（ｃ）ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えて、ステップ（ｂ）で得られたウラシル塩基の、ＤＮＡバックボーンからの除去を媒介するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＤＮＡを熱処理によって断片化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の間、少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子から解放される少なくとも１つの標識を検出するステップと、
を含む方法に関する。
【００４７】
本明細書において用いられる「サンプルＤＮＡ」という語は、それらのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基がウリジン残基に変換されるときにその差動メチル化ステータスが解析される、１又は複数のＤＮＡ分子を含むサンプルを示す。ＤＮＡ分子は、自然発生化合物又は（例えば組み換えＤＮＡ技術によって又は化学合成によって生成される）合成化合物でありえ、一本鎖又は二本鎖でありうる。ＤＮＡ分子は、任意の長さを有することができる。好適には、長さは、１０ｂｐ乃至１０００００ｂｐ、好適には１００ｂｐ乃至１００００ｂｐ、特に好適には５００ｂｐ乃至５０００ｂｐである。
【００４８】
サンプルＤＮＡに含まれるＤＮＡ分子は、精製された形で存在することができ（例えば当分野において知られているＴＥ又はＰＢＳのような適切なバッファ溶液に提供される）、又は精製されていない、部分的に精製された、若しくは高濃度のサンプル溶液に含まれることができる。このような精製されていないサンプルの例は、粗細胞溶解物、体液（例えば血液、血清、唾液及び尿）、可溶化組織及びその他を含む。
【００４９】
ある実施形態において、本発明による方法は、このような精製されていないサンプルに存在するＤＮＡの精製を含む。精製は、一般には、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の完了後に達成される。ＤＮＡを精製する方法及び対応する装置（任意には、自動化システム又はワーキングプラットホームの一体部分としての装置）は、当分野において良く知られており、多くのサブライヤから市販されている。
【００５０】
本明細書で用いられる「ＤＮＡレポータ分子」という語は、そのヌクレオチド配列に少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、少なくとも１つの標識とを含むＤＮＡ分子をさし、少なくとも１つの標識は、検出可能な標識の解放を生じさせる亜硫酸水素塩媒介されるＤＮＡ変換を監視するための実際の基体として使用される。本発明の方法は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子によって、すなわち１又は複数のＤＮＡレポータ分子によって、実施される。２以上のＤＮＡレポータ分子が用いられる場合、これらは一般に同じタイプである（すなわち、同じ核酸配列及び／又は標識を有する）。しかしながら、異なるタイプの（すなわち異なる核酸構造及び／又は標識を有する）ＤＮＡリポータ分子を使用することも可能でありうる。
【００５１】
概して、本発明において使用されるＤＮＡレポータ分子は、１０乃至１５０ヌクレオチド、例えば１５乃至８０ヌクレオチド、１５乃至６０ヌクレオチド、又は１５乃至４０ヌクレオチドの長さを有する核酸分子である。ＤＮＡレポータ分子は、自然発生分子又は好適には合成分子（例えば組み換えＤＮＡ技術又は化学合成によって生成される）でありうる。好適には、本発明において使用されるレポータ分子は、一本鎖の核酸分子である。しかしながら、二本鎖の分子が用いられてもよい。
【００５２】
好適な実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、合成オリゴヌクレオチド（すなわち一本鎖）である。
【００５３】
検出反応を実施するために、ＤＮＡレポータ分子は、１又は複数の検出可能な標識を含む。本明細書で用いられる「標識」という語は、１又は複数の適当な化学物質又は酵素を含む任意の化合物又はモイエティをさし、それらは、化学、物理又は酵素反応において、検出可能な化合物又は信号を直接的又は間接的に生成する。本明細書で使用される場合、この語は、検出可能な標識と、１又は複数のそのような検出可能なマーカに結合される任意の化合物との両方を含むことが理解されるべきである。更に、本発明の範囲内で、標識によって検出可能な信号の生成と干渉するモイエティ（例えば、クエンチャ及び蛍光体が互いに近くにある限り、蛍光体の励起から生じた放出を「乗っ取る」クエンチャ）が更に標識に属する。標識は、例えば、修飾された及び／又は標識化されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの形で、レポータ分子に組み込まれ又はアタッチされることができる。標識は、ＤＮＡレポータ分子の配列の中で、５'−終端及び／又は３'−終端及び／又は任意の内部ヌクレオチドにアタッチされることができる。
【００５４】
本発明により使用されることができる検出可能な標識は、化学、物理又は酵素反応において、検出可能な化合物又は信号を直接的又は間接的に生成する任意の化合物を含む。標識化は、当分野において良く知られている方法によって達成されることができる（Sambrook, J. et al. (1989) Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;、及びLottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg / Berlin, Germanyを参照）。標識は、蛍光標識、酵素標識、着色標識、色素標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属及びコロイド金から選択されることができる。すべてのこれらのタイプの標識は、当分野において良好に確立されている。このような標識によって媒介される物理的反応の例は、照射又は励起の際の蛍光又は燐光の放出であり、又は放射性標識を使用する際のＸ線の放出である。アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−ラクタマーゼは、酵素標識の例であり、これらは、色素反応生成物の形成をもたらし、本発明において使用されることができる。本発明の特定の好適な実施形態において、検出可能な標識は蛍光標識である。多数の蛍光標識は、当分野において良好に確立されており、異なるサブライヤから市販されている（例えばThe Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed. (2006), Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USAを参照）。
【００５５】
このような標識を検出するために、本発明の方法を実施するために使用される装置は、標識の存在及び／又は量を示す値を決定するのに適した検出システムを有することができる。適切な検出システムの選択は、例えば実施される検出又はそのような種類の解析のために使用されるタイプの標識のような幾つかパラメータに依存する。様々な光学及び非光学検出システムが、当分野において良好に確立されている。例えば、本発明において使用されうる蛍光検出方法は、とりわけ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）及び蛍光相関分光法を含む。
【００５６】
特定の実施形態において、検出は、蛍光又は生物発光クエンチャペアの個々の形成に基づくＦＲＥＴ又はＢＲＥＴを使用して実施される。ＦＲＥＴの使用は、例えばLiu, B. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 589-593にも記述されている。ＢＲＥＴの使用は、例えば、Xu, Y. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156に詳述されている。
【００５７】
少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、結合されない形態（すなわち溶液中の自由分子）で提供されることができる。特定の実施形態において、ＤＮＡレポータ分子は、サポートに不動化される（すなわち基質にアタッチされる）。一般に、サポートは、例えば固体の表面のような固体の部材である。サポートに対するＤＮＡレポータ分子のアタッチメントは、ＤＮＡレポータ分子と所与のサポート部材との直接的（例えばレポータ分子に含まれるアンカー基を通じて）な又は間接的（結合を媒介する捕捉分子を通じて）な相互作用によって、達成されることができる。この相互作用は、共有結合又は非共有結合でありえ、概して可逆的である。例えば、カルボジイミド化学は、ＤＮＡレポータ分子を活性化表面に共有結合させるために使用されることができる。ＤＮＡレポータ分子の５'―又は、３'−終端―の適切なアミンリンカーが、この目的のために提供される。ＤＮＡレポータ分子の不動化を達成するための様々な他の確立した化学作用が、当分野において知られている。
【００５８】
ＤＮＡレポータ分子は、好適には磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ及びラテックスビーズのようなビーズでありうる可動サポートに不動化されることができる。このような可動サポート部材は、本発明の方法を実施するために使用されるセンサ装置の流体フローの中で移動されることができる。
【００５９】
他方、ＤＮＡレポータ分子を、反応コンパートメントの内側表面上に、又は例えば反応コンパートメント内に配置されるが自由に移動されることができない顕微鏡スライド、ウエハ又はセラミック材料上に、直接的に不動化することも可能である。
【００６０】
ある実施形態において、検出反応の結果は、（例えば内部制御として提供される）例えば固定量の標識によって得られる値又は文献からのデータのような、基準値と比較される。
【００６１】
好適には、検出ステップは、例えば３０分、６０分、１２０分、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、その他の所与の時間期間内に、少なくとも１回繰り返される。複数回の繰り返しが可能であり、例えば２、５、８、１０、１５、２０、３０回及びそれ以上の繰り返しが可能である。繰り返しは、所与の時間期間にわたる固定の時間間隔中に実施されることができる。しかしながら、繰り返しの間の時間間隔は変化しても良く、例えば亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換が完了に達するにつれて、反応のエンドポイントを正確に決定するために、より短くされうる。言い換えると、検出の間に得られる結果は、ＤＮＡ変換の進行を制御するために使用される。少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、亜硫酸水素塩により媒介される変換が完了する場合、同じことがサンプルＤＮＡにも当てはまると考えられる。
【００６２】
本発明の中で、サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される。すなわち、サンプルＤＮＡは、第１の反応コンパートメントに提供され、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子は、第２の反応コンパートメントに提供され、２つのコンパートメントは、別個のエンティティを表す。本明細書において用いられる「反応コンパートメント」（「反応チャンバ」とも呼ばれる）という語は、液体サンプルを収容するための任意の構造を示す。（例えば直方体又は円筒状３次元形状を有する）このような構造の様々な形状が、当分野において良く知られている。
【００６３】
しかしながら、反応コンパートメントは、完全独立ではなく、互いに流体連絡されており、すなわち、コンポーネントの少なくとも一部が、コンパートメント間の流体フローの中で移動されることができる。これは、例えば、マイクロフルイディックチャネルを通じて反応コンパートメントを接続することによって、達成されることができる。好適な実施形態において、反応コンパートメントの間の空間的な分離は、半透膜によって、好適にはサイズ排除メンブレン又はマイクロダイアリシスメンブレンによって、達成される。このような半透膜は、より大きいもの（すなわちメンブレンの特性に依存する所与のサイズ制限を越える）が保持されたまま、小分子が障壁を通過することを可能にする。
【００６４】
サンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる非メチル化シトシン残基及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するために、空間的に分離された反応コンパートメントへの亜硫酸水素塩（例えば重硫酸ナトリウムであるが、任意の他の塩類も同様に適切である）の添加が、当分野において知られている標準プロトコルに従って実施される。試薬は、異なるサブライヤから市販されている。一般的な反応スキームが、図１に概略的に示されている。ＤＮＡ変換は、概して、４０−７０℃の間、好適には５５−６５℃の間、特に好適には６０℃の反応温度で実施される。インキュベーション期間は、数分乃至数時間（例えば一晩）又はより長い時間まで、（とりわけ解析されるべきサンプルに依存して）様々でありうる。
【００６５】
サンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子のＤＮＡ変換は、空間的に分離された反応コンパートメント内で並行に（すなわち同じ実験条件下で）生じる。必要とされる個々の試薬が、特定のリザーバから、個々のＤＮＡ分子が提供されている反応コンパートメントのいずれか１つ及び／又は両方に加えられることができる。
【００６６】
特定の反応温度を調整するために、本発明を実施するのに用いられる少なくとも１つの、好適にはすべての反応コンパートメントは、反応コンパートメント内の温度を制御し、調節するための１又は複数の温度制御ユニットを備える。このような温度制御ユニットは、使用される装置の１又は複数の反応コンパートメントと直接的に接触しうる１又は複数の別個の加熱及び／又は冷却素子を含むことができる。様々な熱制御システムが、当分野において知られており、異なるサブライヤから市販されている。
【００６７】
酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）が、一般に、以前の反応からのＰＣＲ生成物を汚染する可能性のある「キャリーオーバー」を防ぐために、ＰＣＲ反応において一般に使用される。ＵＮＧは、多くのサプライヤーから市販されており、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡに対して作用する。ＵＮＧは、ウリジン残基を除去する作業を伴うセルのＤＮＡ修復装置の一部である。ウリジンは、シトシンがウラシルに脱アミノ化される場合にのみＤＮＡに見つけられることができ、これは、ＤＮＡの変異につながる。酵素は、ＤＮＡの糖−リン酸塩バックボーンからウラシル塩基を除去し、その反応は、図２に概略的に示されている。この反応は、いわゆる塩基切除修復メカニズムの一部であり、それにより、このケースではＤＮＡのシトシン脱アミノ化変異を防ぐ。
【００６８】
知られている任意のウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼが、本発明において用いられることができる。酵素は、サンプルＤＮＡにでなく、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えられる。ＤＮＡバックボーンからの酵素反応（すなわち、亜硫酸水素塩により媒介される変換の間に得られたウラシル塩基の除去）が、用いられる特定の酵素に依存して確立された標準反応条件下で生じる。
【００６９】
好適な実施形態において、熱安定性のＵＮＧ酵素が使用される、特に好熱性生体から得られるＵＮＧ酵素が使用される。このような熱安定性のＵＮＧ酵素は、当分野において知られている（例えば、Sartori, A.A. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 29979-29986; Sartori, A.A. et al (2002) EMBO J. 21, 3182-3191）。それらは、９０℃より高い温度であっても、高い活動性を維持する。
【００７０】
ＵＮＧにより媒介される酵素反応は、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供されるのと同じ反応コンパートメントにおいて、又は、空間的に分離されているが、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供される１つの反応コンパートメントと流体連絡する他の（すなわち第３の）反応コンパートメントにおいて、実施されることができる。必要な試薬は、個々の反応コンパートメントと流体連絡する特定のリザーバから提供されることができる。
【００７１】
ＵＮＧ処理の後に得られるＤＮＡレポータ分子は、損われていないＤＮＡバックボーンをなお有するが、ウラシル塩基が除去された１又は複数の脱塩基部位をもつ。これらの脱塩基部位は、例えば９０℃乃至９５℃の間の温度のような高温で、加水分解に敏感である。
【００７２】
本発明において、熱誘導の断片化は、ＤＮＡのタイプ及び量に依存して、例えば１０秒、３０秒、１分、２分、５分のような様々な時間期間の中で実施されることができる。当業者であれば、インキュベーション時間を如何にして選択するかが分かる。
【００７３】
熱誘導の断片化ステップは、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供される（及び任意にはＵＮＧにより媒介される反応が行われた）のと同じ反応コンパートメント内で、又は別の空間的に分離された反応コンパートメント内で、実施されることができる。後者は、ＵＮＧにより媒介される反応が行われたのと同じ反応コンパートメント（すなわち第３）、又は空間的に分離されているが第２の及び／又は第３の反応コンパートメントと流体連絡する他の（すなわち第４の）反応コンパートメントでありうる。
【００７４】
最後に、検出ステップは、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が提供される（及びＵＮＧにより媒介される反応及び熱誘導された断片化が行われた）のと同じ反応コンパートメント内で、又は空間的に分離された別の反応コンパートメント内で、実施されることができる。後者は、すでに上述した第３の又は第４の反応コンパートメントでありえ、又は空間的に分離されているが第２及び／又は第３及び／又は第４の反応コンパートメントと流体連絡する他の（すなわち第５の）コンパートメントでありうる。
【００７５】
本発明による方法の原理は、図３に概略的にまとめられている。
【００７６】
ある実施形態において、互いに流体接続される少なくとも２つの空間的に分離される反応コンパートメントが、好適には連続センサ装置であるセンサ装置に組み込まれる。センサ装置は更に、例えばＤＮＡサンプル精製のための及び／又は差動メチル化の次の解析のための手段のような、自動化プラットホーム又はワーキングステーションの一体部分（例えばＰＣＲ反応を実施するためのサーマルサイクラ）でありえる。このようなプラットホームは、当分野において知られており、市販されている。
【００７７】
別の見地において、本発明は、サンプルＤＮＡのメチル化ステータスを解析するための、本明細書に規定される方法の使用に関する。言い換えると、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の進行を監視するこの方法は、高品質の（すなわち十分に変換された）ＤＮＡを提供することによって、下流のアプリケーションの正確さ及び信頼性を確実にするために不可欠である。このような下流のアプリケーションは、亜硫酸水素塩−シークエンシング、メチル化感受性一本鎖コンフォメーション解析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー拡張（ＭＳ−ＳｎｕＰＥ）、メチル化感受性マイクロアレイアプリケーション、組み合わされた亜硫酸水素塩制限解析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化感受性リアルタイムＰＣＲアプリケーション及びその他を含む。
【００７８】
好適な実施形態において、ＤＮＡメチル化ステータスの解析は、癌を診断するために使用される。
【００７９】
本発明は、図面及び以下の例によって詳しく記述されるが、それらの図面及び例は、単に、本発明の特定の実施形態を説明するためだけにあり、いかなる形であれ本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【００８０】
実施例
実施例１：連続センサ装置における亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換の監視
本実施例において、本発明による方法は、図４に概略的に示される例示の連続センサにおいて実施される。
【００８１】
このような状況において、方法のそれぞれ異なるステップが、空間的に分離されたそれぞれ異なる反応コンパートメントにおいて行われることが望ましい。センサ装置のこの構成は、異なる方法ステップの間の干渉及び反応成分の間の不適合を防ぐ。例えば、ウラシル―ＤＮＡ―グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の酵素活性は、熱断片化ステップの間、著しく減少しうる。
【００８２】
図４に示されるセンサ装置は、少なくとも５つの空間的に分離された反応コンパートメントを有する。第１の反応コンパートメントには、サンプルＤＮＡが提供される。サンプルＤＮＡは、メチル化ステータスの次の解析のために、このコンパートメントから除去されうる（図示せず）。第１コンパートメントは、ＤＮＡの準備及び変換のために必要な成分（例えば重硫酸塩溶液）を含む適切な量のリザーバに接続される。
【００８３】
第１の反応コンパートメントは、第２の反応コンパートメントのすぐ隣りに位置し、第２の反応コンパートメントには、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち標識化された合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド）が提供される。
【００８４】
２つの反応コンパートメントの間の空間的な分離は、変換試薬が通過することができるが、サンプルＤＮＡが第１チャンバに保持されるようなやり方で、すなわち、半透過性バリアを通じて、例えばサイズ排除（フィルタ）メンブレンによって、達成される。言い換えると、２つの反応コンパートメントは、互いに流体連絡されている。
【００８５】
第１及び第２の反応コンパートメント内の温度は、１又は複数の加熱（及び／又は冷却）素子を用いることによって、適切な反応条件（例えば６０℃）の調整を可能にするように制御されることができる。
【００８６】
第３の反応コンパートには、ＵＮＧ酵素が提供され、「変換された」少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子からのウラシル塩基の除去が行われる。第２及び第３の反応コンパートメントの間の空間的な分離は、ＵＮＧ酵素のための最適反応条件を生成するために、バッファ成分が、例えばマイクロダイアリシス膜によって、置換され又は除去されることができるようなやり方で、達成される。
【００８７】
第３の反応コンパートメントに隣接して位置する第４の反応コンパートメントでは、ＤＮＡリポータ分子の脱塩基部位において熱誘導の加水分解が行われる。第３及び第４の反応コンパートメントの間の空間的な分離は、例えば（半透過性の）サイズ排除（フィルタ）膜によって、ＵＮＧ酵素分子は保持されるがＤＮＡレポータ分子は保持されないようなやり方で、構成される。
【００８８】
第４の反応コンパートメントに隣接して位置する第５の反応コンパートメントでは、以前の断片化ステップの間に解放された標識（例えば蛍光染料）の検出が行われる。第４及び第５の反応コンパートメントの間の空間的な分離は、例えば（半透過性の）サイズ排除（フィルタ）膜によって、標識及び断片化されたＤＮＡレポータ分子は第５の反応コンパートに通過することができるが、損なわれていないＤＮＡレポータ分子は第４の反応コンパートに保持されるようなやり方で、構成される。
【００８９】
反応スキームの開始時に第２の反応コンパートメントに提供される少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の量は、好適には、後続の反応経路に入るフラクション（割合）がアッセイの時間を通じて一定であると考えられることができるものである。検出される標識の量は、ＤＮＡの変換の尺度である。
【００９０】
標識によって生成される信号は、例えば核酸コンテントのＵＶ測定によって決定される、第３の反応コンパートメントに入るＤＮＡレポータ分子のフラクションに正規化される。
【００９１】
ＵＮＧ及び熱の総合作用によって変換されない、ゆえに断片化されないＤＮＡレポータ分子のフラクションは、第２の反応コンパートメントにへ再び向けられる。これらのＤＮＡレポータ分子は、再び変換反応に入る。これは、例えば第４及び第２の反応コンパートメント（閉ループ構造、図４に示さず）の間の接続によって達成されることができる。
【００９２】
通常のマイクロフルイディクスが、液体及び試薬の量を制限し、システムを作動させるために使用されることができる。
【００９３】
実施例２：２重に標識化されたＤＮＡレポータ分子の使用
本発明による方法の他の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、第１及び第２の標識を含む。
【００９４】
第１の標識は、様々な市販の染料から選択されることができる蛍光染料である。第２の標識は、この染料に適切したクエンチャである。代替として、第２の分子は、第１の染料と共に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のためのドナーアクセプタ対を形成する他の蛍光染料である。
【００９５】
ＤＮＡレポータ分子の熱誘導の断片化が生じるとき、第１の蛍光染料は、クェンチャ分子から分離される。代替として、ＦＲＥＴドナーアクセプタ対は、互いから分離される。蛍光信号は、熱誘導の断片化ステップにおいて既に検出可能である。
【００９６】
それゆえ、断片化及び検出ステップを組み合わせることによって、図４に示されるセンサ装置の少なくとも５つの反応コンパートメントのうちの１つが不要になり、その結果、装置の簡略化された構成を与える。
【００９７】
実施例３：ビーズに不動化されるＤＮＡレポータ分子の使用
あるアプリケーションの場合、例えば試薬の量、エネルギー消費等を制限するために、ほんの少数のデータポイントのみを生成することが好ましいことがある。このような状況では、少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例えば３'−末端のような一方の終端にアタッチされる適切な標識を有し、好適には例えばポリスチレンビーズ又は磁気ビーズのようなビーズである移動表面上に、例えば５'−末端である他方の終端を通じて不動化される。
【００９８】
１つの特定の実施形態において、ビーズは例示のセンサ装置の第２の反応コンパートメントに保持され、特定の時点に、ビーズのフラクションが、他の（複数の）コンパートメントに入るために解放されることができる。
【００９９】
空間的に分離された２つの反応コンパートメントを有する例示のセンサ装置の固体サポート（すなわちビーズの表面）に不動化されるＤＮＡレポータ分子のフラクションを使用することによる、離散的なデータポイントの収集が、図５に概略的に示される。パネルＡ―Ｃは、時間連続の部分的な解放を概略的に示す。パネルＤは、ＤＮＡ変換効率を決定するために使用可能なプロットを表す。
【０１００】
更に、第２の反応コンパートメント内のビーズに不動化されるＤＮＡレポータ分子の使用は、ＤＮＡレポータ分子が保持されたままで、このコンパートメント内の溶液の交換を可能にする。図５に示されるセンサ装置の第２及び第３の反応コンパートメントの間の緩衝平衡の要求は不要であり、省略されることができる。
【０１０１】
更に、（ビーズ当たりのＤＮＡレポータ分子の数及び解放当たりのビーズ数が分かっているので、）第２の反応コンパートメントからのＤＮＡレポータ分子の部分的な解放は、他の（複数の）反応コンパートメントへ移動されるＤＮＡレポータ分子の絶対数のより正確な制御を可能にする。これは、変換されない／変換されたＤＮＡレポータ分子の比率の計算を容易にする。
【０１０２】
第２の反応コンパートメント内のビーズを制限することは、例えば磁界の印加に関連して磁性ビーズを使用することによって、又は交流磁界及び誘電泳動力に関連してポリスチレンビーズを使用することによって、達成されることができる。
【０１０３】
実施例４：反応コンパートメントの内部表面に不動化されるＤＮＡレポータ分子の使用
他の実施形態において、第１及び第２の反応コンパートメントを有するセンサ装置が、本発明の方法を実行するために用いられる。センサ装置は、図６に概略的に示される。
【０１０４】
第１の反応コンパートメント（サンプルＤＮＡが提供される）は、亜硫酸水素塩変換のために必要とされる試薬を含むリザーバに接続される。
【０１０５】
第２の反応コンパートメントは、適切なバッファ中にＵＮＧ酵素を含む少なくとも１つのリザーバに接続される。少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子（すなわち標識化された合成オリゴヌクレオチド）が、例えばＤＮＡレポータ分子の一方の終端においてアミノリンカー及びカルボジイミド化学を使用することによって、第２の反応コンパートメントの内部表面に不動化される。ＤＮＡレポータ分子の他方の終端は、例えば蛍光染料である適切な標識によって修飾される。
【０１０６】
第１及び第２の反応コンパートメントは、空間的に分離されているが、例えば半透過性のサイズ排除フィルタ膜によって、バッファ及び／又は変換試薬の交換は許容されるがサンプルＤＮＡ及び酵素は通過することができないように、互いに流体連絡される。
【０１０７】
両方の反応コンパートメント内の温度は、効果的な亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡ変換を可能にするレベルに調整されることができる。しかしながら、第２の反応コンパートメント内の温度は、例えば第２の加熱（及び／又は冷却）素子を使用することにより、第１の反応コンパートメント内の温度と独立して調節されることができる。
【０１０８】
第１の方法ステップにおいて、両方の反応コンパートメントの 緩衝条件及び温度は、サンプルＤＮＡ及び不動化ＤＮＡレポータ分子を変換するのに適している（図６Ａ）。
【０１０９】
第２ステップにおいて、第２の反応コンパートメントの温度は、ＵＮＧ反応が行われることを可能にするように、例えば３７℃に低下される。リザーバからのＵＮＧ酵素が、第２のコンパートメントに与えられる（図６Ｂ）。
【０１１０】
第３のステップにおいて、第２の反応コンパートメント内の温度は、脱塩基部位でＤＮＡレポータ分子を断片化するために、例えば９５℃に上昇される（図６Ｃ）。断片化されたＤＮＡレポータ分子から解放される標識は、適当な検出器を通じて測定される。代替として、表面におけるなお損なわれていないＤＮＡレポータ分子の標識が、例えばＴＩＲＦと関連して蛍光標識を使用することによって、又は共焦点スキャナ等によって、測定されることができる。
【０１１１】
第２の反応コンパートメントにおける熱処理の後、温度は、変換反応を続けるために、第１の反応コンパートメントの温度にまで再び低下される。特定の時間ポイントに、プロトコルが繰り返され、その結果、離散的なプロットは、（図５Ｄと同様の）経時的な変換効率を示す。
【０１１２】
第２のコンパートメントにおけるＵＮＧ処理、熱誘導の断片化、及び標識検出の間、第１のコンパートメント内の温度は、一般に、サンプルＤＮＡの変換を止めるために低下される。これは、２つのコンパートメントにおいて得られる変換反応のより良好な相関関係を与える。このように、本実施形態では、不連続な測定値が取得され、より洗練された温度制御が必要であるが、複雑さ及び必要なコンパートメントの数は低減される。
【０１１３】
実施例５：熱安定性のウラシル―ＤＮＡ―グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の使用
本発明による方法の別の実施形態において、熱断片化の間、活性のままである熱安定性のＵＮＧ酵素が使用される。しかしながら、好適には、好熱性生物から導き出されたＵＮＧ酵素が使用される。このような熱安定性のＵＮＧ酵素は、当分野において知られている（例えばSartori, A.A. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 29979-29986; Sartori, A.A. et al (2002) EMBO J. 21, 3182-3191）。熱安定性のＵＮＧ酵素は、９０℃以上の温度でも高い活性を維持する。センサ装置における断片化ステップは、９０℃乃至９５℃の間の温度で実施される。このように、熱安定性のＵＮＧ酵素は、熱誘導の断片化の最中及び後にも活性のままである。
【０１１４】
本実施形態において、ＵＮＧ酵素は、コンパートメントの内部表面に不動化されるＤＮＡレポータ分子（すなわち標識化された合成オリゴヌクレオチド）と共に、第２の反応コンパートメントに提供される。酵素リザーバをもたない２コンパートメントセンサ装置が、第２の反応コンパートメントの２ステップ温度プロトコルと協力して、充分である。両方のコンパートメントは、反応コンパートメントの間の酵素及びサンプルＤＮＡの交換を防ぐために、ここでも半透過性のサイズ排除フィルタ膜によって接続される。使用されたセンサ装置の説明は、図７に与えられている。検出は、上記の実施例１―５にて説明したように、実行されることができる。
【０１１５】
実施例６：サンプルＤＮＡ精製
例えばメチル化特異的ＰＣＲ又は他の適切な技法によって、亜硫酸水素塩により媒介される変換の後にサンプルＤＮＡを更に解析するために、サンプルＤＮＡは、精製された形で提供されなければならない。
【０１１６】
こうして、例えば、適切な結合バッファ（例えば高含有量のカオトロピック塩を有する）によってＤＮＡをシリカ膜に結合し、適切なバッファ（例えば高含有量のエタノール）により結合されたＤＮＡを洗浄し、適切なバッファ（例えば水又はそのバッファ溶液）によりＤＮＡを溶離するための手段及び試薬が、本発明による方法に含められることができる。これは、前記シリカ膜を含み、第１の反応コンパートメントにアタッチされる出口と、それぞれの試薬液のためのリザーバと、を提供することによって達成されることができる。
【０１１７】
本明細書に説明的に記述される本発明は、本明細書に特に開示されないが、１又は複数の構成要素、１又は複数の限定が存在しない場合にも適切に実施されることができる。こうして、例えば、「有する、含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」という語は、制限なく、拡張的に理解されるべきである。加えて、本明細書において使用される語及び表現は、説明の語として使用されており、制限するものではなく、そのような語及び表現の使用において、図示され記述される特徴と等価なもの又はその一部を排除することを意図せず、様々な変形例が、請求項に記載の本発明の範囲内で可能であることが理解される。
【０１１８】
従って、本発明は、実施形態によって具体的に開示されているが、その中に具体化される本発明の任意の特徴、変形及び変更は、当業者によって再分類されることができ、そのような変形及び変更は、本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【０１１９】
本発明は、本明細書に広く及び一般的に記述されている。一般的な開示の中に入るよりも狭い種類及び下位の一般的なグループの各々は、本発明の一部を形成する。これは、除去される材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関係なく、概念から任意の発明の主題を除去する但し書き又は否定的な制限を有する本発明の一般的な記述を含む。
【０１２０】
他の実施形態は、添付の請求項の範囲内にある。更に、本発明の特徴又は見地は、マーカッシュ群に関して記述されているが、当業者であれば、本発明が更にマーカッシュ群の個別のメンバ又はメンバのサブグループに関しても記述されるていることが分かるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法であって、
（ａ）解析されるべきサンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するステップであって、前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、（ｉ）そのヌクレオチド配列内の少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、（ｉｉ）少なくとも１つの標識と、を含み、前記サンプルＤＮＡ及び前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される、ステップと、
（ｂ）亜硫酸水素塩を前記空間的に分離された反応コンパートメントに加えて、前記サンプルＤＮＡの前記ヌクレオチド配列に含まれる前記非メチル化シトシン残基及び前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するステップと、
（ｃ）ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えて、前記ステップ（ｂ）で得られた前記ウラシル塩基の、ＤＮＡバックボーンからの除去を媒介するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られたＤＮＡを熱処理によって断片化するステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の間、前記少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子から解放される少なくとも１つの標識を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で得られた結果を基準値と比較するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出するステップが、所与の時間期間内に少なくとも１回繰り返される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｅ）で得られた結果が、前記ステップ（ｂ）による反応の進行を制御するために使用される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が合成オリゴヌクレオチドである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子がサポートに不動化される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼが熱安定性である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）が、前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられるのと同じ反応コンパートメントにおいて実施される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の１つ又は複数が、前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられる反応コンパートメントと流体接続される少なくとも１つの空間的に分離された他の反応コンパートメントにおいて実施される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの及び好適にはすべての反応コンパートメントが、前記反応コンパートメント内の温度を制御し、調節するための１又は複数の温度制御ユニットを備える、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応コンパートメントの間の空間的な分離は、半透膜によって達成され、好適にはサイズ排除メンブレン又はマイクロダイアリシスメンブレンによって達成される、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
互いに流体接続される前記少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントは、センサ装置に組み込まれ、好適には連続センサ装置に組み込まれる、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルＤＮＡのメチル化ステータスを解析するための又は解析する際の請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
前記ＤＮＡメチル化ステータスの解析が癌診断のために実施される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＤＮＡメチル化ステータスを解析する過程における請求項１に記載のレポータ分子の使用。
【請求項１】
ＤＮＡメチル化解析の間、亜硫酸水素塩により媒介されるＤＮＡの変換を監視する方法であって、
（ａ）解析されるべきサンプルＤＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するステップであって、前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、（ｉ）そのヌクレオチド配列内の少なくとも１つの非メチル化シトシン残基と、（ｉｉ）少なくとも１つの標識と、を含み、前記サンプルＤＮＡ及び前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が、互いに流体接続される空間的に分離された反応コンパートメントに提供される、ステップと、
（ｂ）亜硫酸水素塩を前記空間的に分離された反応コンパートメントに加えて、前記サンプルＤＮＡの前記ヌクレオチド配列に含まれる前記非メチル化シトシン残基及び前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子の、ウリジン残基への変換を媒介するステップと、
（ｃ）ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子に加えて、前記ステップ（ｂ）で得られた前記ウラシル塩基の、ＤＮＡバックボーンからの除去を媒介するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られたＤＮＡを熱処理によって断片化するステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の間、前記少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子から解放される少なくとも１つの標識を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で得られた結果を基準値と比較するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出するステップが、所与の時間期間内に少なくとも１回繰り返される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｅ）で得られた結果が、前記ステップ（ｂ）による反応の進行を制御するために使用される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子が合成オリゴヌクレオチドである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの合成ＤＮＡレポータ分子がサポートに不動化される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼが熱安定性である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）が、前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられるのと同じ反応コンパートメントにおいて実施される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の１つ又は複数が、前記少なくとも１つのＤＮＡレポータ分子を提供するために用いられる反応コンパートメントと流体接続される少なくとも１つの空間的に分離された他の反応コンパートメントにおいて実施される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの及び好適にはすべての反応コンパートメントが、前記反応コンパートメント内の温度を制御し、調節するための１又は複数の温度制御ユニットを備える、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応コンパートメントの間の空間的な分離は、半透膜によって達成され、好適にはサイズ排除メンブレン又はマイクロダイアリシスメンブレンによって達成される、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
互いに流体接続される前記少なくとも２つの空間的に分離された反応コンパートメントは、センサ装置に組み込まれ、好適には連続センサ装置に組み込まれる、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルＤＮＡのメチル化ステータスを解析するための又は解析する際の請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
前記ＤＮＡメチル化ステータスの解析が癌診断のために実施される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＤＮＡメチル化ステータスを解析する過程における請求項１に記載のレポータ分子の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０５０３１（Ｐ２０１３−５０５０３１Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３０３８８（Ｐ２０１２−５３０３８８）
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４１６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３６６０９
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５９００００２４８）コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ (12,071)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４１６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３６６０９
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５９００００２４８）コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ (12,071)
【Ｆターム（参考）】
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