亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置
【課題】酸素によってセンサが劣化することなく、特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる亜酸化窒素の測定方法を提供すること。
【解決手段】Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程とを備え、第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶｖｓ．ＳＨＥであり、第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、亜酸化窒素の測定方法。
【解決手段】Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程とを備え、第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶｖｓ．ＳＨＥであり、第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、亜酸化窒素の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）は、一酸化窒素（ＮＯ）や二酸化窒素（ＮＯ２）と同様に窒素酸化物の一種であるが、麻酔作用を有するため、吸入麻酔剤として医療現場で使用され、人体に対してはほとんど無害の気体である。
【０００３】
しかしながら、亜酸化窒素の温暖化係数は二酸化炭素の約３１０倍であり、京都議定書で指定された温室効果ガスに占める亜酸化窒素の割合は約１．９％と少ないものの、その地球温暖化への寄与率は高い。亜酸化窒素の主な発生源は農用地、化石燃料燃焼、家畜排泄物管理、廃棄物焼却場であるが、全体の約５０％は農業関係である（非特許文献１）。温暖化防止のためにその削減が求められているが、発生源が水田等の農耕地、家畜排泄物、肥料施肥等多岐にわたり、さらに簡便な測定技術がないために、適切な管理が困難な状況になっている。
【０００４】
亜酸化窒素の濃度は、フーリエ変換赤外分光計（ＦＴＩＲ)、非分散型赤外線分析法（ＮＤＩＲ）、及び、ガスクロマトグラフで測定するのが一般的である。亜酸化窒素は、発生源では比較的高濃度で存在するが、大気中の濃度は約３１４ｐｐｂと極めて希薄である。そのため、発生源付近での測定や低濃度の亜酸化窒素の測定を可能とする測定技術の開発が求められているが、溶液系での滴定による分析やガス検知管等の簡易・安価かつ迅速に定量する方法がないのが現状である。
【０００５】
近年では、デンマークの研究グループが、亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサを開発し、亜酸化窒素の濃度を測定できることを報告している（非特許文献２）。このセンサは、金電極を用いて、−１Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの還元電位で亜酸化窒素を計測するものである。
【０００６】
亜酸化窒素を基質とする酵素としては亜酸化窒素還元酵素（ＮＯＳ）が報告されている。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のＮＯＳが研究されている。初期の研究段階においてはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属を中心に論文が多く報告されている。近年、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓという細菌に由来する亜酸化窒素が報告されている（非特許文献３）。ＮＯＳの活性測定にはこれまで還元型メチルビオロゲン（ＭＶ）、還元型ベンジルビオロゲン（ＢＶ）等の色素が人工電子供与体として用いられ、亜酸化窒素の還元反応が解析されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本国温室効果ガスインベントリ報告書、温室効果ガスインベントリオフィス編、環境省地球環境局地球温暖化対策課監修、ＩＳＳＮ １３４１−４３５６、ＣＧＥＲ−Ｉ０８５−２００８
【非特許文献２】Ｎｉｅｌｓら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８年、５４巻、ｐ．２２４５−２２４９
【非特許文献３】Ｔｅｒａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｈｏｌｌｏｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９年、２６４巻、ｐ．１９７２−１９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記の非特許文献２に記載された亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサは、電極反応に選択性がなく、測定時に酸素が存在すると酸素に対しても同時に反応してしまうという問題点を有していた。また、これまでに亜酸化窒素のバイオセンサに関する報告はなかったため、亜酸化窒素の濃度を正確に測定するには、測定試料をサンプリングし、ガスクロマトグラフが設置してある測定室まで測定試料を持ち帰る必要があった。
【０００９】
亜酸化窒素を基質とする酵素を応用した亜酸化窒素の測定系の開発に際しては、人工電子供与体の安定性の観点から実用化が困難であった。すなわち、人工電子供与体として用いられている還元型のメチルビオロゲン（ＭＶ）及びベンジルビオロゲン（ＢＶ）は、酸化還元電位が−４００ｍＶ（ｖｓ．標準水素電極（ＳＨＥ））と低く、極めて還元力が強い。よって、これらの人工電子供与体は、大気中では即座に空気酸化されてしまうことから、嫌気状態での使用に限られ、大気中の亜酸化窒素の測定に適用することが事実上不可能であった。したがって、このような電子供与体を用いる亜酸化窒素の酵素分析法は汎用性がないことから、これまでＮＯＳを用いる溶液系での亜酸化窒素の分析方法や検知管等の分析方法に関する報告はなかった。
【００１０】
そこで本発明は、大型の分析装置を用いることなく、酸素存在下においても特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素が、従来の人工電子供与体よりも還元力の弱い電子供与体を電子メディエータ（第一電子メディエータ）として利用できることを見出した。さらに、本発明者は、第一電子メディエータへの電子供与体として、酸化型−還元型間で光学的特性が変化する第二電子メディエータを用いることにより、酸素存在下においても安定な酸化型の第二電子メディエータを指標として亜酸化窒素の濃度を測定することに成功した。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、
上記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、上記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程と、
を備え、
上記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
上記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
上記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定方法を提供する。
【００１３】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、酸素耐性が非常に高く、空気中に放置しても酵素活性が消失しない。また、第一電子メディエータとして、従来の人工電子供与体よりも還元力の弱いものを採用することが可能となり、よって、分析中に還元型の人工電子供与体が空気中の酸素により酸化されてしまうという酸素感受性をより低減することができる。さらに第一電子メディエータを還元するための還元型の第二電子メディエータは、酸素存在下においても安定であるため、安定した測定が可能となる。したがって、上記亜酸化窒素の測定方法によれば、酸素存在下でも、特異的かつ高感度に亜酸化窒素を測定することができる。
【００１４】
本発明は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥである第一電子メディエータと、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元される第二電子メディエータと、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤と、を備える、亜酸化窒素の測定キットを提供する。
【００１５】
また、本発明は、
所定量の被検試料を取り入れる手段と、
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる手段と、
上記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、上記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する手段と、
を備え、
上記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
上記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
上記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定装置を提供する。
【００１６】
上記亜酸化窒素の測定方法、測定キット又は測定装置に用いる第一電子メディエータは、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）、トルイレンブルー、チオニン、フェナジンエトサルフェート、ナフトキノン等であることが好ましい。
【００１７】
上記亜酸化窒素の測定方法、測定キット又は測定装置に用いる第二電子メディエータは、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、ｏ−クレゾールインド−２，６−ジクロロフェノール、２，３’，６−トリクロロインドフェノール等のインドフェノール化合物、フェノールブルー等であることが好ましい。
【００１８】
上記亜酸化窒素の測定方法、測定キット又は測定装置に用いる還元剤は、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤であり、アスコルビン酸であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置によれば、大型の分析装置を用いることなく、酸素存在下においても特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる。本発明の亜酸化窒素の測定装置によれば、安定性と耐久性とを備えた小型測定装置の構築が可能となる。したがって、大型の分析装置を用いる必要がなく、野外においてもリアルタイムで亜酸化窒素の濃度の測定が可能な、簡易・安価かつ迅速に亜酸化窒素を測定できる亜酸化窒素の測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の亜酸化窒素測定の原理を説明する反応式。
【図２】本発明の一実施形態に係る亜酸化窒素測定装置を示す略断面図。
【図３】本発明の一実施形態に係る亜酸化窒素測定装置を示す略断面図。
【図４】水溶性画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図５】陽イオン交換カラムに吸着した成分の溶出プロファイルを示すクロマトグラム。図中、ＵＶは溶出溶液の２８０ｎｍ吸光度、Ｃｏｎｃは溶出溶媒中のＢ液の割合（％、計算値）、ＣｏｎｄはＢ液の電気伝導度を１００％としたときの相対電気伝導度（％）、数字１〜３７は各溶出画分の番号をそれぞれ示す。
【図６】溶出画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図７】亜酸化窒素の還元反応に伴う吸光度６００ｎｍの経時変化を示すグラフ。
【図８】亜酸化窒素の測定結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
（亜酸化窒素の測定原理）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置は、
（１）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、
（２）酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥである第一電子メディエータと、
（３）第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元される第二電子メディエータと、
（４）第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤と、を用いることを特徴とする。以下に、亜酸化窒素の測定原理について説明する。
【００２３】
図１は、本発明の一実施形態に係る亜酸化窒素測定の原理を説明する反応式である。第一電子メディエータ及び第二電子メディエータとして、それぞれフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた実施形態において、図１に示す反応の通り、ＮＯＳによる亜酸化窒素の還元反応によって、無色の還元型ＤＣＩＰから青色の酸化型ＤＣＩＰが生成する。このＤＣＩＰの発色変化を指標として亜酸化窒素を測定することができる。
【００２４】
従来行われている亜酸化窒素を還元する酵素の活性測定では、電子供与体として還元型メチルビオロゲン（ＭＶ）、還元型ベンジルビオロゲン（ＢＶ）等の酸化還元電位−４００ｍＶ（ｖｓ．ＳＨＥ）程度の極めて還元力の高い電子供与体が実験に用いられている。還元型ＭＶや還元型ＢＶを電子供与体として用いることにより、これらの色素の発色変化を指標として、酵素活性又は基質である亜酸化窒素を計測することができる。しかしながら、還元型のＭＶ及びＢＶは大変不安定であり、空気雰囲気下では即座に酸化されることから、嫌気状態での使用に限られ、大気中の亜酸化窒素の測定に適用することが事実上不可能であった。このように、ＮＯＳの人工電子供与体として従来知られているＭＶ又はＢＶを用いる亜酸化窒素計測方法は実用化されていない。
【００２５】
一方、酵素の酸化反応又は脱水素酵素反応の電子受容体として、ＰＭＳ及びＤＣＩＰが用いられている。この反応において、ＰＭＳが酸化酵素又は脱水素酵素反応の第一電子受容体として機能し、さらに第二電子受容体であるＤＣＩＰに電子を伝達する。このＰＭＳを介した電子伝達反応により、青色の酸化型ＤＣＩＰから無色の還元型ＤＣＩＰが生成し、この発色変化を指標として酵素反応速度を評価できる。この原理に基づき、酸化酵素又は脱水素酵素の基質濃度を定量できる。ＰＭＳ及びＤＣＩＰが酸化反応及び脱水素酵素反応の吸光計測に用いることができる理由としては、ＰＭＳが酵素反応の電子受容体として機能し得ること、さらに生成される還元型のＤＣＩＰが大気中で自動酸化を受けず安定であることが挙げられる。
【００２６】
しかしながら、酸化酵素又は脱水素酵素の電子受容体として用いられている電子メディエータが亜酸化窒素還元酵素の電子供与体として機能することは、これまでに報告されていない。その理由としては、ＭＶ及びＢＶの酸化還元電位（約−４００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）に対して、ＰＭＳ及びＤＣＩＰの酸化還元電位（それぞれ＋８０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ及び＋２１７ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）が高いことが挙げられる。つまり、酸化酵素又は脱水素酵素の電子受容体として用いられている電子メディエータは、ＭＶ及びＢＶよりも還元力が低く、亜酸化窒素を還元するためのエネルギーが不足しているためと考えられる。
【００２７】
（亜酸化窒素の測定方法）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定方法について説明する。
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定方法は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程と、を備え、第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である。
【００２８】
（亜酸化窒素還元酵素）
本発明で使用されるＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、亜酸化窒素を還元する活性を有し、ＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した分子量が約８８±２．０ｋＤａであることが好ましい。上記亜酸化窒素還元酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する亜酸化窒素還元酵素である。本発明の亜酸化窒素還元酵素の具体例としては、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭＺ１７４０株が保有する配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する亜酸化窒素還元酵素を例示できる。配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２９】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓは、ルーメン細菌の一種であり、複数の公的機関から入手可能である。例えば、ドイツのＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）や米国のＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から容易に入手できる。
【００３０】
上記の亜酸化窒素還元酵素は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを培養し、増殖したＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ菌体又は培養中から、酵素活性を指標に精製できる。
【００３１】
具体的には、液体培地にＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを植菌し、培養中は常に亜酸化窒素を通気しながら、嫌気的条件下、３７℃で培養すればよい。Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養に用いる液体培地としては、例えば、酵母抽出物、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸銅、チオグリコール酸を含み、ｐＨを中性付近に調整した培地が挙げられる。また、上記液体培地に、ニュートリエント培地成分、トリプチカーゼペプトン、ビタミンＫ１、ヘミン等を加えた栄養培地にＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを植菌し、嫌気的条件下、３７℃で培養してもよい。
【００３２】
亜酸化窒素還元酵素の精製は、培養したＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの菌体から、当業者であれば公知である常法のタンパク質の精製方法に従って行うことができる。例えば、培養したＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの菌体をフレンチプレス又は超音波破砕器等で破砕し、遠心分離して得られた上清（亜酸化窒素還元酵素を含む粗酵素溶液）を、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の精製手段で分画することにより、単一酵素として精製できる。
【００３３】
こうして調製されたＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、同酵素の亜酸化窒素還元活性に基づき、電子供与体として還元型第一電子メディエータ及び還元型第二電子メディエータの存在下において、同酵素の基質である亜酸化窒素を還元させ、還元型第二電子メディエータの減少又は酸化型第二電子メディエータの増加量を指標として亜酸化窒素の濃度を測定することを可能にするものである。
【００３４】
本発明の測定に用いる亜酸化窒素還元酵素は、溶液中に溶解されていても、固相に固定化されていても良い。
【００３５】
（第一電子メディエータ）
本発明における第一電子メディエータは、上記亜酸化窒素還元酵素の亜酸化窒素還元活性に基づき、亜酸化窒素を還元する電子供与体として機能する電子メディエータである。第一電子メディエータの酸化還元電位（標準水素電極；ＳＨＥ）は、＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることが好ましく、＋３０ｍＶ〜＋１２０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることがより好ましく、＋６０ｍＶ〜＋９０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ（例えば、＋８０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ程度）であることが特に好ましい。そのような第一メディエータとして、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ、酸化還元電位：＋８０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ、＋６３ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、トルイレンブルー（＋１１５ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、チオニン（＋６４ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、フェナジンエトサルフェート（＋５５ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、ナフトキノン（＋３６ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）等が好ましく、特に、ＰＭＳが好ましい。
【００３６】
（第二電子メディエータ）
本発明における第二メディエータは、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で光学的特性が変化する電子メディエータである。第二メディエータの酸化還元電位（標準水素電極；ＳＨＥ）は、第一電子メディエータよりも１００ｍＶ〜２００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ高いことが好ましく、＋１００ｍＶ〜＋３５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることが好ましく、＋１５０ｍＶ〜＋３００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることがより好ましく、＋１８０ｍＶ〜＋２４０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ（例えば、＋２００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ程度）であることが特に好ましい。酸化型−還元型間での光学的特性の変化としては、吸光測定、比色分析、蛍光法等の測定系で検出可能な変化であれば良い。そのような第二メディエータとして、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ、＋２１７ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、ｏ−クレゾールインド−２，６−ジクロロフェノール（＋１８１ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、２，３’，６−トリクロロインドフェノール等のインドフェノール化合物、フェノールブルーが例示できる。特に、ＤＣＩＰが好ましい。
【００３７】
（還元剤）
本発明における還元剤は、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である。そのような還元剤として、自らの酸化体が加水分解される化合物が挙げられ、特に、アスコルビン酸が好ましい。アスコルビン酸は、酸化されるとジヒドロアスコルビン酸となり、次いで加水分解により酸化還元性のない２，３−ジケトグロン酸が生成される。
【００３８】
（被検試料）
被検試料は、亜酸化窒素が含まれる疑いのある試料であり、具体的な形態は特に制限されず、亜酸化窒素を含む溶液が適宜用いられる。また、亜酸化窒素を含む気体（例えば大気）を試料とする場合には、亜酸化窒素を溶解可能な緩衝液等に試料を通気し、溶液試料とするか、又は、亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤を含む反応試薬に直接、亜酸化窒素を溶解させることにより測定することができる。
【００３９】
（亜酸化窒素の測定キット）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定キットは、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、還元剤とを備える。Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤としては、上述のものを使用することができる。
【００４０】
（亜酸化窒素の測定装置）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定装置について詳細に説明する。
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定装置は、所定量の被検試料を取り入れる手段と、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる手段と、第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する手段と、を備え、第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、第二電子メディエータが、酸化型及び還元型の変化により発色が変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である。
【００４１】
図２に本発明の亜酸化窒素の測定装置の一実施形態である亜酸化窒素検知管を示す。本実施形態に係る亜酸化窒素検知管は、被検試料として空気等の気体を取り込むことにより、気体中の亜酸化窒素を測定する。この形態では、透明のガラス管１の内部に検知剤２が装填してある。ガラス管１は例えば、全長１３０ｍｍで内径はφ４ｍｍのものを使用できる。このガラス管１内において、検知剤２が、二つの気体透過性の栓３ａと３ｂによって位置決められている。検知剤２と各栓３ａ及び３ｂの間には、それぞれ非反応性の保護剤４ａと４ｂが介装され、これらの保護剤４ａと４ｂの間に、検知剤２が一定の長さＬをもって装填されている。そして、この長さＬにわたって、その管の長さ方向に目盛り７が付されている。
【００４２】
管１の両端は溶封してあるが、使用時に開口し、その一端は空気取入口５として、他端は排気口６として用いられる。前記のように、検知剤２は、空気取入口５から排気口６の方向に一定の長さＬをもって装填され、空気取入口５の側から被検試料が導入されると、被検試料中の微量の亜酸化窒素が検知剤２の試薬と反応し、その反応に消費された分の長さだけ、空気取入口５に近い方から変色することになる。
【００４３】
検知剤２は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ及び第二電子メディエータを含む。検知剤２は測定開始直前に、第二電子メディエータを還元するための還元剤を含む溶液と混合され、第二電子メディエータが還元されて測定可能な状態となる。
【００４４】
測定にさいしては、検知管８内に装填された検知剤２に対し、通過する被検試料中の亜酸化窒素の実質的に全てが第一電子メディエータ及び第二電子メディエータと反応して変色を起こし、しかもその変色が、検知剤２の長さ方向に（空気の入側から出側の方向に）、通気量に対応して順序よく起きることが必要である。そして、測定時間中において検知剤２に対して被検試料がまんべんなく検知剤２と接触しつつ流れることが肝要である。すなわち、空気の入側近くに存在する検知剤２が変色せずに、それより下流側に存在する検知剤２が先に変色したり、被検試料中の亜酸化窒素が反応せずに検知剤２を通過したりすると、変色長さで亜酸化窒素濃度を定量することが出来なくなるので、このような現象が起きないように適宜設定する必要がある。
【００４５】
図３は、図２の亜酸化窒素検知管８の排気口６をチャック９に固定し、このチャック９から通気管１０を介して吸引ポンプ等の吸引手段１１に連結した状態を示しており、吸引手段１１の作動により、亜酸化窒素検知管８の空気取入口５から被検試料が亜酸化窒素検知管８内に通気する。通気管１０には流量計１２が介装されており、チャック９、通気管１０、吸引手段１１及び流量計１２等は、流量積算計やタイマー等（いずれも図示せず）と共に一つのアセンブリ機器１３として持ち運び可能にセットすることができる。吸引手段１１は、その排気が測定結果に影響を与えように対処してある機器であるのが好ましい。被検試料中の亜酸化窒素濃度に応じて、吸引する被検試料の量を適宜設定することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）の生産・精製
（１−１）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養には、以下の組成からなる培地を用いた。なお、この培地を嫌気条件下で保存及び使用した。
０．８％ ニュートリエント培地
０．５％ 酵母抽出物
３％ トリプチカーゼペプトン
１０ｍＭ コハク酸二ナトリウム
０．５％ リン酸水素二カリウム
０．０３５％ Ｌ−システイン
０．０００１％ レサズリン
０．０５％ チオグリコール酸ナトリウム
１μＭ 硫酸銅（ＩＩ）
０．０００５％ ヘミン
０．０００１％ ビタミンＫ１
１００ｍＭ ギ酸ナトリウム
１００ｍＭ 硝酸カリウム
【００４８】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２９５４３株を、上記培地２０ｍｌが入った密封バイアルに植菌し、嫌気条件下、３７℃で２５時間前培養した。増殖がＯＤ６６０＝０．４０程度のところで、この前培養液を０．８ｍｌずつ、嫌気条件下の栄養培地８０ｍｌが入った密封バイアル２５本に植菌し、３７℃で２６時間培養した。増殖がＯＤ６６０＝０．３以上において好気的に集菌し、菌体を洗浄した。２Ｌの培養液からＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ湿菌体２．１ｇが得られた。
【００４９】
（１−２）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の精製
得られた湿菌体２．１ｇを５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）７ｍｌで懸濁し、超音波破機を用いて破砕した。菌体破砕液を４℃、１００００×ｇ、３０分間の遠心分離を２回行い、さらに４℃、８６９００×ｇで６０分間、超遠心分離して上清を回収した。この上清を５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で一晩透析し、得られた透析溶液を水溶性画分とした。
【００５０】
水溶性画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、８８ｋＤａ付近にＮｏｓと考えられるバンドが観察された（図４）。そこで次に、陽イオン交換クロマトグラフィーによりＮｏｓの精製を試みた。
【００５１】
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、１ｍＬ）を５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した後、水溶性画分をカラムに吸着させ、５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）でカラム未吸着成分を洗浄除去した。次に、以下の条件で、カラム容量の２０倍量で溶出溶媒がＡ液１００％からＢ液１００％となるようなリニアグラジエントをかけてカラム吸着成分を溶出させ、０．５ｍLずつ分取し、溶出画分とした。
Ａ液：５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．４Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
移動相の流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２８０ｎｍ
【００５２】
陽イオン交換カラムに吸着した成分の溶出プロファイルを示すクロマトグラムを図５に示す。およそ２５％の０．４Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を流したところで、２８０ｎｍの吸光度の大きなピークが得られた（溶出画分２４及び２５）。これらの画分を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ったところ、８８ｋＤａ付近にＮｏｓと考えられるメインバンドが観察された（図６）。
【００５３】
（１−３）活性測定
水溶性画分及び溶出画分について、以下の方法により亜酸化窒素還元活性を測定した。密封しＡｒガスで置換した分光光度計用セルに、１０ｍＭ ベンジルビオロゲン１５μｌ、５ｍＭ 亜ジチオン酸ナトリウム１５μｌ、標準酵素溶液又は各画分３０μｌ、５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、及び、飽和Ｎ２Ｏ溶液（２５ｍＭ）２００μｌをガスタイトシリンジを用いてこの順に添加し、６００ｎｍにおけるベンジルビオロゲンの吸光度変化（△ＡＢＳ６００ｎｍ／ｍｉｎ）を測定した。ブランクとして、１０ｍＭ ベンジルビオロゲン１５μｌの代わりに等量の５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を添加した試料を用い、この試料により得られた吸光度変化をベースラインとした。
【００５４】
活性測定の結果を表１に示す。水溶性画分の比活性は０．３３Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、溶出画分２４及び２５を合わせた画分（粗精製画分）の比活性は４．９Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。以上より、溶出画分２４及び２５においてメインバンドとして検出される約８８ｋＤａのタンパク質が亜酸化窒素還元酵素であることが分かった。また、この亜酸化窒素還元酵素は酸素存在下においても安定であることが分かった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
実施例２：亜酸化窒素の測定
（２−１）
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤を用い、以下の手順で亜酸化窒素の測定を行った。亜酸化窒素還元酵素としては実施例１で調製したものを使用した。第一電子メディエータとしてフェナジンメトサルフェート、第二電子メディエータとして２、６−ジクロロフェノールインドフェノール、及び、還元剤としてアスコルビン酸を用いた。
【００５７】
活性試薬として、密閉してＡｒ置換したバイアル中で以下の組成物を混合したものを用時調製し、以下の実験に用いた。
＜試薬組成＞
６ｍＭ アスコルビン酸 １００μｌ
６ｍＭ ２、６−ジクロロフェノールインドフェノール １００μｌ
６ｍＭ フェナジンメトサルフェート １０μｌ
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） １２０μｌ
【００５８】
密封し、Ａｒ置換した分光セルに、活性試薬５０μｌ、酵素溶液２０μｌ、基質溶液８０μｌを加えて反応液全量を１５０μＬとし、６００ｎｍの吸光度を経時的に測定した。なお、酵素溶液として１５ｍｇタンパク質／ｍｌ（１．５Ｕ／ｍｇ）、基質溶液として、Ｎ２Ｏの段階希釈溶液を用いた。具体的には、ブランク（Ａｒバブリングした緩衝液）、２５ｍＭ Ｎ２Ｏ（Ｎ２Ｏを緩衝液にバブリングし飽和させたもの）、１２μＭ Ｎ２Ｏ（Ａｒバブリングした緩衝液１０ｍｌに、Ｎ２Ｏバブリングした緩衝液を５μｌ加えたもの）、２５０μＭ Ｎ２Ｏ（Ａｒバブリングした緩衝液１０ｍｌに、Ｎ２Ｏバブリングした緩衝液２５０μｌを加えたもの）を用いた。終濃度２．５ｍＭと１２ｍＭ Ｎ２Ｏについては、Ａｒバブリング溶液と２５ｍＭ Ｎ２Ｏ溶液を分光セルに加えて混合することで調製した。
【００５９】
基質としてＮ２Ｏを添加した際の、酸化型ＤＣＩＰの生成に基づく６００ｎｍの吸光度を測定し、その経時変化を図７に示した。また、亜酸化窒素濃度に対する６００ｎｍの吸光度の増加速度を図８に示した。６００ｎｍの吸光度の増加速度は２５ｍＭ（反応液中の濃度は１３．３ｍＭ）以下の範囲でＮ２Ｏ濃度依存的に増加した。したがって、この測定系によりＮ２Ｏを定量的に測定できることが確認できた。また、基質溶液のＮ２Ｏ濃度が０．１２ｍＭ、すなわち、反応液中のＮ２Ｏ濃度が６４μＭの条件においてもＮ２Ｏを検出できることが明らかとなった。
【００６０】
（２−２）
Ａｒ置換を行わず、空気存在下で密閉したバイアル及び分光セルを用いた以外は、実施例２−１と同様の手順で亜酸化窒素の測定を行った。その結果、亜酸化窒素濃度依存的にＤＣＩＰの発色反応が観察され、酸化型ＤＣＩＰの生成を検出できることが確認できた。したがって、半密閉系の装置（検知管等）において、空気存在下の亜酸化窒素を検出できることが確認できた。
【００６１】
以上の結果より、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤を用いることによって、亜酸化窒素を測定できることが確認できた。
【符号の説明】
【００６２】
１ ガラス管、２ 検知剤、３ 栓、４ 保護剤、５ 空気取入口、６ 排気口、７ 目盛り（検量線）、８ 亜酸化窒素検知管、９ チャック、１０ 通気管、１１ 吸引手段、１２ 流量計、１３ アセンブリ機器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）は、一酸化窒素（ＮＯ）や二酸化窒素（ＮＯ２）と同様に窒素酸化物の一種であるが、麻酔作用を有するため、吸入麻酔剤として医療現場で使用され、人体に対してはほとんど無害の気体である。
【０００３】
しかしながら、亜酸化窒素の温暖化係数は二酸化炭素の約３１０倍であり、京都議定書で指定された温室効果ガスに占める亜酸化窒素の割合は約１．９％と少ないものの、その地球温暖化への寄与率は高い。亜酸化窒素の主な発生源は農用地、化石燃料燃焼、家畜排泄物管理、廃棄物焼却場であるが、全体の約５０％は農業関係である（非特許文献１）。温暖化防止のためにその削減が求められているが、発生源が水田等の農耕地、家畜排泄物、肥料施肥等多岐にわたり、さらに簡便な測定技術がないために、適切な管理が困難な状況になっている。
【０００４】
亜酸化窒素の濃度は、フーリエ変換赤外分光計（ＦＴＩＲ)、非分散型赤外線分析法（ＮＤＩＲ）、及び、ガスクロマトグラフで測定するのが一般的である。亜酸化窒素は、発生源では比較的高濃度で存在するが、大気中の濃度は約３１４ｐｐｂと極めて希薄である。そのため、発生源付近での測定や低濃度の亜酸化窒素の測定を可能とする測定技術の開発が求められているが、溶液系での滴定による分析やガス検知管等の簡易・安価かつ迅速に定量する方法がないのが現状である。
【０００５】
近年では、デンマークの研究グループが、亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサを開発し、亜酸化窒素の濃度を測定できることを報告している（非特許文献２）。このセンサは、金電極を用いて、−１Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの還元電位で亜酸化窒素を計測するものである。
【０００６】
亜酸化窒素を基質とする酵素としては亜酸化窒素還元酵素（ＮＯＳ）が報告されている。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のＮＯＳが研究されている。初期の研究段階においてはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属を中心に論文が多く報告されている。近年、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓという細菌に由来する亜酸化窒素が報告されている（非特許文献３）。ＮＯＳの活性測定にはこれまで還元型メチルビオロゲン（ＭＶ）、還元型ベンジルビオロゲン（ＢＶ）等の色素が人工電子供与体として用いられ、亜酸化窒素の還元反応が解析されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本国温室効果ガスインベントリ報告書、温室効果ガスインベントリオフィス編、環境省地球環境局地球温暖化対策課監修、ＩＳＳＮ １３４１−４３５６、ＣＧＥＲ−Ｉ０８５−２００８
【非特許文献２】Ｎｉｅｌｓら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８年、５４巻、ｐ．２２４５−２２４９
【非特許文献３】Ｔｅｒａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｈｏｌｌｏｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９年、２６４巻、ｐ．１９７２−１９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記の非特許文献２に記載された亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサは、電極反応に選択性がなく、測定時に酸素が存在すると酸素に対しても同時に反応してしまうという問題点を有していた。また、これまでに亜酸化窒素のバイオセンサに関する報告はなかったため、亜酸化窒素の濃度を正確に測定するには、測定試料をサンプリングし、ガスクロマトグラフが設置してある測定室まで測定試料を持ち帰る必要があった。
【０００９】
亜酸化窒素を基質とする酵素を応用した亜酸化窒素の測定系の開発に際しては、人工電子供与体の安定性の観点から実用化が困難であった。すなわち、人工電子供与体として用いられている還元型のメチルビオロゲン（ＭＶ）及びベンジルビオロゲン（ＢＶ）は、酸化還元電位が−４００ｍＶ（ｖｓ．標準水素電極（ＳＨＥ））と低く、極めて還元力が強い。よって、これらの人工電子供与体は、大気中では即座に空気酸化されてしまうことから、嫌気状態での使用に限られ、大気中の亜酸化窒素の測定に適用することが事実上不可能であった。したがって、このような電子供与体を用いる亜酸化窒素の酵素分析法は汎用性がないことから、これまでＮＯＳを用いる溶液系での亜酸化窒素の分析方法や検知管等の分析方法に関する報告はなかった。
【００１０】
そこで本発明は、大型の分析装置を用いることなく、酸素存在下においても特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素が、従来の人工電子供与体よりも還元力の弱い電子供与体を電子メディエータ（第一電子メディエータ）として利用できることを見出した。さらに、本発明者は、第一電子メディエータへの電子供与体として、酸化型−還元型間で光学的特性が変化する第二電子メディエータを用いることにより、酸素存在下においても安定な酸化型の第二電子メディエータを指標として亜酸化窒素の濃度を測定することに成功した。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、
上記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、上記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程と、
を備え、
上記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
上記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
上記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定方法を提供する。
【００１３】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、酸素耐性が非常に高く、空気中に放置しても酵素活性が消失しない。また、第一電子メディエータとして、従来の人工電子供与体よりも還元力の弱いものを採用することが可能となり、よって、分析中に還元型の人工電子供与体が空気中の酸素により酸化されてしまうという酸素感受性をより低減することができる。さらに第一電子メディエータを還元するための還元型の第二電子メディエータは、酸素存在下においても安定であるため、安定した測定が可能となる。したがって、上記亜酸化窒素の測定方法によれば、酸素存在下でも、特異的かつ高感度に亜酸化窒素を測定することができる。
【００１４】
本発明は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥである第一電子メディエータと、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元される第二電子メディエータと、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤と、を備える、亜酸化窒素の測定キットを提供する。
【００１５】
また、本発明は、
所定量の被検試料を取り入れる手段と、
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる手段と、
上記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、上記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する手段と、
を備え、
上記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
上記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
上記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定装置を提供する。
【００１６】
上記亜酸化窒素の測定方法、測定キット又は測定装置に用いる第一電子メディエータは、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）、トルイレンブルー、チオニン、フェナジンエトサルフェート、ナフトキノン等であることが好ましい。
【００１７】
上記亜酸化窒素の測定方法、測定キット又は測定装置に用いる第二電子メディエータは、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、ｏ−クレゾールインド−２，６−ジクロロフェノール、２，３’，６−トリクロロインドフェノール等のインドフェノール化合物、フェノールブルー等であることが好ましい。
【００１８】
上記亜酸化窒素の測定方法、測定キット又は測定装置に用いる還元剤は、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤であり、アスコルビン酸であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置によれば、大型の分析装置を用いることなく、酸素存在下においても特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる。本発明の亜酸化窒素の測定装置によれば、安定性と耐久性とを備えた小型測定装置の構築が可能となる。したがって、大型の分析装置を用いる必要がなく、野外においてもリアルタイムで亜酸化窒素の濃度の測定が可能な、簡易・安価かつ迅速に亜酸化窒素を測定できる亜酸化窒素の測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の亜酸化窒素測定の原理を説明する反応式。
【図２】本発明の一実施形態に係る亜酸化窒素測定装置を示す略断面図。
【図３】本発明の一実施形態に係る亜酸化窒素測定装置を示す略断面図。
【図４】水溶性画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図５】陽イオン交換カラムに吸着した成分の溶出プロファイルを示すクロマトグラム。図中、ＵＶは溶出溶液の２８０ｎｍ吸光度、Ｃｏｎｃは溶出溶媒中のＢ液の割合（％、計算値）、ＣｏｎｄはＢ液の電気伝導度を１００％としたときの相対電気伝導度（％）、数字１〜３７は各溶出画分の番号をそれぞれ示す。
【図６】溶出画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図７】亜酸化窒素の還元反応に伴う吸光度６００ｎｍの経時変化を示すグラフ。
【図８】亜酸化窒素の測定結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
（亜酸化窒素の測定原理）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定方法、測定キット及び測定装置は、
（１）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、
（２）酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥである第一電子メディエータと、
（３）第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元される第二電子メディエータと、
（４）第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤と、を用いることを特徴とする。以下に、亜酸化窒素の測定原理について説明する。
【００２３】
図１は、本発明の一実施形態に係る亜酸化窒素測定の原理を説明する反応式である。第一電子メディエータ及び第二電子メディエータとして、それぞれフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた実施形態において、図１に示す反応の通り、ＮＯＳによる亜酸化窒素の還元反応によって、無色の還元型ＤＣＩＰから青色の酸化型ＤＣＩＰが生成する。このＤＣＩＰの発色変化を指標として亜酸化窒素を測定することができる。
【００２４】
従来行われている亜酸化窒素を還元する酵素の活性測定では、電子供与体として還元型メチルビオロゲン（ＭＶ）、還元型ベンジルビオロゲン（ＢＶ）等の酸化還元電位−４００ｍＶ（ｖｓ．ＳＨＥ）程度の極めて還元力の高い電子供与体が実験に用いられている。還元型ＭＶや還元型ＢＶを電子供与体として用いることにより、これらの色素の発色変化を指標として、酵素活性又は基質である亜酸化窒素を計測することができる。しかしながら、還元型のＭＶ及びＢＶは大変不安定であり、空気雰囲気下では即座に酸化されることから、嫌気状態での使用に限られ、大気中の亜酸化窒素の測定に適用することが事実上不可能であった。このように、ＮＯＳの人工電子供与体として従来知られているＭＶ又はＢＶを用いる亜酸化窒素計測方法は実用化されていない。
【００２５】
一方、酵素の酸化反応又は脱水素酵素反応の電子受容体として、ＰＭＳ及びＤＣＩＰが用いられている。この反応において、ＰＭＳが酸化酵素又は脱水素酵素反応の第一電子受容体として機能し、さらに第二電子受容体であるＤＣＩＰに電子を伝達する。このＰＭＳを介した電子伝達反応により、青色の酸化型ＤＣＩＰから無色の還元型ＤＣＩＰが生成し、この発色変化を指標として酵素反応速度を評価できる。この原理に基づき、酸化酵素又は脱水素酵素の基質濃度を定量できる。ＰＭＳ及びＤＣＩＰが酸化反応及び脱水素酵素反応の吸光計測に用いることができる理由としては、ＰＭＳが酵素反応の電子受容体として機能し得ること、さらに生成される還元型のＤＣＩＰが大気中で自動酸化を受けず安定であることが挙げられる。
【００２６】
しかしながら、酸化酵素又は脱水素酵素の電子受容体として用いられている電子メディエータが亜酸化窒素還元酵素の電子供与体として機能することは、これまでに報告されていない。その理由としては、ＭＶ及びＢＶの酸化還元電位（約−４００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）に対して、ＰＭＳ及びＤＣＩＰの酸化還元電位（それぞれ＋８０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ及び＋２１７ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）が高いことが挙げられる。つまり、酸化酵素又は脱水素酵素の電子受容体として用いられている電子メディエータは、ＭＶ及びＢＶよりも還元力が低く、亜酸化窒素を還元するためのエネルギーが不足しているためと考えられる。
【００２７】
（亜酸化窒素の測定方法）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定方法について説明する。
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定方法は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程と、を備え、第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である。
【００２８】
（亜酸化窒素還元酵素）
本発明で使用されるＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、亜酸化窒素を還元する活性を有し、ＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した分子量が約８８±２．０ｋＤａであることが好ましい。上記亜酸化窒素還元酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する亜酸化窒素還元酵素である。本発明の亜酸化窒素還元酵素の具体例としては、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭＺ１７４０株が保有する配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する亜酸化窒素還元酵素を例示できる。配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２９】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓは、ルーメン細菌の一種であり、複数の公的機関から入手可能である。例えば、ドイツのＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）や米国のＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から容易に入手できる。
【００３０】
上記の亜酸化窒素還元酵素は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを培養し、増殖したＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ菌体又は培養中から、酵素活性を指標に精製できる。
【００３１】
具体的には、液体培地にＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを植菌し、培養中は常に亜酸化窒素を通気しながら、嫌気的条件下、３７℃で培養すればよい。Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養に用いる液体培地としては、例えば、酵母抽出物、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸銅、チオグリコール酸を含み、ｐＨを中性付近に調整した培地が挙げられる。また、上記液体培地に、ニュートリエント培地成分、トリプチカーゼペプトン、ビタミンＫ１、ヘミン等を加えた栄養培地にＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを植菌し、嫌気的条件下、３７℃で培養してもよい。
【００３２】
亜酸化窒素還元酵素の精製は、培養したＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの菌体から、当業者であれば公知である常法のタンパク質の精製方法に従って行うことができる。例えば、培養したＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの菌体をフレンチプレス又は超音波破砕器等で破砕し、遠心分離して得られた上清（亜酸化窒素還元酵素を含む粗酵素溶液）を、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の精製手段で分画することにより、単一酵素として精製できる。
【００３３】
こうして調製されたＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、同酵素の亜酸化窒素還元活性に基づき、電子供与体として還元型第一電子メディエータ及び還元型第二電子メディエータの存在下において、同酵素の基質である亜酸化窒素を還元させ、還元型第二電子メディエータの減少又は酸化型第二電子メディエータの増加量を指標として亜酸化窒素の濃度を測定することを可能にするものである。
【００３４】
本発明の測定に用いる亜酸化窒素還元酵素は、溶液中に溶解されていても、固相に固定化されていても良い。
【００３５】
（第一電子メディエータ）
本発明における第一電子メディエータは、上記亜酸化窒素還元酵素の亜酸化窒素還元活性に基づき、亜酸化窒素を還元する電子供与体として機能する電子メディエータである。第一電子メディエータの酸化還元電位（標準水素電極；ＳＨＥ）は、＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることが好ましく、＋３０ｍＶ〜＋１２０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることがより好ましく、＋６０ｍＶ〜＋９０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ（例えば、＋８０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ程度）であることが特に好ましい。そのような第一メディエータとして、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ、酸化還元電位：＋８０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ、＋６３ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、トルイレンブルー（＋１１５ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、チオニン（＋６４ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、フェナジンエトサルフェート（＋５５ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、ナフトキノン（＋３６ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）等が好ましく、特に、ＰＭＳが好ましい。
【００３６】
（第二電子メディエータ）
本発明における第二メディエータは、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で光学的特性が変化する電子メディエータである。第二メディエータの酸化還元電位（標準水素電極；ＳＨＥ）は、第一電子メディエータよりも１００ｍＶ〜２００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ高いことが好ましく、＋１００ｍＶ〜＋３５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることが好ましく、＋１５０ｍＶ〜＋３００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであることがより好ましく、＋１８０ｍＶ〜＋２４０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ（例えば、＋２００ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ程度）であることが特に好ましい。酸化型−還元型間での光学的特性の変化としては、吸光測定、比色分析、蛍光法等の測定系で検出可能な変化であれば良い。そのような第二メディエータとして、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ、＋２１７ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、ｏ−クレゾールインド−２，６−ジクロロフェノール（＋１８１ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥ）、２，３’，６−トリクロロインドフェノール等のインドフェノール化合物、フェノールブルーが例示できる。特に、ＤＣＩＰが好ましい。
【００３７】
（還元剤）
本発明における還元剤は、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である。そのような還元剤として、自らの酸化体が加水分解される化合物が挙げられ、特に、アスコルビン酸が好ましい。アスコルビン酸は、酸化されるとジヒドロアスコルビン酸となり、次いで加水分解により酸化還元性のない２，３−ジケトグロン酸が生成される。
【００３８】
（被検試料）
被検試料は、亜酸化窒素が含まれる疑いのある試料であり、具体的な形態は特に制限されず、亜酸化窒素を含む溶液が適宜用いられる。また、亜酸化窒素を含む気体（例えば大気）を試料とする場合には、亜酸化窒素を溶解可能な緩衝液等に試料を通気し、溶液試料とするか、又は、亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤を含む反応試薬に直接、亜酸化窒素を溶解させることにより測定することができる。
【００３９】
（亜酸化窒素の測定キット）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定キットは、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、還元剤とを備える。Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤としては、上述のものを使用することができる。
【００４０】
（亜酸化窒素の測定装置）
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定装置について詳細に説明する。
本実施形態に係る亜酸化窒素の測定装置は、所定量の被検試料を取り入れる手段と、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる手段と、第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する手段と、を備え、第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、第二電子メディエータが、酸化型及び還元型の変化により発色が変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である。
【００４１】
図２に本発明の亜酸化窒素の測定装置の一実施形態である亜酸化窒素検知管を示す。本実施形態に係る亜酸化窒素検知管は、被検試料として空気等の気体を取り込むことにより、気体中の亜酸化窒素を測定する。この形態では、透明のガラス管１の内部に検知剤２が装填してある。ガラス管１は例えば、全長１３０ｍｍで内径はφ４ｍｍのものを使用できる。このガラス管１内において、検知剤２が、二つの気体透過性の栓３ａと３ｂによって位置決められている。検知剤２と各栓３ａ及び３ｂの間には、それぞれ非反応性の保護剤４ａと４ｂが介装され、これらの保護剤４ａと４ｂの間に、検知剤２が一定の長さＬをもって装填されている。そして、この長さＬにわたって、その管の長さ方向に目盛り７が付されている。
【００４２】
管１の両端は溶封してあるが、使用時に開口し、その一端は空気取入口５として、他端は排気口６として用いられる。前記のように、検知剤２は、空気取入口５から排気口６の方向に一定の長さＬをもって装填され、空気取入口５の側から被検試料が導入されると、被検試料中の微量の亜酸化窒素が検知剤２の試薬と反応し、その反応に消費された分の長さだけ、空気取入口５に近い方から変色することになる。
【００４３】
検知剤２は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ及び第二電子メディエータを含む。検知剤２は測定開始直前に、第二電子メディエータを還元するための還元剤を含む溶液と混合され、第二電子メディエータが還元されて測定可能な状態となる。
【００４４】
測定にさいしては、検知管８内に装填された検知剤２に対し、通過する被検試料中の亜酸化窒素の実質的に全てが第一電子メディエータ及び第二電子メディエータと反応して変色を起こし、しかもその変色が、検知剤２の長さ方向に（空気の入側から出側の方向に）、通気量に対応して順序よく起きることが必要である。そして、測定時間中において検知剤２に対して被検試料がまんべんなく検知剤２と接触しつつ流れることが肝要である。すなわち、空気の入側近くに存在する検知剤２が変色せずに、それより下流側に存在する検知剤２が先に変色したり、被検試料中の亜酸化窒素が反応せずに検知剤２を通過したりすると、変色長さで亜酸化窒素濃度を定量することが出来なくなるので、このような現象が起きないように適宜設定する必要がある。
【００４５】
図３は、図２の亜酸化窒素検知管８の排気口６をチャック９に固定し、このチャック９から通気管１０を介して吸引ポンプ等の吸引手段１１に連結した状態を示しており、吸引手段１１の作動により、亜酸化窒素検知管８の空気取入口５から被検試料が亜酸化窒素検知管８内に通気する。通気管１０には流量計１２が介装されており、チャック９、通気管１０、吸引手段１１及び流量計１２等は、流量積算計やタイマー等（いずれも図示せず）と共に一つのアセンブリ機器１３として持ち運び可能にセットすることができる。吸引手段１１は、その排気が測定結果に影響を与えように対処してある機器であるのが好ましい。被検試料中の亜酸化窒素濃度に応じて、吸引する被検試料の量を適宜設定することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）の生産・精製
（１−１）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養には、以下の組成からなる培地を用いた。なお、この培地を嫌気条件下で保存及び使用した。
０．８％ ニュートリエント培地
０．５％ 酵母抽出物
３％ トリプチカーゼペプトン
１０ｍＭ コハク酸二ナトリウム
０．５％ リン酸水素二カリウム
０．０３５％ Ｌ−システイン
０．０００１％ レサズリン
０．０５％ チオグリコール酸ナトリウム
１μＭ 硫酸銅（ＩＩ）
０．０００５％ ヘミン
０．０００１％ ビタミンＫ１
１００ｍＭ ギ酸ナトリウム
１００ｍＭ 硝酸カリウム
【００４８】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２９５４３株を、上記培地２０ｍｌが入った密封バイアルに植菌し、嫌気条件下、３７℃で２５時間前培養した。増殖がＯＤ６６０＝０．４０程度のところで、この前培養液を０．８ｍｌずつ、嫌気条件下の栄養培地８０ｍｌが入った密封バイアル２５本に植菌し、３７℃で２６時間培養した。増殖がＯＤ６６０＝０．３以上において好気的に集菌し、菌体を洗浄した。２Ｌの培養液からＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ湿菌体２．１ｇが得られた。
【００４９】
（１−２）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の精製
得られた湿菌体２．１ｇを５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）７ｍｌで懸濁し、超音波破機を用いて破砕した。菌体破砕液を４℃、１００００×ｇ、３０分間の遠心分離を２回行い、さらに４℃、８６９００×ｇで６０分間、超遠心分離して上清を回収した。この上清を５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で一晩透析し、得られた透析溶液を水溶性画分とした。
【００５０】
水溶性画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、８８ｋＤａ付近にＮｏｓと考えられるバンドが観察された（図４）。そこで次に、陽イオン交換クロマトグラフィーによりＮｏｓの精製を試みた。
【００５１】
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、１ｍＬ）を５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した後、水溶性画分をカラムに吸着させ、５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）でカラム未吸着成分を洗浄除去した。次に、以下の条件で、カラム容量の２０倍量で溶出溶媒がＡ液１００％からＢ液１００％となるようなリニアグラジエントをかけてカラム吸着成分を溶出させ、０．５ｍLずつ分取し、溶出画分とした。
Ａ液：５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．４Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
移動相の流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２８０ｎｍ
【００５２】
陽イオン交換カラムに吸着した成分の溶出プロファイルを示すクロマトグラムを図５に示す。およそ２５％の０．４Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を流したところで、２８０ｎｍの吸光度の大きなピークが得られた（溶出画分２４及び２５）。これらの画分を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ったところ、８８ｋＤａ付近にＮｏｓと考えられるメインバンドが観察された（図６）。
【００５３】
（１−３）活性測定
水溶性画分及び溶出画分について、以下の方法により亜酸化窒素還元活性を測定した。密封しＡｒガスで置換した分光光度計用セルに、１０ｍＭ ベンジルビオロゲン１５μｌ、５ｍＭ 亜ジチオン酸ナトリウム１５μｌ、標準酵素溶液又は各画分３０μｌ、５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、及び、飽和Ｎ２Ｏ溶液（２５ｍＭ）２００μｌをガスタイトシリンジを用いてこの順に添加し、６００ｎｍにおけるベンジルビオロゲンの吸光度変化（△ＡＢＳ６００ｎｍ／ｍｉｎ）を測定した。ブランクとして、１０ｍＭ ベンジルビオロゲン１５μｌの代わりに等量の５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を添加した試料を用い、この試料により得られた吸光度変化をベースラインとした。
【００５４】
活性測定の結果を表１に示す。水溶性画分の比活性は０．３３Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、溶出画分２４及び２５を合わせた画分（粗精製画分）の比活性は４．９Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。以上より、溶出画分２４及び２５においてメインバンドとして検出される約８８ｋＤａのタンパク質が亜酸化窒素還元酵素であることが分かった。また、この亜酸化窒素還元酵素は酸素存在下においても安定であることが分かった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
実施例２：亜酸化窒素の測定
（２−１）
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤を用い、以下の手順で亜酸化窒素の測定を行った。亜酸化窒素還元酵素としては実施例１で調製したものを使用した。第一電子メディエータとしてフェナジンメトサルフェート、第二電子メディエータとして２、６−ジクロロフェノールインドフェノール、及び、還元剤としてアスコルビン酸を用いた。
【００５７】
活性試薬として、密閉してＡｒ置換したバイアル中で以下の組成物を混合したものを用時調製し、以下の実験に用いた。
＜試薬組成＞
６ｍＭ アスコルビン酸 １００μｌ
６ｍＭ ２、６−ジクロロフェノールインドフェノール １００μｌ
６ｍＭ フェナジンメトサルフェート １０μｌ
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） １２０μｌ
【００５８】
密封し、Ａｒ置換した分光セルに、活性試薬５０μｌ、酵素溶液２０μｌ、基質溶液８０μｌを加えて反応液全量を１５０μＬとし、６００ｎｍの吸光度を経時的に測定した。なお、酵素溶液として１５ｍｇタンパク質／ｍｌ（１．５Ｕ／ｍｇ）、基質溶液として、Ｎ２Ｏの段階希釈溶液を用いた。具体的には、ブランク（Ａｒバブリングした緩衝液）、２５ｍＭ Ｎ２Ｏ（Ｎ２Ｏを緩衝液にバブリングし飽和させたもの）、１２μＭ Ｎ２Ｏ（Ａｒバブリングした緩衝液１０ｍｌに、Ｎ２Ｏバブリングした緩衝液を５μｌ加えたもの）、２５０μＭ Ｎ２Ｏ（Ａｒバブリングした緩衝液１０ｍｌに、Ｎ２Ｏバブリングした緩衝液２５０μｌを加えたもの）を用いた。終濃度２．５ｍＭと１２ｍＭ Ｎ２Ｏについては、Ａｒバブリング溶液と２５ｍＭ Ｎ２Ｏ溶液を分光セルに加えて混合することで調製した。
【００５９】
基質としてＮ２Ｏを添加した際の、酸化型ＤＣＩＰの生成に基づく６００ｎｍの吸光度を測定し、その経時変化を図７に示した。また、亜酸化窒素濃度に対する６００ｎｍの吸光度の増加速度を図８に示した。６００ｎｍの吸光度の増加速度は２５ｍＭ（反応液中の濃度は１３．３ｍＭ）以下の範囲でＮ２Ｏ濃度依存的に増加した。したがって、この測定系によりＮ２Ｏを定量的に測定できることが確認できた。また、基質溶液のＮ２Ｏ濃度が０．１２ｍＭ、すなわち、反応液中のＮ２Ｏ濃度が６４μＭの条件においてもＮ２Ｏを検出できることが明らかとなった。
【００６０】
（２−２）
Ａｒ置換を行わず、空気存在下で密閉したバイアル及び分光セルを用いた以外は、実施例２−１と同様の手順で亜酸化窒素の測定を行った。その結果、亜酸化窒素濃度依存的にＤＣＩＰの発色反応が観察され、酸化型ＤＣＩＰの生成を検出できることが確認できた。したがって、半密閉系の装置（検知管等）において、空気存在下の亜酸化窒素を検出できることが確認できた。
【００６１】
以上の結果より、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素、第一電子メディエータ、第二電子メディエータ及び還元剤を用いることによって、亜酸化窒素を測定できることが確認できた。
【符号の説明】
【００６２】
１ ガラス管、２ 検知剤、３ 栓、４ 保護剤、５ 空気取入口、６ 排気口、７ 目盛り（検量線）、８ 亜酸化窒素検知管、９ チャック、１０ 通気管、１１ 吸引手段、１２ 流量計、１３ アセンブリ機器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、
前記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、前記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程と、
を備え、
前記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
前記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
前記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定方法。
【請求項２】
前記第一電子メディエータが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、トルイレンブルー、チオニン、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）、フェナジンエトサルフェート、及び、ナフトキノンからなる群より選ばれる一つの電子メディエータである、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記第二電子メディエータが、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、ｏ−クレゾールインド−２，６−ジクロロフェノール、２，３’，６−トリクロロインドフェノール等のインドフェノール化合物、及び、フェノールブルーからなる群より選ばれる一つの電子メディエータである、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記還元剤が、アスコルビン酸である、請求項１〜３いずれか一項に記載の測定方法。
【請求項５】
ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素と、
酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥである第一電子メディエータと、
第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元される第二電子メディエータと、
第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤と、を備える、
亜酸化窒素の測定キット。
【請求項６】
所定量の被検試料を取り入れる手段と、
ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる手段と、
前記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、前記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する手段と、
を備え、
前記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
前記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
前記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定装置。
【請求項１】
ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる工程と、
前記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、前記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する工程と、
を備え、
前記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
前記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
前記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定方法。
【請求項２】
前記第一電子メディエータが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、トルイレンブルー、チオニン、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）、フェナジンエトサルフェート、及び、ナフトキノンからなる群より選ばれる一つの電子メディエータである、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記第二電子メディエータが、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、ｏ−クレゾールインド−２，６−ジクロロフェノール、２，３’，６−トリクロロインドフェノール等のインドフェノール化合物、及び、フェノールブルーからなる群より選ばれる一つの電子メディエータである、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記還元剤が、アスコルビン酸である、請求項１〜３いずれか一項に記載の測定方法。
【請求項５】
ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素と、
酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥである第一電子メディエータと、
第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元される第二電子メディエータと、
第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤と、を備える、
亜酸化窒素の測定キット。
【請求項６】
所定量の被検試料を取り入れる手段と、
ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来の亜酸化窒素還元酵素の存在下において、第一電子メディエータと、第二電子メディエータと、被検試料中の亜酸化窒素とを反応させる手段と、
前記第二電子メディエータの還元型から酸化型への変化に伴う発色変化を指標として、前記被検試料中の亜酸化窒素濃度を測定する手段と、
を備え、
前記第一電子メディエータの酸化還元電位が＋０ｍＶ〜＋１５０ｍＶ ｖｓ．ＳＨＥであり、
前記第二電子メディエータが、第一電子メディエータへの電子供与体として機能し、酸化型−還元型間で発色変化する電子メディエータであり、かつ、測定開始直前に還元剤によって還元され、
前記還元剤が、第二電子メディエータを還元する活性を有し、かつ、自らの酸化体が可逆的に還元されない還元剤である、
亜酸化窒素の測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図４】
【図６】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図４】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２０７１６４（Ｐ２０１０−２０７１６４Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５８５０２（Ｐ２００９−５８５０２）
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【出願人】（０００００１３７３）鹿島建設株式会社 (1,387)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【出願人】（０００００１３７３）鹿島建設株式会社 (1,387)
【Ｆターム（参考）】
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