人工テンプレートおよび単一プライマー増幅におけるその使用
【課題】抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法を提供すること。
【解決手段】上記方法は、ａ）抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートにプライマーをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；ｂ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；ならびにｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程などを包含する。
【解決手段】上記方法は、ａ）抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートにプライマーをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；ｂ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；ならびにｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程などを包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本国際出願は、２００３年１２月１５日に出願された米国出願第１０／７３７，２５２号（これは、２００１年９月１９日に出願された米国仮出願第６０／３２３，４５５号に対する優先権を主張する、２００２年９月１９日に出願された米国出願第１０／２５１，０８５号の一部継続出願である）に対する優先権を主張する。上述の米国出願および米国仮出願の開示全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、標的核酸配列の増幅のために有用な人工テンプレート（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）に関連する。さらに具体的には、その反対端に相補的な配列を含むように操作されたテンプレートが、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）オリゴヌクレオチド伸長反応（ＮＯＥＲ）によって提供される。上記人工テンプレートは、この人工テンプレート内の標的配列を増幅するための単一プライマー増幅（ＳＰＡ）を可能にする。特に有用な実施形態において、上記人工テンプレート由来の標的配列は、発現ビヒクル中にクローニングされて、例えば、抗体ライブラリーのような、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
（関連分野の背景）
核酸増幅および増幅生成物の検出のための方法は、核酸配列の検出、同定、定量および配列分析を支援する。核酸増幅は、例えば、抗体のような、関連する遺伝子ライブラリーの構築において重要な工程である。これらのライブラリーは、特異的であり所望する活性を有する抗体に関して、スクリーニングされ得る。核酸分析は、病原体の検出および同定、規定の表現型を引き起こす遺伝子変化の検出、遺伝病（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）または疾患に対する感受性の診断、発達、疾患および規定の刺激の応答における遺伝子発現の評価、ならびに種々のゲノム計画のために重要である。核酸増幅方法の他の適用としては、稀な細胞の検出、病原体の検出、および悪性疾患における改変された遺伝子発現の検出などが挙げられる。核酸増幅はまた、（例えば、規定の核酸配列の存在の検出のような）定性分析、および（例えば、病原性配列の量の評価、ならびに遺伝子増殖または遺伝子欠失の判定、および正常細胞型から悪性細胞型への細胞形質転換の判定などにおいて有用な）規定の遺伝子配列の定量化のために有用である。核酸配列中の配列変化の検出は、変異遺伝子型の検出、遺伝子分析に関連することとして、薬物耐性を引き起こす変異の検出、薬理ゲノム科学などのために重要である。
【０００４】
多くの種類の核酸増幅（例えば、指数関数的増幅、結合線形増幅（ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ライゲーションベースの増幅、および転写ベースの増幅）が存在する。指数関数的核酸増幅方法の一例は、多数の刊行物において開示される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。例えば、非特許文献１；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．特許文献１；Ｍｕｌｌｉｓら、特許文献２；Ｅｒｌｉｃｈら、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６；およびＳａｉｋｉ Ｒ．ら、特許文献７を参照のこと。実際に、このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、最も一般に使用される標的増幅方法である。ＰＣＲは、多数の標的配列の複数の二重鎖複製物を生成するために、多サイクルの、変性、２種の異なるオリゴヌクレオチドプライマーの（各々、標的鎖の対向する鎖への）ハイブリダイゼーション、およびヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長に基づく。
【０００５】
単一のプライマーを利用した複製方法もまた、開示されている。例えば、特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；および特許文献１２を参照のこと。このプライマーは、特許文献１３において開示されるようなＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーであり得る。
【０００６】
いくつかの増幅方法は、テンプレート転換オリゴヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＴＳＯ）およびブロッキングオリゴヌクレオチド（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用する。例えば、キメラＤＮＡプライマーが利用されたテンプレート転換増幅は、特許文献１２；特許文献１４；特許文献１５において、かつ非特許文献２によって開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第２０１，１８４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５８２，７８８号明細書
【特許文献３】欧州特許第５０，４２４号明細書
【特許文献４】欧州特許第８４，７９６号明細書
【特許文献５】欧州特許第２５８，０１７号明細書
【特許文献６】欧州特許第２３７，３６２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，６８３，１９４号明細書
【特許文献８】米国特許第５，５０８，１７８号明細書
【特許文献９】米国特許第５，５９５，８９１号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６８３，８７９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１３０，２３８号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６７９，５１２号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，７４４，３０８号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９６２，２７２号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，２５１，６３９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．１９８６年、第５１巻：２６３−２７３頁
【非特許文献２】Ｐａｔｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６年、第９３巻：２９６９−２９７４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、既に記載した標的増幅方法は、いくつかの欠点を有する。例えば、転写ベースの増幅方法（例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ））は、プライマーによる増幅生成物の中へのポリメラーゼプロモーター配列の組み込みに対する必要性によって制限され、結果として、この方法は非特異的増幅となる傾向がある。現在の増幅方法の欠点の別の例は、異なる温度で最適な結合を有し得る２回の結合現象の必要性、ならびに天然に存在する配列を含むプライマーの使用である。この要因の組み合わせの結果、ミスプライミング（ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）の可能性が生じ、そして結果として標的配列以外の配列の増幅が生じる。
【００１０】
したがって、これらの欠点を克服する核酸増幅方法に対する必要性が存在する。本明細書中で提供される本発明は、この必要性を満たし、そしてさらなる利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
核酸増幅の新しい方法が、ここ発明され、この方法は、以下の工程：
ａ）テンプレート核酸配列にプライマーをアニーリングする工程であって、このプライマーは、テンプレートにアニーリングする第１の部分および所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）上記プライマーの第１の部分が上記テンプレートにアニーリングする位置と上記テンプレートの末端との間のテンプレートの部分にアニーリングし、かつ相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは第１の末端および第２の末端を有し、ここで、その第１の末端は上記プライマーを組み込む、工程；
ｃ）上記テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドの第２の末端に、ネステッドオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このネステッドオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの第２の末端にアニーリングする第１の部分およびプライマーの第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、上記所定の配列に相補的なこのポリヌクレオチドの末端部分を提供する、工程；ならびに
ｆ）所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する。
【００１２】
代替的な実施形態において、上記方法は、以下の工程：
ａ）テンプレート核酸配列に、プライマーおよび境界（ｂｏｕｎｄａｒｙ）オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このプライマーは、上記テンプレートにアニーリングする第１の部分および所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）上記プライマーの第１の部分がテンプレートにアニーリングする位置と上記境界オリゴヌクレオチドがアニーリングするテンプレートの部分との間のテンプレートの部分にアニーリングし、そしてそれに相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは第１の末端および第２の末端を有し、ここで、この第１の末端はプライマーを組み込む、工程；
ｃ）上記テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドの第２の末端に、ネステッドオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このネステッドオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの第２の末端にアニーリングする第１の部分および上記プライマーの第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する、工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、上記所定の配列に相補的であるポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；ならびに
ｆ）上記所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する。
【００１３】
また、その第１の末端に所定の配列を有し、そしてその他方の末端に、この所定の配列と相補的な配列を有する人工核酸鎖が、それ自身本開示の新しい局面であることが企図される。
【００１４】
別の局面において、本開示は、核酸鎖を増幅する新しい方法を提供し、この方法は、その第１の末端に所定の配列を有し、そしてその他方の末端に、この所定の配列に相補的な配列を有する人工核酸鎖を提供する工程；およびポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下において、このヌクレオチドの重合のために適切な条件下で、上記人工核酸鎖と所定の配列を有するプライマーとを接触させる工程を包含する。
【００１５】
本明細書中に記載される増幅プロセスおよび人工テンプレートは、適切な発現ベクター中にライゲーションされ得る増幅生成物を調製するために使用され得る。次いで、このベクターは、標的配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を生成するために、標準的方法を使用して適切な宿主生物を形質転換するために使用され得る。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、例えば、抗体ライブラリーのような複雑なライブラリーを構築するための、関連する配列のファミリーを増幅するために使用される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートにプライマーをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；
ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの該第２の末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第２の末端にアニーリングする第１の部分および該プライマーの該第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する、工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；および
ｆ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、以下：
【化１】
からなる群より選択される配列を含む少なくとも１つのプライマーをアニーリングする工程を包含し、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである、方法。
（項目３）
項目１に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、ＩｇＡ抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする工程を包含する、方法。
（項目４）
抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートに、プライマーおよび境界オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該境界オリゴヌクレオチドがアニーリングする該テンプレートの部分との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；
ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの該第２の末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第２の末端にアニーリングする第１の部分および該プライマーの該第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的である該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する、工程；
ｆ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程
を包含する、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、以下：
【化２】
【化３】
からなる群より選択される配列を含む少なくとも１つのプライマーをアニーリングする工程を包含し、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである、方法。
（項目６）
項目４に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、ＩｇＡ抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする工程を包含する、方法。
（項目７）
抗体ライブラリーを作製する方法であって、以下の工程：
ａ）ＩｇＡ抗体の少なくとも一部分をコードする、多種多様なテンプレートの集団を提供する工程；
ｂ）該多種多様なテンプレートの集団と少なくとも１つのプライマーとを接触させる工程であって、該少なくとも１つのプライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｃ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的である、ポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；
ｄ）該テンプレートから、工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
ｅ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドの該第２の末端に、少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第２の末端にアニーリングする第１の部分および該プライマー該第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する、工程；
ｆ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的である該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；および
ｇ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、以下：
【化４】
【化５】
からなる群より選択される配列を含む少なくとも１つのプライマーをアニーリングする工程を包含し、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである、方法。
（項目９）
項目７に記載の方法に従って調製された、ＩｇＡ抗体のライブラリー。
（項目１０）
所望の結合特異性を有する抗体を同定する方法であって、以下の工程：
項目７に記載の方法に従ってＩｇＡ抗体のライブラリーを調製する工程；および
該ライブラリーをスクリーニングして、所望の結合特異性を有する１つ以上のＩｇＡ抗体を同定する工程
を包含する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法に従って同定した、ＩｇＡ抗体。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】テンプレートにアニーリングした、プライマーおよび境界オリゴの概略図。
【図２Ａ】核酸鎖にアニーリングした、制限オリゴの概略図。
【図２Ｂ】短縮された５’末端を有するテンプレートにアニーリングした、プライマーの概略図。
【図３】代替の実施形態の概略図であって、ここで、複数ラウンドの重合が実施され、そして、制限オリゴヌクレオチドは、原テンプレートではなく新規に合成された鎖にアニールする。
【図４】新規に合成された核酸鎖にアニーリングした、ネステッドオリゴの概略図。
【図５】本開示に基づいた、人工テンプレートの概略図。
【図６】人工テンプレートの単一プライマー増幅の概略図。
【図７】ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔと名づけられたネステッドオリゴの配列を示す。
【図８ａ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｂ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｃ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｄ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｅ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ａ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ｂ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ｃ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ｄ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示は、標的核酸配列を増幅する方法を提供する。特に有用な実施形態において、上記標的核酸配列は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子である。本開示はまた、どのように増幅生成物をクローニングし、かつ適切な発現系において発現させ得るかを記載する。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、例えば、抗体ライブラリーのような複雑なライブラリーを構築するための、関連する配列のファミリーを増幅するために使用される。
【００１８】
上記標的核酸配列は、単一のプライマーのみを含むプロセスを介して指数関数的に増幅される。単一のプライマーを利用する（すなわち、各々異なった配列を有する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を使用する必要性が無い）能力は、増幅されるべき標的配列を含む核酸の鎖を操作することによって達成される。操作された核酸の鎖（本明細書中において、時折、「人工テンプレート」という）は、２つのテンプレート、すなわち、以下；
１）増幅されるべき配列を含む、天然核酸または合成核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である出発物質
２）ネステッドオリゴヌクレオチド
から調製される。上記出発物質は、原テンプレート（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と見なされ得る。上記ネステッドオリゴヌクレオチドは、操作された核酸の鎖の作製の間に、原テンプレートのヌクレオチド配列を伸長するためのテンプレートとして使用される。この操作された核酸の鎖は、一連の操作によって原テンプレートから作製され、その結果その反対端に相補的な配列が存在する。これは、単一のプライマーのみを使用する増幅を可能にする相補的な配列である。
【００１９】
精製形態または未精製形態のあらゆる核酸は、増幅されるべき標的核酸配列を含むか、または含むと思われる条件で、本明細書中に記載されるプロセスのための出発物質として利用され得る。したがって、このプロセスにおいて利用される出発物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（伝令ＲＮＡを含む）であり得、これらのＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに、各々の１つの鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用され得る。任意のこれらの核酸の混合物がまた利用され得るか、または同じかもしくは異なったプライマーを使用した本明細書における、これまでの増幅反応から生成された核酸が使用され得る。増幅されるべき標的核酸配列は、より大きい分子の一部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）であり得るか、または個々の分子（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として最初に存在し得る。この出発核酸は、同一であり得るかまたは異なり得る１つより多くの所望の標的核酸配列を含み得る。したがって、本プロセスは、大量の１種類の標的核酸配列の生成のためのみではなく、同一であるかまたは異なった核酸分子上に位置する１つより多くの異なる標的核酸配列を同時に増幅するためにも有用であり得る。
【００２０】
核酸は、任意の供給源（例えば：ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、プラスミド、クローニングされたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または任意の供給源（細菌、酵母、ウイルスおよび高等生物（例えば、植物もしくは動物）が挙げられる）に由来する天然のＤＮＡもしくはＲＮＡ）から得られ得る。核酸は、天然に存在し得るか、または全体的もしくは部分的に合成され得る。本発明において使用される核酸を獲得または生成するための技術は、当業者において周知である。核酸が２本の鎖を含む場合、それが原テンプレートとして使用され得る前に、別個の工程かまたはプライマー伸長生成物の合成と同時にかのいずれかとして、その核酸の鎖を分離する必要性がある。さらに、出発物質が第１鎖（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡである場合、第２鎖（ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡは、当業者の範囲内のプロセスによって有利に作製され得、そして原テンプレートとして使用され得、そこから人工テンプレートが作製される。
【００２１】
第１鎖ｃＤＮＡは、本方法のための特に有用な原テンプレートである。ＤＮＡテンプレートを生成するための適切な方法は当業者に公知であり、そして当業者によって容易に選択される。好ましい実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーおよび４つのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下において、任意のＲＮＡ出発物質に相補的であるＤＮＡの合成を逆転写酵素が触媒する反応において合成される。この反応は、ｍＲＮＡの３’末端に対するオリゴ−デオキシヌクレオチドプライマーのアニーリングによって開始され、続いて、上記ｍＲＮＡヌクレオチド配列と関連する塩基対形成により決定されるように、伸長する鎖の３’末端に対して適切なデオキシヌクレオシドが段階的に添加される。当業者において理解されるように、試料中の全てのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡ尾部への、オリゴｄＴのアニーリングを介した第１鎖ｃＤＮＡを生成のために使用され得る。
【００２２】
一旦原テンプレートが得られると、プライマー２０および境界オリゴヌクレオチド３０は、原テンプレート１０にアニーリングされる（図１を参照のこと）。上記プライマーの３’末端で始まり上記境界オリゴヌクレオチドのおよそ５’末端までの、上記原テンプレートの部分に相補的な核酸の鎖が重合化される。
【００２３】
上記原テンプレートにアニーリングした上記プライマー２０は、好ましくは上記原テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第１の部分２２および上記原テンプレートにアニーリングする第２の部分２５を含み、そして必要に応じてその第１の部分と第２の部分との間に制限酵素認識部位２３を含む。上記プライマーは、増幅されるべき標的配列１２に隣接した原テンプレートにアニーリングする。図１に示されるように、上記プライマーは、増幅されるべき標的配列の上流の原テンプレートにアニーリングし得るか、または上記プライマーは、増幅されるべき標的配列１２の開始部（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）に重なり得ることが企図される。このプライマーの非アニーリング部分２２の所定の配列は、もともと上記原テンプレート中に存在するものではなく、そして以下に詳細に記載されるように、増幅処理の間に使用される単一のプライマーがハイブリダイズし得る配列を提供するように選択される。必要に応じて、上記所定の配列は、本明細書中の以下においてより十分に記載されるように、発現ベクター中への人工テンプレート部分の挿入のために有用な制限酵素認識部位を含み得る。
【００２４】
原テンプレートにアニーリングした境界オリゴヌクレオチド３０は、その核酸の重合を終結させる。核酸重合を終結させることが可能なあらゆるオリゴヌクレオチドが、境界オリゴヌクレオチド３０として利用され得る。好ましい実施形態において、上記境界オリゴヌクレオチドは、原テンプレート１０にアニーリングする第１の部分３５および伸長反応に影響されない第２の部分３２を含む。この境界オリゴを、伸長に関する部位としての作用から妨げるための技術は、当業者の範囲内である。一例として、上記境界オリゴ３０の部分３２は、図１に示されるように、原テンプレート１０にアニーリングしないように設計され得る。このような実施形態において、境界オリゴヌクレオチド３０はさらなる重合を妨げるが、その３’末端が原テンプレート１０にハイブリダイズしないので、核酸合成のためのプライマーとしては機能しない。代替的に、境界オリゴ３０の３’末端は、同じ効果を達成するために固定核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むように設計され得る。固定核酸は、例えば、ＷＯ ９９／１４２２６において開示され、その内容は本明細書中に参考として援用される。当業者は、境界オリゴの３’末端の伸長が起こらないことを保証する他の方法を構想する。
【００２５】
本明細書中に記載されるプライマーおよびオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知である、オリゴヌクレオチド合成のための確立された方法を使用して合成され得る。本発明のプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、モノマー−モノマー相互作用の規則的パターン（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能な、天然の、もしくは修飾されたモノマーまたは結合体（ｌｉｎｋａｇｅ）の線形オリゴマー（ｌｉｎｅａｒ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなど）を含む。通常、モノマーは、数単量体単位（例えば、３〜４）から数十単量体単位の大きさの範囲内のオリゴヌクレオチドを形成するために、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって結合する。プライマーは、代表的には一本鎖であるが、二本鎖にもなり得る。プライマーは、代表的にはデオキシリボ核酸であるが、当該分野において公知である種々の合成的プライマーおよび天然に存在するプライマーは、本開示の方法のために有用であり得る。プライマーは、テンプレートに相補的であり、そのプライマーは合成の開始のための部位として機能するためにハイブリダイズするように設計されるが、そのテンプレートの正確な配列を反映する必要性は無い。このような場合において、テンプレートへのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色素性部分、放射活性部分、または蛍光部分で標識され得、そして検出可能な部分として使用される。
【００２６】
核酸の重合は、当業者において公知である方法を使用して達成され得る。重合は、テンプレートの指示に従って遊離ヌクレオチドを順次付加するＤＮＡポリメラーゼを使用し、一般に酵素的に達成される。数種の異なるＤＮＡポリメラーゼが、本プロセスにおける使用のために適切である。ある実施形態において、選択の判定基準としては、エキソヌクレアーゼ活性を欠くこと、または強いエキソヌクレアーゼを有さないＤＮＡポリメラーゼであることが挙げられる。本プロセスにおける使用のための低いエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、天然の供給源から単離され得るか、または組み換えＤＮＡ技術を介して生成され得る。使用され得るポリメラーゼの例示的な例は、Ｔ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖ．２．０、エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、ＴａｑポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント、ｅｘｏ．−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ．（ｅｘｏ．−）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ．（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼであるが、これらに限定されない。
【００２７】
特に有用な実施形態において、出発物質の不必要な部分を消化により取り除くことによって、境界オリゴヌクレオチドの使用が避けられる。図２Ａにおいて模式的に示されるこの実施形態において、制限オリゴヌクレオチド７０は、あらかじめ選択しておいた位置で出発物質１００にアニーリングする。この制限オリゴヌクレオチドは、制限酵素認識部位７２を含む出発物質上に、二本鎖部分を提供する。適切な制限酵素認識部位としては、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、Ｎｈｅ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＩ、およびＰｖｕＩが挙げられるが、これらに限定されない。適切な制限酵素に曝露すると、上記出発物質は消化され、そしてその結果不必要な配列を取り除くために短くなる一方で、原テンプレート１１０として使用されるものの上で、増幅されるべき所望の標的配列１２（またはその一部分）は保存される。一旦原テンプレート１１０が得られると、プライマー２０は、上述の前の実施形態のように標的配列１２に隣接して、または重なって原テンプレート１１０にアニーリングされる（図２Ｂを参照のこと）。プライマー２０の３’末端と原テンプレート１１０の５’末端との間の原テンプレートの部分に相補的な核酸の鎖４０は、重合化される。当業者が理解するように、この実施形態において、制限オリゴヌクレオチドが原テンプレートを生成するために利用される場合、プライマー伸長は短くされた原テンプレート１１０の５’末端までの全てを進むことを可能にし得るので、境界オリゴヌクレオチドを使用する必要性は無い。
【００２８】
一旦重合が完了する（すなわち、伸長する鎖４０が境界ヌクレオチド３０または短くされた原テンプレート１１０の５’末端に到達する）と、新規に合成された相補鎖は、物理学的手段、化学的手段または酵素的手段を含む任意の適切な変性方法によって、原テンプレートから分離される。鎖の分離はまた、ヘリカーゼまたは酵素ＲｅｃＡとして公知の酵素のクラスに由来する酵素によって誘導されるＲｅｃＡは、ヘリカーゼ活性を有し、かつリボＡＴＰの存在下においてＤＮＡを変性させることで知られる。ヘリカーゼを用いた、核酸の鎖を分離するための適切な反応条件は、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第ＸＬＩＩＩ巻「ＤＮＡ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７８）、Ｂ．Ｋｕｈｎら、「ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅｓ」、ｐｐ．６３−６７によって記載され、そしてＲｅｃＡの使用に関する技術は、Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：４０５−３７（１９８２）において総説される。
【００２９】
したがって、新規に合成された相補鎖は、上記プライマー２０によって提供された配列（例えば、所定の配列２２、任意の制限酵素認識部位２３および上記プライマーのアニーリング部分２５）、ならびに、プライマー２０が原テンプレート１０にアニーリングした位置と、境界オリゴヌクレオチド３０にアニーリングした原テンプレート１０の部分かまたは原テンプレートの短くされた５’末端のいずれかとの間の原テンプレート１０の部分に相補的な、新規に合成された部分４５を含む。図４を参照のこと。
【００３０】
必要に応じて、続く工程の中で使用するための複数コピーの新規に合成された相補鎖を生成するために、原テンプレートおよびプライマーを使用した複数ラウンドの重合（好ましくは、１５ラウンド〜２５ラウンド）が実施される。このプロセス中のこの時点での複数コピーの新規に合成された相補鎖の作製は、（増幅の前に全長（ｅｎｔｉｒｅ）の人工テンプレートが生成されるまで待つ代わりに）最終的に生成された人工テンプレート中への標的配列の正確な複製の取り込みを確実にすることを援助する。原テンプレートに基づいた複数ラウンドの重合は、ライブラリーの全てのメンバーのより良い表現が達成されるより大きな可能性を提供すると考えられており、その結果、単一ラウンドの重合と比較して、より大きな多様性を提供する。
【００３１】
代替的な実施形態において、新規合成鎖は、上述のようにプライマー２０を原テンプレート１０にアニーリングし、そしてブロッキングオリゴヌクレオチドの存在も原テンプレートの部分除去のいずれも伴わずに複数ラウンドの重合を実施することによって生成される。この実施形態（これは、図３において図解的に示される）において、プライマーは、全長の新規合成鎖１４０を提供するために、原テンプレートの全長に沿って伸長される。次に、制限オリゴヌクレオチド１７０が、上記全長の新規合成鎖にハイブリダイゼーションされる。この制限オリゴヌクレオチドは、上記新規合成鎖上に制限酵素認識部位を含む二本鎖部分を提供する。適切な制限酵素認識部位としては、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、Ｎｈｅｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓａＪＩ、ＨｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＳａｃＩ、ＤｒａＩＩＩおよびＳｍａＩが挙げられるが、これらに限定されない。適切な制限酵素に曝すことにより、上記新規合成鎖は消化され、そしてその結果短縮される。次いで、ネステッドオリゴヌクレオチド５０は、以下により詳細に説明されるように、人工テンプレートの調製を完了させるために、短くされた新規合成鎖１４２にハイブリダイゼーションされる。
【００３２】
人工テンプレートの調製における次の工程は、例えば、図４において示されるように、ネステッドオリゴヌクレオチド５０を新規に合成された相補鎖の３’末端にアニーリングさせることに関する。図４において見られるように、ネステッドオリゴヌクレオチド５０は、人工テンプレートを完成させるために必要な、さらなる重合のためのテンプレートを提供する。ネステッドオリゴヌクレオチド５０は、新規に合成された相補鎖に対してハイブリダイゼーションしないおよび／または新規に合成された相補鎖に対して修飾された塩基を含む部分５２を含み、その結果、ネステッドオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能することを防いでいる。ネステッドオリゴヌクレオチド５０はまた、新規に合成された相補鎖の３’末端にハイブリダイゼーションする部分５５を含む。部分５５は、図４において示されるように、新規に合成された部分４５と重なり合い得るか、または新規に合成された部分４５を超えて伸長し得る。ネステッドオリゴヌクレオチド５０はまた、必要に応じて、制限酵素認識部位を規定する部分５６を含み得る。ネステッドオリゴヌクレオチド５０の最終部分５８は、プライマー２０の部分２２と同一な所定の配列を含む。部分５５が、新規に合成された相補鎖の初めの３’末端を越えて伸長する地点から、ネステッドオリゴヌクレオチドは、人工テンプレートを形成するためのさらなる重合のためのテンプレートとして機能する。ネステッドオリゴは、（原テンプレートの形成において、その一部分が短縮されていた場合）標的配列の一部分を含み得るか、もしくはポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子（またはその一部分）（例えば、１つ以上のＣＤＲ領域もしくはフレームワーク領域または抗体の定常領域）を含み得ることが、理解されるはずである。種々の配列を有するネステッドオリゴヌクレオチドの収集物が利用され得ることもまた企図され、その結果、多種多様な生成物のライブラリーをもたらす種々のテンプレートが提供される。このようにして、図４において示されるように、ネステッドオリゴヌクレオチドに相補的なさらなる核酸６０を付加することによって、重合は、新規に合成された相補鎖を伸長させる。重合を達成するための技術は、当業者の範囲内にある。前述のように、ある実施形態において、適切なポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素）の選択が好ましくあり得る。
【００３３】
一旦重合が完了すると、人工テンプレート１２０は、例えば、加熱変性のような当業者に周知の技術によって、ネステッドオリゴヌクレオチド５０から分離される。結果生じた人工テンプレート１２０は、初発プライマー２０由来である部分、原テンプレートの一部分に相補的な部分４５、およびネステッドオリゴヌクレオチドの一部分に相補的な部分６５を含む（図５を参照のこと）。注目すべきことに、人工テンプレート１２０の３’末端は、プライマー２０の部分２２の所定の配列に相補的な配列を含む、部分６８を含む。これは、当業者において公知の技術を使用し、プライマー部分２２の所定の配列と同一の配列を有する単一のプライマーを使用して、人工テンプレート１２０内に含まれる所望の配列を増幅することを可能にする。単一プライマー増幅の間、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが存在することは好ましい。なぜならば、このような酵素は「プルーフリーディング」機能を提供することが知られており、かつエキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリメラーゼと比較して相対的により高い伸長性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を有するからである。
【００３４】
図６は、新規に合成されたｃＤＮＡテンプレートの単一プライマー増幅に関連する工程を図示する。反応混合物中にプライマーが存在する場合、プライマーは、テンプレートに隣り合う配列にハイブリダイゼーションし、そしてこのテンプレートを増幅する。プライマーが存在しない場合は、５’末端の所定の配列とこの所定の配列に相補的な３’末端配列との間で、内部の自己アニーリングが存在すると考えられている。好ましい実施形態において、所定の配列および相補的な所定の配列は、単一プライマー増幅反応の間のミスプライミングを避けるために、より高い温度でアニーリングするように設計され得る。
【００３５】
増幅が実施された後、その生成物は、当業者において公知である任意の技術を使用して検出され得る。核酸を検出するために使用される方法の例としては、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション、制限酵素切断、一本鎖立体配座多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）、分析ゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、ヘアピンＦＲＥＴアッセイ（ｅｓｓａｙ）、およびＴａｑＭａｎアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
一旦人工核酸が所望される回数分増幅されると、その鎖を消化するために制限酵素認識部位２３および制限酵素認識部位６６または任意の内在性制限酵素認識部位が使用され得、そして標的核酸配列は、適切な発現ベクター中にライゲーションされ得る。次いで、このベクターは、標準の方法を使用して適切な宿主生物を形質転換するために使用され、標的領域によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質が生成される。
【００３７】
特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される方法は、抗体のｃＤＮＡを使用し、抗体またはその一部（例えば、可変領域（軽鎖または重鎖のいずれか））をコードする標的配列を増幅するために使用される。このようにして、抗体のライブラリーが増幅され得、そしてスクリーニングされ得る。したがって、例えば、抗体ｍＲＮＡで開始して、第１鎖ｃＤＮＡが生成され得、そして原テンプレートを提供するために消化され得る。プライマーは選択された相補性決定領域（ＣＤＲ）の上流にアニーリングするように設計され得、そしてこの新規合成核酸鎖は、ＣＤＲを含む。一例として、上記標的配列が重鎖ＣＤＲ３である場合、プライマーは、重鎖フレームワーク１（ＦＲ１）領域にアニーリングするように設計され得る。当業者は、本開示に基づき、他の上流部位にアニーリングする適切なプライマー、または抗体ｃＤＮＡ内の他に選択された標的を複製する適切なプライマーを、どのようにして設計するかを容易に想定する。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明の例証のために提供されるが、本発明を限定しない。
【００３９】
（実施例１）
（ＩｇＭ重鎖可変遺伝子のレパートリーの増幅）
（第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って、オリゴｄＴプライマーを用いて慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用した。この第１鎖ｃＤＮＡ生成物を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を通じて浄化した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドを上記第１鎖ｃＤＮＡに添加した。制限オリゴヌクレオチド（ＣＭＥｃｏＲＩ）の配列は、５’ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＧ ＴＣＧ３’（配列番号１）であった。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび０．１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップした。試料を２分間９５℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保った。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を上記試料に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この制限酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却した。
【００４０】
（第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
プライマー「ＴＭＸ２４ＶＨ３ａ」（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に加えて、ＥｃｏＲＩで消化された第１鎖ｃＤＮＡを、第２鎖ｃＤＮＡ反応における原テンプレートとして使用した。上記プライマーは、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。「ＴＭＸ２４ＶＨ３ａ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ
ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＲ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ３’（配列番号２）であり、Ｒは、塩基Ａおよび塩基Ｇの等モル混合物を意味する。上記試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で１分間を介する反応を２０回サイクルさせた。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＭ０」と命名されたネステッドオリゴを、次いで０．０８μＭの最終濃度となるように氷上で添加した。「ＴＭＸ２４ＣＭ０」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＧＡ３’（配列番号３）であった。これはその後のクローニング工程において使用されるＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このネステッドオリゴの３’末端は、逆結合（３’−５’よりもむしろ３’−３’）アデノシンの取り込みにより伸長を防ぐように設計される。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃５秒間で加熱変性し、次いで６８℃で１０秒間および９５℃で５秒間の４サイクルアニーリングおよび伸長させることによってネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて６８℃で３０秒間処理し、そして４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ、すなわち人工テンプレートを、次いでＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００４１】
（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびに５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４）の配列を有する単一のプライマー（ＴＭＸ２４）を使用して、上記人工テンプレートを増幅した。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３５回サイクルさせた。これ続いて、さらに６８℃で３分間反応させ、そして４℃で保持した。
【００４２】
（クローニングおよび配列決定）
約４５０ｂｐの増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。個々のクローンを取り出し、そしてそれらのＤＮＡ配列を決定した。分析した１６クローンの全てがＩｇＭ重鎖であり、各々が種々の長さの異なるＣＤＲ３配列を有していた。この結果は、この方法によって抗体鎖の多様な集団が増幅されたことを示す（表１を参照のこと）。
【００４３】
【表１】
。
【００４４】
（実施例２）
ＶＨ生成物をベクター中にクローニングするために、ネイティブＩｇＭ ＣＨ１定常領域が再構成され得、ＣＨ１中のＥｃｏＲＩ以外の部位を、上記第１鎖ｃＤＮＡエンドヌクレアーゼ消化のために利用した。当業者が理解するように、Ｔａｑポリメラーゼがこのプロトコールのために使用された場合、新規に合成されたＤＮＡ鎖の多くに末端のＡが付加される。多様性を最大化させるために、その末端のＡの存在をネステッドオリゴヌクレオチドの設計において考慮した。しかしながら、余剰なＡの存在は、ＥｃｏＲＩ認識部位の減少を招く。ＩｇＭ定常領域の分析は、他のネイティブ制限酵素認識部位が、この方法のために潜在的に使用され得ることを明らかにした（例えば、ＤｒａＩＩＩ）。ＣＨ１ドメイン中のＤｒａＩＩＩネイティブ制限酵素認識部位の使用の結果、上流ＥｃｏＲＩ部位が未修飾のまま残存し、そして重鎖レパートリーのクローニングのために使用され得る。重鎖インサートは、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって、ＥｃｏＲＩからＣＨ２ドメインに残存ＩｇＭ ＣＨ１ドメインを有する適切なベクター中にクローニングされる。
【００４５】
（第１鎖合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用した。これを、基本的にキットの指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して行った。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドを第１鎖ｃＤＮＡに添加した。この制限オリゴヌクレオチド（ＣＭＤｒａＩＩＩ）の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＡ ＣＡＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ Ｇ３’（配列番号２１）であった。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップした。試料を２分間９５℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持した。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、上記試料中に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ
ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。上記制限酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いでこの試料を４℃まで冷却した。
【００４６】
（第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
第２鎖ｃＤＮＡ反応において、プライマー「ＴＭＸ２４ＶＨ１ａ」（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に加えて、ＤｒａＩＩＩで消化された第１鎖ｃＤＮＡを原テンプレートとして使用した。上記プライマーは、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。「ＴＭＸ２４ＶＨ１ａ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＴＫ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ３’（配列番号２２）であり、Ｋは、塩基Ｇおよび塩基Ｔの等モル混合物を意味する。上記試料を９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０回サイクルさせた。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴを、次いで０．２μＭの最終濃度となるように氷上で添加した。図７において示されるように、「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」（配列番号２３）の配列は、オリゴヌクレオチドの伸長を防ぐように設計された、修飾された構造を有する３つの３’末端ヌクレオチドを含む。具体的には、上記ネステッドオリゴは、ホスホチオ酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）および伸長を防ぎかつエキソヌクレアーゼ活性ならびにエンドヌクレアーゼ活性に対して保護するために設計された２’ＯＭｅで修飾された、３つの末端ヌクレオチドを有する。このオリゴの３’末端オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしない（ｃの代わりにｇ）。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃１分間で加熱変性し、次いで６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ、または人工テンプレートを、次いでＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。この手順を繰り返し、そして、適切なベクターにクローニングされ得る免疫グロブリン生成物のライブラリーを生成するために、ＶＨプライマーパネル（ｐｒｉｍｅｒ ｐａｎｅｌ）（プライマーリストを参照のこと）の残りの部分を伸長した。
【００４７】
【化６】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＫはＧおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００４８】
（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
上記人工テンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰならびに５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４）の配列を有する単一のプライマー（ＴＭＸ２４）を使用して増幅した。その試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０回サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００４９】
（クローニングおよび配列決定）
約４５０ｂｐの増幅生成物をゲル精製し、そしてＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって消化する。ネイティブＥｃｏＲＩ由来のＩｇＭ ＣＨ１ドメインの残余部分を含み、ＣＨ２ドメインまでかまたはを含んで増幅されたフラグメントをクローニングするために適性のある制限酵素認識部位を含む任意の適切な発現ベクター中に、このインサートをクローニングする。
【００５０】
（実施例３）
（Ｂ型肝炎陽性ドナー由来のファージミドディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｍｉｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）の構築）
（ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡの合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、Ｂ型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用した。これは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。ＩｇＧについては制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩによって、またはκ軽鎖についてはＳａｃＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、ＩｇＧについては制限オリゴヌクレオチド「ＣＧＡｐａＬＩ」を、またはκ軽鎖については制限オリゴヌクレオチド「ＣＫＳａｃＩ」を第１鎖ｃＤＮＡに添加した。「ＣＧＡｐａＬＩ」配列は、５’ＣＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＴＧＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＴＣＣ３’（配列番号３９）である。「ＣＫＳａｃＩ」配列は、５’ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＴＣ３’（配列番号４０）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×反応緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてセットアップした。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持し、そして３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩまたはＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この制限酵素を、ＳａｃＩに関して６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却した。
【００５１】
各々の制限エンドヌクレアーゼによる上記第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者において公知である技術を使用し、ＰＣＲ増幅によって検証した。これらの生成物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を、ＩｇＧについて５’ＶＢＶＨ１ａ内部コントロールプライマーおよび３’ＣＧ０内部コントロールプライマーを、およびκについて５’ＶＢＶＫ１ａおよび３’ＣＫ０内部コントロールプライマーを使用した反応中で観察した。５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＧ０プライマーまたは５’ＶＢＶＫ１ａ／３’ＣＫ０プライマーを用いた良好な増幅および５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＧ１Ｚプライマーまたは５’ＶＫ１ａ／３’ＣＫ１ｄｘ２プライマーを用いたわずかな増幅は、各々の制限エンドヌクレアーゼを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良い消化を示す。ＰＣＲを検査するチェックのために使用されるプライマーの配列は、以下：
【００５２】
【化７】
である。
【００５３】
（軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＳａｃＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、κについて所定のＴＭＸ２４Ｋ配列５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４７）、ＸｂａＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）由来であり、これらは、公知のヒト抗体の配列に基づいて設計され、そしてκ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。
【００５４】
【化８】
【００５５】
【化９】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＹはＣおよびＴの同じ割合の混合物であり、ＷはＡおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００５６】
上記試料を９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクルさせた。これは、第２鎖ＤＮＡの線形増幅を可能にする。κ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」は、所定の配列ＴＭＸ２４Ｋを含み、そしてこの配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＣＴ３’（配列番号６１）であった。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間加熱変性させ、次いで６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させて、ネステッドオリゴからさらに伸長させ、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００５７】
（軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてのプライマー「ＴＭＸ２４Ｋ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４Ｋ」についての配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号６２）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００５８】
（軽鎖クローニング）
κ増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｂａＩおよびＳａｃＩによって消化した。そのインサートを、κ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するためにＤＮＡマキシプレップ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を実施した。次いで、ライブラリーの構築を完了させるために、ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩによる重鎖Ｆｄフラグメントのクローニングのための続く工程において、この軽鎖ライブラリーＤＮＡを使用した。
【００５９】
（重鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＡｐａＬＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして重鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。
【００６０】
【化１０】
【００６１】
【化１１】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＫはＧおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００６２】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクルさせた。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＧｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチド（配列５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＲＧＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＴＴ Ｇ３’（配列番号７７））を、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。図１に示されるように、ＩｇＭネステッドオリゴについて、オリゴ伸長を防ぐために、３つの３’末端ヌクレオチドを修飾した。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間でアニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長させ、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、次いでＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００６３】
（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、およびプライマー「ＴＭＸ２４」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせた。これに続いて６８℃でさらに３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００６４】
（重鎖クローニングおよびライブラリーの生成）
この増幅された生成物をプールし、次いでゲル精製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを、ＸｈｏＩ制限酵素およびＡｇｅＩ制限酵素で順次消化し、次いでゲル精製した。ＡｇｅＩ部位は、ＡｐａＬＩ部位の上流のＩｇＧ定常領域のＣＨ１中に、天然に存在する。ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で回収した。
【００６５】
軽鎖ライブラリーＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで順次消化し、次いでゲル精製した。この軽鎖ライブラリーＤＮＡを、上記重鎖フラグメントとライゲーションした。ライゲーションされたＤＮＡを、反応緩衝液を除去するためにスピンカラム（ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）上に置き、そしてこのＤＮＡを濃縮した。電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、最終形質転換を行った。
【００６６】
（ＨＢｓ Ａｇについてのライブラリーのパンニングおよびスクリーニング）
基本的に、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，ＣＦ、Ｂｕｒｔｏｎ，ＤＲ、Ｓｃｏｔｔ，ＪＫ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，ＧＪ（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、上記ライブラリーを、固定化ＨＢｓ Ａｇについて４ラウンドパンニングした。パンニングの第２ラウンド、第３ラウンド、および第４ラウンド由来である個々のクローンを、ＨＢｓ ＡｇについてのＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【００６７】
（λ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、Ｂ型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを使用した。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、上記第１鎖ｃＤＮＡに制限オリゴヌクレオチド「ＣＬＳｍａＩ」を添加した。「ＣＬＳｍａＩ」配列は、５’ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＹ ＧＴＧ３’（配列番号７８）であって、ここで、ＹはＣおよびＴの混合物である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×反応緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてセットアップした。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持し、そして３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この制限酵素を６５℃で加熱不活性化し、次いでその試料を４℃まで冷却した。
【００６８】
制限エンドヌクレアーゼによる上記第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者において公知である技術を使用し、ＰＣＲ増幅によって検証した。これらの生成物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。５’ＶＢＶＬ１ａ内部コントロールプライマーおよび３’ＣＬ０内部コントロールプライマーを使用した反応において、消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を観察した。５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＬ０プライマーを用いた良好な増幅および５’ＶＢＶＬ１ａ／３’ＣＬ２ｄｘ２プライマーを用いたわずかな増幅は、ＳｍａＩを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良い消化を示す。ＰＣＲの検査のためのプライマーの配列は、ＶＢＶＬ１ａ：５’ＧＡＣ ＧＣＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ３’（配列番号７９）、ＣＬ０：５’ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＹＧ ＧＧＡ ＡＣＡ Ｇ３’（配列番号８０）およびＣＬ２ｄｘ２：５’ＡＧＡ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＧＧ３’（配列番号８１）である。
【００６９】
（λ軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＳｍａＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、所定のＴＭＸ２４Ｌ配列、ＸｂａＩ部位、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そしてλ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。λ軽鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例４におけるものを使用する。
【００７０】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行った。これは、上記第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。実施例４において示されるような、「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチドを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。図７に示されるようなＩｇＭネステッドオリゴヌクレオチド「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」について、「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」の３’末端ヌクレオチドは、オリゴ伸長を防ぐように修飾される。第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性、６８℃で２分間でアニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴヌクレオチドからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して浄化した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００７１】
（λ軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにプライマー「ＴＭＸ２４Ｌ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４Ｌ」についての所定の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ３’（配列番号８２）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００７２】
（λ軽鎖クローニング）
λ軽鎖増幅生成物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって浄化し、そしてＸｂａＩおよびＳａｃＩによって消化した。そのインサートを、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲル精製し、そしてλ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、λ軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するためにＤＮＡマキシプレップ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を実施した。
【００７３】
（重鎖クローニングおよびＩｇＧλライブラリーの生成）
上記で調製したλ軽鎖ライブラリーＤＮＡを、前述されるように、ＩｇＧκライブラリーに対して調製した重鎖Ｆｄフラグメントの挿入のために、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで順次消化した。次いで、ライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、完全なＩｇＧλライブラリーＤＮＡを回収するために、ＤＮＡマキシプレップ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を実施した。
【００７４】
（ＨＢｓ Ａｇについてのライブラリーの選別およびスクリーニング）
ＩｇＧκライブラリーについて前述されたように、パンニングおよびスクリーニングを実施した。
【００７５】
（ＤＮＡ配列決定分析および単離されたＦａｂの性質決定）
ＥＬＩＳＡスクリーニングによって、ＨＢｓＡｇに対して特異的結合を示し、かつ非特異的タンパク質（オボアルブミン）に対して最低限の結合を示したクローンを、ＤＮＡ配列決定によって分析した。図８ａ〜図８ｅを参照のこと。ＨＢｓＡｇに対して、全部で３８の異なるＩｇＧκＦａｂ（２５重鎖および３７軽鎖）および１７の異なるＩｇＧλＦａｂ（１３重鎖および１６軽鎖）を、Ｂ型肝炎ワクチン接種を受けたドナー由来のＰＢＬ ｍＲＮＡから作製したライブラリーから単離した。
【００７６】
（実施例４）
（ヒトＰＢＬ ｍＲＮＡからのファージディスプレイライブラリーの構築）
（軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
ドナーからのヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて、基本的にキットの指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために使用した。κ軽鎖反応およびλ軽鎖反応を、別々にセットアップする。κ軽鎖については制限ヌクレアーゼＳａｃＩによって、またはλ軽鎖についてはＳｍａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに制限オリゴヌクレオチド「ＣＫＳａｃＩ」または「ＣＬＳｍａＩ」を添加する。複数のλ定常領域（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ６）がある場合、全ての機能的λ定常ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ６）の中で、ＳｍａＩ部位が保存されていることに注意することが重要である。「ＣＫＳａｃＩ」配列は、５’ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＴＣ３’（配列番号１７９）であり、「ＣＬＳｍａＩ」配列は５’ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＹ ＧＴＧ３’（配列番号１８０）であって、ここで、ＹはＣおよびＴの混合物である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持する。適切な量の１０×制限緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を上記試料に添加し、そして３７℃までさらに冷却する。制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩまたはＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。この制限酵素を、６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いでこの試料を４℃まで冷却する。
【００７７】
（軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＳａｃＩ消化されたκ第１鎖ｃＤＮＡまたはＳｍａＩ消化されたλ第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用する。上記プライマーを、ＴＭＸ２４Ｋ（κについて）配列またはＴＭＸ２４Ｌ（λについて）配列、ＸｂａＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体κ鎖遺伝子またはヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）由来であり、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。κ軽鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例３におけるものを使用する。λ増幅における使用のためのプライマーのリストは、以下を参照のこと。
【００７８】
【化１２】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＹはＣおよびＴの同じ割合の混合物であり、ＷはＡおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００７９】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、および５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行う。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。κ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチド、またはλ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチドを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加する。このネステッドオリゴヌクレオチドの配列は；「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＣＴ３’（配列番号１９６）および「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＫＡＴ ＳＡＧ ＲＣＡ ＣＡＧ３’（配列番号１９７）である。図７に示されるように、ＩｇＭネステッドオリゴについて、オリゴ伸長を防げるために３つの３’末端ヌクレオチドを修飾する。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にする。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して精製する。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００８０】
（軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてプライマー「ＴＭＸ２４Ｋ」を、またはλ鎖について「ＴＭＸ２４Ｌ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅する。「ＴＭＸ２４Ｋ」の配列は５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ３’（配列番号１９８）であり、そして「ＴＭＸ２４Ｌ」の配列は５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ３’（配列番号１９９）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクル行う。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持する。
【００８１】
（軽鎖クローニング）
κ増幅生成物およびλ増幅生成物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を使用して浄化し、そして別々にゲル精製した。これらの生成物を、ＸｂａＩおよびＳａｃＩによって消化した。そのインサートを、それぞれの軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するために、ＤＮＡマキシプレップを実施した。ライブラリーの構築を完了させるために、この軽鎖ライブラリーＤＮＡ調製物を、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩによる重鎖Ｆｄフラグメントの挿入のためのクローニングベクターとして使用した。
【００８２】
（重鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを使用する。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行う。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドＣＭＤｒａＩＩＩを、第１鎖ｃＤＮＡに添加する。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。試料を２分間９５℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持する。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を上記試料中に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却する。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートし、次いで４℃まで冷却する。
【００８３】
ＤｒａＩＩＩによる第１鎖ｃＤＮＡの消化を、ＰＣＲ増幅によって検証する。増幅生成物は、抗体フラグメントのクローニングには使用されない。２つの異なる緩衝液条件下において、５’ＶＢＶＨ１ａ内部コントロールプライマーおよび３’ＣＭ０内部コントロールプライマーを使用した反応において、消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を観察する。５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＭ０プライマーを用いた良好な増幅、および５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＭ１プライマーを用いたわずかな増幅は、第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良いＤｒａＩＩＩ消化を示す。
【００８４】
（重鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＤｒａＩＩＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用する。上記プライマーを、ＴＭＸ２４配列、ＸｂａＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして実施例３において上述されるように、重鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。重鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例３において列挙されたものを使用する。
【００８５】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行う。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチド（実施例３において使用したもの）を、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加する。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長によって、ネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にする。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄する。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００８６】
（重鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにプライマー「ＴＭＸ２４」を使用し、上記人工テンプレートを増幅する。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクル行う。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持する。
【００８７】
（重鎖クローニングおよびライブラリーの生成）
約５００ｂｐの増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって消化する。ＩｇＭ ＣＨ１ドメインの残余部分を含む適切な発現ベクター中に、インサートをクローニングする。ライゲーションされたＦａｂライブラリーを含む生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入する。
【００８８】
バクテリオファージの表面上にＦａｂライブラリーを生成させるために、サプレッサー株の細胞（例えば、ＸＬ１ＢＬＵＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用する。続いてエレクトロポレーションに続いて、その細胞を３７℃で１時間振とうし、次いでカルベニシリンを２０μｇ／ｍｌまで添加する。３７℃で１時間の振とうの後、カルベニシリンを５０μｇ／ｍｌまで増やし、３７℃にさらに１時間置く。次いで、ファージミド粒子の生成のために必要な全ての成分を提供するため、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、そして培養物の容積をＳＢ培地で１００ｍｌまで増やす。３７℃で１時間後、ヘルパーファージＤＮＡを含む細菌を選択するために、７０μｇ／ｍｌまでカナマイシンを添加する。この培養物を、３７℃で一晩振とうする。その期間の間、上記細菌は、その表面上にＦａｂを有する新しいファージミド粒子を生成する。翌朝、このファージミド粒子は細菌細胞をスピンアウトすることによって単離され得、次いでこのファージミド粒子を、４％ ＰＥＧ ８０００および０．５Ｍ ＮａＣｌを用いて、氷上で３０分間上清から沈殿させる。１４，３００×ｇの遠沈によって、ファージペレットを沈殿させる。このペレットは、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中で再懸濁され得る。この調製物は、細菌性の破片を取り除くために、濾過され得る。結果生じたライブラリーを、４℃で保存する。
【００８９】
（実施例５）
（ＩｇＥまたは組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４で免疫されたマウスｍＲＮＡ由来のファージミドディスプレイライブラリーの構築）
（ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒトＩｇＥまたは組み換えヒトＩｇＥで免疫されたマウス由来であるマウス脾臓ｍＲＮＡを使用した。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。ＩｇＧ１については制限エンドヌクレアーゼＸｃｍＩ、ＩｇＧ２ａについては制限エンドヌクレアーゼＢｓａＪＩ、またはκ軽鎖についてはＨｐａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、ＩｇＧ１については制限オリゴヌクレオチド「ｍＣＧ１ＸｃｍＩ」、ＩｇＧ２ａについては制限オリゴヌクレオチド「ｍＣＧ２ａＢｓａＪＩ」、またはκ軽鎖については制限オリゴヌクレオチド「ｍＣＫＨｐａＩ」を、第１鎖ｃＤＮＡに添加した。「ｍＣＧ１ＸｃｍＩ」配列は、５’ＣＴＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧ３’（配列番号２００）である。「ｍＣＧ２ａＢｓａＪＩ」配列は、５’ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＡＧ３’（配列番号２０１）であり、「ｍＣＫＨｐａＩ」配列は、５’ＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号２０２）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×ＮＥ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）または１０×反応緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてセットアップした。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持し、そしてＸｃｍＩおよびＨｐａＩについては３７℃まで冷却し、またＢｓａＪＩについては６０℃まで冷却した。上記制限エンドヌクレアーゼＸｃｍＩ、制限エンドヌクレアーゼＢｓａＪＩ、または制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、それぞれ、３７℃で３０分間、６０℃で３０分間、および３７℃で１０分間インキュベートした。上記制限酵素を、ＸｃｍＩについては６５℃で２０分間、およびＢｓａＪＩについては８０℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却した。
【００９０】
各々の制限エンドヌクレアーゼによる上記第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者において公知である技術を使用し、ＰＣＲ増幅によって検証した。これらの生成物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。ＩｇＧ１について５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型内部コントロールプライマーおよび３’ｍＣＧ１内部コントロールプライマーを、ＩｇＧ２ａについて５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＩＢ短縮型および３’ｍＣＧ２の内部コントロールプライマーを、そしてκについて５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶ短縮型および３’ｍＣＫ０内部コントロールプライマーを使用した反応において、消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を観察した。５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ１プライマーもしくは５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ２ａプライマーまたは５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＶ短縮型／３’ｍＣＫ０プライマーを用いた良好な増幅、および５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ１Ｂプライマー、もしくは５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ２ａＢプライマーもしくはＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶ短縮型／３’ｍＣＫＢプライマーを用いたわずかな増幅は、各々の制限エンドヌクレアーゼを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良い消化を示す。ＰＣＲの検査のために使用されるプライマーの配列は、以下：
【００９１】
【化１３】
【００９２】
【化１４】
である。
【００９３】
（軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＨｐａＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、ＴＭＸ２４ｍＫ配列（κについて）、およびＸｂａＩ制限酵素認識部位、ならびにマウス抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。そしてκ軽鎖遺伝子の全マウス抗体レパートリーを網羅するために、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／）由来の公知のマウス抗体の配列に基づいて、これらのアニーリング配列を設計した。
【００９４】
【化１５】
ここで、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＫはＧおよびＴの同じ割合の混合物であり、ＷはＡおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００９５】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行った。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。κ鎖について「ＴＭＸ２４ｍＣＫｎｏｅｒ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチドを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。「ＴＭ２４ＣＫｎｐｔ」の配列は；５’ＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＣＧＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ２’ＯＭｅ［Ａ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）］（プロピル）３’（配列番号２２０）である。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００９６】
（軽鎖単一プライマー増幅）
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてのプライマー「ＴＭＸ２４ｍＫ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４ｍＫ」についての配列は、５’ＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧ３’（配列番号２２１）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を２５サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００９７】
（軽鎖クローニング）
κ増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩによって消化した。そのインサートを、κ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するためにＤＮＡマキシプレップを実施した。次いで、以下の「（重鎖クローニング）」において記載されるようにライブラリーの構築を完了させるため、ＸｈｏＩ／ＢｌｎＩによる重鎖Ｆｄフラグメントをクローニングするための後の工程において、この軽鎖ライブラリーＤＮＡを使用した。
【００９８】
（重鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＸｃｍＩおよびＢｓａＪＩで消化された第１鎖ｃＤＮＡを使用した。上記プライマーを、ＴＭＸ２４ｍＨ配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位、およびマウス抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。そして重鎖遺伝子の全マウス抗体レパートリーを網羅するために、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／）由来の公知のマウス抗体の配列に基づいて、これらのアニーリング配列を設計した。
【００９９】
【化１６】
ここで、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＹはＣおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【０１００】
上記試料を９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行った。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。ＩｇＧ１について「ＴＭＸ２４ｍＣＧ１ｎｏｅｒ」と命名されたネステッドオリゴおよびＩｇＧ２ａについて「ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ」と命名されたネステッドオリゴを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。「ＴＭＸ２４ｍＣＧ１ｎｏｅｒ」の配列は；５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡ２’ＯＭｅ［Ｕ（ｐｓ）Ｃ（ｐｓ）Ａ（ｐｓ）］（プロピル）３’（配列番号２３０）であり、そして「ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ」の配列は；５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＣＡ２’ＯＭｅ［Ｃ（ｐｓ）Ａ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）］（プロピル）３’（配列番号２３１）である。
【０１０１】
上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長によって、ネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【０１０２】
（重鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびに重鎖についてのプライマー「ＴＭＸ２４ｍＨ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４ｍＨ」についての配列は、５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧ３’（配列番号２３２）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を、ＩｇＧ１については２８サイクル、ＩｇＧ２ａについては３０サイクルさせた。これに続いて６８℃でさらに３分間処理し、そして４℃で保持した。
【０１０３】
（重鎖クローニング）
重鎖増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｈｏＩおよびＢｌｎＩによって消化した。そのインサートを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについての重鎖定常領域の残余部分を含むκ鎖ライブラリーＤＮＡ中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、ＩｇＧ１κライブラリーＤＮＡまたはＩｇＧ２ａκライブラリーＤＮＡを回収するために、ＤＮＡマキシプレップを実施した。
【０１０４】
（組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４についてのライブラリーのパンニングおよびスクリーニング）
基本的に、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，ＣＦ、Ｂｕｒｔｏｎ，ＤＲ、Ｓｃｏｔｔ，ＪＫ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，ＧＪ（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、上記ライブラリーを、組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４について４ラウンドパンニングした。選別の第２ラウンド、第３ラウンド、および第４ラウンド由来の個々のクローンを、組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４についてのＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対して特異的結合を示し、かつ非特異的タンパク質（オボアルブミン）に対して最低限の結合を示したクローンを、ＤＮＡ配列決定によって分析した。ＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対して、全部で３１の異なるＦａｂを、マウスライブラリーから単離した。図９ａ〜図９ｄを参照のこと。
【０１０６】
（実施例６）
（ＩｇＡ抗体ライブラリーの構築）
（第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために使用する。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にその指示書に従って行う。制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに制限オリゴヌクレオチド「ＣＡＢｓｒＧＩ」を添加する。「ＣＡＢｓｒＧＩ」の配列は、５’ＴＣＣ ＧＧＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＡＧＣ ＡＧ３’（配列番号２７９）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび０．１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持する。適切な量の１０×制限緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を上記試料中に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。この制限酵素を８０℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却する。
【０１０７】
（第２鎖ｃＤＮＡ合成およびネステッドオリゴヌクレオチド伸長反応（ＮＯＥＲ））
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＢｓｒＧＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを使用する。以下の表Ａ中に列挙されるプライマーは、ＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計された。これらのアニーリング配列は、公知のヒト抗体の配列に基づいて設計され、そして重鎖鎖遺伝子の全長ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されているＶｂａｓｅデータベースプライマー由来である。
【０１０８】
【化１７】
【０１０９】
【化１８】
上記配列の各々において、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである。
【０１１０】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行う。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。次いで、伸長オリゴヌクレオチド「ＴＭＸ２４ＣＡｎｐｔ」を、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加する。「ＴＭＸ２４ＣＡｎｐｔ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＴＣ３’（配列番号２９４）であって、ここで、ＲはＡまたはＧである。オリゴ伸長を防ぐために、３つの３’末端ヌクレオチドを修飾する。９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間での伸長において上記第２鎖ｃＤＮＡをネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にする。次いで、この第２鎖ｃＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄する。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【０１１１】
（単一プライマーＰＣＲ増幅）
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにプライマー「ＴＭＸ２４」を使用し、上記第２鎖ｃＤＮＡの増幅を実施する。「ＴＭＸ２４」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号２９５）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせる。これに続いて６８℃でさらに３分間処理し、そして４℃で保持する。
【０１１２】
（クローニングおよび配列決定）
約５６０ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、ＸｈｏＩおよびＢｓｒＧＩによって消化し、ゲル精製し、そしてＩｇＡ ＣＨ１定常領域の残余部を有する適切なＦａｂ発現ベクター中にクローニングする。
【０１１３】
種々の改変が、本明細書中に記載される実施形態を構成し得ると考えられる。したがって、上記は、好ましい実施形態の限定として解釈されるべきではなく、単に、好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。当業者は、本開示の範囲および精神の範囲内で他の改変を構想する。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本国際出願は、２００３年１２月１５日に出願された米国出願第１０／７３７，２５２号（これは、２００１年９月１９日に出願された米国仮出願第６０／３２３，４５５号に対する優先権を主張する、２００２年９月１９日に出願された米国出願第１０／２５１，０８５号の一部継続出願である）に対する優先権を主張する。上述の米国出願および米国仮出願の開示全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、標的核酸配列の増幅のために有用な人工テンプレート（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）に関連する。さらに具体的には、その反対端に相補的な配列を含むように操作されたテンプレートが、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）オリゴヌクレオチド伸長反応（ＮＯＥＲ）によって提供される。上記人工テンプレートは、この人工テンプレート内の標的配列を増幅するための単一プライマー増幅（ＳＰＡ）を可能にする。特に有用な実施形態において、上記人工テンプレート由来の標的配列は、発現ビヒクル中にクローニングされて、例えば、抗体ライブラリーのような、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
（関連分野の背景）
核酸増幅および増幅生成物の検出のための方法は、核酸配列の検出、同定、定量および配列分析を支援する。核酸増幅は、例えば、抗体のような、関連する遺伝子ライブラリーの構築において重要な工程である。これらのライブラリーは、特異的であり所望する活性を有する抗体に関して、スクリーニングされ得る。核酸分析は、病原体の検出および同定、規定の表現型を引き起こす遺伝子変化の検出、遺伝病（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）または疾患に対する感受性の診断、発達、疾患および規定の刺激の応答における遺伝子発現の評価、ならびに種々のゲノム計画のために重要である。核酸増幅方法の他の適用としては、稀な細胞の検出、病原体の検出、および悪性疾患における改変された遺伝子発現の検出などが挙げられる。核酸増幅はまた、（例えば、規定の核酸配列の存在の検出のような）定性分析、および（例えば、病原性配列の量の評価、ならびに遺伝子増殖または遺伝子欠失の判定、および正常細胞型から悪性細胞型への細胞形質転換の判定などにおいて有用な）規定の遺伝子配列の定量化のために有用である。核酸配列中の配列変化の検出は、変異遺伝子型の検出、遺伝子分析に関連することとして、薬物耐性を引き起こす変異の検出、薬理ゲノム科学などのために重要である。
【０００４】
多くの種類の核酸増幅（例えば、指数関数的増幅、結合線形増幅（ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ライゲーションベースの増幅、および転写ベースの増幅）が存在する。指数関数的核酸増幅方法の一例は、多数の刊行物において開示される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。例えば、非特許文献１；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．特許文献１；Ｍｕｌｌｉｓら、特許文献２；Ｅｒｌｉｃｈら、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６；およびＳａｉｋｉ Ｒ．ら、特許文献７を参照のこと。実際に、このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、最も一般に使用される標的増幅方法である。ＰＣＲは、多数の標的配列の複数の二重鎖複製物を生成するために、多サイクルの、変性、２種の異なるオリゴヌクレオチドプライマーの（各々、標的鎖の対向する鎖への）ハイブリダイゼーション、およびヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長に基づく。
【０００５】
単一のプライマーを利用した複製方法もまた、開示されている。例えば、特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；および特許文献１２を参照のこと。このプライマーは、特許文献１３において開示されるようなＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーであり得る。
【０００６】
いくつかの増幅方法は、テンプレート転換オリゴヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＴＳＯ）およびブロッキングオリゴヌクレオチド（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用する。例えば、キメラＤＮＡプライマーが利用されたテンプレート転換増幅は、特許文献１２；特許文献１４；特許文献１５において、かつ非特許文献２によって開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第２０１，１８４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５８２，７８８号明細書
【特許文献３】欧州特許第５０，４２４号明細書
【特許文献４】欧州特許第８４，７９６号明細書
【特許文献５】欧州特許第２５８，０１７号明細書
【特許文献６】欧州特許第２３７，３６２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，６８３，１９４号明細書
【特許文献８】米国特許第５，５０８，１７８号明細書
【特許文献９】米国特許第５，５９５，８９１号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６８３，８７９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１３０，２３８号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６７９，５１２号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，７４４，３０８号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９６２，２７２号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，２５１，６３９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．１９８６年、第５１巻：２６３−２７３頁
【非特許文献２】Ｐａｔｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６年、第９３巻：２９６９−２９７４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、既に記載した標的増幅方法は、いくつかの欠点を有する。例えば、転写ベースの増幅方法（例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ））は、プライマーによる増幅生成物の中へのポリメラーゼプロモーター配列の組み込みに対する必要性によって制限され、結果として、この方法は非特異的増幅となる傾向がある。現在の増幅方法の欠点の別の例は、異なる温度で最適な結合を有し得る２回の結合現象の必要性、ならびに天然に存在する配列を含むプライマーの使用である。この要因の組み合わせの結果、ミスプライミング（ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）の可能性が生じ、そして結果として標的配列以外の配列の増幅が生じる。
【００１０】
したがって、これらの欠点を克服する核酸増幅方法に対する必要性が存在する。本明細書中で提供される本発明は、この必要性を満たし、そしてさらなる利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
核酸増幅の新しい方法が、ここ発明され、この方法は、以下の工程：
ａ）テンプレート核酸配列にプライマーをアニーリングする工程であって、このプライマーは、テンプレートにアニーリングする第１の部分および所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）上記プライマーの第１の部分が上記テンプレートにアニーリングする位置と上記テンプレートの末端との間のテンプレートの部分にアニーリングし、かつ相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは第１の末端および第２の末端を有し、ここで、その第１の末端は上記プライマーを組み込む、工程；
ｃ）上記テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドの第２の末端に、ネステッドオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このネステッドオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの第２の末端にアニーリングする第１の部分およびプライマーの第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、上記所定の配列に相補的なこのポリヌクレオチドの末端部分を提供する、工程；ならびに
ｆ）所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する。
【００１２】
代替的な実施形態において、上記方法は、以下の工程：
ａ）テンプレート核酸配列に、プライマーおよび境界（ｂｏｕｎｄａｒｙ）オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このプライマーは、上記テンプレートにアニーリングする第１の部分および所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）上記プライマーの第１の部分がテンプレートにアニーリングする位置と上記境界オリゴヌクレオチドがアニーリングするテンプレートの部分との間のテンプレートの部分にアニーリングし、そしてそれに相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは第１の末端および第２の末端を有し、ここで、この第１の末端はプライマーを組み込む、工程；
ｃ）上記テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドの第２の末端に、ネステッドオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、このネステッドオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの第２の末端にアニーリングする第１の部分および上記プライマーの第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する、工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、上記所定の配列に相補的であるポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；ならびに
ｆ）上記所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する。
【００１３】
また、その第１の末端に所定の配列を有し、そしてその他方の末端に、この所定の配列と相補的な配列を有する人工核酸鎖が、それ自身本開示の新しい局面であることが企図される。
【００１４】
別の局面において、本開示は、核酸鎖を増幅する新しい方法を提供し、この方法は、その第１の末端に所定の配列を有し、そしてその他方の末端に、この所定の配列に相補的な配列を有する人工核酸鎖を提供する工程；およびポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下において、このヌクレオチドの重合のために適切な条件下で、上記人工核酸鎖と所定の配列を有するプライマーとを接触させる工程を包含する。
【００１５】
本明細書中に記載される増幅プロセスおよび人工テンプレートは、適切な発現ベクター中にライゲーションされ得る増幅生成物を調製するために使用され得る。次いで、このベクターは、標的配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を生成するために、標準的方法を使用して適切な宿主生物を形質転換するために使用され得る。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、例えば、抗体ライブラリーのような複雑なライブラリーを構築するための、関連する配列のファミリーを増幅するために使用される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートにプライマーをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；
ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの該第２の末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第２の末端にアニーリングする第１の部分および該プライマーの該第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する、工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；および
ｆ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、以下：
【化１】
からなる群より選択される配列を含む少なくとも１つのプライマーをアニーリングする工程を包含し、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである、方法。
（項目３）
項目１に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、ＩｇＡ抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする工程を包含する、方法。
（項目４）
抗体の少なくとも一部分をコードする核酸を増幅する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体の少なくとも一部分をコードするテンプレートに、プライマーおよび境界オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｂ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該境界オリゴヌクレオチドがアニーリングする該テンプレートの部分との間の該テンプレートの部分に相補的であるポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；
ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの該第２の末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第２の末端にアニーリングする第１の部分および該プライマーの該第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する工程；
ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的である該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する、工程；
ｆ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程
を包含する、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、以下：
【化２】
【化３】
からなる群より選択される配列を含む少なくとも１つのプライマーをアニーリングする工程を包含し、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである、方法。
（項目６）
項目４に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、ＩｇＡ抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする工程を包含する、方法。
（項目７）
抗体ライブラリーを作製する方法であって、以下の工程：
ａ）ＩｇＡ抗体の少なくとも一部分をコードする、多種多様なテンプレートの集団を提供する工程；
ｂ）該多種多様なテンプレートの集団と少なくとも１つのプライマーとを接触させる工程であって、該少なくとも１つのプライマーは、該テンプレートにアニーリングする第１の部分および該テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第２の部分を有する、工程；
ｃ）該プライマーの該第１の部分が該テンプレートにアニーリングする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的である、ポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは、その第１の末端において該プライマーを有し、かつ第２の末端を有する、工程；
ｄ）該テンプレートから、工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
ｅ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドの該第２の末端に、少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの該第２の末端にアニーリングする第１の部分および該プライマー該第２の部分と同一の所定の配列を有する第２の部分を有する、工程；
ｆ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的である該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；および
ｇ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用し、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程
を包含する、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、ここで、抗体の少なくとも一部分をコードするテンプテートにプライマーをアニーリングする上記工程が、以下：
【化４】
【化５】
からなる群より選択される配列を含む少なくとも１つのプライマーをアニーリングする工程を包含し、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである、方法。
（項目９）
項目７に記載の方法に従って調製された、ＩｇＡ抗体のライブラリー。
（項目１０）
所望の結合特異性を有する抗体を同定する方法であって、以下の工程：
項目７に記載の方法に従ってＩｇＡ抗体のライブラリーを調製する工程；および
該ライブラリーをスクリーニングして、所望の結合特異性を有する１つ以上のＩｇＡ抗体を同定する工程
を包含する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法に従って同定した、ＩｇＡ抗体。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】テンプレートにアニーリングした、プライマーおよび境界オリゴの概略図。
【図２Ａ】核酸鎖にアニーリングした、制限オリゴの概略図。
【図２Ｂ】短縮された５’末端を有するテンプレートにアニーリングした、プライマーの概略図。
【図３】代替の実施形態の概略図であって、ここで、複数ラウンドの重合が実施され、そして、制限オリゴヌクレオチドは、原テンプレートではなく新規に合成された鎖にアニールする。
【図４】新規に合成された核酸鎖にアニーリングした、ネステッドオリゴの概略図。
【図５】本開示に基づいた、人工テンプレートの概略図。
【図６】人工テンプレートの単一プライマー増幅の概略図。
【図７】ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔと名づけられたネステッドオリゴの配列を示す。
【図８ａ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｂ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｃ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｄ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図８ｅ】実施例３において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ａ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ｂ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ｃ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【図９ｄ】実施例５において生成された、単離されたＦａｂの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示は、標的核酸配列を増幅する方法を提供する。特に有用な実施形態において、上記標的核酸配列は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子である。本開示はまた、どのように増幅生成物をクローニングし、かつ適切な発現系において発現させ得るかを記載する。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、例えば、抗体ライブラリーのような複雑なライブラリーを構築するための、関連する配列のファミリーを増幅するために使用される。
【００１８】
上記標的核酸配列は、単一のプライマーのみを含むプロセスを介して指数関数的に増幅される。単一のプライマーを利用する（すなわち、各々異なった配列を有する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を使用する必要性が無い）能力は、増幅されるべき標的配列を含む核酸の鎖を操作することによって達成される。操作された核酸の鎖（本明細書中において、時折、「人工テンプレート」という）は、２つのテンプレート、すなわち、以下；
１）増幅されるべき配列を含む、天然核酸または合成核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である出発物質
２）ネステッドオリゴヌクレオチド
から調製される。上記出発物質は、原テンプレート（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と見なされ得る。上記ネステッドオリゴヌクレオチドは、操作された核酸の鎖の作製の間に、原テンプレートのヌクレオチド配列を伸長するためのテンプレートとして使用される。この操作された核酸の鎖は、一連の操作によって原テンプレートから作製され、その結果その反対端に相補的な配列が存在する。これは、単一のプライマーのみを使用する増幅を可能にする相補的な配列である。
【００１９】
精製形態または未精製形態のあらゆる核酸は、増幅されるべき標的核酸配列を含むか、または含むと思われる条件で、本明細書中に記載されるプロセスのための出発物質として利用され得る。したがって、このプロセスにおいて利用される出発物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（伝令ＲＮＡを含む）であり得、これらのＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに、各々の１つの鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用され得る。任意のこれらの核酸の混合物がまた利用され得るか、または同じかもしくは異なったプライマーを使用した本明細書における、これまでの増幅反応から生成された核酸が使用され得る。増幅されるべき標的核酸配列は、より大きい分子の一部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）であり得るか、または個々の分子（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として最初に存在し得る。この出発核酸は、同一であり得るかまたは異なり得る１つより多くの所望の標的核酸配列を含み得る。したがって、本プロセスは、大量の１種類の標的核酸配列の生成のためのみではなく、同一であるかまたは異なった核酸分子上に位置する１つより多くの異なる標的核酸配列を同時に増幅するためにも有用であり得る。
【００２０】
核酸は、任意の供給源（例えば：ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、プラスミド、クローニングされたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または任意の供給源（細菌、酵母、ウイルスおよび高等生物（例えば、植物もしくは動物）が挙げられる）に由来する天然のＤＮＡもしくはＲＮＡ）から得られ得る。核酸は、天然に存在し得るか、または全体的もしくは部分的に合成され得る。本発明において使用される核酸を獲得または生成するための技術は、当業者において周知である。核酸が２本の鎖を含む場合、それが原テンプレートとして使用され得る前に、別個の工程かまたはプライマー伸長生成物の合成と同時にかのいずれかとして、その核酸の鎖を分離する必要性がある。さらに、出発物質が第１鎖（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡである場合、第２鎖（ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡは、当業者の範囲内のプロセスによって有利に作製され得、そして原テンプレートとして使用され得、そこから人工テンプレートが作製される。
【００２１】
第１鎖ｃＤＮＡは、本方法のための特に有用な原テンプレートである。ＤＮＡテンプレートを生成するための適切な方法は当業者に公知であり、そして当業者によって容易に選択される。好ましい実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーおよび４つのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下において、任意のＲＮＡ出発物質に相補的であるＤＮＡの合成を逆転写酵素が触媒する反応において合成される。この反応は、ｍＲＮＡの３’末端に対するオリゴ−デオキシヌクレオチドプライマーのアニーリングによって開始され、続いて、上記ｍＲＮＡヌクレオチド配列と関連する塩基対形成により決定されるように、伸長する鎖の３’末端に対して適切なデオキシヌクレオシドが段階的に添加される。当業者において理解されるように、試料中の全てのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡ尾部への、オリゴｄＴのアニーリングを介した第１鎖ｃＤＮＡを生成のために使用され得る。
【００２２】
一旦原テンプレートが得られると、プライマー２０および境界オリゴヌクレオチド３０は、原テンプレート１０にアニーリングされる（図１を参照のこと）。上記プライマーの３’末端で始まり上記境界オリゴヌクレオチドのおよそ５’末端までの、上記原テンプレートの部分に相補的な核酸の鎖が重合化される。
【００２３】
上記原テンプレートにアニーリングした上記プライマー２０は、好ましくは上記原テンプレートにアニーリングしない所定の配列の第１の部分２２および上記原テンプレートにアニーリングする第２の部分２５を含み、そして必要に応じてその第１の部分と第２の部分との間に制限酵素認識部位２３を含む。上記プライマーは、増幅されるべき標的配列１２に隣接した原テンプレートにアニーリングする。図１に示されるように、上記プライマーは、増幅されるべき標的配列の上流の原テンプレートにアニーリングし得るか、または上記プライマーは、増幅されるべき標的配列１２の開始部（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）に重なり得ることが企図される。このプライマーの非アニーリング部分２２の所定の配列は、もともと上記原テンプレート中に存在するものではなく、そして以下に詳細に記載されるように、増幅処理の間に使用される単一のプライマーがハイブリダイズし得る配列を提供するように選択される。必要に応じて、上記所定の配列は、本明細書中の以下においてより十分に記載されるように、発現ベクター中への人工テンプレート部分の挿入のために有用な制限酵素認識部位を含み得る。
【００２４】
原テンプレートにアニーリングした境界オリゴヌクレオチド３０は、その核酸の重合を終結させる。核酸重合を終結させることが可能なあらゆるオリゴヌクレオチドが、境界オリゴヌクレオチド３０として利用され得る。好ましい実施形態において、上記境界オリゴヌクレオチドは、原テンプレート１０にアニーリングする第１の部分３５および伸長反応に影響されない第２の部分３２を含む。この境界オリゴを、伸長に関する部位としての作用から妨げるための技術は、当業者の範囲内である。一例として、上記境界オリゴ３０の部分３２は、図１に示されるように、原テンプレート１０にアニーリングしないように設計され得る。このような実施形態において、境界オリゴヌクレオチド３０はさらなる重合を妨げるが、その３’末端が原テンプレート１０にハイブリダイズしないので、核酸合成のためのプライマーとしては機能しない。代替的に、境界オリゴ３０の３’末端は、同じ効果を達成するために固定核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むように設計され得る。固定核酸は、例えば、ＷＯ ９９／１４２２６において開示され、その内容は本明細書中に参考として援用される。当業者は、境界オリゴの３’末端の伸長が起こらないことを保証する他の方法を構想する。
【００２５】
本明細書中に記載されるプライマーおよびオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知である、オリゴヌクレオチド合成のための確立された方法を使用して合成され得る。本発明のプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、モノマー−モノマー相互作用の規則的パターン（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能な、天然の、もしくは修飾されたモノマーまたは結合体（ｌｉｎｋａｇｅ）の線形オリゴマー（ｌｉｎｅａｒ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなど）を含む。通常、モノマーは、数単量体単位（例えば、３〜４）から数十単量体単位の大きさの範囲内のオリゴヌクレオチドを形成するために、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって結合する。プライマーは、代表的には一本鎖であるが、二本鎖にもなり得る。プライマーは、代表的にはデオキシリボ核酸であるが、当該分野において公知である種々の合成的プライマーおよび天然に存在するプライマーは、本開示の方法のために有用であり得る。プライマーは、テンプレートに相補的であり、そのプライマーは合成の開始のための部位として機能するためにハイブリダイズするように設計されるが、そのテンプレートの正確な配列を反映する必要性は無い。このような場合において、テンプレートへのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色素性部分、放射活性部分、または蛍光部分で標識され得、そして検出可能な部分として使用される。
【００２６】
核酸の重合は、当業者において公知である方法を使用して達成され得る。重合は、テンプレートの指示に従って遊離ヌクレオチドを順次付加するＤＮＡポリメラーゼを使用し、一般に酵素的に達成される。数種の異なるＤＮＡポリメラーゼが、本プロセスにおける使用のために適切である。ある実施形態において、選択の判定基準としては、エキソヌクレアーゼ活性を欠くこと、または強いエキソヌクレアーゼを有さないＤＮＡポリメラーゼであることが挙げられる。本プロセスにおける使用のための低いエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、天然の供給源から単離され得るか、または組み換えＤＮＡ技術を介して生成され得る。使用され得るポリメラーゼの例示的な例は、Ｔ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖ．２．０、エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、ＴａｑポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント、ｅｘｏ．−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ．（ｅｘｏ．−）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ．（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼであるが、これらに限定されない。
【００２７】
特に有用な実施形態において、出発物質の不必要な部分を消化により取り除くことによって、境界オリゴヌクレオチドの使用が避けられる。図２Ａにおいて模式的に示されるこの実施形態において、制限オリゴヌクレオチド７０は、あらかじめ選択しておいた位置で出発物質１００にアニーリングする。この制限オリゴヌクレオチドは、制限酵素認識部位７２を含む出発物質上に、二本鎖部分を提供する。適切な制限酵素認識部位としては、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、Ｎｈｅ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＩ、およびＰｖｕＩが挙げられるが、これらに限定されない。適切な制限酵素に曝露すると、上記出発物質は消化され、そしてその結果不必要な配列を取り除くために短くなる一方で、原テンプレート１１０として使用されるものの上で、増幅されるべき所望の標的配列１２（またはその一部分）は保存される。一旦原テンプレート１１０が得られると、プライマー２０は、上述の前の実施形態のように標的配列１２に隣接して、または重なって原テンプレート１１０にアニーリングされる（図２Ｂを参照のこと）。プライマー２０の３’末端と原テンプレート１１０の５’末端との間の原テンプレートの部分に相補的な核酸の鎖４０は、重合化される。当業者が理解するように、この実施形態において、制限オリゴヌクレオチドが原テンプレートを生成するために利用される場合、プライマー伸長は短くされた原テンプレート１１０の５’末端までの全てを進むことを可能にし得るので、境界オリゴヌクレオチドを使用する必要性は無い。
【００２８】
一旦重合が完了する（すなわち、伸長する鎖４０が境界ヌクレオチド３０または短くされた原テンプレート１１０の５’末端に到達する）と、新規に合成された相補鎖は、物理学的手段、化学的手段または酵素的手段を含む任意の適切な変性方法によって、原テンプレートから分離される。鎖の分離はまた、ヘリカーゼまたは酵素ＲｅｃＡとして公知の酵素のクラスに由来する酵素によって誘導されるＲｅｃＡは、ヘリカーゼ活性を有し、かつリボＡＴＰの存在下においてＤＮＡを変性させることで知られる。ヘリカーゼを用いた、核酸の鎖を分離するための適切な反応条件は、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第ＸＬＩＩＩ巻「ＤＮＡ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７８）、Ｂ．Ｋｕｈｎら、「ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅｓ」、ｐｐ．６３−６７によって記載され、そしてＲｅｃＡの使用に関する技術は、Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：４０５−３７（１９８２）において総説される。
【００２９】
したがって、新規に合成された相補鎖は、上記プライマー２０によって提供された配列（例えば、所定の配列２２、任意の制限酵素認識部位２３および上記プライマーのアニーリング部分２５）、ならびに、プライマー２０が原テンプレート１０にアニーリングした位置と、境界オリゴヌクレオチド３０にアニーリングした原テンプレート１０の部分かまたは原テンプレートの短くされた５’末端のいずれかとの間の原テンプレート１０の部分に相補的な、新規に合成された部分４５を含む。図４を参照のこと。
【００３０】
必要に応じて、続く工程の中で使用するための複数コピーの新規に合成された相補鎖を生成するために、原テンプレートおよびプライマーを使用した複数ラウンドの重合（好ましくは、１５ラウンド〜２５ラウンド）が実施される。このプロセス中のこの時点での複数コピーの新規に合成された相補鎖の作製は、（増幅の前に全長（ｅｎｔｉｒｅ）の人工テンプレートが生成されるまで待つ代わりに）最終的に生成された人工テンプレート中への標的配列の正確な複製の取り込みを確実にすることを援助する。原テンプレートに基づいた複数ラウンドの重合は、ライブラリーの全てのメンバーのより良い表現が達成されるより大きな可能性を提供すると考えられており、その結果、単一ラウンドの重合と比較して、より大きな多様性を提供する。
【００３１】
代替的な実施形態において、新規合成鎖は、上述のようにプライマー２０を原テンプレート１０にアニーリングし、そしてブロッキングオリゴヌクレオチドの存在も原テンプレートの部分除去のいずれも伴わずに複数ラウンドの重合を実施することによって生成される。この実施形態（これは、図３において図解的に示される）において、プライマーは、全長の新規合成鎖１４０を提供するために、原テンプレートの全長に沿って伸長される。次に、制限オリゴヌクレオチド１７０が、上記全長の新規合成鎖にハイブリダイゼーションされる。この制限オリゴヌクレオチドは、上記新規合成鎖上に制限酵素認識部位を含む二本鎖部分を提供する。適切な制限酵素認識部位としては、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、Ｎｈｅｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓａＪＩ、ＨｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＳａｃＩ、ＤｒａＩＩＩおよびＳｍａＩが挙げられるが、これらに限定されない。適切な制限酵素に曝すことにより、上記新規合成鎖は消化され、そしてその結果短縮される。次いで、ネステッドオリゴヌクレオチド５０は、以下により詳細に説明されるように、人工テンプレートの調製を完了させるために、短くされた新規合成鎖１４２にハイブリダイゼーションされる。
【００３２】
人工テンプレートの調製における次の工程は、例えば、図４において示されるように、ネステッドオリゴヌクレオチド５０を新規に合成された相補鎖の３’末端にアニーリングさせることに関する。図４において見られるように、ネステッドオリゴヌクレオチド５０は、人工テンプレートを完成させるために必要な、さらなる重合のためのテンプレートを提供する。ネステッドオリゴヌクレオチド５０は、新規に合成された相補鎖に対してハイブリダイゼーションしないおよび／または新規に合成された相補鎖に対して修飾された塩基を含む部分５２を含み、その結果、ネステッドオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能することを防いでいる。ネステッドオリゴヌクレオチド５０はまた、新規に合成された相補鎖の３’末端にハイブリダイゼーションする部分５５を含む。部分５５は、図４において示されるように、新規に合成された部分４５と重なり合い得るか、または新規に合成された部分４５を超えて伸長し得る。ネステッドオリゴヌクレオチド５０はまた、必要に応じて、制限酵素認識部位を規定する部分５６を含み得る。ネステッドオリゴヌクレオチド５０の最終部分５８は、プライマー２０の部分２２と同一な所定の配列を含む。部分５５が、新規に合成された相補鎖の初めの３’末端を越えて伸長する地点から、ネステッドオリゴヌクレオチドは、人工テンプレートを形成するためのさらなる重合のためのテンプレートとして機能する。ネステッドオリゴは、（原テンプレートの形成において、その一部分が短縮されていた場合）標的配列の一部分を含み得るか、もしくはポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子（またはその一部分）（例えば、１つ以上のＣＤＲ領域もしくはフレームワーク領域または抗体の定常領域）を含み得ることが、理解されるはずである。種々の配列を有するネステッドオリゴヌクレオチドの収集物が利用され得ることもまた企図され、その結果、多種多様な生成物のライブラリーをもたらす種々のテンプレートが提供される。このようにして、図４において示されるように、ネステッドオリゴヌクレオチドに相補的なさらなる核酸６０を付加することによって、重合は、新規に合成された相補鎖を伸長させる。重合を達成するための技術は、当業者の範囲内にある。前述のように、ある実施形態において、適切なポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素）の選択が好ましくあり得る。
【００３３】
一旦重合が完了すると、人工テンプレート１２０は、例えば、加熱変性のような当業者に周知の技術によって、ネステッドオリゴヌクレオチド５０から分離される。結果生じた人工テンプレート１２０は、初発プライマー２０由来である部分、原テンプレートの一部分に相補的な部分４５、およびネステッドオリゴヌクレオチドの一部分に相補的な部分６５を含む（図５を参照のこと）。注目すべきことに、人工テンプレート１２０の３’末端は、プライマー２０の部分２２の所定の配列に相補的な配列を含む、部分６８を含む。これは、当業者において公知の技術を使用し、プライマー部分２２の所定の配列と同一の配列を有する単一のプライマーを使用して、人工テンプレート１２０内に含まれる所望の配列を増幅することを可能にする。単一プライマー増幅の間、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが存在することは好ましい。なぜならば、このような酵素は「プルーフリーディング」機能を提供することが知られており、かつエキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリメラーゼと比較して相対的により高い伸長性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を有するからである。
【００３４】
図６は、新規に合成されたｃＤＮＡテンプレートの単一プライマー増幅に関連する工程を図示する。反応混合物中にプライマーが存在する場合、プライマーは、テンプレートに隣り合う配列にハイブリダイゼーションし、そしてこのテンプレートを増幅する。プライマーが存在しない場合は、５’末端の所定の配列とこの所定の配列に相補的な３’末端配列との間で、内部の自己アニーリングが存在すると考えられている。好ましい実施形態において、所定の配列および相補的な所定の配列は、単一プライマー増幅反応の間のミスプライミングを避けるために、より高い温度でアニーリングするように設計され得る。
【００３５】
増幅が実施された後、その生成物は、当業者において公知である任意の技術を使用して検出され得る。核酸を検出するために使用される方法の例としては、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション、制限酵素切断、一本鎖立体配座多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）、分析ゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、ヘアピンＦＲＥＴアッセイ（ｅｓｓａｙ）、およびＴａｑＭａｎアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
一旦人工核酸が所望される回数分増幅されると、その鎖を消化するために制限酵素認識部位２３および制限酵素認識部位６６または任意の内在性制限酵素認識部位が使用され得、そして標的核酸配列は、適切な発現ベクター中にライゲーションされ得る。次いで、このベクターは、標準の方法を使用して適切な宿主生物を形質転換するために使用され、標的領域によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質が生成される。
【００３７】
特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される方法は、抗体のｃＤＮＡを使用し、抗体またはその一部（例えば、可変領域（軽鎖または重鎖のいずれか））をコードする標的配列を増幅するために使用される。このようにして、抗体のライブラリーが増幅され得、そしてスクリーニングされ得る。したがって、例えば、抗体ｍＲＮＡで開始して、第１鎖ｃＤＮＡが生成され得、そして原テンプレートを提供するために消化され得る。プライマーは選択された相補性決定領域（ＣＤＲ）の上流にアニーリングするように設計され得、そしてこの新規合成核酸鎖は、ＣＤＲを含む。一例として、上記標的配列が重鎖ＣＤＲ３である場合、プライマーは、重鎖フレームワーク１（ＦＲ１）領域にアニーリングするように設計され得る。当業者は、本開示に基づき、他の上流部位にアニーリングする適切なプライマー、または抗体ｃＤＮＡ内の他に選択された標的を複製する適切なプライマーを、どのようにして設計するかを容易に想定する。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明の例証のために提供されるが、本発明を限定しない。
【００３９】
（実施例１）
（ＩｇＭ重鎖可変遺伝子のレパートリーの増幅）
（第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って、オリゴｄＴプライマーを用いて慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用した。この第１鎖ｃＤＮＡ生成物を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を通じて浄化した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドを上記第１鎖ｃＤＮＡに添加した。制限オリゴヌクレオチド（ＣＭＥｃｏＲＩ）の配列は、５’ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＧ ＴＣＧ３’（配列番号１）であった。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび０．１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップした。試料を２分間９５℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保った。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を上記試料に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この制限酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却した。
【００４０】
（第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
プライマー「ＴＭＸ２４ＶＨ３ａ」（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に加えて、ＥｃｏＲＩで消化された第１鎖ｃＤＮＡを、第２鎖ｃＤＮＡ反応における原テンプレートとして使用した。上記プライマーは、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。「ＴＭＸ２４ＶＨ３ａ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ
ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＲ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ３’（配列番号２）であり、Ｒは、塩基Ａおよび塩基Ｇの等モル混合物を意味する。上記試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で１分間を介する反応を２０回サイクルさせた。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＭ０」と命名されたネステッドオリゴを、次いで０．０８μＭの最終濃度となるように氷上で添加した。「ＴＭＸ２４ＣＭ０」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＧＡ３’（配列番号３）であった。これはその後のクローニング工程において使用されるＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このネステッドオリゴの３’末端は、逆結合（３’−５’よりもむしろ３’−３’）アデノシンの取り込みにより伸長を防ぐように設計される。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃５秒間で加熱変性し、次いで６８℃で１０秒間および９５℃で５秒間の４サイクルアニーリングおよび伸長させることによってネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて６８℃で３０秒間処理し、そして４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ、すなわち人工テンプレートを、次いでＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００４１】
（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびに５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４）の配列を有する単一のプライマー（ＴＭＸ２４）を使用して、上記人工テンプレートを増幅した。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３５回サイクルさせた。これ続いて、さらに６８℃で３分間反応させ、そして４℃で保持した。
【００４２】
（クローニングおよび配列決定）
約４５０ｂｐの増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。個々のクローンを取り出し、そしてそれらのＤＮＡ配列を決定した。分析した１６クローンの全てがＩｇＭ重鎖であり、各々が種々の長さの異なるＣＤＲ３配列を有していた。この結果は、この方法によって抗体鎖の多様な集団が増幅されたことを示す（表１を参照のこと）。
【００４３】
【表１】
。
【００４４】
（実施例２）
ＶＨ生成物をベクター中にクローニングするために、ネイティブＩｇＭ ＣＨ１定常領域が再構成され得、ＣＨ１中のＥｃｏＲＩ以外の部位を、上記第１鎖ｃＤＮＡエンドヌクレアーゼ消化のために利用した。当業者が理解するように、Ｔａｑポリメラーゼがこのプロトコールのために使用された場合、新規に合成されたＤＮＡ鎖の多くに末端のＡが付加される。多様性を最大化させるために、その末端のＡの存在をネステッドオリゴヌクレオチドの設計において考慮した。しかしながら、余剰なＡの存在は、ＥｃｏＲＩ認識部位の減少を招く。ＩｇＭ定常領域の分析は、他のネイティブ制限酵素認識部位が、この方法のために潜在的に使用され得ることを明らかにした（例えば、ＤｒａＩＩＩ）。ＣＨ１ドメイン中のＤｒａＩＩＩネイティブ制限酵素認識部位の使用の結果、上流ＥｃｏＲＩ部位が未修飾のまま残存し、そして重鎖レパートリーのクローニングのために使用され得る。重鎖インサートは、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって、ＥｃｏＲＩからＣＨ２ドメインに残存ＩｇＭ ＣＨ１ドメインを有する適切なベクター中にクローニングされる。
【００４５】
（第１鎖合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用した。これを、基本的にキットの指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して行った。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドを第１鎖ｃＤＮＡに添加した。この制限オリゴヌクレオチド（ＣＭＤｒａＩＩＩ）の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＡ ＣＡＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ Ｇ３’（配列番号２１）であった。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップした。試料を２分間９５℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持した。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、上記試料中に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ
ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。上記制限酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いでこの試料を４℃まで冷却した。
【００４６】
（第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
第２鎖ｃＤＮＡ反応において、プライマー「ＴＭＸ２４ＶＨ１ａ」（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に加えて、ＤｒａＩＩＩで消化された第１鎖ｃＤＮＡを原テンプレートとして使用した。上記プライマーは、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。「ＴＭＸ２４ＶＨ１ａ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＴＫ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ３’（配列番号２２）であり、Ｋは、塩基Ｇおよび塩基Ｔの等モル混合物を意味する。上記試料を９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０回サイクルさせた。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴを、次いで０．２μＭの最終濃度となるように氷上で添加した。図７において示されるように、「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」（配列番号２３）の配列は、オリゴヌクレオチドの伸長を防ぐように設計された、修飾された構造を有する３つの３’末端ヌクレオチドを含む。具体的には、上記ネステッドオリゴは、ホスホチオ酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）および伸長を防ぎかつエキソヌクレアーゼ活性ならびにエンドヌクレアーゼ活性に対して保護するために設計された２’ＯＭｅで修飾された、３つの末端ヌクレオチドを有する。このオリゴの３’末端オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしない（ｃの代わりにｇ）。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃１分間で加熱変性し、次いで６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ、または人工テンプレートを、次いでＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。この手順を繰り返し、そして、適切なベクターにクローニングされ得る免疫グロブリン生成物のライブラリーを生成するために、ＶＨプライマーパネル（ｐｒｉｍｅｒ ｐａｎｅｌ）（プライマーリストを参照のこと）の残りの部分を伸長した。
【００４７】
【化６】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＫはＧおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００４８】
（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
上記人工テンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰならびに５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４）の配列を有する単一のプライマー（ＴＭＸ２４）を使用して増幅した。その試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０回サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００４９】
（クローニングおよび配列決定）
約４５０ｂｐの増幅生成物をゲル精製し、そしてＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって消化する。ネイティブＥｃｏＲＩ由来のＩｇＭ ＣＨ１ドメインの残余部分を含み、ＣＨ２ドメインまでかまたはを含んで増幅されたフラグメントをクローニングするために適性のある制限酵素認識部位を含む任意の適切な発現ベクター中に、このインサートをクローニングする。
【００５０】
（実施例３）
（Ｂ型肝炎陽性ドナー由来のファージミドディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｍｉｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）の構築）
（ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡの合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、Ｂ型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用した。これは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。ＩｇＧについては制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩによって、またはκ軽鎖についてはＳａｃＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、ＩｇＧについては制限オリゴヌクレオチド「ＣＧＡｐａＬＩ」を、またはκ軽鎖については制限オリゴヌクレオチド「ＣＫＳａｃＩ」を第１鎖ｃＤＮＡに添加した。「ＣＧＡｐａＬＩ」配列は、５’ＣＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＴＧＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＴＣＣ３’（配列番号３９）である。「ＣＫＳａｃＩ」配列は、５’ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＴＣ３’（配列番号４０）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×反応緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてセットアップした。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持し、そして３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩまたはＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この制限酵素を、ＳａｃＩに関して６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却した。
【００５１】
各々の制限エンドヌクレアーゼによる上記第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者において公知である技術を使用し、ＰＣＲ増幅によって検証した。これらの生成物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を、ＩｇＧについて５’ＶＢＶＨ１ａ内部コントロールプライマーおよび３’ＣＧ０内部コントロールプライマーを、およびκについて５’ＶＢＶＫ１ａおよび３’ＣＫ０内部コントロールプライマーを使用した反応中で観察した。５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＧ０プライマーまたは５’ＶＢＶＫ１ａ／３’ＣＫ０プライマーを用いた良好な増幅および５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＧ１Ｚプライマーまたは５’ＶＫ１ａ／３’ＣＫ１ｄｘ２プライマーを用いたわずかな増幅は、各々の制限エンドヌクレアーゼを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良い消化を示す。ＰＣＲを検査するチェックのために使用されるプライマーの配列は、以下：
【００５２】
【化７】
である。
【００５３】
（軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＳａｃＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、κについて所定のＴＭＸ２４Ｋ配列５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４７）、ＸｂａＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）由来であり、これらは、公知のヒト抗体の配列に基づいて設計され、そしてκ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。
【００５４】
【化８】
【００５５】
【化９】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＹはＣおよびＴの同じ割合の混合物であり、ＷはＡおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００５６】
上記試料を９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクルさせた。これは、第２鎖ＤＮＡの線形増幅を可能にする。κ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」は、所定の配列ＴＭＸ２４Ｋを含み、そしてこの配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＣＴ３’（配列番号６１）であった。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間加熱変性させ、次いで６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させて、ネステッドオリゴからさらに伸長させ、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００５７】
（軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてのプライマー「ＴＭＸ２４Ｋ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４Ｋ」についての配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号６２）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００５８】
（軽鎖クローニング）
κ増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｂａＩおよびＳａｃＩによって消化した。そのインサートを、κ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するためにＤＮＡマキシプレップ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を実施した。次いで、ライブラリーの構築を完了させるために、ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩによる重鎖Ｆｄフラグメントのクローニングのための続く工程において、この軽鎖ライブラリーＤＮＡを使用した。
【００５９】
（重鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＡｐａＬＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして重鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。
【００６０】
【化１０】
【００６１】
【化１１】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＫはＧおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００６２】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクルさせた。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＧｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチド（配列５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＲＧＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＴＴ Ｇ３’（配列番号７７））を、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。図１に示されるように、ＩｇＭネステッドオリゴについて、オリゴ伸長を防ぐために、３つの３’末端ヌクレオチドを修飾した。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間でアニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長させ、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、次いでＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００６３】
（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、およびプライマー「ＴＭＸ２４」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせた。これに続いて６８℃でさらに３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００６４】
（重鎖クローニングおよびライブラリーの生成）
この増幅された生成物をプールし、次いでゲル精製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを、ＸｈｏＩ制限酵素およびＡｇｅＩ制限酵素で順次消化し、次いでゲル精製した。ＡｇｅＩ部位は、ＡｐａＬＩ部位の上流のＩｇＧ定常領域のＣＨ１中に、天然に存在する。ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で回収した。
【００６５】
軽鎖ライブラリーＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで順次消化し、次いでゲル精製した。この軽鎖ライブラリーＤＮＡを、上記重鎖フラグメントとライゲーションした。ライゲーションされたＤＮＡを、反応緩衝液を除去するためにスピンカラム（ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）上に置き、そしてこのＤＮＡを濃縮した。電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、最終形質転換を行った。
【００６６】
（ＨＢｓ Ａｇについてのライブラリーのパンニングおよびスクリーニング）
基本的に、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，ＣＦ、Ｂｕｒｔｏｎ，ＤＲ、Ｓｃｏｔｔ，ＪＫ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，ＧＪ（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、上記ライブラリーを、固定化ＨＢｓ Ａｇについて４ラウンドパンニングした。パンニングの第２ラウンド、第３ラウンド、および第４ラウンド由来である個々のクローンを、ＨＢｓ ＡｇについてのＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【００６７】
（λ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、Ｂ型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを使用した。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、上記第１鎖ｃＤＮＡに制限オリゴヌクレオチド「ＣＬＳｍａＩ」を添加した。「ＣＬＳｍａＩ」配列は、５’ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＹ ＧＴＧ３’（配列番号７８）であって、ここで、ＹはＣおよびＴの混合物である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×反応緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてセットアップした。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持し、そして３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この制限酵素を６５℃で加熱不活性化し、次いでその試料を４℃まで冷却した。
【００６８】
制限エンドヌクレアーゼによる上記第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者において公知である技術を使用し、ＰＣＲ増幅によって検証した。これらの生成物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。５’ＶＢＶＬ１ａ内部コントロールプライマーおよび３’ＣＬ０内部コントロールプライマーを使用した反応において、消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を観察した。５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＬ０プライマーを用いた良好な増幅および５’ＶＢＶＬ１ａ／３’ＣＬ２ｄｘ２プライマーを用いたわずかな増幅は、ＳｍａＩを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良い消化を示す。ＰＣＲの検査のためのプライマーの配列は、ＶＢＶＬ１ａ：５’ＧＡＣ ＧＣＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ３’（配列番号７９）、ＣＬ０：５’ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＹＧ ＧＧＡ ＡＣＡ Ｇ３’（配列番号８０）およびＣＬ２ｄｘ２：５’ＡＧＡ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＧＧ３’（配列番号８１）である。
【００６９】
（λ軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＳｍａＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、所定のＴＭＸ２４Ｌ配列、ＸｂａＩ部位、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そしてλ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。λ軽鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例４におけるものを使用する。
【００７０】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行った。これは、上記第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。実施例４において示されるような、「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチドを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。図７に示されるようなＩｇＭネステッドオリゴヌクレオチド「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」について、「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」の３’末端ヌクレオチドは、オリゴ伸長を防ぐように修飾される。第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性、６８℃で２分間でアニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴヌクレオチドからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して浄化した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００７１】
（λ軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにプライマー「ＴＭＸ２４Ｌ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４Ｌ」についての所定の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ３’（配列番号８２）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００７２】
（λ軽鎖クローニング）
λ軽鎖増幅生成物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって浄化し、そしてＸｂａＩおよびＳａｃＩによって消化した。そのインサートを、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲル精製し、そしてλ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、λ軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するためにＤＮＡマキシプレップ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を実施した。
【００７３】
（重鎖クローニングおよびＩｇＧλライブラリーの生成）
上記で調製したλ軽鎖ライブラリーＤＮＡを、前述されるように、ＩｇＧκライブラリーに対して調製した重鎖Ｆｄフラグメントの挿入のために、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで順次消化した。次いで、ライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、完全なＩｇＧλライブラリーＤＮＡを回収するために、ＤＮＡマキシプレップ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を実施した。
【００７４】
（ＨＢｓ Ａｇについてのライブラリーの選別およびスクリーニング）
ＩｇＧκライブラリーについて前述されたように、パンニングおよびスクリーニングを実施した。
【００７５】
（ＤＮＡ配列決定分析および単離されたＦａｂの性質決定）
ＥＬＩＳＡスクリーニングによって、ＨＢｓＡｇに対して特異的結合を示し、かつ非特異的タンパク質（オボアルブミン）に対して最低限の結合を示したクローンを、ＤＮＡ配列決定によって分析した。図８ａ〜図８ｅを参照のこと。ＨＢｓＡｇに対して、全部で３８の異なるＩｇＧκＦａｂ（２５重鎖および３７軽鎖）および１７の異なるＩｇＧλＦａｂ（１３重鎖および１６軽鎖）を、Ｂ型肝炎ワクチン接種を受けたドナー由来のＰＢＬ ｍＲＮＡから作製したライブラリーから単離した。
【００７６】
（実施例４）
（ヒトＰＢＬ ｍＲＮＡからのファージディスプレイライブラリーの構築）
（軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
ドナーからのヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて、基本的にキットの指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために使用した。κ軽鎖反応およびλ軽鎖反応を、別々にセットアップする。κ軽鎖については制限ヌクレアーゼＳａｃＩによって、またはλ軽鎖についてはＳｍａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに制限オリゴヌクレオチド「ＣＫＳａｃＩ」または「ＣＬＳｍａＩ」を添加する。複数のλ定常領域（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ６）がある場合、全ての機能的λ定常ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ６）の中で、ＳｍａＩ部位が保存されていることに注意することが重要である。「ＣＫＳａｃＩ」配列は、５’ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＴＣ３’（配列番号１７９）であり、「ＣＬＳｍａＩ」配列は５’ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＹ ＧＴＧ３’（配列番号１８０）であって、ここで、ＹはＣおよびＴの混合物である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持する。適切な量の１０×制限緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を上記試料に添加し、そして３７℃までさらに冷却する。制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩまたはＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。この制限酵素を、６５℃で２０分間加熱不活性化し、次いでこの試料を４℃まで冷却する。
【００７７】
（軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＳａｃＩ消化されたκ第１鎖ｃＤＮＡまたはＳｍａＩ消化されたλ第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用する。上記プライマーを、ＴＭＸ２４Ｋ（κについて）配列またはＴＭＸ２４Ｌ（λについて）配列、ＸｂａＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体κ鎖遺伝子またはヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）由来であり、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。κ軽鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例３におけるものを使用する。λ増幅における使用のためのプライマーのリストは、以下を参照のこと。
【００７８】
【化１２】
上記配列において、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＹはＣおよびＴの同じ割合の混合物であり、ＷはＡおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００７９】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、および５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行う。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。κ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチド、またはλ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチドを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加する。このネステッドオリゴヌクレオチドの配列は；「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＣＴ３’（配列番号１９６）および「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＫＡＴ ＳＡＧ ＲＣＡ ＣＡＧ３’（配列番号１９７）である。図７に示されるように、ＩｇＭネステッドオリゴについて、オリゴ伸長を防げるために３つの３’末端ヌクレオチドを修飾する。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にする。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して精製する。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００８０】
（軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてプライマー「ＴＭＸ２４Ｋ」を、またはλ鎖について「ＴＭＸ２４Ｌ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅する。「ＴＭＸ２４Ｋ」の配列は５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ３’（配列番号１９８）であり、そして「ＴＭＸ２４Ｌ」の配列は５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ３’（配列番号１９９）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクル行う。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持する。
【００８１】
（軽鎖クローニング）
κ増幅生成物およびλ増幅生成物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を使用して浄化し、そして別々にゲル精製した。これらの生成物を、ＸｂａＩおよびＳａｃＩによって消化した。そのインサートを、それぞれの軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するために、ＤＮＡマキシプレップを実施した。ライブラリーの構築を完了させるために、この軽鎖ライブラリーＤＮＡ調製物を、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩによる重鎖Ｆｄフラグメントの挿入のためのクローニングベクターとして使用した。
【００８２】
（重鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを使用する。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行う。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴヌクレオチドＣＭＤｒａＩＩＩを、第１鎖ｃＤＮＡに添加する。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。試料を２分間９５℃まで加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持する。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を上記試料中に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却する。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートし、次いで４℃まで冷却する。
【００８３】
ＤｒａＩＩＩによる第１鎖ｃＤＮＡの消化を、ＰＣＲ増幅によって検証する。増幅生成物は、抗体フラグメントのクローニングには使用されない。２つの異なる緩衝液条件下において、５’ＶＢＶＨ１ａ内部コントロールプライマーおよび３’ＣＭ０内部コントロールプライマーを使用した反応において、消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を観察する。５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＭ０プライマーを用いた良好な増幅、および５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＭ１プライマーを用いたわずかな増幅は、第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良いＤｒａＩＩＩ消化を示す。
【００８４】
（重鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＤｒａＩＩＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用する。上記プライマーを、ＴＭＸ２４配列、ＸｂａＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列は、ＶＢａｓｅデータベースプライマー由来であって、これらは公知のヒト抗体の配列に基づいて設計されており、そして実施例３において上述されるように、重鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されている。重鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例３において列挙されたものを使用する。
【００８５】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行う。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチド（実施例３において使用したもの）を、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加する。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長によって、ネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にする。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄する。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００８６】
（重鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにプライマー「ＴＭＸ２４」を使用し、上記人工テンプレートを増幅する。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクル行う。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持する。
【００８７】
（重鎖クローニングおよびライブラリーの生成）
約５００ｂｐの増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって消化する。ＩｇＭ ＣＨ１ドメインの残余部分を含む適切な発現ベクター中に、インサートをクローニングする。ライゲーションされたＦａｂライブラリーを含む生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入する。
【００８８】
バクテリオファージの表面上にＦａｂライブラリーを生成させるために、サプレッサー株の細胞（例えば、ＸＬ１ＢＬＵＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用する。続いてエレクトロポレーションに続いて、その細胞を３７℃で１時間振とうし、次いでカルベニシリンを２０μｇ／ｍｌまで添加する。３７℃で１時間の振とうの後、カルベニシリンを５０μｇ／ｍｌまで増やし、３７℃にさらに１時間置く。次いで、ファージミド粒子の生成のために必要な全ての成分を提供するため、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、そして培養物の容積をＳＢ培地で１００ｍｌまで増やす。３７℃で１時間後、ヘルパーファージＤＮＡを含む細菌を選択するために、７０μｇ／ｍｌまでカナマイシンを添加する。この培養物を、３７℃で一晩振とうする。その期間の間、上記細菌は、その表面上にＦａｂを有する新しいファージミド粒子を生成する。翌朝、このファージミド粒子は細菌細胞をスピンアウトすることによって単離され得、次いでこのファージミド粒子を、４％ ＰＥＧ ８０００および０．５Ｍ ＮａＣｌを用いて、氷上で３０分間上清から沈殿させる。１４，３００×ｇの遠沈によって、ファージペレットを沈殿させる。このペレットは、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中で再懸濁され得る。この調製物は、細菌性の破片を取り除くために、濾過され得る。結果生じたライブラリーを、４℃で保存する。
【００８９】
（実施例５）
（ＩｇＥまたは組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４で免疫されたマウスｍＲＮＡ由来のファージミドディスプレイライブラリーの構築）
（ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、ヒトＩｇＥまたは組み換えヒトＩｇＥで免疫されたマウス由来であるマウス脾臓ｍＲＮＡを使用した。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にキットの指示書に従って行った。ＩｇＧ１については制限エンドヌクレアーゼＸｃｍＩ、ＩｇＧ２ａについては制限エンドヌクレアーゼＢｓａＪＩ、またはκ軽鎖についてはＨｐａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、ＩｇＧ１については制限オリゴヌクレオチド「ｍＣＧ１ＸｃｍＩ」、ＩｇＧ２ａについては制限オリゴヌクレオチド「ｍＣＧ２ａＢｓａＪＩ」、またはκ軽鎖については制限オリゴヌクレオチド「ｍＣＫＨｐａＩ」を、第１鎖ｃＤＮＡに添加した。「ｍＣＧ１ＸｃｍＩ」配列は、５’ＣＴＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧ３’（配列番号２００）である。「ｍＣＧ２ａＢｓａＪＩ」配列は、５’ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＡＧ３’（配列番号２０１）であり、「ｍＣＫＨｐａＩ」配列は、５’ＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号２０２）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×ＮＥ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）または１０×反応緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてセットアップした。この試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持し、そしてＸｃｍＩおよびＨｐａＩについては３７℃まで冷却し、またＢｓａＪＩについては６０℃まで冷却した。上記制限エンドヌクレアーゼＸｃｍＩ、制限エンドヌクレアーゼＢｓａＪＩ、または制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、それぞれ、３７℃で３０分間、６０℃で３０分間、および３７℃で１０分間インキュベートした。上記制限酵素を、ＸｃｍＩについては６５℃で２０分間、およびＢｓａＪＩについては８０℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却した。
【００９０】
各々の制限エンドヌクレアーゼによる上記第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者において公知である技術を使用し、ＰＣＲ増幅によって検証した。これらの生成物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。ＩｇＧ１について５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型内部コントロールプライマーおよび３’ｍＣＧ１内部コントロールプライマーを、ＩｇＧ２ａについて５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＩＢ短縮型および３’ｍＣＧ２の内部コントロールプライマーを、そしてκについて５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶ短縮型および３’ｍＣＫ０内部コントロールプライマーを使用した反応において、消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性増幅物を観察した。５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ１プライマーもしくは５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ２ａプライマーまたは５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＶ短縮型／３’ｍＣＫ０プライマーを用いた良好な増幅、および５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ１Ｂプライマー、もしくは５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢ短縮型／３’ｍＣＧ２ａＢプライマーもしくはＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶ短縮型／３’ｍＣＫＢプライマーを用いたわずかな増幅は、各々の制限エンドヌクレアーゼを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾良い消化を示す。ＰＣＲの検査のために使用されるプライマーの配列は、以下：
【００９１】
【化１３】
【００９２】
【化１４】
である。
【００９３】
（軽鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＨｐａＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを、原テンプレートとして使用した。上記プライマーを、ＴＭＸ２４ｍＫ配列（κについて）、およびＸｂａＩ制限酵素認識部位、ならびにマウス抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。そしてκ軽鎖遺伝子の全マウス抗体レパートリーを網羅するために、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／）由来の公知のマウス抗体の配列に基づいて、これらのアニーリング配列を設計した。
【００９４】
【化１５】
ここで、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＫはＧおよびＴの同じ割合の混合物であり、ＷはＡおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【００９５】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行った。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。κ鎖について「ＴＭＸ２４ｍＣＫｎｏｅｒ」と命名されたネステッドオリゴヌクレオチドを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。「ＴＭ２４ＣＫｎｐｔ」の配列は；５’ＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＣＧＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ２’ＯＭｅ［Ａ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）］（プロピル）３’（配列番号２２０）である。上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させてネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【００９６】
（軽鎖単一プライマー増幅）
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてのプライマー「ＴＭＸ２４ｍＫ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４ｍＫ」についての配列は、５’ＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧ３’（配列番号２２１）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を２５サイクルさせた。これに続いてさらに６８℃で３分間処理し、そして４℃で保持した。
【００９７】
（軽鎖クローニング）
κ増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩによって消化した。そのインサートを、κ軽鎖定常領域の残余部分を含む適切な発現ベクター中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収するためにＤＮＡマキシプレップを実施した。次いで、以下の「（重鎖クローニング）」において記載されるようにライブラリーの構築を完了させるため、ＸｈｏＩ／ＢｌｎＩによる重鎖Ｆｄフラグメントをクローニングするための後の工程において、この軽鎖ライブラリーＤＮＡを使用した。
【００９８】
（重鎖第２鎖線形増幅およびネステッドオリゴ伸長）
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＸｃｍＩおよびＢｓａＪＩで消化された第１鎖ｃＤＮＡを使用した。上記プライマーを、ＴＭＸ２４ｍＨ配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位、およびマウス抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。そして重鎖遺伝子の全マウス抗体レパートリーを網羅するために、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／）由来の公知のマウス抗体の配列に基づいて、これらのアニーリング配列を設計した。
【００９９】
【化１６】
ここで、ＲはＡおよびＧの同じ割合の混合物であり、ＭはＡおよびＣの同じ割合の混合物であり、ＹはＣおよびＴの同じ割合の混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの同じ割合の混合物である。
【０１００】
上記試料を９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行った。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。ＩｇＧ１について「ＴＭＸ２４ｍＣＧ１ｎｏｅｒ」と命名されたネステッドオリゴおよびＩｇＧ２ａについて「ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ」と命名されたネステッドオリゴを、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加した。「ＴＭＸ２４ｍＣＧ１ｎｏｅｒ」の配列は；５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡ２’ＯＭｅ［Ｕ（ｐｓ）Ｃ（ｐｓ）Ａ（ｐｓ）］（プロピル）３’（配列番号２３０）であり、そして「ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ」の配列は；５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＣＡ２’ＯＭｅ［Ｃ（ｐｓ）Ａ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）］（プロピル）３’（配列番号２３１）である。
【０１０１】
上記第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の加熱変性、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長によって、ネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にした。結果生じた第２鎖ｃＤＮＡ（人工テンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【０１０２】
（重鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびに重鎖についてのプライマー「ＴＭＸ２４ｍＨ」を使用し、上記人工テンプレートを増幅した。「ＴＭＸ２４ｍＨ」についての配列は、５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧ３’（配列番号２３２）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を、ＩｇＧ１については２８サイクル、ＩｇＧ２ａについては３０サイクルさせた。これに続いて６８℃でさらに３分間処理し、そして４℃で保持した。
【０１０３】
（重鎖クローニング）
重鎖増幅生成物をゲル精製し、次いでＸｈｏＩおよびＢｌｎＩによって消化した。そのインサートを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについての重鎖定常領域の残余部分を含むκ鎖ライブラリーＤＮＡ中にクローニングした。このライゲーションされた生成物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩成長させた。翌朝、ＩｇＧ１κライブラリーＤＮＡまたはＩｇＧ２ａκライブラリーＤＮＡを回収するために、ＤＮＡマキシプレップを実施した。
【０１０４】
（組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４についてのライブラリーのパンニングおよびスクリーニング）
基本的に、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，ＣＦ、Ｂｕｒｔｏｎ，ＤＲ、Ｓｃｏｔｔ，ＪＫ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，ＧＪ（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、上記ライブラリーを、組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４について４ラウンドパンニングした。選別の第２ラウンド、第３ラウンド、および第４ラウンド由来の個々のクローンを、組み換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４についてのＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対して特異的結合を示し、かつ非特異的タンパク質（オボアルブミン）に対して最低限の結合を示したクローンを、ＤＮＡ配列決定によって分析した。ＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対して、全部で３１の異なるＦａｂを、マウスライブラリーから単離した。図９ａ〜図９ｄを参照のこと。
【０１０６】
（実施例６）
（ＩｇＡ抗体ライブラリーの構築）
（第１鎖ｃＤＮＡ合成および修飾）
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いた慣習的な第１鎖ｃＤＮＡを生成するために使用する。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、基本的にその指示書に従って行う。制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに制限オリゴヌクレオチド「ＣＡＢｓｒＧＩ」を添加する。「ＣＡＢｓｒＧＩ」の配列は、５’ＴＣＣ ＧＧＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＡＧＣ ＡＧ３’（配列番号２７９）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび０．１μＭオリゴヌクレオチドを用いてセットアップする。試料を９５℃まで２分間加熱し、次いで特異的アニーリングが起こり得るように６４℃で２分間保持する。適切な量の１０×制限緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を上記試料中に添加し、そしてさらに３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。この制限酵素を８０℃で２０分間加熱不活性化し、次いで試料を４℃まで冷却する。
【０１０７】
（第２鎖ｃＤＮＡ合成およびネステッドオリゴヌクレオチド伸長反応（ＮＯＥＲ））
フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応をセットアップするために、ＢｓｒＧＩ消化された第１鎖ｃＤＮＡを使用する。以下の表Ａ中に列挙されるプライマーは、ＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域における第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計された。これらのアニーリング配列は、公知のヒト抗体の配列に基づいて設計され、そして重鎖鎖遺伝子の全長ヒト抗体レパートリーを網羅すると報告されているＶｂａｓｅデータベースプライマー由来である。
【０１０８】
【化１７】
【０１０９】
【化１８】
上記配列の各々において、ＲはＡまたはＧであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＳはＣまたはＧである。
【０１１０】
上記試料を、９４℃で１分間加熱変性し、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間を介する反応を２０サイクル行う。これは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にする。次いで、伸長オリゴヌクレオチド「ＴＭＸ２４ＣＡｎｐｔ」を、氷上で０．２μＭの最終濃度となるように添加する。「ＴＭＸ２４ＣＡｎｐｔ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＴＣ３’（配列番号２９４）であって、ここで、ＲはＡまたはＧである。オリゴ伸長を防ぐために、３つの３’末端ヌクレオチドを修飾する。９４℃で１分間の加熱変性し、６８℃で２分間での伸長において上記第２鎖ｃＤＮＡをネステッドオリゴからさらに伸長し、続いて４℃にする。次いで、この第２鎖ｃＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ提供のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄する。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコールのための容易な緩衝液交換を可能にする。
【０１１１】
（単一プライマーＰＣＲ増幅）
Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにプライマー「ＴＭＸ２４」を使用し、上記第２鎖ｃＤＮＡの増幅を実施する。「ＴＭＸ２４」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号２９５）である。この試料を９５℃で１分間加熱変性し、次いで９５℃で５秒間および６８℃で１分間を介する反応を３０サイクルさせる。これに続いて６８℃でさらに３分間処理し、そして４℃で保持する。
【０１１２】
（クローニングおよび配列決定）
約５６０ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、ＸｈｏＩおよびＢｓｒＧＩによって消化し、ゲル精製し、そしてＩｇＡ ＣＨ１定常領域の残余部を有する適切なＦａｂ発現ベクター中にクローニングする。
【０１１３】
種々の改変が、本明細書中に記載される実施形態を構成し得ると考えられる。したがって、上記は、好ましい実施形態の限定として解釈されるべきではなく、単に、好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。当業者は、本開示の範囲および精神の範囲内で他の改変を構想する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の方法。
【請求項１】
本明細書に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図８ｄ】
【図８ｅ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図８ｄ】
【図８ｅ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【公開番号】特開２０１２−１５７３７１（Ｐ２０１２−１５７３７１Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１２２１０１（Ｐ２０１２−１２２１０１）
【出願日】平成２４年５月２９日（２０１２．５．２９）
【分割の表示】特願２００６−５４５８１４（Ｐ２００６−５４５８１４）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２２１０１（Ｐ２０１２−１２２１０１）
【出願日】平成２４年５月２９日（２０１２．５．２９）
【分割の表示】特願２００６−５４５８１４（Ｐ２００６−５４５８１４）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
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