人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法
【課題】廉価で製造可能な合成高分子化合物を利用し、薬物の脂質膜透過性を従来法よりもインビボでの薬物透過性と相関が高くかつ、煩雑な操作や難解な計算を用いることなく、効率的かつ短時間に評価する方法を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有し、分子量５０００乃至５０００００の高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
【解決手段】式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有し、分子量５０００乃至５０００００の高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質に類似した高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする、被験物質の膜透過性測定方法に関する。またさらには、当該人工膜を用いた膜透過性測定装置、膜透過性測定キットおよび当該方法によって得られた測定データに基づく被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口投与された医薬品の薬効成分（以下「薬物」という。）は消化管からの吸収、体内への分布過程を経て薬効を発揮し、代謝、排泄過程を経て体内から消失する。そして現在、優れた医薬品の具備すべき条件の一つに優れた吸収特性が挙げられており、吸収過程の評価は必須となっている。薬物の吸収過程は製剤からの薬物の溶出と、それに続く、薬物の消化管脂質膜透過の過程の二つに分類される。経口投与された医薬品は、薬物の水への溶解速度が十分に速い場合、その吸収の律速段階は消化管脂質膜透過性となる。従って、脂質膜透過性を何らかの方法で把握することは医薬品の開発において必須試験系の一つである。
また一方で、医薬品開発のコストは増大し、医薬品開発競争は激化していることから、脂質膜透過性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価には、生体における実際の消化管吸収性との高い相関性はもちろんのこと、さらに低コスト性や迅速性も求められている。したがって、これらの要望を満たす脂質膜透過性の評価方法が、医薬品の開発を低コストかつ効率的評価を進める上で望まれてきた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いる脂質膜透過の評価方法としては、従来、ＣａＣｏ−２やＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）などの単層細胞膜系を用いる方法、あるいは実験動物からの摘出臓器を用いる方法が用いられてきた（非特許文献１，２および３）。しかしながらこれらの方法は、長時間の細胞培養あるいは大量の動物の犠殺を必要とし、コスト、スループットおよび倫理上の問題などから、大規模スクリーニング系としては不十分である。
これに対し、脂質膜透過をｉｎ ｖｉｔｒｏで低コストかつ迅速に評価可能な方法として、前記のような生物由来の脂質膜ではなく、フィルターに脂質などを保持した人工脂質膜を用いる方法も知られるようになってきた。特に、Ｐａｒａｌｌｅｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（以下ＰＡＭＰＡ法）は広く利用されており（非特許文献４、５、６、７、８）、また、ＰＡＭＰＡ法に利用可能で更なる改良を加えた人工脂質膜も報告されている（特許文献１、２、非特許文献９、１０）。
しかしながら、これら既存の人工脂質膜を用いた方法では、被験物質の透過性が低いために、特に低透過性物質の評価に難点があった。また、ｉｎ ｖｉｖｏでの生体膜透過性との相関が悪い、測定時間が長い、データの解析方法が難解である、多種類の脂質を溶解する必要がある、或いは試験の準備が非常に煩雑などの課題もあった。
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｋａｗａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．,１３,４７２１−４７３０,２００５
【非特許文献２】Ｂｏｈｅｔ Ｈ.ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.,１（５）,３６７−３８３,２００１
【非特許文献３】Ｔｉａｎ．Ｒ．；Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．;１９（６）:８０２−８０９，２００２
【非特許文献４】Ｋａｎｓｙ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１、１００７−１０１０，１９９８
【非特許文献５】Ｓｕｇａｎｏ Ｋ.ｅｔ ａｌ．；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．,２５７，２４５−２５１,２００３
【非特許文献６】Ｗｏｈｎｓｌａｎｄ Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４，９２３−９３０，２００１
【非特許文献７】Ｓｃｍｍｉｄｔ Ｄ．ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，Ｌｉｔ． Ｎｏ． ＡＮ１７２５ＥＮ００，ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２００２
【非特許文献８】Ｓｃｍｍｉｄｔ Ｄ． ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，Ｌｉｔ． Ｎｏ． ＡＮ１７２９ＥＮ００，ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２００３
【非特許文献９】Ｒｕｅｌｌ Ｊ．Ａ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．；２２,３６５−３７４,２００４
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ＰＡＭＰＡ Ｍｏｄｅｌ” Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，２００８年１月１０日オンライン公開
【特許文献１】国際公開第０１／０７０３８０号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２２１４４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、廉価で製造可能な合成高分子化合物を利用し、薬物の脂質膜透過性を従来の方法よりもｉｎ ｖｉｖｏでの薬物透過性と相関が高くかつ、煩雑な操作や難解な計算を用いることなく、効率的かつ短時間に評価することを課題とする。また本発明の目的は、医薬品の開発を進める上で薬物の消化管吸収性を低コストに把握するために有用である、薬物の脂質膜透過性を評価する人工膜を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するため、人工膜に添加することで膜透過性を改良する化合物について鋭意探索を行ったところ、下記一般式で表される高分子化合物を含む人工膜が迅速な薬物の透過効果を有すること、さらにこの人工膜を用いる膜透過性測定方法がｉｎ ｖｉｖｏでの薬物透過性と高い相関を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下によって構成されるものである。
１）
式（Ｉ）
【化１】
［式中、ＸとＹの比率が９９：１乃至１：９９であり、ｎは２乃至１０の整数、Ｒは水素原子又はＯＲ１（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ1-８アルキル基又はＣ６-14アリール基を表す。）を意味する。］で表される繰り返し単位を有し、分子量が５０００乃至５０００００である高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
２）
式（Ｉ）のＸとＹの比率が１：２乃至１：３であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、かつ高分子化合物の分子量が２００００乃至２０００００の範囲であることを特徴とする１）に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
３）
（１）人工膜の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置する工程、（２）当該人工膜の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置する工程、（３）所定時間に当該人工膜及び溶液を一定温度に保つ工程、（４）前記一方面側及び／または前記他方面側の前記被験物質の量を測定する工程、及び（５）測定された量に基づき前記被験物質の膜透過性を評価する工程を含むことを特徴とする１）又は２）に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
４）
３）に記載の人工膜及び溶液を収容する容器から構成される膜透過性測定キット。
５）
３）に記載の膜透過性測定方法により得られた被験物質の膜透過性のデータに基づき、所望の被験物質を選択することを特徴とする被験物質のスクリーニング方法。
６）
被験物質が医薬品用途の薬剤である５）に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００５】
当該発明の方法により、低コスト、高スループットかつ迅速に、薬物の脂質膜透過性を評価する事ができる。すなわち、本発明の方法により作成された脂質透過性の評価キットは、医薬品の開発を低コストかつ迅速に進める上で有用であり、治療方法が確立していない疾患の薬剤治療の開発の可能性を高めるとともに、薬剤治療における最終的なコストを下げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本発明の方法における人工膜は、多孔質の支持体に高分子化合物を添加することにより構築される。このような支持体の形態としては、例えばシート状あるいは膜状の円形或いは四角形であることが望ましい。大きさは、円形の場合、直径０．０１〜４ｃｍ、好ましくは０．０５〜２ｃｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｃｍのものが用いられる。厚さは、好ましくは１０〜２００μｍ、さらに好ましくは２０〜１００μｍのものが用いられる。材質としては、例えば、ガラスファイバー、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリエーテル・サルフォン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）が使用できるが、より好ましくは、ＰＶＤＦが使用される。孔径は、好ましくは０．０１〜２０μｍ、より好ましくは０．０５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．１〜５μｍ、最も好ましくは０．１〜１μｍ程度のものが用いられる。
【０００７】
本発明の方法において、多孔質の支持体に添加される高分子化合物としては、以下の一般式で示される繰り返し単位を有する化合物が挙げられる。
式（Ｉ）
【化２】
当該高分子化合物の共重合成分である２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、例えば、２−ブロモエチルホスホリルジクロリドと２−ヒドロキシエチルメタクリレートを反応させ、２−メタクリロイルオキシエチル２’−ブロモエチルリン酸（ＭＢＰ）を得、このＭＢＰをトリメチルアミンのメタノール溶液中で反応させて得ることができる。一方の共重合成分であるメタクリル酸エステルの具体的な例としては、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸２−エトキシエチル、メタクリル酸２−エトキシプロピル、メタクリル酸２−フェノキシエチル、メタクリル酸２−ブトキシエチル、メタクリル酸３−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸３−メトキシプロピル、メタクリル酸３−フェノキシプロピル、メタクリル酸４−ヒドロキシブチル、メタクリル酸４−メトキシブチル、メタクリル酸４−フェノキシブチル等が挙げられる。この中では、メタクリル酸ブチルが最も好ましい。
【０００８】
当該高分子化合物の製造は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルを不活性ガスの雰囲気下でラジカル重合させることにより調製でき、更に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルの仕込み量を調節することにより、種々の比率の共重合体を得ることができる。その重合の好ましい比率としては、９９：１乃至１：９９であり、より好ましくは１：１乃至１：５であり、さらに好ましくは１：２乃至１：３である。また、当該高分子化合物の好ましい分子量の範囲は５０００乃至５００００００であるが、より好ましくは１００００乃至２００００００、さらに好ましくは２００００乃至２０００００、さらに特に好ましくは３００００乃至１０００００である。分子量の測定は、当該高分子化合物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒に溶解した後、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法を用いて計測することができる。この際、標準物質としてはポリスチレンなどを用いればよい。
【０００９】
当該高分子化合物を多孔質の支持体に添加する際、当該高分子化合物以外に、他の化合物をさらに添加してもよい。その例としては、炭化水素、アルコール、脂質などが挙げられる。炭化水素としては、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、不飽和でも飽和でも良い。好ましくはヘキサン、ドデカン、ヘキサデカン、ヘプタジエン、オクタジエン、ノナジエンなどが使用される。アルコールとしては、好ましくはエタノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロピルアルコール、ペンタノールなどが使用される。脂質としては、例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、リン脂質、ステロールなどが挙げられる。飽和脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸などがあげられる。不飽和脂肪酸としては、例えば、パルミトレイン酸、リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸などが挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。ステロールとしては、フィトステロール、コレステロールなどが挙げられる。これらの脂質については、ポリエチレングリコールなどで修飾されたものを使用してもよい。
【００１０】
以上に述べた炭化水素、アルコール、脂質などは、一種あるいは二種以上を混合して支持体上に添加してもよい。炭化水素、アルコール及び脂質を混合した場合、それらに対する当該高分子化合物の割合は、好ましくは０．００１〜１０（ｇ／１００ｍＬ）であり、さらに好ましくは、０．０５〜５（ｇ／１００ｍＬ）であり、特に好ましくは、０．1〜１（ｇ／１００ｍＬ）である。ここにおいて（ｇ／１００ｍＬ）は溶質１ｇを溶媒１００ｍＬに溶解させた場合の濃度を言う。これらの添加物の組成及び多孔質の支持体に対する含量は、評価対象となる被験物質の特徴等を考慮して適宜選択することができる。また上記の添加物以外にも、特定の物質を輸送する担体を支持体に含んでもよい。
【００１１】
本発明の方法における人工膜は、例えば、Ｋａｎｓｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，４１， １００７−１０１０，１９９８に記載された方法等に準じて作成することができる。
【００１２】
本発明の方法においては、人工膜を用いて被験物質の膜透過性を測定する工程を含むが、測定に使用する人工膜は、測定に先立って作成し保存しておいても、あるいは測定の直前に作成してもよい。作成された脂質膜の一方（Ａ側とする）に被験物質を含む溶液をおき、他方（Ｂ側とする）に被験物質を含まない溶媒をおく。このとき、Ｂ側の溶媒は、Ａ側の被験物質溶液の溶媒と同じものであることが好ましい。そして、所定の時間内に一定温度に保った（以下、インキュベートしたとも言う）後、Ａ側からＢ側へ人工膜を透過した被験物質の量を測定する。その際の温度は、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３５〜４０℃、さらに好ましくは３７℃程度である。また温度を保つ時間は、好ましくは５〜１８０分であり、より好ましくは１０〜１２０分、さらに好ましくは２０〜６０分である。この際、人工膜を透過した被験物質の量を直接定量するのみでなく、人工膜を透過しないでＢ側に残った被験物質の量を測定することで、人工膜を透過した被験物質の量を算出してもよい。
【００１３】
人工膜の設置方向は、重力に対していずれの方向であってもよく、例えば、重力に対して、平行に設置しても垂直に設置してもよい。また、被験物質を透過させる方向も特に制限されるものではなく、例えば、重力と同方向であっても逆方向であってもよく、垂直方向であってもよい。
【００１４】
測定に際しては、１つの容器を人工膜で２つの区画に分けて使用してもよいが、被験物質溶液を入れる容器と、被験物質を含まない溶媒を入れる容器を別々に用意してもよい。例えば、底部に多孔質の支持体が付いた筒状の上部容器と、トップが開放された下部容器とを組み合わせて使用することもできる。上部容器の下端部と下部容器の上端部が同じサイズであることが好ましい。下部容器に被験物質を含まない溶媒を満たし、上部容器を下部容器の上に載せ、多孔質の支持体上に本発明において記載された化合物を添加した後、上部容器に被験物質溶液を入れ、所定時間経過後に下部容器内の被験物質量を測定してもよい。上部容器と下部容器とは、上部容器のフィルターが下部容器の溶媒と接するようにセットする。上部容器と下部容器の間にフィルターを挟んだ状態で、上下容器の間から液が漏れないように固定できればよい。ゴムパッキングなどを利用してもよい。また、多孔質の支持体は、必ずしも上部容器の底部に固定されている必要はない。
【００１５】
また、複数の被験物質の膜透過性を迅速に測定するためには、複数のウェルを有するウェルプレートを使用することが好ましい。複数のウェルを有するウェルプレートを下部容器として使用し、各ウェル中に被験物質を含まない溶媒を満たし、その上を多孔質の支持体で覆ってから、各ウェルと適合する位置に貫通孔を有する上部プレート（上部容器として使用）を載せ、各貫通孔内の多孔質の支持体上に人工膜を形成し、被験物質溶液を入れてもよい。あるいは、上部プレートの各貫通孔の底部にフィルターが設けられていてもよい。例えば、細胞の走化性測定用などに用いられるチャンバープレートなどを利用してもよい。
【００１６】
いずれの場合においても、上部容器に被験物質を含まない溶媒を入れ、下部容器に被験物質溶液を入れてもよい。
【００１７】
人工膜を透過した被験物質の定量方法としては、例えば、吸光度測定法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）法、ガスクロマトグラフィ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）法、液体クロマトグラフィ−マススペクトル（ＬＣ−ＭＳ）法、蛍光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、赤外分光法、放射性同位元素法、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）法等を用いることができるが、好ましくは、吸光度、ＨＰＬＣ法、ＬＣ−ＭＳ法が用いられる。
【００１８】
本発明においては、下記の実施例に示したように、Ｋａｎｓｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１，１００７−１０１０，１９９８に記載の方法に準じて被験物質の膜透過性を測定したが、それ以外にも、例えば、Ｓｕｇａｎｏ Ｋ.ｅｔ ａｌ．；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．,２５７，２４１−２５１,２００３に記載の方法、Ｏｂａｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．；Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．；３０（２）,１８１−１８５,２００４に記載の方法、Ｒｕｅｌｌ Ｊ．Ａ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．；２２,３６５−３７４,２００４に記載の方法、ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．；１（４）：Ｅ１８、１９９９に記載の方法等に準じて被験物質の膜透過性を測定することができる。
【００１９】
本発明の人工膜を用いて被験物質をスクリーニングするには、上述のようにして、被験物質の膜透過性を測定し、所定の膜透過性を有する被験物質を選択する。このとき、何らかの基準物質を用いて、当該基準物質よりも膜透過性が高いものまたは低いものを選択してもよい。あるいは当該基準物質と同等の膜透過性を有する被験物質を選択してもよい。
【００２０】
本発明の方法において評価対象となる被験物質は、ヒト体内での消化管からの吸収特性を調べる要望のある物質であれば何でもよく、その生理活性、物性や構造などから制限されるものではない。被験物質の例としては、医薬品、薬物、農薬、農薬原体、食品添加物、医薬品として開発段階にある化合物、医薬品としての効果を評価するため収集した化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明のスクリーニングキットは、こうしたスクリーニング方法を迅速・簡便に行う上で役立つものであり、本発明の方法に記載された化合物、および使用説明書を含むものであるが、それ以外に、人工膜の支持体（例えば、フィルターペーパーなど）、膜透過性の測定に使用するウェルプレート、膜透過性測定時の基準物質、特定の物質を輸送する担体、被験物質溶解用の溶媒等を含んでもよい。また、本発明のスクリーニングキットは、ウェルプレートのウェル内に予め人工膜を形成したものであってもよく、例えば、支持体上に予め形成された人工膜を含んでもよい。
【００２２】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。例えば、調製される人工膜の厚さ、化合物濃度、溶媒、温度、時間、被験物質の濃度などは、評価対象となる被験物質に合わせて適宜変更できる。
【実施例】
【００２３】
（実施例１ 被験物質の膜透過性測定）
「人工脂質膜の調製」
式（Ｉ）に示される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体であり、ＸとＹの比率が３：７であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、分子量が約１０万であるＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ ＭＢ-３７-１００Ｔ（市販品；日油株式会社製）を０．３（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるようにヘキサノール：ドデカン＝１：２（ｖ：ｖ）の混合液に溶解した。得られた溶液の４〜５μＬをフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ 疎水性ＰＶＤＦ ＭＡＩＰＮ４５１０、孔径０．４５μｍ）の各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
「膜透過性の測定」
９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ９６Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ 疎水性ＰＶＤＦ ＭＡＩＰＮ４５１０）の各ウェル（容積３６０μL）を、Ｈａｎｋｓ‘Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を９．７ｇ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅを３．５ｇ，４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄを２．８６ｇ，炭酸水素ナトリウムを０．３７ｇの割合で水１Ｌに溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて、予めｐＨ７．３５に調整した溶液（以下、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ緩衝液と記す）で満たした後、フィルター部に人工脂質膜を形成したフィルタープレートをかぶせた。このとき、ウェルプレートのＴｒａｎｓｐｏｒｔ緩衝液とフィルタープレートの間に気泡が存在しないことを確認した。
１０〜５０％の割合でジメチルスルフォキシドを含有するＴｒａｎｓｐｏｒｔ緩衝液に、表１に示す被験物質群を各２ｍＭの濃度になるように溶解し、サンプル溶液を調整した。この際、被験物質は医薬品として販売されており、ヒトにおける消化管吸収率が報告されている化合物を選択した。調整された各被験物質のサンプル溶液を、人工脂質膜が形成されたフィルタープレート上に１５０μＬ添加し、カバープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ９６Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ ＭＡＩＰＮ４５１０）を置いて蓋をした。蓋をしてから０．５時間、３７℃でインキュベートを行った。カバープレートとフィルタープレートを取り除いた後、ウェルプレートの各ウェルの吸光度を２５０〜４５０ｎｍ（１０〜２０ｎｍ間隔）でマイクロプレートリーダーを用いて測定した。またこのとき、１０倍に希釈した標準液も同時にウェルプレートの空いている箇所に３００μＬの容量で添加し、試験液と同様に吸光度を測定した。
人工脂質膜に対する被験物質の透過性を示すパラメーターとして、膜透過クリアランス値を、当該分野にて一般的に用いられる原理に基づき、次式により算出した（参考文献：ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．；１（４）：Ｅ１８、１９９９）。
膜透過クリアランス値＝Ｃｏｇ×Ａａｃ／Ａｏｇ×Ｖａｃ／１０００／１０００／Ｔ／６０／６０／Ｓ
Ｃｏｇ；１０倍に希釈した標準液の初期濃度（この実施例では２００μＭ）
Ａｏｇ；１０倍に希釈した標準液のマイクロプレートリーダーより得られた吸光度
Ａａｃ；マイクロプレートリーダーより得られたサンプルの吸光度
Ｔ；インキュベーション時間（０．５時間）
Ｖａｃ；ウェルプレートに添加したトランスポート緩衝液の容積（ここでは２００μＬ）
Ｓ；膜表面積（ここでは０．２６６ｃｍ２）
さらに、実施例１〜２および比較例１〜４については、当該分野にて一般的に用いられる統計学的手法によりヒトにおける消化管吸収率と膜透過性クリアランス値の間の相関関係を解析した。すなわち、各化合物のヒトにおける消化管吸収率を縦軸に、得られた膜透過性クリアランス値の片対数値を横軸にとり、非線形最小２乗法により求められた近似直線に基づいて相関係数Ｒの２乗値である決定係数Ｒ２をマイクロソフトエクセル（商品名；マイクロソフト社製）により算出した。決定係数Ｒ２は、ヒトにおける消化管吸収率と膜透過性クリアランス値との間の相関性を示す指標であり、１に近いほど両者の間で相関性が優れるものと判断した。その結果を表１に示した。
【００２４】
（実施例２ 被験物質の膜透過性測定）
式（Ｉ）に示される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体であり、ＸとＹの比率が３：７であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、分子量が約３万であるＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ ＭＢ-３７-５０Ｔ（市販品；日油株式会社製）を０．３（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるようにヘキサノール：ドデカン＝１：２（ｖ：ｖ）の混合液に溶解した。得られた溶液の４〜５μＬをフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ 疎水性ＰＶＤＦ ＭＡＩＰＮ４５１０、孔径０．４５μｍ）の各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２５】
（比較例１）
Ｗｏｈｎｓｌａｎｄらの方法（非特許文献６）に従い、ヘキサデカンをヘキサンに５（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるように溶解した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２６】
（比較例２）
Ｋａｎｓｙらの方法をより最適化した方法として、Ｓｃｈｍｉｄｔらの方法（非特許文献７）が報告されている。本法に従い、ｌｅｃｉｔｈｉｎを４（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるように、ドデカンに溶解した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することによりフィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２７】
（比較例３）
Ｒｕｅｌｌ Ｊ．Ａ．らの方法（非特許文献９）に従い、1，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを２（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるように、ドデカンに溶解した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２８】
（比較例４）
Ｓｕｇａｎｏ Ｋ．らの方法（非特許文献５）に従い、Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌをそれぞれ、Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝０．８：０．２：０．８：０．２：１．０の割合で溶解した１，７−ｏｃｔａｄｉｅｎｅ溶液を作成した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２９】
表１に、実施例１〜２および比較例１〜４にて算出された膜透過性クリアランス値（ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、各化合物のヒトにおける消化管吸収率（Ｆａ（％））および決定係数Ｒ２を示した。なお、表中の「Ｅ．」は実施例を、「Ｒ．Ｅ．」は比較例を、「ｒｅｆ．」は被験物質のヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号を、「Ｎｏ．」は被験物質の化合物番号を示し、「−」は、被験物質の膜透過が見られなかったことを示している。また、被験物質の化合物番号及び被験物質名、並びに被験物質のヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号及び参考文献名は以下の通りである。
【００３０】
被験物質（化合物番号（Ｎｏ．）：名称）
１：アテノロール
２：アルプレノロール
３：スルピリド
４：クロザピン
５：プロプラノロール
６：フロセミド
７：塩酸ラニチジン
８：バルサルタン
９：スルファサラジン
１０：テルブタリン
１１：アシクロビル
１２：ピロキシカム
１３：ワルファリンナトリウム
１４：チモロールマレイン酸
１５：メトラゾン
１６：ラベタロール塩酸塩
１７：メソトレキセート
１８：ファモチジン
１９：ヒドロクロロチアジド
２０：テストステロン
２１：クロルプロマジン
２２：イミプラミン塩酸塩
２３：カルバマゼピン
２４：酢酸グアナベンズ
【００３１】
被験物質のヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献
（ヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号（ｒｅｆ．）：参考文献名）
１：Ｓｕｇａｎｏ Ｋ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．， ２４１， ２４１−２５１， ２００２
２：国際公開第０１／０７０３８０号パンフレット
３：Ｗｏｈｎｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４４， ９２３−９３０， ２００１
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１に見られるように、比較例１〜３では多くの被験物質が実施時間の中では人工脂質膜を通過できずに、クリアランス値が算出不能であり、決定係数Ｒ２も算出不能であった。また、比較例４においては、全ての被験物質でクリアランス値の算出が可能であったものの、文献から得られたヒトにおける消化管吸収率Ｆａ（％）との相関が悪かった。一方、実施例１、２は全ての被験物質でクリアランス値の算出が可能であり、ヒトにおける消化管吸収率Ｆａ（％）と優れた相関性が認められた。
これらのことから、本発明の方法は、０．５時間という短時間で被験物質の膜透過性測定が可能であり、比較例よりも医薬品である被験物質の膜透過性の測定において優れていることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法により、薬物の膜透過性をｉｎ ｖｉｖｏとの相関よく、迅速に測定できる。本方法は薬物のスクリーニングにおいて有用であるため、医薬品の創薬研究への応用が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質に類似した高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする、被験物質の膜透過性測定方法に関する。またさらには、当該人工膜を用いた膜透過性測定装置、膜透過性測定キットおよび当該方法によって得られた測定データに基づく被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口投与された医薬品の薬効成分（以下「薬物」という。）は消化管からの吸収、体内への分布過程を経て薬効を発揮し、代謝、排泄過程を経て体内から消失する。そして現在、優れた医薬品の具備すべき条件の一つに優れた吸収特性が挙げられており、吸収過程の評価は必須となっている。薬物の吸収過程は製剤からの薬物の溶出と、それに続く、薬物の消化管脂質膜透過の過程の二つに分類される。経口投与された医薬品は、薬物の水への溶解速度が十分に速い場合、その吸収の律速段階は消化管脂質膜透過性となる。従って、脂質膜透過性を何らかの方法で把握することは医薬品の開発において必須試験系の一つである。
また一方で、医薬品開発のコストは増大し、医薬品開発競争は激化していることから、脂質膜透過性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価には、生体における実際の消化管吸収性との高い相関性はもちろんのこと、さらに低コスト性や迅速性も求められている。したがって、これらの要望を満たす脂質膜透過性の評価方法が、医薬品の開発を低コストかつ効率的評価を進める上で望まれてきた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いる脂質膜透過の評価方法としては、従来、ＣａＣｏ−２やＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）などの単層細胞膜系を用いる方法、あるいは実験動物からの摘出臓器を用いる方法が用いられてきた（非特許文献１，２および３）。しかしながらこれらの方法は、長時間の細胞培養あるいは大量の動物の犠殺を必要とし、コスト、スループットおよび倫理上の問題などから、大規模スクリーニング系としては不十分である。
これに対し、脂質膜透過をｉｎ ｖｉｔｒｏで低コストかつ迅速に評価可能な方法として、前記のような生物由来の脂質膜ではなく、フィルターに脂質などを保持した人工脂質膜を用いる方法も知られるようになってきた。特に、Ｐａｒａｌｌｅｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（以下ＰＡＭＰＡ法）は広く利用されており（非特許文献４、５、６、７、８）、また、ＰＡＭＰＡ法に利用可能で更なる改良を加えた人工脂質膜も報告されている（特許文献１、２、非特許文献９、１０）。
しかしながら、これら既存の人工脂質膜を用いた方法では、被験物質の透過性が低いために、特に低透過性物質の評価に難点があった。また、ｉｎ ｖｉｖｏでの生体膜透過性との相関が悪い、測定時間が長い、データの解析方法が難解である、多種類の脂質を溶解する必要がある、或いは試験の準備が非常に煩雑などの課題もあった。
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｋａｗａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．,１３,４７２１−４７３０,２００５
【非特許文献２】Ｂｏｈｅｔ Ｈ.ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.,１（５）,３６７−３８３,２００１
【非特許文献３】Ｔｉａｎ．Ｒ．；Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．;１９（６）:８０２−８０９，２００２
【非特許文献４】Ｋａｎｓｙ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１、１００７−１０１０，１９９８
【非特許文献５】Ｓｕｇａｎｏ Ｋ.ｅｔ ａｌ．；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．,２５７，２４５−２５１,２００３
【非特許文献６】Ｗｏｈｎｓｌａｎｄ Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４，９２３−９３０，２００１
【非特許文献７】Ｓｃｍｍｉｄｔ Ｄ．ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，Ｌｉｔ． Ｎｏ． ＡＮ１７２５ＥＮ００，ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２００２
【非特許文献８】Ｓｃｍｍｉｄｔ Ｄ． ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，Ｌｉｔ． Ｎｏ． ＡＮ１７２９ＥＮ００，ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２００３
【非特許文献９】Ｒｕｅｌｌ Ｊ．Ａ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．；２２,３６５−３７４,２００４
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ＰＡＭＰＡ Ｍｏｄｅｌ” Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，２００８年１月１０日オンライン公開
【特許文献１】国際公開第０１／０７０３８０号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２２１４４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、廉価で製造可能な合成高分子化合物を利用し、薬物の脂質膜透過性を従来の方法よりもｉｎ ｖｉｖｏでの薬物透過性と相関が高くかつ、煩雑な操作や難解な計算を用いることなく、効率的かつ短時間に評価することを課題とする。また本発明の目的は、医薬品の開発を進める上で薬物の消化管吸収性を低コストに把握するために有用である、薬物の脂質膜透過性を評価する人工膜を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するため、人工膜に添加することで膜透過性を改良する化合物について鋭意探索を行ったところ、下記一般式で表される高分子化合物を含む人工膜が迅速な薬物の透過効果を有すること、さらにこの人工膜を用いる膜透過性測定方法がｉｎ ｖｉｖｏでの薬物透過性と高い相関を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下によって構成されるものである。
１）
式（Ｉ）
【化１】
［式中、ＸとＹの比率が９９：１乃至１：９９であり、ｎは２乃至１０の整数、Ｒは水素原子又はＯＲ１（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ1-８アルキル基又はＣ６-14アリール基を表す。）を意味する。］で表される繰り返し単位を有し、分子量が５０００乃至５０００００である高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
２）
式（Ｉ）のＸとＹの比率が１：２乃至１：３であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、かつ高分子化合物の分子量が２００００乃至２０００００の範囲であることを特徴とする１）に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
３）
（１）人工膜の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置する工程、（２）当該人工膜の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置する工程、（３）所定時間に当該人工膜及び溶液を一定温度に保つ工程、（４）前記一方面側及び／または前記他方面側の前記被験物質の量を測定する工程、及び（５）測定された量に基づき前記被験物質の膜透過性を評価する工程を含むことを特徴とする１）又は２）に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
４）
３）に記載の人工膜及び溶液を収容する容器から構成される膜透過性測定キット。
５）
３）に記載の膜透過性測定方法により得られた被験物質の膜透過性のデータに基づき、所望の被験物質を選択することを特徴とする被験物質のスクリーニング方法。
６）
被験物質が医薬品用途の薬剤である５）に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００５】
当該発明の方法により、低コスト、高スループットかつ迅速に、薬物の脂質膜透過性を評価する事ができる。すなわち、本発明の方法により作成された脂質透過性の評価キットは、医薬品の開発を低コストかつ迅速に進める上で有用であり、治療方法が確立していない疾患の薬剤治療の開発の可能性を高めるとともに、薬剤治療における最終的なコストを下げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本発明の方法における人工膜は、多孔質の支持体に高分子化合物を添加することにより構築される。このような支持体の形態としては、例えばシート状あるいは膜状の円形或いは四角形であることが望ましい。大きさは、円形の場合、直径０．０１〜４ｃｍ、好ましくは０．０５〜２ｃｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｃｍのものが用いられる。厚さは、好ましくは１０〜２００μｍ、さらに好ましくは２０〜１００μｍのものが用いられる。材質としては、例えば、ガラスファイバー、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリエーテル・サルフォン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）が使用できるが、より好ましくは、ＰＶＤＦが使用される。孔径は、好ましくは０．０１〜２０μｍ、より好ましくは０．０５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．１〜５μｍ、最も好ましくは０．１〜１μｍ程度のものが用いられる。
【０００７】
本発明の方法において、多孔質の支持体に添加される高分子化合物としては、以下の一般式で示される繰り返し単位を有する化合物が挙げられる。
式（Ｉ）
【化２】
当該高分子化合物の共重合成分である２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、例えば、２−ブロモエチルホスホリルジクロリドと２−ヒドロキシエチルメタクリレートを反応させ、２−メタクリロイルオキシエチル２’−ブロモエチルリン酸（ＭＢＰ）を得、このＭＢＰをトリメチルアミンのメタノール溶液中で反応させて得ることができる。一方の共重合成分であるメタクリル酸エステルの具体的な例としては、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸２−エトキシエチル、メタクリル酸２−エトキシプロピル、メタクリル酸２−フェノキシエチル、メタクリル酸２−ブトキシエチル、メタクリル酸３−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸３−メトキシプロピル、メタクリル酸３−フェノキシプロピル、メタクリル酸４−ヒドロキシブチル、メタクリル酸４−メトキシブチル、メタクリル酸４−フェノキシブチル等が挙げられる。この中では、メタクリル酸ブチルが最も好ましい。
【０００８】
当該高分子化合物の製造は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルを不活性ガスの雰囲気下でラジカル重合させることにより調製でき、更に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルの仕込み量を調節することにより、種々の比率の共重合体を得ることができる。その重合の好ましい比率としては、９９：１乃至１：９９であり、より好ましくは１：１乃至１：５であり、さらに好ましくは１：２乃至１：３である。また、当該高分子化合物の好ましい分子量の範囲は５０００乃至５００００００であるが、より好ましくは１００００乃至２００００００、さらに好ましくは２００００乃至２０００００、さらに特に好ましくは３００００乃至１０００００である。分子量の測定は、当該高分子化合物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒に溶解した後、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法を用いて計測することができる。この際、標準物質としてはポリスチレンなどを用いればよい。
【０００９】
当該高分子化合物を多孔質の支持体に添加する際、当該高分子化合物以外に、他の化合物をさらに添加してもよい。その例としては、炭化水素、アルコール、脂質などが挙げられる。炭化水素としては、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、不飽和でも飽和でも良い。好ましくはヘキサン、ドデカン、ヘキサデカン、ヘプタジエン、オクタジエン、ノナジエンなどが使用される。アルコールとしては、好ましくはエタノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロピルアルコール、ペンタノールなどが使用される。脂質としては、例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、リン脂質、ステロールなどが挙げられる。飽和脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸などがあげられる。不飽和脂肪酸としては、例えば、パルミトレイン酸、リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸などが挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。ステロールとしては、フィトステロール、コレステロールなどが挙げられる。これらの脂質については、ポリエチレングリコールなどで修飾されたものを使用してもよい。
【００１０】
以上に述べた炭化水素、アルコール、脂質などは、一種あるいは二種以上を混合して支持体上に添加してもよい。炭化水素、アルコール及び脂質を混合した場合、それらに対する当該高分子化合物の割合は、好ましくは０．００１〜１０（ｇ／１００ｍＬ）であり、さらに好ましくは、０．０５〜５（ｇ／１００ｍＬ）であり、特に好ましくは、０．1〜１（ｇ／１００ｍＬ）である。ここにおいて（ｇ／１００ｍＬ）は溶質１ｇを溶媒１００ｍＬに溶解させた場合の濃度を言う。これらの添加物の組成及び多孔質の支持体に対する含量は、評価対象となる被験物質の特徴等を考慮して適宜選択することができる。また上記の添加物以外にも、特定の物質を輸送する担体を支持体に含んでもよい。
【００１１】
本発明の方法における人工膜は、例えば、Ｋａｎｓｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，４１， １００７−１０１０，１９９８に記載された方法等に準じて作成することができる。
【００１２】
本発明の方法においては、人工膜を用いて被験物質の膜透過性を測定する工程を含むが、測定に使用する人工膜は、測定に先立って作成し保存しておいても、あるいは測定の直前に作成してもよい。作成された脂質膜の一方（Ａ側とする）に被験物質を含む溶液をおき、他方（Ｂ側とする）に被験物質を含まない溶媒をおく。このとき、Ｂ側の溶媒は、Ａ側の被験物質溶液の溶媒と同じものであることが好ましい。そして、所定の時間内に一定温度に保った（以下、インキュベートしたとも言う）後、Ａ側からＢ側へ人工膜を透過した被験物質の量を測定する。その際の温度は、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３５〜４０℃、さらに好ましくは３７℃程度である。また温度を保つ時間は、好ましくは５〜１８０分であり、より好ましくは１０〜１２０分、さらに好ましくは２０〜６０分である。この際、人工膜を透過した被験物質の量を直接定量するのみでなく、人工膜を透過しないでＢ側に残った被験物質の量を測定することで、人工膜を透過した被験物質の量を算出してもよい。
【００１３】
人工膜の設置方向は、重力に対していずれの方向であってもよく、例えば、重力に対して、平行に設置しても垂直に設置してもよい。また、被験物質を透過させる方向も特に制限されるものではなく、例えば、重力と同方向であっても逆方向であってもよく、垂直方向であってもよい。
【００１４】
測定に際しては、１つの容器を人工膜で２つの区画に分けて使用してもよいが、被験物質溶液を入れる容器と、被験物質を含まない溶媒を入れる容器を別々に用意してもよい。例えば、底部に多孔質の支持体が付いた筒状の上部容器と、トップが開放された下部容器とを組み合わせて使用することもできる。上部容器の下端部と下部容器の上端部が同じサイズであることが好ましい。下部容器に被験物質を含まない溶媒を満たし、上部容器を下部容器の上に載せ、多孔質の支持体上に本発明において記載された化合物を添加した後、上部容器に被験物質溶液を入れ、所定時間経過後に下部容器内の被験物質量を測定してもよい。上部容器と下部容器とは、上部容器のフィルターが下部容器の溶媒と接するようにセットする。上部容器と下部容器の間にフィルターを挟んだ状態で、上下容器の間から液が漏れないように固定できればよい。ゴムパッキングなどを利用してもよい。また、多孔質の支持体は、必ずしも上部容器の底部に固定されている必要はない。
【００１５】
また、複数の被験物質の膜透過性を迅速に測定するためには、複数のウェルを有するウェルプレートを使用することが好ましい。複数のウェルを有するウェルプレートを下部容器として使用し、各ウェル中に被験物質を含まない溶媒を満たし、その上を多孔質の支持体で覆ってから、各ウェルと適合する位置に貫通孔を有する上部プレート（上部容器として使用）を載せ、各貫通孔内の多孔質の支持体上に人工膜を形成し、被験物質溶液を入れてもよい。あるいは、上部プレートの各貫通孔の底部にフィルターが設けられていてもよい。例えば、細胞の走化性測定用などに用いられるチャンバープレートなどを利用してもよい。
【００１６】
いずれの場合においても、上部容器に被験物質を含まない溶媒を入れ、下部容器に被験物質溶液を入れてもよい。
【００１７】
人工膜を透過した被験物質の定量方法としては、例えば、吸光度測定法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）法、ガスクロマトグラフィ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）法、液体クロマトグラフィ−マススペクトル（ＬＣ−ＭＳ）法、蛍光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、赤外分光法、放射性同位元素法、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）法等を用いることができるが、好ましくは、吸光度、ＨＰＬＣ法、ＬＣ−ＭＳ法が用いられる。
【００１８】
本発明においては、下記の実施例に示したように、Ｋａｎｓｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１，１００７−１０１０，１９９８に記載の方法に準じて被験物質の膜透過性を測定したが、それ以外にも、例えば、Ｓｕｇａｎｏ Ｋ.ｅｔ ａｌ．；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．,２５７，２４１−２５１,２００３に記載の方法、Ｏｂａｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．；Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．；３０（２）,１８１−１８５,２００４に記載の方法、Ｒｕｅｌｌ Ｊ．Ａ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．；２２,３６５−３７４,２００４に記載の方法、ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．；１（４）：Ｅ１８、１９９９に記載の方法等に準じて被験物質の膜透過性を測定することができる。
【００１９】
本発明の人工膜を用いて被験物質をスクリーニングするには、上述のようにして、被験物質の膜透過性を測定し、所定の膜透過性を有する被験物質を選択する。このとき、何らかの基準物質を用いて、当該基準物質よりも膜透過性が高いものまたは低いものを選択してもよい。あるいは当該基準物質と同等の膜透過性を有する被験物質を選択してもよい。
【００２０】
本発明の方法において評価対象となる被験物質は、ヒト体内での消化管からの吸収特性を調べる要望のある物質であれば何でもよく、その生理活性、物性や構造などから制限されるものではない。被験物質の例としては、医薬品、薬物、農薬、農薬原体、食品添加物、医薬品として開発段階にある化合物、医薬品としての効果を評価するため収集した化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明のスクリーニングキットは、こうしたスクリーニング方法を迅速・簡便に行う上で役立つものであり、本発明の方法に記載された化合物、および使用説明書を含むものであるが、それ以外に、人工膜の支持体（例えば、フィルターペーパーなど）、膜透過性の測定に使用するウェルプレート、膜透過性測定時の基準物質、特定の物質を輸送する担体、被験物質溶解用の溶媒等を含んでもよい。また、本発明のスクリーニングキットは、ウェルプレートのウェル内に予め人工膜を形成したものであってもよく、例えば、支持体上に予め形成された人工膜を含んでもよい。
【００２２】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。例えば、調製される人工膜の厚さ、化合物濃度、溶媒、温度、時間、被験物質の濃度などは、評価対象となる被験物質に合わせて適宜変更できる。
【実施例】
【００２３】
（実施例１ 被験物質の膜透過性測定）
「人工脂質膜の調製」
式（Ｉ）に示される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体であり、ＸとＹの比率が３：７であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、分子量が約１０万であるＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ ＭＢ-３７-１００Ｔ（市販品；日油株式会社製）を０．３（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるようにヘキサノール：ドデカン＝１：２（ｖ：ｖ）の混合液に溶解した。得られた溶液の４〜５μＬをフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ 疎水性ＰＶＤＦ ＭＡＩＰＮ４５１０、孔径０．４５μｍ）の各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
「膜透過性の測定」
９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ９６Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ 疎水性ＰＶＤＦ ＭＡＩＰＮ４５１０）の各ウェル（容積３６０μL）を、Ｈａｎｋｓ‘Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を９．７ｇ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅを３．５ｇ，４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄを２．８６ｇ，炭酸水素ナトリウムを０．３７ｇの割合で水１Ｌに溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて、予めｐＨ７．３５に調整した溶液（以下、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ緩衝液と記す）で満たした後、フィルター部に人工脂質膜を形成したフィルタープレートをかぶせた。このとき、ウェルプレートのＴｒａｎｓｐｏｒｔ緩衝液とフィルタープレートの間に気泡が存在しないことを確認した。
１０〜５０％の割合でジメチルスルフォキシドを含有するＴｒａｎｓｐｏｒｔ緩衝液に、表１に示す被験物質群を各２ｍＭの濃度になるように溶解し、サンプル溶液を調整した。この際、被験物質は医薬品として販売されており、ヒトにおける消化管吸収率が報告されている化合物を選択した。調整された各被験物質のサンプル溶液を、人工脂質膜が形成されたフィルタープレート上に１５０μＬ添加し、カバープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ９６Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ ＭＡＩＰＮ４５１０）を置いて蓋をした。蓋をしてから０．５時間、３７℃でインキュベートを行った。カバープレートとフィルタープレートを取り除いた後、ウェルプレートの各ウェルの吸光度を２５０〜４５０ｎｍ（１０〜２０ｎｍ間隔）でマイクロプレートリーダーを用いて測定した。またこのとき、１０倍に希釈した標準液も同時にウェルプレートの空いている箇所に３００μＬの容量で添加し、試験液と同様に吸光度を測定した。
人工脂質膜に対する被験物質の透過性を示すパラメーターとして、膜透過クリアランス値を、当該分野にて一般的に用いられる原理に基づき、次式により算出した（参考文献：ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．；１（４）：Ｅ１８、１９９９）。
膜透過クリアランス値＝Ｃｏｇ×Ａａｃ／Ａｏｇ×Ｖａｃ／１０００／１０００／Ｔ／６０／６０／Ｓ
Ｃｏｇ；１０倍に希釈した標準液の初期濃度（この実施例では２００μＭ）
Ａｏｇ；１０倍に希釈した標準液のマイクロプレートリーダーより得られた吸光度
Ａａｃ；マイクロプレートリーダーより得られたサンプルの吸光度
Ｔ；インキュベーション時間（０．５時間）
Ｖａｃ；ウェルプレートに添加したトランスポート緩衝液の容積（ここでは２００μＬ）
Ｓ；膜表面積（ここでは０．２６６ｃｍ２）
さらに、実施例１〜２および比較例１〜４については、当該分野にて一般的に用いられる統計学的手法によりヒトにおける消化管吸収率と膜透過性クリアランス値の間の相関関係を解析した。すなわち、各化合物のヒトにおける消化管吸収率を縦軸に、得られた膜透過性クリアランス値の片対数値を横軸にとり、非線形最小２乗法により求められた近似直線に基づいて相関係数Ｒの２乗値である決定係数Ｒ２をマイクロソフトエクセル（商品名；マイクロソフト社製）により算出した。決定係数Ｒ２は、ヒトにおける消化管吸収率と膜透過性クリアランス値との間の相関性を示す指標であり、１に近いほど両者の間で相関性が優れるものと判断した。その結果を表１に示した。
【００２４】
（実施例２ 被験物質の膜透過性測定）
式（Ｉ）に示される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体であり、ＸとＹの比率が３：７であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、分子量が約３万であるＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ ＭＢ-３７-５０Ｔ（市販品；日油株式会社製）を０．３（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるようにヘキサノール：ドデカン＝１：２（ｖ：ｖ）の混合液に溶解した。得られた溶液の４〜５μＬをフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ 疎水性ＰＶＤＦ ＭＡＩＰＮ４５１０、孔径０．４５μｍ）の各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２５】
（比較例１）
Ｗｏｈｎｓｌａｎｄらの方法（非特許文献６）に従い、ヘキサデカンをヘキサンに５（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるように溶解した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２６】
（比較例２）
Ｋａｎｓｙらの方法をより最適化した方法として、Ｓｃｈｍｉｄｔらの方法（非特許文献７）が報告されている。本法に従い、ｌｅｃｉｔｈｉｎを４（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるように、ドデカンに溶解した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することによりフィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２７】
（比較例３）
Ｒｕｅｌｌ Ｊ．Ａ．らの方法（非特許文献９）に従い、1，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを２（ｇ／１００ｍＬ）の濃度になるように、ドデカンに溶解した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２８】
（比較例４）
Ｓｕｇａｎｏ Ｋ．らの方法（非特許文献５）に従い、Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌをそれぞれ、Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝０．８：０．２：０．８：０．２：１．０の割合で溶解した１，７−ｏｃｔａｄｉｅｎｅ溶液を作成した。得られた溶液の４〜５μＬを実施例１と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例１と同様の方法にて行った。
【００２９】
表１に、実施例１〜２および比較例１〜４にて算出された膜透過性クリアランス値（ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、各化合物のヒトにおける消化管吸収率（Ｆａ（％））および決定係数Ｒ２を示した。なお、表中の「Ｅ．」は実施例を、「Ｒ．Ｅ．」は比較例を、「ｒｅｆ．」は被験物質のヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号を、「Ｎｏ．」は被験物質の化合物番号を示し、「−」は、被験物質の膜透過が見られなかったことを示している。また、被験物質の化合物番号及び被験物質名、並びに被験物質のヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号及び参考文献名は以下の通りである。
【００３０】
被験物質（化合物番号（Ｎｏ．）：名称）
１：アテノロール
２：アルプレノロール
３：スルピリド
４：クロザピン
５：プロプラノロール
６：フロセミド
７：塩酸ラニチジン
８：バルサルタン
９：スルファサラジン
１０：テルブタリン
１１：アシクロビル
１２：ピロキシカム
１３：ワルファリンナトリウム
１４：チモロールマレイン酸
１５：メトラゾン
１６：ラベタロール塩酸塩
１７：メソトレキセート
１８：ファモチジン
１９：ヒドロクロロチアジド
２０：テストステロン
２１：クロルプロマジン
２２：イミプラミン塩酸塩
２３：カルバマゼピン
２４：酢酸グアナベンズ
【００３１】
被験物質のヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献
（ヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号（ｒｅｆ．）：参考文献名）
１：Ｓｕｇａｎｏ Ｋ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．， ２４１， ２４１−２５１， ２００２
２：国際公開第０１／０７０３８０号パンフレット
３：Ｗｏｈｎｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４４， ９２３−９３０， ２００１
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１に見られるように、比較例１〜３では多くの被験物質が実施時間の中では人工脂質膜を通過できずに、クリアランス値が算出不能であり、決定係数Ｒ２も算出不能であった。また、比較例４においては、全ての被験物質でクリアランス値の算出が可能であったものの、文献から得られたヒトにおける消化管吸収率Ｆａ（％）との相関が悪かった。一方、実施例１、２は全ての被験物質でクリアランス値の算出が可能であり、ヒトにおける消化管吸収率Ｆａ（％）と優れた相関性が認められた。
これらのことから、本発明の方法は、０．５時間という短時間で被験物質の膜透過性測定が可能であり、比較例よりも医薬品である被験物質の膜透過性の測定において優れていることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法により、薬物の膜透過性をｉｎ ｖｉｖｏとの相関よく、迅速に測定できる。本方法は薬物のスクリーニングにおいて有用であるため、医薬品の創薬研究への応用が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
［式中、ＸとＹの比率が９９：１乃至１：９９であり、ｎは２乃至１０の整数、Ｒは水素原子又はＯＲ１（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ1-８アルキル基又はＣ６-14アリール基を表す。）を意味する。］で表される繰り返し単位を有し、分子量が５０００乃至５０００００である高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
【請求項２】
式（Ｉ）のＸとＹの比率が１：２乃至１：３であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、かつ高分子化合物の分子量が２００００乃至２０００００の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
【請求項３】
（１）人工膜の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置する工程、（２）当該人工膜の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置する工程、（３）所定時間に当該人工膜及び溶液を一定温度に保つ工程、（４）前記一方面側及び／または前記他方面側の前記被験物質の量を測定する工程、及び（５）測定された量に基づき前記被験物質の膜透過性を評価する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
【請求項４】
請求項３に記載の人工膜及び溶液を収容する容器から構成される膜透過性測定キット。
【請求項５】
請求項３に記載の膜透過性測定方法により得られた被験物質の膜透過性のデータに基づき、所望の被験物質を選択することを特徴とする被験物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験物質が医薬品用途の薬剤である請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
［式中、ＸとＹの比率が９９：１乃至１：９９であり、ｎは２乃至１０の整数、Ｒは水素原子又はＯＲ１（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ1-８アルキル基又はＣ６-14アリール基を表す。）を意味する。］で表される繰り返し単位を有し、分子量が５０００乃至５０００００である高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
【請求項２】
式（Ｉ）のＸとＹの比率が１：２乃至１：３であり、ｎが４であり、Ｒが水素原子であり、かつ高分子化合物の分子量が２００００乃至２０００００の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
【請求項３】
（１）人工膜の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置する工程、（２）当該人工膜の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置する工程、（３）所定時間に当該人工膜及び溶液を一定温度に保つ工程、（４）前記一方面側及び／または前記他方面側の前記被験物質の量を測定する工程、及び（５）測定された量に基づき前記被験物質の膜透過性を評価する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
【請求項４】
請求項３に記載の人工膜及び溶液を収容する容器から構成される膜透過性測定キット。
【請求項５】
請求項３に記載の膜透過性測定方法により得られた被験物質の膜透過性のデータに基づき、所望の被験物質を選択することを特徴とする被験物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験物質が医薬品用途の薬剤である請求項５に記載のスクリーニング方法。
【公開番号】特開２００９−２５０７２７（Ｐ２００９−２５０７２７Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９７５５４（Ｐ２００８−９７５５４）
【出願日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（０００００３９８６）日産化学工業株式会社 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（０００００３９８６）日産化学工業株式会社 (510)
【Ｆターム（参考）】
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