人工血小板
人工血小板として使用するのに適した治療因子が、記載される。その因子は、不溶性キャリアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体を含み、ここでそのフィブリノゲン結合前駆体は、創傷部位特異的因子（例えば、トロンビン）によって、そのキャリアに結合されたフィブリノゲン結合成分へと変換されることができる。そのフィブリノゲン結合成分は、そのフィブリノゲン結合前駆体と比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大する。その因子は、患者固有の血小板における欠損（例えば、血小板数の遺伝性または後天性の欠損（血小板減少症）あるいは機能の遺伝性または後天性の欠損（血小板無力症））を有する患者を処置するために使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工血小板として使用するのに適した因子に関する。その因子は、患者固有の血小板における欠損（例えば、血小板数の遺伝性または後天性の欠損（血小板減少症）あるいは機能の遺伝性または後天性の欠損（血小板無力症））を有する患者を処置するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
最近、血小板輸血は、急性出血および血小板の産生および／または機能の障害を有する患者における出血の予防に対する唯一の有効な処置である。しかし、輸血のために使用される血小板濃縮物の貯蔵寿命は、５日間だけである。血小板輸血に伴う感染の危険性および患者が血小板濃縮物に対するアレルギー反応を有し得る危険性もまた、存在する。
【０００３】
血小板濃縮物および血小板輸血に関連する懸案事項に鑑みて、人工血小板を開発する試みが、行なわれている。人工血小板が血管損傷の部位（血小板が活性化される）において互いおよび内因性の血小板と凝集するが、他の場所における凝集は最小限であることが、重要である。血小板が活性化される場合、血小板膜糖タンパク質（ＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａ）のコンホメーション変化は、血小板膜糖タンパク質を血漿フィブリノゲンに結合させ、そしてさらなる血小板を、成長する血栓に補充する。
【０００４】
特許文献１は、２つの人工血小板生成物の生産を記載する。生成物１は、末端のシステインを介してヒトアルブミンマイクロスフェアに架橋された配列ＮＨ２−ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号１）のペプチドである。フィブリノゲンは、上記ペプチドに結合される。生成物２は、フィブリノゲンが上記ペプチドに結合されないことを除いて生成物１と同一である。投与される場合、生成物２は、上記ペプチドを介して内因性フィブリノゲンに結合する。上記ペプチドは、フィブリノゲンがそのネイティブなコンホメーションで維持されるか、またはネイティブなコンホメーションに近づくようにフィブリノゲンに結合することができる。これは、活性化形態のＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａレセプターとの優勢な相互作用を可能にする。結合されたフィブリノゲンはまた、フィブリノゲンを切断するトロンビンと相互作用し得、フィブリン−フィブリン橋を介する上記マイクロスフェアの架橋を可能にする。
【０００５】
生成物１と比較して、生成物２は増強された安全性プロフィールを有すると考えられる。なぜならば生成物２は、患者の内因性フィブリノゲンに結合するからである。これは、生成物２が投与される場合に、感染およびアレルギー反応の危険性を減少させる。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ ２００５／０３５００２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに改良された人工血小板を提供することが、望まれる。特に、血管損傷の部位から離れた部位における血栓形成の危険性がさらに最小化される人工血小板を提供する必要性が、存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に従って、人工血小板として使用するための因子が提供され、上記因子は、不溶性キャリアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体を含み、ここで上記フィブリノゲン結合前駆体は、上記キャリアに結合されたフィブリノゲン結合成分へと創傷部位特異的因子によって変換されることができ、上記フィブリノゲン結合成分は、上記フィブリノゲン結合前駆体と比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、そして上記フィブリノゲン結合前駆体は、フィブリノゲンではない。
【０００８】
一旦上記フィブリノゲン結合前駆体が創傷の部位で上記フィブリノゲン結合成分に変換されると、上記フィブリノゲン結合成分が、フィブリノゲンに結合できることにより、結合されたフィブリノゲンが、血小板に結合し、それによって血小板凝集を引き起こし得る。創傷部位特異的因子が、上記フィブリノゲン結合前駆体を変換するために必要とされるので、創傷の部位から離れた部位における血小板凝集は、最小化される。既知の人工血小板と比較して、本発明の因子は創傷から離れた血栓形成性が減少しており、それによって安全性が増強されていると、考えられる。
【０００９】
本発明の因子のさらなる利点は、上記フィブリノゲン結合成分が、結合されたフィブリノゲンが活性化された血小板と優勢に相互作用するようにフィブリノゲンをそのネイティブなコンホメーションで維持するかまたはネイティブなコンホメーションに近いような様式で、フィブリノゲンに結合することは、必須ではないということである。これは、上記因子が創傷の部位においてのみ活性化されるからである。結果的に、フィブリノゲン結合成分の選択は、ＷＯ ２００５／０３５００２に記載される生成物１および生成物２に関するものほど重要ではない。それでもなお、上記フィブリノゲン結合成分がフィブリノゲンに結合することにより、結合されたフィブリノゲンが活性化された血小板と優勢に相互作用することが、好ましい。これは、上記因子が創傷部位から離れた部位において血栓形成を引き起こす危険性をさらに最小化する。
【００１０】
一旦フィブリノゲンが、上記フィブリノゲン結合成分に結合されると、そのフィブリノゲンは、フィブリン−フィブリン橋を介した不溶性キャリアの架橋を可能にするためにトロンビンによって切断され得るべきである。
【００１１】
好ましくは、上記フィブリノゲン結合成分は、１０−９Ｍ〜１０−６Ｍの間の解離定数（ＫＤ）でフィブリノゲンに結合する。
【００１２】
上記解離定数は、平衡状態にて測定され得る。例えば、既知の濃度の放射標識されたフィブリノゲンが、フィブリノゲン結合成分が架橋されているマイクロスフェアと一緒にインキュベートされ得る。代表的に、５μＭのペプチドが、１ｇｍのマイクロスフェアに架橋されるか、または１５〜４０μＭのペプチドが、１ｇｍのマイクロスフェアに架橋される。上記ペプチドに連結されたマイクロスフェアは、０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈され、そしてｐＨ７．４の等張緩衝液（例えば、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液）中で、０．０５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度において最大で１時間まで２０℃にて放射標識されたフィブリノゲンと一緒にインキュベートされる。上記マイクロスフェア上のフィブリノゲン結合成分に結合されたフィブリノゲンは、遠心分離によって遊離のフィブリノゲンから分離され得、そして遊離のフィブリノゲンの量および結合されたフィブリノゲンの量が、測定され得る。次いで、その解離定数が、結合されたフィブリノゲンの濃度を結合されたフィブリノゲン：遊離のフィブリノゲンの濃度の比に対してプロットすることによるスキャッチャード分析（その曲線の傾斜がＫＤを示す）によって算出され得る。
【００１３】
フィブリノゲンへの上記フィブリノゲン結合前駆体（および上記不溶性キャリア）の親和性はより低いほど良いことが、認識される。これは、創傷の部位で創傷部位特異的因子によって変換されない限り、本発明の因子の血小板凝集を引き起こす危険性を最小化する。
【００１４】
患者への本発明の因子の投与は、創傷部位から離れた部位における医学的に受容不可能なレベルの血液凝固を引き起こすべきではない。医学的に受容不可能なレベルの血液凝固は、深静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）、一過性の脳虚血または心血管虚血あるいは脳卒中を含む。
【００１５】
好ましくは、フィブリノゲンについての上記フィブリノゲン結合前駆体の解離定数は、１×１０−６Ｍよりも大きい。
【００１６】
上記フィブリノゲン結合前駆体は、ペプチドまたはペプチドアナログであり得るが、好ましくはペプチドである。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体は、ブロック成分（好ましくは、ペプチド）にアミノ酸末端にて結合されたフィブリノゲン結合ペプチド（すなわち、フィブリノゲン結合成分）を含み、上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する（すなわち、減少させる）。上記創傷部位特異的因子による上記フィブリノゲン結合前駆体の切断は、上記不溶性キャリアに結合された上記フィブリノゲン結合ペプチドを露出させる。このような実施形態において、上記ブロック成分は、切断が起きるまで、フィブリノゲン結合ペプチドのフィブリノゲンを結合する能力をブロックまたは阻害する。好ましくは、上記ブロック成分は、１〜３０アミノ酸残基長のペプチドである。
【００１８】
任意の適切なフィブリノゲン結合ペプチドが、使用され得る。例えば、上記ペプチドは、フィブリンに天然に結合されているフィブリノゲンの領域に結合することができる（すなわち、血小板膜糖タンパク質ＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａによって）。フィブリノゲンへのフィブリンの結合は、Ｍｏｓｅｓｓｏｎら、２００１、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３６、１１−３０において考察される。フィブリノゲンへのＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの結合は、Ｂｅｎｎｅｔｔ、２００１、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３６、３４０−３５４において考察される。
【００１９】
上記ペプチドは、フィブリノゲンのα鎖のカルボキシ末端ドメインおよび／またはアミノ末端ドメインに結合することができる。特に、上記ペプチドは、ＲＧＤ含有モチーフに対して、これらのドメイン（例えば、アミノ酸９５〜９８のＲＧＤＦ（配列番号２）、アミノ酸５７２〜５７５のＲＧＤＳ（配列番号３））の一方または両方において結合することができる。上記ペプチドは、フィブリノゲンのγ鎖のカルボキシ末端ドメイン（好ましくは、このドメインの最後の１２アミノ酸（配列ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ（配列番号４））に結合することができる。上記ペプチドは、フィブリノゲンのγ鎖のＤ−ドメイン（例えば、Ｄ−ドメインのβ鎖セグメント）に結合することができる。
【００２０】
上記フィブリノゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩｂまたはＧＰＩＩＩａのフィブリノゲン結合領域に由来する配列を含み得る。例えば、上記ペプチドは、ＧＰＩＩｂのアミノ酸残基２９４〜３１４の配列に対応する配列ＡＶＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬＹＭ（配列番号５）、またはフィブリノゲン結合活性を保持するそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。フィブリノゲン結合活性を保持することが公知であるフラグメントは、ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬ（２９６〜３０６）（配列番号６）、ＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬ（３００〜３１２）（配列番号７）、およびＧＡＰＬ（配列番号８）である。ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬの適切な誘導体としては、以下が挙げられる：Ｔ（Ｄ，Ｅ）ＶＮＧ（Ｄ，Ｅ）ＧＲＨ（Ｄ，Ｅ）Ｌ（配列番号９）；ＴＤ（Ｖ，Ｌ）ＮＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号１０）；ＴＤＶ（Ｎ，Ｑ）ＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号１１）；ＴＤＶＮＧＤＧ（Ｒ，Ｋ）ＨＤＬ（配列番号１２）。
【００２１】
上記フィブリノゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩＩａの残基９５〜２２３の配列またはフィブリノゲン結合活性を保持するそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。例えば、配列ＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧ（配列番号１３）を含む残基２１１〜２２２は、ＧＰＩＩＩａにおける重要なフィブリノゲン結合ドメインであると考えられる。ＧＰＩＩＩａの他の適切な領域は、残基１０９〜１７１および残基１６４〜２０２を含む。
【００２２】
上記フィブリノゲン結合ペプチドは、トロンビンの作用によってフィブリノゲンに対して露出され、そしてフィブリンを産生する重合反応における第１工程としてフィブリノゲンに結合する残基の配列を含み得る。トロンビンは、フィブリノゲンのα鎖およびβ鎖のＮ末端からペプチド切断（フィブリノペプチドＡおよびＢを放出）して、それぞれ、配列ＮＨ２−ＧＰＲ−（配列番号１４）およびＮＨ２−ＧＨＲ−（配列番号１５）を露出させる。したがって、フィブリノゲン結合ペプチドの好ましい例は、そのアミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−Ｇ（Ｐ，Ｈ）ＲＸ−（配列番号１６）を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸であり、そして（Ｐ，Ｈ）は、プロリンまたはヒスチジンのいずれかがその位置に存在することを意味する。好ましくは、上記ペプチドは、そのアミノ末端に配列ＮＨ２−ＧＰＲＰ−（配列番号１７）を含む。
【００２３】
好ましくは、上記フィブリノゲン結合ペプチドは、４〜３０アミノ酸残基長、より好ましくは４〜１０アミノ酸残基長である。
【００２４】
上記創傷部位特異的因子は、好ましくは、フィブリノゲン結合前駆体を切断し得る、創傷の部位において産生される天然に存在する酵素である。このような実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体は、上記創傷部位特異的因子によって特異的に認識される、切断部位を含むべきであり、そしてその切断部位は、上記フィブリノゲン結合ペプチドと上記ブロック成分との間に位置する。トロンビンは、好ましい創傷部位特異的因子である。しかし、他のセリンプロテアーゼ（例えば、第Ｘａ因子またはＦＩＸａ）は、創傷部位において産生され得、そしてフィブリノゲン結合前駆体を切断するために使用され得る。トロンビンは、アルギニン残基のカルボキシ末端、そして一般にアルギニンとグリシンとの間でペプチド結合を切断することが、公知である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体は、そのアミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−ＺＹＸＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１８）を含むペプチドであり、ここで「／」は、トロンビン切断部位を示し、そしてＸは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはプロリンであり、Ｙは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸またはアラニンであり、そしてＺは、好ましくはロイシンまたはプロリンである少なくとも１個のアミノ酸である。例は、以下である：ＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１９）、ＮＨ２−ＡＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号２０）、ＮＨ２−ＬＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号２１）、またはＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＶ−（配列番号２２）。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、上記創傷部位特異的因子に対する結合部位をさらに含む。これは、創傷部位における上記フィブリノゲン結合前駆体の上記フィブリノゲン結合成分への変換を増強すると予想される。上記結合部位は、上記フィブリノゲン結合前駆体または上記フィブリノゲン結合前駆体の部分に結合された不溶性キャリア上にあり得る。好ましい実施形態において、上記結合部位が、上記フィブリノゲン結合成分に結合されることにより、上記創傷部位特異的因子による上記フィブリノゲン結合前駆体の切断が、上記結合部位を放出させて、上記フィブリノゲン結合成分を露出させる。例えば、上記フィブリノゲン結合前駆体は、カルボキシ末端からアミノ末端の方向に、上記不溶性キャリアに固定化されたフィブリノゲン結合ペプチド、上記創傷部位特異的因子に対する切断部位、および上記創傷部位特異的因子に対する結合部位を含むペプチドを含むペプチドであり得る。代表的に、上記結合部位ペプチドのカルボキシ末端は、上記創傷部位特異的因子が上記切断部位で上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する場合にその創傷部位特異的因子により認識される配列によって、上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端から分離される必要がある。例えば、上記創傷部位特異的因子がトロンビンであり、そしてフィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端残基がＧである場合、その配列は、上で規定されるようなＲＸＹＺ（カルボキシ方向からアミノ方向において）（配列番号２３）であり得る。必要に応じて、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）がまた、上記創傷部位特異的因子によって認識される切断配列と、上記結合部位ペプチドとの間に存在し得る。上記スペーサーは、上記創傷部位特異的因子が上記結合部位ペプチドに結合される場合にその創傷部位特異的因子に上記フィブリノゲン結合前駆体を切断させ得るのに十分に長いべきである。好ましくは、上記スペーサーは、１〜２０アミノ酸残基長のペプチドである。
【００２７】
上記創傷部位特異的因子がトロンビンである場合、本発明の因子はトロンビン結合部位をさらに含むことが、好ましい。上記トロンビン結合部位は、好ましくは、トロンビンが好ましくはＫｄ．１０−９〜１０−６の親和性で結合することができるペプチドによって提供される。好ましくは、そのペプチドは、トロンビンのエキソサイト（ｅｘｏｃｉｔｅ）Ｉ結合ドメインまたはエキソサイトＩＩ結合ドメインが結合することができる配列を含む。トロンビン結合ペプチドの適切な例は、ＰＡＲ−１レセプターのエキソサイト結合部位に由来する配列（例えば、ＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号２４））、フィブリノゲンに由来する配列（例えば、ＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２５））、または第ＶＩＩＩ因子に由来する配列（例えば、ＥＥＥＤＷＤ（配列番号２６）またはＥＤＳＹＥＤ（配列番号２７））である。あるいは、上記トロンビン結合部位は、トロンビン結合ペプチドであるヒルジンに由来し得る（例えば、ＮＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬ（配列番号２８））。上記トロンビン結合ペプチドは、別個のペプチドとして上記不溶性キャリアに（ペプチドまたは非ペプチドのいずれかである適切なリンカーによって）架橋され得る。あるいは、上記トロンビン結合ペプチドは、フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分であり得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、その因子の創傷部位への局在化を促進するために、創傷部位標的成分をさらに含む。上記創傷部位標的成分は、（好ましくは、Ｋｄ １０−９〜１０−６の親和性で）創傷部位に選択的に結合するべきである。好ましくは、上記創傷部位標的成分は、細胞表面タンパク質組織因子に結合することができる。血液凝固は、細胞表面タンパク質組織因子が血管損傷後に血液に曝される場合に引き起こされる。一旦曝されると、細胞表面組織因子は、セリンプロテアーゼ第ＶＩＩ因子の不活性な前駆体、またはその酵素的に活性な形態ＶＩＩａに、非常に高い親和性および特異性で結合する。したがって、上記創傷部位標的成分は、第ＶＩＩ因子または細胞表面タンパク質組織因子に結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体、あるいは第ＶＩＩａ因子または細胞表面タンパク質組織因子に結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。
【００２９】
上記創傷部位標的成分は、上記フィブリノゲン結合前駆体または上記フィブリノゲン結合前駆体の部分に結合された不溶性キャリアに固定化され得る。１つの実施形態において、上記創傷部位標的成分および上記フィブリノゲン結合前駆体は、別々に上記不溶性キャリアに架橋される。別の実施形態において、上記創傷部位標的成分が、上記フィブリノゲン結合成分に結合されることにより、上記創傷部位特異的因子による上記フィブリノゲン結合前駆体の切断が、創傷部位標的成分を放出させて、そのフィブリノゲン結合成分を露出させる。例えば、上記フィブリノゲン結合前駆体は、カルボキシ末端からアミノ末端の方向に、上記不溶性キャリアに固定化されたフィブリノゲン結合ペプチド、上記創傷部位特異的因子に対する切断部位、および創傷部位標的成分を含むペプチドであり得る。代表的に、上記創傷部位標的成分のカルボキシ末端は、上記創傷部位特異的因子が上記切断部位で上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する場合にその創傷部位特異的因子により認識される配列によって、上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端から分離される必要がある。例えば、上記創傷部位特異的因子がトロンビンであり、そしてフィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端残基がＧである場合、その配列は、上で規定されるようなＲＸＹＺ（カルボキシ方向からアミノ方向において）であり得る。必要に応じて、スペーサーがまた、上記創傷部位特異的因子によって認識される切断配列と、上記創傷部位標的成分との間に存在し得る。上記スペーサーは、上記創傷部位標的成分を創傷部位に選択的に結合させ得るのに十分長いべきである。好ましくは、上記スペーサーは、１〜２０アミノ酸残基長のペプチドである。
【００３０】
上記不溶性キャリアは、不活性で、生体適合性であるべきであり、そしてその不溶性キャリアは、本発明の因子が投与される場合に、任意の医学的に受容不可能なレベルの血液凝固をもたらすべきではない。上記不溶性キャリアは、肺毛細管床（ｌｕｎｇ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｂｅｄ）を通した本発明の因子の透過を可能にするのに十分小さいべきである。因子が肺毛細管床を透過する能力は、Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、７０、６０３の方法を使用して決定され得る。
【００３１】
上記不溶性キャリアは、少数（例えば、数でその集団うちの約２％よりも少ない）が、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｚｅｒ ＩＩなどの粒子カウンター（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）によって測定された場合に、最大寸法として６μｍを超えているような、最大寸法を有し得る。最大寸法として２〜４μｍの大きさが、適切であり得、それは、ヒト血小板の大きさに匹敵する。
【００３２】
上記不溶性キャリアは、微粒子（固体微粒子、中空微粒子、または多孔性微粒子を含む）であり得、その不溶性キャリアは、好ましくは、実質的に球状の微粒子である。上記微粒子は、任意の適切な物質（例えば、架橋されたタンパク質）から形成され得る。適切なタンパク質は、アルブミン（血清由来アルブミンまたは組換えアルブミン、ヒトアルブミンまたは非ヒトアルブミン）である。本発明において不溶性キャリアとして使用するのに適した微粒子は、ヒト血清アルブミンを、例えば、ＷＯ ９２／１８１６４におけるような周知の噴霧乾燥技術を使用して噴霧乾燥することによって形成され得る。
【００３３】
キャリアとしての微粒子の使用に代わるものは、リポソーム、合成ポリマー粒子（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ（乳酸／グリコール酸））、または細胞膜フラグメントを含む。
【００３４】
上記フィブリノゲン結合前駆体は、任意の適切な手段によって上記不溶性キャリアに結合され得るが、そのフィブリノゲン結合前駆体は、代表的に、共有結合される。好ましい共有結合の例は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、またはアミド結合である。適切な共有結合は、上記フィブリノゲン結合前駆体がシステインを含むペプチドであり、そして上記キャリアがチオール反応基を含む場合に、形成され得る。これは、システインの−ＳＨ基を上記キャリアのチオール反応基に連結することによって、上記ペプチドがそのキャリアに結合されることを可能にする。好ましくは、末端システイン基は、上記ペプチドと上記キャリア上のチオール反応基とを架橋するために、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドに組み込まれる。あるいは、共有結合は、上記フィブリノゲン結合前駆体がマレイミド基（好ましくは、そのカルボキシ末端に（例えば、上記ペプチドのカルボキシ末端リジンに結合される））を含むペプチドであり、そして上記キャリアがスルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を含む場合に、形成され得る。次いで、上記ペプチドは、そのペプチドのマレイミド基と上記キャリアのスルフヒドリルとを反応させることによってそのキャリアに結合することができる。
【００３５】
代表的に、スペーサーは、上記フィブリノゲン結合成分のフィブリノゲン−結合活性が上記不溶性キャリアによって不利な影響を受けないことを確保するために、そのフィブリノゲン結合成分とその不溶性キャリアとの間に必要とされる。例えば、上記不溶性キャリアの表面は、上記フィブリノゲン結合成分へのフィブリノゲンの結合を、その結合がその不溶性キャリアの表面から十分な距離でない限り、立体的に障害し得る。
【００３６】
上記フィブリノゲン結合前駆体がフィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドであり、そしてその前駆体が末端アミノ酸残基によって上記不溶性キャリアに結合される場合、スペーサー配列は、好ましくは、その前駆体の末端アミノ酸残基とフィブリノゲン結合ペプチドとの間に存在する。上記スペーサー配列は、例えば、１〜２０アミノ酸残基長（好ましくは、５〜２０アミノ酸残基長）であり得る。スペーサー配列ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２９）またはＧＧＧＧＧ（配列番号３０）が、好ましい。
【００３７】
多数のフィブリノゲン結合前駆体が、上記不溶性キャリアに結合することができる。血小板は、代表的に、５０，０００〜１００，０００のＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａ表面タンパク質を有する。上記不溶性キャリアに結合された同様の数のフィブリノゲン結合前駆体が、適当であり得るが、約１，０００〜１０，０００が、好ましい。
【００３８】
本発明にしたがって、本発明の因子と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とを含む薬学的組成物もまた、提供される。
【００３９】
本発明の因子は、生理学的ｐＨの等張緩衝液中の懸濁物において処方され得る。マンニトール、グルコース、ヒトアルブミン、またはトレハロース（ｔｒａｈａｌｏｓｅ）を含む緩衝液が、使用され得る。本発明の因子は、使用の直前に再構成され得る凍結乾燥された投薬形態を産生するために、凍結乾燥され得る。
【００４０】
本発明の因子は、代表的に、無菌的に産生される。好ましくは、本発明の因子は、さらに、末期の滅菌処理に供される。適切な処理の例は、適切な温度（例えば、６０℃で１０時間）にて液体懸濁物を加熱すること、または１２１℃で１５分間にわたるオートクレーブにおける蒸気滅菌である。あるいは、本発明の因子は、最初に凍結乾燥され、次いで、例えば、１６０℃に少なくとも２時間、または８０℃に７２時間にわたって加熱され得る。あるいは、上記加熱処理工程は、例えば、コバルト６０供給源を使用した２５〜３５ｋＧｙへの曝露によるγ照射によって置換され得る。
【００４１】
医薬として使用するための本発明の因子もまた、本発明にしたがって提供される。
【００４２】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための医薬の製造における本発明の因子の使用が、本発明にしたがってさらに提供される。
【００４３】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための方法が、本発明にしたがってさらに提供され、この方法は、本発明の因子を、このような処置の必要がある被験体に投与する工程を包含する。
【００４４】
血小板減少症は、血球を計数することによって診断される。正常な血小板数は、１５０×１０９／ｌ〜４００×１０９／ｌである。この範囲を下回ると、主に止血が、損なわれ、そして出血時間が、延長される。しかし、生命を脅かす自発的な出血は、通常、血小板数が１０×１０９／ｌより下に下降した場合にのみ生じる。本発明の方法は、被験体が、４００×１０９／ｌを下回る血小板数、好ましくは１５０×１０９／ｌを下回る血小板数、より好ましくは１０×１０９／ｌを下回る血小板数を有する場合に、使用され得る。
【００４５】
血小板減少症の最も一般的な原因は、血液癌においてか、または細胞傷害性の化学療法または放射線療法後におけるような、骨髄からの血小板産生の不全である。
【００４６】
血小板減少症は、増大した血小板破壊を引き起こす状態から生じ得る。これらとしては、免疫性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固、ヘパリン誘発性血小板減少症、他の薬物誘発性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、ＨＩＶ−１関連血小板減少症、血栓性血小板減少症性紫斑病／溶血性尿毒症症候群、分類不可能型免疫不全、および輸血後紫斑病が挙げられる。
【００４７】
血小板減少症は、減少した血小板産生を引き起こす状態から生じ得る。これらとしては、橈骨欠損に伴う血小板減少症（ＴＡＲ）症候群、無巨核球性血小板減少症、巨大血小板症候群（例えば、ベルナール−スーリエ症候群、メイ−ヘグリン異常、Ｆｅｃｈｔｎｅｒ症候群、セバスチャン（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ）症候群、エプスタイン症候群、モントリオール血小板症候群）、およびヴィスコット−オールドリッチ症候群が挙げられる。
【００４８】
血小板減少症は、腐骨形成（例えば、脾機能亢進症またはＮａｓａｂａｃｈ−Ｍｅｒｒｉｔｔ症候群）または増大した血小板破壊を引き起こす状態および血液希釈（例えば、体外灌流）から生じ得る。
【００４９】
血小板無力症（後天性血小板機能欠損）は、尿毒症、骨髄増殖性障害（例えば、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病、および原因不明性骨髄様化生）、急性白血病および骨髄異形成症候群、異常タンパク血症、体外灌流、後天性フォンウィルブラント病、後天性貯蔵プール欠乏症、抗血小板抗体、肝疾患から生じ得る。
【００５０】
血小板無力症（遺伝性血小板機能欠損）は、血小板接着の状態（例えば、ベルナール−スーリエ症候群）、アゴニストレセプターの状態（例えば、インテグリンα２β１（コラーゲンレセプター）欠損、Ｐ２Ｙ１２（ＡＤＰレセプター）欠損またはトロンボキサンＡ２レセプター欠損）、シグナリング経路の状態（例えば、Ｇαｑ欠損、ホスホリパーゼＣ−β２欠損、シクロオキシゲナーゼ欠損、トロンボキサンシンターゼ欠損、リポキシゲナーゼ欠損またはカルシウム動員の欠損）、分泌の状態（例えば、貯蔵プール疾患、ヘルマンスキー−パラドック症候群、チェディアック−東症候群、灰色血小板症候群、ケベック（Ｑｕｅｂｅｃ）症候群およびヴィスコット−オールドリッチ症候群）、凝集の状態（例えば、グランツマン血小板無力症または先天性無フィブリノゲン血症）および血小板−血液凝固タンパク質相互作用の状態（例えば、スコット（Ｓｃｏｔｔ）症候群）から生じ得る。
【００５１】
本発明の方法は、上記の状態のいずれかを予防、処置、または改善するために、使用され得る。
【００５２】
本発明の方法はまた、冠動脈バイパス手術および／または血液透析における体外循環の間に生じるような患者の血小板への持続性の機械的損傷を有する患者を処置するために、使用され得る。
【００５３】
本発明の因子の適切な総投薬量は、タンパク質ベースのキャリアの０．１〜５ｇタンパク質、または０．１〜５ｇタンパク質当量の範囲にあると予想される。
【００５４】
また、本発明にしたがって、本発明の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体が、提供され、ここで上記フィブリノゲン結合前駆体は、創傷部位特異的因子によってフィブリノゲン結合成分に変換されることができ、上記フィブリノゲン結合成分は、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドと比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、フィブリノゲンではない。好ましくは、上記フィブリノゲン結合前駆体は、ペプチドである。特に好ましい実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、配列番号３２〜３５、または配列番号３８〜４１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法もまた、本発明にしたがって提供され、この方法は：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された標識された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、上記創傷部位特異的因子による既知のフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下で接触させる工程；
ｉｉ）上記創傷部位特異的因子とのインキュベーションの前後において、上記不溶性キャリア上の標識の量を決定する工程；および
ｉｉｉ）上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における上記不溶性キャリア上の標識の量が、上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における上記不溶性キャリア上の標識の量よりも少ない場合に、上記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する。
【００５６】
このような方法の例は、下で実施例１１に記載される。
【００５７】
上記方法は、上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前後において、上記不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合を決定する工程、および工程（ｉｉｉ）において、上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における上記不溶性キャリア上の標識の量が上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における上記不溶性キャリア上の標識の量よりも少なくありかつ上記不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合が上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション後に増大する場合に、上記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程をさらに包含し得る。
【００５８】
本発明の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法が、本発明にしたがってさらに提供され、この方法は：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、上記創傷部位特異的因子によるフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下で接触させる工程；
ｉｉ）上記候補フィブリノゲン結合前駆体が、上記創傷部位特異的因子と接触した後に、クロット形成、血小板凝集、または上記不溶性キャリアの凝集を促進するか否かを決定する工程；および
ｉｉｉ）クロット形成が促進される場合に、上記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する。
【００５９】
候補フィブリノゲン結合前駆体が上記創傷部位特異的因子トロンビンと接触した後に、クロット形成、血小板凝集、または上記不溶性キャリアの凝集を促進するか否かを決定するための適切な方法は、下で実施例７〜１０に記載される。
【００６０】
本発明の因子は一旦投与されると（創傷の部位での創傷部位特異的因子によるその変換を除いて）分解されない（またはゆっくりとしか分解されない）ことが一般に重要であることが、認識される。好ましくは、血中での本発明の因子の循環時間は、本発明の因子の変換をもたらす創傷部位を全く有さない被験体に一旦投与されると、１時間より大きい。インビトロで本発明の因子の安定性を決定するための適切な方法は、下で実施例１２に記載される。本発明の因子は、実施例１２に記載される試験の条件下で、少なくとも１時間にわたって安定であるべきである。
【００６１】
ＷＯ ２００５／０３５００２の実施例１〜４は、ペプチドに連結されたマイクロスフェアを産生する方法、ペプチドに連結されたマイクロスフェアへのフィブリノゲンの結合をアッセイする方法、改変型凝集アッセイ、インビトロ活性アッセイ、およびインビボ評価モデルを記載する。対応する方法は本発明の因子を同定、産生および試験するために使用され得ることが、理解される。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態は、単なる例として、添付の図面に関連して本明細書に記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明の因子の第１の好ましい実施形態は、図１（ａ）において概略的に示される。その因子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体ペプチドを含む。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、（そのカルボキシ末端からそのアミノ末端に向かって）以下を含む：上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基；第１のスペーサー配列（スペーサー１）；フィブリノゲン結合ペプチド；トロンビン切断配列（「トロンビン切断配列」と表示された図中の囲みは、トロンビンが上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る部位（すなわち、トロンビン切断部位）に対してアミノ末端である配列を示す）；第２のスペーサー配列（スペーサー２）；およびトロンビン結合ペプチド。
【００６４】
上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端側にある上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分（すなわち、トロンビン切断配列−スペーサー２−トロンビン結合ペプチド部分）は、ブロック成分を形成する。上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する。創傷部位で産生されたトロンビンは、上記トロンビン結合ペプチドに結合し、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端にて上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る（図１（ｂ）に示される通り）。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図１（ｃ））。
【００６５】
上記第１のスペーサーは、上記フィブリノゲン結合ペプチドを、一旦そのフィブリノゲン結合ペプチドが露出されるとマイクロスフェアがそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を妨げないように、上記ＨＳＡマイクロスフェアから間隔を空けて配置する。上記第２のスペーサーは、トロンビンが上記トロンビン結合ペプチドに結合される場合に上記トロンビン切断部位を切断するように、トロンビンを最適に配向させる。
【００６６】
本発明の因子の第２の好ましい実施形態は、図２（ａ）において概略的に示される。その因子は、ＨＳＡマイクロスフェアに架橋された以下の２つの別個のペプチドを含む：フィブリノゲン結合前駆体ペプチド、およびトロンビン結合ペプチド。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、（そのカルボキシ末端からそのアミノ末端に向かって）以下を含む：上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基；第１のスペーサー配列（スペーサー１）；フィブリノゲン結合ペプチド；およびトロンビン切断配列（「トロンビン切断配列」と表示された図中の囲みは、トロンビンが上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る部位（すなわち、トロンビン切断部位）に対してアミノ末端である配列を示す）。上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端側にある上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分（すなわち、上記トロンビン切断配列）は、ブロック成分を形成する。上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する。
【００６７】
上記トロンビン結合ペプチドは、そのカルボキシ末端において第２のスペーサー配列（スペーサー２）に連結される。上記第２のスペーサー配列のカルボキシ末端は、上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるシステイン残基に連結される。
【００６８】
創傷部位で産生されたトロンビンは、上記トロンビン結合ペプチドに結合し、そして上記トロンビン切断部位にてそのフィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図２（ｂ））。
【００６９】
本発明の因子の第３の好ましい実施形態は、図３ａにおいて概略的に示される。その因子は、ＨＳＡマイクロスフェアに架橋された以下の３つの別個のペプチドを含む：フィブリノゲン結合前駆体ペプチド、トロンビン結合ペプチド、および創傷部位標的ペプチド。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドおよび上記トロンビン結合ペプチドは、第２の好ましい実施形態について上で記載される通りである。上記創傷部位標的ペプチドは、そのカルボキシ末端において第３のスペーサー配列（スペーサー３）に連結される。上記第３のスペーサー配列のカルボキシ末端は、上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるシステイン残基に連結される。上記創傷部位標的ペプチドは、創傷部位（例えば、細胞表面タンパク質組織因子）に選択的に結合することができる。
【００７０】
上記創傷部位標的ペプチドは、本発明の因子の創傷部位への局在化を促進する。創傷部位で産生されたトロンビンは、上記トロンビン結合ペプチドに結合し、そして上記トロンビン切断部位にて上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図３ａ）。
【００７１】
上記第３のスペーサー配列は、上記創傷部位標的ペプチドを、マイクロスフェアが創傷部位へのその創傷部位標的ペプチドの結合を妨げないように、上記ＨＳＡマイクロスフェアから間隔を空けて配置する。
【００７２】
本発明の因子の第４の好ましい実施形態は、図３ｂにおいて概略的に示される。その因子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体ペプチドを含む。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、（そのカルボキシ末端からそのアミノ末端に向かって）以下を含む：上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基；第１のスペーサー配列（スペーサー１）；フィブリノゲン結合ペプチド；およびトロンビン切断配列（「トロンビン切断配列」と表示された図中の囲みは、トロンビンが上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る部位（すなわち、トロンビン切断部位）に対してアミノ末端である配列を示す）。
【００７３】
上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端側にある上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分（すなわち、上記トロンビン切断配列）は、ブロック成分を形成する。上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する。創傷部位で産生されたトロンビンは、上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端において上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る（図３ｂに示される通り）。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図３ｂの下部に示される通り）。
【００７４】
上に記載され、そして図１〜３に示される本発明の因子の４つの好ましい実施形態の適切なペプチド配列の例は、以下である：
スペーサー１：ＮＨ２−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号２９）；
フィブリノゲン結合ペプチド：ＮＨ２−ＧＰＲＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１７）；
トロンビン切断配列：ＮＨ２−ＬＶＰＲ−ＣＯＯＨ（配列番号３１）；
スペーサー２：トロンビンが上記トロンビン結合ペプチドに結合される場合に上記トロンビン切断部位を切断するようにトロンビンを最適に配向させるペプチド配列；
トロンビン結合ペプチド：トロンビンを結合することができる分子（例えば、ＰＡＲ−１）上のトロンビンエキソサイト１結合部位に由来するペプチド配列（すなわち、ＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号２４））；
創傷部位標的ペプチド：第ＶＩＩ因子またはそのフラグメントもしくは誘導体（例えば、組換え第ＶＩＩａ因子）；
スペーサー３：ＮＨ２−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号２９）。
【００７５】
上に記載された好ましい実施形態において、上記ペプチドは、上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基を含む。上記マイクロスフェアへの任意の適切な共有結合は、例えば、そのペプチドに結合されたマレイミド基とそのマイクロスフェアのスルフヒドリル基との反応から生じる共有結合の代わりに使用され得ることが、認識される。
【００７６】
上に記載された好ましい実施形態（および下で実施例において記載された実施形態のいくつか）は、マイクロスフェアを含む。他の微粒子または適切な不溶性キャリアはマイクロスフェアの代わりに使用され得ることが、認識される。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
（本発明の因子の例：）
【００７８】
【化２】
ここで：
「／」は、トロンビン切断部位を示し；
【００７９】
【化３】
は、アルブミンマイクロスフェアを示し；そして
【００８０】
【化４】
は、上記ペプチド配列の末端システインと上記アルブミンマイクロスフェアとの間の共有結合を示す。
【００８１】
この実施例において、上記アルブミンマイクロスフェアの表面を、上記ペプチドのカルボキシ末端システイン残基の−ＳＨ基との反応のための上記キャリア上のチオール反応基を提供するために、ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）によって改変した（下の実施例２を参照のこと）。
【００８２】
（実施例２）
（マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体ペプチド（ペプチドＡ）およびフィブリノゲン結合ペプチド（ペプチドＢ）の調製）
Ｈ２Ｎ−ＬＶＰＲＧＰＲＰＧ６Ｃ（ペプチドＡ）（配列番号３６）およびＨ２Ｎ−ＧＰＲＰＧ６Ｃ（ペプチドＢ）（配列番号３７）を、それぞれ、合成し、そして以下の通りに、ヒトアルブミンから構成されたマイクロスフェアに別個に架橋した：
２５ｍｇのヒトアルブミンから構成されたマイクロスフェアを、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にて０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に懸濁した；
４ｍｇ／ｍｌの濃度にて０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した７５μｌのジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、上記マイクロスフェアに添加し、そしてＤｙｎａｌ撹拌機において２時間にわたって混合した；
洗浄を改善するために混合した後、さらなる２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を、チューブに添加し、そして倒置によって簡単に混合した；
上記マイクロスフェアを、１８００ｇで１５分間にわたる遠心分離によって上清から分離した；
上記マイクロスフェアを、２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁した；
ペプチドＡまたはペプチドＢを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に溶解した。１０ｍｇ／ｍｌにおける１００μｌのペプチドを、上記マイクロスフェアに添加し、そしてＤｙｎａｌ撹拌機において室温にて６時間にわたって混合した；
２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を、添加し、そして倒置によって簡単に混合した；
上記マイクロスフェアを、１８００ｇで１５分間にわたる遠心分離によって上清から分離した；
上記マイクロスフェアを、さらなる５．０ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）によって洗浄し、そして記載したような遠心分離によって分離した；
上記マイクロスフェアを、５％ヒト血清アルブミンを含む２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓに再懸濁した；
上記マイクロスフェアを、２００μｌのアリコートに充填し、そして−７０℃にて保存した。
【００８３】
（実施例３）
（トロンビンの非存在下（ｉ）および存在下（ｉｉ）における、マイクロスフェア（Ｍ／Ｓ）に連結されたフィブリノゲン結合前駆体（ペプチドＡ）およびマイクロスフェア（Ｍ／Ｓ）に連結されたフィブリノゲン結合ペプチド（ペプチドＢ）へのフィブリノゲンの結合の測定）
ペプチドＡに連結されたマイクロスフェア、およびペプチドＢに連結されたマイクロスフェアを、実施例２に記載したように調製した、そして下の表に示したように、緩衝液またはトロンビンと一緒に３０分間にわたって混合した：
【００８４】
【表１】
次いで、上記マイクロスフェアを、１８００ｇにて１０分間遠心分離することによって回収した。上記マイクロスフェアを、１００μｌのＴｒｉｓに再懸濁して、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。１０μｌのヒルジン １００Ｕ／ｍｌを、残余のトロンビンを阻害するために添加した。
【００８５】
濃度０．１ｍｇ／ｍｌにおける１８０μｌのフィブリノゲンを、２０μｌのペプチドＡに連結されたマイクロスフェアまたは２０μｌのペプチドＢに連結されたマイクロスフェアに添加し、そして１時間にわたって混合した。
【００８６】
フィブリノゲンの結合を、以下の通りに測定した。５μｌのマイクロスフェアを、５０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加した。ヒトフィブリノゲンへの１μｌのＦＩＴＣ標識した抗体を、添加し、そして２０分間にわたって混合した。その反応を、０．２％のホルミル食塩水（Ｆｏｒｍｙｌ ｓａｌｉｎｅ）の添加によって停止させた。結合した蛍光を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬ ＭＣＬ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
【００８７】
その結果を、図４に示す。ペプチドＡマイクロスフェアをフィブリノゲンと一緒に混合した場合、予めトロンビンと一緒にインキュベートされなかったペプチドＡマイクロスフェアは、少量のフィブリノゲン（６％）のみを結合した。ペプチドＡに結合されたマイクロスフェアを最初にトロンビンと一緒にインキュベートし、次いでフィブリノゲンと一緒に混合した場合、８６％が、フィブリノゲンを結合した。
【００８８】
ブロック配列を伴わないフィブリノゲン結合ペプチドであったペプチドＢは、トロンビンの存在下および非存在下でフィブリノゲンを結合した。
【００８９】
（実施例４）
（本発明の因子のさらなる例：）
【００９０】
【化５】
ここで：
「／」は、トロンビン切断部位を示し；
【００９１】
【化６】
は、表面スルフヒドリル基を有するアルブミン微粒子を示し；そして
【００９２】
【化７】
は、上記ペプチド配列の末端マレイミドと上記アルブミン微粒子のスルフヒドリル基との反応によって形成されたチオエーテル共有結合を示す。
【００９３】
（実施例５）
（マレイミド連結化学を使用した微粒子へのフィブリノゲン結合前駆体ペプチド（ペプチドＣ）の連結）
Ｃ末端上にマレイミド（ＭＡＬ）部分を有する以下のペプチド：Ｈ２Ｎ−ＬＶＰＲＧＰＲＰＧ５Ｋ−ＭＡＬ（ペプチドＣ）（配列番号４２）を、合成し、そして以下の通りに、ヒトアルブミンから構成された微粒子に架橋した：
ペプチド結合体化の前に、上記微粒子のスルフヒドリル含量を、改変型Ｅｌｌｍａｎｓアッセイによって以下の通りに決定した：ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８）に４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。２０ｍｇ／ｍｌ（０．２ｍｌ）に調製した上記微粒子サンプルを、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．７９ｍｌの０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８）と一緒に混合し、そして１０μＬのＤＴＮＢストックを、その反応に添加した。コントロールブランクを、微粒子を含まない０．２ｍｌの緩衝液を用いて調製した。上記反応を、ターンテーブル上で２０分間にわたって混合し、次いで遠心分離（１８００ｇにて１５分間）し、そしてその上清を、シリンジによって回収し、次いで０．２２μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。その濾液を、４１２ｎｍにて分光光度計を使用して分析し、そしてスルフヒドリル基の量を、１３６００のモル吸光係数を使用して決定した。上記チオール含量は、代表的に、１モルのアルブミンタンパク質あたり０．６モル〜０．３モルの間のチオールであった。
【００９４】
微粒子へのマレイミド改変ペプチドの結合体化のために；６２．５ｍｇのヒト血清アルブミン微粒子を、ターンテーブル上で１０分間にわたって混合し、次いで１０分間にわたって超音波処理することによって、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．４ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）に分散させた。
【００９５】
ペプチドＣを、１０ｍＭ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。ペプチドストック（１００μｌ）を、上記微粒子に添加し、そしてＤｙｎａｌ撹拌機において室温にて１時間にわたって混合した。その反応を、等量の０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に希釈し、そして倒置によって簡単に混合した。上記微粒子を、１８００ｇにて１５分間の遠心分離によって上清から分離した。
【００９６】
上記微粒子を、さらなる５．０ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）によって洗浄し、そして記載したような遠心分離によって分離した；
上記微粒子を、２％マンニトールを含む２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。上記微粒子を、２００μｌのアリコートに充填し、そして−７０℃にて保存した。
【００９７】
（実施例６）
（トロンビンを伴うかまたは伴わないインキュベーション後における微粒子へのフィブリノゲンの結合の測定）
微粒子を、実施例５に記載した通りに、ペプチドＣによって改変した。微粒子を、フィブリノゲン結合配列がトロンビンによって露出されることを確認するために、トロンビンへの曝露後にフィブリノゲン溶液と一緒に混合した。
【００９８】
０．７ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの微粒子を、３７℃にて０〜０．６４Ｕ／ｍＬのトロンビンと一緒にインキュベートし、２分後に、そのトロンビンを、１０Ｕ／ｍＬの最終濃度におけるヒルジン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって阻害した。微粒子を、９３００ｇにて５分間遠心分離し、そしてＨＢＳに再懸濁して、１４ｍｇ／ｍＬを得た。上記微粒子を、０．１ｍｇ／ｍＬのヒトフィブリノゲン（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ：ＳＮＢＴＳ）において１０倍に希釈し、そして室温にて１時間インキュベートした。結合したフィブリノゲンの量を、ポリクローナル抗体ウサギ抗ヒトフィブリノゲン−ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによって決定した。これらの結果は、図５において、トロンビンを伴わずにペプチドＣによって改変した上記微粒子は、フィブリノゲンに結合しないが、トロンビン濃度を上昇させることによって、微粒子に結合したフィブリノゲンの量が試験した微粒子の全３種の濃度において増加したことを示す。ペプチドＣによって改変しなかった微粒子は、トロンビン曝露を伴うかまたは伴わないフィブリノゲンを結合しない。
【００９９】
（実施例７）
（トロンビンに応答したフィブリノゲンにおけるクロット形成）
クロット形成を、以下の通りに、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＡＰ−４（ＢｉｏＤａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を使用して濁度の減少によって決定した；
ペプチドＣに連結された微粒子を、実施例５に記載した通りに、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。ベースラインの光学濃度を、ＨＢＳ中に３ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン（ＳＮＢＴＳ）溶液を用いて設定した。フィブリノゲン溶液（２０５μｌ）を、３７℃まで１分間にわたって予め温め、その後、微粒子（２５μｌ）を、９００ｒｐｍに設定した撹拌子の速度を伴って添加した。２分後に、２０μＬのヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を、添加して、０．０３２Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。代表的な凝集プロフィールを、図６に示す。トロンビンの非存在下において、ブランクもペプチドＣによって改変した微粒子も、クロットを形成しなかった。２分におけるトロンビンの添加後に、その溶液の濁度は、コントロールの未改変微粒子と比較して、ペプチドＣ改変微粒子を含む溶液についてより迅速に低下し、これは、クロット形成を示す。
【０１００】
（実施例８）
（ペプチドＣ改変微粒子をトロンビンと一緒にプレインキュベートした後の、トロンビンに応答した血漿におけるクロット形成）
クロット形成を、緩衝液中でトロンビンに対して予め曝露したペプチドＣ改変微粒子を用いて血漿においてモニタリングした。血漿中の微粒子クロット形成を、上に記載した通りに、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＡＰ−４（ＢｉｏＤａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を使用して濁度計で決定した。
【０１０１】
ペプチドＣ改変微粒子を、実施例５に記載した通りに、ＨＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。ペプチドＣ改変微粒子を、０．６Ｕ／ｍｌのトロンビンと一緒に１時間にわたってプレインキュベートし、次いでヒルジン（１０Ｕ／ｍｌ）を、トロンビン活性を阻害するために添加した。その反応を、９３００ｇにて５分間遠心分離し、次いでＨＢＳに２．５ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。ベースラインの光学濃度を、クエン酸塩添加血から調製した血漿を用いて設定した。血漿サンプル（２０５μｌ）を、３７℃まで１分間にわたって予め温め、その後、微粒子（２５μｌ）を、９００ｒｐｍに設定した撹拌子の速度を伴って添加した。２分後に、２０ｕＬのトロンビンストック溶液を、その反応に添加して、０．２５Ｕ／ｍｌの最終トロンビン濃度を得た。代表的な凝集プロフィールを、図７に示す。この図は、ペプチドＣ微粒子を血漿を伴うインキュベーションの前および間の両方においてトロンビンに曝露する場合に、クロット形成が生じることを示す。トロンビン曝露を伴わない場合、上記ペプチドＣ改変微粒子は、２０分間を超えてクロット形成をもたらさなかった。
【０１０２】
（実施例９）
（トロンビンに応答した血漿におけるクロット形成）
血漿中の微粒子クロット形成を、上に記載した通りに、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＡＰ−４（ＢｉｏＤａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を使用して濁度計で決定した。
【０１０３】
ペプチドＣ改変微粒子を、実施例５に記載した通りに、ＨＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。ベースラインの光学濃度を、クエン酸塩添加血から調製した血漿を用いて設定した。血漿サンプル（２０５μｌ）を、３７℃まで１分間にわたって予め温め、その後、微粒子（２５μｌ）を、９００ｒｐｍに設定した撹拌子の速度を伴って添加した。２分後に、２０ｕＬのヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を、その反応に添加して、０．２５Ｕ／ｍｌの最終トロンビン濃度を得た。代表的な凝集プロフィールを、図８に示す。これらの結果は、トロンビンの添加を伴わない血漿において、未改変微粒子およびペプチドＣ改変微粒子の両方がクロットを形成しなかったことを示す。２分の時点におけるトロンビンの添加によって、ペプチドＣによって改変した微粒子は、未改変のコントロールブランク微粒子と比較して、血漿における加速したクロット形成を示した。
【０１０４】
（実施例１０）
（ペプチドＣ改変微粒子の存在下における血小板凝集）
ペプチドＣ改変微粒子の存在下における血小板凝集を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅｌｅｔインピーダンス血小板凝集計（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）Ｄｙｎａｂｙｔｅ ｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｕｎｉｃｈ）を使用して測定した。
【０１０５】
ペプチドＣ改変微粒子を、実施例５に記載した通りに、ＨＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。上記微粒子（０．７５ｍｇ）を、ＨＢＳ中の１Ｕ／ｍｌのヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）（総容量０．３ｍｌ）と一緒に１時間プレインキュベートした。トロンビン活性を阻害するために、ヒルジン（Ｓｉｇｍａ）を、５Ｕ／ｍｌの最終濃度で添加した。その反応を、９３００ｇにて５分間遠心分離し、そして上清を、廃棄した。上記微粒子を、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度までＨＢＳに再懸濁した。
【０１０６】
血小板減少血液を、以下の通りに、クエン酸塩添加血から調製した：
血小板を、全血を１６３ｇにて２０分間遠心分離し、そして血小板が豊富な上層を廃棄することによって除去した。上部の血小板が豊富な層を、全血を１８００ｇにて３０分間遠心分離した後に上清として単離した血漿によって置換した。
【０１０７】
電気インピーダンスをモニタリングするために；それぞれの電極ウェルについて、０．３ｍｌの血液を、３７℃にて微粒子（０．１５ｍｇ）および生理食塩水と一緒にインキュベートして、０．６ｍｌの総容量を得た。凝集を、３０μｌの活性化剤であるアデノシン二リン酸溶液（０．１ｍＭ）の添加直後に記録した。凝集を、６分間にわたって記録した；図９における結果は、最終的な凝集の任意の単位で示す。これらの結果は、微粒子を伴わないＴＣＢまたはブランク微粒子と比較して、ペプチドＣ改変微粒子の存在下の活性化ＴＣＢにおけるより大きい電気インピーダンス（すなわち、最終的な凝集よりも大きい）を示す。
【０１０８】
（実施例１１）
（候補フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの加水分解の決定）
候補ペプチド（そのペプチドのＮ末端に放射標識分子、色素分子または蛍光発生分子を有する）を、合成する。上記ペプチドを、実施例２または５に記載した方法を使用して不溶性キャリアに連結する。そのペプチド改変キャリアを、緩衝液において純粋なプロテアーゼと一緒にインキュベートする。上記改変キャリア上に残存する標識の量は、そのペプチドの加水分解速度を決定することを可能にする。
【０１０９】
例えば、５，６−カルボキシフルオレセイン標識したペプチドである５，６−ＦＡＭ−ＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧ−Ｃｙｓ（配列番号４３）。その標識したペプチドを、ペプチド結合を容易にするために、ＤＮＴＢを使用し、実施例２に記載した方法を使用してアルブミン微粒子に結合体化する。ペプチド加水分解の速度を、フローサイトメーターを使用して、上記微粒子上に残存する結合したフルオレセインの量によって決定する。
【０１１０】
上記標識したペプチドと結合体化した微粒子を、ｐＨ７．４にて種々の濃度のヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）と一緒に混合し、そして３７℃にて種々の期間にわたってインキュベートする。次いで、その反応を、トロンビンの単位に対して５倍過剰なヒルジンの添加によって停止させ、そしてその反応を、フローサイトメトリーによって分析するために、適切に希釈する。この手順は、アルブミン微粒子に結合体化した場合にトロンビンによって加水分解され得るペプチドの同定を可能にする。同等の手順はマイクロスフェアに結合体化された場合に他のプロテアーゼによって加水分解され得るペプチドを同定するために使用され得ることが、認識される。
【０１１１】
（実施例１２）
（フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの安定性の決定）
Ｎ末端標識を有する候補フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを、合成し、そして実施例１１に記載した通りに、不溶性キャリアに結合体化する。上記標識したペプチドに連結された微粒子を、生物学的サンプル（例えば、全血、血漿または組織ホモジネート）においてインキュベートする。上記ペプチドの安定性は、上記微粒子上のインタクトな蛍光ペプチドの量を反映する。関連するプロテアーゼを同定するために、特定のプロテアーゼ員日々バーを、上記インキュベート反応に含める。
【０１１２】
例えば、クエン酸塩添加血を、トロンビンインヒビターであるヒルジン（５Ｕ／ｍｌ）と一緒に混合し、そしてその血液を、２０ｍｍｏｌ／ｍＬのカルシウムによって再石灰化する。次いで、上記標識したペプチドによって改変した微粒子を、２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度でその血液に添加する。その反応を、３７℃に維持しながら混合し、その反応のサンプルを、異なる時点にて採取し、適切に希釈し、そしてフローサイトメーターに適用してインタクトな結合したペプチドの量を決定する。
【０１１３】
（実施例１３）
（インビボでの用量関連性の止血活性の評価）
（１．血小板減少性ウサギモデルにおける用量関連性の止血活性）
雄ニュージーランド白ウサギ（２．５〜４．０ｋｇ）を、標準的な供給業者から得る。６羽までのウサギの群を、２用量の細胞傷害性薬物ブスルファンを、それぞれ、この研究の１２日前および９日前に使用して血小板減少性にする。ブスルファンの用量を、必要とする血小板減少症の重篤度にしたがって変化させる（例えば、２用量の２０ｍｇ／ｋｇは、一般に、血小板数を１０×１０９／ｌ〜２０×１０９／ｌの間まで減少させるのに対して、２用量の２５ｍｇ／ｋｇは、血小板数を１０×１０９／ｌ未満まで減少させる）。血小板数の減少に加えて、ブスルファン投薬は、白血球の枯渇を伴うが、ヘマトクリットの小さい減少のみを伴い、そして明白な毒性を伴わない。麻酔剤は、この手順に必要ではない。
【０１１４】
ヒト血小板濃縮物を、これらの研究のためにポジティブコントロールとして使用する。これは、動物の１群あたり１つの血小板濃縮物のみを必要とする。ヒト血小板は細網内皮系による取り込みに起因してウサギにおいて約５分間のみにわたって循環することが、先に示されている。したがって、これらの実験において、マクロファージ機能を、研究日の２４時間前に上記ウサギにパルミチン酸エチルを投薬することによって阻害する。一貫性のために、パルミチン酸エチルによる処置が、動物の全ての群に対して使用され得る。
【０１１５】
研究日において、試験因子を、耳静脈中に静脈内に注入する。効力を、その耳の標準的な切開を使用して行われる出血時間の測定によって評価する。
【０１１６】
出血時間の変動性を、上記動物がおとなしくかつ温かく、そして均一な温度であることを確保することによって、可能な限り制御し（Ｒｏｓｋａｍ、１９９３、Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅｓ Ｓｅａｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ、１１４、１６６−１６９）、そして血液サンプルの数を最小化する。Ｂｌａｊｃｈｍａｎ ＆ Ｌｅｅ、１９９７、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１１、９９−１０５。出血時間を、試験用量の投与直前、および投薬の２４時間後のまでの時点において測定する。２０分間を超える出血時間を、創傷に圧力を適用することによって停止させる。動物を、この研究の完了において屠殺する。
【０１１７】
用量／ｋｇベースにおける本発明の因子の用量関連性の活性を、ヒト血小板の活性と比較した出血時間の減少によって規定する。同じ大きさであるがペプチドとカップリングしていないＨＳＡ微粒子を、ネガティブコントロールとして使用する。この研究の２４時間にわたって効果の持続時間の比較が、行われ得る。
【０１１８】
血小板減少性ウサギにおいて、約２０分間の出血時間が、代表的である。本発明の因子は、６羽の群中の３羽、そして好ましくは６羽全ての試験ウサギの出血時間を最小で１０分未満まで減少させ得るはずである。
【０１１９】
（２．ウサギＷｅｓｓｌｅｒモデルにおける血栓形成性の評価）
本発明の因子の潜在的な血栓形成性を、本質的に、Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９５９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１４、９４３−９４６によって記載されるようなＷｅｓｓｌｅｒモデルにおいて評価する。
【０１２０】
雄ニュージーランド白ウサギ（体重２．５ｋｇ〜４．０ｋｇ）を、認可された供給業者から入手し、そして最大で６羽のウサギの群を、麻酔する。左右の頸静脈の区域を、露出させ、そして周囲の組織から引き離す。試験調製物を、耳静脈を介して投与し、そして３分間の循環期間の後、その頸静脈の区域を、結紮し、そしてさらに１０分間にわたってその位置に放置する。その区域を、慎重に切除し、そしてその管腔を、露出させる。その血管を、視覚的に記録される発生した血栓の存在について調べる。
【０１２１】
本発明の因子は、出血時間の最適な減少に関連する用量よりも５倍（好ましくは、１０倍）高い用量において、血栓を産生しないはずである。
【０１２２】
本発明の因子の適切な用量は、患者の体重１ｋｇあたり１×１０８〜２×１０１０個の生成物粒子であり得る。例えば、その用量（体重１ｋｇあたりの生成物粒子の数として示す場合）は、約２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０または２×１０１０であり得る。
【０１２３】
適切な用量はまた、患者の体重１ｋｇあたりの総タンパク質のミリグラムとして示され得る。これに基づくと、適切な用量は、５〜２００ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、その用量は、約５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１２４】
理想的な用量は、少なくとも２倍、好ましくは約１０倍の安全域を有する。換言すれば、その理想的な用量は、２倍または約１０倍増加した場合でさえ、有効であるが、安全なままである。安全な用量は、上に記載したようなＷｅｓｓｌｅｒ試験を用いて、クロットを形成しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１−１】図１は、本発明の因子の第１の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図１−２】図１は、本発明の因子の第１の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図２】図２は、本発明の因子の第２の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図３Ａ】図３ａは、本発明の因子の第３の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図３Ｂ】図３ｂは、本発明の因子の第４の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図４】図４は、実施例３に記載されるようなペプチドに連結されたマイクロスフェアへのフィブリノゲンの結合の測定の結果を示す。
【図５】図５は、種々の濃度のトロンビンとのインキュベーション後における、マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲンの％を示す。０．７ｍｇ／ｍｌ（黒三角）におけるペプチド改変を有さないマイクロスフェアならびに０．７ｍｇ／ｍｌ（黒丸）、５ｍｇ／ｍｌ（黒四角）または１０ｍｇ／ｍｌ（黒逆三角）におけるペプチドＣによって改変されたマイクロスフェア。
【図６】図６は、それぞれ、０．０３２Ｕ／ｍｌのトロンビンの非存在下（１および２）または存在下（３および４）における、ブランク微粒子またはペプチドＣ改変微粒子とフィブリノゲンとの凝集プロフィールを示す。
【図７】図７は、ペプチドＣ改変微粒子と、トロンビンに曝されていない血漿との凝集プロフィール（１）、およびペプチドＣ改変微粒子と、トロンビンとプレインキュベートされ、そしてトロンビンが２分後に添加される血漿に添加された血漿との凝集プロフィール（２）を示す。
【図８】図８は、ブランク微粒子またはペプチドＣ改変微粒子と、血漿との凝集プロフィールを示す。トロンビンを伴わないペプチドＣ（１）微粒子およびブランク（２）微粒子；２分目においてトロンビンの添加を伴うブランク（３）およびペプチドＣ（４）マイクロスフェア。
【図９】図９は、血小板凝集測定を使用した、トロンビンに予め曝露されている微粒子を伴うアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって活性化された血小板減少血液における血小板凝集およびトロンビンに予め曝露されている微粒子を伴わないアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって活性化された血小板減少血液における血小板凝集を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工血小板として使用するのに適した因子に関する。その因子は、患者固有の血小板における欠損（例えば、血小板数の遺伝性または後天性の欠損（血小板減少症）あるいは機能の遺伝性または後天性の欠損（血小板無力症））を有する患者を処置するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
最近、血小板輸血は、急性出血および血小板の産生および／または機能の障害を有する患者における出血の予防に対する唯一の有効な処置である。しかし、輸血のために使用される血小板濃縮物の貯蔵寿命は、５日間だけである。血小板輸血に伴う感染の危険性および患者が血小板濃縮物に対するアレルギー反応を有し得る危険性もまた、存在する。
【０００３】
血小板濃縮物および血小板輸血に関連する懸案事項に鑑みて、人工血小板を開発する試みが、行なわれている。人工血小板が血管損傷の部位（血小板が活性化される）において互いおよび内因性の血小板と凝集するが、他の場所における凝集は最小限であることが、重要である。血小板が活性化される場合、血小板膜糖タンパク質（ＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａ）のコンホメーション変化は、血小板膜糖タンパク質を血漿フィブリノゲンに結合させ、そしてさらなる血小板を、成長する血栓に補充する。
【０００４】
特許文献１は、２つの人工血小板生成物の生産を記載する。生成物１は、末端のシステインを介してヒトアルブミンマイクロスフェアに架橋された配列ＮＨ２−ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号１）のペプチドである。フィブリノゲンは、上記ペプチドに結合される。生成物２は、フィブリノゲンが上記ペプチドに結合されないことを除いて生成物１と同一である。投与される場合、生成物２は、上記ペプチドを介して内因性フィブリノゲンに結合する。上記ペプチドは、フィブリノゲンがそのネイティブなコンホメーションで維持されるか、またはネイティブなコンホメーションに近づくようにフィブリノゲンに結合することができる。これは、活性化形態のＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａレセプターとの優勢な相互作用を可能にする。結合されたフィブリノゲンはまた、フィブリノゲンを切断するトロンビンと相互作用し得、フィブリン−フィブリン橋を介する上記マイクロスフェアの架橋を可能にする。
【０００５】
生成物１と比較して、生成物２は増強された安全性プロフィールを有すると考えられる。なぜならば生成物２は、患者の内因性フィブリノゲンに結合するからである。これは、生成物２が投与される場合に、感染およびアレルギー反応の危険性を減少させる。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ ２００５／０３５００２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに改良された人工血小板を提供することが、望まれる。特に、血管損傷の部位から離れた部位における血栓形成の危険性がさらに最小化される人工血小板を提供する必要性が、存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に従って、人工血小板として使用するための因子が提供され、上記因子は、不溶性キャリアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体を含み、ここで上記フィブリノゲン結合前駆体は、上記キャリアに結合されたフィブリノゲン結合成分へと創傷部位特異的因子によって変換されることができ、上記フィブリノゲン結合成分は、上記フィブリノゲン結合前駆体と比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、そして上記フィブリノゲン結合前駆体は、フィブリノゲンではない。
【０００８】
一旦上記フィブリノゲン結合前駆体が創傷の部位で上記フィブリノゲン結合成分に変換されると、上記フィブリノゲン結合成分が、フィブリノゲンに結合できることにより、結合されたフィブリノゲンが、血小板に結合し、それによって血小板凝集を引き起こし得る。創傷部位特異的因子が、上記フィブリノゲン結合前駆体を変換するために必要とされるので、創傷の部位から離れた部位における血小板凝集は、最小化される。既知の人工血小板と比較して、本発明の因子は創傷から離れた血栓形成性が減少しており、それによって安全性が増強されていると、考えられる。
【０００９】
本発明の因子のさらなる利点は、上記フィブリノゲン結合成分が、結合されたフィブリノゲンが活性化された血小板と優勢に相互作用するようにフィブリノゲンをそのネイティブなコンホメーションで維持するかまたはネイティブなコンホメーションに近いような様式で、フィブリノゲンに結合することは、必須ではないということである。これは、上記因子が創傷の部位においてのみ活性化されるからである。結果的に、フィブリノゲン結合成分の選択は、ＷＯ ２００５／０３５００２に記載される生成物１および生成物２に関するものほど重要ではない。それでもなお、上記フィブリノゲン結合成分がフィブリノゲンに結合することにより、結合されたフィブリノゲンが活性化された血小板と優勢に相互作用することが、好ましい。これは、上記因子が創傷部位から離れた部位において血栓形成を引き起こす危険性をさらに最小化する。
【００１０】
一旦フィブリノゲンが、上記フィブリノゲン結合成分に結合されると、そのフィブリノゲンは、フィブリン−フィブリン橋を介した不溶性キャリアの架橋を可能にするためにトロンビンによって切断され得るべきである。
【００１１】
好ましくは、上記フィブリノゲン結合成分は、１０−９Ｍ〜１０−６Ｍの間の解離定数（ＫＤ）でフィブリノゲンに結合する。
【００１２】
上記解離定数は、平衡状態にて測定され得る。例えば、既知の濃度の放射標識されたフィブリノゲンが、フィブリノゲン結合成分が架橋されているマイクロスフェアと一緒にインキュベートされ得る。代表的に、５μＭのペプチドが、１ｇｍのマイクロスフェアに架橋されるか、または１５〜４０μＭのペプチドが、１ｇｍのマイクロスフェアに架橋される。上記ペプチドに連結されたマイクロスフェアは、０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈され、そしてｐＨ７．４の等張緩衝液（例えば、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液）中で、０．０５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度において最大で１時間まで２０℃にて放射標識されたフィブリノゲンと一緒にインキュベートされる。上記マイクロスフェア上のフィブリノゲン結合成分に結合されたフィブリノゲンは、遠心分離によって遊離のフィブリノゲンから分離され得、そして遊離のフィブリノゲンの量および結合されたフィブリノゲンの量が、測定され得る。次いで、その解離定数が、結合されたフィブリノゲンの濃度を結合されたフィブリノゲン：遊離のフィブリノゲンの濃度の比に対してプロットすることによるスキャッチャード分析（その曲線の傾斜がＫＤを示す）によって算出され得る。
【００１３】
フィブリノゲンへの上記フィブリノゲン結合前駆体（および上記不溶性キャリア）の親和性はより低いほど良いことが、認識される。これは、創傷の部位で創傷部位特異的因子によって変換されない限り、本発明の因子の血小板凝集を引き起こす危険性を最小化する。
【００１４】
患者への本発明の因子の投与は、創傷部位から離れた部位における医学的に受容不可能なレベルの血液凝固を引き起こすべきではない。医学的に受容不可能なレベルの血液凝固は、深静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）、一過性の脳虚血または心血管虚血あるいは脳卒中を含む。
【００１５】
好ましくは、フィブリノゲンについての上記フィブリノゲン結合前駆体の解離定数は、１×１０−６Ｍよりも大きい。
【００１６】
上記フィブリノゲン結合前駆体は、ペプチドまたはペプチドアナログであり得るが、好ましくはペプチドである。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体は、ブロック成分（好ましくは、ペプチド）にアミノ酸末端にて結合されたフィブリノゲン結合ペプチド（すなわち、フィブリノゲン結合成分）を含み、上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する（すなわち、減少させる）。上記創傷部位特異的因子による上記フィブリノゲン結合前駆体の切断は、上記不溶性キャリアに結合された上記フィブリノゲン結合ペプチドを露出させる。このような実施形態において、上記ブロック成分は、切断が起きるまで、フィブリノゲン結合ペプチドのフィブリノゲンを結合する能力をブロックまたは阻害する。好ましくは、上記ブロック成分は、１〜３０アミノ酸残基長のペプチドである。
【００１８】
任意の適切なフィブリノゲン結合ペプチドが、使用され得る。例えば、上記ペプチドは、フィブリンに天然に結合されているフィブリノゲンの領域に結合することができる（すなわち、血小板膜糖タンパク質ＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａによって）。フィブリノゲンへのフィブリンの結合は、Ｍｏｓｅｓｓｏｎら、２００１、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３６、１１−３０において考察される。フィブリノゲンへのＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの結合は、Ｂｅｎｎｅｔｔ、２００１、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３６、３４０−３５４において考察される。
【００１９】
上記ペプチドは、フィブリノゲンのα鎖のカルボキシ末端ドメインおよび／またはアミノ末端ドメインに結合することができる。特に、上記ペプチドは、ＲＧＤ含有モチーフに対して、これらのドメイン（例えば、アミノ酸９５〜９８のＲＧＤＦ（配列番号２）、アミノ酸５７２〜５７５のＲＧＤＳ（配列番号３））の一方または両方において結合することができる。上記ペプチドは、フィブリノゲンのγ鎖のカルボキシ末端ドメイン（好ましくは、このドメインの最後の１２アミノ酸（配列ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ（配列番号４））に結合することができる。上記ペプチドは、フィブリノゲンのγ鎖のＤ−ドメイン（例えば、Ｄ−ドメインのβ鎖セグメント）に結合することができる。
【００２０】
上記フィブリノゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩｂまたはＧＰＩＩＩａのフィブリノゲン結合領域に由来する配列を含み得る。例えば、上記ペプチドは、ＧＰＩＩｂのアミノ酸残基２９４〜３１４の配列に対応する配列ＡＶＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬＹＭ（配列番号５）、またはフィブリノゲン結合活性を保持するそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。フィブリノゲン結合活性を保持することが公知であるフラグメントは、ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬ（２９６〜３０６）（配列番号６）、ＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬ（３００〜３１２）（配列番号７）、およびＧＡＰＬ（配列番号８）である。ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬの適切な誘導体としては、以下が挙げられる：Ｔ（Ｄ，Ｅ）ＶＮＧ（Ｄ，Ｅ）ＧＲＨ（Ｄ，Ｅ）Ｌ（配列番号９）；ＴＤ（Ｖ，Ｌ）ＮＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号１０）；ＴＤＶ（Ｎ，Ｑ）ＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号１１）；ＴＤＶＮＧＤＧ（Ｒ，Ｋ）ＨＤＬ（配列番号１２）。
【００２１】
上記フィブリノゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩＩａの残基９５〜２２３の配列またはフィブリノゲン結合活性を保持するそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。例えば、配列ＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧ（配列番号１３）を含む残基２１１〜２２２は、ＧＰＩＩＩａにおける重要なフィブリノゲン結合ドメインであると考えられる。ＧＰＩＩＩａの他の適切な領域は、残基１０９〜１７１および残基１６４〜２０２を含む。
【００２２】
上記フィブリノゲン結合ペプチドは、トロンビンの作用によってフィブリノゲンに対して露出され、そしてフィブリンを産生する重合反応における第１工程としてフィブリノゲンに結合する残基の配列を含み得る。トロンビンは、フィブリノゲンのα鎖およびβ鎖のＮ末端からペプチド切断（フィブリノペプチドＡおよびＢを放出）して、それぞれ、配列ＮＨ２−ＧＰＲ−（配列番号１４）およびＮＨ２−ＧＨＲ−（配列番号１５）を露出させる。したがって、フィブリノゲン結合ペプチドの好ましい例は、そのアミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−Ｇ（Ｐ，Ｈ）ＲＸ−（配列番号１６）を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸であり、そして（Ｐ，Ｈ）は、プロリンまたはヒスチジンのいずれかがその位置に存在することを意味する。好ましくは、上記ペプチドは、そのアミノ末端に配列ＮＨ２−ＧＰＲＰ−（配列番号１７）を含む。
【００２３】
好ましくは、上記フィブリノゲン結合ペプチドは、４〜３０アミノ酸残基長、より好ましくは４〜１０アミノ酸残基長である。
【００２４】
上記創傷部位特異的因子は、好ましくは、フィブリノゲン結合前駆体を切断し得る、創傷の部位において産生される天然に存在する酵素である。このような実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体は、上記創傷部位特異的因子によって特異的に認識される、切断部位を含むべきであり、そしてその切断部位は、上記フィブリノゲン結合ペプチドと上記ブロック成分との間に位置する。トロンビンは、好ましい創傷部位特異的因子である。しかし、他のセリンプロテアーゼ（例えば、第Ｘａ因子またはＦＩＸａ）は、創傷部位において産生され得、そしてフィブリノゲン結合前駆体を切断するために使用され得る。トロンビンは、アルギニン残基のカルボキシ末端、そして一般にアルギニンとグリシンとの間でペプチド結合を切断することが、公知である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体は、そのアミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−ＺＹＸＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１８）を含むペプチドであり、ここで「／」は、トロンビン切断部位を示し、そしてＸは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはプロリンであり、Ｙは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸またはアラニンであり、そしてＺは、好ましくはロイシンまたはプロリンである少なくとも１個のアミノ酸である。例は、以下である：ＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１９）、ＮＨ２−ＡＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号２０）、ＮＨ２−ＬＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号２１）、またはＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＶ−（配列番号２２）。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、上記創傷部位特異的因子に対する結合部位をさらに含む。これは、創傷部位における上記フィブリノゲン結合前駆体の上記フィブリノゲン結合成分への変換を増強すると予想される。上記結合部位は、上記フィブリノゲン結合前駆体または上記フィブリノゲン結合前駆体の部分に結合された不溶性キャリア上にあり得る。好ましい実施形態において、上記結合部位が、上記フィブリノゲン結合成分に結合されることにより、上記創傷部位特異的因子による上記フィブリノゲン結合前駆体の切断が、上記結合部位を放出させて、上記フィブリノゲン結合成分を露出させる。例えば、上記フィブリノゲン結合前駆体は、カルボキシ末端からアミノ末端の方向に、上記不溶性キャリアに固定化されたフィブリノゲン結合ペプチド、上記創傷部位特異的因子に対する切断部位、および上記創傷部位特異的因子に対する結合部位を含むペプチドを含むペプチドであり得る。代表的に、上記結合部位ペプチドのカルボキシ末端は、上記創傷部位特異的因子が上記切断部位で上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する場合にその創傷部位特異的因子により認識される配列によって、上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端から分離される必要がある。例えば、上記創傷部位特異的因子がトロンビンであり、そしてフィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端残基がＧである場合、その配列は、上で規定されるようなＲＸＹＺ（カルボキシ方向からアミノ方向において）（配列番号２３）であり得る。必要に応じて、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）がまた、上記創傷部位特異的因子によって認識される切断配列と、上記結合部位ペプチドとの間に存在し得る。上記スペーサーは、上記創傷部位特異的因子が上記結合部位ペプチドに結合される場合にその創傷部位特異的因子に上記フィブリノゲン結合前駆体を切断させ得るのに十分に長いべきである。好ましくは、上記スペーサーは、１〜２０アミノ酸残基長のペプチドである。
【００２７】
上記創傷部位特異的因子がトロンビンである場合、本発明の因子はトロンビン結合部位をさらに含むことが、好ましい。上記トロンビン結合部位は、好ましくは、トロンビンが好ましくはＫｄ．１０−９〜１０−６の親和性で結合することができるペプチドによって提供される。好ましくは、そのペプチドは、トロンビンのエキソサイト（ｅｘｏｃｉｔｅ）Ｉ結合ドメインまたはエキソサイトＩＩ結合ドメインが結合することができる配列を含む。トロンビン結合ペプチドの適切な例は、ＰＡＲ−１レセプターのエキソサイト結合部位に由来する配列（例えば、ＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号２４））、フィブリノゲンに由来する配列（例えば、ＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２５））、または第ＶＩＩＩ因子に由来する配列（例えば、ＥＥＥＤＷＤ（配列番号２６）またはＥＤＳＹＥＤ（配列番号２７））である。あるいは、上記トロンビン結合部位は、トロンビン結合ペプチドであるヒルジンに由来し得る（例えば、ＮＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬ（配列番号２８））。上記トロンビン結合ペプチドは、別個のペプチドとして上記不溶性キャリアに（ペプチドまたは非ペプチドのいずれかである適切なリンカーによって）架橋され得る。あるいは、上記トロンビン結合ペプチドは、フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分であり得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、その因子の創傷部位への局在化を促進するために、創傷部位標的成分をさらに含む。上記創傷部位標的成分は、（好ましくは、Ｋｄ １０−９〜１０−６の親和性で）創傷部位に選択的に結合するべきである。好ましくは、上記創傷部位標的成分は、細胞表面タンパク質組織因子に結合することができる。血液凝固は、細胞表面タンパク質組織因子が血管損傷後に血液に曝される場合に引き起こされる。一旦曝されると、細胞表面組織因子は、セリンプロテアーゼ第ＶＩＩ因子の不活性な前駆体、またはその酵素的に活性な形態ＶＩＩａに、非常に高い親和性および特異性で結合する。したがって、上記創傷部位標的成分は、第ＶＩＩ因子または細胞表面タンパク質組織因子に結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体、あるいは第ＶＩＩａ因子または細胞表面タンパク質組織因子に結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。
【００２９】
上記創傷部位標的成分は、上記フィブリノゲン結合前駆体または上記フィブリノゲン結合前駆体の部分に結合された不溶性キャリアに固定化され得る。１つの実施形態において、上記創傷部位標的成分および上記フィブリノゲン結合前駆体は、別々に上記不溶性キャリアに架橋される。別の実施形態において、上記創傷部位標的成分が、上記フィブリノゲン結合成分に結合されることにより、上記創傷部位特異的因子による上記フィブリノゲン結合前駆体の切断が、創傷部位標的成分を放出させて、そのフィブリノゲン結合成分を露出させる。例えば、上記フィブリノゲン結合前駆体は、カルボキシ末端からアミノ末端の方向に、上記不溶性キャリアに固定化されたフィブリノゲン結合ペプチド、上記創傷部位特異的因子に対する切断部位、および創傷部位標的成分を含むペプチドであり得る。代表的に、上記創傷部位標的成分のカルボキシ末端は、上記創傷部位特異的因子が上記切断部位で上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する場合にその創傷部位特異的因子により認識される配列によって、上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端から分離される必要がある。例えば、上記創傷部位特異的因子がトロンビンであり、そしてフィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端残基がＧである場合、その配列は、上で規定されるようなＲＸＹＺ（カルボキシ方向からアミノ方向において）であり得る。必要に応じて、スペーサーがまた、上記創傷部位特異的因子によって認識される切断配列と、上記創傷部位標的成分との間に存在し得る。上記スペーサーは、上記創傷部位標的成分を創傷部位に選択的に結合させ得るのに十分長いべきである。好ましくは、上記スペーサーは、１〜２０アミノ酸残基長のペプチドである。
【００３０】
上記不溶性キャリアは、不活性で、生体適合性であるべきであり、そしてその不溶性キャリアは、本発明の因子が投与される場合に、任意の医学的に受容不可能なレベルの血液凝固をもたらすべきではない。上記不溶性キャリアは、肺毛細管床（ｌｕｎｇ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｂｅｄ）を通した本発明の因子の透過を可能にするのに十分小さいべきである。因子が肺毛細管床を透過する能力は、Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、７０、６０３の方法を使用して決定され得る。
【００３１】
上記不溶性キャリアは、少数（例えば、数でその集団うちの約２％よりも少ない）が、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｚｅｒ ＩＩなどの粒子カウンター（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）によって測定された場合に、最大寸法として６μｍを超えているような、最大寸法を有し得る。最大寸法として２〜４μｍの大きさが、適切であり得、それは、ヒト血小板の大きさに匹敵する。
【００３２】
上記不溶性キャリアは、微粒子（固体微粒子、中空微粒子、または多孔性微粒子を含む）であり得、その不溶性キャリアは、好ましくは、実質的に球状の微粒子である。上記微粒子は、任意の適切な物質（例えば、架橋されたタンパク質）から形成され得る。適切なタンパク質は、アルブミン（血清由来アルブミンまたは組換えアルブミン、ヒトアルブミンまたは非ヒトアルブミン）である。本発明において不溶性キャリアとして使用するのに適した微粒子は、ヒト血清アルブミンを、例えば、ＷＯ ９２／１８１６４におけるような周知の噴霧乾燥技術を使用して噴霧乾燥することによって形成され得る。
【００３３】
キャリアとしての微粒子の使用に代わるものは、リポソーム、合成ポリマー粒子（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ（乳酸／グリコール酸））、または細胞膜フラグメントを含む。
【００３４】
上記フィブリノゲン結合前駆体は、任意の適切な手段によって上記不溶性キャリアに結合され得るが、そのフィブリノゲン結合前駆体は、代表的に、共有結合される。好ましい共有結合の例は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、またはアミド結合である。適切な共有結合は、上記フィブリノゲン結合前駆体がシステインを含むペプチドであり、そして上記キャリアがチオール反応基を含む場合に、形成され得る。これは、システインの−ＳＨ基を上記キャリアのチオール反応基に連結することによって、上記ペプチドがそのキャリアに結合されることを可能にする。好ましくは、末端システイン基は、上記ペプチドと上記キャリア上のチオール反応基とを架橋するために、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドに組み込まれる。あるいは、共有結合は、上記フィブリノゲン結合前駆体がマレイミド基（好ましくは、そのカルボキシ末端に（例えば、上記ペプチドのカルボキシ末端リジンに結合される））を含むペプチドであり、そして上記キャリアがスルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を含む場合に、形成され得る。次いで、上記ペプチドは、そのペプチドのマレイミド基と上記キャリアのスルフヒドリルとを反応させることによってそのキャリアに結合することができる。
【００３５】
代表的に、スペーサーは、上記フィブリノゲン結合成分のフィブリノゲン−結合活性が上記不溶性キャリアによって不利な影響を受けないことを確保するために、そのフィブリノゲン結合成分とその不溶性キャリアとの間に必要とされる。例えば、上記不溶性キャリアの表面は、上記フィブリノゲン結合成分へのフィブリノゲンの結合を、その結合がその不溶性キャリアの表面から十分な距離でない限り、立体的に障害し得る。
【００３６】
上記フィブリノゲン結合前駆体がフィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドであり、そしてその前駆体が末端アミノ酸残基によって上記不溶性キャリアに結合される場合、スペーサー配列は、好ましくは、その前駆体の末端アミノ酸残基とフィブリノゲン結合ペプチドとの間に存在する。上記スペーサー配列は、例えば、１〜２０アミノ酸残基長（好ましくは、５〜２０アミノ酸残基長）であり得る。スペーサー配列ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２９）またはＧＧＧＧＧ（配列番号３０）が、好ましい。
【００３７】
多数のフィブリノゲン結合前駆体が、上記不溶性キャリアに結合することができる。血小板は、代表的に、５０，０００〜１００，０００のＧＰＩＩｂ〜ＩＩＩａ表面タンパク質を有する。上記不溶性キャリアに結合された同様の数のフィブリノゲン結合前駆体が、適当であり得るが、約１，０００〜１０，０００が、好ましい。
【００３８】
本発明にしたがって、本発明の因子と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とを含む薬学的組成物もまた、提供される。
【００３９】
本発明の因子は、生理学的ｐＨの等張緩衝液中の懸濁物において処方され得る。マンニトール、グルコース、ヒトアルブミン、またはトレハロース（ｔｒａｈａｌｏｓｅ）を含む緩衝液が、使用され得る。本発明の因子は、使用の直前に再構成され得る凍結乾燥された投薬形態を産生するために、凍結乾燥され得る。
【００４０】
本発明の因子は、代表的に、無菌的に産生される。好ましくは、本発明の因子は、さらに、末期の滅菌処理に供される。適切な処理の例は、適切な温度（例えば、６０℃で１０時間）にて液体懸濁物を加熱すること、または１２１℃で１５分間にわたるオートクレーブにおける蒸気滅菌である。あるいは、本発明の因子は、最初に凍結乾燥され、次いで、例えば、１６０℃に少なくとも２時間、または８０℃に７２時間にわたって加熱され得る。あるいは、上記加熱処理工程は、例えば、コバルト６０供給源を使用した２５〜３５ｋＧｙへの曝露によるγ照射によって置換され得る。
【００４１】
医薬として使用するための本発明の因子もまた、本発明にしたがって提供される。
【００４２】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための医薬の製造における本発明の因子の使用が、本発明にしたがってさらに提供される。
【００４３】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための方法が、本発明にしたがってさらに提供され、この方法は、本発明の因子を、このような処置の必要がある被験体に投与する工程を包含する。
【００４４】
血小板減少症は、血球を計数することによって診断される。正常な血小板数は、１５０×１０９／ｌ〜４００×１０９／ｌである。この範囲を下回ると、主に止血が、損なわれ、そして出血時間が、延長される。しかし、生命を脅かす自発的な出血は、通常、血小板数が１０×１０９／ｌより下に下降した場合にのみ生じる。本発明の方法は、被験体が、４００×１０９／ｌを下回る血小板数、好ましくは１５０×１０９／ｌを下回る血小板数、より好ましくは１０×１０９／ｌを下回る血小板数を有する場合に、使用され得る。
【００４５】
血小板減少症の最も一般的な原因は、血液癌においてか、または細胞傷害性の化学療法または放射線療法後におけるような、骨髄からの血小板産生の不全である。
【００４６】
血小板減少症は、増大した血小板破壊を引き起こす状態から生じ得る。これらとしては、免疫性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固、ヘパリン誘発性血小板減少症、他の薬物誘発性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、ＨＩＶ−１関連血小板減少症、血栓性血小板減少症性紫斑病／溶血性尿毒症症候群、分類不可能型免疫不全、および輸血後紫斑病が挙げられる。
【００４７】
血小板減少症は、減少した血小板産生を引き起こす状態から生じ得る。これらとしては、橈骨欠損に伴う血小板減少症（ＴＡＲ）症候群、無巨核球性血小板減少症、巨大血小板症候群（例えば、ベルナール−スーリエ症候群、メイ−ヘグリン異常、Ｆｅｃｈｔｎｅｒ症候群、セバスチャン（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ）症候群、エプスタイン症候群、モントリオール血小板症候群）、およびヴィスコット−オールドリッチ症候群が挙げられる。
【００４８】
血小板減少症は、腐骨形成（例えば、脾機能亢進症またはＮａｓａｂａｃｈ−Ｍｅｒｒｉｔｔ症候群）または増大した血小板破壊を引き起こす状態および血液希釈（例えば、体外灌流）から生じ得る。
【００４９】
血小板無力症（後天性血小板機能欠損）は、尿毒症、骨髄増殖性障害（例えば、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病、および原因不明性骨髄様化生）、急性白血病および骨髄異形成症候群、異常タンパク血症、体外灌流、後天性フォンウィルブラント病、後天性貯蔵プール欠乏症、抗血小板抗体、肝疾患から生じ得る。
【００５０】
血小板無力症（遺伝性血小板機能欠損）は、血小板接着の状態（例えば、ベルナール−スーリエ症候群）、アゴニストレセプターの状態（例えば、インテグリンα２β１（コラーゲンレセプター）欠損、Ｐ２Ｙ１２（ＡＤＰレセプター）欠損またはトロンボキサンＡ２レセプター欠損）、シグナリング経路の状態（例えば、Ｇαｑ欠損、ホスホリパーゼＣ−β２欠損、シクロオキシゲナーゼ欠損、トロンボキサンシンターゼ欠損、リポキシゲナーゼ欠損またはカルシウム動員の欠損）、分泌の状態（例えば、貯蔵プール疾患、ヘルマンスキー−パラドック症候群、チェディアック−東症候群、灰色血小板症候群、ケベック（Ｑｕｅｂｅｃ）症候群およびヴィスコット−オールドリッチ症候群）、凝集の状態（例えば、グランツマン血小板無力症または先天性無フィブリノゲン血症）および血小板−血液凝固タンパク質相互作用の状態（例えば、スコット（Ｓｃｏｔｔ）症候群）から生じ得る。
【００５１】
本発明の方法は、上記の状態のいずれかを予防、処置、または改善するために、使用され得る。
【００５２】
本発明の方法はまた、冠動脈バイパス手術および／または血液透析における体外循環の間に生じるような患者の血小板への持続性の機械的損傷を有する患者を処置するために、使用され得る。
【００５３】
本発明の因子の適切な総投薬量は、タンパク質ベースのキャリアの０．１〜５ｇタンパク質、または０．１〜５ｇタンパク質当量の範囲にあると予想される。
【００５４】
また、本発明にしたがって、本発明の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体が、提供され、ここで上記フィブリノゲン結合前駆体は、創傷部位特異的因子によってフィブリノゲン結合成分に変換されることができ、上記フィブリノゲン結合成分は、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドと比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、フィブリノゲンではない。好ましくは、上記フィブリノゲン結合前駆体は、ペプチドである。特に好ましい実施形態において、上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、配列番号３２〜３５、または配列番号３８〜４１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法もまた、本発明にしたがって提供され、この方法は：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された標識された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、上記創傷部位特異的因子による既知のフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下で接触させる工程；
ｉｉ）上記創傷部位特異的因子とのインキュベーションの前後において、上記不溶性キャリア上の標識の量を決定する工程；および
ｉｉｉ）上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における上記不溶性キャリア上の標識の量が、上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における上記不溶性キャリア上の標識の量よりも少ない場合に、上記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する。
【００５６】
このような方法の例は、下で実施例１１に記載される。
【００５７】
上記方法は、上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前後において、上記不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合を決定する工程、および工程（ｉｉｉ）において、上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における上記不溶性キャリア上の標識の量が上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における上記不溶性キャリア上の標識の量よりも少なくありかつ上記不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合が上記創傷部位特異的因子とのインキュベーション後に増大する場合に、上記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程をさらに包含し得る。
【００５８】
本発明の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法が、本発明にしたがってさらに提供され、この方法は：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、上記創傷部位特異的因子によるフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下で接触させる工程；
ｉｉ）上記候補フィブリノゲン結合前駆体が、上記創傷部位特異的因子と接触した後に、クロット形成、血小板凝集、または上記不溶性キャリアの凝集を促進するか否かを決定する工程；および
ｉｉｉ）クロット形成が促進される場合に、上記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する。
【００５９】
候補フィブリノゲン結合前駆体が上記創傷部位特異的因子トロンビンと接触した後に、クロット形成、血小板凝集、または上記不溶性キャリアの凝集を促進するか否かを決定するための適切な方法は、下で実施例７〜１０に記載される。
【００６０】
本発明の因子は一旦投与されると（創傷の部位での創傷部位特異的因子によるその変換を除いて）分解されない（またはゆっくりとしか分解されない）ことが一般に重要であることが、認識される。好ましくは、血中での本発明の因子の循環時間は、本発明の因子の変換をもたらす創傷部位を全く有さない被験体に一旦投与されると、１時間より大きい。インビトロで本発明の因子の安定性を決定するための適切な方法は、下で実施例１２に記載される。本発明の因子は、実施例１２に記載される試験の条件下で、少なくとも１時間にわたって安定であるべきである。
【００６１】
ＷＯ ２００５／０３５００２の実施例１〜４は、ペプチドに連結されたマイクロスフェアを産生する方法、ペプチドに連結されたマイクロスフェアへのフィブリノゲンの結合をアッセイする方法、改変型凝集アッセイ、インビトロ活性アッセイ、およびインビボ評価モデルを記載する。対応する方法は本発明の因子を同定、産生および試験するために使用され得ることが、理解される。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態は、単なる例として、添付の図面に関連して本明細書に記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明の因子の第１の好ましい実施形態は、図１（ａ）において概略的に示される。その因子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体ペプチドを含む。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、（そのカルボキシ末端からそのアミノ末端に向かって）以下を含む：上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基；第１のスペーサー配列（スペーサー１）；フィブリノゲン結合ペプチド；トロンビン切断配列（「トロンビン切断配列」と表示された図中の囲みは、トロンビンが上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る部位（すなわち、トロンビン切断部位）に対してアミノ末端である配列を示す）；第２のスペーサー配列（スペーサー２）；およびトロンビン結合ペプチド。
【００６４】
上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端側にある上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分（すなわち、トロンビン切断配列−スペーサー２−トロンビン結合ペプチド部分）は、ブロック成分を形成する。上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する。創傷部位で産生されたトロンビンは、上記トロンビン結合ペプチドに結合し、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端にて上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る（図１（ｂ）に示される通り）。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図１（ｃ））。
【００６５】
上記第１のスペーサーは、上記フィブリノゲン結合ペプチドを、一旦そのフィブリノゲン結合ペプチドが露出されるとマイクロスフェアがそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を妨げないように、上記ＨＳＡマイクロスフェアから間隔を空けて配置する。上記第２のスペーサーは、トロンビンが上記トロンビン結合ペプチドに結合される場合に上記トロンビン切断部位を切断するように、トロンビンを最適に配向させる。
【００６６】
本発明の因子の第２の好ましい実施形態は、図２（ａ）において概略的に示される。その因子は、ＨＳＡマイクロスフェアに架橋された以下の２つの別個のペプチドを含む：フィブリノゲン結合前駆体ペプチド、およびトロンビン結合ペプチド。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、（そのカルボキシ末端からそのアミノ末端に向かって）以下を含む：上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基；第１のスペーサー配列（スペーサー１）；フィブリノゲン結合ペプチド；およびトロンビン切断配列（「トロンビン切断配列」と表示された図中の囲みは、トロンビンが上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る部位（すなわち、トロンビン切断部位）に対してアミノ末端である配列を示す）。上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端側にある上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分（すなわち、上記トロンビン切断配列）は、ブロック成分を形成する。上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する。
【００６７】
上記トロンビン結合ペプチドは、そのカルボキシ末端において第２のスペーサー配列（スペーサー２）に連結される。上記第２のスペーサー配列のカルボキシ末端は、上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるシステイン残基に連結される。
【００６８】
創傷部位で産生されたトロンビンは、上記トロンビン結合ペプチドに結合し、そして上記トロンビン切断部位にてそのフィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図２（ｂ））。
【００６９】
本発明の因子の第３の好ましい実施形態は、図３ａにおいて概略的に示される。その因子は、ＨＳＡマイクロスフェアに架橋された以下の３つの別個のペプチドを含む：フィブリノゲン結合前駆体ペプチド、トロンビン結合ペプチド、および創傷部位標的ペプチド。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドおよび上記トロンビン結合ペプチドは、第２の好ましい実施形態について上で記載される通りである。上記創傷部位標的ペプチドは、そのカルボキシ末端において第３のスペーサー配列（スペーサー３）に連結される。上記第３のスペーサー配列のカルボキシ末端は、上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるシステイン残基に連結される。上記創傷部位標的ペプチドは、創傷部位（例えば、細胞表面タンパク質組織因子）に選択的に結合することができる。
【００７０】
上記創傷部位標的ペプチドは、本発明の因子の創傷部位への局在化を促進する。創傷部位で産生されたトロンビンは、上記トロンビン結合ペプチドに結合し、そして上記トロンビン切断部位にて上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断する。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図３ａ）。
【００７１】
上記第３のスペーサー配列は、上記創傷部位標的ペプチドを、マイクロスフェアが創傷部位へのその創傷部位標的ペプチドの結合を妨げないように、上記ＨＳＡマイクロスフェアから間隔を空けて配置する。
【００７２】
本発明の因子の第４の好ましい実施形態は、図３ｂにおいて概略的に示される。その因子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体ペプチドを含む。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、（そのカルボキシ末端からそのアミノ末端に向かって）以下を含む：上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基；第１のスペーサー配列（スペーサー１）；フィブリノゲン結合ペプチド；およびトロンビン切断配列（「トロンビン切断配列」と表示された図中の囲みは、トロンビンが上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る部位（すなわち、トロンビン切断部位）に対してアミノ末端である配列を示す）。
【００７３】
上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端側にある上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの部分（すなわち、上記トロンビン切断配列）は、ブロック成分を形成する。上記ブロック成分は、上記フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害する。創傷部位で産生されたトロンビンは、上記フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端において上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを切断し得る（図３ｂに示される通り）。上記フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの切断は、上記フィブリノゲン結合ペプチドから上記ブロック成分を放出させ、それによってそのフィブリノゲン結合ペプチドを露出させ、そしてそのフィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を可能にする（図３ｂの下部に示される通り）。
【００７４】
上に記載され、そして図１〜３に示される本発明の因子の４つの好ましい実施形態の適切なペプチド配列の例は、以下である：
スペーサー１：ＮＨ２−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号２９）；
フィブリノゲン結合ペプチド：ＮＨ２−ＧＰＲＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１７）；
トロンビン切断配列：ＮＨ２−ＬＶＰＲ−ＣＯＯＨ（配列番号３１）；
スペーサー２：トロンビンが上記トロンビン結合ペプチドに結合される場合に上記トロンビン切断部位を切断するようにトロンビンを最適に配向させるペプチド配列；
トロンビン結合ペプチド：トロンビンを結合することができる分子（例えば、ＰＡＲ−１）上のトロンビンエキソサイト１結合部位に由来するペプチド配列（すなわち、ＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号２４））；
創傷部位標的ペプチド：第ＶＩＩ因子またはそのフラグメントもしくは誘導体（例えば、組換え第ＶＩＩａ因子）；
スペーサー３：ＮＨ２−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号２９）。
【００７５】
上に記載された好ましい実施形態において、上記ペプチドは、上記ＨＳＡマイクロスフェアに架橋されるカルボキシ末端システイン残基を含む。上記マイクロスフェアへの任意の適切な共有結合は、例えば、そのペプチドに結合されたマレイミド基とそのマイクロスフェアのスルフヒドリル基との反応から生じる共有結合の代わりに使用され得ることが、認識される。
【００７６】
上に記載された好ましい実施形態（および下で実施例において記載された実施形態のいくつか）は、マイクロスフェアを含む。他の微粒子または適切な不溶性キャリアはマイクロスフェアの代わりに使用され得ることが、認識される。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
（本発明の因子の例：）
【００７８】
【化２】
ここで：
「／」は、トロンビン切断部位を示し；
【００７９】
【化３】
は、アルブミンマイクロスフェアを示し；そして
【００８０】
【化４】
は、上記ペプチド配列の末端システインと上記アルブミンマイクロスフェアとの間の共有結合を示す。
【００８１】
この実施例において、上記アルブミンマイクロスフェアの表面を、上記ペプチドのカルボキシ末端システイン残基の−ＳＨ基との反応のための上記キャリア上のチオール反応基を提供するために、ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）によって改変した（下の実施例２を参照のこと）。
【００８２】
（実施例２）
（マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体ペプチド（ペプチドＡ）およびフィブリノゲン結合ペプチド（ペプチドＢ）の調製）
Ｈ２Ｎ−ＬＶＰＲＧＰＲＰＧ６Ｃ（ペプチドＡ）（配列番号３６）およびＨ２Ｎ−ＧＰＲＰＧ６Ｃ（ペプチドＢ）（配列番号３７）を、それぞれ、合成し、そして以下の通りに、ヒトアルブミンから構成されたマイクロスフェアに別個に架橋した：
２５ｍｇのヒトアルブミンから構成されたマイクロスフェアを、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にて０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に懸濁した；
４ｍｇ／ｍｌの濃度にて０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した７５μｌのジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、上記マイクロスフェアに添加し、そしてＤｙｎａｌ撹拌機において２時間にわたって混合した；
洗浄を改善するために混合した後、さらなる２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を、チューブに添加し、そして倒置によって簡単に混合した；
上記マイクロスフェアを、１８００ｇで１５分間にわたる遠心分離によって上清から分離した；
上記マイクロスフェアを、２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁した；
ペプチドＡまたはペプチドＢを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に溶解した。１０ｍｇ／ｍｌにおける１００μｌのペプチドを、上記マイクロスフェアに添加し、そしてＤｙｎａｌ撹拌機において室温にて６時間にわたって混合した；
２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を、添加し、そして倒置によって簡単に混合した；
上記マイクロスフェアを、１８００ｇで１５分間にわたる遠心分離によって上清から分離した；
上記マイクロスフェアを、さらなる５．０ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）によって洗浄し、そして記載したような遠心分離によって分離した；
上記マイクロスフェアを、５％ヒト血清アルブミンを含む２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓに再懸濁した；
上記マイクロスフェアを、２００μｌのアリコートに充填し、そして−７０℃にて保存した。
【００８３】
（実施例３）
（トロンビンの非存在下（ｉ）および存在下（ｉｉ）における、マイクロスフェア（Ｍ／Ｓ）に連結されたフィブリノゲン結合前駆体（ペプチドＡ）およびマイクロスフェア（Ｍ／Ｓ）に連結されたフィブリノゲン結合ペプチド（ペプチドＢ）へのフィブリノゲンの結合の測定）
ペプチドＡに連結されたマイクロスフェア、およびペプチドＢに連結されたマイクロスフェアを、実施例２に記載したように調製した、そして下の表に示したように、緩衝液またはトロンビンと一緒に３０分間にわたって混合した：
【００８４】
【表１】
次いで、上記マイクロスフェアを、１８００ｇにて１０分間遠心分離することによって回収した。上記マイクロスフェアを、１００μｌのＴｒｉｓに再懸濁して、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。１０μｌのヒルジン １００Ｕ／ｍｌを、残余のトロンビンを阻害するために添加した。
【００８５】
濃度０．１ｍｇ／ｍｌにおける１８０μｌのフィブリノゲンを、２０μｌのペプチドＡに連結されたマイクロスフェアまたは２０μｌのペプチドＢに連結されたマイクロスフェアに添加し、そして１時間にわたって混合した。
【００８６】
フィブリノゲンの結合を、以下の通りに測定した。５μｌのマイクロスフェアを、５０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加した。ヒトフィブリノゲンへの１μｌのＦＩＴＣ標識した抗体を、添加し、そして２０分間にわたって混合した。その反応を、０．２％のホルミル食塩水（Ｆｏｒｍｙｌ ｓａｌｉｎｅ）の添加によって停止させた。結合した蛍光を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬ ＭＣＬ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
【００８７】
その結果を、図４に示す。ペプチドＡマイクロスフェアをフィブリノゲンと一緒に混合した場合、予めトロンビンと一緒にインキュベートされなかったペプチドＡマイクロスフェアは、少量のフィブリノゲン（６％）のみを結合した。ペプチドＡに結合されたマイクロスフェアを最初にトロンビンと一緒にインキュベートし、次いでフィブリノゲンと一緒に混合した場合、８６％が、フィブリノゲンを結合した。
【００８８】
ブロック配列を伴わないフィブリノゲン結合ペプチドであったペプチドＢは、トロンビンの存在下および非存在下でフィブリノゲンを結合した。
【００８９】
（実施例４）
（本発明の因子のさらなる例：）
【００９０】
【化５】
ここで：
「／」は、トロンビン切断部位を示し；
【００９１】
【化６】
は、表面スルフヒドリル基を有するアルブミン微粒子を示し；そして
【００９２】
【化７】
は、上記ペプチド配列の末端マレイミドと上記アルブミン微粒子のスルフヒドリル基との反応によって形成されたチオエーテル共有結合を示す。
【００９３】
（実施例５）
（マレイミド連結化学を使用した微粒子へのフィブリノゲン結合前駆体ペプチド（ペプチドＣ）の連結）
Ｃ末端上にマレイミド（ＭＡＬ）部分を有する以下のペプチド：Ｈ２Ｎ−ＬＶＰＲＧＰＲＰＧ５Ｋ−ＭＡＬ（ペプチドＣ）（配列番号４２）を、合成し、そして以下の通りに、ヒトアルブミンから構成された微粒子に架橋した：
ペプチド結合体化の前に、上記微粒子のスルフヒドリル含量を、改変型Ｅｌｌｍａｎｓアッセイによって以下の通りに決定した：ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８）に４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。２０ｍｇ／ｍｌ（０．２ｍｌ）に調製した上記微粒子サンプルを、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．７９ｍｌの０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８）と一緒に混合し、そして１０μＬのＤＴＮＢストックを、その反応に添加した。コントロールブランクを、微粒子を含まない０．２ｍｌの緩衝液を用いて調製した。上記反応を、ターンテーブル上で２０分間にわたって混合し、次いで遠心分離（１８００ｇにて１５分間）し、そしてその上清を、シリンジによって回収し、次いで０．２２μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。その濾液を、４１２ｎｍにて分光光度計を使用して分析し、そしてスルフヒドリル基の量を、１３６００のモル吸光係数を使用して決定した。上記チオール含量は、代表的に、１モルのアルブミンタンパク質あたり０．６モル〜０．３モルの間のチオールであった。
【００９４】
微粒子へのマレイミド改変ペプチドの結合体化のために；６２．５ｍｇのヒト血清アルブミン微粒子を、ターンテーブル上で１０分間にわたって混合し、次いで１０分間にわたって超音波処理することによって、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．４ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７）に分散させた。
【００９５】
ペプチドＣを、１０ｍＭ リン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。ペプチドストック（１００μｌ）を、上記微粒子に添加し、そしてＤｙｎａｌ撹拌機において室温にて１時間にわたって混合した。その反応を、等量の０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に希釈し、そして倒置によって簡単に混合した。上記微粒子を、１８００ｇにて１５分間の遠心分離によって上清から分離した。
【００９６】
上記微粒子を、さらなる５．０ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）によって洗浄し、そして記載したような遠心分離によって分離した；
上記微粒子を、２％マンニトールを含む２．５ｍｌの０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。上記微粒子を、２００μｌのアリコートに充填し、そして−７０℃にて保存した。
【００９７】
（実施例６）
（トロンビンを伴うかまたは伴わないインキュベーション後における微粒子へのフィブリノゲンの結合の測定）
微粒子を、実施例５に記載した通りに、ペプチドＣによって改変した。微粒子を、フィブリノゲン結合配列がトロンビンによって露出されることを確認するために、トロンビンへの曝露後にフィブリノゲン溶液と一緒に混合した。
【００９８】
０．７ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの微粒子を、３７℃にて０〜０．６４Ｕ／ｍＬのトロンビンと一緒にインキュベートし、２分後に、そのトロンビンを、１０Ｕ／ｍＬの最終濃度におけるヒルジン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって阻害した。微粒子を、９３００ｇにて５分間遠心分離し、そしてＨＢＳに再懸濁して、１４ｍｇ／ｍＬを得た。上記微粒子を、０．１ｍｇ／ｍＬのヒトフィブリノゲン（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ：ＳＮＢＴＳ）において１０倍に希釈し、そして室温にて１時間インキュベートした。結合したフィブリノゲンの量を、ポリクローナル抗体ウサギ抗ヒトフィブリノゲン−ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによって決定した。これらの結果は、図５において、トロンビンを伴わずにペプチドＣによって改変した上記微粒子は、フィブリノゲンに結合しないが、トロンビン濃度を上昇させることによって、微粒子に結合したフィブリノゲンの量が試験した微粒子の全３種の濃度において増加したことを示す。ペプチドＣによって改変しなかった微粒子は、トロンビン曝露を伴うかまたは伴わないフィブリノゲンを結合しない。
【００９９】
（実施例７）
（トロンビンに応答したフィブリノゲンにおけるクロット形成）
クロット形成を、以下の通りに、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＡＰ−４（ＢｉｏＤａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を使用して濁度の減少によって決定した；
ペプチドＣに連結された微粒子を、実施例５に記載した通りに、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。ベースラインの光学濃度を、ＨＢＳ中に３ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン（ＳＮＢＴＳ）溶液を用いて設定した。フィブリノゲン溶液（２０５μｌ）を、３７℃まで１分間にわたって予め温め、その後、微粒子（２５μｌ）を、９００ｒｐｍに設定した撹拌子の速度を伴って添加した。２分後に、２０μＬのヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を、添加して、０．０３２Ｕ／ｍｌの最終濃度を得た。代表的な凝集プロフィールを、図６に示す。トロンビンの非存在下において、ブランクもペプチドＣによって改変した微粒子も、クロットを形成しなかった。２分におけるトロンビンの添加後に、その溶液の濁度は、コントロールの未改変微粒子と比較して、ペプチドＣ改変微粒子を含む溶液についてより迅速に低下し、これは、クロット形成を示す。
【０１００】
（実施例８）
（ペプチドＣ改変微粒子をトロンビンと一緒にプレインキュベートした後の、トロンビンに応答した血漿におけるクロット形成）
クロット形成を、緩衝液中でトロンビンに対して予め曝露したペプチドＣ改変微粒子を用いて血漿においてモニタリングした。血漿中の微粒子クロット形成を、上に記載した通りに、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＡＰ−４（ＢｉｏＤａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を使用して濁度計で決定した。
【０１０１】
ペプチドＣ改変微粒子を、実施例５に記載した通りに、ＨＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。ペプチドＣ改変微粒子を、０．６Ｕ／ｍｌのトロンビンと一緒に１時間にわたってプレインキュベートし、次いでヒルジン（１０Ｕ／ｍｌ）を、トロンビン活性を阻害するために添加した。その反応を、９３００ｇにて５分間遠心分離し、次いでＨＢＳに２．５ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。ベースラインの光学濃度を、クエン酸塩添加血から調製した血漿を用いて設定した。血漿サンプル（２０５μｌ）を、３７℃まで１分間にわたって予め温め、その後、微粒子（２５μｌ）を、９００ｒｐｍに設定した撹拌子の速度を伴って添加した。２分後に、２０ｕＬのトロンビンストック溶液を、その反応に添加して、０．２５Ｕ／ｍｌの最終トロンビン濃度を得た。代表的な凝集プロフィールを、図７に示す。この図は、ペプチドＣ微粒子を血漿を伴うインキュベーションの前および間の両方においてトロンビンに曝露する場合に、クロット形成が生じることを示す。トロンビン曝露を伴わない場合、上記ペプチドＣ改変微粒子は、２０分間を超えてクロット形成をもたらさなかった。
【０１０２】
（実施例９）
（トロンビンに応答した血漿におけるクロット形成）
血漿中の微粒子クロット形成を、上に記載した通りに、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＡＰ−４（ＢｉｏＤａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ）を使用して濁度計で決定した。
【０１０３】
ペプチドＣ改変微粒子を、実施例５に記載した通りに、ＨＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。ベースラインの光学濃度を、クエン酸塩添加血から調製した血漿を用いて設定した。血漿サンプル（２０５μｌ）を、３７℃まで１分間にわたって予め温め、その後、微粒子（２５μｌ）を、９００ｒｐｍに設定した撹拌子の速度を伴って添加した。２分後に、２０ｕＬのヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を、その反応に添加して、０．２５Ｕ／ｍｌの最終トロンビン濃度を得た。代表的な凝集プロフィールを、図８に示す。これらの結果は、トロンビンの添加を伴わない血漿において、未改変微粒子およびペプチドＣ改変微粒子の両方がクロットを形成しなかったことを示す。２分の時点におけるトロンビンの添加によって、ペプチドＣによって改変した微粒子は、未改変のコントロールブランク微粒子と比較して、血漿における加速したクロット形成を示した。
【０１０４】
（実施例１０）
（ペプチドＣ改変微粒子の存在下における血小板凝集）
ペプチドＣ改変微粒子の存在下における血小板凝集を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅｌｅｔインピーダンス血小板凝集計（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）Ｄｙｎａｂｙｔｅ ｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｕｎｉｃｈ）を使用して測定した。
【０１０５】
ペプチドＣ改変微粒子を、実施例５に記載した通りに、ＨＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度で調製した。上記微粒子（０．７５ｍｇ）を、ＨＢＳ中の１Ｕ／ｍｌのヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）（総容量０．３ｍｌ）と一緒に１時間プレインキュベートした。トロンビン活性を阻害するために、ヒルジン（Ｓｉｇｍａ）を、５Ｕ／ｍｌの最終濃度で添加した。その反応を、９３００ｇにて５分間遠心分離し、そして上清を、廃棄した。上記微粒子を、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度までＨＢＳに再懸濁した。
【０１０６】
血小板減少血液を、以下の通りに、クエン酸塩添加血から調製した：
血小板を、全血を１６３ｇにて２０分間遠心分離し、そして血小板が豊富な上層を廃棄することによって除去した。上部の血小板が豊富な層を、全血を１８００ｇにて３０分間遠心分離した後に上清として単離した血漿によって置換した。
【０１０７】
電気インピーダンスをモニタリングするために；それぞれの電極ウェルについて、０．３ｍｌの血液を、３７℃にて微粒子（０．１５ｍｇ）および生理食塩水と一緒にインキュベートして、０．６ｍｌの総容量を得た。凝集を、３０μｌの活性化剤であるアデノシン二リン酸溶液（０．１ｍＭ）の添加直後に記録した。凝集を、６分間にわたって記録した；図９における結果は、最終的な凝集の任意の単位で示す。これらの結果は、微粒子を伴わないＴＣＢまたはブランク微粒子と比較して、ペプチドＣ改変微粒子の存在下の活性化ＴＣＢにおけるより大きい電気インピーダンス（すなわち、最終的な凝集よりも大きい）を示す。
【０１０８】
（実施例１１）
（候補フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの加水分解の決定）
候補ペプチド（そのペプチドのＮ末端に放射標識分子、色素分子または蛍光発生分子を有する）を、合成する。上記ペプチドを、実施例２または５に記載した方法を使用して不溶性キャリアに連結する。そのペプチド改変キャリアを、緩衝液において純粋なプロテアーゼと一緒にインキュベートする。上記改変キャリア上に残存する標識の量は、そのペプチドの加水分解速度を決定することを可能にする。
【０１０９】
例えば、５，６−カルボキシフルオレセイン標識したペプチドである５，６−ＦＡＭ−ＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧ−Ｃｙｓ（配列番号４３）。その標識したペプチドを、ペプチド結合を容易にするために、ＤＮＴＢを使用し、実施例２に記載した方法を使用してアルブミン微粒子に結合体化する。ペプチド加水分解の速度を、フローサイトメーターを使用して、上記微粒子上に残存する結合したフルオレセインの量によって決定する。
【０１１０】
上記標識したペプチドと結合体化した微粒子を、ｐＨ７．４にて種々の濃度のヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）と一緒に混合し、そして３７℃にて種々の期間にわたってインキュベートする。次いで、その反応を、トロンビンの単位に対して５倍過剰なヒルジンの添加によって停止させ、そしてその反応を、フローサイトメトリーによって分析するために、適切に希釈する。この手順は、アルブミン微粒子に結合体化した場合にトロンビンによって加水分解され得るペプチドの同定を可能にする。同等の手順はマイクロスフェアに結合体化された場合に他のプロテアーゼによって加水分解され得るペプチドを同定するために使用され得ることが、認識される。
【０１１１】
（実施例１２）
（フィブリノゲン結合前駆体ペプチドの安定性の決定）
Ｎ末端標識を有する候補フィブリノゲン結合前駆体ペプチドを、合成し、そして実施例１１に記載した通りに、不溶性キャリアに結合体化する。上記標識したペプチドに連結された微粒子を、生物学的サンプル（例えば、全血、血漿または組織ホモジネート）においてインキュベートする。上記ペプチドの安定性は、上記微粒子上のインタクトな蛍光ペプチドの量を反映する。関連するプロテアーゼを同定するために、特定のプロテアーゼ員日々バーを、上記インキュベート反応に含める。
【０１１２】
例えば、クエン酸塩添加血を、トロンビンインヒビターであるヒルジン（５Ｕ／ｍｌ）と一緒に混合し、そしてその血液を、２０ｍｍｏｌ／ｍＬのカルシウムによって再石灰化する。次いで、上記標識したペプチドによって改変した微粒子を、２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度でその血液に添加する。その反応を、３７℃に維持しながら混合し、その反応のサンプルを、異なる時点にて採取し、適切に希釈し、そしてフローサイトメーターに適用してインタクトな結合したペプチドの量を決定する。
【０１１３】
（実施例１３）
（インビボでの用量関連性の止血活性の評価）
（１．血小板減少性ウサギモデルにおける用量関連性の止血活性）
雄ニュージーランド白ウサギ（２．５〜４．０ｋｇ）を、標準的な供給業者から得る。６羽までのウサギの群を、２用量の細胞傷害性薬物ブスルファンを、それぞれ、この研究の１２日前および９日前に使用して血小板減少性にする。ブスルファンの用量を、必要とする血小板減少症の重篤度にしたがって変化させる（例えば、２用量の２０ｍｇ／ｋｇは、一般に、血小板数を１０×１０９／ｌ〜２０×１０９／ｌの間まで減少させるのに対して、２用量の２５ｍｇ／ｋｇは、血小板数を１０×１０９／ｌ未満まで減少させる）。血小板数の減少に加えて、ブスルファン投薬は、白血球の枯渇を伴うが、ヘマトクリットの小さい減少のみを伴い、そして明白な毒性を伴わない。麻酔剤は、この手順に必要ではない。
【０１１４】
ヒト血小板濃縮物を、これらの研究のためにポジティブコントロールとして使用する。これは、動物の１群あたり１つの血小板濃縮物のみを必要とする。ヒト血小板は細網内皮系による取り込みに起因してウサギにおいて約５分間のみにわたって循環することが、先に示されている。したがって、これらの実験において、マクロファージ機能を、研究日の２４時間前に上記ウサギにパルミチン酸エチルを投薬することによって阻害する。一貫性のために、パルミチン酸エチルによる処置が、動物の全ての群に対して使用され得る。
【０１１５】
研究日において、試験因子を、耳静脈中に静脈内に注入する。効力を、その耳の標準的な切開を使用して行われる出血時間の測定によって評価する。
【０１１６】
出血時間の変動性を、上記動物がおとなしくかつ温かく、そして均一な温度であることを確保することによって、可能な限り制御し（Ｒｏｓｋａｍ、１９９３、Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅｓ Ｓｅａｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ、１１４、１６６−１６９）、そして血液サンプルの数を最小化する。Ｂｌａｊｃｈｍａｎ ＆ Ｌｅｅ、１９９７、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１１、９９−１０５。出血時間を、試験用量の投与直前、および投薬の２４時間後のまでの時点において測定する。２０分間を超える出血時間を、創傷に圧力を適用することによって停止させる。動物を、この研究の完了において屠殺する。
【０１１７】
用量／ｋｇベースにおける本発明の因子の用量関連性の活性を、ヒト血小板の活性と比較した出血時間の減少によって規定する。同じ大きさであるがペプチドとカップリングしていないＨＳＡ微粒子を、ネガティブコントロールとして使用する。この研究の２４時間にわたって効果の持続時間の比較が、行われ得る。
【０１１８】
血小板減少性ウサギにおいて、約２０分間の出血時間が、代表的である。本発明の因子は、６羽の群中の３羽、そして好ましくは６羽全ての試験ウサギの出血時間を最小で１０分未満まで減少させ得るはずである。
【０１１９】
（２．ウサギＷｅｓｓｌｅｒモデルにおける血栓形成性の評価）
本発明の因子の潜在的な血栓形成性を、本質的に、Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９５９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１４、９４３−９４６によって記載されるようなＷｅｓｓｌｅｒモデルにおいて評価する。
【０１２０】
雄ニュージーランド白ウサギ（体重２．５ｋｇ〜４．０ｋｇ）を、認可された供給業者から入手し、そして最大で６羽のウサギの群を、麻酔する。左右の頸静脈の区域を、露出させ、そして周囲の組織から引き離す。試験調製物を、耳静脈を介して投与し、そして３分間の循環期間の後、その頸静脈の区域を、結紮し、そしてさらに１０分間にわたってその位置に放置する。その区域を、慎重に切除し、そしてその管腔を、露出させる。その血管を、視覚的に記録される発生した血栓の存在について調べる。
【０１２１】
本発明の因子は、出血時間の最適な減少に関連する用量よりも５倍（好ましくは、１０倍）高い用量において、血栓を産生しないはずである。
【０１２２】
本発明の因子の適切な用量は、患者の体重１ｋｇあたり１×１０８〜２×１０１０個の生成物粒子であり得る。例えば、その用量（体重１ｋｇあたりの生成物粒子の数として示す場合）は、約２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０または２×１０１０であり得る。
【０１２３】
適切な用量はまた、患者の体重１ｋｇあたりの総タンパク質のミリグラムとして示され得る。これに基づくと、適切な用量は、５〜２００ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、その用量は、約５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１２４】
理想的な用量は、少なくとも２倍、好ましくは約１０倍の安全域を有する。換言すれば、その理想的な用量は、２倍または約１０倍増加した場合でさえ、有効であるが、安全なままである。安全な用量は、上に記載したようなＷｅｓｓｌｅｒ試験を用いて、クロットを形成しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１−１】図１は、本発明の因子の第１の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図１−２】図１は、本発明の因子の第１の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図２】図２は、本発明の因子の第２の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図３Ａ】図３ａは、本発明の因子の第３の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図３Ｂ】図３ｂは、本発明の因子の第４の好ましい実施形態を概略的に示す。
【図４】図４は、実施例３に記載されるようなペプチドに連結されたマイクロスフェアへのフィブリノゲンの結合の測定の結果を示す。
【図５】図５は、種々の濃度のトロンビンとのインキュベーション後における、マイクロスフェアに結合されたフィブリノゲンの％を示す。０．７ｍｇ／ｍｌ（黒三角）におけるペプチド改変を有さないマイクロスフェアならびに０．７ｍｇ／ｍｌ（黒丸）、５ｍｇ／ｍｌ（黒四角）または１０ｍｇ／ｍｌ（黒逆三角）におけるペプチドＣによって改変されたマイクロスフェア。
【図６】図６は、それぞれ、０．０３２Ｕ／ｍｌのトロンビンの非存在下（１および２）または存在下（３および４）における、ブランク微粒子またはペプチドＣ改変微粒子とフィブリノゲンとの凝集プロフィールを示す。
【図７】図７は、ペプチドＣ改変微粒子と、トロンビンに曝されていない血漿との凝集プロフィール（１）、およびペプチドＣ改変微粒子と、トロンビンとプレインキュベートされ、そしてトロンビンが２分後に添加される血漿に添加された血漿との凝集プロフィール（２）を示す。
【図８】図８は、ブランク微粒子またはペプチドＣ改変微粒子と、血漿との凝集プロフィールを示す。トロンビンを伴わないペプチドＣ（１）微粒子およびブランク（２）微粒子；２分目においてトロンビンの添加を伴うブランク（３）およびペプチドＣ（４）マイクロスフェア。
【図９】図９は、血小板凝集測定を使用した、トロンビンに予め曝露されている微粒子を伴うアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって活性化された血小板減少血液における血小板凝集およびトロンビンに予め曝露されている微粒子を伴わないアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって活性化された血小板減少血液における血小板凝集を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性キャリアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体を含む因子であって、該フィブリノゲン結合前駆体は、創傷部位特異的因子によって、該キャリアに結合されたフィブリノゲン結合成分へと変換されることができ、該フィブリノゲン結合成分は、該フィブリノゲン結合前駆体と比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、そして該フィブリノゲン結合前駆体は、フィブリノゲンではない、因子。
【請求項２】
前記フィブリノゲン結合成分は、ペプチドである、請求項１に記載の因子。
【請求項３】
前記フィブリノゲン結合ペプチドは、アミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−ＧＰＲＰ−（配列番号１７）を含む、請求項２に記載の因子。
【請求項４】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、前記創傷部位特異的因子によって切断されて、前記キャリアに結合された前記フィブリノゲン結合成分を露出することができる、請求項１〜３に記載の因子。
【請求項５】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、ブロック成分にアミノ末端にて連結されたフィブリノゲン結合ペプチドを含み、該ブロック成分は、該フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害することによって、前記創傷部位特異的因子による該フィブリノゲン結合前駆体の切断が、該フィブリノゲン結合ペプチドを露出させて、該フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を増大させることを可能にする、請求項４に記載の因子。
【請求項６】
前記創傷部位特異的因子は、トロンビンであり、そして前記フィブリノゲン結合前駆体は、トロンビン切断部位を含む、請求項４または５に記載の因子。
【請求項７】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、アミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−ＺＹＸＲ／ＧＰＲＰ（配列番号１８）を含むペプチドを含み、「／」は、前記トロンビン切断部位を示し、そしてＸは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはプロリンであり、Ｙは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸であり、そしてＺは、好ましくはロイシンまたはプロリンである少なくとも１個のアミノ酸である、請求項６に記載の因子。
【請求項８】
前記ペプチドは、そのアミノ末端に以下のアミノ酸配列：
【化１】
のうちの１つを含み、「／」は、前記トロンビン切断部位を示す、請求項７に記載の因子。
【請求項９】
トロンビン結合部位をさらに含む、請求項６〜８のいずれかに記載の因子。
【請求項１０】
前記フィブリノゲン結合前駆体および前記トロンビン結合部位は、別々に前記不溶性キャリアに結合される、請求項９に記載の因子。
【請求項１１】
前記トロンビン結合部位は、前記フィブリノゲン結合前駆体の部分であるペプチド配列である、請求項９に記載の因子。
【請求項１２】
前記ペプチド配列は、トロンビンが結合することができる配列であり、好ましくはトロンビンエキソサイトＩドメインまたはトロンビンエキソサイトＩＩドメインが結合することができる配列である、請求項１１に記載の因子。
【請求項１３】
前記ペプチド配列は、トロンビンエキソサイトＩドメインまたはトロンビンエキソサイトＩＩドメインが結合することができるＰＡＲ−１レセプターのペプチド配列（例えば、ＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号２４））、フィブリノゲンのペプチド配列（例えば、ＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２５））、または第ＶＩＩＩ因子のペプチド配列（例えば、ＥＥＥＤＷＤ（配列番号２６）またはＥＤＳＹＥＤ（配列番号２７））、あるいはトロンビン結合ペプチドであるヒルジンに対応する、請求項１１または１２に記載の因子。
【請求項１４】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、前記不溶性キャリアに共有結合されるカルボキシ末端残基または改変カルボキシ末端残基を有するペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の因子。
【請求項１５】
前記カルボキシ末端残基がシステイン残基であるか、または前記改変カルボキシ末端残基がマレイミド改変リジン残基である、請求項１４に記載の因子。
【請求項１６】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、前記カルボキシ末端残基または前記改変カルボキシ末端残基と、前記フィブリノゲン結合成分との間にスペーサー配列を含む、請求項１４または１５に記載の因子。
【請求項１７】
前記スペーサー配列は、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２９）またはＧＧＧＧＧ（配列番号３０）である、請求項１６に記載の因子。
【請求項１８】
創傷部位標的成分をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の因子。
【請求項１９】
前記創傷部位標的成分は、前記不溶性キャリアに固定化されている、請求項１８に記載の因子。
【請求項２０】
前記創傷部位標的成分は、前記フィブリノゲン結合前駆体の部分である、請求項１８に記載の因子。
【請求項２１】
前記フィブリノゲン結合前駆体が、フィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドであり、そして前記創傷部位標的成分が、該フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端に結合されることにより、該創傷部位特異的因子による該フィブリノゲン結合前駆体の切断が、該創傷部位標的成分を遊離させて該フィブリノゲン結合ペプチドを露出させる、請求項２０に記載の因子。
【請求項２２】
前記創傷部位標的成分は、細胞表面タンパク質組織因子に結合することができる、請求項１８〜２１のいずれかに記載の因子。
【請求項２３】
前記創傷部位標的成分は、第ＶＩＩ因子または細胞表面タンパク質組織因子に結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体、あるいは第ＶＩＩａ因子または細胞表面タンパク質組織因子を結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体を含む、請求項２２に記載の因子。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の因子と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
医薬として使用するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の因子。
【請求項２６】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための医薬の製造における、請求項１〜２３に記載の因子の使用。
【請求項２７】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための方法であって、該方法は、請求項１〜２３のいずれかに記載の因子を、このような予防、処置、または改善の必要がある被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体ペプチドであって、該フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、創傷部位特異的因子によってフィブリノゲン結合ペプチドへと変換されることができ、該フィブリノゲン結合ペプチドは、該フィブリノゲン結合前駆体ペプチドと比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、そして該フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、フィブリノゲンではない、フィブリノゲン結合前駆体ペプチド。
【請求項２９】
配列番号３２〜配列番号３５、または配列番号３８〜配列番号４１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
請求項１に記載の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法であって、以下：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された標識された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、該創傷部位特異的因子による既知のフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下でインキュベートする工程；
ｉｉ）該創傷部位特異的因子とのインキュベーションの前後において、該不溶性キャリア上の標識の量を決定する工程；および
ｉｉｉ）該創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における該不溶性キャリア上の標識の量が、該創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における該不溶性キャリア上の標識の量よりも少ない場合に、該候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前後において、前記不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合を決定する工程、および工程（ｉｉｉ）において、該創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における該不溶性キャリア上の標識の量が、該創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における該不溶性キャリア上の標識の量よりも少なく、かつ該不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合が該創傷部位特異的因子とのインキュベーション後に増大する場合に、前記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法であって、以下：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、該創傷部位特異的因子によるフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下で接触させる工程；
ｉｉ）該候補フィブリノゲン結合前駆体が、該創傷部位特異的因子と接触した後に、クロット形成、血小板凝集、または該不溶性キャリアの凝集を促進するか否かを決定する工程；および
ｉｉｉ）クロット形成が促進される場合に、該候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１】
不溶性キャリアに結合されたフィブリノゲン結合前駆体を含む因子であって、該フィブリノゲン結合前駆体は、創傷部位特異的因子によって、該キャリアに結合されたフィブリノゲン結合成分へと変換されることができ、該フィブリノゲン結合成分は、該フィブリノゲン結合前駆体と比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、そして該フィブリノゲン結合前駆体は、フィブリノゲンではない、因子。
【請求項２】
前記フィブリノゲン結合成分は、ペプチドである、請求項１に記載の因子。
【請求項３】
前記フィブリノゲン結合ペプチドは、アミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−ＧＰＲＰ−（配列番号１７）を含む、請求項２に記載の因子。
【請求項４】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、前記創傷部位特異的因子によって切断されて、前記キャリアに結合された前記フィブリノゲン結合成分を露出することができる、請求項１〜３に記載の因子。
【請求項５】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、ブロック成分にアミノ末端にて連結されたフィブリノゲン結合ペプチドを含み、該ブロック成分は、該フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合をブロックまたは阻害することによって、前記創傷部位特異的因子による該フィブリノゲン結合前駆体の切断が、該フィブリノゲン結合ペプチドを露出させて、該フィブリノゲン結合ペプチドへのフィブリノゲンの結合を増大させることを可能にする、請求項４に記載の因子。
【請求項６】
前記創傷部位特異的因子は、トロンビンであり、そして前記フィブリノゲン結合前駆体は、トロンビン切断部位を含む、請求項４または５に記載の因子。
【請求項７】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、アミノ末端にアミノ酸配列ＮＨ２−ＺＹＸＲ／ＧＰＲＰ（配列番号１８）を含むペプチドを含み、「／」は、前記トロンビン切断部位を示し、そしてＸは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはプロリンであり、Ｙは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸であり、そしてＺは、好ましくはロイシンまたはプロリンである少なくとも１個のアミノ酸である、請求項６に記載の因子。
【請求項８】
前記ペプチドは、そのアミノ末端に以下のアミノ酸配列：
【化１】
のうちの１つを含み、「／」は、前記トロンビン切断部位を示す、請求項７に記載の因子。
【請求項９】
トロンビン結合部位をさらに含む、請求項６〜８のいずれかに記載の因子。
【請求項１０】
前記フィブリノゲン結合前駆体および前記トロンビン結合部位は、別々に前記不溶性キャリアに結合される、請求項９に記載の因子。
【請求項１１】
前記トロンビン結合部位は、前記フィブリノゲン結合前駆体の部分であるペプチド配列である、請求項９に記載の因子。
【請求項１２】
前記ペプチド配列は、トロンビンが結合することができる配列であり、好ましくはトロンビンエキソサイトＩドメインまたはトロンビンエキソサイトＩＩドメインが結合することができる配列である、請求項１１に記載の因子。
【請求項１３】
前記ペプチド配列は、トロンビンエキソサイトＩドメインまたはトロンビンエキソサイトＩＩドメインが結合することができるＰＡＲ−１レセプターのペプチド配列（例えば、ＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号２４））、フィブリノゲンのペプチド配列（例えば、ＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２５））、または第ＶＩＩＩ因子のペプチド配列（例えば、ＥＥＥＤＷＤ（配列番号２６）またはＥＤＳＹＥＤ（配列番号２７））、あるいはトロンビン結合ペプチドであるヒルジンに対応する、請求項１１または１２に記載の因子。
【請求項１４】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、前記不溶性キャリアに共有結合されるカルボキシ末端残基または改変カルボキシ末端残基を有するペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の因子。
【請求項１５】
前記カルボキシ末端残基がシステイン残基であるか、または前記改変カルボキシ末端残基がマレイミド改変リジン残基である、請求項１４に記載の因子。
【請求項１６】
前記フィブリノゲン結合前駆体は、前記カルボキシ末端残基または前記改変カルボキシ末端残基と、前記フィブリノゲン結合成分との間にスペーサー配列を含む、請求項１４または１５に記載の因子。
【請求項１７】
前記スペーサー配列は、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２９）またはＧＧＧＧＧ（配列番号３０）である、請求項１６に記載の因子。
【請求項１８】
創傷部位標的成分をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の因子。
【請求項１９】
前記創傷部位標的成分は、前記不溶性キャリアに固定化されている、請求項１８に記載の因子。
【請求項２０】
前記創傷部位標的成分は、前記フィブリノゲン結合前駆体の部分である、請求項１８に記載の因子。
【請求項２１】
前記フィブリノゲン結合前駆体が、フィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドであり、そして前記創傷部位標的成分が、該フィブリノゲン結合ペプチドのアミノ末端に結合されることにより、該創傷部位特異的因子による該フィブリノゲン結合前駆体の切断が、該創傷部位標的成分を遊離させて該フィブリノゲン結合ペプチドを露出させる、請求項２０に記載の因子。
【請求項２２】
前記創傷部位標的成分は、細胞表面タンパク質組織因子に結合することができる、請求項１８〜２１のいずれかに記載の因子。
【請求項２３】
前記創傷部位標的成分は、第ＶＩＩ因子または細胞表面タンパク質組織因子に結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体、あるいは第ＶＩＩａ因子または細胞表面タンパク質組織因子を結合することができるそのフラグメントもしくは誘導体を含む、請求項２２に記載の因子。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の因子と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
医薬として使用するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の因子。
【請求項２６】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための医薬の製造における、請求項１〜２３に記載の因子の使用。
【請求項２７】
血小板減少症または血小板無力症を予防、処置、または改善するための方法であって、該方法は、請求項１〜２３のいずれかに記載の因子を、このような予防、処置、または改善の必要がある被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体ペプチドであって、該フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、創傷部位特異的因子によってフィブリノゲン結合ペプチドへと変換されることができ、該フィブリノゲン結合ペプチドは、該フィブリノゲン結合前駆体ペプチドと比較して、フィブリノゲンへの結合能力が増大し、そして該フィブリノゲン結合前駆体ペプチドは、フィブリノゲンではない、フィブリノゲン結合前駆体ペプチド。
【請求項２９】
配列番号３２〜配列番号３５、または配列番号３８〜配列番号４１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
請求項１に記載の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法であって、以下：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された標識された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、該創傷部位特異的因子による既知のフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下でインキュベートする工程；
ｉｉ）該創傷部位特異的因子とのインキュベーションの前後において、該不溶性キャリア上の標識の量を決定する工程；および
ｉｉｉ）該創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における該不溶性キャリア上の標識の量が、該創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における該不溶性キャリア上の標識の量よりも少ない場合に、該候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記創傷部位特異的因子とのインキュベーション前後において、前記不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合を決定する工程、および工程（ｉｉｉ）において、該創傷部位特異的因子とのインキュベーション後における該不溶性キャリア上の標識の量が、該創傷部位特異的因子とのインキュベーション前における該不溶性キャリア上の標識の量よりも少なく、かつ該不溶性キャリアへのフィブリノゲンの結合が該創傷部位特異的因子とのインキュベーション後に増大する場合に、前記候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の因子の部分として使用するためのフィブリノゲン結合前駆体を同定する方法であって、以下：
ｉ）創傷部位特異的因子と、不溶性キャリアに結合された候補フィブリノゲン結合前駆体とを、該創傷部位特異的因子によるフィブリノゲン結合前駆体のフィブリノゲン結合成分への変換を許容する条件下で接触させる工程；
ｉｉ）該候補フィブリノゲン結合前駆体が、該創傷部位特異的因子と接触した後に、クロット形成、血小板凝集、または該不溶性キャリアの凝集を促進するか否かを決定する工程；および
ｉｉｉ）クロット形成が促進される場合に、該候補フィブリノゲン結合前駆体をフィブリノゲン結合前駆体として同定する工程；
を包含する、方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１−２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５０５９６４（Ｐ２００９−５０５９６４Ａ）
【公表日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２４５９１（Ｐ２００８−５２４５９１）
【出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２９３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１５１０７
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０６１１７１２７）ヘモスタティクス リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２９３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１５１０７
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０６１１７１２７）ヘモスタティクス リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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