本発明は、ＰＰＡＲガンマリン酸化（例えば、ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体（ヒトを含む）中の対応するセリン残基）の調整により、古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するための方法および組成物を提供する。このようなＰＰＡＲガンマリン酸化の選択的抑制による被験体における代謝障害のための治療の応答性を防止し、処置し、または予測するための方法も提供される。さらに、このようなＰＰＡＲガンマリン酸化を調整し得る化合物を同定するための方法が提供される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）前記ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡガンマ２相同体中の対応するセリン残基を含む試料を試験化合物と接触させること；そして
ｂ）ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅ−２７３リン酸化を抑制する試験化合物の能力を確定すること、それにより、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化を選択的に抑制する化合物を同定すること
を包含する方法。
【請求項２】
試料がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基の前記Ｓｅｒ−２７３リン酸化の抑制が、総ＰＰＡＲガンマに比してＳｅｒ−２７３リン酸化ＰＰＡＲガンマの量を分析し、そして対照に対する比率を比較することにより確定される請求項１記載の方法。
【請求項４】
対照が標準条件下でのロシグリタゾンによる処置からの比率である請求項３記載の方法。
【請求項５】
試験化合物が、前記ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基と直接的に結合するか否かを確定するステップをさらに包含する請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＰＰＡＲガンマを結合し、そして一細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）化合物がＰＰＡＲガンマを結合するか否かを確定すること；そして
ｂ）試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー（この場合、マーカーは、表１または２に列挙されたマーカーの群から選択される）の量および／または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および／または活性と比較すること
（ここで、
第二試料に比して、第一試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または
第二試料に比して、第一試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す）
を包含する方法。
【請求項７】
細胞型が、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
第一および／または第二試料が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
第一および／または第二試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項６記載の方法。
【請求項１０】
第一および／または第二試料が、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項１１】
第一および第二試料が一被験体から得られる単一試料の部分である請求項６記載の方法。
【請求項１２】
第一および第二試料が一被験体から得られるプール試料の部分である請求項６記載の方法。
【請求項１３】
第二試料が、試験化合物の非存在下で保持される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む請求項６記載の方法。
【請求項１４】
第二試料が、ロシグリタゾンで処置される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む請求項６記載の方法。
【請求項１５】
有意に高い量および／または活性が、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％上方調節することを包含する請求項６記載の方法。
【請求項１６】
有意に低い量および／または発現が、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％下方調節することを包含する請求項６記載の方法。
【請求項１７】
マーカーの量が比較される請求項６記載の方法。
【請求項１８】
マーカーの量がマーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
試薬が、ＰＰＡＲガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスｃｄｋ５リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を含む請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
検出のステップが、転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
試料中のマーカーの発現のレベルが、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
マーカーがネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ｓｅｒ−２７３である請求項６記載の方法。
【請求項２７】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項２８】
ＰＰＡＲガンマが配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む請求項６記載の方法。
【請求項２９】
被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害を選択的に促進するためのＰＰＡＲガンマを結合する化合物の効力の査定方法であって、以下の：
ａ）マーカー（ここで、マーカーは表１または２に列挙されたマーカーである）の量および／または活性を、第一の時点で被験体において検出すること；
ｂ）化合物の投与後の少なくとも１つのその後の時点の間、ステップａ）を反復すること；そして
ｃ）ステップａ）およびｂ）で検出された量および／または活性を比較すること
（ここで、
少なくとも１つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表１で列挙されたマーカーの有意に高い量および／または活性は、試験化合物がその被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し；および／または
少なくとも１つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表２で列挙されたマーカーの有意に低い量および／または活性は、試験化合物がその被験体における古典的ＰＰＡＲガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す）
を包含する方法。
【請求項３０】
被験体が代謝障害のための処置を受け、代謝障害のための処置を完了し、および／または第一時点とその後の時点との間で代謝障害から寛解している請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
細胞型が、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料が、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料が、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料がその被験体から得られる単一試料の一部分である請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
第一および／または少なくとも１つのその後の試料がその被験体から得られるプール試料の一部分である請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
ロシグリタゾンを用いるステップａ）およびｂ）をさらに包含する請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
ロシグリタゾンによる処置の結果が試験化合物からの結果と比較される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
有意に高い量および／または活性が、表１に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％上方調節することを包含する請求項２９記載の方法。
【請求項４０】
有意に低い量および／または発現が、表２に列挙されたマーカーの量および／または活性を第二試料に比して少なくとも２５％下方調節することを包含する請求項２９記載の方法。
【請求項４１】
マーカーの量が比較される請求項２９記載の方法。
【請求項４２】
マーカーの量がマーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
試薬が、ＰＰＡＲガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスｃｄｋ５リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
検出のステップが、転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
試料中のマーカーの発現のレベルが、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
マーカーがネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ｓｅｒ−２７３である請求項２９記載の方法。
【請求項５１】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項５２】
ＰＰＡＲガンマが配列番号１〜７で記述されるアミノ酸配列を含む請求項２９記載の方法。
【請求項５３】
代謝性疾患に苦しむ被験体の治療方法であって、ＰＰＡＲガンマを結合し、抗糖尿病活性を選択的に促進する化合物を被験体に投与し、それにより代謝性疾患に苦しむ被験体を治療することを包含する方法。
【請求項５４】
前記化合物が、ネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基のＳｅｒ−２７３リン酸化を抑制する請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
化合物が製薬上許容可能な処方物中で投与される請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
製薬上許容可能な処方物が経口処方物である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
化合物が小分子である請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
ＰＰＡＲガンマを結合し、そして一細胞型における抗代謝障害活性を選択的に促進することによる代謝障害の処置するための化合物であって、化合物がＰＰＡＲガンマ上のＳｅｒ−２７３のリン酸化を抑制する化合物。
【請求項５９】
ロシグリタゾンのＰＰＡＲガンマアゴニスト機能の３０％未満を有する請求項５８記載の化合物。
【請求項６０】
１〜２００ｎＭ未満のＰＰＡＲガンマに関するＥＣ５０結合親和性を有する請求項５８記載の化合物。
【請求項６１】
同一条件下でロシグリタゾンに比して表１に列挙されたマーカーの発現を少なくとも３０％上方調節するか、および／または同一条件下でのロシグリタゾンに比して表２に列挙されたマーカーの発現を少なくとも３０％下方調節する請求項５８記載の化合物。
【請求項６２】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに３０より高い体格指数からなる群から選択される請求項５８記載の化合物。
【請求項６３】
ｍ−ベンジルインドール、ＭＲＬ−２０、ＭＲＬ−２４、ｎＴＺＤｐａ、ＳＲ１４５、ＳＲ１４７、Ｍｂｘ−１０２、ＭＫ−０５３３およびＢＶＴ．１３からなる群から選択される請求項５８記載の化合物。
【請求項６４】
位置Ｓｅｒ−２７３に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ２ポリペプチド、あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体をコードする単離核酸分子、またはその相補体。
【請求項６５】
配列番号２または３で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ｓｅｒ−２７３の非リン酸化可能アミノ酸をコードする請求項６４記載の単離核酸分子、またはその相補体。
【請求項６６】
非相同ポリペプチドをさらにコードする請求項６４または６５記載の単離核酸分子。
【請求項６７】
請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６８】
発現ベクターである請求項６７記載のベクター。
【請求項６９】
請求項６８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７０】
タンパク質の産生方法であって、タンパク質が産生されるまで適切な培地中で請求項６９記載の宿主細胞を培養することを包含する方法。
【請求項７１】
培地または宿主細胞からタンパク質を単離することをさらに包含する請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
位置Ｓｅｒ−２７３に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ２ポリペプチドまたはネズミＰＰＡＲガンマ２ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体を含む単離タンパク質。
【請求項７３】
配列番号２または３で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ｓｅｒ−２７３の非リン酸化可能アミノ酸をコードする請求項７２記載の単離タンパク質。
【請求項７４】
非相同ポリペプチドと操作可能的に連結される請求項７２または７３記載の単離タンパク質。
【請求項７５】
Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基と特異的に結合される抗体またはその断片を産生する単離ハイブリドーマの製造方法であって、以下の：
ａ）Ｓｅｒ−２７３でリン酸化される前記ネズミＰＰＡＲガンマ２あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含む組成物を用いて哺乳動物を免疫化すること、；
ｂ）免疫化哺乳動物から脾細胞を単離すること；
ｃ）単離脾細胞を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成すること；そして
ｄ）その前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体の産生のために個々のハイブリドーマをスクリーニングして、ハイブリドーマを単離すること
を包含する方法。
【請求項７６】
請求項７５記載の方法に従ったハイブリドーマにより産生される抗体。
【請求項７７】
Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２のアミノ酸配列あるいはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含むポリペプチドと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７８】
アミノ酸配列：ＫＴＴＤＫ（ｐＳ）ＰＦＶＩＹＤＣを有するエピトープを特異的に結合する請求項７７記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７９】
モノクローナル抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８０】
ポリクローナル抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８１】
キメラまたはヒト化抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８２】
検出可能的に標識される請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８３】
エフェクタードメインを含む請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８４】
Ｆｃドメインを含む請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８５】
一本鎖抗体である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８６】
Ｆａｂ断片である請求項７７記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８７】
Ｓｅｒ−２７３でリン酸化されるネズミＰＰＡＲガンマ２またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基を特異的に検出するための１つ以上の試薬を含むＰＰＡＲガンマのリン酸化を抑制する化合物の能力を査定するためのキット。
【請求項８８】
セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ２遺伝子を含む非ヒト動物モデル。
【請求項８９】
突然変異が非リン酸化可能アミノ酸への前記セリンの突然変異を含む請求項８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９０】
前記動物が、セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ２遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である特許請求の範囲８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９１】
動物がノックインまたはトランスジェニック動物である請求項８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９２】
動物が齧歯類および／またはマウスである請求項８８記載の非ヒト動物モデル。
【請求項９３】
被験体において調節される遺伝子の同定方法であって、以下の：
（ａ）セリン２７３またはネズミＰＰＡＲガンマ２相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子を発現すること；
（ｂ）前記突然変異化ＰＰＡＲガンマ遺伝子の１つ以上の候補標的遺伝子の発現および／または活性のレベルを確定すること；そして
（ｃ）対照に比して有意に変更された発現および／または活性を示す遺伝子を同定すること
を包含する方法。
【請求項９４】
予測処置結果に従った試料の分類方法であって、以下の：
ａ）生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル；ならびに
ｂ）対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル
を比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表１および２に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が予測処置結果に従った生物学的試料を分類する方法。
【請求項９５】
予測処置結果を有すると思われる被験体の同定方法であって、以下の：
ａ）生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル；ならびに
ｂ）対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル
を比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表１および２に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして被験体からの生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が被験体における予測処置結果の見込みを予測する方法。
【請求項９６】
予測処置結果が表１および２に列挙された処置結果から選択される請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９７】
予測処置結果がグルコース感受性増大の見込みである請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９８】
組織試料が、ＰＰＡＲガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる請求項９４記載の方法。
【請求項９９】
生物学的試料が、ＰＰＡＲガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる請求項９５記載の方法。

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【公表番号】特表２０１３−５２０１６２（Ｐ２０１３−５２０１６２Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５０１１２（Ｐ２０１２−５５０１１２）
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１８５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９１１３４
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（３９９０５２７９６）デイナ　ファーバー　キャンサー　インスティチュート，インコーポレイテッド (36)
【Ｆターム（参考）】