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代謝障害の同定、査定、予防および治療のための組成物、キットおよび方法
説明

代謝障害の同定、査定、予防および治療のための組成物、キットおよび方法

本発明は、PPARガンマリン酸化(例えば、ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPARガンマ)2またはネズミPPARガンマ2相同体(ヒトを含む)中の対応するセリン残基)の調整により、古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進するための方法および組成物を提供する。このようなPPARガンマリン酸化の選択的抑制による被験体における代謝障害のための治療の応答性を防止し、処置し、または予測するための方法も提供される。さらに、このようなPPARガンマリン酸化を調整し得る化合物を同定するための方法が提供される。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
ネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPARガンマ)2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基のSer−273リン酸化を抑制する化合物の同定方法であって、以下の:
a)前記ネズミPPARガンマ2またはネズミPPAガンマ2相同体中の対応するセリン残基を含む試料を試験化合物と接触させること;そして
b)ネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基の前記Se−273リン酸化を抑制する試験化合物の能力を確定すること、それにより、ネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基の前記Ser−273リン酸化を選択的に抑制する化合物を同定すること
を包含する方法。
【請求項2】
試料がin vitro、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項1記載の方法。
【請求項3】
ネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基の前記Ser−273リン酸化の抑制が、総PPARガンマに比してSer−273リン酸化PPARガンマの量を分析し、そして対照に対する比率を比較することにより確定される請求項1記載の方法。
【請求項4】
対照が標準条件下でのロシグリタゾンによる処置からの比率である請求項3記載の方法。
【請求項5】
試験化合物が、前記ネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基と直接的に結合するか否かを確定するステップをさらに包含する請求項1記載の方法。
【請求項6】
PPARガンマを結合し、そして一細胞型における古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する化合物の同定方法であって、以下の:
a)化合物がPPARガンマを結合するか否かを確定すること;そして
b)試験化合物の存在下で保持される細胞型の第一試料中のマーカー(この場合、マーカーは、表1または2に列挙されたマーカーの群から選択される)の量および/または活性を、対照である第二試料中のマーカーの量および/または活性と比較すること
(ここで、
第二試料に比して、第一試料中の表1で列挙されたマーカーの有意に高い量および/または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し;および/または
第二試料に比して、第一試料中の表2で列挙されたマーカーの有意に低い量および/または活性は、試験化合物がその細胞型における古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す)
を包含する方法。
【請求項7】
細胞型が、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項6記載の方法。
【請求項8】
第一および/または第二試料が、in vitro、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項6記載の方法。
【請求項9】
第一および/または第二試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項6記載の方法。
【請求項10】
第一および/または第二試料が、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される請求項6記載の方法。
【請求項11】
第一および第二試料が一被験体から得られる単一試料の部分である請求項6記載の方法。
【請求項12】
第一および第二試料が一被験体から得られるプール試料の部分である請求項6記載の方法。
【請求項13】
第二試料が、試験化合物の非存在下で保持される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む請求項6記載の方法。
【請求項14】
第二試料が、ロシグリタゾンで処置される第一試料と同じ細胞型の細胞を含む請求項6記載の方法。
【請求項15】
有意に高い量および/または活性が、表1に列挙されたマーカーの量および/または活性を第二試料に比して少なくとも25%上方調節することを包含する請求項6記載の方法。
【請求項16】
有意に低い量および/または発現が、表2に列挙されたマーカーの量および/または活性を第二試料に比して少なくとも25%下方調節することを包含する請求項6記載の方法。
【請求項17】
マーカーの量が比較される請求項6記載の方法。
【請求項18】
マーカーの量がマーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される請求項17記載の方法。
【請求項19】
タンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項18記載の方法。
【請求項20】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される請求項19記載の方法。
【請求項21】
試薬が、PPARガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスcdk5リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を含む請求項19記載の方法。
【請求項22】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項17記載の方法。
【請求項23】
転写ポリヌクレオチドがmRNAまたはcDNAである請求項22記載の方法。
【請求項24】
検出のステップが、転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する請求項22記載の方法。
【請求項25】
試料中のマーカーの発現のレベルが、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される請求項17記載の方法。
【請求項26】
マーカーがネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ser−273である請求項6記載の方法。
【請求項27】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、II型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに30より高い体格指数からなる群から選択される請求項6記載の方法。
【請求項28】
PPARガンマが配列番号1〜7で記述されるアミノ酸配列を含む請求項6記載の方法。
【請求項29】
被験体における古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害を選択的に促進するためのPPARガンマを結合する化合物の効力の査定方法であって、以下の:
a)マーカー(ここで、マーカーは表1または2に列挙されたマーカーである)の量および/または活性を、第一の時点で被験体において検出すること;
b)化合物の投与後の少なくとも1つのその後の時点の間、ステップa)を反復すること;そして
c)ステップa)およびb)で検出された量および/または活性を比較すること
(ここで、
少なくとも1つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表1で列挙されたマーカーの有意に高い量および/または活性は、試験化合物がその被験体における古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示し;および/または
少なくとも1つのその後の被験体試料に比して、第一被験体試料中の表2で列挙されたマーカーの有意に低い量および/または活性は、試験化合物がその被験体における古典的PPARガンマ活性化を上回る抗代謝障害活性を選択的に促進する、ということを示す)
を包含する方法。
【請求項30】
被験体が代謝障害のための処置を受け、代謝障害のための処置を完了し、および/または第一時点とその後の時点との間で代謝障害から寛解している請求項29記載の方法。
【請求項31】
細胞型が、前脂肪細胞、成熟白色脂肪細胞、細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される請求項29記載の方法。
【請求項32】
第一および/または少なくとも1つのその後の試料が、ex vivoおよびin vivo試料からなる群から選択される請求項29記載の方法。
【請求項33】
第一および/または少なくとも1つのその後の試料が代謝障害の動物モデルから得られる請求項29記載の方法。
【請求項34】
第一および/または少なくとも1つのその後の試料が、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄からなる群から選択される請求項29記載の方法。
【請求項35】
第一および/または少なくとも1つのその後の試料がその被験体から得られる単一試料の一部分である請求項29記載の方法。
【請求項36】
第一および/または少なくとも1つのその後の試料がその被験体から得られるプール試料の一部分である請求項29記載の方法。
【請求項37】
ロシグリタゾンを用いるステップa)およびb)をさらに包含する請求項29記載の方法。
【請求項38】
ロシグリタゾンによる処置の結果が試験化合物からの結果と比較される請求項37記載の方法。
【請求項39】
有意に高い量および/または活性が、表1に列挙されたマーカーの量および/または活性を第二試料に比して少なくとも25%上方調節することを包含する請求項29記載の方法。
【請求項40】
有意に低い量および/または発現が、表2に列挙されたマーカーの量および/または活性を第二試料に比して少なくとも25%下方調節することを包含する請求項29記載の方法。
【請求項41】
マーカーの量が比較される請求項29記載の方法。
【請求項42】
マーカーの量がマーカーのタンパク質発現のレベルを確定することにより確定される請求項41記載の方法。
【請求項43】
タンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項42記載の方法。
【請求項44】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される請求項43記載の方法。
【請求項45】
試薬が、PPARガンマと結合する抗体、ならびにコンセンサスcdk5リン酸化部位を含むペプチドと結合する抗体を含む請求項43記載の方法。
【請求項46】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写ポリヌクレオチドまたはその部分の試料中の存在を検出することにより査定される請求項41記載の方法。
【請求項47】
転写ポリヌクレオチドがmRNAまたはcDNAである請求項46記載の方法。
【請求項48】
検出のステップが、転写ポリヌクレオチドを増幅することをさらに包含する請求項46記載の方法。
【請求項49】
試料中のマーカーの発現のレベルが、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でマーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチドの一部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより査定される請求項41記載の方法。
【請求項50】
マーカーがネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基上のリン酸化Ser−273である請求項29記載の方法。
【請求項51】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、II型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに30より高い体格指数からなる群から選択される請求項29記載の方法。
【請求項52】
PPARガンマが配列番号1〜7で記述されるアミノ酸配列を含む請求項29記載の方法。
【請求項53】
代謝性疾患に苦しむ被験体の治療方法であって、PPARガンマを結合し、抗糖尿病活性を選択的に促進する化合物を被験体に投与し、それにより代謝性疾患に苦しむ被験体を治療することを包含する方法。
【請求項54】
前記化合物が、ネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基のSer−273リン酸化を抑制する請求項53記載の方法。
【請求項55】
化合物が製薬上許容可能な処方物中で投与される請求項53記載の方法。
【請求項56】
製薬上許容可能な処方物が経口処方物である請求項55記載の方法。
【請求項57】
化合物が小分子である請求項53記載の方法。
【請求項58】
PPARガンマを結合し、そして一細胞型における抗代謝障害活性を選択的に促進することによる代謝障害の処置するための化合物であって、化合物がPPARガンマ上のSer−273のリン酸化を抑制する化合物。
【請求項59】
ロシグリタゾンのPPARガンマアゴニスト機能の30%未満を有する請求項58記載の化合物。
【請求項60】
1〜200nM未満のPPARガンマに関するEC50結合親和性を有する請求項58記載の化合物。
【請求項61】
同一条件下でロシグリタゾンに比して表1に列挙されたマーカーの発現を少なくとも30%上方調節するか、および/または同一条件下でのロシグリタゾンに比して表2に列挙されたマーカーの発現を少なくとも30%下方調節する請求項58記載の化合物。
【請求項62】
代謝障害が、糖不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症、異脂肪血症、肥満症、II型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、収縮期および拡張期血圧上昇、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症ならびに30より高い体格指数からなる群から選択される請求項58記載の化合物。
【請求項63】
m−ベンジルインドール、MRL−20、MRL−24、nTZDpa、SR145、SR147、Mbx−102、MK−0533およびBVT.13からなる群から選択される請求項58記載の化合物。
【請求項64】
位置Ser−273に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ2ポリペプチド、あるいはネズミPPARガンマ2ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体をコードする単離核酸分子、またはその相補体。
【請求項65】
配列番号2または3で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ser−273の非リン酸化可能アミノ酸をコードする請求項64記載の単離核酸分子、またはその相補体。
【請求項66】
非相同ポリペプチドをさらにコードする請求項64または65記載の単離核酸分子。
【請求項67】
請求項64〜66のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項68】
発現ベクターである請求項67記載のベクター。
【請求項69】
請求項68のベクターを含む宿主細胞。
【請求項70】
タンパク質の産生方法であって、タンパク質が産生されるまで適切な培地中で請求項69記載の宿主細胞を培養することを包含する方法。
【請求項71】
培地または宿主細胞からタンパク質を単離することをさらに包含する請求項70記載の方法。
【請求項72】
位置Ser−273に非リン酸化可能アミノ酸を有するネズミペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ2ポリペプチドまたはネズミPPARガンマ2ポリペプチド中の対応するセリン残基位置に非リン酸化可能アミノ酸を有するその相同体を含む単離タンパク質。
【請求項73】
配列番号2または3で記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、さらに位置Ser−273の非リン酸化可能アミノ酸をコードする請求項72記載の単離タンパク質。
【請求項74】
非相同ポリペプチドと操作可能的に連結される請求項72または73記載の単離タンパク質。
【請求項75】
Ser−273でリン酸化されるネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基と特異的に結合される抗体またはその断片を産生する単離ハイブリドーマの製造方法であって、以下の:
a)Ser−273でリン酸化される前記ネズミPPARガンマ2あるいはネズミPPARガンマ2相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含む組成物を用いて哺乳動物を免疫化すること、;
b)免疫化哺乳動物から脾細胞を単離すること;
c)単離脾細胞を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成すること;そして
d)その前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体の産生のために個々のハイブリドーマをスクリーニングして、ハイブリドーマを単離すること
を包含する方法。
【請求項76】
請求項75記載の方法に従ったハイブリドーマにより産生される抗体。
【請求項77】
Ser−273でリン酸化されるネズミPPARガンマ2のアミノ酸配列あるいはネズミPPARガンマ2相同体またはその断片中の対応するセリン残基を含むポリペプチドと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項78】
アミノ酸配列:KTTDK(pS)PFVIYDCを有するエピトープを特異的に結合する請求項77記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項79】
モノクローナル抗体である請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項80】
ポリクローナル抗体である請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項81】
キメラまたはヒト化抗体である請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項82】
検出可能的に標識される請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項83】
エフェクタードメインを含む請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項84】
Fcドメインを含む請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項85】
一本鎖抗体である請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項86】
Fab断片である請求項77記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項87】
Ser−273でリン酸化されるネズミPPARガンマ2またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基を特異的に検出するための1つ以上の試薬を含むPPARガンマのリン酸化を抑制する化合物の能力を査定するためのキット。
【請求項88】
セリン273またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化PPARガンマ2遺伝子を含む非ヒト動物モデル。
【請求項89】
突然変異が非リン酸化可能アミノ酸への前記セリンの突然変異を含む請求項88記載の非ヒト動物モデル。
【請求項90】
前記動物が、セリン273またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化PPARガンマ2遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である特許請求の範囲88記載の非ヒト動物モデル。
【請求項91】
動物がノックインまたはトランスジェニック動物である請求項88記載の非ヒト動物モデル。
【請求項92】
動物が齧歯類および/またはマウスである請求項88記載の非ヒト動物モデル。
【請求項93】
被験体において調節される遺伝子の同定方法であって、以下の:
(a)セリン273またはネズミPPARガンマ2相同体中の対応するセリン残基でリン酸化され得ないタンパク質をコードする突然変異化PPARガンマ遺伝子を発現すること;
(b)前記突然変異化PPARガンマ遺伝子の1つ以上の候補標的遺伝子の発現および/または活性のレベルを確定すること;そして
(c)対照に比して有意に変更された発現および/または活性を示す遺伝子を同定すること
を包含する方法。
【請求項94】
予測処置結果に従った試料の分類方法であって、以下の:
a)生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル;ならびに
b)対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル
を比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表1および2に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が予測処置結果に従った生物学的試料を分類する方法。
【請求項95】
予測処置結果を有すると思われる被験体の同定方法であって、以下の:
a)生物学的試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル;ならびに
b)対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル
を比較することを包含する方法であり、この場合、単数のマーカーまたは複数のマーカーが表1および2に列挙されたマーカーからなる群から選択され、そして被験体からの生物学的試料および対照試料中の単数のマーカーまたは複数のマーカーの発現のレベル間の差が被験体における予測処置結果の見込みを予測する方法。
【請求項96】
予測処置結果が表1および2に列挙された処置結果から選択される請求項94または95記載の方法。
【請求項97】
予測処置結果がグルコース感受性増大の見込みである請求項94または95記載の方法。
【請求項98】
組織試料が、PPARガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる請求項94記載の方法。
【請求項99】
生物学的試料が、PPARガンマリガンドが被験体に投与された後に得られる請求項95記載の方法。

【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14A】
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【図14B】
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【図14C】
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【公表番号】特表2013−520162(P2013−520162A)
【公表日】平成25年6月6日(2013.6.6)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−550112(P2012−550112)
【出願日】平成23年1月20日(2011.1.20)
【国際出願番号】PCT/US2011/021855
【国際公開番号】WO2011/091134
【国際公開日】平成23年7月28日(2011.7.28)
【出願人】(399052796)デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド (36)
【Fターム(参考)】