代謝障害治療のためのカルジオトロフィン１の使用
本発明は、肥満および関連する障害：高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病の発生および異脂肪血症、並びにその食欲減退機能を利用した、脂肪酸化刺激剤、低血糖、骨格筋レベルに対するインスリンの感作剤および腸細胞によるグルコースの腸管輸送抑制剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）の肥満および関連する障害：高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病の発生、および異脂肪血症の治療のための使用、並びにその食欲減退機能を利用した、脂肪酸化刺激剤、低血糖、骨格筋レベルに対するインスリンの感作剤、および腸細胞によるグルコースの腸管輸送抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、数多くの先進国において拡大している重大な公衆衛生上の問題である（Ｂｅｌｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂｒａｙ、２００５、Ｊ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄ Ｓｏｃ；１５７：Ｓ４２−４９；ｑｕｉｚ ４９）。我々先進国における食料摂取量の増加、不健康な食生活、座ることの多い生活様式は、肥満の急激な増加に疑いなく影響している（ＳｔｅｉｎおよびＣｏｌｄｉｔｚ等、２００４、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．８９：２５２２−５）。数多くの研究により、肥満およびその代謝異常の罹患率の驚くべき増加は、ベータ細胞のインスリン抵抗性、異脂肪血症および膵臓における最終的な破綻と関連しており、いや応なく２型糖尿病を生じ、この疾患が引き起こす全ての結果をともなう（Ｒａｎａ等、２００７、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ． Ｍｅｔａｂ．、９：２１８−２３２）。
【０００３】
肥満についての現在の治療法には以下のようなものがある：ｉ）ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ、Ｏｒｌｉｓｔａｔ）は、穏やかな体重減少を生じさせる胃腸リパーゼの抑制剤であるが、大腸癌を含む胃腸における副作用という主要な問題を有する。ｉｉ）シブトラミン（Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）は、前述の治療よりも大きな体重減少を生じさせるモノアミン補足抑制剤であるが、血圧の上昇および心拍出量の増加を伴う。ｉｉｉ）最後に、ヨーロッパで承認されている（ＦＤＡによっては承認されていないが）リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）は、内在性カンナビノイド受容体アンタゴニストであるが、鬱病などの情動行動における変化を生じる問題を有するため、市場から撤退した。
【０００４】
インスリン抵抗性について現在の治療法では、一般的にチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）が、他の療法と併用して使用される。これらの薬物の問題は、とりわけインスリンとともに投与したときに、体重が増加することである。このことから、体重の減少の他に、インスリンの作用を増感または増加することのできる薬剤が、これらの病理学に対し非常に興味あるものとされるであろうことが分かる。さらに、腸グルコース抑制などの末梢作用を伴う治療が、肥満および真性糖尿病に対して非常に興味あるものとされるであろう。
【０００５】
１９９４年の終わりのレプチンの発見が、エネルギーバランスを調節する際に脂肪細胞により分泌される因子の研究に新しい展望を切り開いた。このタンパク質は、主に脂肪の量に比例して、脂肪細胞により産生および分泌される。このタンパク質は、筋肉による脂肪の酸化およびグルコース補足を増す末梢作用の他に、食欲調節のための中枢神経系モジュレータとして確認された。しかしながら、まもなく、肥満は高レプチンレベルに関連していること、内因性レプチンは効果的ではなく、そのため、肥満体のヒトおよび齧歯類の大部分は耐レプチン性であり、したがって、この治療手段は、レプチン欠損（低割合の肥満人）により生じる疾患を患う個体に限定されることが判明した。
【０００６】
レプチンは構造的にｇｐ−１３０ファミリーのサイトカインと類似しており、またレプチン受容体（ＬＲｂ）は構造的にｇｐ−１３０Ｒｂｅｔａとして知られているｇｐ１３０サイトカイン受容体と類似していることから、ｇｐ１３０サイトカインファミリーの別のメンバー、特にＣＮＴＦが、肥満者において観察されるレプチン耐性の問題を克服する肥満治療用治療剤としての能力について研究された。
【０００７】
ＣＮＴＦサイトカインは、肥満、インスリン抵抗性および脂肪肝を患うマウスに対して、これらすべてのパラメータを改善するので、可能性ある治療効果を有するものとして知られている（Ｓｌｅｅｍａｎ等、２００３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１４２９７−１４３０２）。ＣＮＴＦの食欲減退能（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＴＷ等、１９９５）、ＡＭＰＫ活性化能を介してインスリン抵抗性を戻すこのサイトカインの能力（Ｗａｔｔ等、２００６、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１２：５４１−５４８）、さらには筋肉によるグルコース補足を刺激するその能力（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ等、２００９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、 Ｅｐｕｂ Ｊａｎｕａｒｙ、０９、２００９）が報告され、これによりこのサイトカインが肥満および関連疾患を治療できる可能性があるものとして提案された（Ａｈｉｍａ等、２００６、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１２：５１１−５１２）。それにもかかわらず、このサイトカインを治療剤として使用することは、高ＣＮＳによりおよび抗ＣＮＴＦ抗体の産生により、また脂肪および筋肉組織におけるＣＮＴＦＲα受容体が低発現であることにより制限されている。体重約１１４キログラムの患者にこのサイトカインを１〜２マイクログラム／ｋｇの用量で８４日間投与した臨床試験では、３〜４ｋｇの減少を導いた。これらの結果は有望であると思われるが、高ＣＮＴＦ用量で患者に吐き気が現れ、ついには抗ＣＮＴＦ抗体が生じて体重が増加した（ＥｔｔｉｎｇｅｒＭ．Ｐ．等、ＪＡＭＡ、２００３、２８９：１８２６−３２）。
【０００８】
したがって、当該技術分野においては、いままで知られているｇｐ１３０系リガンドの欠点を有していない肥満の治療に有用である薬剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
第一の態様によれば、本発明は、代謝障害治療用のカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物、さらには代謝障害治療用薬物の調製のためのカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物の使用に関する。
【００１０】
別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン１活性を誘起する薬学的に活性な量の化合物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法に関する。
【００１１】
別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン活性を誘起する化合物と抗糖尿病化合物とを一緒または別個に含んでなる組成物に関する。引き続く態様によれば、本発明は、前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用の本発明による組成物に関し、さらには、前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用薬物の調製のための、本発明による組成物の使用に関する。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、薬学的に活性な量の本発明による組成物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カルジオトロフィン１は、高脂肪食物由来肥満のマウスの体重を減らす。（Ｓ：血清、ｒＣＴ−１の投与ビヒクル）。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝８匹の動物。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２】ＣＴ−１が介在する高脂肪食物由来肥満のマウスの体重の減少は、少なくとも一部分は、食欲減退効果によるものである。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝８匹の動物。＊ｐ＜０．０５。
【図３】カルジオトロフィン１は、普通の食事（ＮＣＤ）のマウスの体重を減らす。（Ｓ：血清、ｒＣＴ−１の投与ビヒクル）。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】ＣＴ−１が介在する体重減少は、食欲減退効果以外の因子によるものである（結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝６匹の動物。＊ｐ＜０．０５）。ペアフィード（ＰＦ）群は、ＣＴ−１で処置したマウスと同じ日常摂取したマウス群である。
【図５】マウスＣ５７ＢＬ／６（月齢３カ月）にｒＣＴ−１を単回投与（１０μｇ）で急性静脈投与すると、ベースライン血糖レベルが減少する。血糖レベル、インスリンおよびウエスタンブロット（ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）活性が筋肉にみられる）を、ｒＣＴ−１の投与１時間後に測定する。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５）。
【図６】ｒＣＴ−１を単回投与（１０μｇ）で急性投与すると、高糖食後の血中グルコースの増加を防止する。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５）。
【図７】ＣＴ−１は、膵臓破壊（ストレプトゾトシンで）のマウスでの直接低血糖効果を有する。ＣＴ−１単独で投与すると血糖レベルが減少し、インスリンとともに投与すると効果が増大する。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（対生理食塩水群）。ｘ軸は、種々の処置の実施後の経過時間（分）を示す。
【図８】ＣＴ−１の低血糖効果は、少なくとも一部分は、筋肉によるグルコース消費の増加によるものである。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（対生理食塩水群）。
【図９】高脂肪食物由来肥満のマウスにおいて、ｒＣＴ−１による６日間の長期処置後のグルコースおよびインスリンレベル。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝７匹の動物。＊ｐ＜０．０５。
【図１０】１週間のｒＣＴ−１による長期処置後またはカロリー制限（ＰＦ）後のグルコースおよびインスリンレベル。ＰＦ（ペアフィード）群は、ＣＴ−１で処置したマウスと同じ日常摂取したマウスである。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝６匹の動物。
【図１１】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（生体外処置）。結果は、６種のマウスにおいて１２回測定での平均±ＳＥで表されている。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１２】カルジオトロフィン１は、ＣＮＴＦよりも腸のグルコース輸送の抑制効果が大きい（生体外処置）。結果は、６種のマウスにおける２４〜３５回の測定での平均±ＳＥで表されている。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（生体内急性処置）。結果は、３０回測定での平均±ＳＥで表されている。１実験群当たりのｎ＝５匹のマウス。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１４】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（生体内長期処置）。結果は、３０回測定での平均±ＳＥで表されている。１実験群当たりのｎ＝５匹のマウス。＊＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（Ｃａｃｏ−２細胞における研究）。結果は、１群当たり４２〜４４回測定での平均±ＳＥで表されている。
【図１６】カルジオトロフィン１は、脂肪細胞（ＣＮＴＦではない）におけるレプチン放出を抑制する（脂肪細胞の一次培養における生体外実験）。結果は、６つの独立した実験について、平均±ＳＥで表されている。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照；ｂｐ＜０．０１；ｃｐ＜０．００１対インスリン。
【図１７】油脂分解に対するＣＴ−１とＣＮＴＦの効果の差。２４時間中のインスリンの有無におけるＣＴ−１またはＣＮＴＦにより産生される一次ラット脂肪細胞におけるグリセロール放出（油脂分解の測定）。ｎ＝４−８；＊Ｐ＜０．０５対対照細胞（１００％）；＃Ｐ＜０．０５対インスリン処置細胞
【図１８】典型的に脂肪細胞へ分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における褐色脂肪組織からの遺伝子導入に対するＣＴ−１とＣＮＴＦの効果の差。細胞を、２４時間中ＣＴ−１またはＣＮＴＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理した（ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５対対照細胞）。遺伝子発現を、定量的ＰＣＲにより測定した。
【図１９】ｒＣＴ−１による６日間の長期処置後のＩＬ−６の血清レベル。
【図２０】血清、ＣＴ−１で処置またはＣＴ−１で処置された動物と同じ食事で処置したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢４カ月）の３群における組織学的肝スライス（Ｈ＆Ｅ１００Ｘ）を表すイメージ。いずれの場合も炎症性浸潤は観察されなかった。
【図２１】ｒＣＴ−１は、高脂肪摂取後の血清およびトリグリセリド（ＴＧ）における遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の濃度の減少を生じる。
【図２２】脂質内注射後の血清ＦＦＡの除去におけるｒＣＴ−１の効果。
【図２３】骨格筋における単離ミトコンドリアでのベータ酸化に対する、ｒＣＴ−１の急性投与の効果。データは、平均±ＳＥで表されている（ｎ＝＊＊＊、＊Ｐ＜０．０５）。
【図２４】定量的ＰＣＲにより測定される脂肪酸の酸化に関与する遺伝子の発現レベルに対するｒＣＴ−１の効果。
【図２５】Ｌ６Ｅ９細胞（筋管へ分化した筋芽細胞）におけるインスリンによるグルコース（２−デオキシグルコース）摂取に対するｒＣＴ−１の効果の増加。ＣＴ−１での急性（１時間）および長期（２４時間）の処置では、インスリンにより誘起されたグルコース摂取が顕著に増加する。＊Ｐ＜０．０５対対照細胞；＃Ｐ＜０．０５対インスリン処置細胞。
【図２６】Ｌ６Ｅ９細胞（筋管へ分化した筋芽細胞）におけるインスリンシグナル伝達に対するｒＣＴ−１の効果の増加。（Ａ）ｒＣＴ−１での急性処置（１５分間）および（Ｂ）ｒＣＴ−１での長期処置（１０時間および２４時間）は、インスリンにより誘起されるＡＫＴリン酸化を高める。
【図２７】筋肉における「生体内」インスリンシグナル伝達に対するｒＣＴ−１（急性処置）の効果の増加。月齢４カ月のＣ５７ＢＬ／６マウスに、洞静脈にインスリン注射する３０分前にｒＣＴ−１（１０μｇ／マウス）を注射した。５分後、腓腹筋を取り出し、均一化した。ＣＴ−１は筋肉においてインスリンにより誘起されるＡＫＴリン酸化を高めることが判明した。デンシトメリー分析（ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２８】筋肉における「生体内」インスリンシグナル伝達に対するｒＣＴ−１（長期処置）の効果の増加。月齢４カ月のＣ５７ＢＬ／６マウスに、６日中ｒＣＴ−１（０、２ｍｇ／ｋｇ／日）を注射した。前の群と同じ日常摂取し、６日中生理食塩水血清を注射したマウス（ペアフィード群）を、対照として使用した。絶食１６時間後、インスリンを動物の洞静脈に注射し、５分後、腓腹筋を取り出し、均一化した。ＣＴ−１は筋肉においてインスリンにより誘起されるＡＫＴリン酸化を高めることが判明した。デンシトメリー分析（ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＣＴ−１の医学的および美容的用途
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＴ−１は普通食のマウスおよび高脂肪食のマウスで体重減少を生じさせることを見出した。この効果は、少なくとも一部分は、ＣＴ−１の食欲減退効果（図２）、並びに高脂肪食後の血漿脂質の増加を下げる（図２０および２１）、高糖食後の血糖を減少させる（図５〜６）、筋肉によるグルコース消費の増加を生じさせる（図８）、および腸により補足されるグルコースを減らす（図１１〜１４）というＣＴ−１の能力によるものである。さらに、本発明者らは、ＣＴ−１が脂肪細胞における基礎分泌およびインスリン刺激レプチン分泌を抑制すること、さらにはグリセロールの放出およびインスリンの抗脂肪分解活性の抑制を誘起できることを明らかにした（図１６および１７）。しかしながら、これらの効果は、ＣＮＴＦを使用するときには観察されない。特定の理論にこだわるものではないが、前記効果がこの分子の筋肉に対する作用（低血糖を生じるグルコース捕捉の刺激）に加わり、脂肪細胞がトリグリセリドとなるのに利用できるグルコースの減少を生じるので、この効果の差異はＣＴ−１の使用の利点となると思われる。
【００１５】
第一の態様によれば、本発明は、代謝障害の治療のためのカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物に関する。さらに、本発明は、代謝障害治療用薬物の調製のための、カルジオトロフィン１活性を誘起する化合物の使用、さらにはＣＴ−１活性を誘起する化合物を被験者に投与することを含んでなる代謝障害の治療方法に関する。
【００１６】
本明細書において使用される用語「カルジオトロフィン１活性を誘起する化合物」は、投与により、既に存在しているＣＴ−１の特異的活性を増加させるか、あるいはカルジオトロフィンと同じ機能を実質的に有するＣＴ−１または類似体の合成の増加によるかを問わず、カルジオトロフィン１活性（ＣＴ−１）の増加を生じる化合物である。したがって、好ましい態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起する化学物質は、ＣＴ−１自体である。「ＣＴ−１」は、ヒトカルジオトロフィンのアイソフォーム１に対応する、アクセス番号ＣＴＦ１＿ＨＵＭＡＮまたはＱ１６６１９（バージョン６２、２００８年１２月１６日）若しくはヒトカルジオトロフィンのアイソフォーム２に対応するアクセス番号Ｑ５Ｕ５Ｙ７（バージョン１、２００９年１月２０日）によるＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに記載の配列により定義されているタンパク質、さらには他の種における相同分子種、例えば、マウス（アクセス番号ＮＰ＿０３１８２１またはＱ６０７５３（バージョン５０、２００８年１２月１６日）およびＮＰ＿９４２１５５またはＰ８３７１４（バージョン４２、２００８年１２月１６日）のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに定義されている配列）、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースで定義されている配列（アクセス番号ＮＰ＿０５８８２５またはＱ６３０８６（バージョン５０、２００８年１１月４日）およびＮＰ＿００１１２９２７２またはＱ６Ｒ２Ｒ３（バージョン３０、２００９年１月２０日）並びにチンパンジー（アクセス番号ＮＰ＿００１００９１１２またはＱ６Ｒ２Ｒ２（バージョン３０、２００８年１１月４日）のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに定義されている配列）により定義されているタンパク質である。
【００１７】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起する化学物質は、ＣＴ−１の機能的に同等な変異体である。本明細書で使用されている表現「ＣＴ−１の機能的に同等の変異体」とは、ＣＴ−１と、生体外および生体内の両方で、ＣＴ−１と関連する本発明に記載の機能の一つ以上を共有し、アミノ酸配列において最少の同一性を有する分子である。したがって、本発明に使用するのに好適なＣＴ−１の変異体は、一つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失によって上記配列から誘導されたものであり、天然対立遺伝子、代替処理から生じる変異体および自然に現れる分泌および切断型を含む。ＣＴ−１の変異体は、好ましくはＣＴ−１と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す。同一性度は、当業者に周知の方法を用いて求める。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．等、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ． ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］、好ましくはデフォルトパラメータを用いて求める。一方、想定されるＣＴ−１の変異体は、ＣＴ−１の機能、例えば、以下の機能（これらには限定されない）、の少なくとも一つを示す：
−普通食を与えられたとき、および高脂肪食で肥満を誘起したときの両方で、マウスにおいて体重減少を生じさせる能力。体重の減少を生じる化合物の能力を測定する方法は、当該技術分野においてにおいて十分に記載されており、本発明の実施例１に記載の方法を含む。高脂肪食が与えられたマウスにおける体重減少を測定する場合において、例えば、脂肪の形態でのキロカロリーの１０％であるＤ１２４５０ＢまたはＬＦＤと称される食事、脂肪の形態でのキロカロリーの４５％であるＤ１２４５１またはＨＦＤと称される食事または脂肪の形態でのキロカロリー６０％であるＤ１２４９２またはＶＨＦＤと称される食事などの当該技術分野において知られている高脂肪食を使用することができる。
−本発明の実施例１に記載の方法またはＷＯ２００７０９３３６３に記載の方法を用いて求めることができる食欲減退効果を誘起する能力。
−ＶＯ２値とＶＣＯ２値との比として定義される呼吸率を減少させる能力。このパラメータは、当該技術分野において知られている方法を用いて求めることができる。
−高脂肪食後の脂質血症の増加を防止する能力（トリグリセリドと遊離脂肪酸の両方に関して）。標準的な方法を使用して、好ましくは市販のキットにより、血漿中の脂肪酸およびトリグリセリドの濃度を測定する。
−直接低血糖能、または高糖食後若しくは膵臓破壊後の低血糖能。これは、市販のグルコース検出キットを使用することにより測定できる。膵臓破壊は、本発明の実施例３に記載のストレプトゾトシンによるか、または炎症誘発性サイトカイン（Ｃｈｏｉ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、１３：４３−５３に記載のＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−ａおよびＩＦＮ−γにより形成されるカクテル）を使用することにより生じさせることができる。
−筋肉により補足されるグルコースの増加を生じさせる能力であって、この活性は、グルコースでマークした類似体を吸収する食筋の能力に基づく本願の実施例３に記載の方法を用いるか、またはＵｅｙａｍａ等（Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ Ｒｅｃｅｐｔ ２０００；９：２６７−２７４）により記載されているような非同位法を用いて測定される。
−脂肪細胞の一次培養、および脂肪細胞における分化を促進するように処理された線維芽細胞株の両方を使用できる、グルコース補足、および脂肪細胞によるレプチンの放出についてのインスリンの効果を抑制する能力。脂肪細胞によるグルコースの放出は、市販のグルコース検出キットを使用することによりおこなうことができる。レプチンの測定は、市販のキットを用いた免疫測定（ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等）によりおこなうことができる。
【００１８】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起できる化学物質は、ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたは機能的に同等の変異体である。
【００１９】
本明細書において使用されている用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドにより形成されるいずれかの長さの高分子型ヌクレオチドに関する。この用語は、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの両方を含むだけでなく、改変ポリヌクレオチド（メチル化ポリヌクレオチド、保護されたポリヌクレオチド等）を含む。
【００２０】
ＣＴ−１活性を誘起することのできる化学物質として使用するのに好適なポリヌクレオチドには、その配列がヒトカルジオトロフィンの転写物の変異体１に対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号ＢＣ０６４４１６、バージョン９、２００８年１０月１５日）に記載のものに対応するポリヌクレオチド、ヒトカルジオトロフィンの転写物の変異体１に対応するアクセス番号ＢＣ０３６７８７（バージョン９、２００９年８月１２日）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ｒａｔ）のカルジオトロフィン１をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号Ｄ７８５９１、バージョン４、２００９年１月１２日）に記載の配列、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ｒａｔ）のカルジオトロフィン２をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号ＡＹ５１８２０５、バージョン３、２００９年１月１２日）に記載の配列、ハツカネズミＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｍｏｕｓｅ）のカルジオトロフィン１をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号Ｕ１８３６６、バージョン４、２００９年１月１２日）に記載の配列、ハツカネズミＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ （ｍｏｕｓｅ）のカルジオトロフィン２をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号ＡＢ１２５６６１、バージョン２、２００９年１月１２日）に記載の配列などがあるが、これらには限定されない。
【００２１】
あるいは、ＣＴ−１活性を誘起することができる化学物質には、それらの特異的配列により上記で定義されたポリヌクレオチドの機能的に同等の変異体が含まれる。「機能的に同等の変異体」は、本発明に関連して、上記で定義されたＣＴ−１活性を有するポリペプチドをコードすることができ、上記した配列に対する１つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入、欠失または置換により上記のポリヌクレオチドから得られる全てのポリヌクレオチドである。好ましくは、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列により非常に制限された条件で上記したポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドである。非常に制限されたハイブリダイゼーションの典型的な条件には、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ：０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および４０％ホルムアミド中４２℃で１４１時間のインキュベーション後、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６０℃で１あるいは数サイクルの洗浄が含まれる。あるいは、非常に制限された条件には、６ＸＳＳＣ中概略５０〜５５℃の温度でのハイブリダイゼーションと、最後に１〜３ＸＳＳＣ中６８℃の温度での洗浄を含んでなる。中程度に制限された条件は、０．２または０．３Ｍ ＮａＣｌ中概略５０〜６５℃の温度でハイブリダイゼーション後、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中概略５０〜５５℃で洗浄を含んでなる。
【００２２】
好ましくは、ＣＴ−１活性を誘起することのできる化学物質がポリヌクレオチドであるとき、これは、操作的に発現の調節領域に関連付けられる。本発明に使用される調節配列は、核プロモーター配列またはエンハンサー配列および／または他の調節配列（非相同核酸配列の発現を増加する）であることができる。プロモーターは、構成的でも誘発性でもよい。非相同核酸配列の一定の発現が望まれる場合には、構成的プロモーターが使用される。周知の構成的プロモーターとしては、例えば、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターなどが挙げられる。構成的プロモーターの数多くの他の例は、当該技術分野において周知であり、本発明の実施に使用できる。非相同核酸配列の制御された発現が望まれる場合には、誘発性プロモーターを使用する必要がある。非誘発状態では、誘発性プロモーターは、「サイレント」である。「サイレント」は、誘導剤の不存在下で、非相同核酸配列の発現がほとんどまたは全く検出されないが、誘導剤の存在下では、非相同核酸配列の発現が生じる。しばしば、誘導剤濃度を変えることにより発現レベルを制御することができる。発現を制御すること、例えば、誘発性プロモーターをより強くまたはより弱く刺激するように誘導剤の濃度を変えることにより、非相同核酸配列の転写物の濃度に影響を及ぼすことができる。非相同核酸配列が遺伝子をコードする場合には、合成されたタンパク質の量を制御することができる。このように、治療薬の濃度を変化させることができる。周知の誘発性プロモーターとしては、以下のものがある：エストロゲン若しくはアンドロゲンプロモーター、メタロチオネインプロモーターまたはエクジソンに応答するプロモーター。数多くの他の例が、当該技術分野において周知であり、本発明を実施するのに使用できる。構成的および誘発性プロモーター（通常非常に多種多様な細胞または組織で機能する）の他に、特異的組織プロモーターを使用して、細胞または組織において特異的核酸の非相同配列の発現をさせることができる。特異的組織プロモーターの周知な例としては、以下の異なる特異的筋肉プロモーターなどが挙げられる：骨格α−アクチンプロモーター、心臓アクチンプロモーター、骨格トロポニンＣプロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター（および遅収縮）並びにクレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサー。当該技術分野において周知であり、本発明を実施するのに使用できる特異的筋肉プロモーターがある（特異的筋肉プロモーターについては、Ｍｉｌｌｅｒ等、（１９９３）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１５：１９１−１９６参照）。
【００２３】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起することのできる化学物質は、上記で定義したポリヌクレオチドを含んでなるベクター、すなわち、ＣＴ−１またはその機能的に同等の変異体をコードするベクターである。前記ポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターは、原核生物における発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージ、「シャトル」ベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８、酵母発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミド型のベクター、インテグレーションプラスミド、ＹＥＰベクター、動源体プラスミド等、昆虫細胞における発現ベクター、例えば、ｐＡＣ系ベクターおよびｐＶＬ系ベクター、植物における発現ベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系のベクター、並びにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、さらにはレトロウイルスおよび特にレンチウイルス）に基づく真核生物細胞における発現ベクター、さらには非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１由来のベクターである。
【００２４】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性の増加を生じさせることができる化学物質は、カルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を培地に分泌することができる細胞である。カルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体の発現に好適な細胞には、心筋細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（ＢおよびＴ細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜の細胞、種々の器官、好ましくはランゲルハンス島から単離した細胞から単離した細胞の一次培養液、肝細胞、単核細胞を含む白血球、間葉、臍帯若しくは成人白血球（皮膚、肺、腎臓および肝臓由来）、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞などがあげられるが、これらには限定されない。樹立細胞株、例えば、ジャーカットｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞およびＷ１３８細胞も、好適である。
【００２５】
当業者は、カルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を培地に分泌することができる細胞は、微小粒子またはマイクロカプセルを形成することで、細胞は患者に使用される前、より大きな有用寿命を有するものとなることを理解する。本発明の目的である微小粒子を形成するのに好適な物質には、細胞支持体として作用する治療薬の連続分泌を可能にする生体適合高分子物質などがある。したがって、前記生体適合高分子物質は、例えば、熱可塑性ポリマーまたはヒドロゲルポリマーであることができる。熱可塑性ポリマーには、アクリル酸、アクリルアミド、２−アミノメチルメタクリレート、ポリ（テトラフルオロエチレン−共ヘキサフルオロプロピレン）、メタクリル−（７−クマロキシ）エチルエステル酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリアミドアミン、ポリ（アミノ）−ｐ−キシリレン、ポリ（クロロエチルビニルエーテル）、ポリカプロラクトン、ポリ（カプロラクトン−コ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（カーボネート尿素）ウレタン、ポリ（カーボネート）ウレタン、ポリエチレン、ポリエチレン共重合体およびアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（４−ヒドロキシブチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（Ｌ乳酸）、ポリ（ガンマ−メチル、Ｌ−グルタメート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（プロピレンフマレート）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリピロール、ポリスチレン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、超高分子量ポリエチレン、６−（ｐ−ビニルベンズアミド）−ヘキサン酸およびＮ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−マルトンアミド並びに前記ポリマーの複数を含む共重合体（コポリマー）などがある。ヒドロゲル型ポリマーには、アルギネート、アガロース、コラーゲン、澱粉、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、セルロースおよびその誘導体、ペクチン、コンドロイチンスルフェート、フィブリンおよびフィブロイン型の天然物質、さらには合成ヒドロゲル、例えばセファロースおよびセファデックスなどがある。
【００２６】
当該技術分野においては、前記ポリマーの一部は不安定であり、比較的多孔性であり、抗体が内部にアクセスする可能性があり細胞を損傷することに加えて、ゲル性を失う傾向がある。このため、任意に、本発明の微小粒子は、粒子を安定にする半透過性膜により包囲して、抗体不透過バリアを形成することもできる。半透過性膜は、細胞生存能力に必要な全ての溶質が入ることができ、微小粒子に含まれる細胞により産生される治療用タンパク質が出ることができるが、抗体が実質的に透過することができず、その結果、細胞が微小粒子を収容している生体により生じる免疫応答から保護される。半透過性膜を形成するのに好適な物質は、生体液に不溶の物質、好ましくはポリアミノ酸、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−アスパラギン、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリベンジル−Ｌ−アスパーテート、ポリ−Ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン、ポリ−ガンマ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｓ−ＣＢＺ−Ｌ−システイン、ポリ−ε−ＣＢＺ−Ｄ−リジン、ポリ−δ−ＣＢＺ−ＤＬ−オルニチン、ポリ−Ｏ−ＣＢＺ−Ｌ−セリン、ポリ−Ｏ−ＣＢＺ−Ｄ−チロシン、ポリ（γ−エチル−Ｌ−グルタメート）、ポリ−Ｄ−グルタミン酸、ポリグリシン、ポリ−γ−Ｎ−ヘキシルＬ−グルタメート、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ（α，β−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパートアミド］）、ポリ−Ｌ−ヒドロキシプロリン、ポリ（α、β−［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−ＤＬ−アスパートアミド］）、ポリ−Ｌ−イソロイシン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン、ポリ−Ｌ−プロリン、ポリ−Ｌ−セリン、ポリ−Ｌ−トレオニン、ポリ−ＤＬ−トリプトファン、ポリ−Ｄ−チロシンまたはそれらの組み合わせである。
【００２７】
本明細書において使用されている用語「代謝障害」は、代謝における誤りおよびアンバランスを生じるだけでなく、準最適な形態で起きる代謝過程を生じる全ての種類の障害である。また、この表現は、それ自体の疾患は代謝障害によっては生じなかったかもしれないが、代謝調節により治療できる障害に関する。好ましい態様によれば、代謝障害は、肥満、高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病および異脂肪血症からなる群から選択されるものである。
【００２８】
本発明において使用される用語「肥満」は、ヒトの体重（ｋｇ）と身長（ｍ）の二乗との間の比からなる、肥満度指数（ＢＭＩ）に基づいてＷＨＯにより示された肥満の定義に関する。この基準によれば、ＢＭＩ１８．５ｋｇ／ｍ２未満は体重が不足または痩せ気味とみなし、ＢＭＩ１８．５〜２４．９ｋｇ／ｍ２は正常体重としてみなし、ＢＭＩ２５．０〜２９．９ｋｇ／ｍ２は過体重グレード１とみなし、ＢＭＩ３０．０〜３９．０ｋｇ／ｍ２は過体重グレード２とみなし、ＢＭＩ４０．０ｋｇ／ｍ２以上は病的肥満とみなす。あるいは、個人の肥満度を定義するのには別の方法、例えば、助骨の下端と骨盤の上端との間の中点で測定したウエストの直径（単位：ｃｍ）、皮膚のひだの厚さ、および脂肪のない体は脂肪が多い体よりも電気をよく通すという原理に基づく生体インピーダンスがある。
【００２９】
本発明において使用される用語「高血糖」は、空腹時ベースラインレベルに対して異常に高い血糖値となる状態に関する。特に、空腹時の血糖値が常に１２６ｍｇ／ｄＬ超であるとき、食後の血糖値が１４０ｍｇ／ｄＬ超であるとき、および／または体重の１キログラム当たり１．７５グラムのグルコースを投与してから２時間後の静脈血漿の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ超であるときに高血糖が起きる。
【００３０】
本発明において使用される用語「インスリン抵抗性」は、細胞がインスリンに対して正しく応答しない障害に関する。その結果、体は、高血糖値に応答してより多くのインスリンを生じる。インスリン抵抗性を患う患者は、高血糖値および高循環インスリンレベルを示すことがしばしばある。インスリン抵抗性は、しばしば肥満、高血圧および脂質異常症と関連づけられている。さらに、インスリン抵抗性は、２型糖尿病を患う患者にしばしば現れる。
【００３１】
本発明において使用される用語「２型糖尿病」は、大血管、小血管および神経に影響する慢性合併症を生じる、血糖値の異常な増加により特徴づけられる疾患に関する。この疾患における基礎障害は、インスリン抵抗性と称される、インスリン作用の困難（このホルモンに対する組織感受性の損失の形態）、および膵臓における産生に関与する細胞によるインスリンの不適切な分泌である。グルコース濃度の増加の他に、誤ったインスリン作用がしばしばコレステロールおよび／またはトリグレセリドレベルの増加を生じる。
【００３２】
本発明において使用され用語「異脂肪血症」は、脂質代謝における障害でその結果脂質濃度（コレステロール、トリグリセリドなど）および血中リポタンパク質（高密度リポタンパク質）における障害を生じることにより特徴付けられる病的状態に関する。本発明の方法で治療することができる異脂肪血症として、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、Ｉ型、ＩＩａ型、ＩＩｂ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型高リポタンパク血症、高カイロミクロン血症、複合脂質異常症などがある。
【００３３】
本発明による組成物は、本発明の方法が美容的目的を有する場合には、病的肥満の治療と過体重グレード１またはグレード２の治療の両方に有用である。したがって、別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン１活性を誘起する化合を患者に投与することを含んでなる、肥満治療のための美容的方法に関する。この態様によれば、脂肪の面での過剰体重であり、本発明の美容的方法により処置されることができる患者は、視覚的または２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、好ましくは２５〜３０のＢＭＩにより確認できる。これらの個人は肥満であるとみなされ、美容的理由で体重コントロールを必要とする。
【００３４】
カルジオトロフィン１活性を誘起することができる化学物質として本発明による美容的方法の種々の態様は、肥満および他の代謝障害の治療方法に関連して上記されている。
【００３５】
本発明による化合物は、急性および長期治療の両方で投与できる。本発明において使用される表現「長期投与」は、化合物を長期間にわたって連続的に患者に投与して前記期間の間、治療形態を維持する投与方法に関する。長期投与形態では、化合物を毎日複数回数、毎日２回、毎日３回程度あるいはその付近の回数程度投与される。長期投与は、１日を通して周期的に種々の静脈注射によりおこなうことができる。あるいは、長期投与は、ボーラスの形態または毎日、２日毎、３〜１５日毎、１０日以上毎に実施できる連続注入による投与を含む。典型的には長期投与は、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１年、少なくとも２年以上維持される。
【００３６】
本明細書において使用されている表現「急性投与」は、患者に、化合物の単回投与または数回投与を、時間を減少して、例えば、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間若しくは２４時間または２日間、３日間または４日間実施する投与方法に関する。
【００３７】
当業者には、活性化合物の治療に有効な量および／または製剤を、投与の種類に応じて実施することが理解されるであろう。ここで使用される「治療に有効な量」は、代謝障害と関連する症状を完全または部分的に軽減するか、症状の進行または悪化を防止するか、疾患を患うリスクがある被験者において疾患の発症を防止するのを可能にする化合物の量である。
【００３８】
本発明による化合物の長期投与が望ましい場合には、例えば、ＵＳ５６７２６５９、ＵＳ５５９５７６０、ＵＳ５８２１２２１、ＵＳ５９１６８８３およびＷＯ９９３８５３６に開示されているような除放性組成物で投与することができる。このタイプの投与とは関係なく、急性投与が望ましい場合には即時放出での治療が好ましい。投与の種類とは無関係に、用量および間隔は、治療効果を維持するのに十分な化合物の血漿レベルとするために個々に調節できる。当業者は、過度の実験をおこなうことなく、治療に有効な局所用量を最適化することができる。
【００３９】
本発明による化合物の投与は、本発明の別の態様を構成する医薬組成物における製剤化を必要とする。本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、治療に有効な量の活性剤と薬学的に許容しうる担体を含む。用語「薬学的に許容しうる」は、動物および特にヒトにおける使用のために、連邦政府若しくは州の監督官庁により、または米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方を含めて承認されたことを意味する。用語「担体」は、治療化合物を投与する希釈剤、共アジュバント、賦形剤またはビヒクルに関する。前記医薬担体は、滅菌液、例えば、水および油、石油、動物または植物起源または合成油、例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油などを含む。好適な医薬賦形剤には、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、スキムミルク粉、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望ならば、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、連続放出製剤などの形態をとってもよい。組成物は、結合剤および従来の担体、例えば、トリグリセリドを用いて坐剤として製剤化してもよい。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬型マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムを含むことができる。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００４０】
組成物は、ヒトに対して静脈、皮下または筋肉内投与するための医薬組成物として通常の手順に準じて製剤化できる。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および局部麻酔、例えば、注射部位での痛みを軽減するためのリドカインを含んでいてもよい。組成物を浸潤により投与しようとするとき、薬学的品質の水または食塩水を含む浸潤ボトルで調剤することができる。組成物を注射投与するとき、水バイアルを注射液または無菌食塩水用として用意し、投与前に成分を混合できる。
【００４１】
代謝障害の治療に有効である化合物を誘起するＣＴ−１活性の量は、本明細書に記載の標準的な臨床法により求めることができる。さらに、生体外試験は、最適な用量範囲を確認しやすくするのに必要に応じて使用することもできる。製剤に使用するための正確な用量は、投与経路および重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に応じて決定する必要がある。しかしながら、静脈内投与に好適な用量範囲は、一般的に体重１キログラム当たり活性化合物５０〜５０００マイクログラムである。鼻内投与に好適な用量範囲は、一般的に概略０．０１ｐｇ／ｋｇ（体重）〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）である。有効用量は、生体外アッセイシステムまたは動物におけるモデルから得られた用量に対する一対の応答曲線から推定することができる。
【００４２】
全身投与について、治療に有効な用量は、生体外アッセイから最初に推定できる。例えば、用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において求めたＩＣ５０を含む血中濃度範囲を得ることにより公式化できる。前記情報を使用して、ヒトに有用な用量を正確に求めることができる。また、初期用量も、当該技術分野において周知の手法を用いて、生体内データ、例えば、動物モデルから推定することもできる。当業者は動物におけるデータに基づき、ヒトに対する投与を容易に最適化できる。
【００４３】
同様に、本発明は、ＣＴ−１活性を誘起することができる化学物質と、食欲減退効果を有するか、または肥満防止効果を有する、生体における栄養の入手を減少することができる１つまたは数種の化合物とを併用することを想定している。したがって、本発明による代謝障害治療法は、ＣＴ−１活性を誘起する能力を有する化合物を、アミリン、アミリンアゴニスト、サケカルシトニン、コレシストキニン若しくはそのアゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）、エクセンジン若しくはエクセンジン類似体、ＧＬＰ１若しくはそのアゴニスト、ポリペプチド（ＰＹＹ）若しくはそのアゴニスト、神経伝達物質またはニューロンイオンチャンネルに影響する化学物質、例えば、抗抑鬱剤、ノルアドレナリン補足抑制剤、セロトニン２ｃ受容体アゴニスト、一部のドーパミン作動アンタゴニスト、キャナビノイド１受容体アゴニスト類似体、レプチンを含むＣＮＳにおけるレプチン／インスリンの経路を調節する化学物質、レプチン輸送のプロモーター若しくはレプチン受容体のプロモーター、ＣＮＴＦ、神経ペプチドＹ、アグチ関連ペプチドのアンタゴニスト、プロオピオメラノコルチン、コカイン、アンフェタミン、アルファメラニン細胞刺激ホルモン、メラノコルチン−４受容体アゴニスト、タンパク質チロシンホスフェート１ベータ阻害剤としてインスリン活性／代謝に影響する化学物質、ペルオキシソーム７増殖剤により活性化される受容体のアンタゴニスト、ブロモクリプチン、ソマトスタチンアゴニスト、安静時の新陳代謝率を増加する化学物質（アンカップリングタンパク質のアゴニスト、甲状腺ホルモン受容体のアゴニスト）およびメラニンなどの異なる種類の他の化学物質、フィトステロールの類似体、機能油、脂肪酸合成阻害剤、カルボキシペプチダーゼ、腸リパーゼ阻害薬などからなる群から選択される１つまたは数種の化合物と同時、順次または別個に投与することを想定している。
【００４４】
本発明による組成物
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＴ−１とインスリンの同時投与は、各成分を別個に投与することにより観察されるよりも高い、１型糖尿病のモデルおよび筋肉によるグルコース補足に対する低血糖効果を有することを見出した。したがって、図７は、どのようにＣＴ−１とインスリンとの組み合わせで、ストレプトゾトシンでのベータ膵臓細胞の実験的破壊を受けたマウスの処置が、成分の各々を別個に投与した後に観察されるよりも高い低血糖効果を生じるかを示す。さらに、図８は、どのようにＣＴ−１とインスリンの組み合わせが、化合物を別個に投与したときに観察されるよりも高い筋肉によるグルコース補足の増加を生じるかを示す。
【００４５】
したがって、別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン活性を誘起する化合物と抗糖尿病化合物を一緒または別個に含んでなる組成物（以下、本発明の組成物）に関する。
【００４６】
「カルジオトロフィン活性を誘起する化合物」との表現は、代謝障害の治療法に関連して上記した通りであり、本発明の第一の方法におけるように、化合物が：
（ｉ）カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、
（ｉｉ）ＣＴ−１の機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にカルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞からなる群から選択されるものである。ここで、種々の化合物は上記で詳細に述べたとおりである。
【００４７】
本発明に用いられる表現「抗糖尿病化合物」は、その作用機構とは無関係に、高血糖を含む糖尿病の症状を少なくとも部分的に補償することができる化学物質である。好ましい態様によれば、抗糖尿病化合物は、インスリン活性を誘起する化合物、またはインスリンの低血糖活性を誘起する化合物、またはインスリン活性に対する感作物質である。
【００４８】
インスリン活性を誘起することができる抗糖尿病化合物は、
（ｉ）インスリン、
（ｉｉ）インスリンの機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）インスリンをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にインスリンまたはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞
などがあるが、これらには限定されない。
【００４９】
本発明において用いられる用語「インスリン」は、いずれかの種（霊長類、齧歯動物類またはウサギ）、好ましくはヒト由来のインスリンおよびより好ましくは天然配列（自然由来のインスリンと同じアミノ酸配列のポリペプチドを含んでなる）のインスリンに関する。自然配列の前記インスリンポリペプチドは、自然から単離できるか、または組み換えおよび／または合成培地により産生される。用語「天然配列インスリン」は、具体的には自然に生じる、切断または分泌形態および対立遺伝子変異体を網羅する。本発明の態様によれば、天然配列ヒトインスリンは、成熟天然配列インスリンまたは完全長型（ヒトプレプロインスリン（アクセス番号Ｐ０１３０８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデーターベース、バージョン１２６、２００９年１月２０日）の配列のアミノ酸９０〜１１０に対応するアルファまたはＡ鎖、およびアミノ酸２５〜５４（アクセス番号Ｐ０１３０８、ＮＣＢＩデーターベース、バージョン１２６、２００９年１月２０日）に対応するベータまたはＢ鎖）である。
【００５０】
本発明において用いられる「インスリンの機能的に同等の変異体」は、インスリン配列に対する少なくとも１つのアミノ酸の除去、挿入または修正から生じ、且つ由来するインスリンと実質的に同じ性質を維持する全てのポリペプチドである。インスリン活性は、血清中の正常血糖クランピングまたは血清中のグリコシル化タンパク質の測定などの当業者に広く知られている方法により測定できる（Ｂｕｎｎ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８１、３０：６１３−６１７）。
【００５１】
インスリンの機能的に同等の変異体には、デス−ペンタペプチド（Ｂ２６−Ｂ３０）−ＰｈｅＢ２５−α−カルボキサミド］インスリン、ＡｓｐＢ１０インスリン（ＵＳ４９９２４１７に開示されている）、ＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９インスリンＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９およびその６量体変異体（ＵＳ５４７４９７８およびＵＳ５５１４６４６に開示されている）、インスリンおよびプロタミンの製剤（ＵＳ５６５０４８６）、アシル化ＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９インスリン（ＵＳ５９２２６７５）、並びにＵＳ５９５２２９７、ＵＳ６０３４０５４およびＵＳ６２１１１４４に開示されているものなどの安定化インスリンの組成物、インスリンの超活性類似体、単量体インスリン、肝臓特異的インスリン、インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））、インスリンリスプロプロタミンで製剤化したインスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）５０／５０（商標）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）７５／２５（商標）として市販されている）、ＮＰＨインスリンまたはインスリンイソファンヒト（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）で市販されている）、レギュラーインスリン、レギュラーインスリンと併用したＮＰＨインスリン（ＵＳ５５４７９２９）、インスリン亜鉛、インスリングラルギン、グルリシン（ＡＰｉｄｒａ）、インスリンアスパルト（Ｎｏｖｏｍｉｘ）、インスリンデテミル（ｌｅｖｅｍｉｒ）、生物相、ＬＰ−１００、ノバラピッド、インスリン亜鉛懸濁液（遅および超遅）、ＧＬＰ−Ｉ（１−３６）アミド、ＧＬＰ−Ｉ（７３−７）（ＵＳ５６１４４９２に開示されているインスリンオトロピン）、ＬＹ−３１５９０２（Ｌｉｌｌｙ）、ＧＬＰ−Ｉ（７−３６）−ＮＨ２）、ＡＬ−４０１（自己免疫）、ＵＳ４５７９７３０、ＵＳ４８４９４０５、ＵＳ４９６３５２６、ＵＳ５６４２８６８、ＵＳ５７６３３９６、ＵＳ５８２４６３８、ＵＳ５８４３８６６、ＵＳ６１５３６３２、ＵＳ６１９１１０５およびＷＯ８５／０５０２９に開示されているものなどの組成物などがあるが、これらには限定されない。
【００５２】
さらに、インスリンの機能的に同等の変異体には、（ａ）高脂肪食Ａ鎖の残基１〜２１と高脂肪食Ｂ鎖の残基１〜３０との組み合わせ、または（ｂ）前記配列に特異的に由来する別の断片のアミノ酸の配列とのアミノ酸配列同一度が少なくとも約８０％であるポリペプチドなどがある。さらに、システイン残基Ａ６〜Ａｌ１、Ａ７〜Ｂ７およびＡ２０〜Ｂ１９間ジスルフィド結合により維持されるインスリンの二次構造は、活性に必要であると思われ、そのため、好ましくは機能的に同等の変異体はできるだけ前記二次構造を保存する。
【００５３】
インスリンの機能的に同等の変異体には、例えば、インスリンのＡおよびＢ鎖のＮ末端および／またはＣ末端で、または内部ドメインの１つ以上内で、１つ以上のアミノ酸残基が付加または欠失されたポリペプチドなどが含まれる。通常、インスリンのポリペプチド変異体は、アミノ酸配列と、高脂肪食のＡ鎖の残基１〜２１と高脂肪食のＢ鎖の残基１〜３０との組み合わせにより形成される配列または前記アミノ酸配列から特異的に由来の別の断片とのアミノ酸概略同一度は、少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ポリペプチド変異体の配列長さは、Ａ鎖の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４残基または３５およびＢ鎖の少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、２７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０残基である。
【００５４】
インスリンをコードするポリヌクレオチドには、ヒトインスリン、その前駆体（プレプロインスリンおよびプロインスリン）をコードするポリヌクレオチドと、他の種のオルソログをコードするポリヌクレオチドなどがある。
【００５５】
「インスリンの機能的に同等の変異体をコードするポリヌクレオチド」は、（ａ）上記で定義した活性インスリンのポリペプチドをコードし、（ａ）上記で定義した高脂肪食のＡ鎖の残基１〜２１と上記で定義したヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖の残基１〜３０との組み合わせ、または（ｂ）前記配列とアミノ酸配列同一度が少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を示す上記したアミノ酸配列に特異的に由来する別の断片をコードする核酸の１つをコードする核酸配列との核酸配列同一度が少なくとも約８０％である核酸を示す。インスリンの変異体をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも約４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、８１、８７、１０５ヌクレオチドのインスリンのＡ鎖をコードする核酸および／または少なくとも約７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５または１５０ヌクレオチドのインスリンのＢ鎖をコードする核酸を含む。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、単離された形態であるか、ベクターの一部分である。インスリンまたはその機能的に同等の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に好適なベクターは、ＣＴ−１により構成される組成物との関係で上記したものと実質的に同じである。
【００５７】
あるいは、本発明に関連して使用することができる抗糖尿病化合物は、インスリンの抗血糖活性を有する化合物またはインスリン活性に対する感作物質を含み、インスリンの分泌促進剤、例えば、スルホニル尿素（トルブタミド、クロルプロパミド、グリピシド、グリベンクラミド、グリカジド、グリペンチド、グリメピリド、グリベンクラミド、グリピジド、グリキドン、グリセンチド、グリメピリド等）およびメチグリニド（レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド等）、肝臓グルコース産生の還元剤（ビグアニドおよび特にメトホルミンおよびブホルミン）、炭水化物減少を生じる化学物質、例えば、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトールまたはボグリボース）、グルコースの末梢使用を増加する化学物質、例えば、チアゾリジンジオン（ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等）、ＧＬＰ−若しくはＧＬＰ−１模倣剤（Ｂｙｅｔｔａ−Ｅｘａｎａｔｉｄｅ、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｎｉｄｅ、ＣＪＣ−１１３１（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ、Ｅｘａｎａｔｉｄｅ−ＬＡＲ（アミリン）、ＢＩＭ−５１０７７、ＺＰ−１０、ＷＯ００／０７６１７に記載されている化合物等））、エクゼンジン、セクレチン、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（シタグリプチン、サクサグリプチン、デナグリプチン、ビルダグリプチン、ＡＬＳ−２−０４２６、ＡＲＩ−２２４３、ＢＩ−Ａ、ＢＩ−Ｂ、ＳＹＲ−３２２、ＭＰ−５１３、ＤＰ−８９３、ＲＯ−０７３０６９９等）、ＳＧＬＴ−２阻害剤（ダパグリフロジンおよびセリグリフロジン、ＡＶＥ２２６８、Ｔ−１０９５等）、並びにグルコース産生の増加を生じるペプチド（アミリンチド、プラムリンチド、エキセンディン）、ＧＬＰ−１活性を有する化合物（グルカゴン様ペプチド１）、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂの阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、インスリンの分泌促進物質；脂肪酸酸化阻害剤、Ａ２アンタゴニスト、ｃ−ｊｕｎターミナルキナーゼ阻害剤、インスリン；インスリン模倣剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＶＰＡＣ２受容体アゴニスト、グルコキナーゼ阻害剤等）などがあるが、これらには限定されない。
【００５８】
本発明による組成物は、低血糖効果および筋肉によるグルコース補足を増加する能力を前提として、代謝障害の治療に使用できる（実施例２）。この組成物は、別の化合物の製剤と、同時、別個または順次投与に使用できる。したがって、別の態様によれば、本発明は、組成物が同時、別個または順次投与される代謝障害の治療のための、本発明による組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、組成物が同時、別個または順次投与される代謝障害の治療用薬物の調製のための、本発明による組成物の使用に関する。別の態様によれば、本発明は、本発明による組成物の同時、別個または順次投与を含んでなる、代謝障害の治療方法に関する。
【００５９】
本発明による組成物の治療剤、特にＣＴ−１活性誘導剤および抗糖尿病剤は、単一製剤（例えば、成分の各々の一定量を含んでなる錠剤またはカプセルとして）提供してもよく、また別個の製剤として提供して、後で組み合わせて同時、順次または別個投与してもよい。また、本発明による組成物は、成分を別個に製剤化するが、同じ容器にパッケージ化する、キットオブパート（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）としての製剤を含む。当業者は、本発明による組成物の第一および第二成分の剤形は同様でよく、換言すれば、同様に製剤化でき（錠剤または丸薬）、同じ経路で投与することができることを理解できるであろう。本発明の異なる成分を別個に製剤化する場合には、２つの成分はブリスターで提供できる。各ブリスターは、その日の間に消費しなければならない。もし薬物を１日に数回投与しなければならない場合には、各投与に対応する薬物をブリスターの異なる部分に配置することができ、好ましくは投与しなければならない日の時間をブリスターの各部分に記録する。あるいは、本発明による組成物の成分は、異なる成分が異なって投与されるように、異なって製剤化できる。したがって、第一成分は経口投与用錠剤またはカプセルとして製剤化され、第二成分は静脈投与用に製剤化されることができる。
【００６０】
本発明による組成物は、静脈内、経口、鼻内、非経口、局所的、経皮、直腸などの当業者に公知の方法により投与されるが、これらには限定されない。
【００６１】
本発明による組成物の一部分である成分間の比は、各特定の場合に使用されるＣＴ−１活性誘導剤および抗糖尿病剤、さらには所望の適用に依存する。したがって、本発明によれば、２つの成分の量の間の比が５０：１〜１：５０、特に２０：１〜１：２０、１：１０〜１０：１または５：１〜１：５であることができる組成物を想定できる。
【００６２】
本発明の組成物で治療できる代謝障害には、本発明の第一の態様（ＣＴ−１の治療および美容用途）に関連して上記したような肥満、インスリン抵抗性、高血糖、異脂肪血症および２型糖尿病などがあるが、これらには限定されない。別の態様によれば、本発明は、純粋に美容的な理由での抗肥満治療の候補患者が本発明の第一態様に記載されたようにして確認される（ＣＴ−１の治療および美容用途）、本発明の組成物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療のための美容的方法に関する。
【００６３】
本発明は、以下の実施例により説明するが、これらの実施例は単に説明の目的のみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１
体重に対するＣＴ−１の効果
３カ月の高脂肪食（ＨＦＤ、６０％脂肪）の摂取により、肥満マウスを得た。ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を連続６日間静脈内投与したところ、高脂肪食（ＨＦＤ）のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢：５カ月）の体重が減少した（図１）。この実験で使用される用量は、発熱反応を生じなかった（直腸温度を処置の全ての日で測定した）。
【００６５】
（図１に記載したＨＦＤを与え）上記した用量０．２ｍｇ／ｋｇ／日で６日間連続してｒＣＴ−１で処置した肥満マウスにおいて観察された体重の減少は、このサイトカインの食欲減退効果によるものである（図２）。図は、ｒＣＴ−１で処置した群および生理学的血清（Ｓ）で静脈内処置した対応の対照群の処置の６日間に摂取したキロカロリーを示す。
【００６６】
同様に、ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を６日間連続して静脈内投与したところ、普通食（ＮＣＤ）を与えた非肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（月齢：５カ月）において体重が減少した（図３）。この実験で使用した用量は、発熱反応を生じなかった（直腸温度を処置の全ての日で測定した）。
【００６７】
上記用量で且つ上記で述べたｒＣＴ−１で処置した間に観察された体重の減少が食欲減退効果によるものなのか、または他の効果が関与しているのかを測定する目的で、月齢４カ月のＣ５７ＢＬ／６マウス３群を用いて実験を行った。第一群（生理食塩水群）には、生理学的血清を静脈内投与（ｒＣＴ−１の投与に使用したのと同じ容積）し；第二群（ｒＣＴ−１群）には、上記した用量（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）でｒＣＴ−１を静脈内投与し、第三群（Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群）には、ｒＣＴ−１処置したマウスにより摂取されたのと同じ量の食物を毎日与えるとともに、血清を同じ実験期間の間注射した。図４から明らかなように、ｒＣＴ−１で処置したマウスは、エネルギー摂取が両方の群で同一であるにもかかわらず、Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群よりも体重減少が大きかった。このことは、上記で観察された食欲減退効果の他に、ｒＣＴ−１は体重減少に関与する他の代謝効果を有することを示している。
【００６８】
実施例２
ＣＴ−１の低血糖効果
ｒＣＴ−１（１０μｇ）のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢３カ月）への急性静脈内投与（１回投与）がベースライン血糖レベルを減少させるかどうか判定する目的で、ｒＣＴ−１および生理食塩水血清で処置後１時間後に、血中グルコースレベルを測定した。図５Ａから明らかなように、ｒＣＴ−１は、血糖レベルを顕著に減少させた。ＣＴ−１または生理食塩水で処置した動物のインスリンレベルにおいて顕著な差が観測されないので、血糖が減少した機構は血中インスリンレベルの増加に起因するとすることはできない（図５Ｂに示すように）。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。ｒＣＴ−１での処置は、筋肉におけるＡＫＴのリン酸化を誘起する。これは、このサイトカインの低血糖作用を説明するのに役立つ（図５Ｃは、代表的なウエスタンを示す）。
【００６９】
ｒＣＴ−１（１０μｇ）を急性単回投与すると、高糖食後の血中グルコースの増加が防止される。ｒＣＴ−１の食後の血糖に対する効果を検討するためのこの実験は、Ｆｒｕｅｂｉｓ等（Ｆｒｕｅｂｉｓ等、２００１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．、９８：２００５−２０１０）により公開されたものに準じて、胃への強制投与（体重の１％容積で）による高糖食を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢３カ月）に投与することでおこなった。強制投与後、同じ容積の生理食塩水血清を静脈内投与した（生理食塩水）またはｒＣＴ−１（１０μｇ）。血液はグラフに示した時間で採取し、血糖を測定したところ、ｒＣＴ−１で処置した動物では血糖の増加は生じなかった（図６）。
【００７０】
次に、ｒＣＴ−１を単回急性投与でのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢３カ月）における血糖レベルの減少が、ストレプトゾトシンでの処置をおこなったベータ−膵臓細胞の破壊に続発する高血糖を減少させるかどうか判定した。したがって、ストレプトゾトシンを単回投与（２００ｍｇ／ｋｇ）してから６４時間後、ベースライン血糖を測定し、マウスの３群に対して種々の処置を実施した。第一群（生理食塩水群）を、生理食塩水血清で処置した。第二群（インスリン群）を、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇで処置した。第三群（ｒＣＴ−１群）を、ｒＣＴ−１１０μｇで処置した。第四群（インスリン群＋ｒＣＴ−１）を、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇおよびｒＣＴ−１１０μｇで処置した。種々の処置を実施してから、１５分、３０分、６０分および１２０分後に血糖を測定した。図７から明らかなように、ｒＣＴ−１は、投与後３０分後の血糖を顕著に減少し、分析した全ての血液抽出点においてインスリンの効果を高めた。
【００７１】
ｒＣＴ−１での急性処置から生じる低血糖効果が筋肉によるグルコース捕捉の増加によるものかどうかを判定するために、１８ＦＤＧ（１８ＦｌｕｏｒｏＤｅｏｘｙグルコース）の筋肉捕捉を、種々のマウス群におけるガンマカウンターにより測定した。この実験をおこなうために、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢３カ月）を、以下のように４群にわけた：生理食塩水群（生理食塩水血清で処置）；インスリン群（インスリン０．７５Ｕ／ｋｇで処置）、ｒＣＴ−１群（ｒＣＴ−１１０μｇで処置）およびインスリン群＋ｒＣＴ−１（インスリン０．７５Ｕ／ｋｇ＋ｒＣＴ−１１０μｇで処置）。種々の処置投与の１５分後、１８ＦＤＧを投与し、注射１０分後、腓腹筋を取り出し、放出された放射活性を、ガンマカウンターにより定量化した。結果（図８）は、ｒＣＴ−１は筋肉によるグルコース消費を増加および増進するであろう（しかし、インスリンで観察されるものほど著しくはない）ことを示している。
【００７２】
次に、ｒＣＴ−１での長期処置の低血糖および低インスリン血症効果を、３カ月間高脂肪食（ＨＦＤ、６０％脂肪）の摂取により誘起した肥満のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢５カ月）で測定した。食事処置の終わりに、マウスを、６日間連続（長期処置）で、ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を静脈内投与することで処置した。図９に示すように、血糖レベル（上パネル）とインスリン血症レベル（下パネル）はｒＣＴ−１での処置のため顕著に減少した。
【００７３】
次に、ｒＣＴ−１での長期処置の低血糖および低インスリン血症効果を、対応するＰａｉｒ−ｆｅｄ（ＰＦ）群と比較した。ｒＣＴ−１群には、上記した用量（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）で６日間、静脈内経路によりｒＣＴ−１を与えた。Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群には、ｒＣＴ−１で処置したマウスにより摂取したのと同じ量の毎日の食物を与え、血清を同じ実験期間にそれらに注射した。図１０に示すように、血糖のより大きな低下（上パネル）が、ｒＣＴ−１で長期処置した動物において、同様のカロリー制限したものに対してみられた。このことは、低血糖効果は、ｒＣＴ−１により誘起された食欲減退効果によるだけではなく、タンパク質自体の低血糖性によるものと思われる。
【００７４】
次に、ｒＣＴ−１（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）での生体外処置が、腸管リングにおける糖の輸送を阻害できるかどうかを判定した。したがって、グルコースの腸輸送を、３７℃でのｒＣＴ−１の不存在下または存在下で１５分間のインキュベーションに関して、反転空腸管リングによるα−メチルグルコシド（１ｍＭ）の捕捉を測定することにより判定した。α−メチルグルコシドは、ＳＧＬＴ１ナトリウム−糖コトランスキャリアによる腸細胞の頂端膜を横断するグルコースの類似物質である。このことは、輸送の変化は、前記トランスキャリアの活性の変化に起因するにちがいないことを意味する。図１１は、観察される効果は用量依存ではないが、ＣＴ−１は、腸におけるグルコースの吸収を阻害することができることを示している。
【００７５】
腸管リングにおけるα−メチルグルコシド（１ｍＭ）の捕捉に対するＣＴ−１およびＣＮＴＦの作用を測定した。図１１に示す実験方法に準じて測定したところ、グルコースの腸輸送に対するＣＴ−１の阻害作用は、ＣＮＴＦ（試験した実験条件において顕著な効果が得られなかった）よりも大きいことが判明した。
【００７６】
次に、グルコースの腸捕捉に対するＣＴ−１の生体外効果が生体内で再現できるかどうかを判定した。これのために、ｒＣＴ−１（１０μｇ）を、静脈内に急性的にＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢２カ月）に投与した。ＣＴ−１の投与は、α−メチルグルグルコシド（１ｍＭ）の腸輸送における阻害を生じた（図１３）。腸管リングの単離と、それによるα−メチルグルグルコシド（１ｍＭ）の輸送は、ＣＴ−１の投与３時間後におこなった。得られた結果は、ＣＴ−１の、動物に全身投与するときにグルコースの腸輸送を阻害する能力を示し、ｒＣＴ−１が腸グルコースの輸送を阻害する能力を示した生体外においておこなった上記の実験結果を補強するものである。
【００７７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（月齢５カ月）への６日間連続（長期処置）のｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）の静脈内投与が、生理食塩水血清で処置したマウスからのものと比較して腸環におけるα−メチルグルコシド（１ｍＭ）の腸捕捉を阻害することができたかどうかを次に判定した。結果は図１４に示されるとおりであり、図１４から、どのようにｒＣＴ−１が腸グルコース輸送を阻害することができるかが分かる（生体内長期処置）。
【００７８】
次に、ＣＡＣＯ−２のヒト細胞株の細胞によって、α−メチルグルコシド（０．１ｍＭ）の捕捉について、ｒＣＴ−１の効果を判定した。結果（図１５）から明らかなように、ｒＣＴ−１での処置は、ヒト腸細胞として機能的に挙動するＣＡＣＯ−２ヒト細胞株におけるa−メチルグルコシド（０．１ｍＭ）の捕捉の濃度依存阻害を生じる。ＣＴ−１での処置を、１時間（図１５Ａ）および２４時間（図１５Ｂ）、頂縁からおこなったところ、検討した２つのプレインキュベーション時間における用量２０ｎｇ／ｍｌで顕著な差が観察された。結果は、１群当たり４２〜４４測定の平均±ＳＥで表されている。
【００７９】
実施例３
ＣＴ−１とＣＮＴＦとの効果の差
図１６は、脂肪細胞によるレプチン分泌を調節するｒＣＴ−１およびＣＮＴＦの能力を測定するために、ラット脂肪細胞の一次培養において実施された実験の結果を示す。図１６Ａは、ｒＣＴ−１（７２時間）での処置が、どのようにレプチンのベースライン分泌とインスリン（１．６ｎＭ）により刺激されたものとの両方を阻害するかを示す。しかしながら、これらの効果は、ＣＮＴＦの同様な濃度では観察されなかった（図１６Ｂ）。
【００８０】
図１７は、ＣＴ−１およびＣＮＴＦの、インスリンの不存在下または存在下での脂肪分解を調節する能力を判定するために、ラット脂肪細胞の一次培養において実施された実験の結果を示す。この図は、ＣＴ−１がグリセロール（脂肪分解測定）の放出を誘起し、またインスリンの抗脂肪分解活性を阻害するが、ＣＮＴＦはそれができないことを示している。これらのデータは、ＣＴ−１が脂肪を集めることができ、上記した筋肉におけるベータ酸化が増加することの他に、このサイトカインが脂肪の堆積を減少させる能力があることを示している。
【００８１】
加えて、そして重要なことには、ＣＴ−１は、脂肪細胞（脱ヨード酵素ヨードチロニン、Ｄｉｏ−２およびアンカップリングタンパク質−１、ＵＣＰ−１）における褐色脂肪組織（ＩＩ型）の典型的な遺伝子を誘起することができるが、ＣＮＴＦはできなかった（図１８）。いくつかの研究から、白色脂肪組織において褐色脂肪組織に特有の遺伝子を誘起させることを目的とする療法は、肥満関連障害の改善に効果的であろうということが明らかになっている（Ｆａｒｍｅｒ Ｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００８；２２：１２６９−７）。
【００８２】
実施例４
ＣＴ−１の長期投与は炎症を生じない
長期投与後の炎症を生じさせるＣＴ−１の能力を判定するために、高脂肪食（ＨＦＤ、６０％脂肪）を３カ月間摂取することにより誘起した肥満のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢５カ月）におけるＩＬ−６の血清レベルを測定した。食事処置の終わりに、マウスを、６日間連続して（長期処置）、ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を静脈内投与して処置した。結果（図１９）は、使用された用量での長期処置では、炎症の兆候がなかったことを示している（肝臓および筋肉などの器官において組織学的に確認されたデータ）。
【００８３】
さらに、肝臓の組織学的切断を、炎症の症状の出現を顕微鏡検査により検出するためにおこなった。結果（図２０）は、３群のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢４カ月）における肝臓（Ｈ＆Ｅ１００Ｘ）の組織学的切断の代表であるイメージを示す：対照群：静脈内経路により生理学的血清（ｒＣＴ−１の投与に使用されたものと同じ容積）が与えられた；ｒＣＴ−１群：６日間連続して、上記した用量（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）で、静脈内経路によりｒＣＴ−１が与えられた；Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群：ｒＣＴ−１で処置したマウスが摂取するのと同じ量の食物を毎日与え、同じ実験期間中に、血清を注射した。図から明らかなように、３群のどれにも、炎症性浸潤物の存在が観察されず、また顕著な形態学的変化もなかった。
【００８４】
実施例５
脂質代謝に対するＣＴ−１の効果
脂質代謝に対するＣＴ−１の可能性のある役割を判定する目的で、種々の血清脂質のレベルを、ｒＣＴ−１を６日間長期投与した後の３カ月間、高脂肪食誘起肥満のマウスで測定した。結果は表１に示されるとおりであった。
【００８５】
【表１】
【００８６】
さらに、脂肪酸およびトリグリセリドの血清レベルを、高脂肪食後の野生マウスで測定した。このために、２群の動物を使用し（ｎ＝５）、実験前の３時間の間は絶食状態とした。次に、両方の群の動物に、強制経口投与（体重の１％）により高脂肪食を投与し、血液試料を得て、ベースラインレベルを測定した。食後すぐに、静脈経路により、血清（黒三角）またはｒＣＴ−１（１０μｇ／ｍｌ）（白三角）を投与した。結果（図２１）は、どのようにｒＣＴ−１での処置が遊離脂肪酸レベル（２〜５時間後、＊Ｐ＜０．０５）（上パネル）およびトリグリセリドレベル（１〜３時間後、＊Ｐ＜０．０５）（下パネル）における顕著な減少を生じるかを示す。
【００８７】
次に、ｒＣＴ−１での処置が脂質内注射後の血清における遊離脂肪酸の除去を加速したかどうかを調べた。このために、ｒＣＴ−１を、脂質内投与の３０分間後に２群の動物（ｎ＝５）に静脈内投与した。対照動物には、生理食塩水を与えた。血清中の遊離脂肪酸の濃度を、５分後に測定した。次に、異なる時間での遊離脂肪酸の除去値を、脂質内（１００％）注射の５分後に、ＦＦＡ値に関して標準化した。図２２に示すように、ＦＦＡの無為動力学は、生理食塩水で処置したマウスとＣＴ−１で処置したマウスでは大きく異なった（ボンフェローニ解析事後の二元ＡＮＯＶＡによりＰ＜０．０５）。
【００８８】
ベータ酸化に対するｒＣＴ−１の可能性のある効果を判定するために、生理食塩水またはＣＴ−１（１０μｇ、１時間）で処置したマウスから単離した腓腹筋におけるパルミテートの酸化を測定した。結果（図２３）は、ｒＣＴ−１での急性処置が骨格筋における脂肪酸の酸化を増加することを示している。さらに、筋肉における脂肪酸の酸化に関与する遺伝子の発現レベルを、ｒＣＴ−１での急性処置（３時間）に応答したＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果（図２４）は、ｒＣＴ−１は、ＰＧＣ−１ｂ、ＣＰＴ−１、ＡＣＤ、ＡＣＯおよびＭＣＤＡ遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加を生じることを示している。転写物の各々を検出するのに必要なサイクル数を、内部対照としてのシクロフィリンに対応する数と比較し、それを生理食塩水で処置した動物における値（１．０）と比較した任意単位で表している（ｎ＝５〜６、＊Ｐ＜０．０５）。
【００８９】
実施例６
骨格筋におけるインスリン作用に対するＣＴ−１の増強効果
骨格筋は、インスリン作用に対して最も感受性のある組織であり、健康な個体では、インスリンにより刺激されたグルコース摂取が９０％である。本発明者等は、ＣＴ−１が筋肉（「生体外」および「生体内」）におけるインスリン情報伝達を高めることを示した。
【００９０】
インビボ試験は、ｒＣＴ−１での急性（１時間）または長期（２４時間）処置後のラット筋管（筋管へ分化したＬ６Ｅ９筋芽細胞）におけるインスリン誘起２−デオキシグルコース摂取およびＡＫＴリン酸化を測定することにより実施した。ＣＴ−１は、インスリン誘起２−デオキシグルコース摂取（図２５）およびインスリン誘起ＡＫＴリン酸化（図２６）を刺激することが観察された。これらのデータは、ＣＴ−１は筋肉におけるインスリンの作用を高めることを明らかにしている。これらのデータは同じファミリーＩＬ−６からのサイトカインについて公開されたものとは異なる（Ｎｉｅｔｏ−Ｖａｚｑｕｅｚ、Ｉ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００８、５７：３２１１−３２２１）。
【００９１】
さらに、「生体内」では、インスリン刺激（０．５Ｕ／マウスを下洞静脈に注射した）の３０分前に、ｒＣＴ−１（１０μｇ／マウス）を静脈内投与すると、筋肉におけるインスリン誘起ＡＫＴリン酸化が増加することが判明した（図２７）。さらに、静脈内に０．２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、６日間連続でｒＣＴ−１で長期処置したところ、ＣＴ−１で処置し、生理食塩水を注射した（Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群）、同じ摂取量の動物と比較して筋肉組織におけるインスリンの効果が高まった（図２８）。これらの全てのデータは、骨格筋におけるインスリンの存在下でＣＴ−１には促進的役割があることを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）の肥満および関連する障害：高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病の発生、および異脂肪血症の治療のための使用、並びにその食欲減退機能を利用した、脂肪酸化刺激剤、低血糖、骨格筋レベルに対するインスリンの感作剤、および腸細胞によるグルコースの腸管輸送抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、数多くの先進国において拡大している重大な公衆衛生上の問題である（Ｂｅｌｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂｒａｙ、２００５、Ｊ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄ Ｓｏｃ；１５７：Ｓ４２−４９；ｑｕｉｚ ４９）。我々先進国における食料摂取量の増加、不健康な食生活、座ることの多い生活様式は、肥満の急激な増加に疑いなく影響している（ＳｔｅｉｎおよびＣｏｌｄｉｔｚ等、２００４、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．８９：２５２２−５）。数多くの研究により、肥満およびその代謝異常の罹患率の驚くべき増加は、ベータ細胞のインスリン抵抗性、異脂肪血症および膵臓における最終的な破綻と関連しており、いや応なく２型糖尿病を生じ、この疾患が引き起こす全ての結果をともなう（Ｒａｎａ等、２００７、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ． Ｍｅｔａｂ．、９：２１８−２３２）。
【０００３】
肥満についての現在の治療法には以下のようなものがある：ｉ）ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ、Ｏｒｌｉｓｔａｔ）は、穏やかな体重減少を生じさせる胃腸リパーゼの抑制剤であるが、大腸癌を含む胃腸における副作用という主要な問題を有する。ｉｉ）シブトラミン（Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）は、前述の治療よりも大きな体重減少を生じさせるモノアミン補足抑制剤であるが、血圧の上昇および心拍出量の増加を伴う。ｉｉｉ）最後に、ヨーロッパで承認されている（ＦＤＡによっては承認されていないが）リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）は、内在性カンナビノイド受容体アンタゴニストであるが、鬱病などの情動行動における変化を生じる問題を有するため、市場から撤退した。
【０００４】
インスリン抵抗性について現在の治療法では、一般的にチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）が、他の療法と併用して使用される。これらの薬物の問題は、とりわけインスリンとともに投与したときに、体重が増加することである。このことから、体重の減少の他に、インスリンの作用を増感または増加することのできる薬剤が、これらの病理学に対し非常に興味あるものとされるであろうことが分かる。さらに、腸グルコース抑制などの末梢作用を伴う治療が、肥満および真性糖尿病に対して非常に興味あるものとされるであろう。
【０００５】
１９９４年の終わりのレプチンの発見が、エネルギーバランスを調節する際に脂肪細胞により分泌される因子の研究に新しい展望を切り開いた。このタンパク質は、主に脂肪の量に比例して、脂肪細胞により産生および分泌される。このタンパク質は、筋肉による脂肪の酸化およびグルコース補足を増す末梢作用の他に、食欲調節のための中枢神経系モジュレータとして確認された。しかしながら、まもなく、肥満は高レプチンレベルに関連していること、内因性レプチンは効果的ではなく、そのため、肥満体のヒトおよび齧歯類の大部分は耐レプチン性であり、したがって、この治療手段は、レプチン欠損（低割合の肥満人）により生じる疾患を患う個体に限定されることが判明した。
【０００６】
レプチンは構造的にｇｐ−１３０ファミリーのサイトカインと類似しており、またレプチン受容体（ＬＲｂ）は構造的にｇｐ−１３０Ｒｂｅｔａとして知られているｇｐ１３０サイトカイン受容体と類似していることから、ｇｐ１３０サイトカインファミリーの別のメンバー、特にＣＮＴＦが、肥満者において観察されるレプチン耐性の問題を克服する肥満治療用治療剤としての能力について研究された。
【０００７】
ＣＮＴＦサイトカインは、肥満、インスリン抵抗性および脂肪肝を患うマウスに対して、これらすべてのパラメータを改善するので、可能性ある治療効果を有するものとして知られている（Ｓｌｅｅｍａｎ等、２００３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１４２９７−１４３０２）。ＣＮＴＦの食欲減退能（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＴＷ等、１９９５）、ＡＭＰＫ活性化能を介してインスリン抵抗性を戻すこのサイトカインの能力（Ｗａｔｔ等、２００６、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１２：５４１−５４８）、さらには筋肉によるグルコース補足を刺激するその能力（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ等、２００９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、 Ｅｐｕｂ Ｊａｎｕａｒｙ、０９、２００９）が報告され、これによりこのサイトカインが肥満および関連疾患を治療できる可能性があるものとして提案された（Ａｈｉｍａ等、２００６、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１２：５１１−５１２）。それにもかかわらず、このサイトカインを治療剤として使用することは、高ＣＮＳによりおよび抗ＣＮＴＦ抗体の産生により、また脂肪および筋肉組織におけるＣＮＴＦＲα受容体が低発現であることにより制限されている。体重約１１４キログラムの患者にこのサイトカインを１〜２マイクログラム／ｋｇの用量で８４日間投与した臨床試験では、３〜４ｋｇの減少を導いた。これらの結果は有望であると思われるが、高ＣＮＴＦ用量で患者に吐き気が現れ、ついには抗ＣＮＴＦ抗体が生じて体重が増加した（ＥｔｔｉｎｇｅｒＭ．Ｐ．等、ＪＡＭＡ、２００３、２８９：１８２６−３２）。
【０００８】
したがって、当該技術分野においては、いままで知られているｇｐ１３０系リガンドの欠点を有していない肥満の治療に有用である薬剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
第一の態様によれば、本発明は、代謝障害治療用のカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物、さらには代謝障害治療用薬物の調製のためのカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物の使用に関する。
【００１０】
別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン１活性を誘起する薬学的に活性な量の化合物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法に関する。
【００１１】
別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン活性を誘起する化合物と抗糖尿病化合物とを一緒または別個に含んでなる組成物に関する。引き続く態様によれば、本発明は、前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用の本発明による組成物に関し、さらには、前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用薬物の調製のための、本発明による組成物の使用に関する。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、薬学的に活性な量の本発明による組成物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カルジオトロフィン１は、高脂肪食物由来肥満のマウスの体重を減らす。（Ｓ：血清、ｒＣＴ−１の投与ビヒクル）。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝８匹の動物。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２】ＣＴ−１が介在する高脂肪食物由来肥満のマウスの体重の減少は、少なくとも一部分は、食欲減退効果によるものである。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝８匹の動物。＊ｐ＜０．０５。
【図３】カルジオトロフィン１は、普通の食事（ＮＣＤ）のマウスの体重を減らす。（Ｓ：血清、ｒＣＴ−１の投与ビヒクル）。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】ＣＴ−１が介在する体重減少は、食欲減退効果以外の因子によるものである（結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝６匹の動物。＊ｐ＜０．０５）。ペアフィード（ＰＦ）群は、ＣＴ−１で処置したマウスと同じ日常摂取したマウス群である。
【図５】マウスＣ５７ＢＬ／６（月齢３カ月）にｒＣＴ−１を単回投与（１０μｇ）で急性静脈投与すると、ベースライン血糖レベルが減少する。血糖レベル、インスリンおよびウエスタンブロット（ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）活性が筋肉にみられる）を、ｒＣＴ−１の投与１時間後に測定する。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５）。
【図６】ｒＣＴ−１を単回投与（１０μｇ）で急性投与すると、高糖食後の血中グルコースの増加を防止する。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５）。
【図７】ＣＴ−１は、膵臓破壊（ストレプトゾトシンで）のマウスでの直接低血糖効果を有する。ＣＴ−１単独で投与すると血糖レベルが減少し、インスリンとともに投与すると効果が増大する。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（対生理食塩水群）。ｘ軸は、種々の処置の実施後の経過時間（分）を示す。
【図８】ＣＴ−１の低血糖効果は、少なくとも一部分は、筋肉によるグルコース消費の増加によるものである。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（対生理食塩水群）。
【図９】高脂肪食物由来肥満のマウスにおいて、ｒＣＴ−１による６日間の長期処置後のグルコースおよびインスリンレベル。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝７匹の動物。＊ｐ＜０．０５。
【図１０】１週間のｒＣＴ−１による長期処置後またはカロリー制限（ＰＦ）後のグルコースおよびインスリンレベル。ＰＦ（ペアフィード）群は、ＣＴ−１で処置したマウスと同じ日常摂取したマウスである。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりのｎ＝６匹の動物。
【図１１】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（生体外処置）。結果は、６種のマウスにおいて１２回測定での平均±ＳＥで表されている。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１２】カルジオトロフィン１は、ＣＮＴＦよりも腸のグルコース輸送の抑制効果が大きい（生体外処置）。結果は、６種のマウスにおける２４〜３５回の測定での平均±ＳＥで表されている。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（生体内急性処置）。結果は、３０回測定での平均±ＳＥで表されている。１実験群当たりのｎ＝５匹のマウス。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１４】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（生体内長期処置）。結果は、３０回測定での平均±ＳＥで表されている。１実験群当たりのｎ＝５匹のマウス。＊＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５】カルジオトロフィン１は、腸のグルコース輸送を抑制する（Ｃａｃｏ−２細胞における研究）。結果は、１群当たり４２〜４４回測定での平均±ＳＥで表されている。
【図１６】カルジオトロフィン１は、脂肪細胞（ＣＮＴＦではない）におけるレプチン放出を抑制する（脂肪細胞の一次培養における生体外実験）。結果は、６つの独立した実験について、平均±ＳＥで表されている。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照；ｂｐ＜０．０１；ｃｐ＜０．００１対インスリン。
【図１７】油脂分解に対するＣＴ−１とＣＮＴＦの効果の差。２４時間中のインスリンの有無におけるＣＴ−１またはＣＮＴＦにより産生される一次ラット脂肪細胞におけるグリセロール放出（油脂分解の測定）。ｎ＝４−８；＊Ｐ＜０．０５対対照細胞（１００％）；＃Ｐ＜０．０５対インスリン処置細胞
【図１８】典型的に脂肪細胞へ分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における褐色脂肪組織からの遺伝子導入に対するＣＴ−１とＣＮＴＦの効果の差。細胞を、２４時間中ＣＴ−１またはＣＮＴＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理した（ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５対対照細胞）。遺伝子発現を、定量的ＰＣＲにより測定した。
【図１９】ｒＣＴ−１による６日間の長期処置後のＩＬ−６の血清レベル。
【図２０】血清、ＣＴ−１で処置またはＣＴ−１で処置された動物と同じ食事で処置したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢４カ月）の３群における組織学的肝スライス（Ｈ＆Ｅ１００Ｘ）を表すイメージ。いずれの場合も炎症性浸潤は観察されなかった。
【図２１】ｒＣＴ−１は、高脂肪摂取後の血清およびトリグリセリド（ＴＧ）における遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の濃度の減少を生じる。
【図２２】脂質内注射後の血清ＦＦＡの除去におけるｒＣＴ−１の効果。
【図２３】骨格筋における単離ミトコンドリアでのベータ酸化に対する、ｒＣＴ−１の急性投与の効果。データは、平均±ＳＥで表されている（ｎ＝＊＊＊、＊Ｐ＜０．０５）。
【図２４】定量的ＰＣＲにより測定される脂肪酸の酸化に関与する遺伝子の発現レベルに対するｒＣＴ−１の効果。
【図２５】Ｌ６Ｅ９細胞（筋管へ分化した筋芽細胞）におけるインスリンによるグルコース（２−デオキシグルコース）摂取に対するｒＣＴ−１の効果の増加。ＣＴ−１での急性（１時間）および長期（２４時間）の処置では、インスリンにより誘起されたグルコース摂取が顕著に増加する。＊Ｐ＜０．０５対対照細胞；＃Ｐ＜０．０５対インスリン処置細胞。
【図２６】Ｌ６Ｅ９細胞（筋管へ分化した筋芽細胞）におけるインスリンシグナル伝達に対するｒＣＴ−１の効果の増加。（Ａ）ｒＣＴ−１での急性処置（１５分間）および（Ｂ）ｒＣＴ−１での長期処置（１０時間および２４時間）は、インスリンにより誘起されるＡＫＴリン酸化を高める。
【図２７】筋肉における「生体内」インスリンシグナル伝達に対するｒＣＴ−１（急性処置）の効果の増加。月齢４カ月のＣ５７ＢＬ／６マウスに、洞静脈にインスリン注射する３０分前にｒＣＴ−１（１０μｇ／マウス）を注射した。５分後、腓腹筋を取り出し、均一化した。ＣＴ−１は筋肉においてインスリンにより誘起されるＡＫＴリン酸化を高めることが判明した。デンシトメリー分析（ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２８】筋肉における「生体内」インスリンシグナル伝達に対するｒＣＴ−１（長期処置）の効果の増加。月齢４カ月のＣ５７ＢＬ／６マウスに、６日中ｒＣＴ−１（０、２ｍｇ／ｋｇ／日）を注射した。前の群と同じ日常摂取し、６日中生理食塩水血清を注射したマウス（ペアフィード群）を、対照として使用した。絶食１６時間後、インスリンを動物の洞静脈に注射し、５分後、腓腹筋を取り出し、均一化した。ＣＴ−１は筋肉においてインスリンにより誘起されるＡＫＴリン酸化を高めることが判明した。デンシトメリー分析（ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＣＴ−１の医学的および美容的用途
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＴ−１は普通食のマウスおよび高脂肪食のマウスで体重減少を生じさせることを見出した。この効果は、少なくとも一部分は、ＣＴ−１の食欲減退効果（図２）、並びに高脂肪食後の血漿脂質の増加を下げる（図２０および２１）、高糖食後の血糖を減少させる（図５〜６）、筋肉によるグルコース消費の増加を生じさせる（図８）、および腸により補足されるグルコースを減らす（図１１〜１４）というＣＴ−１の能力によるものである。さらに、本発明者らは、ＣＴ−１が脂肪細胞における基礎分泌およびインスリン刺激レプチン分泌を抑制すること、さらにはグリセロールの放出およびインスリンの抗脂肪分解活性の抑制を誘起できることを明らかにした（図１６および１７）。しかしながら、これらの効果は、ＣＮＴＦを使用するときには観察されない。特定の理論にこだわるものではないが、前記効果がこの分子の筋肉に対する作用（低血糖を生じるグルコース捕捉の刺激）に加わり、脂肪細胞がトリグリセリドとなるのに利用できるグルコースの減少を生じるので、この効果の差異はＣＴ−１の使用の利点となると思われる。
【００１５】
第一の態様によれば、本発明は、代謝障害の治療のためのカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物に関する。さらに、本発明は、代謝障害治療用薬物の調製のための、カルジオトロフィン１活性を誘起する化合物の使用、さらにはＣＴ−１活性を誘起する化合物を被験者に投与することを含んでなる代謝障害の治療方法に関する。
【００１６】
本明細書において使用される用語「カルジオトロフィン１活性を誘起する化合物」は、投与により、既に存在しているＣＴ−１の特異的活性を増加させるか、あるいはカルジオトロフィンと同じ機能を実質的に有するＣＴ−１または類似体の合成の増加によるかを問わず、カルジオトロフィン１活性（ＣＴ−１）の増加を生じる化合物である。したがって、好ましい態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起する化学物質は、ＣＴ−１自体である。「ＣＴ−１」は、ヒトカルジオトロフィンのアイソフォーム１に対応する、アクセス番号ＣＴＦ１＿ＨＵＭＡＮまたはＱ１６６１９（バージョン６２、２００８年１２月１６日）若しくはヒトカルジオトロフィンのアイソフォーム２に対応するアクセス番号Ｑ５Ｕ５Ｙ７（バージョン１、２００９年１月２０日）によるＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに記載の配列により定義されているタンパク質、さらには他の種における相同分子種、例えば、マウス（アクセス番号ＮＰ＿０３１８２１またはＱ６０７５３（バージョン５０、２００８年１２月１６日）およびＮＰ＿９４２１５５またはＰ８３７１４（バージョン４２、２００８年１２月１６日）のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに定義されている配列）、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースで定義されている配列（アクセス番号ＮＰ＿０５８８２５またはＱ６３０８６（バージョン５０、２００８年１１月４日）およびＮＰ＿００１１２９２７２またはＱ６Ｒ２Ｒ３（バージョン３０、２００９年１月２０日）並びにチンパンジー（アクセス番号ＮＰ＿００１００９１１２またはＱ６Ｒ２Ｒ２（バージョン３０、２００８年１１月４日）のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに定義されている配列）により定義されているタンパク質である。
【００１７】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起する化学物質は、ＣＴ−１の機能的に同等な変異体である。本明細書で使用されている表現「ＣＴ−１の機能的に同等の変異体」とは、ＣＴ−１と、生体外および生体内の両方で、ＣＴ−１と関連する本発明に記載の機能の一つ以上を共有し、アミノ酸配列において最少の同一性を有する分子である。したがって、本発明に使用するのに好適なＣＴ−１の変異体は、一つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失によって上記配列から誘導されたものであり、天然対立遺伝子、代替処理から生じる変異体および自然に現れる分泌および切断型を含む。ＣＴ−１の変異体は、好ましくはＣＴ−１と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す。同一性度は、当業者に周知の方法を用いて求める。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．等、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ． ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］、好ましくはデフォルトパラメータを用いて求める。一方、想定されるＣＴ−１の変異体は、ＣＴ−１の機能、例えば、以下の機能（これらには限定されない）、の少なくとも一つを示す：
−普通食を与えられたとき、および高脂肪食で肥満を誘起したときの両方で、マウスにおいて体重減少を生じさせる能力。体重の減少を生じる化合物の能力を測定する方法は、当該技術分野においてにおいて十分に記載されており、本発明の実施例１に記載の方法を含む。高脂肪食が与えられたマウスにおける体重減少を測定する場合において、例えば、脂肪の形態でのキロカロリーの１０％であるＤ１２４５０ＢまたはＬＦＤと称される食事、脂肪の形態でのキロカロリーの４５％であるＤ１２４５１またはＨＦＤと称される食事または脂肪の形態でのキロカロリー６０％であるＤ１２４９２またはＶＨＦＤと称される食事などの当該技術分野において知られている高脂肪食を使用することができる。
−本発明の実施例１に記載の方法またはＷＯ２００７０９３３６３に記載の方法を用いて求めることができる食欲減退効果を誘起する能力。
−ＶＯ２値とＶＣＯ２値との比として定義される呼吸率を減少させる能力。このパラメータは、当該技術分野において知られている方法を用いて求めることができる。
−高脂肪食後の脂質血症の増加を防止する能力（トリグリセリドと遊離脂肪酸の両方に関して）。標準的な方法を使用して、好ましくは市販のキットにより、血漿中の脂肪酸およびトリグリセリドの濃度を測定する。
−直接低血糖能、または高糖食後若しくは膵臓破壊後の低血糖能。これは、市販のグルコース検出キットを使用することにより測定できる。膵臓破壊は、本発明の実施例３に記載のストレプトゾトシンによるか、または炎症誘発性サイトカイン（Ｃｈｏｉ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、１３：４３−５３に記載のＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−ａおよびＩＦＮ−γにより形成されるカクテル）を使用することにより生じさせることができる。
−筋肉により補足されるグルコースの増加を生じさせる能力であって、この活性は、グルコースでマークした類似体を吸収する食筋の能力に基づく本願の実施例３に記載の方法を用いるか、またはＵｅｙａｍａ等（Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ Ｒｅｃｅｐｔ ２０００；９：２６７−２７４）により記載されているような非同位法を用いて測定される。
−脂肪細胞の一次培養、および脂肪細胞における分化を促進するように処理された線維芽細胞株の両方を使用できる、グルコース補足、および脂肪細胞によるレプチンの放出についてのインスリンの効果を抑制する能力。脂肪細胞によるグルコースの放出は、市販のグルコース検出キットを使用することによりおこなうことができる。レプチンの測定は、市販のキットを用いた免疫測定（ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等）によりおこなうことができる。
【００１８】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起できる化学物質は、ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたは機能的に同等の変異体である。
【００１９】
本明細書において使用されている用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドにより形成されるいずれかの長さの高分子型ヌクレオチドに関する。この用語は、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの両方を含むだけでなく、改変ポリヌクレオチド（メチル化ポリヌクレオチド、保護されたポリヌクレオチド等）を含む。
【００２０】
ＣＴ−１活性を誘起することのできる化学物質として使用するのに好適なポリヌクレオチドには、その配列がヒトカルジオトロフィンの転写物の変異体１に対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号ＢＣ０６４４１６、バージョン９、２００８年１０月１５日）に記載のものに対応するポリヌクレオチド、ヒトカルジオトロフィンの転写物の変異体１に対応するアクセス番号ＢＣ０３６７８７（バージョン９、２００９年８月１２日）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ｒａｔ）のカルジオトロフィン１をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号Ｄ７８５９１、バージョン４、２００９年１月１２日）に記載の配列、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ｒａｔ）のカルジオトロフィン２をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号ＡＹ５１８２０５、バージョン３、２００９年１月１２日）に記載の配列、ハツカネズミＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｍｏｕｓｅ）のカルジオトロフィン１をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号Ｕ１８３６６、バージョン４、２００９年１月１２日）に記載の配列、ハツカネズミＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ （ｍｏｕｓｅ）のカルジオトロフィン２をコードするポリヌクレオチドに対応するＧｅｎＥＭＢＬデータベース（アクセス番号ＡＢ１２５６６１、バージョン２、２００９年１月１２日）に記載の配列などがあるが、これらには限定されない。
【００２１】
あるいは、ＣＴ−１活性を誘起することができる化学物質には、それらの特異的配列により上記で定義されたポリヌクレオチドの機能的に同等の変異体が含まれる。「機能的に同等の変異体」は、本発明に関連して、上記で定義されたＣＴ−１活性を有するポリペプチドをコードすることができ、上記した配列に対する１つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入、欠失または置換により上記のポリヌクレオチドから得られる全てのポリヌクレオチドである。好ましくは、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列により非常に制限された条件で上記したポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドである。非常に制限されたハイブリダイゼーションの典型的な条件には、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ：０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および４０％ホルムアミド中４２℃で１４１時間のインキュベーション後、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６０℃で１あるいは数サイクルの洗浄が含まれる。あるいは、非常に制限された条件には、６ＸＳＳＣ中概略５０〜５５℃の温度でのハイブリダイゼーションと、最後に１〜３ＸＳＳＣ中６８℃の温度での洗浄を含んでなる。中程度に制限された条件は、０．２または０．３Ｍ ＮａＣｌ中概略５０〜６５℃の温度でハイブリダイゼーション後、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中概略５０〜５５℃で洗浄を含んでなる。
【００２２】
好ましくは、ＣＴ−１活性を誘起することのできる化学物質がポリヌクレオチドであるとき、これは、操作的に発現の調節領域に関連付けられる。本発明に使用される調節配列は、核プロモーター配列またはエンハンサー配列および／または他の調節配列（非相同核酸配列の発現を増加する）であることができる。プロモーターは、構成的でも誘発性でもよい。非相同核酸配列の一定の発現が望まれる場合には、構成的プロモーターが使用される。周知の構成的プロモーターとしては、例えば、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターなどが挙げられる。構成的プロモーターの数多くの他の例は、当該技術分野において周知であり、本発明の実施に使用できる。非相同核酸配列の制御された発現が望まれる場合には、誘発性プロモーターを使用する必要がある。非誘発状態では、誘発性プロモーターは、「サイレント」である。「サイレント」は、誘導剤の不存在下で、非相同核酸配列の発現がほとんどまたは全く検出されないが、誘導剤の存在下では、非相同核酸配列の発現が生じる。しばしば、誘導剤濃度を変えることにより発現レベルを制御することができる。発現を制御すること、例えば、誘発性プロモーターをより強くまたはより弱く刺激するように誘導剤の濃度を変えることにより、非相同核酸配列の転写物の濃度に影響を及ぼすことができる。非相同核酸配列が遺伝子をコードする場合には、合成されたタンパク質の量を制御することができる。このように、治療薬の濃度を変化させることができる。周知の誘発性プロモーターとしては、以下のものがある：エストロゲン若しくはアンドロゲンプロモーター、メタロチオネインプロモーターまたはエクジソンに応答するプロモーター。数多くの他の例が、当該技術分野において周知であり、本発明を実施するのに使用できる。構成的および誘発性プロモーター（通常非常に多種多様な細胞または組織で機能する）の他に、特異的組織プロモーターを使用して、細胞または組織において特異的核酸の非相同配列の発現をさせることができる。特異的組織プロモーターの周知な例としては、以下の異なる特異的筋肉プロモーターなどが挙げられる：骨格α−アクチンプロモーター、心臓アクチンプロモーター、骨格トロポニンＣプロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター（および遅収縮）並びにクレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサー。当該技術分野において周知であり、本発明を実施するのに使用できる特異的筋肉プロモーターがある（特異的筋肉プロモーターについては、Ｍｉｌｌｅｒ等、（１９９３）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１５：１９１−１９６参照）。
【００２３】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性を誘起することのできる化学物質は、上記で定義したポリヌクレオチドを含んでなるベクター、すなわち、ＣＴ−１またはその機能的に同等の変異体をコードするベクターである。前記ポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターは、原核生物における発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージ、「シャトル」ベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８、酵母発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミド型のベクター、インテグレーションプラスミド、ＹＥＰベクター、動源体プラスミド等、昆虫細胞における発現ベクター、例えば、ｐＡＣ系ベクターおよびｐＶＬ系ベクター、植物における発現ベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系のベクター、並びにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、さらにはレトロウイルスおよび特にレンチウイルス）に基づく真核生物細胞における発現ベクター、さらには非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１由来のベクターである。
【００２４】
別の態様によれば、ＣＴ−１活性の増加を生じさせることができる化学物質は、カルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を培地に分泌することができる細胞である。カルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体の発現に好適な細胞には、心筋細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（ＢおよびＴ細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜の細胞、種々の器官、好ましくはランゲルハンス島から単離した細胞から単離した細胞の一次培養液、肝細胞、単核細胞を含む白血球、間葉、臍帯若しくは成人白血球（皮膚、肺、腎臓および肝臓由来）、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞などがあげられるが、これらには限定されない。樹立細胞株、例えば、ジャーカットｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞およびＷ１３８細胞も、好適である。
【００２５】
当業者は、カルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を培地に分泌することができる細胞は、微小粒子またはマイクロカプセルを形成することで、細胞は患者に使用される前、より大きな有用寿命を有するものとなることを理解する。本発明の目的である微小粒子を形成するのに好適な物質には、細胞支持体として作用する治療薬の連続分泌を可能にする生体適合高分子物質などがある。したがって、前記生体適合高分子物質は、例えば、熱可塑性ポリマーまたはヒドロゲルポリマーであることができる。熱可塑性ポリマーには、アクリル酸、アクリルアミド、２−アミノメチルメタクリレート、ポリ（テトラフルオロエチレン−共ヘキサフルオロプロピレン）、メタクリル−（７−クマロキシ）エチルエステル酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリアミドアミン、ポリ（アミノ）−ｐ−キシリレン、ポリ（クロロエチルビニルエーテル）、ポリカプロラクトン、ポリ（カプロラクトン−コ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（カーボネート尿素）ウレタン、ポリ（カーボネート）ウレタン、ポリエチレン、ポリエチレン共重合体およびアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（４−ヒドロキシブチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（Ｌ乳酸）、ポリ（ガンマ−メチル、Ｌ−グルタメート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（プロピレンフマレート）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリピロール、ポリスチレン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、超高分子量ポリエチレン、６−（ｐ−ビニルベンズアミド）−ヘキサン酸およびＮ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−マルトンアミド並びに前記ポリマーの複数を含む共重合体（コポリマー）などがある。ヒドロゲル型ポリマーには、アルギネート、アガロース、コラーゲン、澱粉、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、セルロースおよびその誘導体、ペクチン、コンドロイチンスルフェート、フィブリンおよびフィブロイン型の天然物質、さらには合成ヒドロゲル、例えばセファロースおよびセファデックスなどがある。
【００２６】
当該技術分野においては、前記ポリマーの一部は不安定であり、比較的多孔性であり、抗体が内部にアクセスする可能性があり細胞を損傷することに加えて、ゲル性を失う傾向がある。このため、任意に、本発明の微小粒子は、粒子を安定にする半透過性膜により包囲して、抗体不透過バリアを形成することもできる。半透過性膜は、細胞生存能力に必要な全ての溶質が入ることができ、微小粒子に含まれる細胞により産生される治療用タンパク質が出ることができるが、抗体が実質的に透過することができず、その結果、細胞が微小粒子を収容している生体により生じる免疫応答から保護される。半透過性膜を形成するのに好適な物質は、生体液に不溶の物質、好ましくはポリアミノ酸、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−アスパラギン、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリベンジル−Ｌ−アスパーテート、ポリ−Ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン、ポリ−ガンマ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｓ−ＣＢＺ−Ｌ−システイン、ポリ−ε−ＣＢＺ−Ｄ−リジン、ポリ−δ−ＣＢＺ−ＤＬ−オルニチン、ポリ−Ｏ−ＣＢＺ−Ｌ−セリン、ポリ−Ｏ−ＣＢＺ−Ｄ−チロシン、ポリ（γ−エチル−Ｌ−グルタメート）、ポリ−Ｄ−グルタミン酸、ポリグリシン、ポリ−γ−Ｎ−ヘキシルＬ−グルタメート、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ（α，β−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパートアミド］）、ポリ−Ｌ−ヒドロキシプロリン、ポリ（α、β−［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−ＤＬ−アスパートアミド］）、ポリ−Ｌ−イソロイシン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン、ポリ−Ｌ−プロリン、ポリ−Ｌ−セリン、ポリ−Ｌ−トレオニン、ポリ−ＤＬ−トリプトファン、ポリ−Ｄ−チロシンまたはそれらの組み合わせである。
【００２７】
本明細書において使用されている用語「代謝障害」は、代謝における誤りおよびアンバランスを生じるだけでなく、準最適な形態で起きる代謝過程を生じる全ての種類の障害である。また、この表現は、それ自体の疾患は代謝障害によっては生じなかったかもしれないが、代謝調節により治療できる障害に関する。好ましい態様によれば、代謝障害は、肥満、高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病および異脂肪血症からなる群から選択されるものである。
【００２８】
本発明において使用される用語「肥満」は、ヒトの体重（ｋｇ）と身長（ｍ）の二乗との間の比からなる、肥満度指数（ＢＭＩ）に基づいてＷＨＯにより示された肥満の定義に関する。この基準によれば、ＢＭＩ１８．５ｋｇ／ｍ２未満は体重が不足または痩せ気味とみなし、ＢＭＩ１８．５〜２４．９ｋｇ／ｍ２は正常体重としてみなし、ＢＭＩ２５．０〜２９．９ｋｇ／ｍ２は過体重グレード１とみなし、ＢＭＩ３０．０〜３９．０ｋｇ／ｍ２は過体重グレード２とみなし、ＢＭＩ４０．０ｋｇ／ｍ２以上は病的肥満とみなす。あるいは、個人の肥満度を定義するのには別の方法、例えば、助骨の下端と骨盤の上端との間の中点で測定したウエストの直径（単位：ｃｍ）、皮膚のひだの厚さ、および脂肪のない体は脂肪が多い体よりも電気をよく通すという原理に基づく生体インピーダンスがある。
【００２９】
本発明において使用される用語「高血糖」は、空腹時ベースラインレベルに対して異常に高い血糖値となる状態に関する。特に、空腹時の血糖値が常に１２６ｍｇ／ｄＬ超であるとき、食後の血糖値が１４０ｍｇ／ｄＬ超であるとき、および／または体重の１キログラム当たり１．７５グラムのグルコースを投与してから２時間後の静脈血漿の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ超であるときに高血糖が起きる。
【００３０】
本発明において使用される用語「インスリン抵抗性」は、細胞がインスリンに対して正しく応答しない障害に関する。その結果、体は、高血糖値に応答してより多くのインスリンを生じる。インスリン抵抗性を患う患者は、高血糖値および高循環インスリンレベルを示すことがしばしばある。インスリン抵抗性は、しばしば肥満、高血圧および脂質異常症と関連づけられている。さらに、インスリン抵抗性は、２型糖尿病を患う患者にしばしば現れる。
【００３１】
本発明において使用される用語「２型糖尿病」は、大血管、小血管および神経に影響する慢性合併症を生じる、血糖値の異常な増加により特徴づけられる疾患に関する。この疾患における基礎障害は、インスリン抵抗性と称される、インスリン作用の困難（このホルモンに対する組織感受性の損失の形態）、および膵臓における産生に関与する細胞によるインスリンの不適切な分泌である。グルコース濃度の増加の他に、誤ったインスリン作用がしばしばコレステロールおよび／またはトリグレセリドレベルの増加を生じる。
【００３２】
本発明において使用され用語「異脂肪血症」は、脂質代謝における障害でその結果脂質濃度（コレステロール、トリグリセリドなど）および血中リポタンパク質（高密度リポタンパク質）における障害を生じることにより特徴付けられる病的状態に関する。本発明の方法で治療することができる異脂肪血症として、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、Ｉ型、ＩＩａ型、ＩＩｂ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型高リポタンパク血症、高カイロミクロン血症、複合脂質異常症などがある。
【００３３】
本発明による組成物は、本発明の方法が美容的目的を有する場合には、病的肥満の治療と過体重グレード１またはグレード２の治療の両方に有用である。したがって、別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン１活性を誘起する化合を患者に投与することを含んでなる、肥満治療のための美容的方法に関する。この態様によれば、脂肪の面での過剰体重であり、本発明の美容的方法により処置されることができる患者は、視覚的または２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、好ましくは２５〜３０のＢＭＩにより確認できる。これらの個人は肥満であるとみなされ、美容的理由で体重コントロールを必要とする。
【００３４】
カルジオトロフィン１活性を誘起することができる化学物質として本発明による美容的方法の種々の態様は、肥満および他の代謝障害の治療方法に関連して上記されている。
【００３５】
本発明による化合物は、急性および長期治療の両方で投与できる。本発明において使用される表現「長期投与」は、化合物を長期間にわたって連続的に患者に投与して前記期間の間、治療形態を維持する投与方法に関する。長期投与形態では、化合物を毎日複数回数、毎日２回、毎日３回程度あるいはその付近の回数程度投与される。長期投与は、１日を通して周期的に種々の静脈注射によりおこなうことができる。あるいは、長期投与は、ボーラスの形態または毎日、２日毎、３〜１５日毎、１０日以上毎に実施できる連続注入による投与を含む。典型的には長期投与は、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１年、少なくとも２年以上維持される。
【００３６】
本明細書において使用されている表現「急性投与」は、患者に、化合物の単回投与または数回投与を、時間を減少して、例えば、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間若しくは２４時間または２日間、３日間または４日間実施する投与方法に関する。
【００３７】
当業者には、活性化合物の治療に有効な量および／または製剤を、投与の種類に応じて実施することが理解されるであろう。ここで使用される「治療に有効な量」は、代謝障害と関連する症状を完全または部分的に軽減するか、症状の進行または悪化を防止するか、疾患を患うリスクがある被験者において疾患の発症を防止するのを可能にする化合物の量である。
【００３８】
本発明による化合物の長期投与が望ましい場合には、例えば、ＵＳ５６７２６５９、ＵＳ５５９５７６０、ＵＳ５８２１２２１、ＵＳ５９１６８８３およびＷＯ９９３８５３６に開示されているような除放性組成物で投与することができる。このタイプの投与とは関係なく、急性投与が望ましい場合には即時放出での治療が好ましい。投与の種類とは無関係に、用量および間隔は、治療効果を維持するのに十分な化合物の血漿レベルとするために個々に調節できる。当業者は、過度の実験をおこなうことなく、治療に有効な局所用量を最適化することができる。
【００３９】
本発明による化合物の投与は、本発明の別の態様を構成する医薬組成物における製剤化を必要とする。本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、治療に有効な量の活性剤と薬学的に許容しうる担体を含む。用語「薬学的に許容しうる」は、動物および特にヒトにおける使用のために、連邦政府若しくは州の監督官庁により、または米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方を含めて承認されたことを意味する。用語「担体」は、治療化合物を投与する希釈剤、共アジュバント、賦形剤またはビヒクルに関する。前記医薬担体は、滅菌液、例えば、水および油、石油、動物または植物起源または合成油、例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油などを含む。好適な医薬賦形剤には、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、スキムミルク粉、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望ならば、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、連続放出製剤などの形態をとってもよい。組成物は、結合剤および従来の担体、例えば、トリグリセリドを用いて坐剤として製剤化してもよい。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬型マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムを含むことができる。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００４０】
組成物は、ヒトに対して静脈、皮下または筋肉内投与するための医薬組成物として通常の手順に準じて製剤化できる。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および局部麻酔、例えば、注射部位での痛みを軽減するためのリドカインを含んでいてもよい。組成物を浸潤により投与しようとするとき、薬学的品質の水または食塩水を含む浸潤ボトルで調剤することができる。組成物を注射投与するとき、水バイアルを注射液または無菌食塩水用として用意し、投与前に成分を混合できる。
【００４１】
代謝障害の治療に有効である化合物を誘起するＣＴ−１活性の量は、本明細書に記載の標準的な臨床法により求めることができる。さらに、生体外試験は、最適な用量範囲を確認しやすくするのに必要に応じて使用することもできる。製剤に使用するための正確な用量は、投与経路および重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に応じて決定する必要がある。しかしながら、静脈内投与に好適な用量範囲は、一般的に体重１キログラム当たり活性化合物５０〜５０００マイクログラムである。鼻内投与に好適な用量範囲は、一般的に概略０．０１ｐｇ／ｋｇ（体重）〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）である。有効用量は、生体外アッセイシステムまたは動物におけるモデルから得られた用量に対する一対の応答曲線から推定することができる。
【００４２】
全身投与について、治療に有効な用量は、生体外アッセイから最初に推定できる。例えば、用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において求めたＩＣ５０を含む血中濃度範囲を得ることにより公式化できる。前記情報を使用して、ヒトに有用な用量を正確に求めることができる。また、初期用量も、当該技術分野において周知の手法を用いて、生体内データ、例えば、動物モデルから推定することもできる。当業者は動物におけるデータに基づき、ヒトに対する投与を容易に最適化できる。
【００４３】
同様に、本発明は、ＣＴ−１活性を誘起することができる化学物質と、食欲減退効果を有するか、または肥満防止効果を有する、生体における栄養の入手を減少することができる１つまたは数種の化合物とを併用することを想定している。したがって、本発明による代謝障害治療法は、ＣＴ−１活性を誘起する能力を有する化合物を、アミリン、アミリンアゴニスト、サケカルシトニン、コレシストキニン若しくはそのアゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）、エクセンジン若しくはエクセンジン類似体、ＧＬＰ１若しくはそのアゴニスト、ポリペプチド（ＰＹＹ）若しくはそのアゴニスト、神経伝達物質またはニューロンイオンチャンネルに影響する化学物質、例えば、抗抑鬱剤、ノルアドレナリン補足抑制剤、セロトニン２ｃ受容体アゴニスト、一部のドーパミン作動アンタゴニスト、キャナビノイド１受容体アゴニスト類似体、レプチンを含むＣＮＳにおけるレプチン／インスリンの経路を調節する化学物質、レプチン輸送のプロモーター若しくはレプチン受容体のプロモーター、ＣＮＴＦ、神経ペプチドＹ、アグチ関連ペプチドのアンタゴニスト、プロオピオメラノコルチン、コカイン、アンフェタミン、アルファメラニン細胞刺激ホルモン、メラノコルチン−４受容体アゴニスト、タンパク質チロシンホスフェート１ベータ阻害剤としてインスリン活性／代謝に影響する化学物質、ペルオキシソーム７増殖剤により活性化される受容体のアンタゴニスト、ブロモクリプチン、ソマトスタチンアゴニスト、安静時の新陳代謝率を増加する化学物質（アンカップリングタンパク質のアゴニスト、甲状腺ホルモン受容体のアゴニスト）およびメラニンなどの異なる種類の他の化学物質、フィトステロールの類似体、機能油、脂肪酸合成阻害剤、カルボキシペプチダーゼ、腸リパーゼ阻害薬などからなる群から選択される１つまたは数種の化合物と同時、順次または別個に投与することを想定している。
【００４４】
本発明による組成物
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＴ−１とインスリンの同時投与は、各成分を別個に投与することにより観察されるよりも高い、１型糖尿病のモデルおよび筋肉によるグルコース補足に対する低血糖効果を有することを見出した。したがって、図７は、どのようにＣＴ−１とインスリンとの組み合わせで、ストレプトゾトシンでのベータ膵臓細胞の実験的破壊を受けたマウスの処置が、成分の各々を別個に投与した後に観察されるよりも高い低血糖効果を生じるかを示す。さらに、図８は、どのようにＣＴ−１とインスリンの組み合わせが、化合物を別個に投与したときに観察されるよりも高い筋肉によるグルコース補足の増加を生じるかを示す。
【００４５】
したがって、別の態様によれば、本発明は、カルジオトロフィン活性を誘起する化合物と抗糖尿病化合物を一緒または別個に含んでなる組成物（以下、本発明の組成物）に関する。
【００４６】
「カルジオトロフィン活性を誘起する化合物」との表現は、代謝障害の治療法に関連して上記した通りであり、本発明の第一の方法におけるように、化合物が：
（ｉ）カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、
（ｉｉ）ＣＴ−１の機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にカルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞からなる群から選択されるものである。ここで、種々の化合物は上記で詳細に述べたとおりである。
【００４７】
本発明に用いられる表現「抗糖尿病化合物」は、その作用機構とは無関係に、高血糖を含む糖尿病の症状を少なくとも部分的に補償することができる化学物質である。好ましい態様によれば、抗糖尿病化合物は、インスリン活性を誘起する化合物、またはインスリンの低血糖活性を誘起する化合物、またはインスリン活性に対する感作物質である。
【００４８】
インスリン活性を誘起することができる抗糖尿病化合物は、
（ｉ）インスリン、
（ｉｉ）インスリンの機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）インスリンをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にインスリンまたはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞
などがあるが、これらには限定されない。
【００４９】
本発明において用いられる用語「インスリン」は、いずれかの種（霊長類、齧歯動物類またはウサギ）、好ましくはヒト由来のインスリンおよびより好ましくは天然配列（自然由来のインスリンと同じアミノ酸配列のポリペプチドを含んでなる）のインスリンに関する。自然配列の前記インスリンポリペプチドは、自然から単離できるか、または組み換えおよび／または合成培地により産生される。用語「天然配列インスリン」は、具体的には自然に生じる、切断または分泌形態および対立遺伝子変異体を網羅する。本発明の態様によれば、天然配列ヒトインスリンは、成熟天然配列インスリンまたは完全長型（ヒトプレプロインスリン（アクセス番号Ｐ０１３０８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデーターベース、バージョン１２６、２００９年１月２０日）の配列のアミノ酸９０〜１１０に対応するアルファまたはＡ鎖、およびアミノ酸２５〜５４（アクセス番号Ｐ０１３０８、ＮＣＢＩデーターベース、バージョン１２６、２００９年１月２０日）に対応するベータまたはＢ鎖）である。
【００５０】
本発明において用いられる「インスリンの機能的に同等の変異体」は、インスリン配列に対する少なくとも１つのアミノ酸の除去、挿入または修正から生じ、且つ由来するインスリンと実質的に同じ性質を維持する全てのポリペプチドである。インスリン活性は、血清中の正常血糖クランピングまたは血清中のグリコシル化タンパク質の測定などの当業者に広く知られている方法により測定できる（Ｂｕｎｎ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８１、３０：６１３−６１７）。
【００５１】
インスリンの機能的に同等の変異体には、デス−ペンタペプチド（Ｂ２６−Ｂ３０）−ＰｈｅＢ２５−α−カルボキサミド］インスリン、ＡｓｐＢ１０インスリン（ＵＳ４９９２４１７に開示されている）、ＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９インスリンＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９およびその６量体変異体（ＵＳ５４７４９７８およびＵＳ５５１４６４６に開示されている）、インスリンおよびプロタミンの製剤（ＵＳ５６５０４８６）、アシル化ＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９インスリン（ＵＳ５９２２６７５）、並びにＵＳ５９５２２９７、ＵＳ６０３４０５４およびＵＳ６２１１１４４に開示されているものなどの安定化インスリンの組成物、インスリンの超活性類似体、単量体インスリン、肝臓特異的インスリン、インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））、インスリンリスプロプロタミンで製剤化したインスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）５０／５０（商標）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）７５／２５（商標）として市販されている）、ＮＰＨインスリンまたはインスリンイソファンヒト（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）で市販されている）、レギュラーインスリン、レギュラーインスリンと併用したＮＰＨインスリン（ＵＳ５５４７９２９）、インスリン亜鉛、インスリングラルギン、グルリシン（ＡＰｉｄｒａ）、インスリンアスパルト（Ｎｏｖｏｍｉｘ）、インスリンデテミル（ｌｅｖｅｍｉｒ）、生物相、ＬＰ−１００、ノバラピッド、インスリン亜鉛懸濁液（遅および超遅）、ＧＬＰ−Ｉ（１−３６）アミド、ＧＬＰ−Ｉ（７３−７）（ＵＳ５６１４４９２に開示されているインスリンオトロピン）、ＬＹ−３１５９０２（Ｌｉｌｌｙ）、ＧＬＰ−Ｉ（７−３６）−ＮＨ２）、ＡＬ−４０１（自己免疫）、ＵＳ４５７９７３０、ＵＳ４８４９４０５、ＵＳ４９６３５２６、ＵＳ５６４２８６８、ＵＳ５７６３３９６、ＵＳ５８２４６３８、ＵＳ５８４３８６６、ＵＳ６１５３６３２、ＵＳ６１９１１０５およびＷＯ８５／０５０２９に開示されているものなどの組成物などがあるが、これらには限定されない。
【００５２】
さらに、インスリンの機能的に同等の変異体には、（ａ）高脂肪食Ａ鎖の残基１〜２１と高脂肪食Ｂ鎖の残基１〜３０との組み合わせ、または（ｂ）前記配列に特異的に由来する別の断片のアミノ酸の配列とのアミノ酸配列同一度が少なくとも約８０％であるポリペプチドなどがある。さらに、システイン残基Ａ６〜Ａｌ１、Ａ７〜Ｂ７およびＡ２０〜Ｂ１９間ジスルフィド結合により維持されるインスリンの二次構造は、活性に必要であると思われ、そのため、好ましくは機能的に同等の変異体はできるだけ前記二次構造を保存する。
【００５３】
インスリンの機能的に同等の変異体には、例えば、インスリンのＡおよびＢ鎖のＮ末端および／またはＣ末端で、または内部ドメインの１つ以上内で、１つ以上のアミノ酸残基が付加または欠失されたポリペプチドなどが含まれる。通常、インスリンのポリペプチド変異体は、アミノ酸配列と、高脂肪食のＡ鎖の残基１〜２１と高脂肪食のＢ鎖の残基１〜３０との組み合わせにより形成される配列または前記アミノ酸配列から特異的に由来の別の断片とのアミノ酸概略同一度は、少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ポリペプチド変異体の配列長さは、Ａ鎖の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４残基または３５およびＢ鎖の少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、２７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０残基である。
【００５４】
インスリンをコードするポリヌクレオチドには、ヒトインスリン、その前駆体（プレプロインスリンおよびプロインスリン）をコードするポリヌクレオチドと、他の種のオルソログをコードするポリヌクレオチドなどがある。
【００５５】
「インスリンの機能的に同等の変異体をコードするポリヌクレオチド」は、（ａ）上記で定義した活性インスリンのポリペプチドをコードし、（ａ）上記で定義した高脂肪食のＡ鎖の残基１〜２１と上記で定義したヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖の残基１〜３０との組み合わせ、または（ｂ）前記配列とアミノ酸配列同一度が少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を示す上記したアミノ酸配列に特異的に由来する別の断片をコードする核酸の１つをコードする核酸配列との核酸配列同一度が少なくとも約８０％である核酸を示す。インスリンの変異体をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも約４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、８１、８７、１０５ヌクレオチドのインスリンのＡ鎖をコードする核酸および／または少なくとも約７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５または１５０ヌクレオチドのインスリンのＢ鎖をコードする核酸を含む。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、単離された形態であるか、ベクターの一部分である。インスリンまたはその機能的に同等の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に好適なベクターは、ＣＴ−１により構成される組成物との関係で上記したものと実質的に同じである。
【００５７】
あるいは、本発明に関連して使用することができる抗糖尿病化合物は、インスリンの抗血糖活性を有する化合物またはインスリン活性に対する感作物質を含み、インスリンの分泌促進剤、例えば、スルホニル尿素（トルブタミド、クロルプロパミド、グリピシド、グリベンクラミド、グリカジド、グリペンチド、グリメピリド、グリベンクラミド、グリピジド、グリキドン、グリセンチド、グリメピリド等）およびメチグリニド（レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド等）、肝臓グルコース産生の還元剤（ビグアニドおよび特にメトホルミンおよびブホルミン）、炭水化物減少を生じる化学物質、例えば、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトールまたはボグリボース）、グルコースの末梢使用を増加する化学物質、例えば、チアゾリジンジオン（ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等）、ＧＬＰ−若しくはＧＬＰ−１模倣剤（Ｂｙｅｔｔａ−Ｅｘａｎａｔｉｄｅ、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｎｉｄｅ、ＣＪＣ−１１３１（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ、Ｅｘａｎａｔｉｄｅ−ＬＡＲ（アミリン）、ＢＩＭ−５１０７７、ＺＰ−１０、ＷＯ００／０７６１７に記載されている化合物等））、エクゼンジン、セクレチン、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（シタグリプチン、サクサグリプチン、デナグリプチン、ビルダグリプチン、ＡＬＳ−２−０４２６、ＡＲＩ−２２４３、ＢＩ−Ａ、ＢＩ−Ｂ、ＳＹＲ−３２２、ＭＰ−５１３、ＤＰ−８９３、ＲＯ−０７３０６９９等）、ＳＧＬＴ−２阻害剤（ダパグリフロジンおよびセリグリフロジン、ＡＶＥ２２６８、Ｔ−１０９５等）、並びにグルコース産生の増加を生じるペプチド（アミリンチド、プラムリンチド、エキセンディン）、ＧＬＰ−１活性を有する化合物（グルカゴン様ペプチド１）、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂの阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、インスリンの分泌促進物質；脂肪酸酸化阻害剤、Ａ２アンタゴニスト、ｃ−ｊｕｎターミナルキナーゼ阻害剤、インスリン；インスリン模倣剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＶＰＡＣ２受容体アゴニスト、グルコキナーゼ阻害剤等）などがあるが、これらには限定されない。
【００５８】
本発明による組成物は、低血糖効果および筋肉によるグルコース補足を増加する能力を前提として、代謝障害の治療に使用できる（実施例２）。この組成物は、別の化合物の製剤と、同時、別個または順次投与に使用できる。したがって、別の態様によれば、本発明は、組成物が同時、別個または順次投与される代謝障害の治療のための、本発明による組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、組成物が同時、別個または順次投与される代謝障害の治療用薬物の調製のための、本発明による組成物の使用に関する。別の態様によれば、本発明は、本発明による組成物の同時、別個または順次投与を含んでなる、代謝障害の治療方法に関する。
【００５９】
本発明による組成物の治療剤、特にＣＴ−１活性誘導剤および抗糖尿病剤は、単一製剤（例えば、成分の各々の一定量を含んでなる錠剤またはカプセルとして）提供してもよく、また別個の製剤として提供して、後で組み合わせて同時、順次または別個投与してもよい。また、本発明による組成物は、成分を別個に製剤化するが、同じ容器にパッケージ化する、キットオブパート（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）としての製剤を含む。当業者は、本発明による組成物の第一および第二成分の剤形は同様でよく、換言すれば、同様に製剤化でき（錠剤または丸薬）、同じ経路で投与することができることを理解できるであろう。本発明の異なる成分を別個に製剤化する場合には、２つの成分はブリスターで提供できる。各ブリスターは、その日の間に消費しなければならない。もし薬物を１日に数回投与しなければならない場合には、各投与に対応する薬物をブリスターの異なる部分に配置することができ、好ましくは投与しなければならない日の時間をブリスターの各部分に記録する。あるいは、本発明による組成物の成分は、異なる成分が異なって投与されるように、異なって製剤化できる。したがって、第一成分は経口投与用錠剤またはカプセルとして製剤化され、第二成分は静脈投与用に製剤化されることができる。
【００６０】
本発明による組成物は、静脈内、経口、鼻内、非経口、局所的、経皮、直腸などの当業者に公知の方法により投与されるが、これらには限定されない。
【００６１】
本発明による組成物の一部分である成分間の比は、各特定の場合に使用されるＣＴ−１活性誘導剤および抗糖尿病剤、さらには所望の適用に依存する。したがって、本発明によれば、２つの成分の量の間の比が５０：１〜１：５０、特に２０：１〜１：２０、１：１０〜１０：１または５：１〜１：５であることができる組成物を想定できる。
【００６２】
本発明の組成物で治療できる代謝障害には、本発明の第一の態様（ＣＴ−１の治療および美容用途）に関連して上記したような肥満、インスリン抵抗性、高血糖、異脂肪血症および２型糖尿病などがあるが、これらには限定されない。別の態様によれば、本発明は、純粋に美容的な理由での抗肥満治療の候補患者が本発明の第一態様に記載されたようにして確認される（ＣＴ−１の治療および美容用途）、本発明の組成物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療のための美容的方法に関する。
【００６３】
本発明は、以下の実施例により説明するが、これらの実施例は単に説明の目的のみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１
体重に対するＣＴ−１の効果
３カ月の高脂肪食（ＨＦＤ、６０％脂肪）の摂取により、肥満マウスを得た。ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を連続６日間静脈内投与したところ、高脂肪食（ＨＦＤ）のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢：５カ月）の体重が減少した（図１）。この実験で使用される用量は、発熱反応を生じなかった（直腸温度を処置の全ての日で測定した）。
【００６５】
（図１に記載したＨＦＤを与え）上記した用量０．２ｍｇ／ｋｇ／日で６日間連続してｒＣＴ−１で処置した肥満マウスにおいて観察された体重の減少は、このサイトカインの食欲減退効果によるものである（図２）。図は、ｒＣＴ−１で処置した群および生理学的血清（Ｓ）で静脈内処置した対応の対照群の処置の６日間に摂取したキロカロリーを示す。
【００６６】
同様に、ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を６日間連続して静脈内投与したところ、普通食（ＮＣＤ）を与えた非肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（月齢：５カ月）において体重が減少した（図３）。この実験で使用した用量は、発熱反応を生じなかった（直腸温度を処置の全ての日で測定した）。
【００６７】
上記用量で且つ上記で述べたｒＣＴ−１で処置した間に観察された体重の減少が食欲減退効果によるものなのか、または他の効果が関与しているのかを測定する目的で、月齢４カ月のＣ５７ＢＬ／６マウス３群を用いて実験を行った。第一群（生理食塩水群）には、生理学的血清を静脈内投与（ｒＣＴ−１の投与に使用したのと同じ容積）し；第二群（ｒＣＴ−１群）には、上記した用量（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）でｒＣＴ−１を静脈内投与し、第三群（Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群）には、ｒＣＴ−１処置したマウスにより摂取されたのと同じ量の食物を毎日与えるとともに、血清を同じ実験期間の間注射した。図４から明らかなように、ｒＣＴ−１で処置したマウスは、エネルギー摂取が両方の群で同一であるにもかかわらず、Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群よりも体重減少が大きかった。このことは、上記で観察された食欲減退効果の他に、ｒＣＴ−１は体重減少に関与する他の代謝効果を有することを示している。
【００６８】
実施例２
ＣＴ−１の低血糖効果
ｒＣＴ−１（１０μｇ）のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢３カ月）への急性静脈内投与（１回投与）がベースライン血糖レベルを減少させるかどうか判定する目的で、ｒＣＴ−１および生理食塩水血清で処置後１時間後に、血中グルコースレベルを測定した。図５Ａから明らかなように、ｒＣＴ−１は、血糖レベルを顕著に減少させた。ＣＴ−１または生理食塩水で処置した動物のインスリンレベルにおいて顕著な差が観測されないので、血糖が減少した機構は血中インスリンレベルの増加に起因するとすることはできない（図５Ｂに示すように）。結果は、平均±ＳＥで表されている。１群当たりｎ＝５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。ｒＣＴ−１での処置は、筋肉におけるＡＫＴのリン酸化を誘起する。これは、このサイトカインの低血糖作用を説明するのに役立つ（図５Ｃは、代表的なウエスタンを示す）。
【００６９】
ｒＣＴ−１（１０μｇ）を急性単回投与すると、高糖食後の血中グルコースの増加が防止される。ｒＣＴ−１の食後の血糖に対する効果を検討するためのこの実験は、Ｆｒｕｅｂｉｓ等（Ｆｒｕｅｂｉｓ等、２００１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．、９８：２００５−２０１０）により公開されたものに準じて、胃への強制投与（体重の１％容積で）による高糖食を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢３カ月）に投与することでおこなった。強制投与後、同じ容積の生理食塩水血清を静脈内投与した（生理食塩水）またはｒＣＴ−１（１０μｇ）。血液はグラフに示した時間で採取し、血糖を測定したところ、ｒＣＴ−１で処置した動物では血糖の増加は生じなかった（図６）。
【００７０】
次に、ｒＣＴ−１を単回急性投与でのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢３カ月）における血糖レベルの減少が、ストレプトゾトシンでの処置をおこなったベータ−膵臓細胞の破壊に続発する高血糖を減少させるかどうか判定した。したがって、ストレプトゾトシンを単回投与（２００ｍｇ／ｋｇ）してから６４時間後、ベースライン血糖を測定し、マウスの３群に対して種々の処置を実施した。第一群（生理食塩水群）を、生理食塩水血清で処置した。第二群（インスリン群）を、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇで処置した。第三群（ｒＣＴ−１群）を、ｒＣＴ−１１０μｇで処置した。第四群（インスリン群＋ｒＣＴ−１）を、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇおよびｒＣＴ−１１０μｇで処置した。種々の処置を実施してから、１５分、３０分、６０分および１２０分後に血糖を測定した。図７から明らかなように、ｒＣＴ−１は、投与後３０分後の血糖を顕著に減少し、分析した全ての血液抽出点においてインスリンの効果を高めた。
【００７１】
ｒＣＴ−１での急性処置から生じる低血糖効果が筋肉によるグルコース捕捉の増加によるものかどうかを判定するために、１８ＦＤＧ（１８ＦｌｕｏｒｏＤｅｏｘｙグルコース）の筋肉捕捉を、種々のマウス群におけるガンマカウンターにより測定した。この実験をおこなうために、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢３カ月）を、以下のように４群にわけた：生理食塩水群（生理食塩水血清で処置）；インスリン群（インスリン０．７５Ｕ／ｋｇで処置）、ｒＣＴ−１群（ｒＣＴ−１１０μｇで処置）およびインスリン群＋ｒＣＴ−１（インスリン０．７５Ｕ／ｋｇ＋ｒＣＴ−１１０μｇで処置）。種々の処置投与の１５分後、１８ＦＤＧを投与し、注射１０分後、腓腹筋を取り出し、放出された放射活性を、ガンマカウンターにより定量化した。結果（図８）は、ｒＣＴ−１は筋肉によるグルコース消費を増加および増進するであろう（しかし、インスリンで観察されるものほど著しくはない）ことを示している。
【００７２】
次に、ｒＣＴ−１での長期処置の低血糖および低インスリン血症効果を、３カ月間高脂肪食（ＨＦＤ、６０％脂肪）の摂取により誘起した肥満のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢５カ月）で測定した。食事処置の終わりに、マウスを、６日間連続（長期処置）で、ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を静脈内投与することで処置した。図９に示すように、血糖レベル（上パネル）とインスリン血症レベル（下パネル）はｒＣＴ−１での処置のため顕著に減少した。
【００７３】
次に、ｒＣＴ−１での長期処置の低血糖および低インスリン血症効果を、対応するＰａｉｒ−ｆｅｄ（ＰＦ）群と比較した。ｒＣＴ−１群には、上記した用量（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）で６日間、静脈内経路によりｒＣＴ−１を与えた。Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群には、ｒＣＴ−１で処置したマウスにより摂取したのと同じ量の毎日の食物を与え、血清を同じ実験期間にそれらに注射した。図１０に示すように、血糖のより大きな低下（上パネル）が、ｒＣＴ−１で長期処置した動物において、同様のカロリー制限したものに対してみられた。このことは、低血糖効果は、ｒＣＴ−１により誘起された食欲減退効果によるだけではなく、タンパク質自体の低血糖性によるものと思われる。
【００７４】
次に、ｒＣＴ−１（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）での生体外処置が、腸管リングにおける糖の輸送を阻害できるかどうかを判定した。したがって、グルコースの腸輸送を、３７℃でのｒＣＴ−１の不存在下または存在下で１５分間のインキュベーションに関して、反転空腸管リングによるα−メチルグルコシド（１ｍＭ）の捕捉を測定することにより判定した。α−メチルグルコシドは、ＳＧＬＴ１ナトリウム−糖コトランスキャリアによる腸細胞の頂端膜を横断するグルコースの類似物質である。このことは、輸送の変化は、前記トランスキャリアの活性の変化に起因するにちがいないことを意味する。図１１は、観察される効果は用量依存ではないが、ＣＴ−１は、腸におけるグルコースの吸収を阻害することができることを示している。
【００７５】
腸管リングにおけるα−メチルグルコシド（１ｍＭ）の捕捉に対するＣＴ−１およびＣＮＴＦの作用を測定した。図１１に示す実験方法に準じて測定したところ、グルコースの腸輸送に対するＣＴ−１の阻害作用は、ＣＮＴＦ（試験した実験条件において顕著な効果が得られなかった）よりも大きいことが判明した。
【００７６】
次に、グルコースの腸捕捉に対するＣＴ−１の生体外効果が生体内で再現できるかどうかを判定した。これのために、ｒＣＴ−１（１０μｇ）を、静脈内に急性的にＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢２カ月）に投与した。ＣＴ−１の投与は、α−メチルグルグルコシド（１ｍＭ）の腸輸送における阻害を生じた（図１３）。腸管リングの単離と、それによるα−メチルグルグルコシド（１ｍＭ）の輸送は、ＣＴ−１の投与３時間後におこなった。得られた結果は、ＣＴ−１の、動物に全身投与するときにグルコースの腸輸送を阻害する能力を示し、ｒＣＴ−１が腸グルコースの輸送を阻害する能力を示した生体外においておこなった上記の実験結果を補強するものである。
【００７７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（月齢５カ月）への６日間連続（長期処置）のｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）の静脈内投与が、生理食塩水血清で処置したマウスからのものと比較して腸環におけるα−メチルグルコシド（１ｍＭ）の腸捕捉を阻害することができたかどうかを次に判定した。結果は図１４に示されるとおりであり、図１４から、どのようにｒＣＴ−１が腸グルコース輸送を阻害することができるかが分かる（生体内長期処置）。
【００７８】
次に、ＣＡＣＯ−２のヒト細胞株の細胞によって、α−メチルグルコシド（０．１ｍＭ）の捕捉について、ｒＣＴ−１の効果を判定した。結果（図１５）から明らかなように、ｒＣＴ−１での処置は、ヒト腸細胞として機能的に挙動するＣＡＣＯ−２ヒト細胞株におけるa−メチルグルコシド（０．１ｍＭ）の捕捉の濃度依存阻害を生じる。ＣＴ−１での処置を、１時間（図１５Ａ）および２４時間（図１５Ｂ）、頂縁からおこなったところ、検討した２つのプレインキュベーション時間における用量２０ｎｇ／ｍｌで顕著な差が観察された。結果は、１群当たり４２〜４４測定の平均±ＳＥで表されている。
【００７９】
実施例３
ＣＴ−１とＣＮＴＦとの効果の差
図１６は、脂肪細胞によるレプチン分泌を調節するｒＣＴ−１およびＣＮＴＦの能力を測定するために、ラット脂肪細胞の一次培養において実施された実験の結果を示す。図１６Ａは、ｒＣＴ−１（７２時間）での処置が、どのようにレプチンのベースライン分泌とインスリン（１．６ｎＭ）により刺激されたものとの両方を阻害するかを示す。しかしながら、これらの効果は、ＣＮＴＦの同様な濃度では観察されなかった（図１６Ｂ）。
【００８０】
図１７は、ＣＴ−１およびＣＮＴＦの、インスリンの不存在下または存在下での脂肪分解を調節する能力を判定するために、ラット脂肪細胞の一次培養において実施された実験の結果を示す。この図は、ＣＴ−１がグリセロール（脂肪分解測定）の放出を誘起し、またインスリンの抗脂肪分解活性を阻害するが、ＣＮＴＦはそれができないことを示している。これらのデータは、ＣＴ−１が脂肪を集めることができ、上記した筋肉におけるベータ酸化が増加することの他に、このサイトカインが脂肪の堆積を減少させる能力があることを示している。
【００８１】
加えて、そして重要なことには、ＣＴ−１は、脂肪細胞（脱ヨード酵素ヨードチロニン、Ｄｉｏ−２およびアンカップリングタンパク質−１、ＵＣＰ−１）における褐色脂肪組織（ＩＩ型）の典型的な遺伝子を誘起することができるが、ＣＮＴＦはできなかった（図１８）。いくつかの研究から、白色脂肪組織において褐色脂肪組織に特有の遺伝子を誘起させることを目的とする療法は、肥満関連障害の改善に効果的であろうということが明らかになっている（Ｆａｒｍｅｒ Ｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００８；２２：１２６９−７）。
【００８２】
実施例４
ＣＴ−１の長期投与は炎症を生じない
長期投与後の炎症を生じさせるＣＴ−１の能力を判定するために、高脂肪食（ＨＦＤ、６０％脂肪）を３カ月間摂取することにより誘起した肥満のＣ５７ＢＬ／６マウス（月齢５カ月）におけるＩＬ−６の血清レベルを測定した。食事処置の終わりに、マウスを、６日間連続して（長期処置）、ｒＣＴ−１（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を静脈内投与して処置した。結果（図１９）は、使用された用量での長期処置では、炎症の兆候がなかったことを示している（肝臓および筋肉などの器官において組織学的に確認されたデータ）。
【００８３】
さらに、肝臓の組織学的切断を、炎症の症状の出現を顕微鏡検査により検出するためにおこなった。結果（図２０）は、３群のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、月齢４カ月）における肝臓（Ｈ＆Ｅ１００Ｘ）の組織学的切断の代表であるイメージを示す：対照群：静脈内経路により生理学的血清（ｒＣＴ−１の投与に使用されたものと同じ容積）が与えられた；ｒＣＴ−１群：６日間連続して、上記した用量（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）で、静脈内経路によりｒＣＴ−１が与えられた；Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群：ｒＣＴ−１で処置したマウスが摂取するのと同じ量の食物を毎日与え、同じ実験期間中に、血清を注射した。図から明らかなように、３群のどれにも、炎症性浸潤物の存在が観察されず、また顕著な形態学的変化もなかった。
【００８４】
実施例５
脂質代謝に対するＣＴ−１の効果
脂質代謝に対するＣＴ−１の可能性のある役割を判定する目的で、種々の血清脂質のレベルを、ｒＣＴ−１を６日間長期投与した後の３カ月間、高脂肪食誘起肥満のマウスで測定した。結果は表１に示されるとおりであった。
【００８５】
【表１】
【００８６】
さらに、脂肪酸およびトリグリセリドの血清レベルを、高脂肪食後の野生マウスで測定した。このために、２群の動物を使用し（ｎ＝５）、実験前の３時間の間は絶食状態とした。次に、両方の群の動物に、強制経口投与（体重の１％）により高脂肪食を投与し、血液試料を得て、ベースラインレベルを測定した。食後すぐに、静脈経路により、血清（黒三角）またはｒＣＴ−１（１０μｇ／ｍｌ）（白三角）を投与した。結果（図２１）は、どのようにｒＣＴ−１での処置が遊離脂肪酸レベル（２〜５時間後、＊Ｐ＜０．０５）（上パネル）およびトリグリセリドレベル（１〜３時間後、＊Ｐ＜０．０５）（下パネル）における顕著な減少を生じるかを示す。
【００８７】
次に、ｒＣＴ−１での処置が脂質内注射後の血清における遊離脂肪酸の除去を加速したかどうかを調べた。このために、ｒＣＴ−１を、脂質内投与の３０分間後に２群の動物（ｎ＝５）に静脈内投与した。対照動物には、生理食塩水を与えた。血清中の遊離脂肪酸の濃度を、５分後に測定した。次に、異なる時間での遊離脂肪酸の除去値を、脂質内（１００％）注射の５分後に、ＦＦＡ値に関して標準化した。図２２に示すように、ＦＦＡの無為動力学は、生理食塩水で処置したマウスとＣＴ−１で処置したマウスでは大きく異なった（ボンフェローニ解析事後の二元ＡＮＯＶＡによりＰ＜０．０５）。
【００８８】
ベータ酸化に対するｒＣＴ−１の可能性のある効果を判定するために、生理食塩水またはＣＴ−１（１０μｇ、１時間）で処置したマウスから単離した腓腹筋におけるパルミテートの酸化を測定した。結果（図２３）は、ｒＣＴ−１での急性処置が骨格筋における脂肪酸の酸化を増加することを示している。さらに、筋肉における脂肪酸の酸化に関与する遺伝子の発現レベルを、ｒＣＴ−１での急性処置（３時間）に応答したＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果（図２４）は、ｒＣＴ−１は、ＰＧＣ−１ｂ、ＣＰＴ−１、ＡＣＤ、ＡＣＯおよびＭＣＤＡ遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加を生じることを示している。転写物の各々を検出するのに必要なサイクル数を、内部対照としてのシクロフィリンに対応する数と比較し、それを生理食塩水で処置した動物における値（１．０）と比較した任意単位で表している（ｎ＝５〜６、＊Ｐ＜０．０５）。
【００８９】
実施例６
骨格筋におけるインスリン作用に対するＣＴ−１の増強効果
骨格筋は、インスリン作用に対して最も感受性のある組織であり、健康な個体では、インスリンにより刺激されたグルコース摂取が９０％である。本発明者等は、ＣＴ−１が筋肉（「生体外」および「生体内」）におけるインスリン情報伝達を高めることを示した。
【００９０】
インビボ試験は、ｒＣＴ−１での急性（１時間）または長期（２４時間）処置後のラット筋管（筋管へ分化したＬ６Ｅ９筋芽細胞）におけるインスリン誘起２−デオキシグルコース摂取およびＡＫＴリン酸化を測定することにより実施した。ＣＴ−１は、インスリン誘起２−デオキシグルコース摂取（図２５）およびインスリン誘起ＡＫＴリン酸化（図２６）を刺激することが観察された。これらのデータは、ＣＴ−１は筋肉におけるインスリンの作用を高めることを明らかにしている。これらのデータは同じファミリーＩＬ−６からのサイトカインについて公開されたものとは異なる（Ｎｉｅｔｏ−Ｖａｚｑｕｅｚ、Ｉ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００８、５７：３２１１−３２２１）。
【００９１】
さらに、「生体内」では、インスリン刺激（０．５Ｕ／マウスを下洞静脈に注射した）の３０分前に、ｒＣＴ−１（１０μｇ／マウス）を静脈内投与すると、筋肉におけるインスリン誘起ＡＫＴリン酸化が増加することが判明した（図２７）。さらに、静脈内に０．２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、６日間連続でｒＣＴ−１で長期処置したところ、ＣＴ−１で処置し、生理食塩水を注射した（Ｐａｉｒ−ｆｅｄ群）、同じ摂取量の動物と比較して筋肉組織におけるインスリンの効果が高まった（図２８）。これらの全てのデータは、骨格筋におけるインスリンの存在下でＣＴ−１には促進的役割があることを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝障害治療のための、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物。
【請求項２】
代謝障害治療用薬物を調製するための、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物の使用。
【請求項３】
前記代謝障害が、肥満、高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病および異脂肪血症からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
カルジオトロフィン１活性を誘起する、薬学的に活性な量の化合物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法。
【請求項５】
前記化合物を、急性または長期治療のために投与する、請求項１若しくは３に記載の化合物、請求項２若しくは３に記載の使用、または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
カルジオトロフィン１活性を誘起する化合物が、
（ｉ）カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、
（ｉｉ）ＣＴ−１の機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にカルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞
からなる群から選択されるものである、請求項１若しくは３に記載の化合物、請求項２若しくは３に記載の使用、または請求項４に記載の方法。
【請求項７】
カルジオトロフィン活性を誘起する化合物と抗糖尿病化合物とを、一緒または別個に含んでなる、組成物。
【請求項８】
カルジオトロフィン活性を誘起する化合物が、
（ｉ）カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、
（ｉｉ）ＣＴ−１の機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にカルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞
からなる群から選択されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗糖尿病化合物が、インスリン活性を誘起する化合物および低血糖活性を誘起する化合物および／またはインスリン活性感作剤からなる群から選択されるものである、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
インスリン活性を誘起する化合物が、
（ｉ）インスリン、
（ｉｉ）インスリンの機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）インスリンをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用の請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用薬物を調製するための、請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性、高血糖、異脂肪血症および２型糖尿病からなる群から選択されるものである、請求項７〜１０に記載の組成物または請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項７〜１０のいずれかに記載の薬学的に活性な量の組成物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法。
【請求項１５】
前記治療が、急性または長期である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
代謝障害治療のための、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物。
【請求項２】
代謝障害治療用薬物を調製するための、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物の使用。
【請求項３】
前記代謝障害が、肥満、高血糖、インスリン抵抗性、２型糖尿病および異脂肪血症からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）活性を誘起する化合物または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
カルジオトロフィン１活性を誘起する、薬学的に活性な量の化合物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法。
【請求項５】
前記化合物を、急性または長期治療のために投与する、請求項１若しくは３に記載の化合物、請求項２若しくは３に記載の使用、または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
カルジオトロフィン１活性を誘起する化合物が、
（ｉ）カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、
（ｉｉ）ＣＴ−１の機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にカルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞
からなる群から選択されるものである、請求項１若しくは３に記載の化合物、請求項２若しくは３に記載の使用、または請求項４に記載の方法。
【請求項７】
カルジオトロフィン活性を誘起する化合物と抗糖尿病化合物とを、一緒または別個に含んでなる、組成物。
【請求項８】
カルジオトロフィン活性を誘起する化合物が、
（ｉ）カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、
（ｉｉ）ＣＴ−１の機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）ＣＴ−１をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および
（ｖ）培地にカルジオトロフィン１またはその機能的に同等の変異体を分泌することができる細胞
からなる群から選択されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗糖尿病化合物が、インスリン活性を誘起する化合物および低血糖活性を誘起する化合物および／またはインスリン活性感作剤からなる群から選択されるものである、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
インスリン活性を誘起する化合物が、
（ｉ）インスリン、
（ｉｉ）インスリンの機能的に同等の変異体、
（ｉｉｉ）インスリンをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に同等の変異体、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用の請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物を、同時、別個または順次投与する、代謝障害治療用薬物を調製するための、請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性、高血糖、異脂肪血症および２型糖尿病からなる群から選択されるものである、請求項７〜１０に記載の組成物または請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項７〜１０のいずれかに記載の薬学的に活性な量の組成物を患者に投与することを含んでなる、肥満治療用美容的方法。
【請求項１５】
前記治療が、急性または長期である、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図５】
【図２０】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図５】
【図２０】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公表番号】特表２０１２−５１７４５９（Ｐ２０１２−５１７４５９Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４９６１５（Ｐ２０１１−５４９６１５）
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１０／０７００７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９２２１８
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【出願人】（５００５２２９６５）インスティトゥト シエンティフィコ イ テクノロジコ デ ナバッラ，ソシエダ アノニマ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１０／０７００７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９２２１８
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【出願人】（５００５２２９６５）インスティトゥト シエンティフィコ イ テクノロジコ デ ナバッラ，ソシエダ アノニマ (4)
【Ｆターム（参考）】
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