伸長α鎖を有するフィブリノーゲンが濃縮されたフィブリノーゲン調製物
本発明は、α伸長フィブリノーゲンが濃縮されたフィブリノーゲン調製物に関する。このような調製物を含む組成物は、典型的にはα伸長フィブリノーゲンを全く含まないか、またはごく少量含むＨＭＷ Ｆｉｂに基づく調製物と比較して改善された凝固特性を示す。具体的には、α伸長フィブリノーゲンによって作成されるクロットのクロット形成時間、およびクロット強度は改善される。さらに、α伸長フィブリノーゲンのプラスミン媒介性の変性は、血漿由来のフィブリノーゲンに比較して低減される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリノーゲン調製物および医学的適用におけるフィブリノーゲン調製物の使用に関する。具体的には、本発明は、伸長α鎖を有するフィブリノーゲンが濃縮されたフィブリノーゲン調製物に、この調製物を作製するための方法に、およびその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノーゲンは、主に肝実質細胞によって人体で合成される可溶性の血漿糖タンパク質である。フィブリノーゲンは、二量体分子であって、ジスルフィド架橋によって接続される、Ａα、Ｂβおよびγと命名された３つのポリペプチド鎖のうち２つの対から構成される。この３つのポリペプチド鎖は、３つの別々の遺伝子によってコードされる。優勢な形態（ＨＭＷ ｆｉｂ）は、Ａα鎖を保有し、Ａα鎖は、６２５個のアミノ酸前駆体として合成され、かつ６１０個のアミノ酸のポリペプチド鎖として、血漿中に見出されるフィブリノーゲン中に存在し、Ｂβ鎖は、４６１アミノ酸を含み、γ鎖は４１１アミノ酸を含む。この３つのポリペプチドは、３つのｍＲＮＡから個々に合成される。３成分の鎖（Ａα、Ｂβおよびγ）の６鎖の二量体（Ａα、Ｂβ、γ）２としてのその最終形態へ組み立て（アセンブリ）は、小胞体（ＥＲ）の内腔で生じる。
【０００３】
フィブリノーゲンは、血中で高濃度（１〜２ｇ／Ｌ）で循環し、かつ示す異質性の程度が高い。各々の個体において、約１００万の異なるフィブリノーゲン分子が循環すると推定される。フィブリノーゲン全体のうちほんのわずかな割合しか占めない（ほとんどの場合、せいぜい２〜３パーセント）、これらの改変体のほとんどが、機能および構造において異なる。
【０００４】
Ａα鎖のカルボキシ末端部分のタンパク質分解は、３つの主要な循環型の明確に異なる分子量を有するフィブリノーゲンを生じる。フィブリノーゲンは、高分子量型（ＨＭＷ；分子量３４０ｋＤａ；循環中のＡα鎖の優勢な型は６１０アミノ酸を含む）で合成される。Ａα鎖のうちの１つの分解は、ＬＭＷ型（ＭＷ＝３０５ｋＤａ）を生じ、ＬＭＷ型（２７０ｋＤａ）は、両方のＡα鎖がカルボキシ末端で部分的に分解されている改変体である。健常個体の血中では、フィブリノーゲンの５０〜７０％は、ＨＭＷであって、２０〜５０％は、１または２個のＡα鎖が分解されたフィブリノーゲンである（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。このＨＭＷおよびＬＭＷの改変体は、凝固時間およびフィブリノーゲンのポリマー構造において別個の相違を示す（Ｈａｓｅｇａｗａ Ｎ，Ｓａｓａｋｉ Ｓ．（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５７，１８３）。
【０００５】
選択的スプライシングの結果である周知の改変体は、いわゆるガンマプライム（γ’）改変体およびα−ｅｘｔ ＦｉｂまたはＦｉｂ４２０改変体である。
【０００６】
α−ｅｘｔ ＦｉｂまたはＦｉｂ４２０改変体（４２０ｋＤａの分子量を有する）は、総循環フィブリノーゲンの１〜３％を占める（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。伸長α−ｅｘｔ Ｆｉｂイソ型は、選択的スプライシングに起因して追加の２３６残基のＣ末端球状ドメインの存在によってフィブリノーゲンの従来のα鎖とは識別される。Ｆｉｂ４２０の機能および特徴に対して矛盾するデータが文献に示される。血漿由来のα−ｅｘｔ Ｆｉｂでの研究に基づいて、Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９５：２２９７は、α−ｅｘｔ Ｆｉｂの重合化および架橋特性が、血漿由来のＨＭＷ Ｆｉｂと大きく異なることはないと結論付けた。彼らは、追加のＣドメインが血液凝固に対して影響がないと結論付けており、かつ彼らは、このドメインの機能が、インテグリン媒介性の細胞接着を支持することであり得ると示唆している。欧州特許１４９５０５１号では、Ｆｉｂ４２０は、分解に対して感受性が劣る場合があり、クロット構造に対して影響を有し得ることが示唆される。しかし、実証化はされておらず、この効果がクロットの構造または強度における増強または悪化であり得るか否かに関する示唆はない。Ｍｏｓｅｓｓｏｎら（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１１２，２０９：２０４４）は、臍帯血漿由来のα−ｅｘｔ Ｆｉｂに基づくクロットの超微細構造を研究した。彼らは、α−ｅｘｔ Ｆｉｂクロットの線維がＨＭＷフィブリノーゲンに基づくクロットの線維よりも薄くかつ分岐していること、ただしそれらは、全てのフィブリン線維を特徴付ける同じ周期性を有することを報告した。著者らは、α−ｅｘｔ Ｆｉｂにおける伸長されたα鎖についての機能がおそらく、細胞のインテグリンとの相互作用のための部位を提供することであるということを示唆する。
【０００７】
詳細な説明
本発明は、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含むフィブリノーゲン調製物であって、ここでこのフィブリノーゲンのうち少なくとも１０％がＦｉｂ４２０の形態であるフィブリノーゲン調製物に関する。
【０００８】
この分野では、Ｆｉｂ４２０はまた、「α−ｅｘｔ ｆｉｂ」、「伸長α鎖を有するフィブリノーゲン」、または「フィブリノーゲン４２０」とも呼ばれる。本発明の状況では、これらの用語は交換可能に用いられる。これらの用語全てが、対称的な分子構造（Ａαｅｘｔ、Ｂβ、γ）を指し、ここではＨＭＷ ｆｉｂで見出されるような両方の従来のフィブリノーゲンα鎖は、伸長α鎖によって置き換えられている。
【０００９】
本発明の状況では、「フィブリノーゲン調製物」という用語は、単離型のフィブリノーゲン、例えば、フィブリノーゲンの血漿単離物または細胞上清単離物を指す。これは、またフィブリノーゲンの合成調製物とも呼ばれる。本発明によるフィブリノーゲン調製物は好ましくは、総タンパク質あたり、少なくとも６５％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７５％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）または少なくとも８５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含む。さらに好ましくは、これは、他のタンパク質などの混入物を実質的に含まない純粋な調製物であり、総タンパク質あたり、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９６％（ｗ／ｗ）、少なくとも９７％（ｗ／ｗ）または少なくとも９８％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンであって、これを含む。最も好ましくは、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、総タンパク質あたり、少なくとも９９％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９９．５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含む。このような純粋なフィブリノーゲン調製物は特に、創傷治療および外科的修復のための組成物などの医学的適用において用いられる組成物を製剤するために適切である。
【００１０】
本発明によれば、調製物中のフィブリノーゲンのうち少なくとも１０％（ｗ／ｗ）が、Ｆｉｂ４２０の形態である。好ましくは、フィブリノーゲンのうち少なくとも１５％（ｗ／ｗ）、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）または少なくとも３０％（ｗ／ｗ）が、Ｆｉｂ４２０の形態である。さらに好ましくは、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）が、Ｆｉｂ４２０の形態である。最も好ましくは、フィブリノーゲンのうち少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９９％（ｗ／ｗ）または全てが、Ｆｉｂ４２０の形態である。
【００１１】
本発明による、フィブリノーゲン調製物の１つの利点は、フィブリノーゲン調製物の血漿媒介性の消化が、血漿由来のフィブリノーゲンよりも遅いということである。プラスミン消化に対してその抵抗性が増強されれば、後天性の凝血障害の場合に高頻度に見られる過剰線維素溶解に罹患する患者の処置のために有益である可能性が高い。
【００１２】
本発明による、フィブリノーゲン調製物を用いれば、クロットがより速く形成され、形成されるクロットは、血漿由来のフィブリノーゲンまたはＨＭＷフィブリノーゲンで形成されるクロットよりもクロットの硬度が高い。このことは、フィブリンクロットの安定性が、本発明によるフィブリノーゲン調製物を用いる場合に増強されること、および本発明によるフィブリノーゲン調製物が、当該分野の調製物の状態よりも強力であることを意味する。さらに強力なフィブリノーゲン調製物によって、投与されるべき液体の量および治療タンパク質の量の両方とも減少することが可能になる。これは、希釈性凝固障害を処置するための静脈内の使用のために有利である。現在、低い血液凝固活性を補償するためのフィブリノーゲンの静脈内（ｉ．ｖ．）注射のためには、高用量のフィブリノーゲンが必要とされる（１処置あたり約５グラムのフィブリノーゲン）。これは、７０ｍｇ／ｋｇという用量で直接注射によって投与される。フィブリノーゲンは一般には、２０ｍｇ／ｍｌという最大濃度で溶解され得るので、このことは、約２５０ｍｌの液体を、成人に静脈内投与しなければならないことを意味する。さらに強力なフィブリノーゲンを提供することによってこの用量を低下することが有益であろう。
【００１３】
さらに別の利点は、本発明のフィブリノーゲン調製物を用いるクロット形成が、血漿由来のフィブリノーゲンまたはＨＭＷフィブリノーゲンの調製物よりも第ＸＩＩＩ因子依存性が少ないということである。α伸長Ｆｉｂによって緩衝液中で（すなわち第ＸＩＩＩ因子の非存在下で）作製されるクロットの強度は、ある程度の第ＸＩＩＩ因子を含む血漿由来のフィブリノーゲンについてよりも高い。固いクロットを形成するのに第ＸＩＩＩ因子は必要ない。従って、一実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、第ＸＩＩＩ因子を含まない。
【００１４】
α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂおよび血漿由来フィブリノーゲンの凝固時間（ＣＴ）、クロット形成時間（ＣＦＴ）およびクロットの硬度は、ＲＯＴＥＭ分析を用いて測定され得る。ＲＯＴＥＭ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とは、ＲＯｔａｔｉｏｎ ＴｈｒｏｍｂｏＥｌａｓｔｏＭｅｔｒｙを表す。この技術は、使い捨てキュベット中の（血液）サンプル中に浸漬された回転軸を利用する。異なる凝固条件下の弾力性の変化は、軸の回転の変化を生じ、この変化が、機械的なクロットのパラメーターを反映しているトロンボエラストグラムで可視化される（例えば、Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｒ．Ｊ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５ ２７（２）：８１を参照のこと）。
【００１５】
同様の条件下のＲＯＴＥＭ（登録商標）システムでは、本発明によるフィブリノーゲン調製物は典型的には、フィブリノーゲン調製物または組成物と少なくとも同じかまたはそれよりも優れて機能し、ここではフィブリノーゲン改変体の分布は、ヒト血漿における改変体分布と似ており、すなわち、フィブリノーゲンの５％（ｗ／ｗ）未満がＦｉｂ４２０型のフィブリノーゲンである。これは例えば、血漿由来のフィブリノーゲンに基づく、フィブリノーゲン濃縮物についての場合である。このような濃縮物は市販されている。具体的には、そのクロット形成時間は、フィブリノーゲンの５％（ｗ／ｗ）未満がＦｉｂ４２０型のフィブリノーゲンであるフィブリノーゲン調製物のクロット形成時間よりも短い。好ましくは、本発明によるフィブリノーゲン調製物のクロット形成時間は、血漿由来のフィブリノーゲン調製物のように、フィブリノーゲンのうち５％（ｗ／ｗ）未満がＦｉｂ４２０型であるフィブリノーゲン調製物のクロット形成時間の最大で８０％、最大で６０％、最大で５０％、最大で４０％、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％である。この実施例に示されるα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂでのＲＯＴＥＭ実験によって、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、静脈内への適用のために製造された精製血漿由来フィブリノーゲンのＣＦＴよりも短いクロット形成時間（ＣＦＴ）を有することが示される。
【００１６】
別の局面では、本発明は、本発明によるフィブリノーゲン調製物を含む組成物に関する。フィブリノーゲンに加えて、この組成物は、活性化因子、例えば、トロビンまたはトロンビン様タンパク質、例えば、レプチラーゼを含んでもよい。この組成物はまた、注射用調製物での使用に適切である賦形剤も含んでもよい。この調製物は、乾燥型であって、その後に例えば、緩衝生理食塩水などで再構成されてもよいし、または懸濁液もしくは溶液のいずれかとして液体型であってもよい。適切な賦形剤の物質としては、溶媒および共溶媒、例えば、エタノール、グリセリン、ＰＥＧ類、油類など；可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤または増粘剤類、例えば、カルボキシメチルセルロース、加水分解ゼラチン、プルロニック類、ポリソルベート類など；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡカルシウム、ＤＴＰＡなど；抗酸化剤類および還元剤類、例えば、ＢＨＴ、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムなど；抗菌性保存剤類、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、パラベン類など；緩衝液類およびｐＨ調節剤類、例えば、トロメタミン、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなど；増量剤類、保護剤類および等張化剤類、例えば、アラニン、アルブミン、デキストラン、ラクトース、ソルビトール、塩化ナトリウム、ヒスチジンなど；専門的な添加物、例えば、消泡剤としてのシメチコン、タンパク質凝集の軽減のためのトレハロースを挙げることができる。
【００１７】
この組成物は、血漿由来または組み換えのフィブリノーゲンが用いられる任意の適用で用いられ得る。この主要な適用は、止血および組織のシーリングである。本発明の一実施形態では、この組成物は、薬学的組成物である。この薬学的組成物は、本発明によるフィブリノーゲン調製物および薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」とは、本発明のフィブリノーゲン調製物とともに投与される、ビヒクル、補助剤、アジュバント、希釈剤、賦形剤または担体を指す。薬学的に許容される担体の例としては、限定するものではないが、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油類、界面活性剤類、懸濁剤類またはそれらの適切な混合物類が挙げられる。適切な薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）に記載される。
【００１８】
薬学的組成物は局所的に適用されてもよいし、水溶性、吸水性、水不溶性または水膨潤性である担体を含んでもよい。適切な材料としては、糖類、例えば、単糖類および二糖類、例としては、ラクトース、マンニトールおよびトレハロース、またはデキストランおよびデキストランポリマー類、例としては、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（種々の粒径で利用可能である）、デンプン類、プルラン誘導体類、ヒアルロン酸エステル類などが挙げられる。セルロース製品、例えば、微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌの領域）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、超微粒セルロースまたはヒドロキシプロピルセルロース、および他の物質、例えば、架橋ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を単独で、または混合して用いてもよい。また、適切な担体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（好ましくは、約１０００という分子量を有する）；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（好ましくは、約５０，０００という平均分子量を有する）；ポリ（アクリル酸）、ＰＶＡ、ポリ（メチルビニルエーテルｃｏ−マレイン酸無水物）、ポリ（エチレンオキシド）、およびデキストラン（典型的には約４０，０００という平均分子量を有する）が挙げられる。
【００１９】
錠剤分解物質が含まれてもよい。これらの物質は、傷口から水分を吸収し、急速に膨らんで、それによって粉末混合物の止血成分の水和性を増強する。適切な例としては、３５〜５５μｍの範囲の平均粒径を有するデンプングリコール酸ナトリウム（Ｅｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）またはＰｒｉｍｏｊｅｌ（登録商標））が挙げられる。約２５％のグルコース単位が、カルボキシメチル化され；架橋ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標））；アルギン酸塩およびアルギン酸；架橋カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ）である。用いられ得るゴムおよびゲル化剤としては、例えば、トラガカント、カラヤゴム、可溶性デンプン、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、およびジェランガムが挙げられる。
【００２０】
特に好ましい添加物は、Ｅｍｅｄｅｘ（登録商標）、すなわち、デクストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）（少量のデンプンオリゴ糖類を含む噴霧結晶化デキストロース）の水和型である。これは、１９０〜２２０μｍの中央粒径を有する、白色、自由流動性、噴霧結晶化多孔性球体から構成される極めて微細な製品である。
【００２１】
最も好ましい添加物は、ＮＯＮ−ＰＡＲＥＩＬ ＳＥＥＤＳ（登録商標）：（Ｓｕｇａｒ Ｓｐｈｅｒｅｓ）である。これらは、含量均一性の改善、一貫してかつ制御された薬物放出および高い薬物安定性、２００〜２０００ｎｍのサイズ範囲のために複数の薬物単位で用いられる。
【００２２】
薬学的に許容される担体は、発泡性の対を含んでもよい。発泡性の反応の後に生じるガスは、フィブリンシーラントを「泡状物」に膨らませるか、および／またはフィブリンシーラントを含む粉末の水和性を増大し得る。粉末が創傷に適用されれば、発泡性の成分は、溶解し、反応して、例えば、二酸化炭素を放出し、それによって止血成分の水和性を増大し、従って、クロット形成までの時間を増大し得る。このフィブリンシーラントは、一旦完全に反応されてクロットが形成されれば、安定な泡状物として出現する。
【００２３】
発泡性の対は典型的には、クエン酸またはクエン酸水素ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムを含むが、ただし、他の生理学的に許容される酸／アルカリまたはアルカリ土類金属炭酸塩混合物、例えば、酒石酸、アジピン酸、フマル酸またはマレイン酸、およびナトリウム、カリウムまたはカルシウム（重）炭酸塩またはグリシン炭酸ナトリウムを用いてもよい。
【００２４】
一般には、化学的な分子当量に基づく発泡性の対の成分の相対的な割合が、酸性成分対塩基性成分の分子当量の比として表して、４：３〜１：３、より好ましくは約２：３の範囲である場合に、好ましい風味の特徴が示されることが見出された。クエン酸および重炭酸ナトリウムの好ましい組み合わせに関して、これらの値は、重量あたりで、酸性成分対塩基性成分の比として表して、１：１〜０．３：１、好ましくは０．５：１の範囲である。
【００２５】
本発明による薬学的組成物は、組織接着を容易にするか、創傷治癒を改善するか、または静脈内投与のために適切である。
【００２６】
一実施形態では、本発明による薬学的組成物は、フィブリンシーラントである。本発明によるフィブリンシーラントは典型的には、トロンビンを含む。このシーラントは、任意の従来の形態であってもよく、乾燥されても液体であってもよい。本発明によるフィブリノーゲン調製物が用いられ得る乾燥シーラントの適切な例は、Ｆｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）粉末シーラントであり、これはＷＯ９７／４４０１５に記載されており、フィブリノーゲンおよびトロンビンのマイクロ粒子に基づく。別々の成分が、噴霧乾燥、フィブリノーゲンとトレハロースおよびトロンビンとトレハロースによって調製される。各々の粉末成分は、直径で最大でほぼ５０μｍの優勢な粒径を有する。これらの成分の混合物であるＦｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）フィブリンシーラントは、使いやすく、安定かつ有効な局所止血であることが示された。この製品は、再構成することなく直ちに用いられ、創傷治療において、外科的修復において、および血管外ステントとして有用である。血液などの水性の液体との接触の際、露出された活性トロンビンは、露出されたフィブリノーゲンを不溶性のフィブリンポリマーに変換する。本発明によるフィブリノーゲン調製物は、さらに改善された血液凝固特性を示す。
【００２７】
本発明の組成物は、創傷、縫合、切開および出血が生じ得る他の開口に適用され得る。創傷としては、生きている生物体における任意の組織に対する障害が挙げられる。組織は、内部組織（例えば、臓器）または外部組織（例えば、眼または皮膚）であってもよく、硬組織（例えば、骨）であっても、または軟組織（例えば、肝臓または脾臓）であってもよい。創傷は、感染、外科的介入、火傷または外傷を含む任意の因子によって生じた場合もある。本発明の組成物は、胃腸系、例えば、食道、胃、小腸、大腸、直腸において、実質器官、例えば、肝臓、膵臓、脾臓、肺、腎臓、副腎、リンパ腺および甲状腺に対するなどのような外科的介入；耳、鼻および咽頭領域（ＥＮＴ）における外科的介入、例としては、歯科手術、心血管系手術、美顔成形手術、神経学的手術、リンパ、胆管および脳脊髄（ＣＳＦ）瘻孔、胸腔および肺の手術の間の空気漏れ、胸部手術、例としては、気管、気管支および肺の手術、婦人科、血管、泌尿器、骨（例えば、海綿骨切除）および緊急の手術のために用いられ得る。
【００２８】
血管外ステントまたは支持体として、本発明の組成物は、静脈移植血管のセグメントまたは全体の外側に適用され得る。適切な血管外ステント組成物は、本発明によるフィブリノーゲン調製物およびトロンビンの組成物である。この組成物は、任意の適切な形態であっても、液体であってもまたは乾燥型であってもよい。一実施形態では、乾燥粉末組成物、例えば、上記のような組成物が、血管外ステントとして用いられる。乾燥粉末組成物は、血管壁の外側に通常存在する限られた量の体液中で重合化し、これによって血管外ステントを形成する。
【００２９】
本発明による血管外ステント組成物でコーティングされた血管（静脈）もまた本発明の一部である。この血管（静脈）は、過伸展から保護される必要があるか、または支持を必要とする任意の種類の血管、例えば、静脈瘤であり得る。好ましい実施形態では、この血管（静脈）は、静脈グラフトである。一実施形態では、この組成物は、静脈グラフトがヒトまたは動物の体に導入される前に適用される。別の実施形態では、この組成物は、静脈グラフトがヒトまたは動物の体に導入された後に適用される。
【００３０】
さらに別の局面では、本発明は、医薬としての本発明によるフィブリノーゲン調製物の使用に関する。これは、急性出血の症状、過剰線維素溶解症、フィブリノーゲン欠損症（後天性であっても先天性であってもよい）、または他の出血障害の処置のための医薬の調製のために用いられ得る。
【００３１】
一実施形態では、本発明による組成物は、出血部位での出血を軽減するための方法で用いられる。好ましくは、本発明による組成物の止血に有効な量が用いられる。局所止血剤として用いられる場合、約１０分以下、約５分以下、または約３分以下という止血時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（ＴＴＨ）が達成され得る。本発明の状況では、ＴＴＨは、出血が停止するのにかかる時間である。圧迫シートを用いる場合、ＴＴＨの測定は典型的には、圧迫シートを出血部位に適用した時点で開始し、包帯を観て出血が停止するまで、および／または包帯を通じてもしくは包帯の周囲に出血が観察されなくなるまで行う。
【００３２】
さらに別の局面では、本発明は、本発明によるフィブリノーゲン調製物を調製するための方法に関する。このような調製物は、当該分野で利用可能な技術を用いて任意の適切な方式で調製され得る。経済的に実現可能な方法でα−ｅｘｔ Ｆｉｂを生成するために、高発現レベルのインタクトな機能的なフィブリノーゲンが必要であり、従って組み換え生成が好ましい。本発明の状況では、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン鎖は、アミノ酸配列が、必要に応じて、正常な細胞（分泌）プロセシングの間に除去されるアミノ酸なしに、ヌクレオチド配列によってコードされた全てのアミノ酸を含む場合に、「インタクトな形態」である。従って、８６６または８４７個のアミノ酸を有するα−ｅｘｔ鎖は、インタクトな形態のアミノ酸の例である。
【００３３】
フィブリノーゲンの組み換え生成は、血漿由来の物質の使用を上回る多くの利点を有する。これらとしては、その好ましい安全性プロフィール、任意の他の血液由来混入物のない改変体の純粋な均一な調製物を作製する能力、および制限のない供給が挙げられる。さらに、特定の適用（例えば、静脈内止血剤としてのフィブリノーゲンの使用）に関しては、適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）が必要である。従って、真核生物における、特定の哺乳動物系における、さらに詳細にはヒトの系における発現が好ましい。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、以下の工程：
−核酸配列であってフィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する工程と；
−この発現ベクターを用いて真核生物細胞を形質転換する工程と；
−フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードする核酸配列の発現を可能にするような条件下でこの形質転換された真核生物細胞を維持する工程と；
を包含する方法によって調製される。
【００３５】
真核生物宿主の発現ベクターは、当該分野で公知であり、真核生物細胞での発現に従来用いられる任意のベクターが用いられてもよい。発現ベクターは典型的には、発現されるべき核酸配列に対して作動可能に連結されたプロモーター、およびリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節性ドメインおよびエンハンサーを含む。一実施形態では、哺乳動物細胞における発現のため、例えば、ＣＨＯまたはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のための発現ベクターが用いられる。このようなベクターは、当該分野で公知であり、適切な例としては、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＦＮベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）および多数の他のベクター系が挙げられる。
【００３６】
本発明の状況では、「フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖」とは、シグナル配列を有する８６６アミノ酸のフィブリノーゲンα鎖、またはシグナル配列なしのフィブリノーゲンα鎖、ならびに遺伝的多型性またはグリコシル化およびリン酸化における相違を通じて生じたそれらの任意の改変体を指す場合がある。α伸長鎖アミノ酸配列の適切な例は、配列番号１に示される。「α鎖」および「Ａα鎖」という用語は、本発明の状況では交換可能に用いられる。
【００３７】
当業者は、真核生物細胞がまた、フィブリノーゲン分子を生成できるためには、フィブリノーゲンのβ鎖およびγ鎖をコードする核酸配列を含まなければならないということを理解する。α、βおよびγ鎖由来のフィブリノーゲンの組み換え生成は、以前に記載されており、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８７５４、米国特許第６，０３７，４５７号またはＷＯ９５／０２３８６８号を参照のこと。
【００３８】
本発明の状況では、「β鎖」および「Ｂβ鎖」という用語は、交換可能に用いられる。それらの鎖は、シグナル配列の有無がある、β鎖の野生型および改変体の両方を指す場合がある。フィブリノーゲンβ鎖のアミノ酸配列の適切な例は、配列番号２に示される。
【００３９】
本発明の状況では、「ガンマ鎖」および「γ鎖」という用語は交換可能に用いられる。それらは、シグナル配列の有無の、γ鎖の野生型および改変体の両方を指す場合がある。フィブリノーゲンγ鎖アミノ酸配列の適切な例は、配列番号３および配列番号４に示される。
【００４０】
好ましくは、フィブリノーゲン鎖をコードする核酸配列は最適化される。最適化された核酸配列は、組み換えフィブリノーゲンの効果的な発現をインタクトな形態で可能にする。好ましくは、それらの配列は、真核生物細胞培養系での発現のために、例えば、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞または昆虫細胞培養系における発現のために最適化される。さらに好ましくは、それらは、哺乳動物細胞培養系における発現のために最適化される。最も好ましくは、この核酸配列は、ヒト細胞培養系における発現のために、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞培養系のために最適化される。最適化されるヌクレオチド配列は、ＤＮＡであってもまたはＲＮＡであってもよい。好ましくは、これはｃＤＮＡである。
【００４１】
フィブリノーゲンα伸長のβ鎖またはγ鎖をコードする最適化ヌクレオチド配列は、そのそれぞれの非最適化対応物に対して少なくとも７０％の同一性を示す。一実施形態では、フィブリノーゲンα−ｅｘｔ Ｆｉｂ、Ｂβおよびγ鎖をコードする最適化ヌクレオチド配列は、そのそれぞれの非最適化配列に対して７０〜８０％の同一性を示す。好ましくは、フィブリノーゲンα伸長のβ鎖またはγ鎖をコードするこの最適化ヌクレオチド配列は、ｃｉｓ作用性部位、例えば、スプライス部位およびポリ（Ａ）シグナルを含まない。
【００４２】
本発明による方法で用いられ、フィブリノーゲンα伸長鎖をコードする、最適化ヌクレオチド配列は、ヒトフィブリノーゲンのα鎖をコードする遺伝子中に正常には存在する３９塩基対の直接反復配列を含まない。反復性配列は、コードされたタンパク質配列を変化することなく変化されなければならない。
【００４３】
好ましい実施形態では、配列番号５による最適化されたヌクレオチド配列、またはシグナルなしのこの配列の一部（ヌクレオチド６０〜２５９８）が、α伸長鎖を発現するために用いられる。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、配列番号６による最適化されたヌクレオチド配列、またはシグナルなしのこの配列の一部（ヌクレオチド９３〜１４７３）が、β鎖を発現するために用いられる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、配列番号７または８による最適化されたヌクレオチド配列、またはシグナル配列なしのこれらの配列の一部（配列番号７のヌクレオチド５１〜１３１１および配列番号８のヌクレオチド５１〜１３５９）が、γ鎖を発現するために用いられる。
【００４６】
本発明による核酸配列は、任意の種類のフィブリノーゲン鎖をコードし得る。好ましくはそれらの配列は、哺乳動物フィブリノーゲン鎖をコードしており、さらに好ましくは、それらは、霊長類のフィブリノーゲン鎖をコードしており、最も好ましくは、それらは、ヒトフィブリノーゲン鎖をコードしている。また組み合わせ、例えば、２つまたは１つのげっ歯類のフィブリノーゲン鎖と組み合された１つまたは２つの哺乳動物フィブリノーゲン鎖なども可能である。本発明の方法による組み換え発現によって、組み換えＨＭＷ Ｆｉｂの発現レベルと同様であるＦｉｂ４２０の発現レベルが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ウエスタンブロット分析。レーン１は、血漿由来の野生型フィブリノーゲン（ＦＩＢ３，Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むコントロールである。レーン２は、α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂを発現するＰＥＲ．Ｃ６クローンであるクローンＷ１１５の培養上清を含む。分子量マーカー（ＭＷ）は左側に示される。
【図２】ＲＯＴＥＭ分析。凝固時間、クロット形成時間およびクロット硬度は、ＲＯＴＥＭ分析によって決定した。左側のパネルは、緩衝液中のフィブリノーゲン調製物を示し、右のパネルは、フィブリノーゲン調製物と１：１混合された血漿を示す。２Ａ：緩衝液中の血漿由来のフィブリノーゲン（Ｈａｅｍａｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；２Ｂ：緩衝液中のＰＥＲ．Ｃ６由来の組み換えＨＭＷフィブリノーゲン（α−６２５）；２Ｃ：緩衝液中のＰＥＲ．Ｃ６由来のｒｈＦｉｂ−ｅｘｔフィブリノーゲン（α−８４７）；２Ｄ：血漿と混合された血漿由来のフィブリノーゲン（Ｈａｅｍａｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；２Ｅ：血漿と混合されたＰＥＲ．Ｃ６由来の組み換えＨＭＷフィブリノーゲン（α−６２５）；２Ｆ：血漿と混合されたＰＥＲ．Ｃ６由来のｒｈＦｉｂ−ｅｘｔフィブリノーゲン（α−８４７）；
【図３】この図は、プラスミン分解の血漿由来の物質由来の物質（ＥＲＬ ＦＩＢ３；上部パネル、およびα−ｅｘｔ Ｆｉｂ（下部パネル）をロードされたクーマシー染色されたタンパク質ゲルを示す。この条件は、ゲルの上に示しており；インキュベーションの時間（０、１、５、３０、６０および１２０分およびｏ／ｎ（一晩））も同様に示される。ゲルの右側には、ＭＷマーカーを示す。
【００４８】
実施例
実施例１
最適化ｃＤＮＡ構築物の調製
α−ｅｘｔ Ｆｉｂ（Ｆｉｂ４２０）、Ｂβおよびγのヒトフィブリノーゲンポリペプチド鎖をコードするｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるコドン最適化形式で合成した：（ｉ）ｃｉｓ−作用性部位（スプライス部位、ポリ（Ａ）シグナル）を取り除いた；（ｉｉ）Ａα鎖の反復配列を改変した；（ｉｉｉ）ＧＣ含量をｍＲＮＡ半減期の伸長のために増大した；（ｉｖ）コドン用法は、ＣＨＯ（コドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）−ＣＡＩ−＞０．９５）に適合した。
α−ｅｘｔ Ｆｉｂ（配列番号５）、Ｂβ（配列番号６）およびγ（配列番号６）鎖のコドン最適化ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体中にサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏ中のＡα伸長（Ｆｉｂ４２０）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏ中のＢβ鎖およびｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ中のγ鎖（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＵＳＡ）。
【００４９】
実施例２
組み換えヒトα−ｅｘｔＦｉｂを発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞株
組み換えヒトフィブリノーゲンを産生するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の生成は、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８７５４において以前に記載されるのと同様である。要約すれば、細胞をＭＡｂ培地中において懸濁物中で培養して、ＡＭＡＸＡヌクレオフェクションデバイス（ｐｒｏｍｅｇａＡ−２７）を用い、そしてヒトフィブリノーゲンタンパク質の３つの異なる鎖（Ａα−ｅｘｔ、Ｂβおよびγ鎖）をコードしており、かつ最適化ｃＤＮＡ鎖（それぞれ、配列番号５、配列番号６および配列番号７）を含んでいる３つのベクターを備える、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴを用いて、トランスフェクトした。
【００５０】
９６ウェルプレート中でのトランスフェクションおよびプレートの後、３２５個のクローンを４８ウェルプレート中にトランスファーして、スクリーニングした。増殖経路の終わりに、２４個のクローンを振盪フラスコに移して、そのうちの８つを、連続バッチ培養試験において、安定性および発現分析のために選択した。
【００５１】
バッチ培養における収率は、６１０または６２５のアミノ酸のフォーマットにおいてＡα鎖を発現する細胞株で得られた収率と同様であって、このことは、Ａα鎖の伸長が発現レベルを損なわないことを示す。これは、事前には予想されなかった。なぜなら血漿由来のフィブリノーゲンは、６１０／６２５Ａα鎖含有のフィブリノーゲンに比較して伸長Ａα鎖を１〜３％しか含まないからである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を用いるタンパク質分析によって、組み換えフィブリノーゲンが、予想の大きさのα鎖を有するインタクトな形式で生成されることが示される（図１）。
【００５２】
実施例３
ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養培地からのα伸長フィブリノーゲンの精製
組み換えヒトα伸長フィブリノーゲンは、標準的方法によって細胞培養上清から精製した。要するに、（ＮＨ４）２ＳＯ４を培養上清に対して４０％飽和まで添加して、沈殿物を遠心分離によって収集した。引き続き、沈殿物を、ＴＭＡＥローディング緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中に溶解し、続いて同じ緩衝液に対して透析した。次いで、このタンパク質溶液を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（ｍ）４０〜９０μｍ（３ｍｌ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｏｌｕｍｎ上にロードした。組み換えヒトα伸長フィブリノーゲンをその後に、２０カラム容積中で０〜１ＭのＮａＣｌの連続塩勾配を用いて溶出した。ピーク画分中の組み換えヒトフィブリノーゲンを、４０％飽和まで（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加することによって再度沈殿し、遠心分離によって収集した。最後に、その物質をＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、ＴＢＳに対して透析して、残留する（ＮＨ４）２ＳＯ４を除いた。
【００５３】
実施例４
ＲＯＴＥＭ分析
α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂおよび血漿由来フィブリノーゲンの凝固時間（ＣＴ）、クロット形成時間（ＣＦＴ）およびクロット硬度を、ＲＯＴＥＭ分析を用いて測定した。ＲＯＴＥＭ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とは、ＲＯｔａｔｉｏｎ ＴｈｒｏｍｂｏＥｌａｓｔｏＭｅｔｒｙを表す。この技術は、使い捨てキュベット中の（血液）サンプル中に浸漬された回転軸を利用する。異なる凝固条件下の弾力性の変化は、軸の回転の変化を生じ、この変化が、機械的なクロットのパラメーターを反映しているトロンボエラストグラムで可視化される（例えば、Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｒ．Ｊ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５ ２７（２）：８１を参照のこと）。
【００５４】
プールした正常な（クエン酸塩）血漿を、血漿由来のフィブリノーゲン（Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＰＥＲ．Ｃ６フィブリノーゲン（ＨＭＷ ｒｈＦｉｂまたはα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂ）と、全て２ｍｇ／ｍｌでＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．００１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、１：１混合した。またフィブリノーゲン調製物（ＴＢＳＴ中で２ｍｇ／ｍｌ）を直接用いた。ＣａＣｌ２を、１７ｍＭ（血漿中の測定値）または１．７ｍＭ（緩衝液中の測定値）という最終濃度まで添加した。凝固を開始するため、αトロンビンを１ＩＵ／ｍｌという最終濃度まで添加した。凝固を開始するために、αトロンビンを１ＩＵ／ｍｌという最終濃度まで添加した。緩衝液中のまたは血漿と１：１混合したフィブリノーゲン調製物についてのＲＯＴＥＭ（登録商標）分析グラフを図２に示す。Ａ１０、Ａ２０、ＣＦＴおよびＭＣＦの値（ｍｍ）を表１に示す。Ａ１０およびＡ２０は、α−トロンビン添加後１０分および２０分のクロットの硬度に相当する。ＣＦＴは、凝固の開始から２０ｍｍというクロット硬度が検出されるまでの時間に相当する。ＭＣＦは、最大クロット硬度に相当する。
【００５５】
この結果、緩衝液中のα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂの凝固は、ＨＭＷ ｒｈＦｉｂで観察される（Ａ１０＝４ｍｍ）よりも強力なクロット（Ａ１０＝１２ｍｍ）を生じることが示される。血漿由来のフィブリノーゲンは、１５ｍｍというＡ１０を有し；緩衝液中のこのさらに強力なクロット形成は、フィブリン単量体を（部分的に）架橋する、同時精製された血液由来の第ＸＩＩＩ因子の活性によって説明され得る。精製された組み換えフィブリノーゲンでは、第ＸＩＩＩ因子が存在し、従って架橋は生じ得ない。これは、希釈された血漿（第ＸＩＩＩ因子を含む）中で実験を行うことによって補償され得る。この場合、より強力なクロットが形成される。興味深いことに、この状況では、α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂはより強力なクロットを形成し、ＨＭＷ ｒｈＦｉｂまたは血漿由来のＦｉｂよりも速くクロットを形成し、これは、それぞれ２１、１８および１７ｍｍというＡ２０値である。
【００５６】
【表１】
【００５７】
実施例５
α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂおよび血漿由来のフィブリノーゲンのプラスミン消化
精製組み換えヒトα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂの線維素原溶解を、プラスミンでのインキュベーションによって試験した。要するに、フィブリノーゲンをＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中に希釈し、ＣａＣｌ２またはＥＤＴＡを添加し（５ｍＭの最終濃度）、プラスミンを添加し（１０ｎＭの最終濃度）、続いて３７℃でインキュベーションした。時間中のいくつかのポイントで、サンプルを採取して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液とただちに混合した（ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプル緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＮＰ００００７）。次いで、サンプルを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ３〜８％ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＷＧ１６０２）上でサイズ分離に供した。タンパク質は、クーマシー染色（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＬＣ６０６０）によって可視化した。
【００５８】
この結果、図４に示すとおり、α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂのプラスミン媒介性消化が、血漿由来のフィブリノーゲンについてよりも有意に遅いことが示される。例えば、Ｃａ２＋の存在下では、６０分後、全ての血漿由来フィブリノーゲンが、フラグメントＤおよびＥの種に分解される。α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂについては、これには１２０分よりもかかり、わずか一晩のインキュベーションでさえ、３０分後血漿由来のフィブリノーゲンの消化に既に存在する、実質的な量のフラグメントＥ生成が示される。
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリノーゲン調製物および医学的適用におけるフィブリノーゲン調製物の使用に関する。具体的には、本発明は、伸長α鎖を有するフィブリノーゲンが濃縮されたフィブリノーゲン調製物に、この調製物を作製するための方法に、およびその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノーゲンは、主に肝実質細胞によって人体で合成される可溶性の血漿糖タンパク質である。フィブリノーゲンは、二量体分子であって、ジスルフィド架橋によって接続される、Ａα、Ｂβおよびγと命名された３つのポリペプチド鎖のうち２つの対から構成される。この３つのポリペプチド鎖は、３つの別々の遺伝子によってコードされる。優勢な形態（ＨＭＷ ｆｉｂ）は、Ａα鎖を保有し、Ａα鎖は、６２５個のアミノ酸前駆体として合成され、かつ６１０個のアミノ酸のポリペプチド鎖として、血漿中に見出されるフィブリノーゲン中に存在し、Ｂβ鎖は、４６１アミノ酸を含み、γ鎖は４１１アミノ酸を含む。この３つのポリペプチドは、３つのｍＲＮＡから個々に合成される。３成分の鎖（Ａα、Ｂβおよびγ）の６鎖の二量体（Ａα、Ｂβ、γ）２としてのその最終形態へ組み立て（アセンブリ）は、小胞体（ＥＲ）の内腔で生じる。
【０００３】
フィブリノーゲンは、血中で高濃度（１〜２ｇ／Ｌ）で循環し、かつ示す異質性の程度が高い。各々の個体において、約１００万の異なるフィブリノーゲン分子が循環すると推定される。フィブリノーゲン全体のうちほんのわずかな割合しか占めない（ほとんどの場合、せいぜい２〜３パーセント）、これらの改変体のほとんどが、機能および構造において異なる。
【０００４】
Ａα鎖のカルボキシ末端部分のタンパク質分解は、３つの主要な循環型の明確に異なる分子量を有するフィブリノーゲンを生じる。フィブリノーゲンは、高分子量型（ＨＭＷ；分子量３４０ｋＤａ；循環中のＡα鎖の優勢な型は６１０アミノ酸を含む）で合成される。Ａα鎖のうちの１つの分解は、ＬＭＷ型（ＭＷ＝３０５ｋＤａ）を生じ、ＬＭＷ型（２７０ｋＤａ）は、両方のＡα鎖がカルボキシ末端で部分的に分解されている改変体である。健常個体の血中では、フィブリノーゲンの５０〜７０％は、ＨＭＷであって、２０〜５０％は、１または２個のＡα鎖が分解されたフィブリノーゲンである（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。このＨＭＷおよびＬＭＷの改変体は、凝固時間およびフィブリノーゲンのポリマー構造において別個の相違を示す（Ｈａｓｅｇａｗａ Ｎ，Ｓａｓａｋｉ Ｓ．（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５７，１８３）。
【０００５】
選択的スプライシングの結果である周知の改変体は、いわゆるガンマプライム（γ’）改変体およびα−ｅｘｔ ＦｉｂまたはＦｉｂ４２０改変体である。
【０００６】
α−ｅｘｔ ＦｉｂまたはＦｉｂ４２０改変体（４２０ｋＤａの分子量を有する）は、総循環フィブリノーゲンの１〜３％を占める（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。伸長α−ｅｘｔ Ｆｉｂイソ型は、選択的スプライシングに起因して追加の２３６残基のＣ末端球状ドメインの存在によってフィブリノーゲンの従来のα鎖とは識別される。Ｆｉｂ４２０の機能および特徴に対して矛盾するデータが文献に示される。血漿由来のα−ｅｘｔ Ｆｉｂでの研究に基づいて、Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９５：２２９７は、α−ｅｘｔ Ｆｉｂの重合化および架橋特性が、血漿由来のＨＭＷ Ｆｉｂと大きく異なることはないと結論付けた。彼らは、追加のＣドメインが血液凝固に対して影響がないと結論付けており、かつ彼らは、このドメインの機能が、インテグリン媒介性の細胞接着を支持することであり得ると示唆している。欧州特許１４９５０５１号では、Ｆｉｂ４２０は、分解に対して感受性が劣る場合があり、クロット構造に対して影響を有し得ることが示唆される。しかし、実証化はされておらず、この効果がクロットの構造または強度における増強または悪化であり得るか否かに関する示唆はない。Ｍｏｓｅｓｓｏｎら（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１１２，２０９：２０４４）は、臍帯血漿由来のα−ｅｘｔ Ｆｉｂに基づくクロットの超微細構造を研究した。彼らは、α−ｅｘｔ Ｆｉｂクロットの線維がＨＭＷフィブリノーゲンに基づくクロットの線維よりも薄くかつ分岐していること、ただしそれらは、全てのフィブリン線維を特徴付ける同じ周期性を有することを報告した。著者らは、α−ｅｘｔ Ｆｉｂにおける伸長されたα鎖についての機能がおそらく、細胞のインテグリンとの相互作用のための部位を提供することであるということを示唆する。
【０００７】
詳細な説明
本発明は、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含むフィブリノーゲン調製物であって、ここでこのフィブリノーゲンのうち少なくとも１０％がＦｉｂ４２０の形態であるフィブリノーゲン調製物に関する。
【０００８】
この分野では、Ｆｉｂ４２０はまた、「α−ｅｘｔ ｆｉｂ」、「伸長α鎖を有するフィブリノーゲン」、または「フィブリノーゲン４２０」とも呼ばれる。本発明の状況では、これらの用語は交換可能に用いられる。これらの用語全てが、対称的な分子構造（Ａαｅｘｔ、Ｂβ、γ）を指し、ここではＨＭＷ ｆｉｂで見出されるような両方の従来のフィブリノーゲンα鎖は、伸長α鎖によって置き換えられている。
【０００９】
本発明の状況では、「フィブリノーゲン調製物」という用語は、単離型のフィブリノーゲン、例えば、フィブリノーゲンの血漿単離物または細胞上清単離物を指す。これは、またフィブリノーゲンの合成調製物とも呼ばれる。本発明によるフィブリノーゲン調製物は好ましくは、総タンパク質あたり、少なくとも６５％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７５％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）または少なくとも８５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含む。さらに好ましくは、これは、他のタンパク質などの混入物を実質的に含まない純粋な調製物であり、総タンパク質あたり、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９６％（ｗ／ｗ）、少なくとも９７％（ｗ／ｗ）または少なくとも９８％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンであって、これを含む。最も好ましくは、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、総タンパク質あたり、少なくとも９９％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９９．５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含む。このような純粋なフィブリノーゲン調製物は特に、創傷治療および外科的修復のための組成物などの医学的適用において用いられる組成物を製剤するために適切である。
【００１０】
本発明によれば、調製物中のフィブリノーゲンのうち少なくとも１０％（ｗ／ｗ）が、Ｆｉｂ４２０の形態である。好ましくは、フィブリノーゲンのうち少なくとも１５％（ｗ／ｗ）、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）または少なくとも３０％（ｗ／ｗ）が、Ｆｉｂ４２０の形態である。さらに好ましくは、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）が、Ｆｉｂ４２０の形態である。最も好ましくは、フィブリノーゲンのうち少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９９％（ｗ／ｗ）または全てが、Ｆｉｂ４２０の形態である。
【００１１】
本発明による、フィブリノーゲン調製物の１つの利点は、フィブリノーゲン調製物の血漿媒介性の消化が、血漿由来のフィブリノーゲンよりも遅いということである。プラスミン消化に対してその抵抗性が増強されれば、後天性の凝血障害の場合に高頻度に見られる過剰線維素溶解に罹患する患者の処置のために有益である可能性が高い。
【００１２】
本発明による、フィブリノーゲン調製物を用いれば、クロットがより速く形成され、形成されるクロットは、血漿由来のフィブリノーゲンまたはＨＭＷフィブリノーゲンで形成されるクロットよりもクロットの硬度が高い。このことは、フィブリンクロットの安定性が、本発明によるフィブリノーゲン調製物を用いる場合に増強されること、および本発明によるフィブリノーゲン調製物が、当該分野の調製物の状態よりも強力であることを意味する。さらに強力なフィブリノーゲン調製物によって、投与されるべき液体の量および治療タンパク質の量の両方とも減少することが可能になる。これは、希釈性凝固障害を処置するための静脈内の使用のために有利である。現在、低い血液凝固活性を補償するためのフィブリノーゲンの静脈内（ｉ．ｖ．）注射のためには、高用量のフィブリノーゲンが必要とされる（１処置あたり約５グラムのフィブリノーゲン）。これは、７０ｍｇ／ｋｇという用量で直接注射によって投与される。フィブリノーゲンは一般には、２０ｍｇ／ｍｌという最大濃度で溶解され得るので、このことは、約２５０ｍｌの液体を、成人に静脈内投与しなければならないことを意味する。さらに強力なフィブリノーゲンを提供することによってこの用量を低下することが有益であろう。
【００１３】
さらに別の利点は、本発明のフィブリノーゲン調製物を用いるクロット形成が、血漿由来のフィブリノーゲンまたはＨＭＷフィブリノーゲンの調製物よりも第ＸＩＩＩ因子依存性が少ないということである。α伸長Ｆｉｂによって緩衝液中で（すなわち第ＸＩＩＩ因子の非存在下で）作製されるクロットの強度は、ある程度の第ＸＩＩＩ因子を含む血漿由来のフィブリノーゲンについてよりも高い。固いクロットを形成するのに第ＸＩＩＩ因子は必要ない。従って、一実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、第ＸＩＩＩ因子を含まない。
【００１４】
α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂおよび血漿由来フィブリノーゲンの凝固時間（ＣＴ）、クロット形成時間（ＣＦＴ）およびクロットの硬度は、ＲＯＴＥＭ分析を用いて測定され得る。ＲＯＴＥＭ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とは、ＲＯｔａｔｉｏｎ ＴｈｒｏｍｂｏＥｌａｓｔｏＭｅｔｒｙを表す。この技術は、使い捨てキュベット中の（血液）サンプル中に浸漬された回転軸を利用する。異なる凝固条件下の弾力性の変化は、軸の回転の変化を生じ、この変化が、機械的なクロットのパラメーターを反映しているトロンボエラストグラムで可視化される（例えば、Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｒ．Ｊ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５ ２７（２）：８１を参照のこと）。
【００１５】
同様の条件下のＲＯＴＥＭ（登録商標）システムでは、本発明によるフィブリノーゲン調製物は典型的には、フィブリノーゲン調製物または組成物と少なくとも同じかまたはそれよりも優れて機能し、ここではフィブリノーゲン改変体の分布は、ヒト血漿における改変体分布と似ており、すなわち、フィブリノーゲンの５％（ｗ／ｗ）未満がＦｉｂ４２０型のフィブリノーゲンである。これは例えば、血漿由来のフィブリノーゲンに基づく、フィブリノーゲン濃縮物についての場合である。このような濃縮物は市販されている。具体的には、そのクロット形成時間は、フィブリノーゲンの５％（ｗ／ｗ）未満がＦｉｂ４２０型のフィブリノーゲンであるフィブリノーゲン調製物のクロット形成時間よりも短い。好ましくは、本発明によるフィブリノーゲン調製物のクロット形成時間は、血漿由来のフィブリノーゲン調製物のように、フィブリノーゲンのうち５％（ｗ／ｗ）未満がＦｉｂ４２０型であるフィブリノーゲン調製物のクロット形成時間の最大で８０％、最大で６０％、最大で５０％、最大で４０％、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％である。この実施例に示されるα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂでのＲＯＴＥＭ実験によって、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、静脈内への適用のために製造された精製血漿由来フィブリノーゲンのＣＦＴよりも短いクロット形成時間（ＣＦＴ）を有することが示される。
【００１６】
別の局面では、本発明は、本発明によるフィブリノーゲン調製物を含む組成物に関する。フィブリノーゲンに加えて、この組成物は、活性化因子、例えば、トロビンまたはトロンビン様タンパク質、例えば、レプチラーゼを含んでもよい。この組成物はまた、注射用調製物での使用に適切である賦形剤も含んでもよい。この調製物は、乾燥型であって、その後に例えば、緩衝生理食塩水などで再構成されてもよいし、または懸濁液もしくは溶液のいずれかとして液体型であってもよい。適切な賦形剤の物質としては、溶媒および共溶媒、例えば、エタノール、グリセリン、ＰＥＧ類、油類など；可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤または増粘剤類、例えば、カルボキシメチルセルロース、加水分解ゼラチン、プルロニック類、ポリソルベート類など；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡカルシウム、ＤＴＰＡなど；抗酸化剤類および還元剤類、例えば、ＢＨＴ、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムなど；抗菌性保存剤類、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、パラベン類など；緩衝液類およびｐＨ調節剤類、例えば、トロメタミン、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなど；増量剤類、保護剤類および等張化剤類、例えば、アラニン、アルブミン、デキストラン、ラクトース、ソルビトール、塩化ナトリウム、ヒスチジンなど；専門的な添加物、例えば、消泡剤としてのシメチコン、タンパク質凝集の軽減のためのトレハロースを挙げることができる。
【００１７】
この組成物は、血漿由来または組み換えのフィブリノーゲンが用いられる任意の適用で用いられ得る。この主要な適用は、止血および組織のシーリングである。本発明の一実施形態では、この組成物は、薬学的組成物である。この薬学的組成物は、本発明によるフィブリノーゲン調製物および薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」とは、本発明のフィブリノーゲン調製物とともに投与される、ビヒクル、補助剤、アジュバント、希釈剤、賦形剤または担体を指す。薬学的に許容される担体の例としては、限定するものではないが、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油類、界面活性剤類、懸濁剤類またはそれらの適切な混合物類が挙げられる。適切な薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）に記載される。
【００１８】
薬学的組成物は局所的に適用されてもよいし、水溶性、吸水性、水不溶性または水膨潤性である担体を含んでもよい。適切な材料としては、糖類、例えば、単糖類および二糖類、例としては、ラクトース、マンニトールおよびトレハロース、またはデキストランおよびデキストランポリマー類、例としては、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（種々の粒径で利用可能である）、デンプン類、プルラン誘導体類、ヒアルロン酸エステル類などが挙げられる。セルロース製品、例えば、微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌの領域）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、超微粒セルロースまたはヒドロキシプロピルセルロース、および他の物質、例えば、架橋ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を単独で、または混合して用いてもよい。また、適切な担体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（好ましくは、約１０００という分子量を有する）；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（好ましくは、約５０，０００という平均分子量を有する）；ポリ（アクリル酸）、ＰＶＡ、ポリ（メチルビニルエーテルｃｏ−マレイン酸無水物）、ポリ（エチレンオキシド）、およびデキストラン（典型的には約４０，０００という平均分子量を有する）が挙げられる。
【００１９】
錠剤分解物質が含まれてもよい。これらの物質は、傷口から水分を吸収し、急速に膨らんで、それによって粉末混合物の止血成分の水和性を増強する。適切な例としては、３５〜５５μｍの範囲の平均粒径を有するデンプングリコール酸ナトリウム（Ｅｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）またはＰｒｉｍｏｊｅｌ（登録商標））が挙げられる。約２５％のグルコース単位が、カルボキシメチル化され；架橋ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標））；アルギン酸塩およびアルギン酸；架橋カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ）である。用いられ得るゴムおよびゲル化剤としては、例えば、トラガカント、カラヤゴム、可溶性デンプン、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、およびジェランガムが挙げられる。
【００２０】
特に好ましい添加物は、Ｅｍｅｄｅｘ（登録商標）、すなわち、デクストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）（少量のデンプンオリゴ糖類を含む噴霧結晶化デキストロース）の水和型である。これは、１９０〜２２０μｍの中央粒径を有する、白色、自由流動性、噴霧結晶化多孔性球体から構成される極めて微細な製品である。
【００２１】
最も好ましい添加物は、ＮＯＮ−ＰＡＲＥＩＬ ＳＥＥＤＳ（登録商標）：（Ｓｕｇａｒ Ｓｐｈｅｒｅｓ）である。これらは、含量均一性の改善、一貫してかつ制御された薬物放出および高い薬物安定性、２００〜２０００ｎｍのサイズ範囲のために複数の薬物単位で用いられる。
【００２２】
薬学的に許容される担体は、発泡性の対を含んでもよい。発泡性の反応の後に生じるガスは、フィブリンシーラントを「泡状物」に膨らませるか、および／またはフィブリンシーラントを含む粉末の水和性を増大し得る。粉末が創傷に適用されれば、発泡性の成分は、溶解し、反応して、例えば、二酸化炭素を放出し、それによって止血成分の水和性を増大し、従って、クロット形成までの時間を増大し得る。このフィブリンシーラントは、一旦完全に反応されてクロットが形成されれば、安定な泡状物として出現する。
【００２３】
発泡性の対は典型的には、クエン酸またはクエン酸水素ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムを含むが、ただし、他の生理学的に許容される酸／アルカリまたはアルカリ土類金属炭酸塩混合物、例えば、酒石酸、アジピン酸、フマル酸またはマレイン酸、およびナトリウム、カリウムまたはカルシウム（重）炭酸塩またはグリシン炭酸ナトリウムを用いてもよい。
【００２４】
一般には、化学的な分子当量に基づく発泡性の対の成分の相対的な割合が、酸性成分対塩基性成分の分子当量の比として表して、４：３〜１：３、より好ましくは約２：３の範囲である場合に、好ましい風味の特徴が示されることが見出された。クエン酸および重炭酸ナトリウムの好ましい組み合わせに関して、これらの値は、重量あたりで、酸性成分対塩基性成分の比として表して、１：１〜０．３：１、好ましくは０．５：１の範囲である。
【００２５】
本発明による薬学的組成物は、組織接着を容易にするか、創傷治癒を改善するか、または静脈内投与のために適切である。
【００２６】
一実施形態では、本発明による薬学的組成物は、フィブリンシーラントである。本発明によるフィブリンシーラントは典型的には、トロンビンを含む。このシーラントは、任意の従来の形態であってもよく、乾燥されても液体であってもよい。本発明によるフィブリノーゲン調製物が用いられ得る乾燥シーラントの適切な例は、Ｆｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）粉末シーラントであり、これはＷＯ９７／４４０１５に記載されており、フィブリノーゲンおよびトロンビンのマイクロ粒子に基づく。別々の成分が、噴霧乾燥、フィブリノーゲンとトレハロースおよびトロンビンとトレハロースによって調製される。各々の粉末成分は、直径で最大でほぼ５０μｍの優勢な粒径を有する。これらの成分の混合物であるＦｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）フィブリンシーラントは、使いやすく、安定かつ有効な局所止血であることが示された。この製品は、再構成することなく直ちに用いられ、創傷治療において、外科的修復において、および血管外ステントとして有用である。血液などの水性の液体との接触の際、露出された活性トロンビンは、露出されたフィブリノーゲンを不溶性のフィブリンポリマーに変換する。本発明によるフィブリノーゲン調製物は、さらに改善された血液凝固特性を示す。
【００２７】
本発明の組成物は、創傷、縫合、切開および出血が生じ得る他の開口に適用され得る。創傷としては、生きている生物体における任意の組織に対する障害が挙げられる。組織は、内部組織（例えば、臓器）または外部組織（例えば、眼または皮膚）であってもよく、硬組織（例えば、骨）であっても、または軟組織（例えば、肝臓または脾臓）であってもよい。創傷は、感染、外科的介入、火傷または外傷を含む任意の因子によって生じた場合もある。本発明の組成物は、胃腸系、例えば、食道、胃、小腸、大腸、直腸において、実質器官、例えば、肝臓、膵臓、脾臓、肺、腎臓、副腎、リンパ腺および甲状腺に対するなどのような外科的介入；耳、鼻および咽頭領域（ＥＮＴ）における外科的介入、例としては、歯科手術、心血管系手術、美顔成形手術、神経学的手術、リンパ、胆管および脳脊髄（ＣＳＦ）瘻孔、胸腔および肺の手術の間の空気漏れ、胸部手術、例としては、気管、気管支および肺の手術、婦人科、血管、泌尿器、骨（例えば、海綿骨切除）および緊急の手術のために用いられ得る。
【００２８】
血管外ステントまたは支持体として、本発明の組成物は、静脈移植血管のセグメントまたは全体の外側に適用され得る。適切な血管外ステント組成物は、本発明によるフィブリノーゲン調製物およびトロンビンの組成物である。この組成物は、任意の適切な形態であっても、液体であってもまたは乾燥型であってもよい。一実施形態では、乾燥粉末組成物、例えば、上記のような組成物が、血管外ステントとして用いられる。乾燥粉末組成物は、血管壁の外側に通常存在する限られた量の体液中で重合化し、これによって血管外ステントを形成する。
【００２９】
本発明による血管外ステント組成物でコーティングされた血管（静脈）もまた本発明の一部である。この血管（静脈）は、過伸展から保護される必要があるか、または支持を必要とする任意の種類の血管、例えば、静脈瘤であり得る。好ましい実施形態では、この血管（静脈）は、静脈グラフトである。一実施形態では、この組成物は、静脈グラフトがヒトまたは動物の体に導入される前に適用される。別の実施形態では、この組成物は、静脈グラフトがヒトまたは動物の体に導入された後に適用される。
【００３０】
さらに別の局面では、本発明は、医薬としての本発明によるフィブリノーゲン調製物の使用に関する。これは、急性出血の症状、過剰線維素溶解症、フィブリノーゲン欠損症（後天性であっても先天性であってもよい）、または他の出血障害の処置のための医薬の調製のために用いられ得る。
【００３１】
一実施形態では、本発明による組成物は、出血部位での出血を軽減するための方法で用いられる。好ましくは、本発明による組成物の止血に有効な量が用いられる。局所止血剤として用いられる場合、約１０分以下、約５分以下、または約３分以下という止血時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（ＴＴＨ）が達成され得る。本発明の状況では、ＴＴＨは、出血が停止するのにかかる時間である。圧迫シートを用いる場合、ＴＴＨの測定は典型的には、圧迫シートを出血部位に適用した時点で開始し、包帯を観て出血が停止するまで、および／または包帯を通じてもしくは包帯の周囲に出血が観察されなくなるまで行う。
【００３２】
さらに別の局面では、本発明は、本発明によるフィブリノーゲン調製物を調製するための方法に関する。このような調製物は、当該分野で利用可能な技術を用いて任意の適切な方式で調製され得る。経済的に実現可能な方法でα−ｅｘｔ Ｆｉｂを生成するために、高発現レベルのインタクトな機能的なフィブリノーゲンが必要であり、従って組み換え生成が好ましい。本発明の状況では、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン鎖は、アミノ酸配列が、必要に応じて、正常な細胞（分泌）プロセシングの間に除去されるアミノ酸なしに、ヌクレオチド配列によってコードされた全てのアミノ酸を含む場合に、「インタクトな形態」である。従って、８６６または８４７個のアミノ酸を有するα−ｅｘｔ鎖は、インタクトな形態のアミノ酸の例である。
【００３３】
フィブリノーゲンの組み換え生成は、血漿由来の物質の使用を上回る多くの利点を有する。これらとしては、その好ましい安全性プロフィール、任意の他の血液由来混入物のない改変体の純粋な均一な調製物を作製する能力、および制限のない供給が挙げられる。さらに、特定の適用（例えば、静脈内止血剤としてのフィブリノーゲンの使用）に関しては、適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）が必要である。従って、真核生物における、特定の哺乳動物系における、さらに詳細にはヒトの系における発現が好ましい。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン調製物は、以下の工程：
−核酸配列であってフィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する工程と；
−この発現ベクターを用いて真核生物細胞を形質転換する工程と；
−フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードする核酸配列の発現を可能にするような条件下でこの形質転換された真核生物細胞を維持する工程と；
を包含する方法によって調製される。
【００３５】
真核生物宿主の発現ベクターは、当該分野で公知であり、真核生物細胞での発現に従来用いられる任意のベクターが用いられてもよい。発現ベクターは典型的には、発現されるべき核酸配列に対して作動可能に連結されたプロモーター、およびリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節性ドメインおよびエンハンサーを含む。一実施形態では、哺乳動物細胞における発現のため、例えば、ＣＨＯまたはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のための発現ベクターが用いられる。このようなベクターは、当該分野で公知であり、適切な例としては、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＦＮベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）および多数の他のベクター系が挙げられる。
【００３６】
本発明の状況では、「フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖」とは、シグナル配列を有する８６６アミノ酸のフィブリノーゲンα鎖、またはシグナル配列なしのフィブリノーゲンα鎖、ならびに遺伝的多型性またはグリコシル化およびリン酸化における相違を通じて生じたそれらの任意の改変体を指す場合がある。α伸長鎖アミノ酸配列の適切な例は、配列番号１に示される。「α鎖」および「Ａα鎖」という用語は、本発明の状況では交換可能に用いられる。
【００３７】
当業者は、真核生物細胞がまた、フィブリノーゲン分子を生成できるためには、フィブリノーゲンのβ鎖およびγ鎖をコードする核酸配列を含まなければならないということを理解する。α、βおよびγ鎖由来のフィブリノーゲンの組み換え生成は、以前に記載されており、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８７５４、米国特許第６，０３７，４５７号またはＷＯ９５／０２３８６８号を参照のこと。
【００３８】
本発明の状況では、「β鎖」および「Ｂβ鎖」という用語は、交換可能に用いられる。それらの鎖は、シグナル配列の有無がある、β鎖の野生型および改変体の両方を指す場合がある。フィブリノーゲンβ鎖のアミノ酸配列の適切な例は、配列番号２に示される。
【００３９】
本発明の状況では、「ガンマ鎖」および「γ鎖」という用語は交換可能に用いられる。それらは、シグナル配列の有無の、γ鎖の野生型および改変体の両方を指す場合がある。フィブリノーゲンγ鎖アミノ酸配列の適切な例は、配列番号３および配列番号４に示される。
【００４０】
好ましくは、フィブリノーゲン鎖をコードする核酸配列は最適化される。最適化された核酸配列は、組み換えフィブリノーゲンの効果的な発現をインタクトな形態で可能にする。好ましくは、それらの配列は、真核生物細胞培養系での発現のために、例えば、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞または昆虫細胞培養系における発現のために最適化される。さらに好ましくは、それらは、哺乳動物細胞培養系における発現のために最適化される。最も好ましくは、この核酸配列は、ヒト細胞培養系における発現のために、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞培養系のために最適化される。最適化されるヌクレオチド配列は、ＤＮＡであってもまたはＲＮＡであってもよい。好ましくは、これはｃＤＮＡである。
【００４１】
フィブリノーゲンα伸長のβ鎖またはγ鎖をコードする最適化ヌクレオチド配列は、そのそれぞれの非最適化対応物に対して少なくとも７０％の同一性を示す。一実施形態では、フィブリノーゲンα−ｅｘｔ Ｆｉｂ、Ｂβおよびγ鎖をコードする最適化ヌクレオチド配列は、そのそれぞれの非最適化配列に対して７０〜８０％の同一性を示す。好ましくは、フィブリノーゲンα伸長のβ鎖またはγ鎖をコードするこの最適化ヌクレオチド配列は、ｃｉｓ作用性部位、例えば、スプライス部位およびポリ（Ａ）シグナルを含まない。
【００４２】
本発明による方法で用いられ、フィブリノーゲンα伸長鎖をコードする、最適化ヌクレオチド配列は、ヒトフィブリノーゲンのα鎖をコードする遺伝子中に正常には存在する３９塩基対の直接反復配列を含まない。反復性配列は、コードされたタンパク質配列を変化することなく変化されなければならない。
【００４３】
好ましい実施形態では、配列番号５による最適化されたヌクレオチド配列、またはシグナルなしのこの配列の一部（ヌクレオチド６０〜２５９８）が、α伸長鎖を発現するために用いられる。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、配列番号６による最適化されたヌクレオチド配列、またはシグナルなしのこの配列の一部（ヌクレオチド９３〜１４７３）が、β鎖を発現するために用いられる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、配列番号７または８による最適化されたヌクレオチド配列、またはシグナル配列なしのこれらの配列の一部（配列番号７のヌクレオチド５１〜１３１１および配列番号８のヌクレオチド５１〜１３５９）が、γ鎖を発現するために用いられる。
【００４６】
本発明による核酸配列は、任意の種類のフィブリノーゲン鎖をコードし得る。好ましくはそれらの配列は、哺乳動物フィブリノーゲン鎖をコードしており、さらに好ましくは、それらは、霊長類のフィブリノーゲン鎖をコードしており、最も好ましくは、それらは、ヒトフィブリノーゲン鎖をコードしている。また組み合わせ、例えば、２つまたは１つのげっ歯類のフィブリノーゲン鎖と組み合された１つまたは２つの哺乳動物フィブリノーゲン鎖なども可能である。本発明の方法による組み換え発現によって、組み換えＨＭＷ Ｆｉｂの発現レベルと同様であるＦｉｂ４２０の発現レベルが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ウエスタンブロット分析。レーン１は、血漿由来の野生型フィブリノーゲン（ＦＩＢ３，Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むコントロールである。レーン２は、α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂを発現するＰＥＲ．Ｃ６クローンであるクローンＷ１１５の培養上清を含む。分子量マーカー（ＭＷ）は左側に示される。
【図２】ＲＯＴＥＭ分析。凝固時間、クロット形成時間およびクロット硬度は、ＲＯＴＥＭ分析によって決定した。左側のパネルは、緩衝液中のフィブリノーゲン調製物を示し、右のパネルは、フィブリノーゲン調製物と１：１混合された血漿を示す。２Ａ：緩衝液中の血漿由来のフィブリノーゲン（Ｈａｅｍａｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；２Ｂ：緩衝液中のＰＥＲ．Ｃ６由来の組み換えＨＭＷフィブリノーゲン（α−６２５）；２Ｃ：緩衝液中のＰＥＲ．Ｃ６由来のｒｈＦｉｂ−ｅｘｔフィブリノーゲン（α−８４７）；２Ｄ：血漿と混合された血漿由来のフィブリノーゲン（Ｈａｅｍａｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；２Ｅ：血漿と混合されたＰＥＲ．Ｃ６由来の組み換えＨＭＷフィブリノーゲン（α−６２５）；２Ｆ：血漿と混合されたＰＥＲ．Ｃ６由来のｒｈＦｉｂ−ｅｘｔフィブリノーゲン（α−８４７）；
【図３】この図は、プラスミン分解の血漿由来の物質由来の物質（ＥＲＬ ＦＩＢ３；上部パネル、およびα−ｅｘｔ Ｆｉｂ（下部パネル）をロードされたクーマシー染色されたタンパク質ゲルを示す。この条件は、ゲルの上に示しており；インキュベーションの時間（０、１、５、３０、６０および１２０分およびｏ／ｎ（一晩））も同様に示される。ゲルの右側には、ＭＷマーカーを示す。
【００４８】
実施例
実施例１
最適化ｃＤＮＡ構築物の調製
α−ｅｘｔ Ｆｉｂ（Ｆｉｂ４２０）、Ｂβおよびγのヒトフィブリノーゲンポリペプチド鎖をコードするｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるコドン最適化形式で合成した：（ｉ）ｃｉｓ−作用性部位（スプライス部位、ポリ（Ａ）シグナル）を取り除いた；（ｉｉ）Ａα鎖の反復配列を改変した；（ｉｉｉ）ＧＣ含量をｍＲＮＡ半減期の伸長のために増大した；（ｉｖ）コドン用法は、ＣＨＯ（コドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）−ＣＡＩ−＞０．９５）に適合した。
α−ｅｘｔ Ｆｉｂ（配列番号５）、Ｂβ（配列番号６）およびγ（配列番号６）鎖のコドン最適化ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体中にサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏ中のＡα伸長（Ｆｉｂ４２０）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏ中のＢβ鎖およびｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ中のγ鎖（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＵＳＡ）。
【００４９】
実施例２
組み換えヒトα−ｅｘｔＦｉｂを発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞株
組み換えヒトフィブリノーゲンを産生するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の生成は、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８７５４において以前に記載されるのと同様である。要約すれば、細胞をＭＡｂ培地中において懸濁物中で培養して、ＡＭＡＸＡヌクレオフェクションデバイス（ｐｒｏｍｅｇａＡ−２７）を用い、そしてヒトフィブリノーゲンタンパク質の３つの異なる鎖（Ａα−ｅｘｔ、Ｂβおよびγ鎖）をコードしており、かつ最適化ｃＤＮＡ鎖（それぞれ、配列番号５、配列番号６および配列番号７）を含んでいる３つのベクターを備える、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴを用いて、トランスフェクトした。
【００５０】
９６ウェルプレート中でのトランスフェクションおよびプレートの後、３２５個のクローンを４８ウェルプレート中にトランスファーして、スクリーニングした。増殖経路の終わりに、２４個のクローンを振盪フラスコに移して、そのうちの８つを、連続バッチ培養試験において、安定性および発現分析のために選択した。
【００５１】
バッチ培養における収率は、６１０または６２５のアミノ酸のフォーマットにおいてＡα鎖を発現する細胞株で得られた収率と同様であって、このことは、Ａα鎖の伸長が発現レベルを損なわないことを示す。これは、事前には予想されなかった。なぜなら血漿由来のフィブリノーゲンは、６１０／６２５Ａα鎖含有のフィブリノーゲンに比較して伸長Ａα鎖を１〜３％しか含まないからである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を用いるタンパク質分析によって、組み換えフィブリノーゲンが、予想の大きさのα鎖を有するインタクトな形式で生成されることが示される（図１）。
【００５２】
実施例３
ＰＥＲ．Ｃ６細胞培養培地からのα伸長フィブリノーゲンの精製
組み換えヒトα伸長フィブリノーゲンは、標準的方法によって細胞培養上清から精製した。要するに、（ＮＨ４）２ＳＯ４を培養上清に対して４０％飽和まで添加して、沈殿物を遠心分離によって収集した。引き続き、沈殿物を、ＴＭＡＥローディング緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中に溶解し、続いて同じ緩衝液に対して透析した。次いで、このタンパク質溶液を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（ｍ）４０〜９０μｍ（３ｍｌ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｏｌｕｍｎ上にロードした。組み換えヒトα伸長フィブリノーゲンをその後に、２０カラム容積中で０〜１ＭのＮａＣｌの連続塩勾配を用いて溶出した。ピーク画分中の組み換えヒトフィブリノーゲンを、４０％飽和まで（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加することによって再度沈殿し、遠心分離によって収集した。最後に、その物質をＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、ＴＢＳに対して透析して、残留する（ＮＨ４）２ＳＯ４を除いた。
【００５３】
実施例４
ＲＯＴＥＭ分析
α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂおよび血漿由来フィブリノーゲンの凝固時間（ＣＴ）、クロット形成時間（ＣＦＴ）およびクロット硬度を、ＲＯＴＥＭ分析を用いて測定した。ＲＯＴＥＭ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とは、ＲＯｔａｔｉｏｎ ＴｈｒｏｍｂｏＥｌａｓｔｏＭｅｔｒｙを表す。この技術は、使い捨てキュベット中の（血液）サンプル中に浸漬された回転軸を利用する。異なる凝固条件下の弾力性の変化は、軸の回転の変化を生じ、この変化が、機械的なクロットのパラメーターを反映しているトロンボエラストグラムで可視化される（例えば、Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｒ．Ｊ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５ ２７（２）：８１を参照のこと）。
【００５４】
プールした正常な（クエン酸塩）血漿を、血漿由来のフィブリノーゲン（Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＰＥＲ．Ｃ６フィブリノーゲン（ＨＭＷ ｒｈＦｉｂまたはα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂ）と、全て２ｍｇ／ｍｌでＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．００１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、１：１混合した。またフィブリノーゲン調製物（ＴＢＳＴ中で２ｍｇ／ｍｌ）を直接用いた。ＣａＣｌ２を、１７ｍＭ（血漿中の測定値）または１．７ｍＭ（緩衝液中の測定値）という最終濃度まで添加した。凝固を開始するため、αトロンビンを１ＩＵ／ｍｌという最終濃度まで添加した。凝固を開始するために、αトロンビンを１ＩＵ／ｍｌという最終濃度まで添加した。緩衝液中のまたは血漿と１：１混合したフィブリノーゲン調製物についてのＲＯＴＥＭ（登録商標）分析グラフを図２に示す。Ａ１０、Ａ２０、ＣＦＴおよびＭＣＦの値（ｍｍ）を表１に示す。Ａ１０およびＡ２０は、α−トロンビン添加後１０分および２０分のクロットの硬度に相当する。ＣＦＴは、凝固の開始から２０ｍｍというクロット硬度が検出されるまでの時間に相当する。ＭＣＦは、最大クロット硬度に相当する。
【００５５】
この結果、緩衝液中のα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂの凝固は、ＨＭＷ ｒｈＦｉｂで観察される（Ａ１０＝４ｍｍ）よりも強力なクロット（Ａ１０＝１２ｍｍ）を生じることが示される。血漿由来のフィブリノーゲンは、１５ｍｍというＡ１０を有し；緩衝液中のこのさらに強力なクロット形成は、フィブリン単量体を（部分的に）架橋する、同時精製された血液由来の第ＸＩＩＩ因子の活性によって説明され得る。精製された組み換えフィブリノーゲンでは、第ＸＩＩＩ因子が存在し、従って架橋は生じ得ない。これは、希釈された血漿（第ＸＩＩＩ因子を含む）中で実験を行うことによって補償され得る。この場合、より強力なクロットが形成される。興味深いことに、この状況では、α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂはより強力なクロットを形成し、ＨＭＷ ｒｈＦｉｂまたは血漿由来のＦｉｂよりも速くクロットを形成し、これは、それぞれ２１、１８および１７ｍｍというＡ２０値である。
【００５６】
【表１】
【００５７】
実施例５
α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂおよび血漿由来のフィブリノーゲンのプラスミン消化
精製組み換えヒトα−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂの線維素原溶解を、プラスミンでのインキュベーションによって試験した。要するに、フィブリノーゲンをＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中に希釈し、ＣａＣｌ２またはＥＤＴＡを添加し（５ｍＭの最終濃度）、プラスミンを添加し（１０ｎＭの最終濃度）、続いて３７℃でインキュベーションした。時間中のいくつかのポイントで、サンプルを採取して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液とただちに混合した（ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプル緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＮＰ００００７）。次いで、サンプルを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ３〜８％ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＷＧ１６０２）上でサイズ分離に供した。タンパク質は、クーマシー染色（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＬＣ６０６０）によって可視化した。
【００５８】
この結果、図４に示すとおり、α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂのプラスミン媒介性消化が、血漿由来のフィブリノーゲンについてよりも有意に遅いことが示される。例えば、Ｃａ２＋の存在下では、６０分後、全ての血漿由来フィブリノーゲンが、フラグメントＤおよびＥの種に分解される。α−ｅｘｔ ｒｈＦｉｂについては、これには１２０分よりもかかり、わずか一晩のインキュベーションでさえ、３０分後血漿由来のフィブリノーゲンの消化に既に存在する、実質的な量のフラグメントＥ生成が示される。
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲン調製物であって、同様の条件下でＲＯＴＥＭ（登録商標）トロンボエラストグラフィー試験中の血漿由来フィブリノーゲン調製物のクロット形成時間よりも短いクロット形成を有する、フィブリノーゲン調製物。
【請求項２】
少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含み、前記フィブリノーゲンの少なくとも１０％（ｗ／ｗ）がＦｉｂ４２０の形態である、請求項１に記載のフィブリノーゲン調製物。
【請求項３】
第ＸＩＩＩ因子を含まない、請求項１または２に記載のフィブリノーゲン調製物。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物が、組織付着を容易にするか、創傷治癒を改善するか、または静脈内投与のために適切である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記薬学的組成物が、フィブリンシーラントまたは局所止血薬である、請求項４または５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
さらにトロンビンを含む、請求項４〜６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
乾燥型の請求項４〜７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
医薬としての使用のための、請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物。
【請求項１０】
急性出血症状、過剰線維素溶解、フィブリノーゲン欠損症または他の出血障害の処置ための方法における使用のための、請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物または請求項４〜８に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
急性出血症状、過剰線維素溶解、フィブリノーゲン欠損症または他の出血障害の処置ための医薬の調製のための、請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物または請求項４〜８に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１２】
Ｆｉｂ４２０フィブリノーゲン調製物を調製するための方法であって：
−フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供することと；
前記発現ベクターを用いて哺乳動物細胞を形質転換することと；
−フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にするような条件下で前記哺乳動物細胞を維持することと、
を包含する、方法。
【請求項１３】
フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードする前記ヌクレオチド配列が、最適化配列、好ましくは配列番号５による最適化配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、好ましくはＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１】
フィブリノーゲン調製物であって、同様の条件下でＲＯＴＥＭ（登録商標）トロンボエラストグラフィー試験中の血漿由来フィブリノーゲン調製物のクロット形成時間よりも短いクロット形成を有する、フィブリノーゲン調製物。
【請求項２】
少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含み、前記フィブリノーゲンの少なくとも１０％（ｗ／ｗ）がＦｉｂ４２０の形態である、請求項１に記載のフィブリノーゲン調製物。
【請求項３】
第ＸＩＩＩ因子を含まない、請求項１または２に記載のフィブリノーゲン調製物。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物が、組織付着を容易にするか、創傷治癒を改善するか、または静脈内投与のために適切である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記薬学的組成物が、フィブリンシーラントまたは局所止血薬である、請求項４または５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
さらにトロンビンを含む、請求項４〜６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
乾燥型の請求項４〜７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
医薬としての使用のための、請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物。
【請求項１０】
急性出血症状、過剰線維素溶解、フィブリノーゲン欠損症または他の出血障害の処置ための方法における使用のための、請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物または請求項４〜８に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
急性出血症状、過剰線維素溶解、フィブリノーゲン欠損症または他の出血障害の処置ための医薬の調製のための、請求項１〜３に記載のフィブリノーゲン調製物または請求項４〜８に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１２】
Ｆｉｂ４２０フィブリノーゲン調製物を調製するための方法であって：
−フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供することと；
前記発現ベクターを用いて哺乳動物細胞を形質転換することと；
−フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にするような条件下で前記哺乳動物細胞を維持することと、
を包含する、方法。
【請求項１３】
フィブリノーゲンのα伸長ポリペプチド鎖をコードする前記ヌクレオチド配列が、最適化配列、好ましくは配列番号５による最適化配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、好ましくはＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項１２または１３に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１６４４３（Ｐ２０１３−５１６４４３Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４７５１６（Ｐ２０１２−５４７５１６）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８３１５３
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５１１００６２１４）プロフィブリックス ビーブイ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８３１５３
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５１１００６２１４）プロフィブリックス ビーブイ (3)
【Ｆターム（参考）】
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