位置特定可能なアレイによるリガーゼ検出反応を用いた核酸配列差異の検出
【課題】多数の標的ヌクレオチド配列における、一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失又は転座による一つ又は複数の多数の配列の差異を同定する方法の提供。
【解決手段】標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する一つのオリゴヌクレオチドプローブ、並びに標的配列特異的部分及び検出可能な標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーション検出反応を利用する。固体支持体に該オリゴヌクレオチドプローブを、少なくともその一部が位置特定可能なアレイ特異的部分に対して相補的であるような固定された捕獲用オリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせる(捕獲期)。完了後、固体支持体にハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドプローブの標識を検出する(検出期)。本方法を実施するためのキット、固体支持体上にアレイを形成する方法、および支持体それ自身に関する。
【解決手段】標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する一つのオリゴヌクレオチドプローブ、並びに標的配列特異的部分及び検出可能な標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーション検出反応を利用する。固体支持体に該オリゴヌクレオチドプローブを、少なくともその一部が位置特定可能なアレイ特異的部分に対して相補的であるような固定された捕獲用オリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせる(捕獲期)。完了後、固体支持体にハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドプローブの標識を検出する(検出期)。本方法を実施するためのキット、固体支持体上にアレイを形成する方法、および支持体それ自身に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる多数の配列の、一つ又は複数を同定する方法:
多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のある試料を提供する段階;
各セットが(a)標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合には相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
リガーゼを提供する段階;
混合物を形成するために、試料、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合する段階;
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれもが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、オリゴヌクレオチドプローブセットが、その各々の標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合は隣接した位置で塩基特異的に当該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いにライゲーションして、 (a)位置特定可能なアレイ特異的部分、(b)互いに結合した標的特異的部分、及び(c)検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物配列を形成し、また、オリゴヌクレオチドプローブセットがその各々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるものの、一つまたは複数のミスマッチが存在するために相互にライゲーションせず変性処理中に個別に分離される、ハイブリダイゼーション処理を含む、一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに混合物を供する段階;
多孔質表面および、特定部位に固定された種々の、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を提供する段階;
前述の供する段階後、塩基特異的方法で位置特定可能なアレイ特異的部分が捕獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに効果的な条件下で、混合物を固体支持体と接触させ、これにより位置特定可能なアレイ特異的部分を相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う部位で固体支持体上に捕獲する段階;並びに
固体支持体に特定部位で捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標識を検出し、これにより試料中に一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列が存在することを示す段階。
【請求項2】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項1記載の方法。
【請求項3】
ミスマッチがライゲーション接合部の3'側塩基にある、請求項2記載の方法。
【請求項4】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項1記載の方法。
【請求項5】
ミスマッチがライゲーション接合部の3'側塩基に隣接した塩基にある、請求項4記載の方法。
【請求項6】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
前述の検出後に、試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の量を、既知量の標的ヌクレオチド配列を伴う試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の検量線と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項7】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
前記混合が、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを、混合物を生成するために混合することを含み、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在し、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び固体支持体上の捕獲用オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより各セットが特徴付けられる、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から作製された捕獲されたライゲーション産物の量と、捕獲された他のライゲーション産物の量とを比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項8】
一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、試料中の標的ヌクレオチド配列と、一つ又は複数の単ヌクレオチド部位で異なる、請求項7記載の方法。
【請求項9】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項8記載の方法。
【請求項10】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項8記載の方法。
【請求項11】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の2つ以上を未知量含む可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
検出後に、試料中の各々の多数の標的配列により作製された捕獲されたライゲーション産物配列の相対量を比較することにより、試料中の各々の多数の標的ヌクレオチド配列の相対量を定量し、これにより試料中の2つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量的尺度を提供する段階。
【請求項12】
重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブセットにより、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異、または、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異が識別される、請求項1記載の方法。
【請求項13】
オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらが同様のハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項1記載の方法。
【請求項14】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に異なる部位で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の試料中の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項15】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項14記載の方法。
【請求項16】
重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブ群により、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異、または複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異が識別される、請求項14記載の方法。
【請求項17】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項16記載の方法。
【請求項18】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子と塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上の異なる位置で捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される一つ又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項19】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、及びマイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子に塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請求項18記載の方法。
【請求項20】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列中の、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異、又は、過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異が識別され、
オリゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、検出において、異なる位置で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、試料中における、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の少量の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項21】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中の任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項20記載の方法。
【請求項22】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異、又は、過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異が、試料中で定量される、以下の段階を更に含む、請求項20記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
各セットが、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された、一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列とハイブリダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、混合は、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を生成するために混合することを含む、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段階;
固体支持体上に特定の部位で捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列より作製された捕獲されたライゲーション産物の量と、少量の未知の試料より作製された他の捕獲されたライゲーション産物の量とを比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項23】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、選択された条件下で対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項22記載の方法。
【請求項24】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、
オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、
各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、
各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、
上記検出において、固体支持体上に特定の部位で捕獲された各群のライゲーション産物配列の異なるレポーター標識が検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項25】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項24記載の方法。
【請求項26】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項24記載の方法。
【請求項27】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位で相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項26記載の方法。
【請求項28】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有するか、もしくは第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に特定の部位で捕獲された各群の多数の標識されたライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項29】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項28記載の方法。
【請求項30】
ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特異的部分を伴うプローブを含む、請求項28記載の方法。
【請求項31】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項30記載の方法。
【請求項32】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でのそれらの5'側塩基のみが異なり、かつ異なるレポーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でのそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基に隣接するそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項29記載の方法。
【請求項33】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の3'側塩基もしくはライゲーション接合部のこの塩基に隣接する塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有するか、又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の5'側塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項29記載の方法。
【請求項34】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の2個以上の隣接するコドンについての、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項33記載の方法。
【請求項35】
変性処理が約80℃〜105℃で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項36】
変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイクルが、約30秒から約5分間の長さである、請求項1記載の方法。
【請求項37】
前記供する段階が2サイクルから50サイクル繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項38】
前記供する段階の総時間が1分から250分間である、請求項1記載の方法。
【請求項39】
リガーゼが、サーマスアクアティカス(Thermus aquaticus)リガーゼ、サーマスサーモフィラス(Thermus thermophilus)リガーゼ、大腸菌(E.coli)リガーゼ、T4リガーゼ、サーマス(Thermus)種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクス(Aquifex aeolicus)リガーゼ、サーモトガマリチマ(Thermotoga maritima)リガーゼ、及びピロコッカス(Pyrococcus)リガーゼからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項40】
検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、及び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項41】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々、40℃〜85℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項1記載の方法。
【請求項42】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、20 ヌクレオチド長から28ヌクレオチド長を有する、請求項1記載の方法。
【請求項43】
混合物が更に担体DNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項44】
前記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットについて、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションする部位でミスマッチを生じたライゲーション産物の生成速度が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのマッチしたライゲーション産物配列の生成速度の0.005未満であるような生成速度を実現する、請求項1記載の方法。
【請求項45】
以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。
【請求項46】
前記増幅が、試料をポリメラーゼに基づく増幅法へ供することにより実施される、請求項45記載の方法。
【請求項47】
前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、DNAポリメラーゼにより実施される、請求項45記載の方法。
【請求項48】
固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で製造されている、請求項1記載の方法。
【請求項49】
前記検出が、以下の段階を含む、請求項1記載の方法:
特定の部位で固体支持体をスキャニングし、オリゴヌクレオチドプローブセットのライゲーションが生じたかどうかを確定する段階;及び
確定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付ける段階。
【請求項50】
多数の捕獲用オリゴヌクレオチドが各々、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の方法。
【請求項51】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを内部挿入又は欠失を伴わずに1端で互いに並置したときに、ヌクレオチド総数の4個毎に少なくとも1個につき、アレイ上のその隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドと異なる、請求項50記載の方法。
【請求項52】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが前記接触中にそれにハイブリダイズしないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔てられた、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項50記載の方法。
【請求項53】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項1記載の方法。
【請求項54】
以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊する段階。
【請求項55】
前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求項54記載の方法。
【請求項56】
以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。
【請求項57】
固体支持体が、異なる位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請求項1記載の方法。
【請求項58】
固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識により検出されかつ識別される、請求項1記載の方法。
【請求項59】
多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリマーである、請求項1記載の方法。
【請求項60】
機能性モノマーがアクリル酸である、請求項59記載の方法。
【請求項61】
機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、請求項59記載の方法。
【請求項62】
親水性ポリマーが、50:1未満のレベルで架橋される、請求項59記載の方法。
【請求項63】
親水性ポリマーが、500:1未満のレベルで架橋される、請求項62記載の方法。
【請求項64】
以下を含む、固体支持体上のオリゴヌクレオチドアレイ:
多孔質表面及び各々オリゴヌクレオチド結合に適した位置のアレイを有する、固体支持体;
各アレイ位置で固体支持体に結合した、固体支持体へのオリゴヌクレオチドのカップリングに適したリンカー又は支持体;及び
アレイ位置の少なくとも一部が16個のヌクレオチドより大きいオリゴヌクレオチドで占有される、固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ。
【請求項65】
異なるオリゴヌクレオチドが、固体支持体上の異なるアレイ位置に結合し、異なる核酸を検出する、請求項64記載のアレイ。
【請求項66】
固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で製造された、請求項64記載のアレイ。
【請求項67】
固体支持体が、アレイ位置に結合したオリゴヌクレオチドを伴うアレイ位置を有する、請求項64記載のアレイ。
【請求項68】
多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリマーである、請求項64記載のアレイ。
【請求項69】
機能性モノマーがアクリル酸である、請求項68記載のアレイ。
【請求項70】
機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、請求項68記載のアレイ。
【請求項71】
親水性ポリマーが、50:1未満のレベルで架橋される、請求項68記載のアレイ。
【請求項72】
親水性ポリマーが、500:1未満のレベルで架橋される、請求項68記載のアレイ。
【請求項73】
以下を含む、多数の標的ヌクレオチド配列中の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列の一つ又は複数を同定するキット:
リガーゼ;
各セットが(a)標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)標的配列特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブで特徴付けられ、ここで特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット;並びに
捕獲用オリゴヌクレオチドが、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する、多孔質表面及び特定の部位で固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体。
【請求項74】
リガーゼが、サーマスアクアティカスリガーゼ、サーマスサーモフィラスリガーゼ、大腸菌リガーゼ、T4リガーゼ、サーマス種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクスリガーゼ、サーモトガマリチマリガーゼ、及びピロコッカスリガーゼからなる群より選択される、請求項73記載のキット。
【請求項75】
以下を更に含む、請求項73記載のキット:
標的ヌクレオチド配列の一次増幅に適した、増幅プライマー;及び
ポリメラーゼ。
【請求項76】
固体支持体が、異なる特定の位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位にハイブリダイズしかつ検出される、請求項73記載のキット。
【請求項77】
固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これによりオリゴヌクレオチドプローブセットが、異なる標識により検出されかつ識別される、請求項73記載のキット。
【請求項78】
オリゴヌクレオチドプローブセット及び捕獲用オリゴヌクレオチドが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドプローブセットがそれぞれ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された、請求項73記載のキット。
【請求項79】
以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列の一つ又は複数を同定する方法:
多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含む可能性がある試料を提供する段階;
各セットが(a)標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
リガーゼを提供する段階;
混合物を形成するために、試料、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合する段階;
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれもが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、オリゴヌクレオチドプローブセットが、その各々の標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合は隣接した位置で塩基特異的に当該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いにライゲーションして(a)位置特定可能なアレイ特異的部分、(b)互いに結合した標的特異的部分、及び(c)検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物配列を形成し、また、オリゴヌクレオチドプローブセットがその各々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるものの、一つまたは複数のミスマッチが存在するために相互にライゲーションせず変性処理中に個別に分離される、ハイブリダイゼーション処理を含む、一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに混合物を供する段階;
特定の部位に固定された、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体を提供する段階;
前述の供する段階の後に、混合物を、負電荷を遮蔽しかつ塩基特異的方法で捕獲用オリゴヌクレオチドに対し位置特定可能なアレイ特異的部分をハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、固体支持体と接触させ、これにより、位置特定可能なアレイ特異的部分を固体支持体上に相補的捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う位置で捕獲する段階;並びに
固体支持体上に特定の部位で捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標識を検出し、これにより、試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階。
【請求項80】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項79記載の方法。
【請求項81】
ミスマッチが、ライゲーション接合部の3'側塩基にある、請求項80記載の方法。
【請求項82】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項80記載の方法。
【請求項83】
ミスマッチが、ライゲーション接合部の3'側塩基に隣接した塩基にある、請求項82記載の方法。
【請求項84】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
前記検出後に、試料から生成された捕獲されたライゲーション産物配列の量を、既知量の標的ヌクレオチド配列を含む試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の検量線と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を、定量する段階。
【請求項85】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
前記混合が、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を生成するために混合することを含み、各セットが、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び固体支持体上の捕獲用オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成された捕獲されたライゲーション産物の量を、捕獲された他のライゲーション産物の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項86】
一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、一つ又は複数の単独のヌクレオチド部位で試料中の標的ヌクレオチド配列と異なる、請求項85記載の方法。
【請求項87】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で、所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項86記載の方法。
【請求項88】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、異なる標的特異的部分を有し、これが所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列に、塩基特異的方法でハイブリダイズする、請求項86記載の方法。
【請求項89】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の2つ以上を未知量潜在的に含み、以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
検出後に、試料中の各々の多数の標的配列により形成された捕獲されたライゲーション産物配列の相対量を比較することにより、試料中の各々の多数の標的ヌクレオチド配列の相対量を定量し、これにより試料中の2つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量的尺度を提供する段階。
【請求項90】
重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブセットにより、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別される、請求項79記載の方法。
【請求項91】
オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらは標的ヌクレオチド配列に同様のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項79記載の方法。
【請求項92】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、異なる部位で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項93】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項92記載の方法。
【請求項94】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が、重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブ群で識別される、請求項92記載の方法。
【請求項95】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項94記載の方法。
【請求項96】
単独の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要としている一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子とハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上の異なる位置で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される一つ又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項97】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、及びマイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズするように、異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請求項79記載の方法。
【請求項98】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異、又は過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、及び第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、異なる位置で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の少量の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項99】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中の任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項98記載の方法。
【請求項100】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異、又は過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異が、試料中で定量される方法であり、以下の段階を更に含む、請求項99記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
各セットが、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを含み、ここで群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で、正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列とハイブリダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、上記混合は、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を形成するために混合することを含む、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段階;
固体支持体上に特定部位で捕獲された、ライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列により作製された捕獲されたライゲーション産物の量を、少量の未知の試料から作製された他の捕獲されたライゲーション産物の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項101】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、選択された条件下で、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項100記載の方法。
【請求項102】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、所定の対立遺伝子に塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、特定部位で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の異なるレポーター標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項103】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項102記載の方法。
【請求項104】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項102記載の方法。
【請求項105】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項104記載の方法。
【請求項106】
単独の標的ヌクレオチド配列における一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列における一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異を識別し、オリゴヌクレオチドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有するか、もしくは第一のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に特定の位置で捕獲された各群の多数の標識されたライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより、試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項107】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項106記載の方法。
【請求項108】
ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異を識別し、オリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特異的部分を伴うプローブを含む、請求項106記載の方法。
【請求項109】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項108記載の方法。
【請求項110】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でそれらの5'側塩基のみが異なり、かつ異なるレポーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基に隣接するそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項107記載の方法。
【請求項111】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合に、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の3'側塩基もしくはライゲーション接合部のこの塩基に隣接する3'側塩基にミスマッチを有するか、又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の5'側塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項107記載の方法。
【請求項112】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の2個以上の隣接するコドンもしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項111記載の方法。
【請求項113】
変性処理が約80〜105℃で行われる、請求項79記載の方法。
【請求項114】
変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイクルが、約30秒〜約5分間の長さである、請求項79記載の方法。
【請求項115】
前記供する段階が2サイクルから50サイクル繰り返される、請求項79記載の方法。
【請求項116】
前記供する段階の総時間が1分から250分間である、請求項79記載の方法。
【請求項117】
リガーゼが、サーマスアクアティカスリガーゼ、サーマスサーモフィラス リガーゼ、大腸菌リガーゼ、T4リガーゼ、サーマス種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクスリガーゼ、サーモトガマリチマリガーゼ、及びピロコッカスリガーゼからなる群より選択される、請求項79記載の方法。
【請求項118】
検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、及び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項79記載の方法。
【請求項119】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々、40℃〜85℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項79記載の方法。
【請求項120】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、20ヌクレオチド長から28ヌクレオチド長を有する、請求項79記載の方法。
【請求項121】
混合物が担体DNAを更に含む、請求項79記載の方法。
【請求項122】
前記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットについて、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションする部位でミスマッチを生じたライゲーション産物配列の形成速度が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのマッチしたライゲーション産物配列の形成速度の0.005未満であるような形成速度を達成する、請求項79記載の方法。
【請求項123】
以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。
【請求項124】
前記増幅が、ポリメラーゼに基づく増幅法に試料を供することにより実施される、請求項123記載の方法。
【請求項125】
前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、DNAポリメラーゼにより実施される、請求項123記載の方法。
【請求項126】
固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料から製造される、請求項79記載の方法。
【請求項127】
前記検出が、以下の段階を含む、請求項79記載の方法:
特定部位で固体支持体をスキャンする段階;及び
オリゴヌクレオチドプローブセットのライゲーションが生じたかどうかを確定し、かつ同定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付ける段階。
【請求項128】
多数の捕獲用オリゴヌクレオチドが各々、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項79記載の方法。
【請求項129】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを内部挿入又は欠失を伴わずに1端で互いに並置したときに、ヌクレオチド総数の4個毎に少なくとも1個につき、アレイ上のその隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドと異なる、請求項128記載の方法。
【請求項130】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが前記接触中にそれにハイブリダイズしないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔てられた、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項128記載の方法。
【請求項131】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度より低い温度で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項79記載の方法。
【請求項132】
以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊する段階。
【請求項133】
前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求項132記載の方法。
【請求項134】
以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。
【請求項135】
固体支持体が、異なる位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請求項79記載の方法。
【請求項136】
固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識により検出されかつ識別される、請求項79記載の方法。
【請求項137】
負電荷を遮蔽するのに有用な条件が、接触を二価のカチオン含有化合物の存在下で実施することに関連する、請求項79記載の方法。
【請求項138】
二価のカチオンが、Mg+2、Ca+2、Mn+2及びCO+2からなる群より選択される、請求項137記載の方法。
【請求項139】
二価のカチオンがMg+2である、請求項138記載の方法。
【請求項140】
負電荷を遮蔽するのに有効な条件が、6.0又はそれ以下のpHで前記接触を実施することを含む、請求項79記載の方法。
【請求項141】
負電荷を遮蔽するのに有効な条件が、中和剤による遊離カルボン酸基のキャッピングを含む、請求項79記載の方法。
【請求項142】
中和剤が、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、イソプロパノールアミン、及びジイソプロパノールアミンからなる群より選択される、請求項141記載の方法。
【請求項143】
中和剤がエタノールアミンである、請求項142記載の方法。
【請求項144】
前記接触が、固体支持体の存在下での混合物の混合により実施される、請求項79記載の方法。
【請求項145】
位置特定可能なアレイ特異的部分が、前記接触中に、温度60℃から70℃で、捕獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項79記載の方法。
【請求項146】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:300未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項147】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:900未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項146記載の方法。
【請求項148】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:3000未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項147記載の方法。
【請求項149】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:9000未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項148記載の方法。
【請求項150】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:20未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項79記載の方法。
【請求項151】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:50未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項150記載の方法。
【請求項152】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:100未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項151記載の方法。
【請求項153】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:200未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項152記載の方法。
【請求項1】
以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる多数の配列の、一つ又は複数を同定する方法:
多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のある試料を提供する段階;
各セットが(a)標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合には相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
リガーゼを提供する段階;
混合物を形成するために、試料、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合する段階;
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれもが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、オリゴヌクレオチドプローブセットが、その各々の標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合は隣接した位置で塩基特異的に当該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いにライゲーションして、 (a)位置特定可能なアレイ特異的部分、(b)互いに結合した標的特異的部分、及び(c)検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物配列を形成し、また、オリゴヌクレオチドプローブセットがその各々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるものの、一つまたは複数のミスマッチが存在するために相互にライゲーションせず変性処理中に個別に分離される、ハイブリダイゼーション処理を含む、一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに混合物を供する段階;
多孔質表面および、特定部位に固定された種々の、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を提供する段階;
前述の供する段階後、塩基特異的方法で位置特定可能なアレイ特異的部分が捕獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに効果的な条件下で、混合物を固体支持体と接触させ、これにより位置特定可能なアレイ特異的部分を相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う部位で固体支持体上に捕獲する段階;並びに
固体支持体に特定部位で捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標識を検出し、これにより試料中に一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列が存在することを示す段階。
【請求項2】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項1記載の方法。
【請求項3】
ミスマッチがライゲーション接合部の3'側塩基にある、請求項2記載の方法。
【請求項4】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項1記載の方法。
【請求項5】
ミスマッチがライゲーション接合部の3'側塩基に隣接した塩基にある、請求項4記載の方法。
【請求項6】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
前述の検出後に、試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の量を、既知量の標的ヌクレオチド配列を伴う試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の検量線と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項7】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
前記混合が、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを、混合物を生成するために混合することを含み、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在し、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び固体支持体上の捕獲用オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより各セットが特徴付けられる、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から作製された捕獲されたライゲーション産物の量と、捕獲された他のライゲーション産物の量とを比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項8】
一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、試料中の標的ヌクレオチド配列と、一つ又は複数の単ヌクレオチド部位で異なる、請求項7記載の方法。
【請求項9】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項8記載の方法。
【請求項10】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項8記載の方法。
【請求項11】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の2つ以上を未知量含む可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
検出後に、試料中の各々の多数の標的配列により作製された捕獲されたライゲーション産物配列の相対量を比較することにより、試料中の各々の多数の標的ヌクレオチド配列の相対量を定量し、これにより試料中の2つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量的尺度を提供する段階。
【請求項12】
重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブセットにより、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異、または、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異が識別される、請求項1記載の方法。
【請求項13】
オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらが同様のハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項1記載の方法。
【請求項14】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に異なる部位で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の試料中の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項15】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項14記載の方法。
【請求項16】
重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブ群により、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異、または複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異が識別される、請求項14記載の方法。
【請求項17】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項16記載の方法。
【請求項18】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子と塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上の異なる位置で捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される一つ又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項19】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、及びマイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子に塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請求項18記載の方法。
【請求項20】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列中の、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異、又は、過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異が識別され、
オリゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、検出において、異なる位置で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、試料中における、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の少量の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項21】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中の任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項20記載の方法。
【請求項22】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異、又は、過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異が、試料中で定量される、以下の段階を更に含む、請求項20記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
各セットが、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された、一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列とハイブリダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、混合は、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を生成するために混合することを含む、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段階;
固体支持体上に特定の部位で捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列より作製された捕獲されたライゲーション産物の量と、少量の未知の試料より作製された他の捕獲されたライゲーション産物の量とを比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項23】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、選択された条件下で対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項22記載の方法。
【請求項24】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、
オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、
各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、
各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、
上記検出において、固体支持体上に特定の部位で捕獲された各群のライゲーション産物配列の異なるレポーター標識が検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項25】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項24記載の方法。
【請求項26】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項24記載の方法。
【請求項27】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位で相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項26記載の方法。
【請求項28】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有するか、もしくは第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に特定の部位で捕獲された各群の多数の標識されたライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。
【請求項29】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項28記載の方法。
【請求項30】
ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特異的部分を伴うプローブを含む、請求項28記載の方法。
【請求項31】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項30記載の方法。
【請求項32】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でのそれらの5'側塩基のみが異なり、かつ異なるレポーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でのそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基に隣接するそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項29記載の方法。
【請求項33】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の3'側塩基もしくはライゲーション接合部のこの塩基に隣接する塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有するか、又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の5'側塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項29記載の方法。
【請求項34】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の2個以上の隣接するコドンについての、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項33記載の方法。
【請求項35】
変性処理が約80℃〜105℃で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項36】
変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイクルが、約30秒から約5分間の長さである、請求項1記載の方法。
【請求項37】
前記供する段階が2サイクルから50サイクル繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項38】
前記供する段階の総時間が1分から250分間である、請求項1記載の方法。
【請求項39】
リガーゼが、サーマスアクアティカス(Thermus aquaticus)リガーゼ、サーマスサーモフィラス(Thermus thermophilus)リガーゼ、大腸菌(E.coli)リガーゼ、T4リガーゼ、サーマス(Thermus)種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクス(Aquifex aeolicus)リガーゼ、サーモトガマリチマ(Thermotoga maritima)リガーゼ、及びピロコッカス(Pyrococcus)リガーゼからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項40】
検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、及び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項41】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々、40℃〜85℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項1記載の方法。
【請求項42】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、20 ヌクレオチド長から28ヌクレオチド長を有する、請求項1記載の方法。
【請求項43】
混合物が更に担体DNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項44】
前記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットについて、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションする部位でミスマッチを生じたライゲーション産物の生成速度が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのマッチしたライゲーション産物配列の生成速度の0.005未満であるような生成速度を実現する、請求項1記載の方法。
【請求項45】
以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。
【請求項46】
前記増幅が、試料をポリメラーゼに基づく増幅法へ供することにより実施される、請求項45記載の方法。
【請求項47】
前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、DNAポリメラーゼにより実施される、請求項45記載の方法。
【請求項48】
固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で製造されている、請求項1記載の方法。
【請求項49】
前記検出が、以下の段階を含む、請求項1記載の方法:
特定の部位で固体支持体をスキャニングし、オリゴヌクレオチドプローブセットのライゲーションが生じたかどうかを確定する段階;及び
確定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付ける段階。
【請求項50】
多数の捕獲用オリゴヌクレオチドが各々、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の方法。
【請求項51】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを内部挿入又は欠失を伴わずに1端で互いに並置したときに、ヌクレオチド総数の4個毎に少なくとも1個につき、アレイ上のその隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドと異なる、請求項50記載の方法。
【請求項52】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが前記接触中にそれにハイブリダイズしないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔てられた、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項50記載の方法。
【請求項53】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項1記載の方法。
【請求項54】
以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊する段階。
【請求項55】
前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求項54記載の方法。
【請求項56】
以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:
捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。
【請求項57】
固体支持体が、異なる位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請求項1記載の方法。
【請求項58】
固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識により検出されかつ識別される、請求項1記載の方法。
【請求項59】
多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリマーである、請求項1記載の方法。
【請求項60】
機能性モノマーがアクリル酸である、請求項59記載の方法。
【請求項61】
機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、請求項59記載の方法。
【請求項62】
親水性ポリマーが、50:1未満のレベルで架橋される、請求項59記載の方法。
【請求項63】
親水性ポリマーが、500:1未満のレベルで架橋される、請求項62記載の方法。
【請求項64】
以下を含む、固体支持体上のオリゴヌクレオチドアレイ:
多孔質表面及び各々オリゴヌクレオチド結合に適した位置のアレイを有する、固体支持体;
各アレイ位置で固体支持体に結合した、固体支持体へのオリゴヌクレオチドのカップリングに適したリンカー又は支持体;及び
アレイ位置の少なくとも一部が16個のヌクレオチドより大きいオリゴヌクレオチドで占有される、固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ。
【請求項65】
異なるオリゴヌクレオチドが、固体支持体上の異なるアレイ位置に結合し、異なる核酸を検出する、請求項64記載のアレイ。
【請求項66】
固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で製造された、請求項64記載のアレイ。
【請求項67】
固体支持体が、アレイ位置に結合したオリゴヌクレオチドを伴うアレイ位置を有する、請求項64記載のアレイ。
【請求項68】
多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリマーである、請求項64記載のアレイ。
【請求項69】
機能性モノマーがアクリル酸である、請求項68記載のアレイ。
【請求項70】
機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、請求項68記載のアレイ。
【請求項71】
親水性ポリマーが、50:1未満のレベルで架橋される、請求項68記載のアレイ。
【請求項72】
親水性ポリマーが、500:1未満のレベルで架橋される、請求項68記載のアレイ。
【請求項73】
以下を含む、多数の標的ヌクレオチド配列中の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列の一つ又は複数を同定するキット:
リガーゼ;
各セットが(a)標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)標的配列特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブで特徴付けられ、ここで特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット;並びに
捕獲用オリゴヌクレオチドが、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する、多孔質表面及び特定の部位で固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体。
【請求項74】
リガーゼが、サーマスアクアティカスリガーゼ、サーマスサーモフィラスリガーゼ、大腸菌リガーゼ、T4リガーゼ、サーマス種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクスリガーゼ、サーモトガマリチマリガーゼ、及びピロコッカスリガーゼからなる群より選択される、請求項73記載のキット。
【請求項75】
以下を更に含む、請求項73記載のキット:
標的ヌクレオチド配列の一次増幅に適した、増幅プライマー;及び
ポリメラーゼ。
【請求項76】
固体支持体が、異なる特定の位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位にハイブリダイズしかつ検出される、請求項73記載のキット。
【請求項77】
固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これによりオリゴヌクレオチドプローブセットが、異なる標識により検出されかつ識別される、請求項73記載のキット。
【請求項78】
オリゴヌクレオチドプローブセット及び捕獲用オリゴヌクレオチドが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドプローブセットがそれぞれ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された、請求項73記載のキット。
【請求項79】
以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列の一つ又は複数を同定する方法:
多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含む可能性がある試料を提供する段階;
各セットが(a)標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
リガーゼを提供する段階;
混合物を形成するために、試料、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合する段階;
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれもが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、オリゴヌクレオチドプローブセットが、その各々の標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合は隣接した位置で塩基特異的に当該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いにライゲーションして(a)位置特定可能なアレイ特異的部分、(b)互いに結合した標的特異的部分、及び(c)検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物配列を形成し、また、オリゴヌクレオチドプローブセットがその各々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるものの、一つまたは複数のミスマッチが存在するために相互にライゲーションせず変性処理中に個別に分離される、ハイブリダイゼーション処理を含む、一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに混合物を供する段階;
特定の部位に固定された、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体を提供する段階;
前述の供する段階の後に、混合物を、負電荷を遮蔽しかつ塩基特異的方法で捕獲用オリゴヌクレオチドに対し位置特定可能なアレイ特異的部分をハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、固体支持体と接触させ、これにより、位置特定可能なアレイ特異的部分を固体支持体上に相補的捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う位置で捕獲する段階;並びに
固体支持体上に特定の部位で捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標識を検出し、これにより、試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階。
【請求項80】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項79記載の方法。
【請求項81】
ミスマッチが、ライゲーション接合部の3'側塩基にある、請求項80記載の方法。
【請求項82】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項80記載の方法。
【請求項83】
ミスマッチが、ライゲーション接合部の3'側塩基に隣接した塩基にある、請求項82記載の方法。
【請求項84】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
前記検出後に、試料から生成された捕獲されたライゲーション産物配列の量を、既知量の標的ヌクレオチド配列を含む試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の検量線と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を、定量する段階。
【請求項85】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
前記混合が、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を生成するために混合することを含み、各セットが、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び固体支持体上の捕獲用オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成された捕獲されたライゲーション産物の量を、捕獲された他のライゲーション産物の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項86】
一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、一つ又は複数の単独のヌクレオチド部位で試料中の標的ヌクレオチド配列と異なる、請求項85記載の方法。
【請求項87】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で、所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項86記載の方法。
【請求項88】
オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、異なる標的特異的部分を有し、これが所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列に、塩基特異的方法でハイブリダイズする、請求項86記載の方法。
【請求項89】
試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の2つ以上を未知量潜在的に含み、以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
検出後に、試料中の各々の多数の標的配列により形成された捕獲されたライゲーション産物配列の相対量を比較することにより、試料中の各々の多数の標的ヌクレオチド配列の相対量を定量し、これにより試料中の2つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量的尺度を提供する段階。
【請求項90】
重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブセットにより、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別される、請求項79記載の方法。
【請求項91】
オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらは標的ヌクレオチド配列に同様のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項79記載の方法。
【請求項92】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、異なる部位で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項93】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項92記載の方法。
【請求項94】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が、重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブ群で識別される、請求項92記載の方法。
【請求項95】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項94記載の方法。
【請求項96】
単独の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要としている一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子とハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上の異なる位置で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される一つ又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項97】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、及びマイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズするように、異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請求項79記載の方法。
【請求項98】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異、又は過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、及び第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、異なる位置で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の少量の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項99】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中の任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項98記載の方法。
【請求項100】
過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異、又は過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異が、試料中で定量される方法であり、以下の段階を更に含む、請求項99記載の方法:
既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;
各セットが、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;
各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを含み、ここで群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で、正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列とハイブリダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、上記混合は、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を形成するために混合することを含む、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段階;
固体支持体上に特定部位で捕獲された、ライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに
既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列により作製された捕獲されたライゲーション産物の量を、少量の未知の試料から作製された他の捕獲されたライゲーション産物の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
【請求項101】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、選択された条件下で、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項100記載の方法。
【請求項102】
単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、所定の対立遺伝子に塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、特定部位で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の異なるレポーター標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項103】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項102記載の方法。
【請求項104】
単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項102記載の方法。
【請求項105】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項104記載の方法。
【請求項106】
単独の標的ヌクレオチド配列における一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列における一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異を識別し、オリゴヌクレオチドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有するか、もしくは第一のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に特定の位置で捕獲された各群の多数の標識されたライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより、試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項107】
所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項106記載の方法。
【請求項108】
ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異を識別し、オリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特異的部分を伴うプローブを含む、請求項106記載の方法。
【請求項109】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項108記載の方法。
【請求項110】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でそれらの5'側塩基のみが異なり、かつ異なるレポーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基に隣接するそれらの3'側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項107記載の方法。
【請求項111】
セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合に、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の3'側塩基もしくはライゲーション接合部のこの塩基に隣接する3'側塩基にミスマッチを有するか、又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の5'側塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項107記載の方法。
【請求項112】
単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の2個以上の隣接するコドンもしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項111記載の方法。
【請求項113】
変性処理が約80〜105℃で行われる、請求項79記載の方法。
【請求項114】
変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイクルが、約30秒〜約5分間の長さである、請求項79記載の方法。
【請求項115】
前記供する段階が2サイクルから50サイクル繰り返される、請求項79記載の方法。
【請求項116】
前記供する段階の総時間が1分から250分間である、請求項79記載の方法。
【請求項117】
リガーゼが、サーマスアクアティカスリガーゼ、サーマスサーモフィラス リガーゼ、大腸菌リガーゼ、T4リガーゼ、サーマス種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクスリガーゼ、サーモトガマリチマリガーゼ、及びピロコッカスリガーゼからなる群より選択される、請求項79記載の方法。
【請求項118】
検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、及び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項79記載の方法。
【請求項119】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々、40℃〜85℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項79記載の方法。
【請求項120】
オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、20ヌクレオチド長から28ヌクレオチド長を有する、請求項79記載の方法。
【請求項121】
混合物が担体DNAを更に含む、請求項79記載の方法。
【請求項122】
前記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットについて、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションする部位でミスマッチを生じたライゲーション産物配列の形成速度が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのマッチしたライゲーション産物配列の形成速度の0.005未満であるような形成速度を達成する、請求項79記載の方法。
【請求項123】
以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。
【請求項124】
前記増幅が、ポリメラーゼに基づく増幅法に試料を供することにより実施される、請求項123記載の方法。
【請求項125】
前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、DNAポリメラーゼにより実施される、請求項123記載の方法。
【請求項126】
固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料から製造される、請求項79記載の方法。
【請求項127】
前記検出が、以下の段階を含む、請求項79記載の方法:
特定部位で固体支持体をスキャンする段階;及び
オリゴヌクレオチドプローブセットのライゲーションが生じたかどうかを確定し、かつ同定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付ける段階。
【請求項128】
多数の捕獲用オリゴヌクレオチドが各々、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項79記載の方法。
【請求項129】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを内部挿入又は欠失を伴わずに1端で互いに並置したときに、ヌクレオチド総数の4個毎に少なくとも1個につき、アレイ上のその隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドと異なる、請求項128記載の方法。
【請求項130】
各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが前記接触中にそれにハイブリダイズしないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔てられた、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項128記載の方法。
【請求項131】
オリゴヌクレオチドプローブセットが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度より低い温度で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項79記載の方法。
【請求項132】
以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊する段階。
【請求項133】
前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求項132記載の方法。
【請求項134】
以下の段階を更に含む、請求項79記載の方法:
捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。
【請求項135】
固体支持体が、異なる位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請求項79記載の方法。
【請求項136】
固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識により検出されかつ識別される、請求項79記載の方法。
【請求項137】
負電荷を遮蔽するのに有用な条件が、接触を二価のカチオン含有化合物の存在下で実施することに関連する、請求項79記載の方法。
【請求項138】
二価のカチオンが、Mg+2、Ca+2、Mn+2及びCO+2からなる群より選択される、請求項137記載の方法。
【請求項139】
二価のカチオンがMg+2である、請求項138記載の方法。
【請求項140】
負電荷を遮蔽するのに有効な条件が、6.0又はそれ以下のpHで前記接触を実施することを含む、請求項79記載の方法。
【請求項141】
負電荷を遮蔽するのに有効な条件が、中和剤による遊離カルボン酸基のキャッピングを含む、請求項79記載の方法。
【請求項142】
中和剤が、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、イソプロパノールアミン、及びジイソプロパノールアミンからなる群より選択される、請求項141記載の方法。
【請求項143】
中和剤がエタノールアミンである、請求項142記載の方法。
【請求項144】
前記接触が、固体支持体の存在下での混合物の混合により実施される、請求項79記載の方法。
【請求項145】
位置特定可能なアレイ特異的部分が、前記接触中に、温度60℃から70℃で、捕獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項79記載の方法。
【請求項146】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:300未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項79記載の方法。
【請求項147】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:900未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項146記載の方法。
【請求項148】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:3000未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項147記載の方法。
【請求項149】
前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1:9000未満で、ライゲーション産物の存在を示す、請求項148記載の方法。
【請求項150】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:20未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項79記載の方法。
【請求項151】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:50未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項150記載の方法。
【請求項152】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:100未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項151記載の方法。
【請求項153】
前記検出が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:200未満で、非標的ヌクレオチド配列と1塩基差異で異なる標的ヌクレオチド配列が存在することを示す、請求項152記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34A】
【図34B】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
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【図44】
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【図33】
【図34A】
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【図40】
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【図43】
【図44】
【公開番号】特開2011−200230(P2011−200230A)
【公開日】平成23年10月13日(2011.10.13)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−91716(P2011−91716)
【出願日】平成23年4月18日(2011.4.18)
【分割の表示】特願2000−606786(P2000−606786)の分割
【原出願日】平成12年3月17日(2000.3.17)
【出願人】(500056220)コーネル リサーチ ファンデーション インク. (7)
【出願人】(305023366)リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ (39)
【出願人】(501368698)ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステイト ユニバーシティ アンド アグリカルチュラル アンド メカニカル カレッジ (1)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成23年10月13日(2011.10.13)
【国際特許分類】
【出願日】平成23年4月18日(2011.4.18)
【分割の表示】特願2000−606786(P2000−606786)の分割
【原出願日】平成12年3月17日(2000.3.17)
【出願人】(500056220)コーネル リサーチ ファンデーション インク. (7)
【出願人】(305023366)リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ (39)
【出願人】(501368698)ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステイト ユニバーシティ アンド アグリカルチュラル アンド メカニカル カレッジ (1)
【Fターム(参考)】
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