低免疫原性のタンパク質製剤のための組成物および方法
低免疫原性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド製剤にかかる方法および組成物に関する。前記方法は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと、セリン含有化合物または他のホスファチジル化合物もしくはリン脂質でありうる結合剤との複合体の形成を含む。形成された複合体は、単純複合体、ミセル、渦巻形構造、リポソーム、非二重層、および新規な脂質構造を有する。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの抗原性および免疫原性はこのような複合体の形成によって減弱される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低い免疫原性を有するタンパク質複合体およびこれを作るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、ファクターVIII(抗血友病ファクター，ＡＨＦあるいはＦVIII)の欠損によってもたらされる出血性疾患である。ＦVIIIは６つのドメインＡ１，Ａ２，Ａ３，Ｂ，Ｃ１およびＣ２からなるマルチドメインタンパク質であり、トロンビンによるこのタンパク質の活性化は、重鎖(Ａ１およびＡ２)と軽鎖(Ａ３，Ｃ１およびＣ２)内に生じる[１,２]。血液濃縮物、組換えファクターVIIIおよびファクターVIIIの変異体を用いた補充療法が、血友病のための一次治療である。しかしながら、１５〜３５％の患者では中和抗体が発現し、 このような免疫応答は血友病の治療を損なう。中和抗体の発現を克服するための最新の治療計画が存在するが、コスト効率が良くない。免疫原性のより少ないファクターVIII製剤の開発は、代替的なクリニカル・アプローチを提供しうる。
【０００３】
一般に、治療用タンパク質への免疫応答は、以下の理由が原因とされている；(ｉ)投与経路、(ii)凝集物の存在、(iii)頻回投与、および(iv)特定のエピトープ領域［３］。最近、ＦVIIIが凝集物を形成する傾向をもつことが明らかになったが［４］、免疫応答の進行におけるこれらの凝集物の役割はよく理解されていない。さらに、ＦVIII分子上には主に２つのエピトープ領域、Ｃ２およびＡ２ドメインが存在する。スカンデラら［５］は、抗体価が軽鎖のＣ２ドメインに対して最も高いことを明らかにした。Ｃ２ドメインは膜結合ドメインでもあり、それはその凝固カスケードの一環として血小板膜上のホスファチジルセリン(ＰＳ)に結合する［６，７］。Ｃ２ドメインに対する抗体の抗凝固作用は、リン脂質へのファクターVIIIの結合阻害に起因する。Ｃ２ドメインに対するモノクローナル抗体が、リン脂質含有膜へのファクターVIIIの結合を妨げることが明らかにされ、そしてこれらの観察に基づいて、エピトープと膜結合領域が重複することが結論づけられた［１０，１１］。
【０００４】
ＦVIIIのリポソーム封入に関する従来の研究は、従来のリポソーム内へのＦVIII(VIIIファクター)の封入効率を増加することを目的とし、さらに生体内安定性および経口バイオアベイラビリティの増加を目的とする［１２，１３］。その分子構造に起因して、脂質分子は、リポソーム、ミセル、非二重層構造および渦巻形構造などの複数の分子アセンブリを形成する傾向がある。これらの分子アセンブリを、タンパク質およびペプチドを含むいくつかの薬物の治療特性を改良するための薬物送達媒体として使用するため、多数の研究が行われてきた。これらの治療の特徴は、循環時間の延長、毒性の低減、免疫応答の亢進および生体内分解の減少である［１４-２５］。したがって、リポソームは免疫応答を増加させるためのアジュバント(adjuvants)として使用されてきた［２６-３１］。
【０００５】
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【非特許文献７】Saenko, E.L., Yakhyaev, A.V., Mikhailenko, I., Strickland, D.K. & Sarafanov, A.G. Role of the low density lipoprotein-related protein receptor in mediation of factor VIII catabolism. Journal of Biological Chemistry. 274, 37685-92 (1999).
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、免疫応答および抗原性を減じるための脂質複合体の開発は研究されておらず、それゆえ、治療用タンパク質の免疫原性を減少させるためのアプローチを開発する必要性が引き続き存在している。免疫毒性を減少させるために特定のエピトープの配列を変更する別のアプローチがある［３２］。しかしながら、そのようなアミノ酸置換は生物活性の損失をもたらす可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、低い抗原性と免疫原性を有する組成物およびその製造方法を開示する。したがって、タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドのような治療薬、およびその免疫原性と抗原性を減じるように前記タンパク質に結合できる一以上の分子(本明細書中で結合剤と呼ぶ)を含む組成物が開示される。このような結合剤には、ホスホセリン、ホスファチジルセリンもしくはホスファチジルセリン(ＰＳ)を含むリン脂質等のセリン化合物；ホスファチジルコリン(ＰＣ)，ホスファチジン酸(ＰＡ)，もしくはホスホエタノールアミン(ＰＥ)；またはＰＡ，ＰＣもしくはＰＥを含むリン脂質が含まれる。
【０００８】
前記のタンパク質-結合剤複合体は、その免疫応答を減じる(１)タンパク質-結合剤複合体を含む液体またはこの液体の凍結乾燥剤、(２)新規な非リポソーム構造、(３)リポソーム、(４)ミセル、(５)渦巻形、(６)非二重層構造の形で存在しうる。
【０００９】
本発明はまた、結合剤(セリン含有化合物など)と複合体を形成することによってタンパク質の免疫原性および／または抗原性を減じる方法を開示する。前記タンパク質-結合剤複合体は、適切な緩衝剤を用いて安定化しうる。
【００１０】
ある実施形態では、ジミリスチルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)および脳ホスファチジルセリン(ｂＰＳ)を含有する乾燥脂質膜は、各種の緩衝系中でタンパク質(ＦVIIIなど)を用いて水和させられる。新規の、非リポソーム構造物は、３００ｍＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２中のＤＭＰＣ、ｂＰＳを用いて形成される。従来のリポソームは、水に変化する緩衝系あるいはリン酸緩衝生理食塩水として形成される。これはカルシウムあるいはＰＳ濃度を減じることによって達成することもできる。ＤＭＰＣの除去および１００％ＰＳと超音波処理もしくは押出ステップの使用は渦巻形構造を導き、中間アシル鎖長のＰＳの使用はミセル構造をもたらす。より低濃度でのより短いアシル鎖長の使用は、溶液中にタンパク質-脂質複合体を産生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＡＨＦ、ファクターVIII およびＦVIIIという語は、同じ分子を意味するために互換的に使用される。
本発明は、タンパク質の抗原性および免疫原性を低減するための方法を提供する。本出願を通して「タンパク質」という語が使用されるが、これはポリペプチド(一般的にはアミノ酸が５０より多いものを指す)のみならずペプチド(一般的にはアミノ酸５０以下を指す)を含む意味で用いられる。
本発明の方法は、リン脂質(好ましくはセリンを含むリン脂質)と一以上のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの複合体を形成するステップを含む。様々な種類のタンパク質-脂質構造が、特定のリン脂質、濃度、リン脂質の組み合わせによって形成されうる。
【００１２】
一般に、「リポソーム」という語は、広く球形のもしくは球状の脂質化合物のクラスターまたは凝集物であって、典型的には一以上の同心円性の層、例えば単層、二重層、多層の形態をとるものを意味する。それらは脂質小胞(lipid vesicles)とも呼ばれる。リポソームは、例えばイオン性脂質および／または非イオン性脂質から形成することができる。
「渦巻形」または「渦巻形構造」という語は通常、一般的にスパイラルまたは細管の形で存在する多重膜の脂質小胞を意味する。
「ミセル」という語は、脂質から形成されるコロイド状の存在を意味する。ミセルは単層、二重層、または六方相構造を構成しうる。
【００１３】
本発明では、結合剤に応じて、タンパク質／ポリペプチド複合体により形成される構造が異なることが観察された。一般的に、セリン含有剤を使用した場合、単純複合体、ミセル、リポソーム、渦巻形構造および新規な凝縮物相が観察された。他のホスファチジル化合物またはリン脂質を使用した場合(例えばＰＣ、ＰＧ、ＰＡもしくはＰＥまたはＰＣ、ＰＧもしくはＰＥ含有リン脂質)、ミセルまたはリポソームのみが観察された。さらに、ＰＥ含有リン脂質だけが、二重層および非二重層(六角形)構造を形成することが観察された。
【００１４】
ホスホセリン、ホスファチジルセリン、もしくは短アシル鎖長(すなわち、４以下のアシル鎖炭素原子を有する)のＰＳ含有リン脂質の使用は、脂質分子アセンブリの形成をもたらさなかった。形成された構造は単純複合体である。これらの単純複合体は、主にイオン性結合によって特徴付けられる。中間アシル鎖長(すなわち、５〜１２アシル鎖炭素原子)のセリン含有リン脂質の使用は、その臨界ミセル濃度以上ではミセルを形成し、臨界ミセル濃度未満では単なる複合体(単純複合体)を形成する。長アシル鎖長(１２〜１８炭素原子)のリン脂質は、その分子構造に起因して、リポソーム、非二重層構造および渦巻形構造などの複数の分子アセンブリを形成する傾向がある。
【００１５】
ＰＣ、ＰＧ、ＰＡおよびＰＥなどの他のホスファチジル化合物およびＰＣ、ＰＧ、ＰＡおよびＰＥ含有リン脂質の使用は、中間長のアシル鎖炭素原子ではミセルの形成をもたらし、より長いアシル鎖炭素原子ではリポソームの形成をもたらす。
【００１６】
全てのリン脂質において、アシル鎖は、ジアシル鎖または単アシル鎖であってもよい。ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールという語は、化合物中にアシル鎖を持たないものを意味する。
【００１７】
脂質組成物は、リポソーム、非二重層構造および渦巻型相を調製するために変更することができる。高ＰＣ含有量を有する、ホスファチジルコリン(ＰＣ)：ホスファチジルセリン(ＰＳ)もしくはホスホセリンの脂質組成物は、Ｃａ２＋とＮａ＋を含む緩衝液を用いた水和によりリポソームを形成するだろう。ホスファチジルエタノールアミンＰＥおよびＰＳの存在は、非二重層構造の形成を促進する。Ｎａ＋を含まないか低濃度(１００ｍＭ)で含むＣａ２＋の存在下では、ＰＳ(９０ｍｏｌ％以上)を伴う処方は、渦巻形シリンダーの形成を促進する。温度、Ｃａ２＋／Ｎａ＋などの条件は、タンパク質-脂質複合体を含むナノ粒子における渦巻形シリンダーのサイズを減じるために変更できる。
【００１８】
本発明にとって有用なリン脂質には、セリン含有化合物を含むリン脂質が含まれる。
このようなセリン含有リン脂質の例として、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリン(ＯＰＬＳ)、ジカプロイルホスファチジルセリン、ジオクタノイルホスファチジルセリン、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジオレオイル-，ジステロイル-ホスファチジルセリンが挙げられる。セリン含有リン脂質は、他の分子を含む他のリン脂質と併用してもよい。例えば、ホスファチジルセリンを、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンと併用してもよい。ある実施形態では、ＰＳ、ＰＣ、ＰＡおよびＰＥはアシル化またはジアシル化される。ホスファチジルセリンは、天然の(脳)あるいは合成起源などの何らかの原料から得ることができる。ホスファチジルセリンは、ホスファチジルコリン(ＰＣ)と併用されてもよい。ホスファチジルコリンはジミリストイルホスファチジルコリンであってもよい。ＰＳとＰＣの比は、１：９〜９：１で変化しうる。一実施形態では、その比は３：７である。
【００１９】
本発明のタンパク質-脂質組成物は、好ましくは適切な緩衝系中で安定化され保管される。このような緩衝剤には、ＴＲＩＳバッファー並びにＨＥＰＥＳバッファー及びナトリウム並びにカルシウム塩が含まれる。任意にアルコール(例えば１０％エタノール)を添加してもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質-脂質複合体は、標準的な方法によって特徴づけられることができる。例えば、励起および発光スリットとして４ｎｍを使用してＳＬＭ ＡＭＩＮＣＯ ８０００シリーズ装置またはＰＴＩ ３８０装置で蛍光研究を行うことができる。サンプルは２８０ｎｍで発光させることができ、その発光スペクトルは３００〜４００ｎｍの範囲でスキャンされる。遊離ファクターVIIIの発光スペクトルは、３３５ｎｍ付近で観察され、ＯＰＬＳの添加は蛍光発光の強度を減じ、タンパク質の三次構造がわずかに変化したことを示した。
【００２１】
さらに、前記の脂質結合タンパク質の粒子サイズは、標準的な粒子サイズ測定器(例えばＮＩＣＯＭＰ ３１５モデル)を使用して測定することができる。粒度分布は、単峰性および二峰性分布のためのガウス分布とＮＩＣＯＭＰ分析の両方を使用して分析することができる。ラテックスビーズのサイズは、各測定でスタンダード・コントロールとして使用できる。
【００２２】
脂質の構造は、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって分析することも可能である。このような方法は当該技術において一般的であり、凝集物がないことを確認するため、およびその構造をリポソーム、非二重層あるいは渦巻形に分類するために使用することができる。非二重層および渦巻形構造の形成は、Ｌａｕｒｄａｎ蛍光を使用して研究することもできる。前記脂質構造は、脂質含有溶液とプローブの水溶液(０．０１％エタノール含有)を混合することによって、プローブで標識することもできる。そのサンプルは３４０ｎｍで励起することができ、その発光スペクトルは４４０ｎｍでモニターされる。励起スペクトルは４４０ｎｍの発光モノクロメータを用いて、３２０および４２０ｎｍの範囲で得ることができる。
【００２３】
本発明のタンパク質-脂質複合体は、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、静脈内、経口、直腸、皮下、局所投与などの標準的な投与手段によって、個体（例えばヒトを含む動物）に送達することができる。前記複合体は、標的部位に直接もしくはその付近に送達されてもよく、または循環中に直接もしくは間接的に送達されてもよい。前記複合体は、当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアーを用いて送達されてもよい。
【００２４】
本発明のタンパク質-脂質複合体は、減弱された抗原性のみならず減弱された免疫原性をも示す。したがって、このような組成物は、個体において治療薬に対する免疫応答を減じるために使用することができる。本発明の組成物は、そのタンパク質への免疫反応がすでに発生した個体に治療薬を送達するために使用することもできる。したがって、これらの組成物は免疫反応の発生前あるいは後に使用することができる。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は特異的ＦVIII-脂質複合体を提供する。前記タンパク質-脂質複合体は、リポソーム、渦巻形、ミセルおよび非二重層構造などの構造だけでなく新規な脂質構造を形成し、免疫応答および抗原性を減弱しうる。その方法は、バッファーコンディションによって適切に安定化された特異的ＦVIII-脂質複合体を構築することを含む。特定の理論に制約されることを意図しないが、この抗原性および免疫原性の低下は、タンパク質-脂質複合体に起因し、リポソームなどの分子アセンブリにおいて、疎水性シールドおよび粒状物質の細胞(抗原提示細胞 ＡＰＣｓ)内取り込みなどの担体特性を含むと信じられる。これらの複合体は、抗体の存在下で凝血活性を有し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてモノクローナル抗体への結合能力を測定した際に減弱した抗原性を示した。前記複合体はまた動物モデルにおいて減弱した免疫応答を示した。本発明は、いまだＦVIIIで治療されていない患者における免疫応答の発達を減じるだけでなく、すでに治療され抗体が構築された患者におけるＦVIII凝血活性を保持するのにも役立つ。
【００２６】
したがって、一実施形態では、本発明はＦVIIIに対する免疫応答を減じる方法を提供する。ここに開示した組成物の使用によって、免疫原性は低減されるが、凝血活性は維持される。免疫原性の低下はリン脂質とＣ２およびＡ２ドメインの複合体形成によって達成されると考えられる。これは、(１)凝集物形成を低下させる、(２)投与回数を減少させる(複合体がクリアランス機構を変え、これにより循環時間がより長くなる)および／または (３)エピトープ領域の立体構造を遮蔽および変えるおよび／または(４)優先的な細胞取り込みを含む担体特性、によって免疫原性を低下させると考えられる。安定性、循環時間を増加させるクリアランス機構の変化、および抗原性並びに免疫原性の低下などの、複合体の改善された薬学的性質は、予想外の観察結果である。
【００２７】
以下の実施例は本発明をより詳細に説明するために存在し、なんら制限を意図しない。
【実施例１】
【００２８】
本実施例は、本発明にかかるタンパク質-脂質複合体の調製を説明する。この実施形態を説明するため、ＦVIIIが使用された。２５ｍＭのＴＲＩＳ、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２中で２０ｕｇの前記タンパク質と５および２０ｍＭのＯＰＬＳを混合することによって、ＦVIII-Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリン(ＯＰＬＳ)複合体を形成した。
【実施例２】
【００２９】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質複合体(実施例１)の安定性について説明するものである。遊離ＦVIIIにとって前記タンパク質のアンフォールディングはタンパク質の凝集をもたらし、これは次にアンフォールディングの不可逆性を引き起こす。凝集はＣ２ドメイン中のわずかな立体構造変化によって開始される。タンパク質、およびＦVIIIのＣ２ドメインに結合すると信じられるＯ-ホスホ-Ｌ-セリンを含有する製剤の安定性を測定するために、アンフォールディング／リフォールディングの調査を、遊離ＦVIIIおよび実施例１に記載したＰＳと複合体を形成したＦVIIIを用いて行った。
【００３０】
組換えヒトＦVIII(ｒＦVIII)の温度依存性の物理的および機能的変化を研究するために、円偏光二色性(ＣＤ)、蛍光偏光測定法、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)、ドメイン特異的抗体結合、および凝血活性の調査を行った。フォールディングおよびアンフォールディングを測定するために、ＣＤスペクトルの調査を行った。ＣＤスペクトルはｄ１０ショウノウスルホン酸で較正したＪＡＳＣＯ-７１５分光偏光計を用いて得た。サンプルは二次構造分析のために２５５〜２０８ｎｍの範囲で調査され、そして典型的には、使用したタンパク質濃度は２０〜２２μｇ／ｍｌであった。タンパク質のＣＤスペクトルは、バッファー・ベースラインのスペクトルを差し引くことによって補正した。シグナルのクオリティを高めるために複数の調査を行い、平均化した。タンパク質の融解は、２．５℃ごとに２分の保持時間で２０〜８０℃の温度範囲にわたって行った。温度調査は、Ｐｅｌｔｉｅｒ ３００ＲＴＳユニットを用いて行い、その分析結果は、製造業者によって提供されるソフトウェアを用いて作成した。アンフォールディング特性の加熱速度依存は、キネティック・コントロール下でタンパク質の熱変性が少なくともある程度存在することを示した(図１)。フォールディングモデルは、ファクターVIIIの凝集キネティクスを説明するために提唱された。このモデルに基づき、ファクターVIIIのアンフォールディングは、単なる二状態のキネティックモデル［凝集性(Ａ)→未変性(Ｎ)、ここでｋはアレニウス式によって与えられるように、温度に伴って変化する一次速度定数である］において解釈される。上記遷移に関する活性化エネルギーは、〜１２７．９８ Ｋｃａｌ／Ｍｏｌｅ(〜５３４．９７ ＫＪ／Ｍｏｌｅ)と算出された。抗体結合の研究は、Ｃ２ドメインの脂質-結合領域(２３０３-２３３２)中の立体構造変化が、少なくともある程度、凝集の開始に関与しうることを示した（図２）。ＯＰＬＳの存在下および不存在下におけるＦVIIIのＳＥＣ特性の分析は、単量体の集団がＰＳの存在下の凝集性タンパク質のものより有意に高いことを明確に示し、これはファクターVIIIの凝集キネティクスにおけるＯＰＬＳの干渉が原因かもしれない（図３）。前記データは、複合体がＦVIIIの安定性を改善し、凝集物を減らすことによって免疫原性を減じるのに役立ちうることを示す。
【００３１】
本実施例のさらなる実例では、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンは前記タンパク質と複合体を形成する（Ｃ２ドメインを遮蔽すると思われる）。２０ｕｇ／ｍｌのタンパク質と５および２０ｍＭのホスホ-Ｌ-セリンとを、２５ｍＭのＴＲＩＳ、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含む別のバッファー中で混合した。モノクローナル抗体への結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって調査した。図４に示すように、添加無しのタンパク質では凝集が原因で未変性様構造の回復は不可能であり、一方、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンの存在は未変性構造の実質的な回復をもたらした。
【実施例３】
【００３２】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質組成物(実施例１)が、Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、前記タンパク質に対し免疫原性を減弱することを実証する。この実施形態を説明するために、ＯＰＬＳ-ファクターVIII複合体を、Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。このラットモデルは、ＦVIIIへの抗体開発を研究するのに好適であることが実証されている。ＥＬＩＳＡによって、遊離ＦVIIIおよびＦVIII-ＰＳ複合体に対する抗体価を測定した。投与から２週間、ファクターVIII-ＯＰＬＳ複合体に対する抗体価の分析が非免疫毒性であることが見い出された。遊離ＦVIIIに対する抗体価は５６３．７２±９１６．１５であり、ＦVIII-ＯＰＬＳ複合体に対する検出可能な抗体価は観察されなかった。
【実施例４】
【００３３】
本実施例は、ホスホセリンが、免疫原性を減少させる単純複合体において必須であることを実証する。本実施例を説明するために、ホスホセリン、ホスホコリンまたはホスファチジン酸を用いて単純複合体を調製した。免疫原性は、血友病Ａマウスにおいて複合体の皮下投与によってテストした。総抗体価(ＥＬＩＳＡによって測定)または特異的阻害力価(Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｕｎｉｔｓ)を図５Ａおよび５Ｂに示す。効果はホスホセリンでは統計的に有意であったが、ホスホコリンまたはホスファチジン酸では統計的に有意ではなかった。
【実施例５】
【００３４】
本実施例は、本発明の組成物を小さな単層ベシクル(ｖｅｓｉｃｌｅｓ)として作ることができることを実証する。０．３ｍｇ／ｍｌのＤＭＰＣおよび０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳを丸底フラスコ中で溶解し、溶媒を蒸発させて薄膜を形成した。その後この薄膜を水和してＭＬＶ’ｓを形成し、そしてこのＭＬＶｓを２００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、１６０ｎｍのサイズ範囲内のＳＵＶ’ｓを形成した。この製剤(ファクターVIIIを含む)の免疫応答を実施例５で説明する。
【００３５】
全ての上述した研究において、ＰＳ無しの状態を使用して行った実験、および脂質と結び付いたタンパク質の濃度並びに脂質構造は、これら全ての脂質製剤において特異的な脂質-ＦVIII複合体の存在を示唆している。さらに、Ｃ２ドメインに特異的なモノクローナル抗体が、セリンの存在下でＦVIIIに結合しなかったことは、調査した脂質構造における複合体の存在を明確に示唆する。
【実施例６】
【００３６】
本実施例は、抗原性および、複合体の形成におけるタンパク質の特定のエピトープ領域の関与を研究するためのＥＬＩＳＡ分析の一般的な方法論を実証する。タンパク質-脂質複合体の抗体結合は、抗体捕獲ＥＬＩＳＡとサンドイッチ ＥＬＩＳＡを用いて調べた。サンドイッチＥＬＩＳＡでは、炭酸緩衝液(０．２Ｍ、ｐＨ９．４)中５μｇ／ｍｌの濃度にて５０μｌ／ウェルの抗体溶液を４℃で一晩インキュベートすることによって、９６ウェルプレート(Ｎｕｎｃ-Ｍａｘｉｓｏｒｂ)を抗-Ｃ２ドメイン抗体(ＥＳＨ４)でコートした。前記プレートをその後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．１４ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，および０．０２％ ＮａＮ３からなるＰＢＴ)を含む１００μｌのリン酸緩衝液で１０回洗浄した。プラスチックの吸着性表面上の残りの非特異的タンパク質結合サイトを、リン酸緩衝液(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．１４ｍＭ ＮａＣｌ，および２．７ｍＭ ＫＣｌからなるＰＢ)中の１％ウシ血清アルブミンからなるブロッキングバッファー２００μｌを室温で２時間インキュベートすることによってブロックした。プレートをＰＢＴで１０回洗浄し、ブロッキングバッファー中の１００ｎｇ／ｍｌのｒＦVIIIもしくはｒＦVIII／ＯＰＬＳ(実施例１および３)またはリポソーム付随ｒＦVIII(実施例５)５０μｌを添加して３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴで１０回洗浄し、そして、５０μｌのビオチン化ＥＳＨ８−別の抗-Ｃ２抗体を用いて、１μｇ／ｍｌ濃度および５０μｌの１：１０００希釈のアビジン-アルカリホスファターゼ複合物にて、どちらもブロッキングバッファー中、室温にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴおよびジエタノールアミン緩衝液(１Ｍジエタノールアミン，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０２％ ＮａＮ３からなる)中の１ｍｇ／ｍｌ ｐ-ニトロフェニルリン酸塩溶液１００μｌで１０回洗浄した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、３ＮのＮａＯＨを１００μｌ添加することによって反応をクエンチした。吸光度を４０５ｎｍでプレートリーダーを用いて読み取った。このＥＬＩＳＡ研究は、より少ないＣ２ドメイン特異的抗体、ＥＳＨ８またはＥＳＨ４がＰＳ(ＯＰＬＳまたはリポソーム 図６)の存在下でタンパク質に結合することを示した。その結果は、これらのモノクローナル抗体の結合が脂質によって阻害されることを示し、エピトープ領域がタンパク質-脂質複合体中に遮蔽されることを示唆する。さらに、前記特異的複合体ＦVIII-ＰＳが、前記エピトープ遮蔽の原因であることが、さらに対照実験によって確認された。この際、抗原性はＤＭＰＣ／ＰＳ混合物を用いたときのみ観察され、ＤＭＰＣ単独では観察されなかった(図７)。
【実施例７】
【００３７】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質組成物(実施例５)が、動物モデル、Ｓｐｒａｇｕｅ-ＤａｗｌｅｙラットおよびファクターVIIIノックアウトマウス，血友病Ａモデルにおいて、前記タンパク質に対し免疫原性を減じることを実証する。
【００３８】
タンパク質-リポソーム複合体の投与後４および６週間目にＳｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットで評価された抗体価は、遊離ＦVIIIに比べてＦVIII-ＰＳ複合体でより低いことが見いだされた(図８Ａ)。
【００３９】
本実施形態の別の実例では、免疫原性に対する本発明のタンパク質-脂質複合体の効果を、ファクターVIIIノックアウトマウスモデルでテストした。この表現型のマウスは重度の血友病である(ネオ・カセットを用いる標的破壊によるエクソン１６ノックアウト)。前記タンパク質-リポソーム複合体(ＤＭＰＣ＋ｂＰＳ)は皮下に投与し、その抗体価はＥＬＩＳＡ分析を用いて測定した。図８Ｂから明らかなように、抗体の濃度は投与後６週間、リポソーム付随タンパク質でより低かった。このデータは明確に、リポソーム結合ファクターVIIIが遊離ファクターVIIIに比べてより少ない抗体を誘発することを実証する。特定の理論に拘束されることを意図しないが、この観察結果は、一部、変化した(１)遊離ＦVIIIの立体構造および凝集キネティクス、(２)粒状物質のデコイ効果および免疫系によるプロセシングおよび (３)クリアランス機構、に起因するかもしれない。
【実施例８】
【００４０】
以下の実施例は、タンパク質-脂質複合体のミセル、非二重層構造、渦巻形構造、および新規な非リポソーム脂質粒子の形成を実証する。本実施例は、ここに記載された組成物によるミセルの形成を説明する。タンパク質溶液を、低濃度および高濃度(臨界ミセル濃度の上下)の短鎖アシル鎖脂質(ジヘキサノイル・ホスファチジルセリン[０．３ｍＭ前後])と混合し、その結果生じたミセル粒子を特性化した。ミセルの構造は、光散乱、円二色性および蛍光実験によって特性化した。活性や抗体結合などの機能分析を行った。
【実施例９】
【００４１】
本実施例は、ここに記載された組成物による渦巻形構造の形成について記述する。０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳをクロロホルム中に溶解し、溶媒を蒸発させて薄い脂質膜を形成した。それからこのフィルムをｐＨ７．０の複数の緩衝系中で水和させ、前記ＭＬＶｓを押し出すか超音波処理するかのいずれかによりＳＵＶｓを形成した。この結果生じたＳＵＶｓを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する緩衝系中でタンパク質と混合し、渦巻形構造を形成した。その脂質構造を、光散乱、微分干渉顕微鏡法、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって及び蛍光研究によって分析した。これらの研究により、この手順によって形成された脂質構造は事実上渦巻形であることが分かった。
【実施例１０】
【００４２】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質複合体調製の別の実例である。０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳおよび０．３ｍｇ／ｍｌのジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)をクロロホルム中に溶解し、溶媒を蒸発して薄い脂質膜を形成した。結果物である脂質膜をリン酸緩衝生理食塩水を用いて水和し、六方相を形成した。前記非二重層構造は蛍光研究によって特性化した。
【実施例１１】
【００４３】
本実施例は、新規な非リポソーム構造をもつ、本発明のタンパク質-脂質複合体の調製の別の実例である。０．３ｍｇ／ｍｌのＤＭＰＣ、０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳをクロロホルム中に溶解し、溶媒を蒸発させ、丸底フラスコ中で薄い脂質膜を形成した。この脂質を、ＦVIII、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する緩衝系を用いて水和させ、この溶液を室温あるいは３７℃のいずれかにて穏やかに回転した。その後前記フィルムを、穏やかに回旋させながら適切な緩衝液(２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２)中で水和させた。このようにして形成したＭＬＶ’ｓを、ＭＬＶ’ｓと結びついたタンパク質から遊離タンパク質を分離するために、デキストラン遠心分離勾配にかけた。０．５ｍｌの脂質付随タンパク質を１ｍｌの２０％ｗ／ｖデキストランと混合し、そして３ｍｌの１０％ｗ／ｖデキストランを上記溶液上に層状に重ねた。その後０．５ｍｌの緩衝液をトップに層状に重ねた。前記勾配を、ベックマン社のＳＷ５０．１ローターを用いて３５分間、４５Ｋ ＰＲＭで遠心分離した。遠心分離研究の結果を図９に示す。図から明らかなように、浮かなかった脂質分画がある(図中では分画３として表示する)。この分画は、１４％と１０％のデキストランの界面で観察された。この分画が浮かなかったという事実は、この脂質分画が十分な浮力あるいは被包された水を持たないことを示す。従来のリポソームは一般的に封入された水を有するため勾配の最高部に浮く。それゆえ、浮かない分画は、脂質粒子を含有する非リポソームタンパク質の可能性がある。分画を採取して、質量分析で脂質含量を、活量でタンパク質含量をテストした。質量分析研究により、この分画が、単なるＰＳ-Ｃａ＋複合体ではないことを示唆する高ＰＣ含量の脂質を含むことが明らかになった。活量分析は、この分画内に最初のタンパク質が約４０％封入されていることを示した。
【００４４】
含水量が無いかわずかである高密度な分画３に関し、いくつかの考えられる解釈が存在する。この分画は以下のことを意味するかもしれない：（１）わずかな封入水量を有する非常に小さな単層ベシクル ごく小さなベシクル(２００ｎｍ未満)が同一のコンディション下で浮くことができるかどうかを確認するために、事前にサイズを揃えたリポソームを、ポリカーボネートフィルターを通して押し出すことによって調製した。前記押し出しを３回繰り返し、粒子のサイズを約１６０ｎｍとした。結果物であるＳＵＶｓをＦVIIIと混合し、デキストラン遠心分離勾配を適用した。この対照研究は、これらのＳＵＶ’ｓが分画３のバンドを示さないことを明らかにし、これにより、このようなバンドの観察が小さなリポソームの形成に起因しないことが示された。さらにこの実験を、デキストラン勾配における人為的な影響を排除するために、同一の緩衝液および実験条件の下で行った。（２）第二の可能性は、分画３が、含水量がわずかな、渦巻形構造の形成を意味するかもしれないということである[２６]。しかしながら、渦巻形構造の形成は、非常に高いＰＳ含量(＞５０％)を必要とする。分画３バンドの形成において、使われるＰＳ含量は約３０％であり、これらの条件の下で渦巻形構造の形成は見られなかった。（３）脱水構造[２７]を有する崩壊したＣａ(ＰＳ)２複合体の形成は、浮かない可能性があり、高密度なバンドを形成しうる。このような崩壊した構造の形成には、非常に高いＰＳ含量(＞５０％)と、Ｎａ＋が存在しないことが必要である。しかしながら、本実施例では、組成物は低いＰＳ含量と、非常に高い濃度のＮａ＋を有する、言い換えると、３０％のＰＳおよび３００ｍＭのＮａＣｌが使用されており、それゆえ、Ｃａ(ＰＳ)２ 形成の可能性は除外される。（４）ＰＳおよびカルシウム系は、ベシクル融合を促進することが示されている。しかしながら、Ｃａ２＋などの二価カチオンによるベシクルの融合は、脂質結合サイトでカルシウムと競合するＮａ＋の存在によって阻害される。このＰＣ／ＰＳ比７：３における、および３００ｍＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下におけるＰＳあたりのカルシウム結合の推定量は、０．２２(５００ｍＭ ＮａＣｌ)〜０．３５(１００ｍＭ ＮａＣｌ)の間である[２８, ２９]。ＰＳあたりの推定結合カルシウムは、小さな単層ＰＳ／ＰＣベシクル系において融合に必要とされる臨界比０．３５〜０．３９より小さい。したがって、ベシクルの融合が、高密度なバンドを示すとは考えられない。これは、より大きなＰＣ分画(＞５０％)は結果的により少ないＰＳ-二価カチオン複合体をもたらすかもしれないため、および、大きなドメインへクラスター形成して融合を誘導するその能力のためである[２８，２９]。これらの理由に基き、高密度なバンドは、新規な非リポソーム脂質粒子の形成に起因する可能性が高いと思われる。このバンドは、封入水量がわずかであるため、非リポソームである。この新規な脂質構造の構造を理解するため、ネガティブ染色電子顕微鏡法、微分干渉コントラスト光学顕微鏡法、光散乱、円二色性および蛍光測定(データは示さず)を行った。
【００４５】
複数のコンディション下で行われた遠心分離の研究は、緩衝剤条件、バルクタンパク質濃度、アルコールの使用(例えば１０％エタノール)およびタンパク質-脂質比を、所望の収量の複合体を得るために変化させることができることを示す。これらのパラメーターにおけるこのようなバリエーションは、当業者の範囲内であると見なされる。視覚的な検査で確認できるように、一般に、より高いタンパク質濃度はより高密度の分画をもたらすことが確認された。
【実施例１２】
【００４６】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質組成物が生物活性を保持することを実証する。この実施形態を実証するために、ファクターVIIIを含むタンパク質-脂質複合体(ＯＬＰＳ，ＤＣＰＳ，およびＤＣＰＣ)の凝固に対する効果をテストした。ｒＦVIII凝血活性は、活性化剤として微粉化シリカおよび基質としてＦVIII欠損プラズマを用いた一段階活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)分析によって測定した。ＡＰＴＴ分析は、ＣＯＡＧ-Ａ-ＭＡＴＥモデルの凝固分析器(Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ社、ダラム，ＮＣ)を用いて行った。手短に言えば、ｒＦVIIIをＦVIII欠損プラズマに添加し、凝固時間をモニターした。その後、既知の活性を持つ凍結乾燥参考濃縮物の様々な希釈物から測定された凝固時間を利用して作成した較正曲線から、ｒＦVIIIの活性を求めた。タンパク質の濃度は、ビシンコニン酸(ＢＣＡ)分析を用いて独立的に測定して、活性と比較した。例えば、タンパク質の２０〜２２μｇ／ｍｌは全て８７〜９５．６ＩＵの比活性に対応する。サンプルを調製するために使用された原液は、２１７４ＩＵ／０．５ｍｇ／ｍｌの比活性を有していた。
【実施例１３】
【００４７】
本実施例は、ＰＳ含有リン脂質の存在下におけるタンパク質の減弱した抗原性を実証する。本実施形態を説明するために、ＥＳＨ４抗体へのｒＦVIIIの結合に対するジカプロイルホスファチジルセリン(ＤＣＰＳ)の効果をテストした。２ｕｇのタンパク質と０．５，２および５ｍＭのＤＣＰＳを、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２中で混合することによって、ＦVIII-(ＤＣＰＳ)複合体を形成した。この複合体の抗原性をＥＬＩＳＡを用いて研究した。図１０に示すように、試験した濃度(すなわち、０．５，２および５．０ｕＭ)にて、ＤＣＰＳはＥＳＨ４抗体へのｒＦVIIIの結合を阻害した。これらの濃度はこのリン脂質のＣＭＣの上および下である。
【実施例１４】
【００４８】
本実施例は、タンパク質の免疫原性に対するＰＳ含有リン脂質の効果を説明する。２ｕｇのタンパク質と５ｍＭのＤＣＰＳを、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２中で混合することによって、ＦVIII-(ＤＣＰＳ)複合体を形成した。この組成物はミセル構造を形成し、複合体の免疫原性は血友病Ａマウスにおいて研究した。総抗体価は遊離ＦVIIIでは１３,１６７(ＳＤ＝７９０９，ｎ＝１６)およびＦVIII-ＤＣＰＳ複合体では３５０６(ＳＤ＝１１５０．７，ｎ＝１２)である。
【実施例１５】
【００４９】
２ｕｇのタンパク質と２０ｍＭのＤＣＰＣを、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２中で混合することによって、ＦVIII-ジカプロイル・ホスファチジルコリン(ＤＣＰＣ)複合体を形成した。この組成物はミセル構造を形成し、複合体の免疫原性は血友病Ａマウスにおいて研究した。総抗体価は遊離ＦVIIIでは１３,１６７(ＳＤ＝７９０９，ｎ＝１６)およびＦVIII-ＤＣＰＣ複合体では１２９３(ＳＤ＝９４６．５７，ｎ＝１２)である。
【実施例１６】
【００５０】
本実施例は、本発明の組成物をリポソーム小胞として作ることができることを実証する。クロロホルム中に溶解した１１．２５μｍｏｌのＤＭＰＣと４．８３μｍｏｌのＢＰＳを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発しフラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、３ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを８０ｎｍもしくは２００ｎｍもしくは４００ｎｍのいずれかのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、８０ｎｍ〜４００ｎｍのサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。その後このリポソームを以下のように免疫化で使用した。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０,０００に維持した。
【００５１】
別のサンプルでは、クロロホルム中に溶解した１１．２５μｍｏｌのＤＭＰＣを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発し、フラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、３ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを８０ｎｍもしくは２００ｎｍもしくは４００ｎｍのいずれかのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、８０ｎｍ〜４００ｎｍのサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０，０００に維持した。高い相転移温度を持つＤＳＰＣ(固体状態)はネガティブ・コントロールに使用された。
【００５２】
別のサンプルでは、クロロホルム中に溶解した７．５μｍｏｌのＤＭＰＣと３．２２μｍｏｌのＤＯＰＡを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発し、フラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、２ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを２００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、２００ｎｍ以下のサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０,０００に維持した。
【００５３】
別のサンプルでは、クロロホルム中に溶解した７．５μｍｏｌのＤＭＰＣと３．２２μｍｏｌのＤＯＰＧを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発し、フラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、２ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)中で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを２００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、２００ｎｍ以下のサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０,０００に維持した。この製剤の免疫応答を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
平均総抗-ｒＦVIII抗体価および阻害価は、リポソーム不存在下および存在下でのｒＦVIIIを用いたＦVIII-ＫＯマウスの免疫化に続く６週間後の値である。＊はリポソームを押し出すのに使用したポリカーボネート膜の孔サイズを示し、＊＊Ｐ＜０．０５，統計分析は、実験手順において記載したようにして行った。
【００５６】
本発明をここに記載した実施例を用いて説明したが、本発明の精神を逸脱することなく本発明について一般的な修正を行うことができる。このような修正は本願の特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、様々な加熱速度でのＦVIIIの融解特性を示す。
【図２】図２は、Ｃ２ドメインにおける立体構造変化を示す抗体結合アッセイを示す。モノクローナル抗体ＥＳＨ４およびＥＳＨ８のｒＦVIIIへの結合は、６０℃および１５℃／ｈｒでｒＦVIIIを表示の温度まで加熱した後サンドイッチＥＲＩＳＡによって測定した。
【図３】図３は、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンの存在下または不存在下でのファクターVIIIのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)特性を示す。
【図４】図４は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって研究されたＦVIII-Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンの抗原性を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ｒＦVIIIの免疫原性に対するＯＰＬＳ、ホスホコリンおよびホスファチジン酸の影響を示す。平均総抗体価(５Ａ)および阻害価(５Ｂ)は、ｒＦVIIIと比較した表記の結合剤-ｒＦVIII複合体を示す。
【図６】図６は、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリン中のＦVIIIのフォールディング研究を示す。
【図７】図７は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって研究されたリポソーム中のＦVIII-ＰＳ複合体の抗原性を示す。ＦVIII：遊離ＦVIII、本発明のＦVIII：本発明で使用される組成物、およびＤＭＰＣ＋ＦVIII：ＤＭＰＣリポソームおよびＦVIII欠損特異的タンパク質(ＦVIII)脂質(ＰＳ)複合体の物理的混合物。
【図８Ａ】図８Ａは、遊離ＦVIIIおよびＦVIII-ＰＳ複合体に対する動物モデルにおける免疫応答を示す。ＦVIII：遊離ＦVIII、本発明のＦVIII：本発明で使用される組成物
【図８Ｂ】図８Ｂは、ファクターVIII欠損血友病ＡマウスモデルにおけるＦVIIIとＦVIII-ＰＳ複合体リポソームを示す。
【図９】図９は、ＦVIII-ＰＳ複合体を含む、非リポソームで低水分量フラクションを示すデキストラン密度勾配の写真である。
【図１０】図１０は、ｒＦVIIIの抗原性に対するＤＣＰＳの影響を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低い免疫原性を有するタンパク質複合体およびこれを作るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、ファクターVIII(抗血友病ファクター，ＡＨＦあるいはＦVIII)の欠損によってもたらされる出血性疾患である。ＦVIIIは６つのドメインＡ１，Ａ２，Ａ３，Ｂ，Ｃ１およびＣ２からなるマルチドメインタンパク質であり、トロンビンによるこのタンパク質の活性化は、重鎖(Ａ１およびＡ２)と軽鎖(Ａ３，Ｃ１およびＣ２)内に生じる[１,２]。血液濃縮物、組換えファクターVIIIおよびファクターVIIIの変異体を用いた補充療法が、血友病のための一次治療である。しかしながら、１５〜３５％の患者では中和抗体が発現し、 このような免疫応答は血友病の治療を損なう。中和抗体の発現を克服するための最新の治療計画が存在するが、コスト効率が良くない。免疫原性のより少ないファクターVIII製剤の開発は、代替的なクリニカル・アプローチを提供しうる。
【０００３】
一般に、治療用タンパク質への免疫応答は、以下の理由が原因とされている；(ｉ)投与経路、(ii)凝集物の存在、(iii)頻回投与、および(iv)特定のエピトープ領域［３］。最近、ＦVIIIが凝集物を形成する傾向をもつことが明らかになったが［４］、免疫応答の進行におけるこれらの凝集物の役割はよく理解されていない。さらに、ＦVIII分子上には主に２つのエピトープ領域、Ｃ２およびＡ２ドメインが存在する。スカンデラら［５］は、抗体価が軽鎖のＣ２ドメインに対して最も高いことを明らかにした。Ｃ２ドメインは膜結合ドメインでもあり、それはその凝固カスケードの一環として血小板膜上のホスファチジルセリン(ＰＳ)に結合する［６，７］。Ｃ２ドメインに対する抗体の抗凝固作用は、リン脂質へのファクターVIIIの結合阻害に起因する。Ｃ２ドメインに対するモノクローナル抗体が、リン脂質含有膜へのファクターVIIIの結合を妨げることが明らかにされ、そしてこれらの観察に基づいて、エピトープと膜結合領域が重複することが結論づけられた［１０，１１］。
【０００４】
ＦVIIIのリポソーム封入に関する従来の研究は、従来のリポソーム内へのＦVIII(VIIIファクター)の封入効率を増加することを目的とし、さらに生体内安定性および経口バイオアベイラビリティの増加を目的とする［１２，１３］。その分子構造に起因して、脂質分子は、リポソーム、ミセル、非二重層構造および渦巻形構造などの複数の分子アセンブリを形成する傾向がある。これらの分子アセンブリを、タンパク質およびペプチドを含むいくつかの薬物の治療特性を改良するための薬物送達媒体として使用するため、多数の研究が行われてきた。これらの治療の特徴は、循環時間の延長、毒性の低減、免疫応答の亢進および生体内分解の減少である［１４-２５］。したがって、リポソームは免疫応答を増加させるためのアジュバント(adjuvants)として使用されてきた［２６-３１］。
【０００５】
【非特許文献１】Fay, P.J. Factor VIII structure and function. Thromb Haemost 70, 63-7 (1993).
【非特許文献２】Foster, P.A. & Zimmerman, T.S. Factor VIII structure and function. Blood Rev 3, 180-91 (1989).
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、免疫応答および抗原性を減じるための脂質複合体の開発は研究されておらず、それゆえ、治療用タンパク質の免疫原性を減少させるためのアプローチを開発する必要性が引き続き存在している。免疫毒性を減少させるために特定のエピトープの配列を変更する別のアプローチがある［３２］。しかしながら、そのようなアミノ酸置換は生物活性の損失をもたらす可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、低い抗原性と免疫原性を有する組成物およびその製造方法を開示する。したがって、タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドのような治療薬、およびその免疫原性と抗原性を減じるように前記タンパク質に結合できる一以上の分子(本明細書中で結合剤と呼ぶ)を含む組成物が開示される。このような結合剤には、ホスホセリン、ホスファチジルセリンもしくはホスファチジルセリン(ＰＳ)を含むリン脂質等のセリン化合物；ホスファチジルコリン(ＰＣ)，ホスファチジン酸(ＰＡ)，もしくはホスホエタノールアミン(ＰＥ)；またはＰＡ，ＰＣもしくはＰＥを含むリン脂質が含まれる。
【０００８】
前記のタンパク質-結合剤複合体は、その免疫応答を減じる(１)タンパク質-結合剤複合体を含む液体またはこの液体の凍結乾燥剤、(２)新規な非リポソーム構造、(３)リポソーム、(４)ミセル、(５)渦巻形、(６)非二重層構造の形で存在しうる。
【０００９】
本発明はまた、結合剤(セリン含有化合物など)と複合体を形成することによってタンパク質の免疫原性および／または抗原性を減じる方法を開示する。前記タンパク質-結合剤複合体は、適切な緩衝剤を用いて安定化しうる。
【００１０】
ある実施形態では、ジミリスチルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)および脳ホスファチジルセリン(ｂＰＳ)を含有する乾燥脂質膜は、各種の緩衝系中でタンパク質(ＦVIIIなど)を用いて水和させられる。新規の、非リポソーム構造物は、３００ｍＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２中のＤＭＰＣ、ｂＰＳを用いて形成される。従来のリポソームは、水に変化する緩衝系あるいはリン酸緩衝生理食塩水として形成される。これはカルシウムあるいはＰＳ濃度を減じることによって達成することもできる。ＤＭＰＣの除去および１００％ＰＳと超音波処理もしくは押出ステップの使用は渦巻形構造を導き、中間アシル鎖長のＰＳの使用はミセル構造をもたらす。より低濃度でのより短いアシル鎖長の使用は、溶液中にタンパク質-脂質複合体を産生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＡＨＦ、ファクターVIII およびＦVIIIという語は、同じ分子を意味するために互換的に使用される。
本発明は、タンパク質の抗原性および免疫原性を低減するための方法を提供する。本出願を通して「タンパク質」という語が使用されるが、これはポリペプチド(一般的にはアミノ酸が５０より多いものを指す)のみならずペプチド(一般的にはアミノ酸５０以下を指す)を含む意味で用いられる。
本発明の方法は、リン脂質(好ましくはセリンを含むリン脂質)と一以上のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの複合体を形成するステップを含む。様々な種類のタンパク質-脂質構造が、特定のリン脂質、濃度、リン脂質の組み合わせによって形成されうる。
【００１２】
一般に、「リポソーム」という語は、広く球形のもしくは球状の脂質化合物のクラスターまたは凝集物であって、典型的には一以上の同心円性の層、例えば単層、二重層、多層の形態をとるものを意味する。それらは脂質小胞(lipid vesicles)とも呼ばれる。リポソームは、例えばイオン性脂質および／または非イオン性脂質から形成することができる。
「渦巻形」または「渦巻形構造」という語は通常、一般的にスパイラルまたは細管の形で存在する多重膜の脂質小胞を意味する。
「ミセル」という語は、脂質から形成されるコロイド状の存在を意味する。ミセルは単層、二重層、または六方相構造を構成しうる。
【００１３】
本発明では、結合剤に応じて、タンパク質／ポリペプチド複合体により形成される構造が異なることが観察された。一般的に、セリン含有剤を使用した場合、単純複合体、ミセル、リポソーム、渦巻形構造および新規な凝縮物相が観察された。他のホスファチジル化合物またはリン脂質を使用した場合(例えばＰＣ、ＰＧ、ＰＡもしくはＰＥまたはＰＣ、ＰＧもしくはＰＥ含有リン脂質)、ミセルまたはリポソームのみが観察された。さらに、ＰＥ含有リン脂質だけが、二重層および非二重層(六角形)構造を形成することが観察された。
【００１４】
ホスホセリン、ホスファチジルセリン、もしくは短アシル鎖長(すなわち、４以下のアシル鎖炭素原子を有する)のＰＳ含有リン脂質の使用は、脂質分子アセンブリの形成をもたらさなかった。形成された構造は単純複合体である。これらの単純複合体は、主にイオン性結合によって特徴付けられる。中間アシル鎖長(すなわち、５〜１２アシル鎖炭素原子)のセリン含有リン脂質の使用は、その臨界ミセル濃度以上ではミセルを形成し、臨界ミセル濃度未満では単なる複合体(単純複合体)を形成する。長アシル鎖長(１２〜１８炭素原子)のリン脂質は、その分子構造に起因して、リポソーム、非二重層構造および渦巻形構造などの複数の分子アセンブリを形成する傾向がある。
【００１５】
ＰＣ、ＰＧ、ＰＡおよびＰＥなどの他のホスファチジル化合物およびＰＣ、ＰＧ、ＰＡおよびＰＥ含有リン脂質の使用は、中間長のアシル鎖炭素原子ではミセルの形成をもたらし、より長いアシル鎖炭素原子ではリポソームの形成をもたらす。
【００１６】
全てのリン脂質において、アシル鎖は、ジアシル鎖または単アシル鎖であってもよい。ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールという語は、化合物中にアシル鎖を持たないものを意味する。
【００１７】
脂質組成物は、リポソーム、非二重層構造および渦巻型相を調製するために変更することができる。高ＰＣ含有量を有する、ホスファチジルコリン(ＰＣ)：ホスファチジルセリン(ＰＳ)もしくはホスホセリンの脂質組成物は、Ｃａ２＋とＮａ＋を含む緩衝液を用いた水和によりリポソームを形成するだろう。ホスファチジルエタノールアミンＰＥおよびＰＳの存在は、非二重層構造の形成を促進する。Ｎａ＋を含まないか低濃度(１００ｍＭ)で含むＣａ２＋の存在下では、ＰＳ(９０ｍｏｌ％以上)を伴う処方は、渦巻形シリンダーの形成を促進する。温度、Ｃａ２＋／Ｎａ＋などの条件は、タンパク質-脂質複合体を含むナノ粒子における渦巻形シリンダーのサイズを減じるために変更できる。
【００１８】
本発明にとって有用なリン脂質には、セリン含有化合物を含むリン脂質が含まれる。
このようなセリン含有リン脂質の例として、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリン(ＯＰＬＳ)、ジカプロイルホスファチジルセリン、ジオクタノイルホスファチジルセリン、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジオレオイル-，ジステロイル-ホスファチジルセリンが挙げられる。セリン含有リン脂質は、他の分子を含む他のリン脂質と併用してもよい。例えば、ホスファチジルセリンを、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンと併用してもよい。ある実施形態では、ＰＳ、ＰＣ、ＰＡおよびＰＥはアシル化またはジアシル化される。ホスファチジルセリンは、天然の(脳)あるいは合成起源などの何らかの原料から得ることができる。ホスファチジルセリンは、ホスファチジルコリン(ＰＣ)と併用されてもよい。ホスファチジルコリンはジミリストイルホスファチジルコリンであってもよい。ＰＳとＰＣの比は、１：９〜９：１で変化しうる。一実施形態では、その比は３：７である。
【００１９】
本発明のタンパク質-脂質組成物は、好ましくは適切な緩衝系中で安定化され保管される。このような緩衝剤には、ＴＲＩＳバッファー並びにＨＥＰＥＳバッファー及びナトリウム並びにカルシウム塩が含まれる。任意にアルコール(例えば１０％エタノール)を添加してもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質-脂質複合体は、標準的な方法によって特徴づけられることができる。例えば、励起および発光スリットとして４ｎｍを使用してＳＬＭ ＡＭＩＮＣＯ ８０００シリーズ装置またはＰＴＩ ３８０装置で蛍光研究を行うことができる。サンプルは２８０ｎｍで発光させることができ、その発光スペクトルは３００〜４００ｎｍの範囲でスキャンされる。遊離ファクターVIIIの発光スペクトルは、３３５ｎｍ付近で観察され、ＯＰＬＳの添加は蛍光発光の強度を減じ、タンパク質の三次構造がわずかに変化したことを示した。
【００２１】
さらに、前記の脂質結合タンパク質の粒子サイズは、標準的な粒子サイズ測定器(例えばＮＩＣＯＭＰ ３１５モデル)を使用して測定することができる。粒度分布は、単峰性および二峰性分布のためのガウス分布とＮＩＣＯＭＰ分析の両方を使用して分析することができる。ラテックスビーズのサイズは、各測定でスタンダード・コントロールとして使用できる。
【００２２】
脂質の構造は、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって分析することも可能である。このような方法は当該技術において一般的であり、凝集物がないことを確認するため、およびその構造をリポソーム、非二重層あるいは渦巻形に分類するために使用することができる。非二重層および渦巻形構造の形成は、Ｌａｕｒｄａｎ蛍光を使用して研究することもできる。前記脂質構造は、脂質含有溶液とプローブの水溶液(０．０１％エタノール含有)を混合することによって、プローブで標識することもできる。そのサンプルは３４０ｎｍで励起することができ、その発光スペクトルは４４０ｎｍでモニターされる。励起スペクトルは４４０ｎｍの発光モノクロメータを用いて、３２０および４２０ｎｍの範囲で得ることができる。
【００２３】
本発明のタンパク質-脂質複合体は、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、静脈内、経口、直腸、皮下、局所投与などの標準的な投与手段によって、個体（例えばヒトを含む動物）に送達することができる。前記複合体は、標的部位に直接もしくはその付近に送達されてもよく、または循環中に直接もしくは間接的に送達されてもよい。前記複合体は、当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアーを用いて送達されてもよい。
【００２４】
本発明のタンパク質-脂質複合体は、減弱された抗原性のみならず減弱された免疫原性をも示す。したがって、このような組成物は、個体において治療薬に対する免疫応答を減じるために使用することができる。本発明の組成物は、そのタンパク質への免疫反応がすでに発生した個体に治療薬を送達するために使用することもできる。したがって、これらの組成物は免疫反応の発生前あるいは後に使用することができる。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は特異的ＦVIII-脂質複合体を提供する。前記タンパク質-脂質複合体は、リポソーム、渦巻形、ミセルおよび非二重層構造などの構造だけでなく新規な脂質構造を形成し、免疫応答および抗原性を減弱しうる。その方法は、バッファーコンディションによって適切に安定化された特異的ＦVIII-脂質複合体を構築することを含む。特定の理論に制約されることを意図しないが、この抗原性および免疫原性の低下は、タンパク質-脂質複合体に起因し、リポソームなどの分子アセンブリにおいて、疎水性シールドおよび粒状物質の細胞(抗原提示細胞 ＡＰＣｓ)内取り込みなどの担体特性を含むと信じられる。これらの複合体は、抗体の存在下で凝血活性を有し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてモノクローナル抗体への結合能力を測定した際に減弱した抗原性を示した。前記複合体はまた動物モデルにおいて減弱した免疫応答を示した。本発明は、いまだＦVIIIで治療されていない患者における免疫応答の発達を減じるだけでなく、すでに治療され抗体が構築された患者におけるＦVIII凝血活性を保持するのにも役立つ。
【００２６】
したがって、一実施形態では、本発明はＦVIIIに対する免疫応答を減じる方法を提供する。ここに開示した組成物の使用によって、免疫原性は低減されるが、凝血活性は維持される。免疫原性の低下はリン脂質とＣ２およびＡ２ドメインの複合体形成によって達成されると考えられる。これは、(１)凝集物形成を低下させる、(２)投与回数を減少させる(複合体がクリアランス機構を変え、これにより循環時間がより長くなる)および／または (３)エピトープ領域の立体構造を遮蔽および変えるおよび／または(４)優先的な細胞取り込みを含む担体特性、によって免疫原性を低下させると考えられる。安定性、循環時間を増加させるクリアランス機構の変化、および抗原性並びに免疫原性の低下などの、複合体の改善された薬学的性質は、予想外の観察結果である。
【００２７】
以下の実施例は本発明をより詳細に説明するために存在し、なんら制限を意図しない。
【実施例１】
【００２８】
本実施例は、本発明にかかるタンパク質-脂質複合体の調製を説明する。この実施形態を説明するため、ＦVIIIが使用された。２５ｍＭのＴＲＩＳ、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２中で２０ｕｇの前記タンパク質と５および２０ｍＭのＯＰＬＳを混合することによって、ＦVIII-Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリン(ＯＰＬＳ)複合体を形成した。
【実施例２】
【００２９】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質複合体(実施例１)の安定性について説明するものである。遊離ＦVIIIにとって前記タンパク質のアンフォールディングはタンパク質の凝集をもたらし、これは次にアンフォールディングの不可逆性を引き起こす。凝集はＣ２ドメイン中のわずかな立体構造変化によって開始される。タンパク質、およびＦVIIIのＣ２ドメインに結合すると信じられるＯ-ホスホ-Ｌ-セリンを含有する製剤の安定性を測定するために、アンフォールディング／リフォールディングの調査を、遊離ＦVIIIおよび実施例１に記載したＰＳと複合体を形成したＦVIIIを用いて行った。
【００３０】
組換えヒトＦVIII(ｒＦVIII)の温度依存性の物理的および機能的変化を研究するために、円偏光二色性(ＣＤ)、蛍光偏光測定法、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)、ドメイン特異的抗体結合、および凝血活性の調査を行った。フォールディングおよびアンフォールディングを測定するために、ＣＤスペクトルの調査を行った。ＣＤスペクトルはｄ１０ショウノウスルホン酸で較正したＪＡＳＣＯ-７１５分光偏光計を用いて得た。サンプルは二次構造分析のために２５５〜２０８ｎｍの範囲で調査され、そして典型的には、使用したタンパク質濃度は２０〜２２μｇ／ｍｌであった。タンパク質のＣＤスペクトルは、バッファー・ベースラインのスペクトルを差し引くことによって補正した。シグナルのクオリティを高めるために複数の調査を行い、平均化した。タンパク質の融解は、２．５℃ごとに２分の保持時間で２０〜８０℃の温度範囲にわたって行った。温度調査は、Ｐｅｌｔｉｅｒ ３００ＲＴＳユニットを用いて行い、その分析結果は、製造業者によって提供されるソフトウェアを用いて作成した。アンフォールディング特性の加熱速度依存は、キネティック・コントロール下でタンパク質の熱変性が少なくともある程度存在することを示した(図１)。フォールディングモデルは、ファクターVIIIの凝集キネティクスを説明するために提唱された。このモデルに基づき、ファクターVIIIのアンフォールディングは、単なる二状態のキネティックモデル［凝集性(Ａ)→未変性(Ｎ)、ここでｋはアレニウス式によって与えられるように、温度に伴って変化する一次速度定数である］において解釈される。上記遷移に関する活性化エネルギーは、〜１２７．９８ Ｋｃａｌ／Ｍｏｌｅ(〜５３４．９７ ＫＪ／Ｍｏｌｅ)と算出された。抗体結合の研究は、Ｃ２ドメインの脂質-結合領域(２３０３-２３３２)中の立体構造変化が、少なくともある程度、凝集の開始に関与しうることを示した（図２）。ＯＰＬＳの存在下および不存在下におけるＦVIIIのＳＥＣ特性の分析は、単量体の集団がＰＳの存在下の凝集性タンパク質のものより有意に高いことを明確に示し、これはファクターVIIIの凝集キネティクスにおけるＯＰＬＳの干渉が原因かもしれない（図３）。前記データは、複合体がＦVIIIの安定性を改善し、凝集物を減らすことによって免疫原性を減じるのに役立ちうることを示す。
【００３１】
本実施例のさらなる実例では、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンは前記タンパク質と複合体を形成する（Ｃ２ドメインを遮蔽すると思われる）。２０ｕｇ／ｍｌのタンパク質と５および２０ｍＭのホスホ-Ｌ-セリンとを、２５ｍＭのＴＲＩＳ、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含む別のバッファー中で混合した。モノクローナル抗体への結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって調査した。図４に示すように、添加無しのタンパク質では凝集が原因で未変性様構造の回復は不可能であり、一方、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンの存在は未変性構造の実質的な回復をもたらした。
【実施例３】
【００３２】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質組成物(実施例１)が、Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、前記タンパク質に対し免疫原性を減弱することを実証する。この実施形態を説明するために、ＯＰＬＳ-ファクターVIII複合体を、Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。このラットモデルは、ＦVIIIへの抗体開発を研究するのに好適であることが実証されている。ＥＬＩＳＡによって、遊離ＦVIIIおよびＦVIII-ＰＳ複合体に対する抗体価を測定した。投与から２週間、ファクターVIII-ＯＰＬＳ複合体に対する抗体価の分析が非免疫毒性であることが見い出された。遊離ＦVIIIに対する抗体価は５６３．７２±９１６．１５であり、ＦVIII-ＯＰＬＳ複合体に対する検出可能な抗体価は観察されなかった。
【実施例４】
【００３３】
本実施例は、ホスホセリンが、免疫原性を減少させる単純複合体において必須であることを実証する。本実施例を説明するために、ホスホセリン、ホスホコリンまたはホスファチジン酸を用いて単純複合体を調製した。免疫原性は、血友病Ａマウスにおいて複合体の皮下投与によってテストした。総抗体価(ＥＬＩＳＡによって測定)または特異的阻害力価(Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｕｎｉｔｓ)を図５Ａおよび５Ｂに示す。効果はホスホセリンでは統計的に有意であったが、ホスホコリンまたはホスファチジン酸では統計的に有意ではなかった。
【実施例５】
【００３４】
本実施例は、本発明の組成物を小さな単層ベシクル(ｖｅｓｉｃｌｅｓ)として作ることができることを実証する。０．３ｍｇ／ｍｌのＤＭＰＣおよび０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳを丸底フラスコ中で溶解し、溶媒を蒸発させて薄膜を形成した。その後この薄膜を水和してＭＬＶ’ｓを形成し、そしてこのＭＬＶｓを２００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、１６０ｎｍのサイズ範囲内のＳＵＶ’ｓを形成した。この製剤(ファクターVIIIを含む)の免疫応答を実施例５で説明する。
【００３５】
全ての上述した研究において、ＰＳ無しの状態を使用して行った実験、および脂質と結び付いたタンパク質の濃度並びに脂質構造は、これら全ての脂質製剤において特異的な脂質-ＦVIII複合体の存在を示唆している。さらに、Ｃ２ドメインに特異的なモノクローナル抗体が、セリンの存在下でＦVIIIに結合しなかったことは、調査した脂質構造における複合体の存在を明確に示唆する。
【実施例６】
【００３６】
本実施例は、抗原性および、複合体の形成におけるタンパク質の特定のエピトープ領域の関与を研究するためのＥＬＩＳＡ分析の一般的な方法論を実証する。タンパク質-脂質複合体の抗体結合は、抗体捕獲ＥＬＩＳＡとサンドイッチ ＥＬＩＳＡを用いて調べた。サンドイッチＥＬＩＳＡでは、炭酸緩衝液(０．２Ｍ、ｐＨ９．４)中５μｇ／ｍｌの濃度にて５０μｌ／ウェルの抗体溶液を４℃で一晩インキュベートすることによって、９６ウェルプレート(Ｎｕｎｃ-Ｍａｘｉｓｏｒｂ)を抗-Ｃ２ドメイン抗体(ＥＳＨ４)でコートした。前記プレートをその後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．１４ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，および０．０２％ ＮａＮ３からなるＰＢＴ)を含む１００μｌのリン酸緩衝液で１０回洗浄した。プラスチックの吸着性表面上の残りの非特異的タンパク質結合サイトを、リン酸緩衝液(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．１４ｍＭ ＮａＣｌ，および２．７ｍＭ ＫＣｌからなるＰＢ)中の１％ウシ血清アルブミンからなるブロッキングバッファー２００μｌを室温で２時間インキュベートすることによってブロックした。プレートをＰＢＴで１０回洗浄し、ブロッキングバッファー中の１００ｎｇ／ｍｌのｒＦVIIIもしくはｒＦVIII／ＯＰＬＳ(実施例１および３)またはリポソーム付随ｒＦVIII(実施例５)５０μｌを添加して３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴで１０回洗浄し、そして、５０μｌのビオチン化ＥＳＨ８−別の抗-Ｃ２抗体を用いて、１μｇ／ｍｌ濃度および５０μｌの１：１０００希釈のアビジン-アルカリホスファターゼ複合物にて、どちらもブロッキングバッファー中、室温にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴおよびジエタノールアミン緩衝液(１Ｍジエタノールアミン，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０２％ ＮａＮ３からなる)中の１ｍｇ／ｍｌ ｐ-ニトロフェニルリン酸塩溶液１００μｌで１０回洗浄した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、３ＮのＮａＯＨを１００μｌ添加することによって反応をクエンチした。吸光度を４０５ｎｍでプレートリーダーを用いて読み取った。このＥＬＩＳＡ研究は、より少ないＣ２ドメイン特異的抗体、ＥＳＨ８またはＥＳＨ４がＰＳ(ＯＰＬＳまたはリポソーム 図６)の存在下でタンパク質に結合することを示した。その結果は、これらのモノクローナル抗体の結合が脂質によって阻害されることを示し、エピトープ領域がタンパク質-脂質複合体中に遮蔽されることを示唆する。さらに、前記特異的複合体ＦVIII-ＰＳが、前記エピトープ遮蔽の原因であることが、さらに対照実験によって確認された。この際、抗原性はＤＭＰＣ／ＰＳ混合物を用いたときのみ観察され、ＤＭＰＣ単独では観察されなかった(図７)。
【実施例７】
【００３７】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質組成物(実施例５)が、動物モデル、Ｓｐｒａｇｕｅ-ＤａｗｌｅｙラットおよびファクターVIIIノックアウトマウス，血友病Ａモデルにおいて、前記タンパク質に対し免疫原性を減じることを実証する。
【００３８】
タンパク質-リポソーム複合体の投与後４および６週間目にＳｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットで評価された抗体価は、遊離ＦVIIIに比べてＦVIII-ＰＳ複合体でより低いことが見いだされた(図８Ａ)。
【００３９】
本実施形態の別の実例では、免疫原性に対する本発明のタンパク質-脂質複合体の効果を、ファクターVIIIノックアウトマウスモデルでテストした。この表現型のマウスは重度の血友病である(ネオ・カセットを用いる標的破壊によるエクソン１６ノックアウト)。前記タンパク質-リポソーム複合体(ＤＭＰＣ＋ｂＰＳ)は皮下に投与し、その抗体価はＥＬＩＳＡ分析を用いて測定した。図８Ｂから明らかなように、抗体の濃度は投与後６週間、リポソーム付随タンパク質でより低かった。このデータは明確に、リポソーム結合ファクターVIIIが遊離ファクターVIIIに比べてより少ない抗体を誘発することを実証する。特定の理論に拘束されることを意図しないが、この観察結果は、一部、変化した(１)遊離ＦVIIIの立体構造および凝集キネティクス、(２)粒状物質のデコイ効果および免疫系によるプロセシングおよび (３)クリアランス機構、に起因するかもしれない。
【実施例８】
【００４０】
以下の実施例は、タンパク質-脂質複合体のミセル、非二重層構造、渦巻形構造、および新規な非リポソーム脂質粒子の形成を実証する。本実施例は、ここに記載された組成物によるミセルの形成を説明する。タンパク質溶液を、低濃度および高濃度(臨界ミセル濃度の上下)の短鎖アシル鎖脂質(ジヘキサノイル・ホスファチジルセリン[０．３ｍＭ前後])と混合し、その結果生じたミセル粒子を特性化した。ミセルの構造は、光散乱、円二色性および蛍光実験によって特性化した。活性や抗体結合などの機能分析を行った。
【実施例９】
【００４１】
本実施例は、ここに記載された組成物による渦巻形構造の形成について記述する。０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳをクロロホルム中に溶解し、溶媒を蒸発させて薄い脂質膜を形成した。それからこのフィルムをｐＨ７．０の複数の緩衝系中で水和させ、前記ＭＬＶｓを押し出すか超音波処理するかのいずれかによりＳＵＶｓを形成した。この結果生じたＳＵＶｓを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する緩衝系中でタンパク質と混合し、渦巻形構造を形成した。その脂質構造を、光散乱、微分干渉顕微鏡法、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって及び蛍光研究によって分析した。これらの研究により、この手順によって形成された脂質構造は事実上渦巻形であることが分かった。
【実施例１０】
【００４２】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質複合体調製の別の実例である。０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳおよび０．３ｍｇ／ｍｌのジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)をクロロホルム中に溶解し、溶媒を蒸発して薄い脂質膜を形成した。結果物である脂質膜をリン酸緩衝生理食塩水を用いて水和し、六方相を形成した。前記非二重層構造は蛍光研究によって特性化した。
【実施例１１】
【００４３】
本実施例は、新規な非リポソーム構造をもつ、本発明のタンパク質-脂質複合体の調製の別の実例である。０．３ｍｇ／ｍｌのＤＭＰＣ、０．１５ｍｇ／ｍｌのｂＰＳをクロロホルム中に溶解し、溶媒を蒸発させ、丸底フラスコ中で薄い脂質膜を形成した。この脂質を、ＦVIII、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する緩衝系を用いて水和させ、この溶液を室温あるいは３７℃のいずれかにて穏やかに回転した。その後前記フィルムを、穏やかに回旋させながら適切な緩衝液(２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２)中で水和させた。このようにして形成したＭＬＶ’ｓを、ＭＬＶ’ｓと結びついたタンパク質から遊離タンパク質を分離するために、デキストラン遠心分離勾配にかけた。０．５ｍｌの脂質付随タンパク質を１ｍｌの２０％ｗ／ｖデキストランと混合し、そして３ｍｌの１０％ｗ／ｖデキストランを上記溶液上に層状に重ねた。その後０．５ｍｌの緩衝液をトップに層状に重ねた。前記勾配を、ベックマン社のＳＷ５０．１ローターを用いて３５分間、４５Ｋ ＰＲＭで遠心分離した。遠心分離研究の結果を図９に示す。図から明らかなように、浮かなかった脂質分画がある(図中では分画３として表示する)。この分画は、１４％と１０％のデキストランの界面で観察された。この分画が浮かなかったという事実は、この脂質分画が十分な浮力あるいは被包された水を持たないことを示す。従来のリポソームは一般的に封入された水を有するため勾配の最高部に浮く。それゆえ、浮かない分画は、脂質粒子を含有する非リポソームタンパク質の可能性がある。分画を採取して、質量分析で脂質含量を、活量でタンパク質含量をテストした。質量分析研究により、この分画が、単なるＰＳ-Ｃａ＋複合体ではないことを示唆する高ＰＣ含量の脂質を含むことが明らかになった。活量分析は、この分画内に最初のタンパク質が約４０％封入されていることを示した。
【００４４】
含水量が無いかわずかである高密度な分画３に関し、いくつかの考えられる解釈が存在する。この分画は以下のことを意味するかもしれない：（１）わずかな封入水量を有する非常に小さな単層ベシクル ごく小さなベシクル(２００ｎｍ未満)が同一のコンディション下で浮くことができるかどうかを確認するために、事前にサイズを揃えたリポソームを、ポリカーボネートフィルターを通して押し出すことによって調製した。前記押し出しを３回繰り返し、粒子のサイズを約１６０ｎｍとした。結果物であるＳＵＶｓをＦVIIIと混合し、デキストラン遠心分離勾配を適用した。この対照研究は、これらのＳＵＶ’ｓが分画３のバンドを示さないことを明らかにし、これにより、このようなバンドの観察が小さなリポソームの形成に起因しないことが示された。さらにこの実験を、デキストラン勾配における人為的な影響を排除するために、同一の緩衝液および実験条件の下で行った。（２）第二の可能性は、分画３が、含水量がわずかな、渦巻形構造の形成を意味するかもしれないということである[２６]。しかしながら、渦巻形構造の形成は、非常に高いＰＳ含量(＞５０％)を必要とする。分画３バンドの形成において、使われるＰＳ含量は約３０％であり、これらの条件の下で渦巻形構造の形成は見られなかった。（３）脱水構造[２７]を有する崩壊したＣａ(ＰＳ)２複合体の形成は、浮かない可能性があり、高密度なバンドを形成しうる。このような崩壊した構造の形成には、非常に高いＰＳ含量(＞５０％)と、Ｎａ＋が存在しないことが必要である。しかしながら、本実施例では、組成物は低いＰＳ含量と、非常に高い濃度のＮａ＋を有する、言い換えると、３０％のＰＳおよび３００ｍＭのＮａＣｌが使用されており、それゆえ、Ｃａ(ＰＳ)２ 形成の可能性は除外される。（４）ＰＳおよびカルシウム系は、ベシクル融合を促進することが示されている。しかしながら、Ｃａ２＋などの二価カチオンによるベシクルの融合は、脂質結合サイトでカルシウムと競合するＮａ＋の存在によって阻害される。このＰＣ／ＰＳ比７：３における、および３００ｍＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下におけるＰＳあたりのカルシウム結合の推定量は、０．２２(５００ｍＭ ＮａＣｌ)〜０．３５(１００ｍＭ ＮａＣｌ)の間である[２８, ２９]。ＰＳあたりの推定結合カルシウムは、小さな単層ＰＳ／ＰＣベシクル系において融合に必要とされる臨界比０．３５〜０．３９より小さい。したがって、ベシクルの融合が、高密度なバンドを示すとは考えられない。これは、より大きなＰＣ分画(＞５０％)は結果的により少ないＰＳ-二価カチオン複合体をもたらすかもしれないため、および、大きなドメインへクラスター形成して融合を誘導するその能力のためである[２８，２９]。これらの理由に基き、高密度なバンドは、新規な非リポソーム脂質粒子の形成に起因する可能性が高いと思われる。このバンドは、封入水量がわずかであるため、非リポソームである。この新規な脂質構造の構造を理解するため、ネガティブ染色電子顕微鏡法、微分干渉コントラスト光学顕微鏡法、光散乱、円二色性および蛍光測定(データは示さず)を行った。
【００４５】
複数のコンディション下で行われた遠心分離の研究は、緩衝剤条件、バルクタンパク質濃度、アルコールの使用(例えば１０％エタノール)およびタンパク質-脂質比を、所望の収量の複合体を得るために変化させることができることを示す。これらのパラメーターにおけるこのようなバリエーションは、当業者の範囲内であると見なされる。視覚的な検査で確認できるように、一般に、より高いタンパク質濃度はより高密度の分画をもたらすことが確認された。
【実施例１２】
【００４６】
本実施例は、本発明のタンパク質-脂質組成物が生物活性を保持することを実証する。この実施形態を実証するために、ファクターVIIIを含むタンパク質-脂質複合体(ＯＬＰＳ，ＤＣＰＳ，およびＤＣＰＣ)の凝固に対する効果をテストした。ｒＦVIII凝血活性は、活性化剤として微粉化シリカおよび基質としてＦVIII欠損プラズマを用いた一段階活性化部分トロンボプラスチン時間(ＡＰＴＴ)分析によって測定した。ＡＰＴＴ分析は、ＣＯＡＧ-Ａ-ＭＡＴＥモデルの凝固分析器(Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ社、ダラム，ＮＣ)を用いて行った。手短に言えば、ｒＦVIIIをＦVIII欠損プラズマに添加し、凝固時間をモニターした。その後、既知の活性を持つ凍結乾燥参考濃縮物の様々な希釈物から測定された凝固時間を利用して作成した較正曲線から、ｒＦVIIIの活性を求めた。タンパク質の濃度は、ビシンコニン酸(ＢＣＡ)分析を用いて独立的に測定して、活性と比較した。例えば、タンパク質の２０〜２２μｇ／ｍｌは全て８７〜９５．６ＩＵの比活性に対応する。サンプルを調製するために使用された原液は、２１７４ＩＵ／０．５ｍｇ／ｍｌの比活性を有していた。
【実施例１３】
【００４７】
本実施例は、ＰＳ含有リン脂質の存在下におけるタンパク質の減弱した抗原性を実証する。本実施形態を説明するために、ＥＳＨ４抗体へのｒＦVIIIの結合に対するジカプロイルホスファチジルセリン(ＤＣＰＳ)の効果をテストした。２ｕｇのタンパク質と０．５，２および５ｍＭのＤＣＰＳを、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２中で混合することによって、ＦVIII-(ＤＣＰＳ)複合体を形成した。この複合体の抗原性をＥＬＩＳＡを用いて研究した。図１０に示すように、試験した濃度(すなわち、０．５，２および５．０ｕＭ)にて、ＤＣＰＳはＥＳＨ４抗体へのｒＦVIIIの結合を阻害した。これらの濃度はこのリン脂質のＣＭＣの上および下である。
【実施例１４】
【００４８】
本実施例は、タンパク質の免疫原性に対するＰＳ含有リン脂質の効果を説明する。２ｕｇのタンパク質と５ｍＭのＤＣＰＳを、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２中で混合することによって、ＦVIII-(ＤＣＰＳ)複合体を形成した。この組成物はミセル構造を形成し、複合体の免疫原性は血友病Ａマウスにおいて研究した。総抗体価は遊離ＦVIIIでは１３,１６７(ＳＤ＝７９０９，ｎ＝１６)およびＦVIII-ＤＣＰＳ複合体では３５０６(ＳＤ＝１１５０．７，ｎ＝１２)である。
【実施例１５】
【００４９】
２ｕｇのタンパク質と２０ｍＭのＤＣＰＣを、２５ｍＭ ＴＲＩＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２中で混合することによって、ＦVIII-ジカプロイル・ホスファチジルコリン(ＤＣＰＣ)複合体を形成した。この組成物はミセル構造を形成し、複合体の免疫原性は血友病Ａマウスにおいて研究した。総抗体価は遊離ＦVIIIでは１３,１６７(ＳＤ＝７９０９，ｎ＝１６)およびＦVIII-ＤＣＰＣ複合体では１２９３(ＳＤ＝９４６．５７，ｎ＝１２)である。
【実施例１６】
【００５０】
本実施例は、本発明の組成物をリポソーム小胞として作ることができることを実証する。クロロホルム中に溶解した１１．２５μｍｏｌのＤＭＰＣと４．８３μｍｏｌのＢＰＳを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発しフラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、３ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを８０ｎｍもしくは２００ｎｍもしくは４００ｎｍのいずれかのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、８０ｎｍ〜４００ｎｍのサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。その後このリポソームを以下のように免疫化で使用した。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０,０００に維持した。
【００５１】
別のサンプルでは、クロロホルム中に溶解した１１．２５μｍｏｌのＤＭＰＣを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発し、フラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、３ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを８０ｎｍもしくは２００ｎｍもしくは４００ｎｍのいずれかのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、８０ｎｍ〜４００ｎｍのサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０，０００に維持した。高い相転移温度を持つＤＳＰＣ(固体状態)はネガティブ・コントロールに使用された。
【００５２】
別のサンプルでは、クロロホルム中に溶解した７．５μｍｏｌのＤＭＰＣと３．２２μｍｏｌのＤＯＰＡを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発し、フラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、２ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを２００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、２００ｎｍ以下のサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０,０００に維持した。
【００５３】
別のサンプルでは、クロロホルム中に溶解した７．５μｍｏｌのＤＭＰＣと３．２２μｍｏｌのＤＯＰＧを丸底フラスコに入れ、回転エバポレータを使用して溶媒を蒸発し、フラスコ壁上に薄膜を形成した。その後この薄膜を、２ｍｌのトリス緩衝液(３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＣａＣｌ２含有 ｐＨ＝７．０)中で水和させ、ＭＬＶ’ｓを形成し、このＭＬＶｓを２００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出し、２００ｎｍ以下のサイズ範囲のＳＵＶ’ｓを形成した。脂質リカバリーはバートレット法によってリン含有量を測定することにより推定した。タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることによってリポソームと結合させた。ＦVIII欠損マウスの免疫化は、一週間間隔でｒＦVIIIもしくはｒＦVIII-リポソーム(１００μｌのトリス緩衝液中２μｇ)を４回皮下(ｓ．ｃ．)注射して行った。タンパク質と脂質のモル比は１：１０,０００に維持した。この製剤の免疫応答を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
平均総抗-ｒＦVIII抗体価および阻害価は、リポソーム不存在下および存在下でのｒＦVIIIを用いたＦVIII-ＫＯマウスの免疫化に続く６週間後の値である。＊はリポソームを押し出すのに使用したポリカーボネート膜の孔サイズを示し、＊＊Ｐ＜０．０５，統計分析は、実験手順において記載したようにして行った。
【００５６】
本発明をここに記載した実施例を用いて説明したが、本発明の精神を逸脱することなく本発明について一般的な修正を行うことができる。このような修正は本願の特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、様々な加熱速度でのＦVIIIの融解特性を示す。
【図２】図２は、Ｃ２ドメインにおける立体構造変化を示す抗体結合アッセイを示す。モノクローナル抗体ＥＳＨ４およびＥＳＨ８のｒＦVIIIへの結合は、６０℃および１５℃／ｈｒでｒＦVIIIを表示の温度まで加熱した後サンドイッチＥＲＩＳＡによって測定した。
【図３】図３は、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンの存在下または不存在下でのファクターVIIIのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)特性を示す。
【図４】図４は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって研究されたＦVIII-Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリンの抗原性を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ｒＦVIIIの免疫原性に対するＯＰＬＳ、ホスホコリンおよびホスファチジン酸の影響を示す。平均総抗体価(５Ａ)および阻害価(５Ｂ)は、ｒＦVIIIと比較した表記の結合剤-ｒＦVIII複合体を示す。
【図６】図６は、Ｏ-ホスホ-Ｌ-セリン中のＦVIIIのフォールディング研究を示す。
【図７】図７は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって研究されたリポソーム中のＦVIII-ＰＳ複合体の抗原性を示す。ＦVIII：遊離ＦVIII、本発明のＦVIII：本発明で使用される組成物、およびＤＭＰＣ＋ＦVIII：ＤＭＰＣリポソームおよびＦVIII欠損特異的タンパク質(ＦVIII)脂質(ＰＳ)複合体の物理的混合物。
【図８Ａ】図８Ａは、遊離ＦVIIIおよびＦVIII-ＰＳ複合体に対する動物モデルにおける免疫応答を示す。ＦVIII：遊離ＦVIII、本発明のＦVIII：本発明で使用される組成物
【図８Ｂ】図８Ｂは、ファクターVIII欠損血友病ＡマウスモデルにおけるＦVIIIとＦVIII-ＰＳ複合体リポソームを示す。
【図９】図９は、ＦVIII-ＰＳ複合体を含む、非リポソームで低水分量フラクションを示すデキストラン密度勾配の写真である。
【図１０】図１０は、ｒＦVIIIの抗原性に対するＤＣＰＳの影響を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される治療薬の免疫原性を減弱する方法であって、
前記治療薬と、セリン化合物、ホスファチジルコリン(ＰＣ)、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)、ホスファチジン酸(ＰＡ)、およびＰＣ、ＰＥもしくはＰＡ含有リン脂質からなる群から選択される一以上の結合剤との複合体を形成する工程を含み、
個体に投与された前記治療薬の免疫原性が、結合剤と複合体を形成した時に減弱されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記セリン化合物が、ホスホセリン、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＰＳ含有リン脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体が、単純複合体、リポソーム、ミセル、渦巻形および非リポソーム脂質構造からなる群から選択される一以上の構造を有し、前記非リポソーム脂質構造は１０％と１４％のデキストラン勾配の界面に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合剤がホスホセリンであり、形成される複合体が単純複合体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスホセリンがＯ-ホスホ-Ｌ-セリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リン脂質がアシル化またはジアシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記のアシル鎖長が炭素原子数１〜１８の範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のアシル鎖長が炭素原子数１〜４の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記のアシル鎖長が炭素原子数５〜１２の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記のアシル鎖長が炭素原子数１３〜１８の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記リン脂質がＰＳ含有リン脂質である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記リン脂質が、さらにＰＣ含有リン脂質および／またはＰＥ含有リン脂質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣ含有リン脂質とＰＳ含有リン脂質の比が７：３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アシル鎖が、カプロイル、オレオイル、オクタノイル、ミリストイル、パルミトイル、およびステロイルからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬がファクターVIIIである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
非-脂質二重層が、前記治療薬とセリン含有リン脂質とを約１００ｎＭのナトリウム塩と約５ｎＭのカルシウム塩の存在下でインキュベートすることによって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
約１００ｎＭのナトリウム塩と約５ｎＭのカルシウム塩の存在下で、タンパク質をセリン含有リン脂質とインキュベートすることによって形成された脂質-タンパク質複合体であって、前記複合体が１０％と１４％のデキストラン勾配の界面に移行することを特徴とする、脂質-タンパク質複合体。
【請求項１８】
前記セリン含有リン脂質がホスファチジルセリンである、請求項１７に記載の脂質-タンパク質複合体。
【請求項１９】
ホスファチジルコリンをさらに含有し、ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの比が７：３である、請求項１８に記載の脂質-タンパク質複合体。
【請求項２０】
前記タンパク質がファクターVIIIである、請求項１９に記載の脂質-タンパク質複合体。
【請求項１】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される治療薬の免疫原性を減弱する方法であって、
前記治療薬と、セリン化合物、ホスファチジルコリン(ＰＣ)、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)、ホスファチジン酸(ＰＡ)、およびＰＣ、ＰＥもしくはＰＡ含有リン脂質からなる群から選択される一以上の結合剤との複合体を形成する工程を含み、
個体に投与された前記治療薬の免疫原性が、結合剤と複合体を形成した時に減弱されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記セリン化合物が、ホスホセリン、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＰＳ含有リン脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体が、単純複合体、リポソーム、ミセル、渦巻形および非リポソーム脂質構造からなる群から選択される一以上の構造を有し、前記非リポソーム脂質構造は１０％と１４％のデキストラン勾配の界面に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合剤がホスホセリンであり、形成される複合体が単純複合体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスホセリンがＯ-ホスホ-Ｌ-セリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リン脂質がアシル化またはジアシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記のアシル鎖長が炭素原子数１〜１８の範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のアシル鎖長が炭素原子数１〜４の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記のアシル鎖長が炭素原子数５〜１２の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記のアシル鎖長が炭素原子数１３〜１８の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記リン脂質がＰＳ含有リン脂質である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記リン脂質が、さらにＰＣ含有リン脂質および／またはＰＥ含有リン脂質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣ含有リン脂質とＰＳ含有リン脂質の比が７：３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アシル鎖が、カプロイル、オレオイル、オクタノイル、ミリストイル、パルミトイル、およびステロイルからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬がファクターVIIIである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
非-脂質二重層が、前記治療薬とセリン含有リン脂質とを約１００ｎＭのナトリウム塩と約５ｎＭのカルシウム塩の存在下でインキュベートすることによって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
約１００ｎＭのナトリウム塩と約５ｎＭのカルシウム塩の存在下で、タンパク質をセリン含有リン脂質とインキュベートすることによって形成された脂質-タンパク質複合体であって、前記複合体が１０％と１４％のデキストラン勾配の界面に移行することを特徴とする、脂質-タンパク質複合体。
【請求項１８】
前記セリン含有リン脂質がホスファチジルセリンである、請求項１７に記載の脂質-タンパク質複合体。
【請求項１９】
ホスファチジルコリンをさらに含有し、ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの比が７：３である、請求項１８に記載の脂質-タンパク質複合体。
【請求項２０】
前記タンパク質がファクターVIIIである、請求項１９に記載の脂質-タンパク質複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５２８６９６（Ｐ２００８−５２８６９６Ａ）
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４２２８（Ｐ２００７−５５４２２８）
【出願日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３７７９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８４０９５
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５０６１９４１１７）ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３７７９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８４０９５
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５０６１９４１１７）ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク (11)
【Ｆターム（参考）】
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