低減されたＶＷＦ結合を有する因子ＶＩＩＩ分子
本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え因子VIII(FVIII)分子に関する。特に、本発明は、内因性FVIIIと比較して低減されたフォンウィレブランド因子(vWF)結合を有するFVIII分子に関する。本発明は、そのような分子の使用、ならびにそのような分子を得るための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Aとは、凝血因子VIII(FVIII)活性の欠損または機能不全により引き起こされる、遺伝性の出血障害である。その臨床症状は、一次止血に関するものではなく(血栓の形成は正常に行われる)、二次的なトロンビン形成が行われないために、血栓が不安定なことである。血友病Aは、血液から単離するか、または組換えを介して生成させる凝血因子FVIIIの静脈内注射により治療する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】EP0319315
【特許文献２】WO09156137
【特許文献３】WO03031464
【特許文献４】米国特許第5,985,265号
【特許文献５】WO99/55377
【特許文献６】米国特許第5,932,462号
【特許文献７】米国特許第5,629,384号
【特許文献８】WO03062290
【特許文献９】WO0331464
【特許文献１０】WO2007/056191
【特許文献１１】WO2006102652
【特許文献１２】US2006/0115876 A1
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Grahamら、J. Gen. Virol. 36巻:59〜72頁、1977年
【非特許文献２】WaechterおよびBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79巻:1106〜1110頁、1982年
【非特許文献３】UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77巻:4216〜4220頁、1980年
【非特許文献４】Cell、33巻: 405頁、1983年
【非特許文献５】Somatic Cell and Molecular Genetics 12巻:555頁、1986年
【非特許文献６】MacEwan SR、Chilkoti A. Biopolymers. 2010年;94巻:60頁
【非特許文献７】Schellenberger VらNat Biotechnol. 2009年;27巻:1186頁
【非特許文献８】Schlapschy MらProtein Eng Des Sel. 2007年;20巻:273頁
【非特許文献９】Dennis MSらJ Biol Chem. 2002年、277巻:35035頁
【非特許文献１０】Kjalke Eur J Biochem、234、773頁
【非特許文献１１】Hansen, J Thromb Haemost 2009; 7, Supplement 2: abstract no. PP-WE-572
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在の治療に関する推奨は、従来のオンデマンド治療から、予防へと推移しつつある。フォンウィレブランド因子に結合した内因性FVIIIの循環における半減期は、12〜14時間であり、したがって、患者が実質的に無症状の生存を享受するには、毎週複数回にわたり予防治療を実施するべきである。多くの患者、とりわけ、小児および若年者にとって、静脈内投与は、大きな不都合および/または痛みを随伴する。したがって、好ましくは構造が均質で、好ましくは安全で、かつ1週当たりの因子VIII投与の回数を低減するために好ましくは相当に長い循環半減期を有する、因子VIII活性を有する新規因子VIII生成物の必要が当技術分野にある。そのような分子を得、生成するための比較的単純な方法の必要が当技術分野にさらにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。本発明は、そのような分子の作製方法、ならびにそのような分子の使用にさらに関する。そのような分子は、改変された循環半減期を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】FVIII-KOマウス(n=6〜10)におけるFeCl3によって誘導された損傷のモデルでのNNC129-0000-9105およびAdvate(登録商標)の用量反応相関を示す図。*ビヒクル処理と有意に異なる。*P<0.05。
【図２】FVIII-KOマウス(n=5〜6)の尾部出血モデルでのNNC0129-000-9105およびAdvate(登録商標)(20および280IU/kg)の影響を示す図。*ビヒクル処理と有意に異なる。*P<0.05。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義:
フォンウィレブランド因子(vWF): vWFは血漿中に存在する大きな単量体/多量体の糖タンパク質であり、内皮(Weibel-Palade体)、巨核球(血小板のα-顆粒)および内皮下結合組織で構成的に生成される。その一次機能は他のタンパク質、特に因子VIIIへの結合であり、それは創傷部位への血小板粘着で重要である。
【０００９】
因子VIIIはvWFに結合するが、循環内では不活性である。vWFに結合していないとき、因子VIIIは速やかに分解するか取り除かれる。したがってFVIIIでのvWF結合能力の低下または撤廃は、長期循環半減期を有する因子FVIII変異体を得る上で非常に望ましくない手法であるとこれまでみなされてきた。
【００１０】
用語「低減されたvWF結合能力」は、本明細書で因子VIII変異体を包含するものとし、そこでvWF結合能力は少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは約100%低減される。vWFへのFVIII結合は、ELISAのようなアッセイによって、または表面プラズモン共鳴を用いて固定化vWFへの直接結合として測定することができる。EP0319315で開示されるように、vWFへの結合を担う因子VIIIの領域は、残基1670〜1684にわたる領域である。この領域を含む因子VIIIの点突然および/または欠失突然変異体は、vWFに結合する能力を改変すると想定される。本発明による特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異を含む変異体が含まれる:Y1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680CおよびE1682T。
【００１１】
WO09156137は、PEGなどの側鎖基とコンジュゲートしていない、低減されたvWF結合を有する融合タンパク質を開示する。その中のタンパク質は、様々な比較検定法との関連で明らかに有用である。
【００１２】
因子VIII分子: FVIII/因子VIIIは、主に肝細胞によって生成される、大きな複合糖タンパク質である。FVIIIは、シグナルペプチドを含む2351アミノ酸からなり、相同性によって定義されるようにいくつかの異なるドメインを含む。3つのA-ドメイン、特異なB-ドメインおよび2つのC-ドメインがある。ドメインの順序は、NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHのように記載することができる。FVIIIは、B-A3境界で分離される2つの鎖として血漿中を循環する。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって連結される。A1-A2-B鎖は重鎖(HC)と呼ばれ、A3-C1-C2は軽鎖(LC)と呼ばれる。
【００１３】
内因性因子VIII分子は、様々なサイズのBドメインを有する分子のプールとしてin vivoで循環する。in vivoでおそらく起こることは、様々なサイズのBドメインを有する分子のプールをもたらすBドメインの段階的な酵素除去である。Bドメインの最後の部分が除去される740位での切断は、トロンビン活性化に関連して起こると一般に思われている。しかし、例えば740位の切断部位が損なわれている因子VIII変異体が活性である可能性を、除外することができない。
【００１４】
本明細書で用いる「因子VIII」または「FVIII」は、内在性の凝固経路のメンバーであって血液凝固に必須であるヒト血漿糖タンパク質を指す。「天然のFVIII」は、配列番号1(アミノ酸1〜2332)に示す完全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1のアミノ酸741〜1648にわたっている。
【００１５】
配列番号1:野生型のヒト凝血因子VII
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【００１６】
配列番号2:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIFDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【００１７】
配列番号3:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDICDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【００１８】
本発明による因子VIII分子は、配列番号2の残基1670〜1684のvWF結合領域内には1または複数の変化も当然存在するが、残りのドメインは、配列番号1のアミノ酸番号1〜740および1649〜2332に示される配列に緊密に対応する、Bドメイン末端欠失型因子FVIII分子でありうる。しかし、本発明によるBドメイン切断分子は、配列番号1に示される配列と若干異なりうるが、これは、vWF結合能を低減する目的で、突然変異を導入するという事実のために、残りのドメイン(すなわち、3つのAドメインおよび2つのCドメイン)が、配列番号1に示されるアミノ酸配列(アミノ酸1〜740および1649〜2332)とは若干、例えば、約1%、2%、3%、4%または5%異なりうることを意味する。さらに、例えば、LRP、各種の受容体、他の凝血因子、細胞表面など、他の各種の構成要素、グリコシル化部位の導入および/または除去などにより、因子VIIIの結合能を修飾するために、分子内の他の位置にアミノ酸修飾(置換、欠失など)を導入することが妥当である。
【００１９】
本発明による因子VIII分子は、因子VIII活性を有するが、これは、凝血カスケード内で、FVIIIと機能的に類似するかまたは同等の形で機能し、活性化血小板においてFIXaと相互作用することによりFXaの形成を誘導し、血栓の形成を支援する能力を意味する。活性化は、in vitroにおいて、例えば、血栓解析、内因性トロンビンポテンシャル解析など、当技術分野でよく知られる技法により評価することができる。本発明による因子VIII分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および100%であるか、または100%をさらに超えるFVIII活性を有する。
【００２０】
融合タンパク質:融合タンパク質/キメラタンパク質とは、元は個別のタンパク質をコードする、2つ以上の遺伝子を接合することにより創出されるタンパク質である。この融合遺伝子が翻訳されると、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を伴う単一のポリペプチドが結果としてもたらされる。本発明の融合タンパク質は、FVIIIポリペプチドおよび少なくとも1つの他のポリペプチドを含む。融合タンパク質は、少なくとも1つのリンカーを任意選択で含むことができる。したがって、FVIIIポリペプチドは、他のポリペプチド部分に直接的に連結されなくてもよい。他のポリペプチド部分はFVIIIポリペプチド鎖のN末端またはC末端に連結することができるか、FVIIIポリペプチド鎖の内部位置に挿入することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、Bドメイン欠失FVIIIのBドメインリンカーに挿入される。別の好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、FVIII軽鎖のN末端でvWF結合a3領域を置換する。別の好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、FVIII軽鎖のC末端に連結される。
【００２２】
他のポリペプチドは、例えばヒト血清アルブミン、抗体結合ポリペプチド、Fc受容体、ヒトFcyRI(CD64)、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、抗体(免疫グロブリン)のFc部分、転移(transferring)、アルブミン結合ポリペプチドまたはトランスフェリン結合ポリペプチドに由来する1つまたは複数のアミノ酸配列を含むことができる。
【００２３】
Bドメイン:因子VIIIのBドメインは、配列番号1のアミノ酸741〜1648にわたっている。Bドメインはいくつかの異なる部位で切断され、循環血漿中のFVIII分子の大きな異質性をもたらす。かなりグリコシル化されたBドメインの正確な機能は、未知である。知られているのは、凝固カスケードでのFVIII活性のためにドメインが不必要であるということである。機能のこの見かけの欠如は、Bドメイン欠失/末端欠失型FVIIIが、完全長天然FVIIIで見られるものと同一のin vivo特性を有するらしいという事実によって支えられる。しかし、Bドメインが、少なくとも無血清条件の下で細胞膜との結合を低減することができることの兆候がある。
【００２４】
Bドメイン末端欠失/欠失型因子VIII分子:
内因性の全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌される前に、前駆体は、重鎖および軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失FVIIIは、2つの異なる戦略により生成させることができる。Bドメインのない重鎖および軽鎖を2つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成する(2本鎖戦略)か、またはBドメイン欠失FVIIIを、単鎖前駆体ポリペプチド鎖として合成し(単鎖戦略)、これを、全長FVIII前駆体と同じ形で重鎖および軽鎖へと切断する。
【００２５】
Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドでは、重鎖部分と軽鎖部分とが通常、リンカーにより隔てられている。Bドメイン欠失FVIII内に免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するために、リンカー配列は、FVIIIのBドメインに由来することが好ましい。少なくとも、リンカーは、Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖および軽鎖へと切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。全長FVIIIのBドメインでは、アミノ酸1644〜1648が、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失FVIIIが活性化するとリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖内に配置される。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビンの活性化による、残りのFVIII分子からのリンカーの除去に影響を与える可能性は低い。Bドメインの欠失は、FVIIIを生成させるのに有利である。それにも関わらず、生成能を低下させることなく、Bドメインの一部をリンカー内に組み入れることもできる。生成能に対するBドメインの負の影響が、Bドメインの特定のサイズまたは配列に帰せられたことはない。
【００２６】
末端欠失型Bドメインは、複数のO-グリコシル化部位を含有しうる。しかし、好ましい実施形態によれば、該分子が、末端欠失型Bドメイン内に含むO結合オリゴ糖は、1つ、代替的に、2つ、3つ、または4つだけである。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、末端欠失型Bドメインが含む潜在的なO-グリコシル化部位は1つだけであり、親水性ポリマーが、共有結合によりこのO-グリコシル化部位にコンジュゲートされる。
【００２８】
本発明によるBドメイン末端欠失型分子のO-連結オリゴ糖は、組換え手段によりおよび/またはBドメインの末端欠失による「隠れた」O-グリコシル化部位の曝露のいずれかによって人工的に作製されたO-グリコシル化部位に結合することができる。いずれにしても、Bドメイン末端欠失型因子VIIIアミノ酸配列を設計し、その後、末端欠失型BドメインでO-グリコシル化部位の可能性を予測するコンピュータ分析にアミノ酸配列をかけることによって、そのような分子を作製することができる。そのようなグリコシル化部位を有する比較的高い可能性を有する分子を適する宿主細胞で合成し、続いてグリコシル化パターンを分析し、その後末端欠失型BドメインでO-連結グリコシル化を有する分子を選択することができる。
【００２９】
因子VIII分子は、酵素または化学的コンジュゲーション法のいずれか、例えばシアリン酸誘導体と組み合わせたシアリルトランスフェラーゼまたはグリカン酸化を用いて、選定された試薬による以降の改変のためのアルデヒドを形成するコンジュゲーション点の役目を果たすこともできる、いくつかのN連結オリゴ糖も含む。
【００３０】
組換え因子VIIIタンパク質の生成に適する宿主細胞は、その分子がグリコシル化されることを保証するために、好ましくは哺乳動物起源である。本発明の実施では、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくは、それらに限定されないが、CHO(例えば、ATCC CCL 61)、COS-1(例えば、ATCC CRL 1650)、ベイビーハムスター腎臓(BHK)、およびHEK293(例えば、ATCC CCRL 1573、Grahamら、J. Gen. Virol.36巻:59〜72頁、1977年)細胞系を含む確立された哺乳動物細胞系である。好ましいBHK細胞系は、tk-ts13 BHK細胞系(WaechterおよびBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79巻:1106〜1110頁、1982年)であり、以降BHK 570細胞と称す。BHK 570細胞系は、ATCC受託番号CRL 10314の下で、American Type Culture Collection、12301 Parklawn Dr.、Rockville、MD 20852から入手可能である。tk-ts13 BHK細胞系は、受託番号CRL 1632の下でもATCCから入手可能である。好ましいCHO細胞は、受託番号CCI61の下でATCCから入手可能なCHO K1細胞系ならびに細胞系CHO-DXB11およびCHO-DG44である。
【００３１】
他の適する細胞系には、それらに限定されないが、ラットHep I(ラット肝癌;ATCC CRL 1600)、ラットHep II(ラット肝癌;ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、ヒト肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1); DUKX細胞(CHO細胞系)(UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77巻:4216〜4220頁、1980年)(DXB11細胞とも呼ばれるDUKX細胞)、およびDG44(CHO細胞系)(Cell、33巻: 405頁、1983年およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12巻:555頁、1986年)が含まれる。また、3T3細胞、ナマルバ細胞、骨髄腫および他の細胞との骨髄腫の融合体も有用である。一部の実施形態では、細胞は、例えば、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する、それらが由来する細胞型と質的または量的に異なるスペクトルの酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび/もしくはグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素、またはプロペプチドなどのプロセシング酵素)を発現する細胞などの、突然変異細胞または組換え細胞であってよい。DUKX細胞(CHO細胞系)が特に好ましい。
【００３２】
現在好ましい細胞は、HEK293、COS、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベイビーハムスター腎臓(BHK)および骨髄腫細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
【００３３】
したがって、Bドメインを末端欠失させることによって因子VIIIBドメインの「隠れた」O-グリコシル化部位の活性化が可能のようである。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、この現象は変更される末端欠失型Bドメインでの分子の三次構造に帰することができるかもしれない。したがって、「隠れた」O-グリコシル化部位は末端欠失型Bドメインでのグリコシル化を「受けやすくする」。この手法の1つの利点は、例えばアレルゲン性に関して有利な安全性プロファイルを有する組換え分子の提供である。別の利点は、組換えタンパク質に人工O-グリコシル化部位を組み入れることが困難であると前に判明しているので、Bドメインでのグリコシル化部位の生来の豊富さのために、この手法がBドメインにO-連結オリゴ糖を有するBドメイン末端欠失型変異体を得るより単純な手法となることであろう。
【００３４】
wt FVIII分子のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明による分子中の末端欠失型Bドメインの長さは、約10から約800アミノ酸、例えば約10から約700アミノ酸、例えば約12〜500アミノ酸、12〜400アミノ酸、12〜300アミノ酸、12〜200アミノ酸、15〜100アミノ酸、15〜75アミノ酸、15〜50アミノ酸、15〜45アミノ酸、20〜45アミノ酸、20〜40アミノ酸または20〜30アミノ酸の範囲であってよい。末端欠失型Bドメインは、重鎖および/もしくは軽鎖の断片および/またはwt FVIII分子で見出されない人工的に導入された配列を含むことができる。用語「Bドメイン末端欠失」および「Bドメイン欠失」は、本明細書で互換的に用いることができる。
【００３５】
循環における半減期の改変:本発明による分子は、野生型の因子VIII分子と比較して、循環における半減期が改変され、循環における半減期が延長されることが好ましい。循環における半減期は、少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも125%、より好ましくは少なくとも150%、より好ましくは少なくとも175%、より好ましくは少なくとも200%、および最も好ましくは少なくとも250%または300%延長されることが好ましい。このような分子は、循環における半減期が、少なくとも400%、500%、600%、またはさらに700%延長されることがなおより好ましい。
【００３６】
側鎖/側鎖基:本発明によるFVIII変異体は、翻訳後修飾を通して、または融合タンパク質の形で側鎖基と共有結合でコンジュゲートされてもよい。したがって、以下のFVIIIの側鎖基改変の1つまたは複数を実行することができる:アルキル化、アシル化、エステル形成、ジスルフィドまたはアミド形成、その他。これには、ペグ化FVIII、システイン-ペグ化FVIIIおよびその変異体が含まれる。本発明によるFVIII変異体は、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、親水性ポリマー(ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ホスホリルコリンベースのポリマー、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸)、ポリペプチド(抗体、抗体の抗原結合断片、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド(MacEwan SR、Chilkoti A. Biopolymers. 2010年;94巻:60頁)、XTENポリマー(Schellenberger VらNat Biotechnol. 2009年;27巻:1186頁)、PAS化またはHAP化(Schlapschy MらProtein Eng Des Sel.2007年;20巻:273頁)、アルブミン結合ペプチド(Dennis MSらJ Biol Chem. 2002年、277巻:35035頁))などとコンジュゲートされてもよい。
【００３７】
本発明によるFVIIIは、任意選択でリンカーを通して1つまたは複数の疎水性の側鎖基によってコンジュゲートされてもよい。-(CH2)12-部分を有する化合物は、本発明との関連で可能なアルブミン結合剤である。疎水性の側鎖基は、そのような側鎖基がアルブミンと非共有の複合体を形成することが可能であり、それによって、改変FVIII変異体およびアルブミンの複合体が徐々にだけ崩壊してFVIII変異体を放出するという事実のために血流中での改変FVIII変異体の循環を促進するという事実のために、「アルブミン結合剤」と呼ばれることがときにある。FVIIIは、WO03031464で開示される方法に基本的に従って、化学的方法ならびに酵素的「グリコ改変」法を用いて改変することができる。酵素法は、いかなる有機溶媒の使用も避ける利点、ならびに一般に非常に部位特異的である利点を有する。
【００３８】
用語「ペグ化FVIII」は、PEG分子とコンジュゲートしているFVIIIを意味する。PEG分子は、任意のアミノ酸残基または炭化水素部分を含むFVIIIの任意の部分へ結合させることができることを理解するべきである。用語「システイン-ペグ化FVIII」は、FVIIIに導入されたシステインのスルフヒドリル基とコンジュゲートしているPEG分子を有するFVIIIを意味する。
【００３９】
PEGは、デキストランなどの多糖と比較して架橋が可能な反応性基をわずかしか有しないので、適するポリマー分子である。特に、その結合化学が比較的単純である(ポリペプチド上の給合基とコンジュゲートするのに1つの反応性基だけが利用可能)ので、単官能PEG、例えばメトキシポリエチレングリコール(mPEG)に関心が高い。したがって、架橋のリスクが除去され、生じるポリペプチドコンジュゲートはより均一であり、ポリペプチドとのポリマー分子の反応は制御がより容易である。
【００４０】
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合を実行するために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は活性型で、すなわち反応性官能基と一緒に提供される。ペグ化は、ポリペプチド上の全ての利用できる給合基(すなわちポリペプチドの表面に曝露させられる給合基)とのコンジュゲーションに向けることができるか、1つまたは複数の特異的な給合基、例えばN末端アミノ基(米国特許第5,985,265号)、N-および/またはO-連結グリカンなどに向けることができる。さらに、コンジュゲーションは1段階で、または段階的に達成することができる(例えばWO99/55377に記載のように)。O-および/またはN-連結グリカンに側鎖基を結合するための酵素的手法は、WO03031464に開示されている。
【００４１】
融合タンパク質:融合タンパク質/キメラタンパク質は、当初別々のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子の連結を通して作製されるタンパク質である。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドを生じる。したがって本発明によるFVIII変異体の側鎖は、FVIIIと融合したポリペプチドの形となることができる。したがって本発明によるFVIII変異体は、FVIIIに長期にわたる半減期を付与することができるペプチド、例えば抗体および「Fc融合誘導体」または「Fc融合タンパク質」と融合させてもよい。
【００４２】
本明細書でFc融合タンパク質は、任意の抗体アイソタイプに由来してよいFcドメインに融合しているFVIIIを包含するものとするが、IgG抗体の比較的長い循環半減期のためにIgG Fcドメインが多くの場合好ましい。特定のエフェクター機能、例えば補体結合および/または特定のFc受容体への結合を調整するために、Fcドメインはさらに改変されてもよい。FcRn受容体に結合する能力を有するFcドメインとのFVIIIの融合は、wt FVIIIタンパク質の半減期と比較して長期にわたる循環半減期の融合タンパク質を一般にもたらす。IgG Fcドメインの234位、235位および237位での突然変異は、FcγRI受容体への結合の減少、ならびにおそらくFcγRIIaおよびFcγRIII受容体への結合の減少も一般にもたらす。これらの突然変異はFcRn受容体への結合を変更せず、それはエンドサイトーシス再利用経路によって長い循環半減期を促進する。好ましくは、本発明による融合タンパク質の改変IgG Fcドメインは、以下の、特定のFc受容体への親和性の低下(L234A、L235EおよびG237A)およびC1q媒介補体結合の減少(A330SおよびP331S)をそれぞれもたらす突然変異の1つまたは複数を含む。
【００４３】
理論によって縛られることなく、正常なvWF結合能力を有する因子VIII分子へ側鎖基を結合させるよりも、低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子へ側鎖基を結合させるためにそれがより効率的に機能する理由は、側鎖基の相対サイズが大きな因子VIII/vWF複合体で比較的小さいということであると想定される。遊離の因子VIIIをクリアランスから保護することにおいて、比較的大きな側鎖基がより効率的に機能すると仮定される。FVIIIの半減期がvWFのそれと関連するとさらに仮定される。vWFに結合する能力の低下したFVIII分子は、通常ならばvWFによって保護されているクリアランスエピトープを曝露させた可能性が最も高い。したがって、側鎖基を結合することによって、この「クリアランス保護」を回復させることができると仮定される。他の場合には、例えば抗体断片などの側鎖基の給合は、例えば比較的長い循環半減期を有するタンパク質、細胞または血小板に分子を結合することによって機能することができる。
【００４４】
親水性ポリマー:本発明による改変基/親水性ポリマーは、好ましくは天然に存在しない。一例において、「天然に存在しない改変基」は、少なくとも1つのポリマー部分が天然に存在しないポリマー改変基である。別の例では、天然に存在しない改変基は、改変炭水化物である。改変基による官能基化の座位は、「改変糖」がポリペプチドに酵素的に加えられることをそれが阻止しないように選択される。「改変糖」は、改変基で官能基化され、グリコシルトランスフェラーゼなどの天然であるか改変された酵素の基質である、任意のグリコシル模倣部分も指す。
【００４５】
ポリペプチドに加えられるポリマー改変基は、そのようなポリペプチドの特性、例えばその生物学的利用能、生物的活性または体内でのその半減期を変更することができる。本発明による例示的なポリマーには、線状または分枝状であってよい水溶性ポリマーが含まれ、1つまたは複数の独立して選択されるポリマー部分、例えばポリ(アルキレングリコール)およびその誘導体を含むことができる。本発明によるポリマー改変基には、水溶性ポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)およびその誘導体(PEG、m-PEG)、ポリ(プロピレングリコール)およびその誘導体(PPG、m-PPG)などが含まれてよい。
【００４６】
用語「水溶性」は、水へのなんらかの検出可能な程度の溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出および/または定量化する方法は、当技術分野で周知である。本発明による例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカライド、ポリ(エーテル)、ポリ(アミン)、ポリ(カルボン酸)などが含まれる。ペプチドは混合した配列を有することができ、例えばポリ(リジン)など、単一のアミノ酸で構成されてもよい。例示的な多糖は、ポリ(シアリン酸)である。例示的なポリ(エーテル)は、ポリ(エチレングリコール)、例えばm-PEGである。ポリ(エチレンイミン)は例示的なポリアミンであり、ポリ(アクリル)酸は代表的なポリ(カルボン酸)である。
【００４７】
本発明による水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ(エチレングリコール)(すなわちPEG)であってよい。本発明との関連で用語PEGには、アルコキシPEG、二官能性PEG、マルチアームPEG、分岐PEG、分枝状PEG、ペンダントPEG(すなわちポリマー骨格にぶら下がる1つまたは複数の官能基を有するPEGもしくは関連したポリマー)、またはその中の分解可能な結合を有するPEGを含む、その形態のいずれかのポリ(エチレングリコール)が含まれる。
【００４８】
ポリマー骨格は、線状または分枝状であってよい。分枝状ポリマー骨格は、当技術分野で一般に公知である。一般的に、分枝状ポリマーは、中央の枝コア部分および中央の枝コアに連結する複数の線状ポリマー鎖を有する。PEGは、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加によって調製することができる分枝形で一般に用いられる。中央の枝部分は、リジンまたはシステインなどのいくつかのアミノ酸に由来することもできる。一例において、分枝状ポリ(エチレングリコール)はR(-PEG-OH)mのような一般形で表すことができ、式中、Rはグリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、mはアーム数を表す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第5,932,462号に記載のものなどのマルチアームPEG分子を、ポリマー骨格として用いることもできる。
【００４９】
他の多くのポリマーも、本発明に適する。非ペプチド性で水溶性のポリマー骨格が、本発明で特に有用である。適するポリマーの例には、それらに限定されないが、他のポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン(olefmic)アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ([アルファ]-ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,629,384号に記載のもの、ならびにそのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が含まれる。
【００５０】
ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化してよいが、それは一般的に約100Daから約160,000Da、例えば約5,000Daから約100,000Daの範囲である。より具体的には、本発明によるコンジュゲートした各親水性ポリマーのサイズは、約500Daから約80,000Daまで、例えば約1000Daから約80,000Daまで、約2000Daから約70,000Daまで、約5000から約70,000Daまで、約5000から約60,000Daまで、約10,000から約70,000Daまで、約20,000から約60,000Daまで、約30,000から約60,000Daまで、約30,000から約50,000Daまで、または約30,000から約40,000Daまで変化してよい。これらのサイズは、正確な測定値でなく推定値を表すことを理解すべきである。好ましい実施形態によると、本発明による分子は、親水性ポリマー、例えば10,000、40,000または80,000Da+/-約5000、約4000、約3000、約2000または約1000DaのサイズのPEGなどの不均一な集団とコンジュゲートされる。
【００５１】
アルブミン結合剤コンジュゲート/側鎖基
タンパク質のin vivo特性は、アルブミン結合側鎖を用いて向上させることができることが知られている。そのような側鎖またはアルブミン結合剤は、投与の前にタンパク質に結合させることができ、例えば、in vivoでタンパク質を安定させることができるか、タンパク質のin vivo半減期を向上もしくは延長させることができる。
【００５２】
それによって、アルブミン結合剤は血流による誘導体の循環を促進することができる。アルブミン結合剤は、ペプチド誘導体およびアルブミンの複合体が徐々にだけ崩壊して活性医薬成分を放出するという事実のために、それが結合しているタンパク質の作用時間を延長させるか引き延ばす作用を有することができる。したがって、好ましい置換基または側鎖は、全体としてアルブミン結合部分と呼ぶことができる。
【００５３】
アルブミン結合剤(アルブミン結合部分)は、アルブミン結合に特に関連し、それによって血流中の循環の延長に関連する部分を含むことができ、その部分はしたがって延長部分と呼ぶことができる。延長部分は、ペプチドへのその給合点と比較して好ましくはアルブミン結合部分の反対側の末端に、またはその近くにある。
【００５４】
好ましい実施形態では、アルブミン結合剤は、アルブミンと非共有結合性の複合体を形成することが可能である側鎖であるか、それを含む。アルブミン結合剤は、アルブミンに非共有結合的におよび/または可逆的に結合することができる。アルブミン結合剤は、アルブミンに特異的に結合することができる。下記の方法から明らかであるように、アルブミン結合剤はシクロデキストリンに結合することができる。アルブミン結合剤は、シクロデキストリンに非共有結合的におよび/または可逆的に結合することができる。アルブミン結合剤は、シクロデキストリンに特異的に結合することができる。
【００５５】
本明細書に記載されるアルブミン結合剤は、一般に疎水性の基である。アルブミン結合部分の他の部分、すなわち延長部分およびペプチドへの給合点の中間の部分は、リンカー部分、リンカー、スペーサーなどと呼ぶことができる。しかし、そのようなリンカーの存在は任意選択であり、したがってアルブミン結合部分は延長部分と同一であってよい。
【００５６】
特定の実施形態では、アルブミン結合部分および/または延長部分は親油性であり、および/または生理的pH(7.4)で負に荷電している。
【００５７】
アルブミン結合部分および/または延長部分は、アルキル化、アシル化もしくはアミド形成などのコンジュゲーション化学によってペプチドのアミノ基と共有結合することができるか、またはエステル化、アルキル化、オキシム化などによってヒドロキシル基と共有結合することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、アルブミン結合部分および/または延長部分の活性エステルは、アミド結合の形成の下で、シアル酸残基またはシアル酸誘導体のアミノ基と共有結合する。
【００５９】
本目的のために、用語「アルブミン結合部分」、「延長部分」および「リンカー」には、これらの分子の未反応形ならびに反応形が含まれる。一方または他方の形が意味されるかは、その用語が用いられる文脈から明らかである。
【００６０】
アルブミン結合部分は、脂肪酸または脂肪二酸、またはその誘導体もしくはそのいずれかであってよいか、それを含むことができる。
【００６１】
用語「脂肪酸」は、4から28個の炭素原子、例えば16個の炭素原子を有する脂肪族モノカルボン酸を指す。それは好ましくは非分枝状であり、および/または偶数であり、それは飽和であるか、不飽和であってよい。
【００６２】
用語「脂肪二酸」は、上で定義される脂肪酸であるが、オメガ位置にさらなるカルボン酸基を有するものを指す。したがって、脂肪二酸はジカルボン酸である。
【００６３】
命名法は当技術分野で通常のものであり、例えば-COOHならびにHOOC-はカルボキシを指し、-C6H4-はフェニレンを、-CO-ならびに-OC-はカルボニル(O=C<)を、C6H5-O-はフェノキシを指す。
【００６４】
好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、2〜80個のC原子、好ましくは5〜70個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、4〜20個のヘテロ原子、好ましくは2〜40個のヘテロ原子、より好ましくは3〜30個のヘテロ原子を有する。ヘテロ原子の特に好ましい例は、N原子およびO原子である。H原子はヘテロ原子ではない。
【００６５】
別の実施形態では、リンカーが、少なくとも1つのOEG分子、および/もしくは少なくとも1つのグルタミン酸残基、またはそうではなくて対応するラジカル(OEGとは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、すなわちこの分子のラジカル:-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-を名指すものである)を含む。
【００６６】
好ましい一実施形態では、リンカー部分が、アミド結合によりシアル酸残基に連結される、ジカルボキシル残基を含む。好ましい例では、ジカルボキシル残基が、2〜30個のC原子、好ましくは4〜20個のC原子、より好ましくは4〜10個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、ジカルボキシル残基が、0〜10個のヘテロ原子、好ましくは0〜5個のヘテロ原子を有する。
【００６７】
別の好ましい例では、リンカー部分が、その遠位カルボキシル基を介して、アミド結合によりシアル酸残基に連結された、アミノ基および遠位カルボキシル基の両方を含有する基を含む。好ましい一実施形態では、この基が、OEG基である。
【００６８】
アミノ酸であるグルタミン酸(Glu)は、2つのカルボン酸基を含む。そのガンマ-カルボキシ基は、シアル酸残基もしくはシアル酸誘導体のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は、OEG分子のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とのアミド結合を形成するのに用いられることが好ましい。Gluのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合はOEG分子のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGluのガンマ-カルボキシ基とのアミド結合を形成する。このようなGluの組入れを、場合によって簡単に、「ガンマ-Glu」と称する。
【００６９】
O連結オリゴ糖: N-グリカンおよびO-グリカンの両方は、そのタンパク質を生成する細胞によってタンパク質に結合される。発生期のタンパク質がリボソームから小胞体に転位されるに従い、細胞性N-グリコシル化機構はアミノ酸鎖のN-グリコシル化シグナル(N-X-S/Tモチーフ)を認識してグリコシル化する(Kielyら1976年;Glabeら1980年)。
【００７０】
同様に、O-グリカンはアミノ酸鎖の特定のO-グリコシル化部位に結合されるが、O-グリコシル化を誘発するモチーフはN-グリコシル化シグナルより非常に不均一であり、アミノ酸配列のO-グリコシル化部位を予測する我々の能力はなお不十分である(Juleniusら2004年)。したがって、人工O-グリコシル化部位の構築には、多少の不確実性が付随する。
【００７１】
したがって、末端欠失型因子VIIIBドメインのO-連結オリゴ糖は、天然に存在するO-連結グリコシル化配列または組換え技術によって人工的に構築されたO-連結グリコシル化配列と共有結合させることができる。
【００７２】
本発明の好適な実施例によると、O-連結オリゴ糖は、野生型因子VIII分子のグリコシル化に曝露されていないが、Bドメインの末端欠失の結果としてO-グリコシル化にアクセス可能になっている天然に存在するO-連結グリコシル化配列に連結される。その例は、Bドメインが配列番号1中のアミノ酸742〜763に対応する、Bドメイン末端欠失型因子VIII変異体である。Bドメインがいくぶん異なる場所で末端欠失型されるとしても、すなわち末端欠失型Bドメインが742〜763リンカーと比較していくぶん短い(例えば1、2、3、4または5アミノ酸短い)か長い(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸)場合でも、この末端欠失型変異体中の「隠れた」O-グリコシル化部位がグリコシル化されることはありそうである。人工O-グリコシル化部位の生成ではなくBドメインの末端欠失によって「隠れた」O-グリコシル化部位を活性化させることによるこの手法は、有利な安全性プロファイル(すなわち低アレルゲン性など)を有する分子を作製する利点を有する。因子VIIIBドメインの他のO-グリコシル化部位は、異なる方法で分子を末端欠失させることによって同様に活性になることができる。
【００７３】
シアリルトランスフェラーゼ:シアリルトランスフェラーゼは、発生期のオリゴ糖にシアリン酸を移す酵素である。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖基質に特異的である。シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸付加糖脂質(ガングリオシド)の末端部分に、または糖タンパク質のN-もしくはO-連結糖鎖にシアリン酸を加える。それらが作用する受容体構造に基づいて、およびそれらが形成する糖結合の種類に基づいて識別することができる約20個の異なるシアリルトランスフェラーゼがある。本発明による好ましいシアリルトランスフェラーゼは、ST3Gal-I(O-グリカン特異的)およびST3Gal-III(N-グリカン特異的)である。したがって、例えば特異的シアリルトランスフェラーゼの選択および/または特定のグリコシル化パターンを有する因子VIII分子の操作によって、本発明によるコンジュゲート因子VIII分子の構造を操作することができる。
【００７４】
O-連結オリゴ糖のグリコ-ペグ化: O-グリカンの生合成は、生合成の比較的初期にシアル酸残基を加えることによって改変すること、および終了することができる。特定のシアリルトランスフェラーゼ酵素は、GalNAcα-Ser/Thrに、またはCore 1 GalT作用の後の早期のO-グリカンコアサブタイプに作用することが可能である。用語T抗原は、Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖の存在と関連している。これらの構造の生成は同じ基質に対してのグリコシルトランスフェラーゼ間の競合を含み、したがってゴルジ装置の中のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルおよび細胞内分布が、O-グリカンの生合成および多様化での構造的結果を決定する。Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖だけが、グリコペグ化のために適合する。
【００７５】
しかし、この構造の利用できる量は、シアリダーゼまたはCore1 GalTまたはその組合せによるタンパク質の処理を通して、大いに増強することができる。グリコペグ化処理の結果、標的タンパク質のGalβ-3GalNAcα-Ser/Thr二糖へのα3結合を通して、シアリン酸PEGが天然の構造に加えられる。
【００７６】
他の親水性ポリマーを、O-連結オリゴ糖に結合することもできる。O-グリカンを通してFVIIIへ他の親水性ポリマーを酵素的にコンジュゲートするための基本的な要件は、WO03031464に開示されるように、遊離アミノ基を通してグリシルシアリン酸誘導体にそれらを結合させる能力である。当業者に公知である多様な結合化学を通してこれを達成することができる。活性化生体適合性ポリマーの例には、ポリアルキレン酸化物、例えばそれらに限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、2-(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリン(mPC)ポリマー(WO03062290に記載される)、デキストラン、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸もしくは特定のペプチド配列のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン-無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン-無水リンゴ酸コポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物、他のバイオポリマーおよびその任意の同等物が含まれる。
【００７７】
例えばWO0331464に開示されるように、側鎖基はN-連結オリゴ糖に結合することができる。そのような方法は、因子VIII分子へのいくつかの側鎖基の給合をしばしばもたらす。
【００７８】
医薬組成物:本明細書では、医薬組成物が、例えば、RTU(ready-to-use)滅菌水性組成物、または、例えば、水中もしくは水性緩衝液中で再構成しうる乾燥滅菌組成物など、非経口投与に適する、本発明による因子VIII分子を含む組成物を包含することを意味することが好ましい。本発明による組成物は、各種の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤などを含みうる。
【００７９】
このような組成物中のさらなる成分には、保湿剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調整剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、またはタンパク質)、および双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン、およびヒスチジンなどのアミノ酸)が含まれうる。このようなさらなる成分が、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害な影響を与えるべきでないことは当然である。非経口投与は、シリンジ、場合によって、ペン型シリンジによる皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介して実施することができる。代替的に、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、鼻腔内スプレーまたは肺内スプレーの形態でFVIII化合物を投与するための溶液または懸濁液でありうる組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のFVIII化合物を含有する医薬組成物はまた、例えば、注射針なしの注射による、もしくはパッチ、場合によって、イオントフォレーシスパッチによる経皮投与、または経粘膜投与、例えば、口腔内投与にも適合させうる。
【００８０】
本明細書で用いられる「治療」という用語は、それを必要とする任意のヒト対象または他の動物対象に対する医学的治療を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト対象または他の動物対象の健康に有益であることを示す一時的または決定的な診断を施した治療者による身体検診を受けていることが期待される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康状態に従い、個体により異なりうる。したがって、前記治療は、予防的治療の場合もあり、緩和的治療の場合もあり、対症的治療の場合もあり、かつ/または治癒的治療の場合もある。
【００８１】
第1の態様では、したがって本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。一実施形態では、側鎖基は、親水性ポリマー、アルブミン結合剤、抗体またはその断片、トランスフェリンおよびアルブミンからなる群の1つまたは複数から選択される。
【００８２】
好ましい実施形態では、因子VIII分子はBドメイン末端欠失型変異体であり、側鎖基は任意選択で末端欠失型Bドメインと共有結合でコンジュゲートされ、それによって因子VIIIの活性化は共有結合でコンジュゲートされた側鎖基の除去をもたらす。別の実施形態では、Bドメイン末端欠失型分子は、末端欠失型BドメインのO-連結オリゴ糖を通して親水性ポリマーと共有結合でコンジュゲートされ、因子VIIIの活性化は共有結合でコンジュゲートされた親水性ポリマーの除去をもたらす。そのようなO-グリコシル化部位は、好ましくはBドメインの末端欠失によって構築される。
【００８３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による分子は、残基1680の点突然変異を含む。別の好ましい実施形態では、因子分子は、残基1670〜1684にわたる領域で、1つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む。したがって、本発明による分子は、vWF結合ドメインの中に点突然変異および欠失の両方を含むことができる。特に好ましい実施形態によると、側鎖基はPEGである。
【００８４】
本発明の別の態様は、低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子への側鎖基の給合を含む、本発明による分子の作製方法に関する。そのような方法によって得ることができる、または得られる分子も、本発明の一部である。
【００８５】
本発明の第3の態様は、それを必要とする患者に本発明による分子の治療的有効量を投与することを含む、血友病疾患の治療方法に関する。
【００８６】
本発明の第4の態様は、本発明による分子の医薬として使用に関する。
【００８７】
第5の態様は、血友病の治療のための医薬の製造のための、本発明による分子の使用に関する。
【００８８】
最後の態様は、本発明による分子を含む医薬組成物に関する。
【００８９】
(実施例)
(実施例1)
組換えBドメイン末端欠失型O-グリコシル化因子VIIIおよびその変異体、例えば因子VIII(Y1680F)または因子VIII(Y1680C)の生成
細胞系および培養工程
因子VIIIのcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。プラスミドは、Y1680F突然変異を含むBドメイン欠失因子VIII、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1〜740を含む因子VIII重鎖、および全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1649〜2332を含む因子VIII軽鎖をコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸741〜750および1638〜1648による配列を含む21アミノ酸のリンカー(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR:配列番号4)により連結した。配列番号4で定義されるリンカーを含むFVIII変異体は、本明細書で「N8」と呼ぶこともできる。このプラスミドによってコードされる因子VIIIアミノ酸配列は、配列番号1(wt)、配列番号2(Y1680F)、配列番号3(Y1680C)に示す通りである。
【００９０】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に、このプラスミドをトランスフェクトし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ系により選択し、最終的に、動物成分非含有培地中で培養されるクローン懸濁液生成細胞をもたらした。
【００９１】
工程の第1のステップは、作業用の細胞バンクバイアルに由来する細胞バイアルを、化学的に規定された、動物成分非含有増殖培地へと接種することである。まず融解後、細胞を、T型フラスコ内でインキュベートする。融解の1または2日後、細胞をシェーカーフラスコへと移し、細胞密度を0.2〜3.0×106個/mlに維持するために、培養物容量を系列希釈により拡張する。次のステップは、シェーカーフラスコ中の培地を、種培養用バイオリアクターへと移すことである。ここで培養物容量をさらに拡張してから、最終的に生成用バイオリアクターへと移す。化学的に規定された、同じ、動物成分非含有培地を、全ての接種物拡張ステップに用いる。生成用バイオリアクターへと移した後で、培地に、生成物濃度を増大させる成分を補充する。生成用バイオリアクターでは、サイクル時間を3日間とする反復バッチ工程で細胞を培養する。回収時には、培養物容量の80〜90%を、回収タンクへと移す。次いで、初期細胞密度を得るために、残りの培養液を、新鮮な培地で希釈し、次いで、新規の増殖期を開始する。遠心分離および濾過により回収バッチを洗浄し、保持タンクへと移してから、精製工程を開始する。保持タンク内の細胞を含まない回収物に緩衝液を添加し、pHを安定化させる。
【００９２】
生成試行が終了するまでに、細胞バンクの生成を終了させるために、細胞を回収して凍結させる。この細胞バンクを、マイコプラズマ、滅菌性、およびウイルス汚染について検査する。
【００９３】
精製
細胞培養培地から、Bドメイン欠失因子VIII(Y1680F)を単離するために、Capto MMCカラムにおける濃縮ステップ、ELISA(immunoabsorbent)およびクロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、ならびに最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を使用した:11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、0.02%のTween 80、pH=7.5中で平衡化したCapto MMC(GE Healthcare、Sweden)によるカラム(1.6×12cm)へと、流速15ml/分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、1.5MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、2.5MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH=7.5により、流速1ml/分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、因子VIII活性(FVIII:C)について比色アッセイでアッセイした(実施例3参照)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。
【００９４】
因子VIIIに対するモノクローナル抗体を発生させた(Kjalke Eur J Biochem、234、773頁、Hansen, J Thromb Haemost 2009; 7, Supplement 2: abstract no. PP-WE-572)。さらなるエピトープマッピング(結果は示さない)により、この抗体F25は、アミノ酸残基725〜740の重鎖最C末端配列を認識することが判明した。本質的に、製造元により説明される通りに、ゲル1ml当たり2.4mgの密度で、F25抗体を、NHS活性化セファロース4 FF(GE Healthcare, BioSciences AB、Uppsala、Sweden)に連結した。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、pH=7.3で10倍に希釈し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH7.3で平衡化したF25 Sepharoseカラム(1.6×9.5cm)へと、流速0.5ml/分で適用した。UVシグナルが一定となるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、UVシグナルが一定となるまで、再度、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.65MのNaCl、pH7.3で洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、2.5MのNaCl、50%のエチレングリコール、pH=7.3により、流速1ml/分で、因子VIIIを溶出させた。1mlの画分を回収し、因子VIII:Cについてアッセイした(実施例3参照)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約25mlのプール容量を得た。
【００９５】
イオン交換ステップのために、緩衝液A:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3および緩衝液B:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、1MのNaCl、pH=7.3を調製した。85%の緩衝液A/15%の緩衝液Bにより、流速2ml/分で、Macro-Prep 25Q Support(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA)によるカラム(1×10cm)を平衡化した。前出の工程によるプールを、緩衝液Aで10倍に希釈し、流速2ml/分でカラムへと送入した。85%の緩衝液A/15%の緩衝液Bにより、流速2ml/分でカラムを洗浄し、流速2ml/分で120mlの15%緩衝液B〜70%緩衝液Bにわたる直線勾配により、因子VIIIを溶出させた。2mlの画分を回収し、実施例3で説明されているように因子VIII活性(FVIII:C)についてアッセイした(比色アッセイ)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約36mlのプール容量を得た。
【００９６】
前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、150mMのNaCl、pH=7.3で平衡化した調製グレードのSuperdex 200(GE Healthcare, Bio-Ssiences AB、Uppsala、Sweden)カラム(2.6×60cm)へと1ml/分で適用し、溶出させた。3mlの画分を回収し、因子VIII:Cについてアッセイした(実施例3参照)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約57mlのプール容量を得た。因子VIIIを含有するプールを、-80℃で保存した。
【００９７】
FVIII:CおよびELISAの測定により判定される通り、上記の4ステップの精製手順を用いることにより、約15%の全収量が得られた。
【００９８】
(実施例2)
組換えO-グリコシル化因子VIIIのペグ化の手法
以下の手法を用いて、実施例1で得られる組換え因子VIII分子をポリエチレングリコール(PEG)とコンジュゲートさせる。
【００９９】
グリコペグ化反応が効率的であるために、>5mg/mlのFVIII濃度が必要とされる。FVIIIはその濃度で通常可溶性でないので、選択された緩衝液組成のスクリーニングを行った(表1(Table 1)を参照)。これらの検討事項に基づき、pH6.0の50mM MES、50mM CaCl2、150mM NaCl、20%グリセロールを含む緩衝液が適する反応緩衝液であると見出された。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
前記のように精製された組換えFVIIIは、段階溶出を用いるPoros 50 HQカラム、Sartorius Vivaspin(PES)フィルター、10kDaカットオフ、またはAmicon 10kDa MWCO PESフィルターでのイオン交換によって、反応緩衝液中で6〜10mg/mLの濃度まで濃縮した。FVIIIのグリコペグ化は、因子VIII(BDD)(最終約4.7mg/mL)を、シアリダーゼ(A.ウレアファシエンス(A. ureafaciens))(159mU/mL)、CMP-SA-グリセロール-PEG-40kDa(WO2007/056191を参照)(5モル等量)およびMBP- ST3Gal1(540mU)(WO2006102652)と反応緩衝液(50mM MES、50mM CaCl2、150mM NaCl、20%グリセロール、0.5mMアンチパイン、pH6.0)中で混合することによって開始された。反応混合液は、全体の約20〜30%の変換収率まで、32℃でインキュベートされた。
【０１０２】
インキュベーションの後、試料を緩衝液A(25mMトリス、5mM CaCl2、20mM NaCl、20%グリセロール、pH7.5)で希釈し、Source 15Qカラム(1cm id×6cm、4.7mL、1mL/分、280nm)に加えた。結合した材料を緩衝液Aで洗浄し、段階勾配を用いて緩衝液B(25mMトリス、5mM CaCl2、1M NaCl、20%グリセロール、pH7.5)で溶出させた。グリコペグ化因子VIII-(O)-SA-グリセロール-PEG-40kDaを、約25%の緩衝液Bでカラムから溶出させた。
【０１０３】
シアリダーゼ処理の間にN-グリカンに曝露させた遊離のガラクトース部分をブロックするために、因子VIII-SA-グリセロール-PEG-40kDaのプール画分(最終1.0mg/mL)を、CMP-SA(2,000モル等量)およびMBP-SBD-ST3Gal3(WO2006102652)(400mU/mL)と反応緩衝液50mM MES、20mM CaCl2、150mM NaCl、10mM MnCl2、20%グリセロール、pH6.0中で混合し、32℃で11時間インキュベートした。
【０１０４】
生じたキャップ付のグリコペグ化因子VIII-SA-グリセロール-PEG-40kDaを、50mM MES、50mM CaCl2、150mM NaCl、10%グリセロール、pH6.0で平衡させたSuperdex 200カラム(10cm id×300mm;280nm)でのゲル濾過によって、cmp-SAおよびST3GalIIIから分離した;流速0.25mL/分。生成物因子VIII-SA-グリセロール-PEG-40kDaは38分後に溶出する。ピーク分画を収集、等分し、以降の分析にかけた。
【０１０５】
O-グリカン40kDa-グリコPEG-BDD-FVIII Y1680F
水(pH7.3)中のイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、ツイーン80(0.02%)、塩化ナトリウム(500mM)およびグリセロール(1M)からなる緩衝液中のBDD-FVIII Y1680F(1.18mg、0.85mg/ml)を解凍した。
【０１０６】
アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)からのシアリダーゼ(20マイクロリットルの緩衝液に2.4U)、シアリルトランスフェラーゼ(His-ST3Gal-I、2.5mg/ml、6.75U、125マイクロリットル、EC 2.4.99.4、WO2006102652)およびシチジンモノホスフェートN-5'-PEG-グリセロール-ノイラミン酸、CMP-SA-グリセロール-PEG-40kDa(1.9mM、41マイクロリットル緩衝液、78nmol、WO2007/056191を参照)を加えた。最終容量は、1.5mlであった。生じた混合液は、摂氏32度で24時間放置した。混合液を緩衝液A(水(pH7.3)にイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、ツイーン80(0.02%)およびグリセロール(1M))で20mlに希釈した。
【０１０７】
生じた混合液をMonoQ 5/50 GLカラム(GE Healthcare Bio-Sciences、Hillerod、Denmark)に加えた。緩衝液A(10カラム容量)で固定化された物質を洗浄し、その後0〜100%の緩衝液B(水(pH7.3)にイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、ツイーン80(0.02%)、塩化ナトリウム(1M)およびグリセロール(1M))(10 CV 100% A、10 CV 0〜20%緩衝液B、10 CV 20%緩衝液B、25 CV 20〜100%緩衝液Bおよび5 CV 100%緩衝液B)の勾配を用いてそれをカラムから溶出させた。
【０１０８】
収集した物質を、シチジンモノホスフェートN-5'アセチルノイラミン酸(53マイクログラム)およびシアリルトランスフェラーゼ(MBP-SBD-ST3Gal-III、EC 2.4.99.6、WO2006102652を参照)と混合した。最終容量および濃度は、それぞれ2.56mlならびに0.46mg/ml(FVIII)、0.132mg/ml(MBP-SBD-ST3Gal-III)および54マイクロモル(シチジンモノホスフェートN-5'アセチルノイラミン酸)であった。
【０１０９】
混合液を摂氏32度で1時間放置し、その時間に混合液を緩衝液Aで20mlに希釈した。生じた混合液をMonoQ 5/50 GLカラム(GE Healthcare Bio-Sciences)に加えた。緩衝液Aで固定化された物質を洗浄し、その後0〜100%(10 CV 100% A、10 CV 0〜20%緩衝液B、10 CV 20%緩衝液B、25 CV 20〜100%緩衝液Bおよび5 CV 100%緩衝液B)の勾配を用いてそれをカラムから溶出させた。単離した分画中のタンパク含有量は、SDS-PAGEゲル(Invitrogen、7%トリス-酢酸塩、NuPAGEトリス-酢酸塩ランニング緩衝液、70分、150V、非還元条件)を用いて評価した。
【０１１０】
選択された分画をプールし、Amicon Ultra遠心管(Millipore、カットオフ:50kDa)を用いて濃縮した。濃縮後の容量は、0.5mlであった。生じた溶液を、水(pH7.0)中のヒスチジン(1.5g/l)、塩化カルシウム(250mg/l)、ツイーン80(0.1g/l)、塩化ナトリウム(18g/l)およびショ糖(3g/l)からなる緩衝液で前平衡させたSuperose 6 10/300 GLカラム(GE Healthcare Bio-Sciences、Hillerod、Denmark;カラム容量24ml)に加えた。前述の緩衝液および0.6ml/分の流動を用いて、混合液の構成成分を1.5カラム容量にわたり1mlのサイズの分画に分離した。選択された分画をプールした(0.015mg/ml、2ml)。
【０１１１】
(実施例3)
Peg-30K-マレイミドによるY1680Cのペグ化(参照US2006/0115876 A1)
試薬:
1) BDD-FVIII N8-Y1680C(MW 178,000)、1200μl、濃度80μg/ml、96μg、緩衝液20mMイミダゾール、+10mM CaCl2、+0.02%ツイーン80、+1M NaCl、1M gグリセロール、pH7.3に0.54nmol
2)トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP、MW 287):700等量; 0.0315μmモル;9μg。1mgのTCEPを、1mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3、1M NaClに溶解させた。この溶液の109μlを用いた。
3) 30kDa PEG-マレイミド(NOF Corp.からのSunbright Me-300Ma、MW 29300)、10等量、180μg。4.8mgの30kDa PEG-マレイミドを、2.4mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3、1M NaClに溶解させた。この溶液の90μlを用いた。
【０１１２】
VivaPピュアスピンカラム(強力な陰イオン交換)およびPro-spin(スピンカラム)のために用いた緩衝液:
緩衝液A: 20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3
緩衝液B: 20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 25mM NaCl
緩衝液C:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 50mM NaCl
緩衝液D:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 200mM NaCl
緩衝液E:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 1M NaCl
【０１１３】
BDD-FVIIIN8-Y1680Cを室温で解凍し、5ml管にプールした。TCEP溶液の109μlの量を加えた。混合液を、5℃で30分間インキュベートした。
【０１１４】
次に、TCEPを除去した:反応混合液を、42mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3で希釈し、塩濃度を31mMにした。溶液を、Viva pPure Q maxi M(Sartorius、強力な陰イオン交換)に加えた。
【０１１５】
平衡化: 10mlの緩衝液Aを加え、2000g(1500 RCF)で2分間遠心回転させる
試料ローディング:希釈試料の4×11mlを加えた。各々について、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液B(25mM NaCl): 10mlの緩衝液Bを加え、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液C(50mM NaCl): 10mlの緩衝液Cを加え、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液D(200mM NaCl): 10mlの緩衝液Dを加え、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液E(1M NaCl): 2×750μlの緩衝液Eを加え、2000gで1分間遠心回転させる。(2回繰り返した)
【０１１６】
脱ブロックされたタンパク質は、緩衝液Eによる溶出からの第一分画で収集された; Nanodropによる測定で103μg、137μg/ml。次に、NAP-10カラム(GE Healthcare)、および溶出剤として20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3、1M NaClを用いて、それを緩衝液交換した。全ての物質を含む1200μlの単一の分画を収集した。
【０１１７】
この分画に、30kDa PEG-マレイミド溶液の90μlを加えた。反応混合液を5℃で20時間インキュベートし、その後のSDS-PAGEゲル分析によってFVIII LCバンドの強度の低下、および同時により高い分子量の新しいバンドの存在が示された。
【０１１８】
次に前記のように反応混合液を42mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3で希釈し、Viva pure Q maxi M(強力な陰イオン交換)スピンカラムに加え、緩衝液BからEを通して溶出させた。67μgの量のタンパク質誘導体を収集し、濃度89μg/ml、750μl、それをSuperdex 200 10/300カラムに加え、ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、ツイーン80(0.1mg/ml)、NaCl(18mg/ml)、ショ糖(3mg/ml)、pH7で溶出させた。9.5から12分間の保持時間で溶出した物質を収集し、一ペグ化BDD-FVIII N8-Y1680C突然変異体、35μg、14μg/mlを提供した。分画のSDS-PAGE分析は、PEGがLCに結合している、化合物の正しい構造を示した。
【０１１９】
上記のプロトコルを用いて、一ペグ化BDD-FVIII Y1680C化合物を調製した。この化合物では、PEG基はBDD-FVIIIの1680位へ結合している。この特定の改変は、2つの同時作用を生む:vWF結合の減少およびPEG媒介半減期の延長。
【０１２０】
(実施例4)
発色性アッセイで測定されるFVIII:C
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)は、以下の通りにCoatest SP試薬(Chromogenix)を用いて発色性FVIIIアッセイで評価された: rFVIII試料およびFVIII標準(例えばNIBSCからの第7国際FVIII標準に対して較正された、精製野生型rFVIII)を、Coatestアッセイ緩衝液(50mMトリス、150mM NaCl、1% BSA、pH7.3、保存剤含有)に希釈した。試料、標準および緩衝液陰性対照の50μlを、2反復で96穴マイクロタイタープレート(Nunc)に加えた。Coatest SPキットからの因子IXa/因子X試薬、リン脂質試薬およびCaCl2を5:1:3(vol:vol:vol)で混合し、これの75μlをウェルに加えた。室温で15分間のインキュベーションの後、50μlの因子Xa基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを加え、反応体を室温で10分間インキュベートした後、25μlの1Mクエン酸、pH3を加えた。Spectramaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で415nmの吸光度を測定し、620nmの吸光度を参照波長として用いた。陰性対照の値を全ての試料から引き、プロットされた吸光度値対FVIII濃度の線形回帰によって較正曲線を作成した。HPLCで測定されたタンパク質濃度で試料の活性を割ることによって、比活性を計算した。軽鎖に対応するクロマトグラム中のピーク下面積を積算し、濃度がアミノ酸分析で測定された野生型未改変rFVIIIの平行分析で同じピークの面積と比較することによって、試料濃度を決定した。O-グリコペグ化rFVIII化合物については比FVIII:C活性が維持されたことを、Table 1(表2)のデータは実証する。
【０１２１】
(実施例5)
1段階クロットアッセイで測定されるFVIII:C
rFVIII化合物のFVIII:Cは、以下の通りに1段階FVIIIクロットアッセイでさらに評価した: rFVIII試料およびFVIII標準(例えばNIBSCからの第7国際FVIII標準に対して較正された、精製野生型rFVIII)を、HBS/BSA緩衝液(1%BSAを含む20mM hepes、150mM NaCl、pH7.4)で約10U/mlに希釈し、その後VWFを含んでいるFVIII欠損血漿(Dade Behring)で10倍に希釈した。試料は、その後HBS/BSA緩衝液で希釈した。APTTクロット時間は、単一因子プログラムを用いるACL300RまたはACL5000機器(Instrumentation Laboratory)で測定した。VWFを含むFVIII欠損血漿(Dade Behring)をアッセイ血漿として用い、およびSynthASil(HemosIL(商標)、Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として用いた。クロット機器では、希釈された試料または標準を、FVIII欠損血漿、aPTT試薬と37℃で混合する。塩化カルシウムを加え、クロット形成までの時間を濁度で測定する。試料中のFVIII:Cは、FVIII標準の希釈溶液のクロット形成時間の標準曲線に基づいて計算される。Table 1(表2)のデータは、凝固と発色活性との間の比を示す。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
(実施例6)
FVIII欠損およびVWF欠損マウスでのrFVIIIの薬物動態
rfviii変異体の薬物動態は、FVIII欠損マウス(c57bl/6バックグラウンドを有するFVIIIエクソン16ノックアウト(KO)マウス、Taconic m&bで育成)で、またはvWF欠損マウス(c57bl/6バックグラウンドを有するvWFエクソン4 + 5 KOマウス、Charles River、Germanyで育成)で評価された。vWF-KOマウスは13%の正常なFVIII:Cを有していたが、FVIII-KOマウスは検出可能なFVIII:Cを有していなかった。25グラムの概算重量を有する16〜28週齢の雌雄(約1:1)混合群を用いた。マウスは、尾静脈からrFVIII(280iu/kg)の単一のi.v.注射を受けた。コーティングされていないガラス毛管を用いて、投与から最高64時間後までの時点で眼窩叢から採血した。3つの試料を各マウスからとり、2つから4つの試料を各時点で収集した。クエン酸ナトリウムで血液を直ちに安定させ、4容のFVIII coatest sp緩衝液(実施例4を参照)で希釈した後、4000×gで5分間の遠心にかけた。希釈血液から得られた血漿をドライアイスの上で冷凍し、-80℃で保存した。FVIII:Cは、実施例4に記載の発色性アッセイで測定した。winnonlinプロバージョン4.1ソフトウェアを用いて、ノンコンパートメント法(NCA)によって薬物動態分析を実行した。Table 2(表3)は、薬物動態パラメータの推定値を示す:半減期(t1/2)、クリアランス(cl)および平均滞留時間(MRT)。データは、ペグ化の結果クリアランスが減少し、半減期および平均滞留時間が増加したことを示す。
【０１２４】
BDD- FVIIIはvWF KOマウスでは速く消去され(0.5時間のT1/2)、そのことは、vWFが循環中でFVIIIのための担体および安定剤であるとの一般に容認されている仮説に一致する。vWF KOマウスが10K〜80Kのグリコペグ化BDD-FVIIIをi.v.で投与された場合、BDD-FVIIIと比較して5〜22倍の増加に対応する末端T1/2の増加が観察され(2.7〜11時間の範囲で)(Table 2(表3))、グリコペグ化がvWFへのFVIII結合の重要性を低下させたことを示唆している。結合したPEG部分の増加に従ってBDD-FVIIIのvWFへの結合が減少することを示した、BDD-FVIII-PEG-vWF結合で得られた予備データにこれは一致する。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
興味深いことに、グリコペグ化は、FVIII KOマウスと比較してvWF KOマウスでBDD-FVIIIの曝露プロファイルをほとんど「正常化した」。結合したPEG基が大きいほど、FVIII KOとvWF KOマウスとの間で薬物動態学の差はより小さい。グリコペグ化されたBDD-FVIII変異体の半減期の間の比は、PEG基のサイズの増加にともなって減少した。グリコペグ化された変異体の曝露は、未改変のBDD-FVIIIと比較してvWF依存性が低いことをこれは示す。vWF結合が欠損しているFVIII変異体を用いる場合、FVIII KOマウスで類似した傾向を観察することができる(Table 3(表4))。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
(実施例7)
血友病AマウスのFeCl3によって誘導された損傷モデルにおけるvWF結合能力が欠如しているFVIII変異体の止血効果
マウスをケタミン(Ketaminol(登録商標) Vet.(Intervet);100mg/kg)、キシラジン(Narcoxyl(登録商標) Vet.注射溶液(Intervet);5.6mg/kg)およびアトロピン(硫酸アトロピン(Phoenix Pharma);0.3mg/kg)の混合物で麻酔にかけ、体温を維持するために加熱パッド(37℃)の上に置いた。その後頸動脈を露出させ、0.5PSB Nanoprobeを動脈周囲に置いた。FeCl3損傷の誘導の5分前に、試験化合物を側部尾静脈に注射した。10% FeCl3溶液に短時間浸した濾紙(2×5mm)をプローブに隣接した動脈の周囲に置き、3分後に除去することによってFeCl3損傷を誘導した。FeCl3飽和濾紙の除去後、動脈を0.9% NaClで3回洗浄し、最後に、流動プローブ中の空気を排気して血流の最適化された測定を確保するためにSurgilube(音響カプラ)を適用した。FeCl3の除去後、最初の血流があまりに低い(0.4ml/分未満)場合、または流動が測定不能の場合は、マウスを除外した。FeCl3飽和濾紙を除去してから25分間、AD instrumentsからのソフトウェアChart5(バージョン5.5.5.20)を用いて血流(ml/分)を記録した。
【０１２９】
データ分析
特記しない限りデータは平均±SEMで提示し、GraphPad Prismバージョン5(La Jolla、CA、USA)を用いて分析した。2つの化合物の効果は、一元配置ANOVAを用いて、続いて多重比較のためのチューキーの検定を用いて比較した。P<0.05は、統計的に有意であるとみなした。
【０１３０】
結果
FeCl3損傷の後、正常に機能している凝固系を有するマウス(C57BL/6NTac)の全ての血管は3.3分以内に閉塞し、閉塞までの平均時間は2.4±0.2分であった(n=6;図1)。FVIIIノックアウトマウスのいずれも、25分の観察時間中に閉塞しなかった(n=6)。NNC 0129-0000-9105の用量依存性は、閉塞までの時間を短縮した(NNC 0129-0000-9105は、末端欠失型Bドメイン中のO-連結グリカン上のF8-500 Y1680F 40kDa-ペグ化(PEGyleret)に対応する)。閉塞までの時間は、ビヒクル処置動物と比較して5または10IU/kgのいずれかによる処置の後、有意により短かった。Advate(登録商標)の類似した効果が観察され、Advate(登録商標)とNNC 0129-0000-9105との間で効果に統計的差はなかった(図1)。
【０１３１】
(実施例8)
血友病Aマウスの尾処理出血モデルにおけるvWF結合能力が欠如しているFVIII変異体の止血効果
マウスにペントバルビタール(100mg/kg、i.p.;Nomeco、Roskilde、Denmark)で麻酔をかけ、体温を維持するために加熱パッドの上に置いた。鋭いメスで尾部の先端の4mmを切断することによって、出血を誘導した。切断の10分前に、14mLの生理食塩水(37℃)を含む試験管に尾を入れ、切断の5分前に、尾静脈注射によって試験化合物を5mL/kgの量で投与した(20または280U/kg)。血友病Aマウスおよび正常な凝固をもつ動物を、同じ量のビヒクルで処置した。動物を安楽死させた後に、30分間にわたって血液を収集した。血液減少は、ヘモグロビンの量を定量化することによって測定した。したがって、4000×で5分間の遠心によって赤血球を単離した。上清を廃棄し、ヘモグロビン試薬(ABX Lysebio;HORIBA、ABX、Roedover、Denmark)で細胞を溶解した。4000×gで5分間の遠心によって細胞片を除去した。試料を550nmで読みとり、ヘモグロビン総量を標準曲線から決定した(ヘモグロビン標準;J.T. Baker 3074;Bie & Berntsen、Roedover、Denmark)。
【０１３２】
データ分析
特記しない限りデータは平均±SEMで提示し、GraphPad Prismバージョン5(La Jolla、CA、USA)を用いて分析した。2つの化合物の効果は、一元配置ANOVAを用いて、続いて多重比較のためのチューキーの検定を用いて比較した。P<0.05は、統計的に有意であるとみなされた。
【０１３３】
結果
FVIIIノックアウトマウスの尾部出血モデルにおけるAdvate(登録商標)の用量反応相関は、前に完全に調査されている(Documentum ObjectID: 0900c76e80e3e7a5)。200IU/kgのAdvate(登録商標)は血液減少および出血時間を正常化し、血液減少および出血時間のED50値はそれぞれ39および28IU/kgであった。NNC 0129-0000-9105の止血効果を試験するために、20および280IU/kgの効果をAdvate(登録商標)の同じ用量と比較した。NNC0129-0000-9105(20および280lU/kg)は、ビヒクル処置動物と比較して、血液減少および出血時間を有意に低減した(図2)。Advate(登録商標)とNNC 0129-0000-9105との間でその効果の差は観察されなかった。
【０１３４】
Advate(登録商標)の20IU/kgの効果は、以前の試験(Documentum ObjectID: 0900c76e80e3e7a5)から予想されるよりも顕著であった。これは、Advate(登録商標)の実際に投与される活性の差および尾部出血方式の一般的変動に起因する合併効果による可能性が最も高い。したがって、両試験で20IU/kgを投与することが意図されたが、投与溶液中のFVIII活性の分析(Chromogenix(登録商標))は、活性が現在および以前の試験で意図されたものよりそれぞれ20%高かったこと(ELN 15876-199)および15%低かったことを示した。しかし、現在の試験で両化合物は同等のFVIII活性で投与されたので、NNC 0129-0000-9105およびAdvate(登録商標)が同等の効果を有するとの試験の全体的な結論をこれが変更することはない。
【０１３５】
(実施例9)
vWFに結合しない血小板結合特性によるFVIII変異体の生成。
抗GPIIa/IIIB抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、AP3を、SMART(商標)RACE cDNA増幅キット(Clontech、Ca)を用いてAP3抗体を発現するハイブリドーマ細胞から単離されたRNAから増幅した。2つのAP3鎖の可変領域の増幅のために用いたプライマーは、以下の通りであった:
重鎖:
汎用プライマーミックスA(Clontech、CA):
長い(0.4μM):
5'-ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3'(配列番号5)
短い(2μM):
5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(配列番号6)
プライマー69(10μM)
5'-gctctagactaacactcattcctgttgaagctcttg-3'(配列番号7)
軽鎖
汎用プライマーミックスA(Clontech:
長い(0.4μM):
5'-ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3'(配列番号8)
短い(2μM):
5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(配列番号9)
プライマー312(10μM)
5'-gtctaccacaacacacgtgac-3'(配列番号10)
【０１３６】
配列決定のためにZero Blunt(登録商標)TOPO(登録商標)PCRクローニングキットを用いてpCR4ベクターに可変領域をクローニングした(カタログ番号K287520 Invitrogen、CAから)。その後、可変領域をpTT5ベースの発現ベクター中のネズミIgG1枠組みにサブクローニングした。完全長AP3 abをコードする2つの鎖を、Hek293 6E細胞で一時的に発現させた。静止中の血小板への完全長抗体の結合は、FACS分析によって確認された。
【０１３７】
AP3抗体の軽鎖および重鎖の可変領域をコードするDNA配列に基づき、AP3 abの2つの単鎖抗体フォーマット(AP3 LC-HC scFvおよびAP3 HC-LC scFv)を生成した(配列1および配列2)。AP3 abの2つの単鎖フォーマットを、その後pTT5ベースの発現ベクターにサブクローニングした。静止中の血小板のGPIIa/IIIBへの2つの単鎖抗体の結合は、FACS分析によって確認された。
【０１３８】
標準の分子生物学方法を用いてAP3 LC-HC scFvまたはAP3 HC-LC scFvをBDD FVIIIのaa R761とQ1686(それぞれ配列3および配列4)との間に挿入することによって、AP3 LC-HC scFvまたはAP3 HC-LC scFvとBドメイン欠失-a3ドメイン欠失FVIIIとの間の融合タンパク質を作製した。
【０１３９】
配列番号11:AP3-LC-HC scFV-FLAG
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSDYKDDDDK*
【０１４０】
配列番号12:AP3-HC-LC scFV-FLAG
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRDYKDDDDK*
【０１４１】
これらの構築物に基づいて、変異体AP3 scFv LC-HC C34S S248Cを、標準の分子生物学方法を用いて生成することができた。
【０１４２】
N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の生成
【０１４３】
【化１】
【０１４４】
工程1:
3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジニル-1-イルエステル
【０１４５】
【化２】
【０１４６】
3-マレイミドプロピオン酸(1.0g、5.9mmol)をテトラヒドロフラン(20ml)に溶解した。2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU、2.14g、7.1mmol)およびエチルジイソプロピルアミン(1.24ml、7.1mmol)をその後加えた。N,N-ジメチルホルムアミド(5ml)を加えた。ゆっくりと回転する間、反応混合液を室温で撹拌した。混合液を2分間撹拌した。N,N-ジメチルホルムアミド(5ml)を加えた。混合液を室温で2.5時間撹拌した。それをジクロロメタン(150ml)で希釈し、その後硫酸水素ナトリウムの10%水溶液(150ml)、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(150ml)および水(150ml)で洗浄した。それを硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させて、1.20gの3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジニル-1-イルエステルを与えた。
MS: m/z=289、[M+Na]+のために必要とされる: 289
1H-NMR (CDCl3) δ 2.82 (m, 4H); 3.02 (t, 2H); 3.94 (t, 2H)、6.73 (s, 2H)。
【０１４７】
工程2:
N-((3-(ω-アミノ10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(100mg、0.009mmol)を、テトラヒドロフラン(2ml)およびジクロロメタン(10ml)の混合物に溶解した。ジクロロメタン(3ml)中の3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジニル-1-イルエステル(50mg、0.18mmol)の溶液を加えた。エチルジイソプロピルアミン(0.005ml、0.028mmol)を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。ジクロロメタン(2ml)およびエチルジイソプロピルアミン(0.5ml)を加えた。アミノメチル化(Amionomethylated)ポリスチレン樹脂(例えばNovabiochemから市販されている、添加量0.85mmol/g、438mg、0.372mmol)を加えた。混合液を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。樹脂を濾過によって除去した。25℃の浴温で溶媒を真空中で除去した。残基をジクロロメタン(4ml)に溶解した。エーテル(200ml)を加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で2時間放置した。沈殿を濾過によって単離し、真空中で乾燥させ、標記化合物の38mgを与えた。DMSO-d6での1H-NMRスペクトルは、マレイミド基の存在を示した。
【０１４８】
FVIII(NNC 0129-0000-3270)へのAP3 scFv LC-HC C34S S248Cのコンジュゲーション
【０１４９】
【化３】
【０１５０】
工程1:
AP3 scFV C24S S248CのCys 248へのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合
【０１５１】
【化４】
【０１５２】
pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mのグリセロールからなる緩衝液(0.40ml)中のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンハイドロクロリド(0.40mg)の溶液を、(4ml、2.12mg、76nmol)でpH7.5に調整した100mM HEPESおよび150mM NaClの溶液中の、そのC末端にFlagタグを有し、余分のCysがS-S橋を通して248位のシステインに結合したAP3 scFv LC-HC C34S S248Cの0.53mg/mlの濃度の溶液に加えた。反応混合液を20℃で静かに振盪した。それを2つの部分に分けた。pH7.0に調整した25mM HEPESの緩衝液を用いて、その各々をPD-10カラム(GE-Healthcare)に加えた。カラムの溶出液(その各々3.5ml)を合わせた。
【０１５３】
pH7.0に調整した25mM HEPESの緩衝液(0.43ml)中のN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(3.3mg、305nmol)の溶液を、タンパク質の溶液に加えた。反応混合液を20℃で4時間静かに振盪した。それを10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10℃で10分間の4000rpmの超遠心にかけた。混合液を精製までフリーザーに保存した。
【０１５４】
精製のために、混合液を解凍した。それを、1ml/分の流動の直径16mmおよび長さ60cmの床サイズを有するSuperdex 200ゲル、およびpH8.0に調整した25mMトリスおよび150mM NaClの緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールして、1.61mgの所望のタンパク質を与えた。SDS-PAGEゲルは、予想通りであった。
【０１５５】
工程2:
pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mのグリセロールからなる緩衝液(0.018ml)中の、重鎖のC末端にSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失FVIIIの溶液(1mg、5.64mmol)を、カットオフが10kDaのAmicon超遠心装置に入れた。pH8.0に調整した25mMトリスおよび150mM NaClの溶液(0.680ml)中のAP3 scFv C24S S248CのCys 248(1.29mg、34nmol)へのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)-アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の給合生成物の溶液を加え、pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(3ml)をその後加えた。混合液を、10℃で20分間の4000rpmの超遠心にかけた。FVIIIの残りの量は、0.800mlまたは1.25mg/mlであった。A.ウリファシエンス(A. Urifaciens)からのシアリダーゼの溶液(0.43mg/ml、302U/mg、0.0049ml、0.645U)およびST3-Gal-Iの溶液(2.5mg/ml、0.105mg、0.042ml)をその後加えた。反応混合液を32℃で1分間静かに振盪し、その後32℃で18時間放置した。それを精製までフリーザーで保存した。
【０１５６】
反応混合液を解凍した。それを2つの部分に分け、それぞれを、0.30ml/分の流動の直径10mmおよび長さ300mmの床サイズのSuperose 6ゲル、および溶離液としてpH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、150mM NaClおよび1Mグリセロールからなる緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む両方のランの全ての分画をプールした。それらをカットオフ10kDaのAmicon超遠心装置に入れ、10℃で18分間の4000rpmの超遠心にかけた。
【０１５７】
pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、150mM NaClおよび1Mのグリセロールからなる緩衝液(0.100ml)中のCMP-N-アセチルノイラミン酸(CMP Neu/Vac、1.5mg、2597nmol)の溶液、およびST3Gal-III(0.10ml、0.033mg)の0.33mg/ml溶液をその後加えた。反応混合液を300rpmで静かに振盪し、その後精製までフリーザーで保存した。
【０１５８】
反応混合液を2つの部分に分けた。その各々を、0.00045mmフィルターに通して濾過した。CNBrで活性化の後にF25抗体を結合させておいた、直径5mmおよび長さ5cmの床サイズのセファロースカラムにそれらを加えた。F25は、FVIIIの公知の抗体である。負荷後、pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、150mM NaClおよび1Mグリセロールからなる緩衝液によって、カラムを0.6ml/分の流動で3CVについて洗浄した。その後、pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80および650mM NaClからなる緩衝液によって、それを0.6ml/分の流動で3CVについて洗浄した。最後に、pH 7.35に調整した、50v/v%エチレングリコール/水溶液中の20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、2.5M NaClからなる緩衝液によって、化合物を6CVの範囲内で0.1ml/分の流動で溶出させた。所望の生成物を含む両方のランの分画をプールした。それらを10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを、10℃で14分間の4000rpmの超遠心にかけた。残りの溶液は、pH7に調整した10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01%ツイーン80、0.3M NaCl、8.8mMショ糖からなる緩衝液を用いる、0.50ml/分の流動の、直径10mmおよび長さ30cmの床サイズのSuperose 6材料でのサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。適する純度の所望の化合物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを、9℃で12分間の4000rpmの超遠心にかけた。14.46のモル吸光度を用いて、収量は0.0176mgのFVIIIへのAP3 scFv LC-HC C34S S248Cのコンジュゲートであると判明した。非還元条件下のSDS-PAGEゲルによる分析は、予想通りであった。
【０１５９】
N-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の生成
【０１６０】
【化５】
【０１６１】
工程1:
N-((3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(NNC 0129-0000-3219)
【０１６２】
【化６】
【０１６３】
N-(アミノアセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(18mg、0.029mmol)を、pH8.9に調整した50mMトリスからなる緩衝液(4ml)に溶解した。現在のpHを検査し、0.1N塩酸の添加によってpH8.9に調整した。THF(16ml)を加えた。3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(例えばRapp Polymere GmbHから市販されている、全体で200mg、0.019mmol)の最終的な量の約半分を加えた。反応混合液を室温で撹拌した。1時間の後、3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルの第二の半分を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。THFは、25℃の浴温で真空中で除去した。残りの混合液を濾過し、直径26mmおよび長さ10cmの床サイズのG25ゲルを7ml/分の流動で用いて、25mM炭酸水素アンモニウムの緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の化合物を含む分画をプールして凍結乾燥し、N-((3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸を含む453mgの物質を与えた。
【０１６４】
DMSO-d6で実施された1H-NMRスペクトルは、シチジリル部分ならびにフルオレニル-9-イルメトキシカルボニル部分の存在を示した。材料をフリーザーで保存した。
【０１６５】
この反応を、1gの3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび90mgのO2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸で繰り返した。炭酸水素アンモニウムの50mM水溶液中の、アセトニトリル(acetontrile)中の炭酸水素アンモニウムの5mM水溶液からなる混合液の30〜50%の勾配を用いて、直径2cmのHPLC C4カラムで精製を実施した。所望の化合物を含む分画を収集して凍結乾燥し、288mgの所望の化合物を与えた。1H-NMRスペクトルは、上記の実験で見出された1H-NMRスペクトルに一致した。
【０１６６】
工程2:
N-((3-(ω-アミノ10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(NNC 0129-0000-3227)
【０１６７】
【化７】
【０１６８】
N-((3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(453mg)を、N,N-ジメチルホルムアミド(12ml)に溶解した。ピペリジン(1.25ml)を加えた。透明溶液を室温で20分間撹拌した。エーテル(200ml)を加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で1.5時間放置した。沈殿を濾過によって単離した。それをジクロロメタン(4ml)に溶解した。エチルジイソプロピルアミン(1ml)を加えた。エーテル(250ml)を加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で16時間放置した。沈殿を濾過によって単離し、真空中で乾燥させた。DMSO-d6での1H-NMRスペクトルは9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル基のシグナルを示さなかったが、シチジリル部分に帰属されるシグナルが見出された。物質をフリーザーで保存した。
【０１６９】
工程3:
4-ホルミル安息香酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル
【０１７０】
【化８】
【０１７１】
トリエチルアミン(2.04ml、14.65mmol)および2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU、4.44g、14.65mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(30ml)中の4-ホルミル安息香酸(2.0g、13.3mmol)の溶液に連続して加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。それを酢酸エチル(150ml)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの10%水溶液(100ml)で洗浄した。水相を酢酸エチル(2×30ml)で抽出した。合わせた有機層を塩水(50ml)および水(50ml)の混合液で洗浄した。合わせた有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させて、1.89gの4-ホルミル安息香酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルを与えた。
1H-NMR (CDCl3)。δ 2.95 (s, 4H); 8.04 (d, 2H)、8.32 (d, 2H); 10.15 (s, 1H)。
【０１７２】
工程4:
N-((3-(ω-アミノ10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(42mg、0.004mmol)を、ジクロロメタン(2ml)に溶解した。エチルジイソプロピルアミン(0.002ml、0.012mmol)を溶液に加えた。ジクロロメタン(0.5ml)中の4-ホルミル安息香酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルの溶液(19.32mg、0.078mmol)を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。溶媒を25℃の浴温で真空中で除去した。残渣を炭酸水素アンモニウムの25mM水溶液(15ml)に懸濁した。非可溶性物質を濾過によって除去した。それを5つの部分に分けた。その各々を、25mM炭酸水素アンモニウムの緩衝液を用いて、7ml/分の流動による直径26mmおよび長さ10cmのカラム上のG25を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の物質を含む全ての分画を合わせ、凍結乾燥した。DMSO-d6での1H-NMRスペクトルは、アルデヒド部分およびシチジリル部分の両方の存在を示した。得られた物質をフリーザーで保存した。
【０１７３】
O-グリカンでのFVIIIへのアブシキシマブのコンジュゲーション(NNC 0129-0000-3279)
【０１７４】
【化９】
【０１７５】
工程1:
アブシキシマブ(Abxicimab)の1つのN末端へのN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸のコンジュゲーション
【０１７６】
【化１０】
【０１７７】
市販のアブシキシマブ(ProReo、市販緩衝液の2mg/ml溶液中に、10mg、215nmol)の溶液を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(5ml)を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10℃で10分間実行した。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(10ml)を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10℃で10分間実行した。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(10ml)を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10℃で10分間実行した。0.65mlの残りの溶液をプラスチック反応器に入れた。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(3.85ml)を加えた。pH7.0に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(1.5ml)中のN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(14mg、1290nmol)の溶液を加えた。反応混合液を20℃で3分間、300rpmで静かに振盪した。新たに調製されたナトリウムシアノボロハイドライドの1.0M水溶液(0.025ml)を加えた。反応混合液を20℃において300rpmで静かに振盪した。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部(0.025ml)を加えた。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド(cyanoborohydrice)溶液の別の一部(0.025ml)を加えた。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部を加えた。溶液を20℃で16時間、300rpmで静かに振盪した。反応混合液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、18℃で10分間の4000rpmの超遠心にかけた。0.360 mlの残りの溶液を濾過し、1ml/分の流動の16mm×60cmの床サイズを有するSuperdex 200ゲルでの、pH8.0に調整した25mMトリス、150mM NaClの緩衝液を溶離液として用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画を合わせて2つのバッチにした。それらのバッチの各々を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを10℃で10分間の4000rpmの超遠心にかけて、それぞれ2.67mgおよび3.27 mgを与えた。定量化のために、10.94のモル吸光度をNanodrop(登録商標)分光光度計で用いた。SDS-PAGEによる生成物の分析は、アブシキシマブ(Abxicimab)の1つのN末端とのN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸のコンジュゲートの予想と一致した。
【０１７８】
工程2:
FVIIIのO-グリカンへのアブシキシマブのコンジュゲーション
pH7.35に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液(2.5ml)を、pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液中の、重鎖のC末端にSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失FVIIIの溶液(5.7mg/ml、1mg、5.6nmol)に加えた。pH8.0に調整した25mMトリス、150mM NaClからなる緩衝液(0.323ml)中の、アブシキシマブ(Abxicimab)の1つのN末端とのN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸のコンジュゲートの溶液(2.3mg、39.5nmol)を加えた。溶液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10℃で20分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH7.35に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液(2ml)を加えた。溶液を10℃で30分間の4000rpmの超遠心にかけ、1.4mlの容量の溶液が残された。A.ウリファシエンス(A. Urifaciens)のシアリダーゼの溶液(0.4mg/ml、242U/mg、0.0066ml)およびST3Gal-Iの溶液(2.5mg/ml、0.042ml)をその後加えた。反応混合液を32℃で15分間静かに振盪した。その後、反応混合液を32℃で20.5時間静置させた。反応混合液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10℃で15分間の4000rpmの超遠心にかけた。0.300mlの残りの溶液は、pH7に調整した10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01%ツイーン80、0.3M NaCl、8.8mMショ糖からなる緩衝液を溶離液として用い、0.5ml/分の流動の、10mm×300mmの床サイズのSuperose 6材料を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(2.5ml)を加えた。溶液を、10℃で15分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(1.5ml)を加えた。溶液を、10℃で15分間の4000rpmの超遠心にかけた。0.220mlの残りの溶液をプラスチック反応器に入れた。pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(0.173ml)中の市販のCMP NeuNAc(1.73mg、2800nmol)の溶液を加えた。反応混合液を32℃で1時間、300rpmで静かに振盪した。それを、pH7に調整した10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01%ツイーン80、0.3M NaCl、8.8mMショ糖からなる緩衝液を溶離液として用い、0.5ml/分の流動の、10mm×300mmの床サイズのSuperose 6材料を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。プールを10℃で5分間の4000rpmの超遠心にかけ、O-グリカンでのFVIIIとのアブシキシマブのコンジュゲーション生成物の0.0358mgの0.275mlの溶液を与えた。定量化のために、13.15のモル吸光度をNanodrop(登録商標)分光光度計で用いた。SDS-PAGE分析は、O-グリカンでのFVIIIとのアブシキシマブのコンジュゲーション生成物のSDS-PAGEの予想に一致した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え因子VIII(FVIII)分子に関する。特に、本発明は、内因性FVIIIと比較して低減されたフォンウィレブランド因子(vWF)結合を有するFVIII分子に関する。本発明は、そのような分子の使用、ならびにそのような分子を得るための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Aとは、凝血因子VIII(FVIII)活性の欠損または機能不全により引き起こされる、遺伝性の出血障害である。その臨床症状は、一次止血に関するものではなく(血栓の形成は正常に行われる)、二次的なトロンビン形成が行われないために、血栓が不安定なことである。血友病Aは、血液から単離するか、または組換えを介して生成させる凝血因子FVIIIの静脈内注射により治療する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】EP0319315
【特許文献２】WO09156137
【特許文献３】WO03031464
【特許文献４】米国特許第5,985,265号
【特許文献５】WO99/55377
【特許文献６】米国特許第5,932,462号
【特許文献７】米国特許第5,629,384号
【特許文献８】WO03062290
【特許文献９】WO0331464
【特許文献１０】WO2007/056191
【特許文献１１】WO2006102652
【特許文献１２】US2006/0115876 A1
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Grahamら、J. Gen. Virol. 36巻:59〜72頁、1977年
【非特許文献２】WaechterおよびBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79巻:1106〜1110頁、1982年
【非特許文献３】UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77巻:4216〜4220頁、1980年
【非特許文献４】Cell、33巻: 405頁、1983年
【非特許文献５】Somatic Cell and Molecular Genetics 12巻:555頁、1986年
【非特許文献６】MacEwan SR、Chilkoti A. Biopolymers. 2010年;94巻:60頁
【非特許文献７】Schellenberger VらNat Biotechnol. 2009年;27巻:1186頁
【非特許文献８】Schlapschy MらProtein Eng Des Sel. 2007年;20巻:273頁
【非特許文献９】Dennis MSらJ Biol Chem. 2002年、277巻:35035頁
【非特許文献１０】Kjalke Eur J Biochem、234、773頁
【非特許文献１１】Hansen, J Thromb Haemost 2009; 7, Supplement 2: abstract no. PP-WE-572
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在の治療に関する推奨は、従来のオンデマンド治療から、予防へと推移しつつある。フォンウィレブランド因子に結合した内因性FVIIIの循環における半減期は、12〜14時間であり、したがって、患者が実質的に無症状の生存を享受するには、毎週複数回にわたり予防治療を実施するべきである。多くの患者、とりわけ、小児および若年者にとって、静脈内投与は、大きな不都合および/または痛みを随伴する。したがって、好ましくは構造が均質で、好ましくは安全で、かつ1週当たりの因子VIII投与の回数を低減するために好ましくは相当に長い循環半減期を有する、因子VIII活性を有する新規因子VIII生成物の必要が当技術分野にある。そのような分子を得、生成するための比較的単純な方法の必要が当技術分野にさらにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。本発明は、そのような分子の作製方法、ならびにそのような分子の使用にさらに関する。そのような分子は、改変された循環半減期を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】FVIII-KOマウス(n=6〜10)におけるFeCl3によって誘導された損傷のモデルでのNNC129-0000-9105およびAdvate(登録商標)の用量反応相関を示す図。*ビヒクル処理と有意に異なる。*P<0.05。
【図２】FVIII-KOマウス(n=5〜6)の尾部出血モデルでのNNC0129-000-9105およびAdvate(登録商標)(20および280IU/kg)の影響を示す図。*ビヒクル処理と有意に異なる。*P<0.05。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義:
フォンウィレブランド因子(vWF): vWFは血漿中に存在する大きな単量体/多量体の糖タンパク質であり、内皮(Weibel-Palade体)、巨核球(血小板のα-顆粒)および内皮下結合組織で構成的に生成される。その一次機能は他のタンパク質、特に因子VIIIへの結合であり、それは創傷部位への血小板粘着で重要である。
【０００９】
因子VIIIはvWFに結合するが、循環内では不活性である。vWFに結合していないとき、因子VIIIは速やかに分解するか取り除かれる。したがってFVIIIでのvWF結合能力の低下または撤廃は、長期循環半減期を有する因子FVIII変異体を得る上で非常に望ましくない手法であるとこれまでみなされてきた。
【００１０】
用語「低減されたvWF結合能力」は、本明細書で因子VIII変異体を包含するものとし、そこでvWF結合能力は少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは約100%低減される。vWFへのFVIII結合は、ELISAのようなアッセイによって、または表面プラズモン共鳴を用いて固定化vWFへの直接結合として測定することができる。EP0319315で開示されるように、vWFへの結合を担う因子VIIIの領域は、残基1670〜1684にわたる領域である。この領域を含む因子VIIIの点突然および/または欠失突然変異体は、vWFに結合する能力を改変すると想定される。本発明による特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異を含む変異体が含まれる:Y1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680CおよびE1682T。
【００１１】
WO09156137は、PEGなどの側鎖基とコンジュゲートしていない、低減されたvWF結合を有する融合タンパク質を開示する。その中のタンパク質は、様々な比較検定法との関連で明らかに有用である。
【００１２】
因子VIII分子: FVIII/因子VIIIは、主に肝細胞によって生成される、大きな複合糖タンパク質である。FVIIIは、シグナルペプチドを含む2351アミノ酸からなり、相同性によって定義されるようにいくつかの異なるドメインを含む。3つのA-ドメイン、特異なB-ドメインおよび2つのC-ドメインがある。ドメインの順序は、NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHのように記載することができる。FVIIIは、B-A3境界で分離される2つの鎖として血漿中を循環する。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって連結される。A1-A2-B鎖は重鎖(HC)と呼ばれ、A3-C1-C2は軽鎖(LC)と呼ばれる。
【００１３】
内因性因子VIII分子は、様々なサイズのBドメインを有する分子のプールとしてin vivoで循環する。in vivoでおそらく起こることは、様々なサイズのBドメインを有する分子のプールをもたらすBドメインの段階的な酵素除去である。Bドメインの最後の部分が除去される740位での切断は、トロンビン活性化に関連して起こると一般に思われている。しかし、例えば740位の切断部位が損なわれている因子VIII変異体が活性である可能性を、除外することができない。
【００１４】
本明細書で用いる「因子VIII」または「FVIII」は、内在性の凝固経路のメンバーであって血液凝固に必須であるヒト血漿糖タンパク質を指す。「天然のFVIII」は、配列番号1(アミノ酸1〜2332)に示す完全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1のアミノ酸741〜1648にわたっている。
【００１５】
配列番号1:野生型のヒト凝血因子VII
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【００１６】
配列番号2:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIFDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【００１７】
配列番号3:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDICDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【００１８】
本発明による因子VIII分子は、配列番号2の残基1670〜1684のvWF結合領域内には1または複数の変化も当然存在するが、残りのドメインは、配列番号1のアミノ酸番号1〜740および1649〜2332に示される配列に緊密に対応する、Bドメイン末端欠失型因子FVIII分子でありうる。しかし、本発明によるBドメイン切断分子は、配列番号1に示される配列と若干異なりうるが、これは、vWF結合能を低減する目的で、突然変異を導入するという事実のために、残りのドメイン(すなわち、3つのAドメインおよび2つのCドメイン)が、配列番号1に示されるアミノ酸配列(アミノ酸1〜740および1649〜2332)とは若干、例えば、約1%、2%、3%、4%または5%異なりうることを意味する。さらに、例えば、LRP、各種の受容体、他の凝血因子、細胞表面など、他の各種の構成要素、グリコシル化部位の導入および/または除去などにより、因子VIIIの結合能を修飾するために、分子内の他の位置にアミノ酸修飾(置換、欠失など)を導入することが妥当である。
【００１９】
本発明による因子VIII分子は、因子VIII活性を有するが、これは、凝血カスケード内で、FVIIIと機能的に類似するかまたは同等の形で機能し、活性化血小板においてFIXaと相互作用することによりFXaの形成を誘導し、血栓の形成を支援する能力を意味する。活性化は、in vitroにおいて、例えば、血栓解析、内因性トロンビンポテンシャル解析など、当技術分野でよく知られる技法により評価することができる。本発明による因子VIII分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および100%であるか、または100%をさらに超えるFVIII活性を有する。
【００２０】
融合タンパク質:融合タンパク質/キメラタンパク質とは、元は個別のタンパク質をコードする、2つ以上の遺伝子を接合することにより創出されるタンパク質である。この融合遺伝子が翻訳されると、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を伴う単一のポリペプチドが結果としてもたらされる。本発明の融合タンパク質は、FVIIIポリペプチドおよび少なくとも1つの他のポリペプチドを含む。融合タンパク質は、少なくとも1つのリンカーを任意選択で含むことができる。したがって、FVIIIポリペプチドは、他のポリペプチド部分に直接的に連結されなくてもよい。他のポリペプチド部分はFVIIIポリペプチド鎖のN末端またはC末端に連結することができるか、FVIIIポリペプチド鎖の内部位置に挿入することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、Bドメイン欠失FVIIIのBドメインリンカーに挿入される。別の好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、FVIII軽鎖のN末端でvWF結合a3領域を置換する。別の好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、FVIII軽鎖のC末端に連結される。
【００２２】
他のポリペプチドは、例えばヒト血清アルブミン、抗体結合ポリペプチド、Fc受容体、ヒトFcyRI(CD64)、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、抗体(免疫グロブリン)のFc部分、転移(transferring)、アルブミン結合ポリペプチドまたはトランスフェリン結合ポリペプチドに由来する1つまたは複数のアミノ酸配列を含むことができる。
【００２３】
Bドメイン:因子VIIIのBドメインは、配列番号1のアミノ酸741〜1648にわたっている。Bドメインはいくつかの異なる部位で切断され、循環血漿中のFVIII分子の大きな異質性をもたらす。かなりグリコシル化されたBドメインの正確な機能は、未知である。知られているのは、凝固カスケードでのFVIII活性のためにドメインが不必要であるということである。機能のこの見かけの欠如は、Bドメイン欠失/末端欠失型FVIIIが、完全長天然FVIIIで見られるものと同一のin vivo特性を有するらしいという事実によって支えられる。しかし、Bドメインが、少なくとも無血清条件の下で細胞膜との結合を低減することができることの兆候がある。
【００２４】
Bドメイン末端欠失/欠失型因子VIII分子:
内因性の全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌される前に、前駆体は、重鎖および軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失FVIIIは、2つの異なる戦略により生成させることができる。Bドメインのない重鎖および軽鎖を2つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成する(2本鎖戦略)か、またはBドメイン欠失FVIIIを、単鎖前駆体ポリペプチド鎖として合成し(単鎖戦略)、これを、全長FVIII前駆体と同じ形で重鎖および軽鎖へと切断する。
【００２５】
Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドでは、重鎖部分と軽鎖部分とが通常、リンカーにより隔てられている。Bドメイン欠失FVIII内に免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するために、リンカー配列は、FVIIIのBドメインに由来することが好ましい。少なくとも、リンカーは、Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖および軽鎖へと切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。全長FVIIIのBドメインでは、アミノ酸1644〜1648が、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失FVIIIが活性化するとリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖内に配置される。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビンの活性化による、残りのFVIII分子からのリンカーの除去に影響を与える可能性は低い。Bドメインの欠失は、FVIIIを生成させるのに有利である。それにも関わらず、生成能を低下させることなく、Bドメインの一部をリンカー内に組み入れることもできる。生成能に対するBドメインの負の影響が、Bドメインの特定のサイズまたは配列に帰せられたことはない。
【００２６】
末端欠失型Bドメインは、複数のO-グリコシル化部位を含有しうる。しかし、好ましい実施形態によれば、該分子が、末端欠失型Bドメイン内に含むO結合オリゴ糖は、1つ、代替的に、2つ、3つ、または4つだけである。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、末端欠失型Bドメインが含む潜在的なO-グリコシル化部位は1つだけであり、親水性ポリマーが、共有結合によりこのO-グリコシル化部位にコンジュゲートされる。
【００２８】
本発明によるBドメイン末端欠失型分子のO-連結オリゴ糖は、組換え手段によりおよび/またはBドメインの末端欠失による「隠れた」O-グリコシル化部位の曝露のいずれかによって人工的に作製されたO-グリコシル化部位に結合することができる。いずれにしても、Bドメイン末端欠失型因子VIIIアミノ酸配列を設計し、その後、末端欠失型BドメインでO-グリコシル化部位の可能性を予測するコンピュータ分析にアミノ酸配列をかけることによって、そのような分子を作製することができる。そのようなグリコシル化部位を有する比較的高い可能性を有する分子を適する宿主細胞で合成し、続いてグリコシル化パターンを分析し、その後末端欠失型BドメインでO-連結グリコシル化を有する分子を選択することができる。
【００２９】
因子VIII分子は、酵素または化学的コンジュゲーション法のいずれか、例えばシアリン酸誘導体と組み合わせたシアリルトランスフェラーゼまたはグリカン酸化を用いて、選定された試薬による以降の改変のためのアルデヒドを形成するコンジュゲーション点の役目を果たすこともできる、いくつかのN連結オリゴ糖も含む。
【００３０】
組換え因子VIIIタンパク質の生成に適する宿主細胞は、その分子がグリコシル化されることを保証するために、好ましくは哺乳動物起源である。本発明の実施では、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくは、それらに限定されないが、CHO(例えば、ATCC CCL 61)、COS-1(例えば、ATCC CRL 1650)、ベイビーハムスター腎臓(BHK)、およびHEK293(例えば、ATCC CCRL 1573、Grahamら、J. Gen. Virol.36巻:59〜72頁、1977年)細胞系を含む確立された哺乳動物細胞系である。好ましいBHK細胞系は、tk-ts13 BHK細胞系(WaechterおよびBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79巻:1106〜1110頁、1982年)であり、以降BHK 570細胞と称す。BHK 570細胞系は、ATCC受託番号CRL 10314の下で、American Type Culture Collection、12301 Parklawn Dr.、Rockville、MD 20852から入手可能である。tk-ts13 BHK細胞系は、受託番号CRL 1632の下でもATCCから入手可能である。好ましいCHO細胞は、受託番号CCI61の下でATCCから入手可能なCHO K1細胞系ならびに細胞系CHO-DXB11およびCHO-DG44である。
【００３１】
他の適する細胞系には、それらに限定されないが、ラットHep I(ラット肝癌;ATCC CRL 1600)、ラットHep II(ラット肝癌;ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、ヒト肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1); DUKX細胞(CHO細胞系)(UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77巻:4216〜4220頁、1980年)(DXB11細胞とも呼ばれるDUKX細胞)、およびDG44(CHO細胞系)(Cell、33巻: 405頁、1983年およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12巻:555頁、1986年)が含まれる。また、3T3細胞、ナマルバ細胞、骨髄腫および他の細胞との骨髄腫の融合体も有用である。一部の実施形態では、細胞は、例えば、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する、それらが由来する細胞型と質的または量的に異なるスペクトルの酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび/もしくはグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素、またはプロペプチドなどのプロセシング酵素)を発現する細胞などの、突然変異細胞または組換え細胞であってよい。DUKX細胞(CHO細胞系)が特に好ましい。
【００３２】
現在好ましい細胞は、HEK293、COS、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベイビーハムスター腎臓(BHK)および骨髄腫細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
【００３３】
したがって、Bドメインを末端欠失させることによって因子VIIIBドメインの「隠れた」O-グリコシル化部位の活性化が可能のようである。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、この現象は変更される末端欠失型Bドメインでの分子の三次構造に帰することができるかもしれない。したがって、「隠れた」O-グリコシル化部位は末端欠失型Bドメインでのグリコシル化を「受けやすくする」。この手法の1つの利点は、例えばアレルゲン性に関して有利な安全性プロファイルを有する組換え分子の提供である。別の利点は、組換えタンパク質に人工O-グリコシル化部位を組み入れることが困難であると前に判明しているので、Bドメインでのグリコシル化部位の生来の豊富さのために、この手法がBドメインにO-連結オリゴ糖を有するBドメイン末端欠失型変異体を得るより単純な手法となることであろう。
【００３４】
wt FVIII分子のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明による分子中の末端欠失型Bドメインの長さは、約10から約800アミノ酸、例えば約10から約700アミノ酸、例えば約12〜500アミノ酸、12〜400アミノ酸、12〜300アミノ酸、12〜200アミノ酸、15〜100アミノ酸、15〜75アミノ酸、15〜50アミノ酸、15〜45アミノ酸、20〜45アミノ酸、20〜40アミノ酸または20〜30アミノ酸の範囲であってよい。末端欠失型Bドメインは、重鎖および/もしくは軽鎖の断片および/またはwt FVIII分子で見出されない人工的に導入された配列を含むことができる。用語「Bドメイン末端欠失」および「Bドメイン欠失」は、本明細書で互換的に用いることができる。
【００３５】
循環における半減期の改変:本発明による分子は、野生型の因子VIII分子と比較して、循環における半減期が改変され、循環における半減期が延長されることが好ましい。循環における半減期は、少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも125%、より好ましくは少なくとも150%、より好ましくは少なくとも175%、より好ましくは少なくとも200%、および最も好ましくは少なくとも250%または300%延長されることが好ましい。このような分子は、循環における半減期が、少なくとも400%、500%、600%、またはさらに700%延長されることがなおより好ましい。
【００３６】
側鎖/側鎖基:本発明によるFVIII変異体は、翻訳後修飾を通して、または融合タンパク質の形で側鎖基と共有結合でコンジュゲートされてもよい。したがって、以下のFVIIIの側鎖基改変の1つまたは複数を実行することができる:アルキル化、アシル化、エステル形成、ジスルフィドまたはアミド形成、その他。これには、ペグ化FVIII、システイン-ペグ化FVIIIおよびその変異体が含まれる。本発明によるFVIII変異体は、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、親水性ポリマー(ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ホスホリルコリンベースのポリマー、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸)、ポリペプチド(抗体、抗体の抗原結合断片、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド(MacEwan SR、Chilkoti A. Biopolymers. 2010年;94巻:60頁)、XTENポリマー(Schellenberger VらNat Biotechnol. 2009年;27巻:1186頁)、PAS化またはHAP化(Schlapschy MらProtein Eng Des Sel.2007年;20巻:273頁)、アルブミン結合ペプチド(Dennis MSらJ Biol Chem. 2002年、277巻:35035頁))などとコンジュゲートされてもよい。
【００３７】
本発明によるFVIIIは、任意選択でリンカーを通して1つまたは複数の疎水性の側鎖基によってコンジュゲートされてもよい。-(CH2)12-部分を有する化合物は、本発明との関連で可能なアルブミン結合剤である。疎水性の側鎖基は、そのような側鎖基がアルブミンと非共有の複合体を形成することが可能であり、それによって、改変FVIII変異体およびアルブミンの複合体が徐々にだけ崩壊してFVIII変異体を放出するという事実のために血流中での改変FVIII変異体の循環を促進するという事実のために、「アルブミン結合剤」と呼ばれることがときにある。FVIIIは、WO03031464で開示される方法に基本的に従って、化学的方法ならびに酵素的「グリコ改変」法を用いて改変することができる。酵素法は、いかなる有機溶媒の使用も避ける利点、ならびに一般に非常に部位特異的である利点を有する。
【００３８】
用語「ペグ化FVIII」は、PEG分子とコンジュゲートしているFVIIIを意味する。PEG分子は、任意のアミノ酸残基または炭化水素部分を含むFVIIIの任意の部分へ結合させることができることを理解するべきである。用語「システイン-ペグ化FVIII」は、FVIIIに導入されたシステインのスルフヒドリル基とコンジュゲートしているPEG分子を有するFVIIIを意味する。
【００３９】
PEGは、デキストランなどの多糖と比較して架橋が可能な反応性基をわずかしか有しないので、適するポリマー分子である。特に、その結合化学が比較的単純である(ポリペプチド上の給合基とコンジュゲートするのに1つの反応性基だけが利用可能)ので、単官能PEG、例えばメトキシポリエチレングリコール(mPEG)に関心が高い。したがって、架橋のリスクが除去され、生じるポリペプチドコンジュゲートはより均一であり、ポリペプチドとのポリマー分子の反応は制御がより容易である。
【００４０】
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合を実行するために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は活性型で、すなわち反応性官能基と一緒に提供される。ペグ化は、ポリペプチド上の全ての利用できる給合基(すなわちポリペプチドの表面に曝露させられる給合基)とのコンジュゲーションに向けることができるか、1つまたは複数の特異的な給合基、例えばN末端アミノ基(米国特許第5,985,265号)、N-および/またはO-連結グリカンなどに向けることができる。さらに、コンジュゲーションは1段階で、または段階的に達成することができる(例えばWO99/55377に記載のように)。O-および/またはN-連結グリカンに側鎖基を結合するための酵素的手法は、WO03031464に開示されている。
【００４１】
融合タンパク質:融合タンパク質/キメラタンパク質は、当初別々のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子の連結を通して作製されるタンパク質である。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドを生じる。したがって本発明によるFVIII変異体の側鎖は、FVIIIと融合したポリペプチドの形となることができる。したがって本発明によるFVIII変異体は、FVIIIに長期にわたる半減期を付与することができるペプチド、例えば抗体および「Fc融合誘導体」または「Fc融合タンパク質」と融合させてもよい。
【００４２】
本明細書でFc融合タンパク質は、任意の抗体アイソタイプに由来してよいFcドメインに融合しているFVIIIを包含するものとするが、IgG抗体の比較的長い循環半減期のためにIgG Fcドメインが多くの場合好ましい。特定のエフェクター機能、例えば補体結合および/または特定のFc受容体への結合を調整するために、Fcドメインはさらに改変されてもよい。FcRn受容体に結合する能力を有するFcドメインとのFVIIIの融合は、wt FVIIIタンパク質の半減期と比較して長期にわたる循環半減期の融合タンパク質を一般にもたらす。IgG Fcドメインの234位、235位および237位での突然変異は、FcγRI受容体への結合の減少、ならびにおそらくFcγRIIaおよびFcγRIII受容体への結合の減少も一般にもたらす。これらの突然変異はFcRn受容体への結合を変更せず、それはエンドサイトーシス再利用経路によって長い循環半減期を促進する。好ましくは、本発明による融合タンパク質の改変IgG Fcドメインは、以下の、特定のFc受容体への親和性の低下(L234A、L235EおよびG237A)およびC1q媒介補体結合の減少(A330SおよびP331S)をそれぞれもたらす突然変異の1つまたは複数を含む。
【００４３】
理論によって縛られることなく、正常なvWF結合能力を有する因子VIII分子へ側鎖基を結合させるよりも、低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子へ側鎖基を結合させるためにそれがより効率的に機能する理由は、側鎖基の相対サイズが大きな因子VIII/vWF複合体で比較的小さいということであると想定される。遊離の因子VIIIをクリアランスから保護することにおいて、比較的大きな側鎖基がより効率的に機能すると仮定される。FVIIIの半減期がvWFのそれと関連するとさらに仮定される。vWFに結合する能力の低下したFVIII分子は、通常ならばvWFによって保護されているクリアランスエピトープを曝露させた可能性が最も高い。したがって、側鎖基を結合することによって、この「クリアランス保護」を回復させることができると仮定される。他の場合には、例えば抗体断片などの側鎖基の給合は、例えば比較的長い循環半減期を有するタンパク質、細胞または血小板に分子を結合することによって機能することができる。
【００４４】
親水性ポリマー:本発明による改変基/親水性ポリマーは、好ましくは天然に存在しない。一例において、「天然に存在しない改変基」は、少なくとも1つのポリマー部分が天然に存在しないポリマー改変基である。別の例では、天然に存在しない改変基は、改変炭水化物である。改変基による官能基化の座位は、「改変糖」がポリペプチドに酵素的に加えられることをそれが阻止しないように選択される。「改変糖」は、改変基で官能基化され、グリコシルトランスフェラーゼなどの天然であるか改変された酵素の基質である、任意のグリコシル模倣部分も指す。
【００４５】
ポリペプチドに加えられるポリマー改変基は、そのようなポリペプチドの特性、例えばその生物学的利用能、生物的活性または体内でのその半減期を変更することができる。本発明による例示的なポリマーには、線状または分枝状であってよい水溶性ポリマーが含まれ、1つまたは複数の独立して選択されるポリマー部分、例えばポリ(アルキレングリコール)およびその誘導体を含むことができる。本発明によるポリマー改変基には、水溶性ポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)およびその誘導体(PEG、m-PEG)、ポリ(プロピレングリコール)およびその誘導体(PPG、m-PPG)などが含まれてよい。
【００４６】
用語「水溶性」は、水へのなんらかの検出可能な程度の溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出および/または定量化する方法は、当技術分野で周知である。本発明による例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカライド、ポリ(エーテル)、ポリ(アミン)、ポリ(カルボン酸)などが含まれる。ペプチドは混合した配列を有することができ、例えばポリ(リジン)など、単一のアミノ酸で構成されてもよい。例示的な多糖は、ポリ(シアリン酸)である。例示的なポリ(エーテル)は、ポリ(エチレングリコール)、例えばm-PEGである。ポリ(エチレンイミン)は例示的なポリアミンであり、ポリ(アクリル)酸は代表的なポリ(カルボン酸)である。
【００４７】
本発明による水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ(エチレングリコール)(すなわちPEG)であってよい。本発明との関連で用語PEGには、アルコキシPEG、二官能性PEG、マルチアームPEG、分岐PEG、分枝状PEG、ペンダントPEG(すなわちポリマー骨格にぶら下がる1つまたは複数の官能基を有するPEGもしくは関連したポリマー)、またはその中の分解可能な結合を有するPEGを含む、その形態のいずれかのポリ(エチレングリコール)が含まれる。
【００４８】
ポリマー骨格は、線状または分枝状であってよい。分枝状ポリマー骨格は、当技術分野で一般に公知である。一般的に、分枝状ポリマーは、中央の枝コア部分および中央の枝コアに連結する複数の線状ポリマー鎖を有する。PEGは、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加によって調製することができる分枝形で一般に用いられる。中央の枝部分は、リジンまたはシステインなどのいくつかのアミノ酸に由来することもできる。一例において、分枝状ポリ(エチレングリコール)はR(-PEG-OH)mのような一般形で表すことができ、式中、Rはグリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、mはアーム数を表す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第5,932,462号に記載のものなどのマルチアームPEG分子を、ポリマー骨格として用いることもできる。
【００４９】
他の多くのポリマーも、本発明に適する。非ペプチド性で水溶性のポリマー骨格が、本発明で特に有用である。適するポリマーの例には、それらに限定されないが、他のポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン(olefmic)アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ([アルファ]-ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,629,384号に記載のもの、ならびにそのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が含まれる。
【００５０】
ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化してよいが、それは一般的に約100Daから約160,000Da、例えば約5,000Daから約100,000Daの範囲である。より具体的には、本発明によるコンジュゲートした各親水性ポリマーのサイズは、約500Daから約80,000Daまで、例えば約1000Daから約80,000Daまで、約2000Daから約70,000Daまで、約5000から約70,000Daまで、約5000から約60,000Daまで、約10,000から約70,000Daまで、約20,000から約60,000Daまで、約30,000から約60,000Daまで、約30,000から約50,000Daまで、または約30,000から約40,000Daまで変化してよい。これらのサイズは、正確な測定値でなく推定値を表すことを理解すべきである。好ましい実施形態によると、本発明による分子は、親水性ポリマー、例えば10,000、40,000または80,000Da+/-約5000、約4000、約3000、約2000または約1000DaのサイズのPEGなどの不均一な集団とコンジュゲートされる。
【００５１】
アルブミン結合剤コンジュゲート/側鎖基
タンパク質のin vivo特性は、アルブミン結合側鎖を用いて向上させることができることが知られている。そのような側鎖またはアルブミン結合剤は、投与の前にタンパク質に結合させることができ、例えば、in vivoでタンパク質を安定させることができるか、タンパク質のin vivo半減期を向上もしくは延長させることができる。
【００５２】
それによって、アルブミン結合剤は血流による誘導体の循環を促進することができる。アルブミン結合剤は、ペプチド誘導体およびアルブミンの複合体が徐々にだけ崩壊して活性医薬成分を放出するという事実のために、それが結合しているタンパク質の作用時間を延長させるか引き延ばす作用を有することができる。したがって、好ましい置換基または側鎖は、全体としてアルブミン結合部分と呼ぶことができる。
【００５３】
アルブミン結合剤(アルブミン結合部分)は、アルブミン結合に特に関連し、それによって血流中の循環の延長に関連する部分を含むことができ、その部分はしたがって延長部分と呼ぶことができる。延長部分は、ペプチドへのその給合点と比較して好ましくはアルブミン結合部分の反対側の末端に、またはその近くにある。
【００５４】
好ましい実施形態では、アルブミン結合剤は、アルブミンと非共有結合性の複合体を形成することが可能である側鎖であるか、それを含む。アルブミン結合剤は、アルブミンに非共有結合的におよび/または可逆的に結合することができる。アルブミン結合剤は、アルブミンに特異的に結合することができる。下記の方法から明らかであるように、アルブミン結合剤はシクロデキストリンに結合することができる。アルブミン結合剤は、シクロデキストリンに非共有結合的におよび/または可逆的に結合することができる。アルブミン結合剤は、シクロデキストリンに特異的に結合することができる。
【００５５】
本明細書に記載されるアルブミン結合剤は、一般に疎水性の基である。アルブミン結合部分の他の部分、すなわち延長部分およびペプチドへの給合点の中間の部分は、リンカー部分、リンカー、スペーサーなどと呼ぶことができる。しかし、そのようなリンカーの存在は任意選択であり、したがってアルブミン結合部分は延長部分と同一であってよい。
【００５６】
特定の実施形態では、アルブミン結合部分および/または延長部分は親油性であり、および/または生理的pH(7.4)で負に荷電している。
【００５７】
アルブミン結合部分および/または延長部分は、アルキル化、アシル化もしくはアミド形成などのコンジュゲーション化学によってペプチドのアミノ基と共有結合することができるか、またはエステル化、アルキル化、オキシム化などによってヒドロキシル基と共有結合することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、アルブミン結合部分および/または延長部分の活性エステルは、アミド結合の形成の下で、シアル酸残基またはシアル酸誘導体のアミノ基と共有結合する。
【００５９】
本目的のために、用語「アルブミン結合部分」、「延長部分」および「リンカー」には、これらの分子の未反応形ならびに反応形が含まれる。一方または他方の形が意味されるかは、その用語が用いられる文脈から明らかである。
【００６０】
アルブミン結合部分は、脂肪酸または脂肪二酸、またはその誘導体もしくはそのいずれかであってよいか、それを含むことができる。
【００６１】
用語「脂肪酸」は、4から28個の炭素原子、例えば16個の炭素原子を有する脂肪族モノカルボン酸を指す。それは好ましくは非分枝状であり、および/または偶数であり、それは飽和であるか、不飽和であってよい。
【００６２】
用語「脂肪二酸」は、上で定義される脂肪酸であるが、オメガ位置にさらなるカルボン酸基を有するものを指す。したがって、脂肪二酸はジカルボン酸である。
【００６３】
命名法は当技術分野で通常のものであり、例えば-COOHならびにHOOC-はカルボキシを指し、-C6H4-はフェニレンを、-CO-ならびに-OC-はカルボニル(O=C<)を、C6H5-O-はフェノキシを指す。
【００６４】
好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、2〜80個のC原子、好ましくは5〜70個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、4〜20個のヘテロ原子、好ましくは2〜40個のヘテロ原子、より好ましくは3〜30個のヘテロ原子を有する。ヘテロ原子の特に好ましい例は、N原子およびO原子である。H原子はヘテロ原子ではない。
【００６５】
別の実施形態では、リンカーが、少なくとも1つのOEG分子、および/もしくは少なくとも1つのグルタミン酸残基、またはそうではなくて対応するラジカル(OEGとは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、すなわちこの分子のラジカル:-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-を名指すものである)を含む。
【００６６】
好ましい一実施形態では、リンカー部分が、アミド結合によりシアル酸残基に連結される、ジカルボキシル残基を含む。好ましい例では、ジカルボキシル残基が、2〜30個のC原子、好ましくは4〜20個のC原子、より好ましくは4〜10個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、ジカルボキシル残基が、0〜10個のヘテロ原子、好ましくは0〜5個のヘテロ原子を有する。
【００６７】
別の好ましい例では、リンカー部分が、その遠位カルボキシル基を介して、アミド結合によりシアル酸残基に連結された、アミノ基および遠位カルボキシル基の両方を含有する基を含む。好ましい一実施形態では、この基が、OEG基である。
【００６８】
アミノ酸であるグルタミン酸(Glu)は、2つのカルボン酸基を含む。そのガンマ-カルボキシ基は、シアル酸残基もしくはシアル酸誘導体のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は、OEG分子のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とのアミド結合を形成するのに用いられることが好ましい。Gluのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合はOEG分子のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGluのガンマ-カルボキシ基とのアミド結合を形成する。このようなGluの組入れを、場合によって簡単に、「ガンマ-Glu」と称する。
【００６９】
O連結オリゴ糖: N-グリカンおよびO-グリカンの両方は、そのタンパク質を生成する細胞によってタンパク質に結合される。発生期のタンパク質がリボソームから小胞体に転位されるに従い、細胞性N-グリコシル化機構はアミノ酸鎖のN-グリコシル化シグナル(N-X-S/Tモチーフ)を認識してグリコシル化する(Kielyら1976年;Glabeら1980年)。
【００７０】
同様に、O-グリカンはアミノ酸鎖の特定のO-グリコシル化部位に結合されるが、O-グリコシル化を誘発するモチーフはN-グリコシル化シグナルより非常に不均一であり、アミノ酸配列のO-グリコシル化部位を予測する我々の能力はなお不十分である(Juleniusら2004年)。したがって、人工O-グリコシル化部位の構築には、多少の不確実性が付随する。
【００７１】
したがって、末端欠失型因子VIIIBドメインのO-連結オリゴ糖は、天然に存在するO-連結グリコシル化配列または組換え技術によって人工的に構築されたO-連結グリコシル化配列と共有結合させることができる。
【００７２】
本発明の好適な実施例によると、O-連結オリゴ糖は、野生型因子VIII分子のグリコシル化に曝露されていないが、Bドメインの末端欠失の結果としてO-グリコシル化にアクセス可能になっている天然に存在するO-連結グリコシル化配列に連結される。その例は、Bドメインが配列番号1中のアミノ酸742〜763に対応する、Bドメイン末端欠失型因子VIII変異体である。Bドメインがいくぶん異なる場所で末端欠失型されるとしても、すなわち末端欠失型Bドメインが742〜763リンカーと比較していくぶん短い(例えば1、2、3、4または5アミノ酸短い)か長い(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸)場合でも、この末端欠失型変異体中の「隠れた」O-グリコシル化部位がグリコシル化されることはありそうである。人工O-グリコシル化部位の生成ではなくBドメインの末端欠失によって「隠れた」O-グリコシル化部位を活性化させることによるこの手法は、有利な安全性プロファイル(すなわち低アレルゲン性など)を有する分子を作製する利点を有する。因子VIIIBドメインの他のO-グリコシル化部位は、異なる方法で分子を末端欠失させることによって同様に活性になることができる。
【００７３】
シアリルトランスフェラーゼ:シアリルトランスフェラーゼは、発生期のオリゴ糖にシアリン酸を移す酵素である。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖基質に特異的である。シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸付加糖脂質(ガングリオシド)の末端部分に、または糖タンパク質のN-もしくはO-連結糖鎖にシアリン酸を加える。それらが作用する受容体構造に基づいて、およびそれらが形成する糖結合の種類に基づいて識別することができる約20個の異なるシアリルトランスフェラーゼがある。本発明による好ましいシアリルトランスフェラーゼは、ST3Gal-I(O-グリカン特異的)およびST3Gal-III(N-グリカン特異的)である。したがって、例えば特異的シアリルトランスフェラーゼの選択および/または特定のグリコシル化パターンを有する因子VIII分子の操作によって、本発明によるコンジュゲート因子VIII分子の構造を操作することができる。
【００７４】
O-連結オリゴ糖のグリコ-ペグ化: O-グリカンの生合成は、生合成の比較的初期にシアル酸残基を加えることによって改変すること、および終了することができる。特定のシアリルトランスフェラーゼ酵素は、GalNAcα-Ser/Thrに、またはCore 1 GalT作用の後の早期のO-グリカンコアサブタイプに作用することが可能である。用語T抗原は、Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖の存在と関連している。これらの構造の生成は同じ基質に対してのグリコシルトランスフェラーゼ間の競合を含み、したがってゴルジ装置の中のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルおよび細胞内分布が、O-グリカンの生合成および多様化での構造的結果を決定する。Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖だけが、グリコペグ化のために適合する。
【００７５】
しかし、この構造の利用できる量は、シアリダーゼまたはCore1 GalTまたはその組合せによるタンパク質の処理を通して、大いに増強することができる。グリコペグ化処理の結果、標的タンパク質のGalβ-3GalNAcα-Ser/Thr二糖へのα3結合を通して、シアリン酸PEGが天然の構造に加えられる。
【００７６】
他の親水性ポリマーを、O-連結オリゴ糖に結合することもできる。O-グリカンを通してFVIIIへ他の親水性ポリマーを酵素的にコンジュゲートするための基本的な要件は、WO03031464に開示されるように、遊離アミノ基を通してグリシルシアリン酸誘導体にそれらを結合させる能力である。当業者に公知である多様な結合化学を通してこれを達成することができる。活性化生体適合性ポリマーの例には、ポリアルキレン酸化物、例えばそれらに限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、2-(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリン(mPC)ポリマー(WO03062290に記載される)、デキストラン、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸もしくは特定のペプチド配列のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン-無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン-無水リンゴ酸コポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物、他のバイオポリマーおよびその任意の同等物が含まれる。
【００７７】
例えばWO0331464に開示されるように、側鎖基はN-連結オリゴ糖に結合することができる。そのような方法は、因子VIII分子へのいくつかの側鎖基の給合をしばしばもたらす。
【００７８】
医薬組成物:本明細書では、医薬組成物が、例えば、RTU(ready-to-use)滅菌水性組成物、または、例えば、水中もしくは水性緩衝液中で再構成しうる乾燥滅菌組成物など、非経口投与に適する、本発明による因子VIII分子を含む組成物を包含することを意味することが好ましい。本発明による組成物は、各種の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤などを含みうる。
【００７９】
このような組成物中のさらなる成分には、保湿剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調整剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、またはタンパク質)、および双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン、およびヒスチジンなどのアミノ酸)が含まれうる。このようなさらなる成分が、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害な影響を与えるべきでないことは当然である。非経口投与は、シリンジ、場合によって、ペン型シリンジによる皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介して実施することができる。代替的に、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、鼻腔内スプレーまたは肺内スプレーの形態でFVIII化合物を投与するための溶液または懸濁液でありうる組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のFVIII化合物を含有する医薬組成物はまた、例えば、注射針なしの注射による、もしくはパッチ、場合によって、イオントフォレーシスパッチによる経皮投与、または経粘膜投与、例えば、口腔内投与にも適合させうる。
【００８０】
本明細書で用いられる「治療」という用語は、それを必要とする任意のヒト対象または他の動物対象に対する医学的治療を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト対象または他の動物対象の健康に有益であることを示す一時的または決定的な診断を施した治療者による身体検診を受けていることが期待される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康状態に従い、個体により異なりうる。したがって、前記治療は、予防的治療の場合もあり、緩和的治療の場合もあり、対症的治療の場合もあり、かつ/または治癒的治療の場合もある。
【００８１】
第1の態様では、したがって本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。一実施形態では、側鎖基は、親水性ポリマー、アルブミン結合剤、抗体またはその断片、トランスフェリンおよびアルブミンからなる群の1つまたは複数から選択される。
【００８２】
好ましい実施形態では、因子VIII分子はBドメイン末端欠失型変異体であり、側鎖基は任意選択で末端欠失型Bドメインと共有結合でコンジュゲートされ、それによって因子VIIIの活性化は共有結合でコンジュゲートされた側鎖基の除去をもたらす。別の実施形態では、Bドメイン末端欠失型分子は、末端欠失型BドメインのO-連結オリゴ糖を通して親水性ポリマーと共有結合でコンジュゲートされ、因子VIIIの活性化は共有結合でコンジュゲートされた親水性ポリマーの除去をもたらす。そのようなO-グリコシル化部位は、好ましくはBドメインの末端欠失によって構築される。
【００８３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による分子は、残基1680の点突然変異を含む。別の好ましい実施形態では、因子分子は、残基1670〜1684にわたる領域で、1つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む。したがって、本発明による分子は、vWF結合ドメインの中に点突然変異および欠失の両方を含むことができる。特に好ましい実施形態によると、側鎖基はPEGである。
【００８４】
本発明の別の態様は、低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子への側鎖基の給合を含む、本発明による分子の作製方法に関する。そのような方法によって得ることができる、または得られる分子も、本発明の一部である。
【００８５】
本発明の第3の態様は、それを必要とする患者に本発明による分子の治療的有効量を投与することを含む、血友病疾患の治療方法に関する。
【００８６】
本発明の第4の態様は、本発明による分子の医薬として使用に関する。
【００８７】
第5の態様は、血友病の治療のための医薬の製造のための、本発明による分子の使用に関する。
【００８８】
最後の態様は、本発明による分子を含む医薬組成物に関する。
【００８９】
(実施例)
(実施例1)
組換えBドメイン末端欠失型O-グリコシル化因子VIIIおよびその変異体、例えば因子VIII(Y1680F)または因子VIII(Y1680C)の生成
細胞系および培養工程
因子VIIIのcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。プラスミドは、Y1680F突然変異を含むBドメイン欠失因子VIII、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1〜740を含む因子VIII重鎖、および全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1649〜2332を含む因子VIII軽鎖をコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸741〜750および1638〜1648による配列を含む21アミノ酸のリンカー(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR:配列番号4)により連結した。配列番号4で定義されるリンカーを含むFVIII変異体は、本明細書で「N8」と呼ぶこともできる。このプラスミドによってコードされる因子VIIIアミノ酸配列は、配列番号1(wt)、配列番号2(Y1680F)、配列番号3(Y1680C)に示す通りである。
【００９０】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に、このプラスミドをトランスフェクトし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ系により選択し、最終的に、動物成分非含有培地中で培養されるクローン懸濁液生成細胞をもたらした。
【００９１】
工程の第1のステップは、作業用の細胞バンクバイアルに由来する細胞バイアルを、化学的に規定された、動物成分非含有増殖培地へと接種することである。まず融解後、細胞を、T型フラスコ内でインキュベートする。融解の1または2日後、細胞をシェーカーフラスコへと移し、細胞密度を0.2〜3.0×106個/mlに維持するために、培養物容量を系列希釈により拡張する。次のステップは、シェーカーフラスコ中の培地を、種培養用バイオリアクターへと移すことである。ここで培養物容量をさらに拡張してから、最終的に生成用バイオリアクターへと移す。化学的に規定された、同じ、動物成分非含有培地を、全ての接種物拡張ステップに用いる。生成用バイオリアクターへと移した後で、培地に、生成物濃度を増大させる成分を補充する。生成用バイオリアクターでは、サイクル時間を3日間とする反復バッチ工程で細胞を培養する。回収時には、培養物容量の80〜90%を、回収タンクへと移す。次いで、初期細胞密度を得るために、残りの培養液を、新鮮な培地で希釈し、次いで、新規の増殖期を開始する。遠心分離および濾過により回収バッチを洗浄し、保持タンクへと移してから、精製工程を開始する。保持タンク内の細胞を含まない回収物に緩衝液を添加し、pHを安定化させる。
【００９２】
生成試行が終了するまでに、細胞バンクの生成を終了させるために、細胞を回収して凍結させる。この細胞バンクを、マイコプラズマ、滅菌性、およびウイルス汚染について検査する。
【００９３】
精製
細胞培養培地から、Bドメイン欠失因子VIII(Y1680F)を単離するために、Capto MMCカラムにおける濃縮ステップ、ELISA(immunoabsorbent)およびクロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、ならびに最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を使用した:11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、0.02%のTween 80、pH=7.5中で平衡化したCapto MMC(GE Healthcare、Sweden)によるカラム(1.6×12cm)へと、流速15ml/分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、1.5MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、2.5MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH=7.5により、流速1ml/分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、因子VIII活性(FVIII:C)について比色アッセイでアッセイした(実施例3参照)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。
【００９４】
因子VIIIに対するモノクローナル抗体を発生させた(Kjalke Eur J Biochem、234、773頁、Hansen, J Thromb Haemost 2009; 7, Supplement 2: abstract no. PP-WE-572)。さらなるエピトープマッピング(結果は示さない)により、この抗体F25は、アミノ酸残基725〜740の重鎖最C末端配列を認識することが判明した。本質的に、製造元により説明される通りに、ゲル1ml当たり2.4mgの密度で、F25抗体を、NHS活性化セファロース4 FF(GE Healthcare, BioSciences AB、Uppsala、Sweden)に連結した。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、pH=7.3で10倍に希釈し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH7.3で平衡化したF25 Sepharoseカラム(1.6×9.5cm)へと、流速0.5ml/分で適用した。UVシグナルが一定となるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、UVシグナルが一定となるまで、再度、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.65MのNaCl、pH7.3で洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、2.5MのNaCl、50%のエチレングリコール、pH=7.3により、流速1ml/分で、因子VIIIを溶出させた。1mlの画分を回収し、因子VIII:Cについてアッセイした(実施例3参照)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約25mlのプール容量を得た。
【００９５】
イオン交換ステップのために、緩衝液A:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3および緩衝液B:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、1MのNaCl、pH=7.3を調製した。85%の緩衝液A/15%の緩衝液Bにより、流速2ml/分で、Macro-Prep 25Q Support(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA)によるカラム(1×10cm)を平衡化した。前出の工程によるプールを、緩衝液Aで10倍に希釈し、流速2ml/分でカラムへと送入した。85%の緩衝液A/15%の緩衝液Bにより、流速2ml/分でカラムを洗浄し、流速2ml/分で120mlの15%緩衝液B〜70%緩衝液Bにわたる直線勾配により、因子VIIIを溶出させた。2mlの画分を回収し、実施例3で説明されているように因子VIII活性(FVIII:C)についてアッセイした(比色アッセイ)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約36mlのプール容量を得た。
【００９６】
前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、150mMのNaCl、pH=7.3で平衡化した調製グレードのSuperdex 200(GE Healthcare, Bio-Ssiences AB、Uppsala、Sweden)カラム(2.6×60cm)へと1ml/分で適用し、溶出させた。3mlの画分を回収し、因子VIII:Cについてアッセイした(実施例3参照)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約57mlのプール容量を得た。因子VIIIを含有するプールを、-80℃で保存した。
【００９７】
FVIII:CおよびELISAの測定により判定される通り、上記の4ステップの精製手順を用いることにより、約15%の全収量が得られた。
【００９８】
(実施例2)
組換えO-グリコシル化因子VIIIのペグ化の手法
以下の手法を用いて、実施例1で得られる組換え因子VIII分子をポリエチレングリコール(PEG)とコンジュゲートさせる。
【００９９】
グリコペグ化反応が効率的であるために、>5mg/mlのFVIII濃度が必要とされる。FVIIIはその濃度で通常可溶性でないので、選択された緩衝液組成のスクリーニングを行った(表1(Table 1)を参照)。これらの検討事項に基づき、pH6.0の50mM MES、50mM CaCl2、150mM NaCl、20%グリセロールを含む緩衝液が適する反応緩衝液であると見出された。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
前記のように精製された組換えFVIIIは、段階溶出を用いるPoros 50 HQカラム、Sartorius Vivaspin(PES)フィルター、10kDaカットオフ、またはAmicon 10kDa MWCO PESフィルターでのイオン交換によって、反応緩衝液中で6〜10mg/mLの濃度まで濃縮した。FVIIIのグリコペグ化は、因子VIII(BDD)(最終約4.7mg/mL)を、シアリダーゼ(A.ウレアファシエンス(A. ureafaciens))(159mU/mL)、CMP-SA-グリセロール-PEG-40kDa(WO2007/056191を参照)(5モル等量)およびMBP- ST3Gal1(540mU)(WO2006102652)と反応緩衝液(50mM MES、50mM CaCl2、150mM NaCl、20%グリセロール、0.5mMアンチパイン、pH6.0)中で混合することによって開始された。反応混合液は、全体の約20〜30%の変換収率まで、32℃でインキュベートされた。
【０１０２】
インキュベーションの後、試料を緩衝液A(25mMトリス、5mM CaCl2、20mM NaCl、20%グリセロール、pH7.5)で希釈し、Source 15Qカラム(1cm id×6cm、4.7mL、1mL/分、280nm)に加えた。結合した材料を緩衝液Aで洗浄し、段階勾配を用いて緩衝液B(25mMトリス、5mM CaCl2、1M NaCl、20%グリセロール、pH7.5)で溶出させた。グリコペグ化因子VIII-(O)-SA-グリセロール-PEG-40kDaを、約25%の緩衝液Bでカラムから溶出させた。
【０１０３】
シアリダーゼ処理の間にN-グリカンに曝露させた遊離のガラクトース部分をブロックするために、因子VIII-SA-グリセロール-PEG-40kDaのプール画分(最終1.0mg/mL)を、CMP-SA(2,000モル等量)およびMBP-SBD-ST3Gal3(WO2006102652)(400mU/mL)と反応緩衝液50mM MES、20mM CaCl2、150mM NaCl、10mM MnCl2、20%グリセロール、pH6.0中で混合し、32℃で11時間インキュベートした。
【０１０４】
生じたキャップ付のグリコペグ化因子VIII-SA-グリセロール-PEG-40kDaを、50mM MES、50mM CaCl2、150mM NaCl、10%グリセロール、pH6.0で平衡させたSuperdex 200カラム(10cm id×300mm;280nm)でのゲル濾過によって、cmp-SAおよびST3GalIIIから分離した;流速0.25mL/分。生成物因子VIII-SA-グリセロール-PEG-40kDaは38分後に溶出する。ピーク分画を収集、等分し、以降の分析にかけた。
【０１０５】
O-グリカン40kDa-グリコPEG-BDD-FVIII Y1680F
水(pH7.3)中のイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、ツイーン80(0.02%)、塩化ナトリウム(500mM)およびグリセロール(1M)からなる緩衝液中のBDD-FVIII Y1680F(1.18mg、0.85mg/ml)を解凍した。
【０１０６】
アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)からのシアリダーゼ(20マイクロリットルの緩衝液に2.4U)、シアリルトランスフェラーゼ(His-ST3Gal-I、2.5mg/ml、6.75U、125マイクロリットル、EC 2.4.99.4、WO2006102652)およびシチジンモノホスフェートN-5'-PEG-グリセロール-ノイラミン酸、CMP-SA-グリセロール-PEG-40kDa(1.9mM、41マイクロリットル緩衝液、78nmol、WO2007/056191を参照)を加えた。最終容量は、1.5mlであった。生じた混合液は、摂氏32度で24時間放置した。混合液を緩衝液A(水(pH7.3)にイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、ツイーン80(0.02%)およびグリセロール(1M))で20mlに希釈した。
【０１０７】
生じた混合液をMonoQ 5/50 GLカラム(GE Healthcare Bio-Sciences、Hillerod、Denmark)に加えた。緩衝液A(10カラム容量)で固定化された物質を洗浄し、その後0〜100%の緩衝液B(水(pH7.3)にイミダゾール(20mM)、塩化カルシウム(10mM)、ツイーン80(0.02%)、塩化ナトリウム(1M)およびグリセロール(1M))(10 CV 100% A、10 CV 0〜20%緩衝液B、10 CV 20%緩衝液B、25 CV 20〜100%緩衝液Bおよび5 CV 100%緩衝液B)の勾配を用いてそれをカラムから溶出させた。
【０１０８】
収集した物質を、シチジンモノホスフェートN-5'アセチルノイラミン酸(53マイクログラム)およびシアリルトランスフェラーゼ(MBP-SBD-ST3Gal-III、EC 2.4.99.6、WO2006102652を参照)と混合した。最終容量および濃度は、それぞれ2.56mlならびに0.46mg/ml(FVIII)、0.132mg/ml(MBP-SBD-ST3Gal-III)および54マイクロモル(シチジンモノホスフェートN-5'アセチルノイラミン酸)であった。
【０１０９】
混合液を摂氏32度で1時間放置し、その時間に混合液を緩衝液Aで20mlに希釈した。生じた混合液をMonoQ 5/50 GLカラム(GE Healthcare Bio-Sciences)に加えた。緩衝液Aで固定化された物質を洗浄し、その後0〜100%(10 CV 100% A、10 CV 0〜20%緩衝液B、10 CV 20%緩衝液B、25 CV 20〜100%緩衝液Bおよび5 CV 100%緩衝液B)の勾配を用いてそれをカラムから溶出させた。単離した分画中のタンパク含有量は、SDS-PAGEゲル(Invitrogen、7%トリス-酢酸塩、NuPAGEトリス-酢酸塩ランニング緩衝液、70分、150V、非還元条件)を用いて評価した。
【０１１０】
選択された分画をプールし、Amicon Ultra遠心管(Millipore、カットオフ:50kDa)を用いて濃縮した。濃縮後の容量は、0.5mlであった。生じた溶液を、水(pH7.0)中のヒスチジン(1.5g/l)、塩化カルシウム(250mg/l)、ツイーン80(0.1g/l)、塩化ナトリウム(18g/l)およびショ糖(3g/l)からなる緩衝液で前平衡させたSuperose 6 10/300 GLカラム(GE Healthcare Bio-Sciences、Hillerod、Denmark;カラム容量24ml)に加えた。前述の緩衝液および0.6ml/分の流動を用いて、混合液の構成成分を1.5カラム容量にわたり1mlのサイズの分画に分離した。選択された分画をプールした(0.015mg/ml、2ml)。
【０１１１】
(実施例3)
Peg-30K-マレイミドによるY1680Cのペグ化(参照US2006/0115876 A1)
試薬:
1) BDD-FVIII N8-Y1680C(MW 178,000)、1200μl、濃度80μg/ml、96μg、緩衝液20mMイミダゾール、+10mM CaCl2、+0.02%ツイーン80、+1M NaCl、1M gグリセロール、pH7.3に0.54nmol
2)トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP、MW 287):700等量; 0.0315μmモル;9μg。1mgのTCEPを、1mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3、1M NaClに溶解させた。この溶液の109μlを用いた。
3) 30kDa PEG-マレイミド(NOF Corp.からのSunbright Me-300Ma、MW 29300)、10等量、180μg。4.8mgの30kDa PEG-マレイミドを、2.4mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3、1M NaClに溶解させた。この溶液の90μlを用いた。
【０１１２】
VivaPピュアスピンカラム(強力な陰イオン交換)およびPro-spin(スピンカラム)のために用いた緩衝液:
緩衝液A: 20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3
緩衝液B: 20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 25mM NaCl
緩衝液C:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 50mM NaCl
緩衝液D:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 200mM NaCl
緩衝液E:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mグリセロール、pH7.3 1M NaCl
【０１１３】
BDD-FVIIIN8-Y1680Cを室温で解凍し、5ml管にプールした。TCEP溶液の109μlの量を加えた。混合液を、5℃で30分間インキュベートした。
【０１１４】
次に、TCEPを除去した:反応混合液を、42mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3で希釈し、塩濃度を31mMにした。溶液を、Viva pPure Q maxi M(Sartorius、強力な陰イオン交換)に加えた。
【０１１５】
平衡化: 10mlの緩衝液Aを加え、2000g(1500 RCF)で2分間遠心回転させる
試料ローディング:希釈試料の4×11mlを加えた。各々について、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液B(25mM NaCl): 10mlの緩衝液Bを加え、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液C(50mM NaCl): 10mlの緩衝液Cを加え、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液D(200mM NaCl): 10mlの緩衝液Dを加え、2000gで2分間遠心回転させる。
溶出緩衝液E(1M NaCl): 2×750μlの緩衝液Eを加え、2000gで1分間遠心回転させる。(2回繰り返した)
【０１１６】
脱ブロックされたタンパク質は、緩衝液Eによる溶出からの第一分画で収集された; Nanodropによる測定で103μg、137μg/ml。次に、NAP-10カラム(GE Healthcare)、および溶出剤として20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3、1M NaClを用いて、それを緩衝液交換した。全ての物質を含む1200μlの単一の分画を収集した。
【０１１７】
この分画に、30kDa PEG-マレイミド溶液の90μlを加えた。反応混合液を5℃で20時間インキュベートし、その後のSDS-PAGEゲル分析によってFVIII LCバンドの強度の低下、および同時により高い分子量の新しいバンドの存在が示された。
【０１１８】
次に前記のように反応混合液を42mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1M Gグリセロール、pH7.3で希釈し、Viva pure Q maxi M(強力な陰イオン交換)スピンカラムに加え、緩衝液BからEを通して溶出させた。67μgの量のタンパク質誘導体を収集し、濃度89μg/ml、750μl、それをSuperdex 200 10/300カラムに加え、ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、ツイーン80(0.1mg/ml)、NaCl(18mg/ml)、ショ糖(3mg/ml)、pH7で溶出させた。9.5から12分間の保持時間で溶出した物質を収集し、一ペグ化BDD-FVIII N8-Y1680C突然変異体、35μg、14μg/mlを提供した。分画のSDS-PAGE分析は、PEGがLCに結合している、化合物の正しい構造を示した。
【０１１９】
上記のプロトコルを用いて、一ペグ化BDD-FVIII Y1680C化合物を調製した。この化合物では、PEG基はBDD-FVIIIの1680位へ結合している。この特定の改変は、2つの同時作用を生む:vWF結合の減少およびPEG媒介半減期の延長。
【０１２０】
(実施例4)
発色性アッセイで測定されるFVIII:C
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)は、以下の通りにCoatest SP試薬(Chromogenix)を用いて発色性FVIIIアッセイで評価された: rFVIII試料およびFVIII標準(例えばNIBSCからの第7国際FVIII標準に対して較正された、精製野生型rFVIII)を、Coatestアッセイ緩衝液(50mMトリス、150mM NaCl、1% BSA、pH7.3、保存剤含有)に希釈した。試料、標準および緩衝液陰性対照の50μlを、2反復で96穴マイクロタイタープレート(Nunc)に加えた。Coatest SPキットからの因子IXa/因子X試薬、リン脂質試薬およびCaCl2を5:1:3(vol:vol:vol)で混合し、これの75μlをウェルに加えた。室温で15分間のインキュベーションの後、50μlの因子Xa基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを加え、反応体を室温で10分間インキュベートした後、25μlの1Mクエン酸、pH3を加えた。Spectramaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で415nmの吸光度を測定し、620nmの吸光度を参照波長として用いた。陰性対照の値を全ての試料から引き、プロットされた吸光度値対FVIII濃度の線形回帰によって較正曲線を作成した。HPLCで測定されたタンパク質濃度で試料の活性を割ることによって、比活性を計算した。軽鎖に対応するクロマトグラム中のピーク下面積を積算し、濃度がアミノ酸分析で測定された野生型未改変rFVIIIの平行分析で同じピークの面積と比較することによって、試料濃度を決定した。O-グリコペグ化rFVIII化合物については比FVIII:C活性が維持されたことを、Table 1(表2)のデータは実証する。
【０１２１】
(実施例5)
1段階クロットアッセイで測定されるFVIII:C
rFVIII化合物のFVIII:Cは、以下の通りに1段階FVIIIクロットアッセイでさらに評価した: rFVIII試料およびFVIII標準(例えばNIBSCからの第7国際FVIII標準に対して較正された、精製野生型rFVIII)を、HBS/BSA緩衝液(1%BSAを含む20mM hepes、150mM NaCl、pH7.4)で約10U/mlに希釈し、その後VWFを含んでいるFVIII欠損血漿(Dade Behring)で10倍に希釈した。試料は、その後HBS/BSA緩衝液で希釈した。APTTクロット時間は、単一因子プログラムを用いるACL300RまたはACL5000機器(Instrumentation Laboratory)で測定した。VWFを含むFVIII欠損血漿(Dade Behring)をアッセイ血漿として用い、およびSynthASil(HemosIL(商標)、Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として用いた。クロット機器では、希釈された試料または標準を、FVIII欠損血漿、aPTT試薬と37℃で混合する。塩化カルシウムを加え、クロット形成までの時間を濁度で測定する。試料中のFVIII:Cは、FVIII標準の希釈溶液のクロット形成時間の標準曲線に基づいて計算される。Table 1(表2)のデータは、凝固と発色活性との間の比を示す。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
(実施例6)
FVIII欠損およびVWF欠損マウスでのrFVIIIの薬物動態
rfviii変異体の薬物動態は、FVIII欠損マウス(c57bl/6バックグラウンドを有するFVIIIエクソン16ノックアウト(KO)マウス、Taconic m&bで育成)で、またはvWF欠損マウス(c57bl/6バックグラウンドを有するvWFエクソン4 + 5 KOマウス、Charles River、Germanyで育成)で評価された。vWF-KOマウスは13%の正常なFVIII:Cを有していたが、FVIII-KOマウスは検出可能なFVIII:Cを有していなかった。25グラムの概算重量を有する16〜28週齢の雌雄(約1:1)混合群を用いた。マウスは、尾静脈からrFVIII(280iu/kg)の単一のi.v.注射を受けた。コーティングされていないガラス毛管を用いて、投与から最高64時間後までの時点で眼窩叢から採血した。3つの試料を各マウスからとり、2つから4つの試料を各時点で収集した。クエン酸ナトリウムで血液を直ちに安定させ、4容のFVIII coatest sp緩衝液(実施例4を参照)で希釈した後、4000×gで5分間の遠心にかけた。希釈血液から得られた血漿をドライアイスの上で冷凍し、-80℃で保存した。FVIII:Cは、実施例4に記載の発色性アッセイで測定した。winnonlinプロバージョン4.1ソフトウェアを用いて、ノンコンパートメント法(NCA)によって薬物動態分析を実行した。Table 2(表3)は、薬物動態パラメータの推定値を示す:半減期(t1/2)、クリアランス(cl)および平均滞留時間(MRT)。データは、ペグ化の結果クリアランスが減少し、半減期および平均滞留時間が増加したことを示す。
【０１２４】
BDD- FVIIIはvWF KOマウスでは速く消去され(0.5時間のT1/2)、そのことは、vWFが循環中でFVIIIのための担体および安定剤であるとの一般に容認されている仮説に一致する。vWF KOマウスが10K〜80Kのグリコペグ化BDD-FVIIIをi.v.で投与された場合、BDD-FVIIIと比較して5〜22倍の増加に対応する末端T1/2の増加が観察され(2.7〜11時間の範囲で)(Table 2(表3))、グリコペグ化がvWFへのFVIII結合の重要性を低下させたことを示唆している。結合したPEG部分の増加に従ってBDD-FVIIIのvWFへの結合が減少することを示した、BDD-FVIII-PEG-vWF結合で得られた予備データにこれは一致する。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
興味深いことに、グリコペグ化は、FVIII KOマウスと比較してvWF KOマウスでBDD-FVIIIの曝露プロファイルをほとんど「正常化した」。結合したPEG基が大きいほど、FVIII KOとvWF KOマウスとの間で薬物動態学の差はより小さい。グリコペグ化されたBDD-FVIII変異体の半減期の間の比は、PEG基のサイズの増加にともなって減少した。グリコペグ化された変異体の曝露は、未改変のBDD-FVIIIと比較してvWF依存性が低いことをこれは示す。vWF結合が欠損しているFVIII変異体を用いる場合、FVIII KOマウスで類似した傾向を観察することができる(Table 3(表4))。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
(実施例7)
血友病AマウスのFeCl3によって誘導された損傷モデルにおけるvWF結合能力が欠如しているFVIII変異体の止血効果
マウスをケタミン(Ketaminol(登録商標) Vet.(Intervet);100mg/kg)、キシラジン(Narcoxyl(登録商標) Vet.注射溶液(Intervet);5.6mg/kg)およびアトロピン(硫酸アトロピン(Phoenix Pharma);0.3mg/kg)の混合物で麻酔にかけ、体温を維持するために加熱パッド(37℃)の上に置いた。その後頸動脈を露出させ、0.5PSB Nanoprobeを動脈周囲に置いた。FeCl3損傷の誘導の5分前に、試験化合物を側部尾静脈に注射した。10% FeCl3溶液に短時間浸した濾紙(2×5mm)をプローブに隣接した動脈の周囲に置き、3分後に除去することによってFeCl3損傷を誘導した。FeCl3飽和濾紙の除去後、動脈を0.9% NaClで3回洗浄し、最後に、流動プローブ中の空気を排気して血流の最適化された測定を確保するためにSurgilube(音響カプラ)を適用した。FeCl3の除去後、最初の血流があまりに低い(0.4ml/分未満)場合、または流動が測定不能の場合は、マウスを除外した。FeCl3飽和濾紙を除去してから25分間、AD instrumentsからのソフトウェアChart5(バージョン5.5.5.20)を用いて血流(ml/分)を記録した。
【０１２９】
データ分析
特記しない限りデータは平均±SEMで提示し、GraphPad Prismバージョン5(La Jolla、CA、USA)を用いて分析した。2つの化合物の効果は、一元配置ANOVAを用いて、続いて多重比較のためのチューキーの検定を用いて比較した。P<0.05は、統計的に有意であるとみなした。
【０１３０】
結果
FeCl3損傷の後、正常に機能している凝固系を有するマウス(C57BL/6NTac)の全ての血管は3.3分以内に閉塞し、閉塞までの平均時間は2.4±0.2分であった(n=6;図1)。FVIIIノックアウトマウスのいずれも、25分の観察時間中に閉塞しなかった(n=6)。NNC 0129-0000-9105の用量依存性は、閉塞までの時間を短縮した(NNC 0129-0000-9105は、末端欠失型Bドメイン中のO-連結グリカン上のF8-500 Y1680F 40kDa-ペグ化(PEGyleret)に対応する)。閉塞までの時間は、ビヒクル処置動物と比較して5または10IU/kgのいずれかによる処置の後、有意により短かった。Advate(登録商標)の類似した効果が観察され、Advate(登録商標)とNNC 0129-0000-9105との間で効果に統計的差はなかった(図1)。
【０１３１】
(実施例8)
血友病Aマウスの尾処理出血モデルにおけるvWF結合能力が欠如しているFVIII変異体の止血効果
マウスにペントバルビタール(100mg/kg、i.p.;Nomeco、Roskilde、Denmark)で麻酔をかけ、体温を維持するために加熱パッドの上に置いた。鋭いメスで尾部の先端の4mmを切断することによって、出血を誘導した。切断の10分前に、14mLの生理食塩水(37℃)を含む試験管に尾を入れ、切断の5分前に、尾静脈注射によって試験化合物を5mL/kgの量で投与した(20または280U/kg)。血友病Aマウスおよび正常な凝固をもつ動物を、同じ量のビヒクルで処置した。動物を安楽死させた後に、30分間にわたって血液を収集した。血液減少は、ヘモグロビンの量を定量化することによって測定した。したがって、4000×で5分間の遠心によって赤血球を単離した。上清を廃棄し、ヘモグロビン試薬(ABX Lysebio;HORIBA、ABX、Roedover、Denmark)で細胞を溶解した。4000×gで5分間の遠心によって細胞片を除去した。試料を550nmで読みとり、ヘモグロビン総量を標準曲線から決定した(ヘモグロビン標準;J.T. Baker 3074;Bie & Berntsen、Roedover、Denmark)。
【０１３２】
データ分析
特記しない限りデータは平均±SEMで提示し、GraphPad Prismバージョン5(La Jolla、CA、USA)を用いて分析した。2つの化合物の効果は、一元配置ANOVAを用いて、続いて多重比較のためのチューキーの検定を用いて比較した。P<0.05は、統計的に有意であるとみなされた。
【０１３３】
結果
FVIIIノックアウトマウスの尾部出血モデルにおけるAdvate(登録商標)の用量反応相関は、前に完全に調査されている(Documentum ObjectID: 0900c76e80e3e7a5)。200IU/kgのAdvate(登録商標)は血液減少および出血時間を正常化し、血液減少および出血時間のED50値はそれぞれ39および28IU/kgであった。NNC 0129-0000-9105の止血効果を試験するために、20および280IU/kgの効果をAdvate(登録商標)の同じ用量と比較した。NNC0129-0000-9105(20および280lU/kg)は、ビヒクル処置動物と比較して、血液減少および出血時間を有意に低減した(図2)。Advate(登録商標)とNNC 0129-0000-9105との間でその効果の差は観察されなかった。
【０１３４】
Advate(登録商標)の20IU/kgの効果は、以前の試験(Documentum ObjectID: 0900c76e80e3e7a5)から予想されるよりも顕著であった。これは、Advate(登録商標)の実際に投与される活性の差および尾部出血方式の一般的変動に起因する合併効果による可能性が最も高い。したがって、両試験で20IU/kgを投与することが意図されたが、投与溶液中のFVIII活性の分析(Chromogenix(登録商標))は、活性が現在および以前の試験で意図されたものよりそれぞれ20%高かったこと(ELN 15876-199)および15%低かったことを示した。しかし、現在の試験で両化合物は同等のFVIII活性で投与されたので、NNC 0129-0000-9105およびAdvate(登録商標)が同等の効果を有するとの試験の全体的な結論をこれが変更することはない。
【０１３５】
(実施例9)
vWFに結合しない血小板結合特性によるFVIII変異体の生成。
抗GPIIa/IIIB抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、AP3を、SMART(商標)RACE cDNA増幅キット(Clontech、Ca)を用いてAP3抗体を発現するハイブリドーマ細胞から単離されたRNAから増幅した。2つのAP3鎖の可変領域の増幅のために用いたプライマーは、以下の通りであった:
重鎖:
汎用プライマーミックスA(Clontech、CA):
長い(0.4μM):
5'-ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3'(配列番号5)
短い(2μM):
5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(配列番号6)
プライマー69(10μM)
5'-gctctagactaacactcattcctgttgaagctcttg-3'(配列番号7)
軽鎖
汎用プライマーミックスA(Clontech:
長い(0.4μM):
5'-ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3'(配列番号8)
短い(2μM):
5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(配列番号9)
プライマー312(10μM)
5'-gtctaccacaacacacgtgac-3'(配列番号10)
【０１３６】
配列決定のためにZero Blunt(登録商標)TOPO(登録商標)PCRクローニングキットを用いてpCR4ベクターに可変領域をクローニングした(カタログ番号K287520 Invitrogen、CAから)。その後、可変領域をpTT5ベースの発現ベクター中のネズミIgG1枠組みにサブクローニングした。完全長AP3 abをコードする2つの鎖を、Hek293 6E細胞で一時的に発現させた。静止中の血小板への完全長抗体の結合は、FACS分析によって確認された。
【０１３７】
AP3抗体の軽鎖および重鎖の可変領域をコードするDNA配列に基づき、AP3 abの2つの単鎖抗体フォーマット(AP3 LC-HC scFvおよびAP3 HC-LC scFv)を生成した(配列1および配列2)。AP3 abの2つの単鎖フォーマットを、その後pTT5ベースの発現ベクターにサブクローニングした。静止中の血小板のGPIIa/IIIBへの2つの単鎖抗体の結合は、FACS分析によって確認された。
【０１３８】
標準の分子生物学方法を用いてAP3 LC-HC scFvまたはAP3 HC-LC scFvをBDD FVIIIのaa R761とQ1686(それぞれ配列3および配列4)との間に挿入することによって、AP3 LC-HC scFvまたはAP3 HC-LC scFvとBドメイン欠失-a3ドメイン欠失FVIIIとの間の融合タンパク質を作製した。
【０１３９】
配列番号11:AP3-LC-HC scFV-FLAG
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSDYKDDDDK*
【０１４０】
配列番号12:AP3-HC-LC scFV-FLAG
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRDYKDDDDK*
【０１４１】
これらの構築物に基づいて、変異体AP3 scFv LC-HC C34S S248Cを、標準の分子生物学方法を用いて生成することができた。
【０１４２】
N-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の生成
【０１４３】
【化１】
【０１４４】
工程1:
3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジニル-1-イルエステル
【０１４５】
【化２】
【０１４６】
3-マレイミドプロピオン酸(1.0g、5.9mmol)をテトラヒドロフラン(20ml)に溶解した。2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU、2.14g、7.1mmol)およびエチルジイソプロピルアミン(1.24ml、7.1mmol)をその後加えた。N,N-ジメチルホルムアミド(5ml)を加えた。ゆっくりと回転する間、反応混合液を室温で撹拌した。混合液を2分間撹拌した。N,N-ジメチルホルムアミド(5ml)を加えた。混合液を室温で2.5時間撹拌した。それをジクロロメタン(150ml)で希釈し、その後硫酸水素ナトリウムの10%水溶液(150ml)、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(150ml)および水(150ml)で洗浄した。それを硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させて、1.20gの3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジニル-1-イルエステルを与えた。
MS: m/z=289、[M+Na]+のために必要とされる: 289
1H-NMR (CDCl3) δ 2.82 (m, 4H); 3.02 (t, 2H); 3.94 (t, 2H)、6.73 (s, 2H)。
【０１４７】
工程2:
N-((3-(ω-アミノ10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(100mg、0.009mmol)を、テトラヒドロフラン(2ml)およびジクロロメタン(10ml)の混合物に溶解した。ジクロロメタン(3ml)中の3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジニル-1-イルエステル(50mg、0.18mmol)の溶液を加えた。エチルジイソプロピルアミン(0.005ml、0.028mmol)を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。ジクロロメタン(2ml)およびエチルジイソプロピルアミン(0.5ml)を加えた。アミノメチル化(Amionomethylated)ポリスチレン樹脂(例えばNovabiochemから市販されている、添加量0.85mmol/g、438mg、0.372mmol)を加えた。混合液を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。樹脂を濾過によって除去した。25℃の浴温で溶媒を真空中で除去した。残基をジクロロメタン(4ml)に溶解した。エーテル(200ml)を加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で2時間放置した。沈殿を濾過によって単離し、真空中で乾燥させ、標記化合物の38mgを与えた。DMSO-d6での1H-NMRスペクトルは、マレイミド基の存在を示した。
【０１４８】
FVIII(NNC 0129-0000-3270)へのAP3 scFv LC-HC C34S S248Cのコンジュゲーション
【０１４９】
【化３】
【０１５０】
工程1:
AP3 scFV C24S S248CのCys 248へのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の結合
【０１５１】
【化４】
【０１５２】
pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、1Mのグリセロールからなる緩衝液(0.40ml)中のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンハイドロクロリド(0.40mg)の溶液を、(4ml、2.12mg、76nmol)でpH7.5に調整した100mM HEPESおよび150mM NaClの溶液中の、そのC末端にFlagタグを有し、余分のCysがS-S橋を通して248位のシステインに結合したAP3 scFv LC-HC C34S S248Cの0.53mg/mlの濃度の溶液に加えた。反応混合液を20℃で静かに振盪した。それを2つの部分に分けた。pH7.0に調整した25mM HEPESの緩衝液を用いて、その各々をPD-10カラム(GE-Healthcare)に加えた。カラムの溶出液(その各々3.5ml)を合わせた。
【０１５３】
pH7.0に調整した25mM HEPESの緩衝液(0.43ml)中のN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(3.3mg、305nmol)の溶液を、タンパク質の溶液に加えた。反応混合液を20℃で4時間静かに振盪した。それを10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10℃で10分間の4000rpmの超遠心にかけた。混合液を精製までフリーザーに保存した。
【０１５４】
精製のために、混合液を解凍した。それを、1ml/分の流動の直径16mmおよび長さ60cmの床サイズを有するSuperdex 200ゲル、およびpH8.0に調整した25mMトリスおよび150mM NaClの緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールして、1.61mgの所望のタンパク質を与えた。SDS-PAGEゲルは、予想通りであった。
【０１５５】
工程2:
pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mのグリセロールからなる緩衝液(0.018ml)中の、重鎖のC末端にSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失FVIIIの溶液(1mg、5.64mmol)を、カットオフが10kDaのAmicon超遠心装置に入れた。pH8.0に調整した25mMトリスおよび150mM NaClの溶液(0.680ml)中のAP3 scFv C24S S248CのCys 248(1.29mg、34nmol)へのN-((3-(ω-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)-アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の給合生成物の溶液を加え、pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(3ml)をその後加えた。混合液を、10℃で20分間の4000rpmの超遠心にかけた。FVIIIの残りの量は、0.800mlまたは1.25mg/mlであった。A.ウリファシエンス(A. Urifaciens)からのシアリダーゼの溶液(0.43mg/ml、302U/mg、0.0049ml、0.645U)およびST3-Gal-Iの溶液(2.5mg/ml、0.105mg、0.042ml)をその後加えた。反応混合液を32℃で1分間静かに振盪し、その後32℃で18時間放置した。それを精製までフリーザーで保存した。
【０１５６】
反応混合液を解凍した。それを2つの部分に分け、それぞれを、0.30ml/分の流動の直径10mmおよび長さ300mmの床サイズのSuperose 6ゲル、および溶離液としてpH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、150mM NaClおよび1Mグリセロールからなる緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む両方のランの全ての分画をプールした。それらをカットオフ10kDaのAmicon超遠心装置に入れ、10℃で18分間の4000rpmの超遠心にかけた。
【０１５７】
pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、150mM NaClおよび1Mのグリセロールからなる緩衝液(0.100ml)中のCMP-N-アセチルノイラミン酸(CMP Neu/Vac、1.5mg、2597nmol)の溶液、およびST3Gal-III(0.10ml、0.033mg)の0.33mg/ml溶液をその後加えた。反応混合液を300rpmで静かに振盪し、その後精製までフリーザーで保存した。
【０１５８】
反応混合液を2つの部分に分けた。その各々を、0.00045mmフィルターに通して濾過した。CNBrで活性化の後にF25抗体を結合させておいた、直径5mmおよび長さ5cmの床サイズのセファロースカラムにそれらを加えた。F25は、FVIIIの公知の抗体である。負荷後、pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、150mM NaClおよび1Mグリセロールからなる緩衝液によって、カラムを0.6ml/分の流動で3CVについて洗浄した。その後、pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80および650mM NaClからなる緩衝液によって、それを0.6ml/分の流動で3CVについて洗浄した。最後に、pH 7.35に調整した、50v/v%エチレングリコール/水溶液中の20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02%ツイーン80、2.5M NaClからなる緩衝液によって、化合物を6CVの範囲内で0.1ml/分の流動で溶出させた。所望の生成物を含む両方のランの分画をプールした。それらを10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを、10℃で14分間の4000rpmの超遠心にかけた。残りの溶液は、pH7に調整した10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01%ツイーン80、0.3M NaCl、8.8mMショ糖からなる緩衝液を用いる、0.50ml/分の流動の、直径10mmおよび長さ30cmの床サイズのSuperose 6材料でのサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。適する純度の所望の化合物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを、9℃で12分間の4000rpmの超遠心にかけた。14.46のモル吸光度を用いて、収量は0.0176mgのFVIIIへのAP3 scFv LC-HC C34S S248Cのコンジュゲートであると判明した。非還元条件下のSDS-PAGEゲルによる分析は、予想通りであった。
【０１５９】
N-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸の生成
【０１６０】
【化５】
【０１６１】
工程1:
N-((3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(NNC 0129-0000-3219)
【０１６２】
【化６】
【０１６３】
N-(アミノアセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(18mg、0.029mmol)を、pH8.9に調整した50mMトリスからなる緩衝液(4ml)に溶解した。現在のpHを検査し、0.1N塩酸の添加によってpH8.9に調整した。THF(16ml)を加えた。3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(例えばRapp Polymere GmbHから市販されている、全体で200mg、0.019mmol)の最終的な量の約半分を加えた。反応混合液を室温で撹拌した。1時間の後、3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルの第二の半分を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。THFは、25℃の浴温で真空中で除去した。残りの混合液を濾過し、直径26mmおよび長さ10cmの床サイズのG25ゲルを7ml/分の流動で用いて、25mM炭酸水素アンモニウムの緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の化合物を含む分画をプールして凍結乾燥し、N-((3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸を含む453mgの物質を与えた。
【０１６４】
DMSO-d6で実施された1H-NMRスペクトルは、シチジリル部分ならびにフルオレニル-9-イルメトキシカルボニル部分の存在を示した。材料をフリーザーで保存した。
【０１６５】
この反応を、1gの3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび90mgのO2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸で繰り返した。炭酸水素アンモニウムの50mM水溶液中の、アセトニトリル(acetontrile)中の炭酸水素アンモニウムの5mM水溶液からなる混合液の30〜50%の勾配を用いて、直径2cmのHPLC C4カラムで精製を実施した。所望の化合物を含む分画を収集して凍結乾燥し、288mgの所望の化合物を与えた。1H-NMRスペクトルは、上記の実験で見出された1H-NMRスペクトルに一致した。
【０１６６】
工程2:
N-((3-(ω-アミノ10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(NNC 0129-0000-3227)
【０１６７】
【化７】
【０１６８】
N-((3-(ω-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(453mg)を、N,N-ジメチルホルムアミド(12ml)に溶解した。ピペリジン(1.25ml)を加えた。透明溶液を室温で20分間撹拌した。エーテル(200ml)を加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で1.5時間放置した。沈殿を濾過によって単離した。それをジクロロメタン(4ml)に溶解した。エチルジイソプロピルアミン(1ml)を加えた。エーテル(250ml)を加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で16時間放置した。沈殿を濾過によって単離し、真空中で乾燥させた。DMSO-d6での1H-NMRスペクトルは9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル基のシグナルを示さなかったが、シチジリル部分に帰属されるシグナルが見出された。物質をフリーザーで保存した。
【０１６９】
工程3:
4-ホルミル安息香酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル
【０１７０】
【化８】
【０１７１】
トリエチルアミン(2.04ml、14.65mmol)および2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU、4.44g、14.65mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(30ml)中の4-ホルミル安息香酸(2.0g、13.3mmol)の溶液に連続して加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。それを酢酸エチル(150ml)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの10%水溶液(100ml)で洗浄した。水相を酢酸エチル(2×30ml)で抽出した。合わせた有機層を塩水(50ml)および水(50ml)の混合液で洗浄した。合わせた有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させて、1.89gの4-ホルミル安息香酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルを与えた。
1H-NMR (CDCl3)。δ 2.95 (s, 4H); 8.04 (d, 2H)、8.32 (d, 2H); 10.15 (s, 1H)。
【０１７２】
工程4:
N-((3-(ω-アミノ10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(42mg、0.004mmol)を、ジクロロメタン(2ml)に溶解した。エチルジイソプロピルアミン(0.002ml、0.012mmol)を溶液に加えた。ジクロロメタン(0.5ml)中の4-ホルミル安息香酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルの溶液(19.32mg、0.078mmol)を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。溶媒を25℃の浴温で真空中で除去した。残渣を炭酸水素アンモニウムの25mM水溶液(15ml)に懸濁した。非可溶性物質を濾過によって除去した。それを5つの部分に分けた。その各々を、25mM炭酸水素アンモニウムの緩衝液を用いて、7ml/分の流動による直径26mmおよび長さ10cmのカラム上のG25を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の物質を含む全ての分画を合わせ、凍結乾燥した。DMSO-d6での1H-NMRスペクトルは、アルデヒド部分およびシチジリル部分の両方の存在を示した。得られた物質をフリーザーで保存した。
【０１７３】
O-グリカンでのFVIIIへのアブシキシマブのコンジュゲーション(NNC 0129-0000-3279)
【０１７４】
【化９】
【０１７５】
工程1:
アブシキシマブ(Abxicimab)の1つのN末端へのN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸のコンジュゲーション
【０１７６】
【化１０】
【０１７７】
市販のアブシキシマブ(ProReo、市販緩衝液の2mg/ml溶液中に、10mg、215nmol)の溶液を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(5ml)を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10℃で10分間実行した。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(10ml)を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10℃で10分間実行した。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(10ml)を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10℃で10分間実行した。0.65mlの残りの溶液をプラスチック反応器に入れた。pH7.4に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(3.85ml)を加えた。pH7.0に調整した25mM HEPESからなる緩衝液(1.5ml)中のN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸(14mg、1290nmol)の溶液を加えた。反応混合液を20℃で3分間、300rpmで静かに振盪した。新たに調製されたナトリウムシアノボロハイドライドの1.0M水溶液(0.025ml)を加えた。反応混合液を20℃において300rpmで静かに振盪した。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部(0.025ml)を加えた。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド(cyanoborohydrice)溶液の別の一部(0.025ml)を加えた。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部を加えた。溶液を20℃で16時間、300rpmで静かに振盪した。反応混合液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、18℃で10分間の4000rpmの超遠心にかけた。0.360 mlの残りの溶液を濾過し、1ml/分の流動の16mm×60cmの床サイズを有するSuperdex 200ゲルでの、pH8.0に調整した25mMトリス、150mM NaClの緩衝液を溶離液として用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画を合わせて2つのバッチにした。それらのバッチの各々を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを10℃で10分間の4000rpmの超遠心にかけて、それぞれ2.67mgおよび3.27 mgを与えた。定量化のために、10.94のモル吸光度をNanodrop(登録商標)分光光度計で用いた。SDS-PAGEによる生成物の分析は、アブシキシマブ(Abxicimab)の1つのN末端とのN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸のコンジュゲートの予想と一致した。
【０１７８】
工程2:
FVIIIのO-グリカンへのアブシキシマブのコンジュゲーション
pH7.35に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液(2.5ml)を、pH7.35に調整した20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液中の、重鎖のC末端にSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失FVIIIの溶液(5.7mg/ml、1mg、5.6nmol)に加えた。pH8.0に調整した25mMトリス、150mM NaClからなる緩衝液(0.323ml)中の、アブシキシマブ(Abxicimab)の1つのN末端とのN-((3-(ω-(4-ホルミルベンゾイルアミノ)10kDaペギル)プロピオニルアミノ)アセチル)-O2-[5']シチジリル-ξ-ノイラミン酸のコンジュゲートの溶液(2.3mg、39.5nmol)を加えた。溶液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10℃で20分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH7.35に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.02%ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液(2ml)を加えた。溶液を10℃で30分間の4000rpmの超遠心にかけ、1.4mlの容量の溶液が残された。A.ウリファシエンス(A. Urifaciens)のシアリダーゼの溶液(0.4mg/ml、242U/mg、0.0066ml)およびST3Gal-Iの溶液(2.5mg/ml、0.042ml)をその後加えた。反応混合液を32℃で15分間静かに振盪した。その後、反応混合液を32℃で20.5時間静置させた。反応混合液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10℃で15分間の4000rpmの超遠心にかけた。0.300mlの残りの溶液は、pH7に調整した10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01%ツイーン80、0.3M NaCl、8.8mMショ糖からなる緩衝液を溶離液として用い、0.5ml/分の流動の、10mm×300mmの床サイズのSuperose 6材料を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(2.5ml)を加えた。溶液を、10℃で15分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(1.5ml)を加えた。溶液を、10℃で15分間の4000rpmの超遠心にかけた。0.220mlの残りの溶液をプラスチック反応器に入れた。pH6.07に調整した20mMヒスチジン、10mM CaCl2、10%グリセロール、0.02%ツイーン80、500mM NaClからなる緩衝液(0.173ml)中の市販のCMP NeuNAc(1.73mg、2800nmol)の溶液を加えた。反応混合液を32℃で1時間、300rpmで静かに振盪した。それを、pH7に調整した10mMヒスチジン、1.7mM CaCl2、0.01%ツイーン80、0.3M NaCl、8.8mMショ糖からなる緩衝液を溶離液として用い、0.5ml/分の流動の、10mm×300mmの床サイズのSuperose 6材料を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。プールを10℃で5分間の4000rpmの超遠心にかけ、O-グリカンでのFVIIIとのアブシキシマブのコンジュゲーション生成物の0.0358mgの0.275mlの溶液を与えた。定量化のために、13.15のモル吸光度をNanodrop(登録商標)分光光度計で用いた。SDS-PAGE分析は、O-グリカンでのFVIIIとのアブシキシマブのコンジュゲーション生成物のSDS-PAGEの予想に一致した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子。
【請求項２】
側鎖基が、親水性ポリマー、アルブミン結合剤、抗体またはその断片、およびアルブミンからなる群の1つまたは複数から選択される、請求項1に記載の分子。
【請求項３】
因子VIII分子がBドメイン末端欠失型変異体である、請求項1または2のいずれか一項に記載の分子。
【請求項４】
側鎖基が末端欠失型Bドメインと共有結合でコンジュゲートし、因子VIIIの活性化が、共有結合でコンジュゲートしている側鎖基の除去をもたらす、請求項3に記載の分子。
【請求項５】
末端欠失型BドメインのO-連結オリゴ糖を通して親水性ポリマーと共有結合でコンジュゲートし、因子VIIIの活性化が、共有結合でコンジュゲートしている親水性ポリマーの除去をもたらす、請求項4に記載の分子。
【請求項６】
O-連結オリゴ糖がBドメインの末端欠失によって形成されるO-グリコシル化部位に結合する、請求項5に記載の分子。
【請求項７】
残基1680に点突然変異を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
残基1670〜1684にわたる領域で1つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
側鎖基がPEGである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１０】
低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子への側鎖基の給合を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分子の作製方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の方法によって得ることができる分子。
【請求項１２】
それを必要とする患者に請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子の治療的有効量を投与する工程を含む、血友病疾患の治療方法。
【請求項１３】
請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子の医薬としての使用。
【請求項１４】
血友病の治療のための医薬の製造のための、請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子の使用。
【請求項１５】
請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子を含む医薬組成物。
【請求項１】
低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子。
【請求項２】
側鎖基が、親水性ポリマー、アルブミン結合剤、抗体またはその断片、およびアルブミンからなる群の1つまたは複数から選択される、請求項1に記載の分子。
【請求項３】
因子VIII分子がBドメイン末端欠失型変異体である、請求項1または2のいずれか一項に記載の分子。
【請求項４】
側鎖基が末端欠失型Bドメインと共有結合でコンジュゲートし、因子VIIIの活性化が、共有結合でコンジュゲートしている側鎖基の除去をもたらす、請求項3に記載の分子。
【請求項５】
末端欠失型BドメインのO-連結オリゴ糖を通して親水性ポリマーと共有結合でコンジュゲートし、因子VIIIの活性化が、共有結合でコンジュゲートしている親水性ポリマーの除去をもたらす、請求項4に記載の分子。
【請求項６】
O-連結オリゴ糖がBドメインの末端欠失によって形成されるO-グリコシル化部位に結合する、請求項5に記載の分子。
【請求項７】
残基1680に点突然変異を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
残基1670〜1684にわたる領域で1つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
側鎖基がPEGである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１０】
低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子への側鎖基の給合を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分子の作製方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の方法によって得ることができる分子。
【請求項１２】
それを必要とする患者に請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子の治療的有効量を投与する工程を含む、血友病疾患の治療方法。
【請求項１３】
請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子の医薬としての使用。
【請求項１４】
血友病の治療のための医薬の製造のための、請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子の使用。
【請求項１５】
請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の分子を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５１９６９７（Ｐ２０１３−５１９６９７Ａ）
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５３２５４（Ｐ２０１２−５５３２５４）
【出願日】平成２３年２月２日（２０１１．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１４３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０１２４２
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５０９０９１８４８）ノヴォ ノルディスク アー／エス (42)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２日（２０１１．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１４３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０１２４２
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５０９０９１８４８）ノヴォ ノルディスク アー／エス (42)
【Ｆターム（参考）】
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