低酸素誘導因子（ＨＩＦ）安定化ガラス
本発明は、細胞低酸素経路を調節するために特定遷移金属イオンの制御放出を与えるように配合されたガラス組成物、並びに薬剤及び生物医学的研究（罹患組織又は損傷組織の修復、回復又は再生に関する）における、これらの低酸素経路調節ガラスの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞低酸素経路を調節するために特定遷移金属イオンの制御放出を与えるように配合されたガラス組成物、並びに薬剤及び生物医学的研究（罹患組織又は損傷組織の修復、回復又は再生に関する）における、これらの低酸素経路調節ガラスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
体の組織及び器官における酸素圧力は、成長、治癒及び細胞挙動（細胞表現型）を確認するのに重要である。体における低酸素圧力（低酸素）は、特定組織（例えば、軟骨又は骨髄）に自然に存在し、血液（従って、酸素供給）の制限によるか、又は発達組織の代謝要求増大によって、生じ得る。低酸素感受性経路を介する低酸素への細胞応答は、組織損傷後の自然治癒、及び新組織形成に極めて重要である。低酸素は、ヘテロ二量体転写因子低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）によって媒介される多面適応的細胞型特異的応答を誘発する。
【０００３】
酸素正常状態条件下に、ＨＩＦ−１アルファサブユニット（ＨＩＦ−１α）は、ユビキチン化及びプロテアソーム消化によって分解される。これに対して、低酸素条件下において、ＨＩＦ−１α分解が阻害され、タンパク質の蓄積、βサブユニット（ＨＩＦ−１β）での二量化、標的遺伝子内での低酸素応答要素（ＨＲＥ）への結合、及び転写の活性化が生じる。この低酸素経路は、組織修復及び再生に必要な多くの遺伝子及び細胞機構（血管新生、リンパ管新生、細胞分化、前駆細胞漸増、並びに細胞保護及び殺細菌特性の強化を含む）を活性化する。これらの過程は、多くの再生医療戦略（創傷治癒及び組織工学を含む）の極めて重要な標的であり、低酸素経路の誘導は、これらの過程を促進する魅力的経路である。
【０００４】
低酸素経路によって誘導される組織再生過程の１つは、血管新生（虚血組織への酸素輸送の回復を生じる新しい血管の形成）である。血管新生の誘導は、特定の組織工学戦略に極めて重要である。血管は、細胞生存、細胞外基質（ＥＣＭ）リモデリング及び組織再生に極めて重要な、栄養、酸素、増殖因子及び細胞を供給する。従って、組織工学構成物の長時間の機能、統合及び生存は、適切な血管化に依存する。
【０００５】
新しい組織及び組織工学構成物の成長は、新血管成長だけでなく、適切な種類の血管にも依存する。浮腫又は慢性炎症を生じ得る「漏出性」未熟脈管に対するものとして、安定な、成熟した、充分に分化した脈管構造を発生させる必要がある。単一前駆血管形成増殖因子、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の投与は、漏出性未熟血管の形成を助長することが示されている。従って、多くの前駆血管形成因子の細胞産生を生じて、安定成熟血管の形成に導く、低酸素応答を標的とする有効手段が必要とされている。
【０００６】
低酸素経路によって誘導される他の過程は、新リンパ脈管成長（リンパ管新生）である。障害リンパ機能は、浮腫及び遅延創傷治癒を含む多くの病理学的状態に関連付けられている。低酸素は、リンパ球増殖因子ＶＥＧＦ−Ｃの産生を誘導することが公知であり、組換えＶＥＧＦ−Ｃでの治療が、創傷治癒、糖尿病性創傷の治癒を促進し、浮腫を減少させることが示されている。従って、リンパ球増殖を促進する低酸素経路の調節が、再建手術後の浮腫を減少させる望ましい方法である。
【０００７】
低酸素の他の作用は、抗微生物特性の強化である。低酸素勾配は、虚血組織（例えば、創傷）への免疫細胞の漸増を生じ、低酸素は、マクロファージの貪食活性を増大させ、それによって、自然防御機構を活性化し、潜在感染を制限する。感染と戦うことは、生体材料移植後を含む創傷治癒の成功に極めて重要である。
【０００８】
さらに、低酸素は、多くの細胞型（軟骨細胞、神経細胞、成体幹細胞、前駆細胞及び胚性幹細胞）の分化に影響を与える。従って、低酸素経路の標的化を使用して、インビトロ又はインビボで、特定の細胞系列の分化を指向するか、又は他の細胞型の表現型を維持することができる。
【０００９】
低酸素に対する細胞応答を標的とする１つの治療法は、組換え及び遺伝子療法である。潜在的に有効な、組換え及び遺伝子療法は、一般に、長期の費用のかかる分離、製造、精製及び特性決定工程を含むが、得られる治療生成物は、一般に、比較的短い保存期間を有する。
【００１０】
他の方法は、特定の遷移金属イオンの正確な濃度での制御放出によって、組織における低酸素を模倣することである。これらの遷移金属イオン（１つ又はそれ以上のＣｏ、Ｃｕ、Ｆｅ及びＮｉを含む）は、細胞低酸素経路を調節することが公知である（Maxwell, P.ら、Cancer Biol. Ther. 3(1):29-35(2004)）。遷移金属イオンは、正常酸素状態条件下において転写因子ＨＩＦ−１αの分解を阻止し、その結果として、ＶＥＧＦを含むＨＲＥ関連遺伝子の産生を生じることによって、低酸素を模倣する（米国特許第５４８０９７５号）。
【００１１】
細胞低酸素経路を調節するための遷移金属イオンの使用は、組織修復を刺激し、組織構成物を形成し、創傷治癒を促進する方法として、再生医療において大きな可能性を有する。従って、低酸素経路を誘導するのに充分な濃度及び時間において、遷移金属イオンへの組織の制御可能暴露を可能にするのに有効なビヒクルが必要とされている。
【００１２】
生物活性ガラスは、細胞挙動に影響を及ぼし、それによって組織成長に影響を及ぼすことが示されているシリカ又はホスフェート網状構造に基づく再吸収可能な材料群である。シリケートガラスの生物活性は、１９６９年にソーダ−カルシア−ホスホ−シリカガラスにおいて最初に観察された。これらのガラスは、ＳｉＯ２（４０〜５２％）、ＣａＯ（１０〜５０％）、Ｎａ２Ｏ（１０〜３５％）、Ｐ２Ｏ５（２〜８％）、ＣａＦ２（０〜２５％）及びＢ２Ｏ３（０〜１０％）を含んでいた。ＳｉＯ２−Ｐ２Ｏ５−ＣａＯ−Ｎａ２Ｏ生物活性ガラスの特定の例は、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）として製造されている。
【００１３】
生物活性ガラスの生物活性は、表面特性、及び生理学的環境における溶解イオンの局所放出の結果である。生物活性ガラス（例えば、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標））溶解のイオン生成物は、硬質組織及び軟質組織形成の両方に重要な遺伝子の発現を調節することが示されている。
【００１４】
多くの生物活性シリカガラスは、「４５Ｓ５ Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）」と称される配合に基づき、それは、４５ｗｔ％シリコンジオキシド（ＳｉＯ２）及びモル比５：１のカルシウム（Ｃａ）：リン（Ｐ）を表す。しかし、これらの成分の比率の変化、並びに、他の成分、例えば、ボロンオキシド（Ｂ２Ｏ３）、マグネシウムオキシド（ＭｇＯ）、カリウムオキシド（Ｋ２Ｏ）、ストロンチウムオキシド（ＳｒＯ）及びカルシウムフルオライド（ＣａＦ２）の含有は、生物活性ガラスの特性（溶解速度及びアパタイト形成を含む）の改質を可能にしている。
【００１５】
ＳｉＯ２、Ｎａ２Ｏ、ＣａＯ及びＰ２Ｏ５を含む商業的に入手可能な４５Ｓ５ Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）組成物は、ＶＥＧＦアップレギュレーションの誘導において作用を有することがインビトロで示されている（国際公開第２００４／０７１５４２号）。しかし、観察されたＶＥＧＦ産生の増加は最低限であり、ガラスは、低酸素経路を調節せず、ＶＥＧＦ産生を誘導し及び／又は血管新生応答を生じるために改質された組成を有していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第５４８０９７５号
【特許文献２】国際公開第２００４／０７１５４２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Maxwell, P.ら、Cancer Biol. Ther. 3(1):29-35(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
生物学的適合性及び／又は生物活性ガラスの化学組成、濃度、気孔寸法及び製造法の操作によって、低酸素刺激イオン（Ｃｕ、Ｎｉ、Ｆｅ及び／又はＣｏ）の生理活性レベルでの制御放出を与えるガラスを製造することができ、このガラスを使用して、低酸素を有利に模倣し、ＨＩＦ−１αの転写を安定化し、低酸素応答（例えば、低酸素遺伝子発現）を酸素正常状態条件下に誘導し得ることが、現在、確認された。低酸素模倣イオンの制御放出によって低酸素応答を標的にするガラスは、好都合にも、ＶＥＧＦ発現だけでなく、血管新生及び低酸素経路によって誘導される他の応答に重要な、かつ組織再生に重要な、多くの他の因子も刺激する。低酸素経路を調節するのに加えて、ガラス化学組成物は、組織再生及びインプラント統合に重要な他の生物学的過程を活性化する（例えば、骨組織再生におけるアパタイト形成）ために、最適化することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、第一の態様において、本発明は、下記から形成されるガラスを提供する：
３０〜６２％ＳｉＯ２（例えば、４５〜６２％、４７〜５３％、又は４７〜５０％ＳｉＯ２）；
０．１〜１５％Ｐ２Ｏ５；
合計含有率１２〜４５％のＣａＯ及びＳｒＯ；
合計含有率６〜３０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び
０．１〜１０％低酸素模倣イオン源；
前記低酸素模倣イオンは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ及びＦｅイオンから選択される１つ又はそれ以上のものである。
【００２０】
特定の実施形態において、ＳｉＯ２含有率は、４５〜６２％、好ましくは４７〜５３％、より好ましくは４７〜５０％であり、及び／又はＰ２Ｏ５含有率は０．５〜１．５％であり、及び／又はＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏの合計含有率は６〜２８％である。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のガラスは、Ｍｇ源（例えば、ＭｇＯ）０〜１２％、Ｚｎ源（例えば、ＺｎＯ）０〜１０％、ホウ素源（例えば、Ｂ２Ｏ３）０〜１５％、及びフッ素源（例えば、ＣａＦ２）０〜１０％の１つ又はそれ以上をさらに含む。
【００２２】
ガラスは、好ましくは、非晶質ガラス網状構造を含み、低酸素模倣イオンは非晶質ガラス網状構造に組み込まれる。好ましくは、結晶性構造が存在しない。
【００２３】
ガラスの組成は、低酸素模倣イオンがガラスの非晶質網状構造に組み込まれるために、かつ、ガラスが生理学的環境での使用においてイオンの制御放出を与えるために、重要である。低酸素イオンの制御送達と組み合わせて、ガラスの化学組成は、ガラスの物理的及び化学的特性に影響を与える。従って、本発明のガラスの化学組成は、所望される適用及び組織型のために変更できる。好ましい組成を以下に詳述する。
【００２４】
全体的に言及されるガラス組成物のパーセント含有量は、モルパーセントである。ガラス組成物の形成に使用される金属酸化物、例えばＣａＯは、各金属イオンの源を与える。ガラスが特定パーセントの酸化物から形成されるか又は含むと記載されている場合、ガラスの形成の間に、酸化物自体を与えてもよく、又は分解して酸化物を形成する化合物を与えてもよい。従って、低酸素模倣イオンの源は、ＣｏＯ、ＣｕＯ、ＭｎＯ、ＮｉＯ、酸化鉄又はそれらの混合物であってもよい。
【００２５】
好都合には、ガラスの組成は、低酸素経路を誘導するのに適切なレベルでの低酸素模倣イオンのインビボ放出を与えるのが好適である。好ましい実施形態において、低酸素刺激イオンはＣｏ又はＣｕである。より好ましくは、低酸素刺激イオンはＣｏイオンである。
【００２６】
好ましい実施形態において、低酸素刺激イオンの源は、０．２〜１０モル％、好ましくは０．５〜５モル％、より好ましくは０．５〜４モル％、さらに好ましくは１〜３モル％又は２〜４モル％で存在する。
【００２７】
高度に崩壊したガラス網状構造（例えば、生物活性ガラス）において、遷移金属イオンは、成核剤としての使用が公知であり、結晶化を生じる。これは、均質性の固有損失を生じて、予測性の欠如を生じる。好都合には、本発明の組成物は、この作用を回避し、それに代わって、遷移金属イオンの制御放出を与えるように調整される。
【００２８】
好都合には、本発明のガラスは、低酸素刺激遷移金属イオンの制御放出を与える。制御可能低酸放出速度は、低酸素経路を調節するのに極めて重要である。多くの遷移金属は栄養要求物であるが、高濃度及び／又は長期間の遷移金属イオンへの暴露において、局所組織において又は全身的に、毒性を生じ得る。例えば、コバルトはビタミンＢ１２の重要成分であるが、高コバルトレベルは、インビトロ及びインビボにおける細胞死に関連付けられている。低酸素経路模倣物への持続的長期局所組織暴露は、慢性炎症及び関連する病変も生じ得る。
【００２９】
低酸素模倣イオンの局所生理的濃度は、ガラス組成、遷移金属型、適用及び標的組織に依存する。ガラスの組成は、制御放出に極めて重要である。特定の組成範囲でのみ、生理的活性であって病理学的範囲でない制御放出が生じ得る。例えば、高架橋ガラスは、低酸素イオン放出を阻止し、一方、高破壊ガラス(highly disrupted glass)は、多すぎる低酸素イオンをあまりにも速く放出し得る。好ましい実施形態において、本発明のガラスは、０．１μＭ〜５００μＭの遷移金属イオンの局所濃度を、０〜３１日間にわたって与えるように配合される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ガラスは下記から形成される：４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント１８〜２５％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜２％ＺｎＯ；０〜２％ＭｇＯ；及び０．１〜１０％（好ましくは０．５〜１０％、より好ましくは０．５〜５％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、骨／硬質−組織用途、例えば、骨再生材料に使用し得る。
【００３１】
他の実施形態において、ガラスは下記から形成される：４９〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；合計モルパーセント１６〜１８％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント１８〜２０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；１〜１０％フッ素源（例えば、ＣａＦ２）；１〜３％ＺｎＯ；１〜３％ＭｇＯ；及び０．１〜５％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、歯周用途に使用し得る。
【００３２】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記を含む：４６〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；８〜４０％ＣａＯ（好ましくは８〜２７％）；０〜１５％ＳｒＯ；５〜７％Ｎａ２Ｏ；４〜７％Ｋ２Ｏ；０〜４％ＺｎＯ（好ましくは２〜４％）；０〜４％ＭｇＯ（好ましくは２〜４％）；０〜９％ＣａＦ２；及び５％以下の低酸素模倣イオン源。好ましくは、ガラスは下記を含む：４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは約１％）；８〜２７％ＣａＯ；３〜１５％ＳｒＯ；約３％ＺｎＯ；約３％ＭｇＯ；及び約２％ＣｏＯ、ＣｕＯ又はＮｉＯ。ガラス内のＺｎＯ、ＭｇＯ、ＣｏＯ、ＳｒＯ及びＰ２Ｏ５の合計モルパーセントは、１〜１２％であってもよい。ガラスは下記から形成してもよい：４６〜５０％ＳｉＯ２（好ましくは４７〜５０％）；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント２０〜２９％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント１２〜１４％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；２〜４％ＺｎＯ；２〜４％ＭｇＯ；０〜９％ＣａＦ２；及び０．１〜５％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。特定の実施形態において、ガラスは下記を含んでもよい：４６〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５；合計モルパーセント３５〜４０％のＣａＯ、ＺｎＯ、ＭｇＯ及びＳｒＯ；５〜７％Ｎａ２Ｏ；及び５〜７％Ｋ２Ｏ。前記ガラス組成物は、好ましくは、骨の多孔質焼結足場を形成するのに使用されるガラスである。従って、好ましい実施形態において、ガラスは、低酸素を模倣するイオンを含む多孔質焼結足場として提供される。そのような足場は、骨の再生及び修復に有用である。
【００３３】
さらに他の好ましい実施形態において、ガラスは下記から形成される：４８〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；合計モルパーセント３０〜４１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント６〜８％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び０．１〜１０％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、複合材料用の充填剤として使用し得る。ガラスは、４〜６％ＺｎＯ及び４〜６％ＭｇＯをさらに含んでもよく、これらの成分が存在する場合、ガラスは非骨複合材料用の充填剤として使用するのに特に適し得る。
【００３４】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記から形成される：４７〜６２％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント１２〜１７％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント１２〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０．８％ＺｎＯ（好ましくは０〜６％、より好ましくは３〜６％）；０．８％ＭｇＯ（好ましくは０〜３％）；及び０．１〜１０％（好ましくは０．５〜５％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、軟質組織用途に使用し得る。
【００３５】
軟質組織用途のために、ガラスは、生物学的に適合性であるが、好ましくは生物活性でない。生物活性を防止する１つの方法は、ＳｉＯ２含有量を、例えば６２％まで（例えば５５〜６２％）に増加することである。アパタイト形成を防止する他の方法は、ＭｇＯ又はＺｎＯ濃度を増加することである。従って、特定の実施形態において、ガラスは４〜８％ＺｎＯ又はＭｇＯを含む。
【００３６】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記から形成し得る：４７〜６２％ＳｉＯ２（好ましくは４７〜５０％）；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント１８〜２１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜６％ＺｎＯ（好ましくは３〜６％）；及び０．１〜５％（好ましくは２〜５％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、脱毛症の治療用のシャンプーに使用し得る。ガラスは、好ましくは、生物活性ガラスである。
【００３７】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記から形成し得る：３０〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１１％）；合計モルパーセント２２〜２８％のＣａＯ及びＳｒＯ（これは、ＣａＯのみ、ＳｒＯのみ、又はそれらの組合せであってもよい）；２２〜２８％Ｎａ２Ｏ；及び０．１〜５％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、ｐＨ安定性であり、従って、ｐＨ変化を最小限にすることが重要な用途、例えば、細胞培養系又はシャンプー、又は局所投与に、特に有用である。局所投与する場合、そのようなガラスは、ＨＩＦ−１経路を介して作用して、向上した創傷修復（真皮〜皮下）を与え得るか、又はシャンプーにおける使用の場合、小胞ＶＥＧＦ発現を増加させることによって脱毛を抑制し得る。
【００３８】
低酸素経路の刺激は、血管新生を刺激するために当分野で一般に使用されている他の方法、即ち、血管形成因子の組換え放出と比較して、多くの利点を有する。本発明のガラスは、組換えタンパク質を組み込んだ材料、ゲル及び足場の使用、又は血管新生を刺激する遺伝子導入法と比較して、有効性及び経済性の両方において、利点を有する。
【００３９】
組換えタンパク質又は遺伝子導入と比較して、本発明のガラスは、比較的「低度技術」の製造法を必要とし、安価な原材料を必要とし、極めて長い貯蔵寿命を有する。さらに、前記ガラスは、遺伝子導入用のベクターの使用に関する安全懸念がない。
【００４０】
好ましい実施形態において、ガラスは、生組織（又は、インビトロにおける細胞／小器官）と接触した場合に、有利な生物学的応答を誘発する。有利な生物学的応答、即ち、低酸素経路の誘導は、低酸素経路調節イオンの放出によって生じる。
【００４１】
本発明のガラスは、生物学的に適合性である。特定の好ましい実施形態において、ガラスは、生物活性ガラスである。他の好ましい実施形態において、ガラス組成物は、生物活性でない（しかし、生体適合性である）。軟質組織において石灰化作用を刺激することは望ましくなく、これは軟質組織用途の既存組成物の主要な欠点である。
【００４２】
シリカ基材ガラスにおいて、ＳｉＯ２は、生物活性ガラスの非晶質網状構造を形成し、ガラスにおけるＳｉＯ２のモルパーセントは、その網状構造結合性（ＮＣ）に影響を与える。ＮＣは、ガラス構造物における網状構造形成要素当たりの平均架橋結合数である。ＮＣは、ガラス特性、例えば、粘性、結晶速度及び分解性を決定する。ＮＣ２．０において、無限モル質量の線状シリケート鎖(linear silicate chains)が存在すると考えられる。ＮＣが２．０未満に低下すると共に、シリケート鎖のモル質量及び長さが急激に減少する。２．０より高いＮＣにおいて、ガラスは３次元網状構造になる。ガラスが分解性及びアパタイト形成可能であるために、ＮＣは２．６未満、より好ましくは２．４未満でなければならない。従って、アパタイト形成が重要な骨への適用のために、生物活性ガラスは、２．６又はそれ以下、好ましくは２．４又はそれ以下の網状構造結合性を有する。ＳｉＯ２含有量を増加して、網状構造結合性を２．６又はそれ以上に増加することは、アパタイト形成能力を減少させるか又は除去し得る。
【００４３】
本発明に関する網状構造結合性は、Hill R. J. Mat. Sci. Letts. 1996 Jul 1;15(13):1122-5に記載されている方法によって計算されるが、リンが分離オルトホスフェート相として存在すると考えられ、ガラス網状構造の一部でないことを前提とする。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明のガラスは、生理的条件下に再吸収性である。従って、本発明は、再吸収性ガラスを含む。本発明の１つの態様は、低酸素模倣溶解性ガラスについて詳述し、それは、輸送中、手術中及び埋め込み後の両方において、組織工学構成物の生存力を維持するのに重要な特定の細胞型において、保護作用を生じる。
【００４５】
好ましい実施形態において、ガラス組成物は、Ｌｉ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂ又はＦの１つ又はそれ以上の供給源を含む。
【００４６】
本発明のガラスは、下記から選択される１つ又はそれ以上の成分を含んでもよい：カルシウム、ホスフェート、マグネシウム、ストロンチウム、亜鉛、ホウ素、フッ素、又はアルカリ金属、例えばナトリウム又はカリウムの源。好ましくは、これらの成分は、下記を含むがそれらに限定されない化合物として与えられる：Ｎａ２Ｏ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＮＯ３、Ｎａ２ＳＯ４、ケイ酸ナトリウム、Ｋ２Ｏ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ケイ酸カリウム、ＣａＯ、ＣａＣＯ３、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４、ケイ酸カルシウム、ＭｇＯ、ＭｇＣＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４、ケイ酸マグネシウム、ＺｎＯ、ＺｎＣＯ３、Ｚｎ（ＮＯ３）２、ＺｎＳＯ４、及びケイ酸亜鉛、ＣｏＯ、ＣＯ２Ｏ３、ＣｏＣＯ３、Ｃｏ（ＮＯ３）２、ＣｏＣｌ２、ＣｏＦ２、ＣｏＳＯ４、ケイ酸コバルト、ＮｉＯ、Ｎｉ２Ｏ３、ＮｉＣＯ３、Ｎｉ（ＮＯ３）２、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＮｉＦ２、ケイ酸ニッケル、ＣｕＯ、ＣｕＣＯ３、Ｃｕ（ＮＯ３）２、ＣｕＣｌ２、ＣｕＦ２、ＣｕＳＯ４、ケイ酸銅、及び分解して酸化物を形成する任意のそのような化合物。
【００４７】
本発明のガラスが特定の成分から形成されるか又はそれらを含むと先に記載されている場合、ガラスは、これらの成分から形成されているが、付加的成分もガラス網状構造内に存在し得ることが認識される。しかし、本発明は、付加的成分がガラス網状構造に存在しない、本明細書に記載されているガラス組成を有するガラス、即ち、記載されている成分「から本質的になる」ガラスも含む。例えば、本発明のガラスは、アルミニウム不含であってもよい。ガラスは、銀等のような成分を含有しなくてもよい。
【００４８】
ガラスの成分の正確なモルパーセントは、ガラスの物理的及び生物学的特性に影響を与えることが認識される。ガラスの種々の使用は、種々の特性を必要とし、従って、各成分のモルパーセントを調節することによって、ガラスの特性を特定の意図する使用に合わせて調整し得る。例えば、ガラスの化学組成を、特定用途に合わせて調整することができ、例えば、Ｓｉ、Ｚｎ及び／又はＭｇ濃度を増加することによって、非骨用途のためにアパタイト形成能力を減少又は除去することができる。さらに、低酸素応答は全ての細胞に遍在するが、応答の型は細胞特異的であり、標的組織の構造的及び機械的特性に合わせて調整されたガラスの形成を可能にする。
【００４９】
好ましい実施形態において、ガラスは、カルシウム源を含む。本発明の目的のために、カルシウム源は、カルシウムオキシド、又は分解してカルシウムオキシドを形成する任意の化合物を含む。ガラスにおけるカルシウム源の存在は、ガラス表面からのＣａ２＋イオンの放出を生じ、これは、ガラス表面におけるカルシウムホスフェート豊富層の形成を助け、形成速度を増加させる。この層の形成は骨組織の生成における重要段階であり、従って、カルシウムを含む生物活性ガラスは、骨組織修復及び再生の促進に使用するのに特に好適である。体液自体がカルシウムイオンを含有しているので、カルシウムホスフェート豊富層は、生物活性ガラスによるカルシウムイオンの供給なしに形成できることを認識すべきである。従って、本発明の目的のために、カルシウムを含有しない生物活性ガラスを使用することができる。好ましくは、Ｃａ源（例えばＣａＯ）のモルパーセントは、０％〜４５％、より好ましくは１０％〜４０％である。
【００５０】
本発明のガラスは、Ｐ２Ｏ５を含む。体液自体がホスフェートイオンを含有しているので、ヒドロキシカーボネート化アパタイトは、活性ガラスによるホスフェートイオンの供給なしに形成できるが、生物活性ガラスによるホスフェートイオンの供給は、ヒドロキシカーボネート化アパタイトの形成速度を増加させる。さらに、Ｐ２Ｏ５の供給は、ガラスの粘度−温度依存性に有利な作用を有し、ガラスの製造及び形成に有利な使用温度範囲を増加させる。
【００５１】
本発明のガラスは、好ましくは、下記を含むがそれらに限定されないマグネシウム源を含む：ＭｇＯ、ＭｇＣＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４、ケイ酸マグネシウム、及び分解してマグネシウムオキシドを形成する任意のそのような化合物。マグネシウムイオンは、形成されるヒドロキシカーボネート化アパタイト結晶の大きさを減少させ、熱膨張率を減少させる。それにより、減少したアパタイト結晶の大きさは脆性骨の形成を減少させる。好ましくは、ＭｇＯのモルパーセントは、０％〜１２％、より好ましくは０％〜１０％である。マグネシウムの一部又は全部を、マグネシウムオキシドとして与えることができる。
【００５２】
亜鉛イオンの含有（ＺｎＯのモルパーセントは０％〜５％である）も、形成されるヒドロキシカーボネート化アパタイト結晶の大きさを減少させ、熱膨張率を減少させる。熱膨膨張率を減少させることは、ガラスをコーティングとして使用する場合に、有利である。ガラスは、骨折部、又は骨の損傷領域に導入することができる。従って、本発明のガラスは、下記を含むがそれらに限定されない亜鉛源から形成し得る：ＺｎＯ、ＺｎＣＯ３、Ｚｎ（ＮＯ３）２、ＺｎＳＯ４、及びケイ酸亜鉛、並びに分解して酸化亜鉛を形成する任意のそのような化合物。好ましくは、亜鉛源のモルパーセント（ＺｎＯとして測定）は、０〜１０％である。亜鉛源を含むガラスは、創傷治癒、幹細胞分化の指向、及び軟骨組織修復のような用途において、軟質組織の修復及び再生を促進するのに特に有用である。本発明のガラスへの亜鉛の組込みは、創傷治癒を促進し、罹患又は損傷組織の再生を助ける。理論に縛られるわけではないが、研究により、特定組成物における亜鉛イオン源（ＺｎＯ）の４％〜５％モルパーセントより高い含有は、アパタイト形成を阻害することが示されており、これは非骨用途に好ましい。研究により、ＺｎＯ含有量が４％〜５％ＺｎＯモルパーセントより高く増加すると共に、ガラスにおけるその役割が、網状構造調節剤から中間体酸化物に変化し、それによってより安定なガラス構造を形成し、アパタイト形成に必要なイオン交換を防止することが示されている。従って、好ましい実施形態において、本発明は、亜鉛イオン源を５％より高いモルパーセントで含むガラスを提供する。このガラスは、特に軟質組織用途に使用される。
【００５３】
同様に、高ＭｇＯ含有量を使用して、生物活性をノックアウトし、軟質組織用途に好適なガラスを提供することができる。例えば、ＣａＯ及びＳｒＯを、ＭｇＯ及び／又はＺｎＯで置き換えて、生物活性をノックアウトすることができる。Ｚｎ２＋及びＭｇ２＋はガラスのＮＣを増加させ、ガラス分解／溶解を減少させることによって作用する。Ｚｎ２＋及びＭｇ２＋は、さらに、アパタイト結晶格子における面をブロックし、アパタイトの結晶成長を阻害し得る。
【００５４】
他の好ましい実施形態において、本発明のガラスは、ホウ素源を、好ましくはＢ２Ｏ３として含む。Ｐ２Ｏ５の場合と同様に、Ｂ２Ｏ３は、ガラスの粘度−温度依存性に有利な作用を有し、ガラスの製造及び形成に有利な使用温度範囲を増加させると考えられる。Ｂ２Ｏ３は、さらに、生物活性ガラスのガラス転移温度と結晶化開始温度との間の作業ウインドの大きさを増加して、結晶化を伴わないガラス粉末の焼結を可能にすると考えられる。生物活性ガラスにおける結晶の形成はその生物活性を一般に減少させるので、これは有利である。好ましくは、Ｂ２Ｏ３のモルパーセントは０％〜１５％である。より好ましくは、Ｂ２Ｏ３のモルパーセントは０％〜１２％である。
【００５５】
本発明のガラスは、好ましくは、フッ素源（好ましくは１つ又はそれ以上のＣａＦ２、ＳｒＦ２、ＭｇＦ２、ＮａＦ又はＫＦの形態）を含む。フルオリドは、骨芽細胞を刺激し、ヒドロキシカーボネート化アパタイト付着の速度を増加させる。フルオリド及びストロンチウムは、これに関して相乗的に作用する。フルオリドは、さらに、アパタイト格子におけるヒドロキシルイオンと容易に置き換わることによって、自然生物形態により高い類似性を有するより混合型のアパタイト構造の形成を促進する。混合アパタイトは、より熱力学的安定性であり、従って、より低い溶解性及びより低い再吸収性である。フルオリドは、生物活性ガラスの融解温度を低下させるために使用することもできる。好ましくは、フッ素は、０％〜５０％、より好ましくは０％〜２５％のモルパーセントで与えられる。好ましくは、フッ素源（好ましくはＣａＦ２）は、０％〜１０％、又は１％〜７％のモルパーセントで与えられる。好ましくは、少なくとも１％で存在する。
【００５６】
本明細書に記載されているガラスのいくつかの好ましい実施形態において、ＳｉＯ２、Ｐ２Ｏ５及びＢ２Ｏ５の合計モルパーセントは、８０％を超えない。
【００５７】
さらに、本発明のガラスにおけるＳｒＯ、ＣａＯ、ＭｇＯ、Ｎａ２Ｏ及びＫ２Ｏの合計モルパーセントは、４０〜６０％であってもよい。
【００５８】
ガラスは、その意図する使用に依存して、粒子形態において、３Ｄ構造として、又は固形物、例えばディスク又はモノリスとして提供し得る。特に、ガラスは、任意の必要とされる形又は形態において、例えば、ペレット、シート、ディスク、フォーム等として、提供できる。粒子形態において、好ましい粒度は、前記生物活性ガラスの用途に依存するが、好ましい粒度範囲は、１２００ミクロン未満、好ましくは１〜１０００ミクロン、より好ましくは５０〜８００ミクロン、より好ましくは１００〜７００ミクロンである。必要とされる粒度の範囲は、ガラスの用途及び生物活性に依存する。例えば、複合材料又は焼結ガラス用の充填剤は、４５ミクロン又はそれ以下の粒度で提供される。粒子形態、例えば粉末において、ガラスを、セメント、ペースト又は複合材料に含有し得る。アクリル、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルメタクリレート（Ｂｉｓ ＧＭＡ）及びポリアクチドを含むがそれらに限定されない物質に、ガラスを含有し得る（例えば充填剤として）。被覆剤を形成するか、又は足場として使用される多孔質固形物を形成するために、ガラス粉末を焼結してもよい。さらに、ガラスを、分解性ポリマー足場に組み込んでもよい。ガラスは、グラニュールの形態であってもよい。
【００５９】
本発明のガラスは、ゲルキャストフォーミング法を使用して、多孔質低酸素経路調節足場を形成するためにも使用し得る。このゲルキャスト法は、低酸素刺激生体適合性多孔質足場の製造を可能にする。この足場は独特の性質を有し、それにより、前記足場は、３次元での骨成長用のテンプレートとして機能し、支持部位における骨再生に適した機械的特性を有し、制御速度で分解でき、生物活性を与えるためにカルシウムイオン源を含有し、血管成長を刺激することができ、骨成長を刺激することができ、工業生産及び臨床用に滅菌することができる。ゲルキャストフォーミング法は、界面活性剤を使用するガラス粒子スラリーの発泡、及びゲル化剤のインサイチュ重合を含む。次に、ゲル化フォームを、ゲル化の直前に鋳型に注ぎ、熱処理して、ポリマーを除去し、ガラス粒子を焼結する。従って、本発明のガラスは、低酸素を模倣するイオンを含む多孔質焼結足場として提供でき、従って、本発明は、本発明の第一態様のガラスを含む多孔質焼結足場を含む。好ましい実施形態において、本発明は、濃度勾配の低酸素模倣イオンを含有する多孔質生物活性足場を提供する。そのような足場は、溶融誘導多孔質足場の直接レーザー焼結及び多層焼結によって形成できる。これらのイオン放出勾配は、天然インビボ低酸素勾配を模倣し、それによって、細胞移動及び漸増のための細胞シグナル伝達濃度勾配を模倣する。
【００６０】
ガラスは、好ましくは、溶融誘導ガラスとして提供される。溶融誘導ガラスは、公知の方法でさらに焼結することができる。溶融誘導ガラスは、好ましくは、適切なカーボネート又は酸化物の粒子を混合及びブレンドし、約１２５０℃〜１５００℃の温度で混合物を溶融し均質化することによって製造される。均質化は、好ましくは、酸素バブリングによって行なわれる。次に、混合物を、好ましくは、好適な液体、例えば脱イオン水への溶融混合物のキャスティングによって冷却して、ガラスフリットを製造する。
【００６１】
ガラスの化学組成及び形態は、用途に依存する。低酸素経路調節生物活性ガラスは、粒子形態において、前記形態のモノリス、３Ｄ多孔質足場、繊維及び／又は被覆剤として、又は埋め込み材料、組織再生構造物及び創傷治癒デバイス、例えば、組織工学足場、縫合糸、プロテーゼインプラント、ポリマーマトリックス、フィブリンゲル、ヒドロゲル、プラスター、創傷被覆材、クリーム、シャンプー等の中又は上に組み込まれた低酸素模倣ガラスとして使用できる。低酸素刺激ガラス組成物は、インビトロ及びエクスビトロ細胞培養に使用されるデバイスにも使用できる。さらに、ガラスは、インビボでの細胞の治療使用の前に、インビトロで特定の細胞応答を誘発するのに使用し得る。
【００６２】
本発明のガラスを、他の材料、例えば、ヒドロゲル、ゲル、クリーム、足場及び／又はポリマー複合材料に組み込むことができる。他の材料へのガラスの組込みは、多くの再生医療用途のためにガラスイオン放出特性を利用することを可能にする。
【００６３】
ヒドロゲルは、水溶性ポリマーの架橋によって得られ、例えば、架橋ポリアクリルアミドゲル又はポリサッカリドゲルが特に好ましい。好ましいポリサッカリドヒドロゲルは、アルギネート、カラギーナン、アガー及びアガロ−スを含み；他のポリサッカリド、例えば、カードラン、プルラン、ゲラン等も、ヒドロゲル形成成分として有用である。
【００６４】
他の好ましい実施形態において、ガラスは、局所適用用の組成物として提供され、例えば、創傷又は火傷を治療するために、皮膚移植における使用のために提供され、その場合、組成物はドナー組織の適用前に移植部位に適用されるか又はドナー組織自体に適用され、又は手術における使用のために、創傷治癒を促進する間に手術部位における術後浮腫及び感染を最小限にするために手術部位に適用される。
【００６５】
本発明の組成物は、ガラス粒子の形態のガラスを含んでもよい。ガラス粒子は、単独で、又は、下記の物質を含むがそれらに限定されない他の物質と組み合わせて、提供し得る：抗生物質、例えば、エリスロマイシン及びテトラサイクリン、抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル及びガンシクロビル、治癒促進剤、抗炎症剤、例えば、コルチコステロイド及びヒドロコルチゾン、免疫抑制剤、成長因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子、抗代謝剤、細胞接着分子、骨形成タンパク質、血管新生化剤、抗凝固剤及び局所麻酔剤、例えば、ベンゾカイン及びリドカイン。
【００６６】
第二の態様において、本発明は、医療における使用、好ましくは、組織損傷の予防及び／治療における使用のための前記ガラスを提供する。本発明の目的のために、組織は、骨組織、皮膚、軟骨、軟質組織（結合組織を含む）、及び歯組織（石灰化歯組織、例えば、エナメル質及び象牙質を含む）であってもよい。組織は、動物組織、より好ましくは哺乳類又はヒト組織であってもよい。
【００６７】
好ましい実施形態において、ガラスは、血管新生又はリンパ管新生の誘発、抗細菌活性の促進、又は細胞生存力の維持に使用するために提供される。
【００６８】
本明細書全体を通して、予防及び／又は治療は、任意の損傷又は任意の医学的障害を任意の程度に緩和する任意の作用を意味し、損傷自体の予防及び治療、並びに損傷の制御も含む。「治療」という用語は、障害、疾患、症候群、症状、疼痛、又は１つ若しくはそれ以上のそれらの組合せの任意の改善を意味する。「制御」という用語は、必ずしも症状を改善させないが、疾患の進行を止めることによって症状が増悪又は悪化するのを防止することを意味する。「予防」という用語は、症状が起こらないようにするか、又は症状の開始を遅らせるか、又は症状の開始の重篤度を減少させることを意味する。
【００６９】
特に、予防及び／又は治療という用語は、組織の修復及び／又は再構成を含む。本発明の目的のために、「修復」という用語は、例えば生物学的過程のインビボ刺激によって、組織を正常作動可能状態に回復することを意味する。「再構成」という用語は、組織の再建を意味し、外部成分、例えば、足場、模型等の組織への一時的又は永久的組込みを含む。
【００７０】
本発明の目的のために、損傷は、機械的損傷であってもよく、外部物質によって生じてもよく、又は内部生物学的過程の結果であってもよい。機械的損傷の例は、外傷、手術、加齢性摩耗等によって生じた損傷である。外部物質によって生じた損傷の例は、下記の損傷である：薬剤、毒素又は治療法（例えば、化学療法又は放射線療法）、例えば透析関連アミロイドーシスによって生じた損傷；疾患、例えば、細菌、ウイルス又は真菌感染症、例えば骨髄炎、遺伝子疾患、例えば骨形成不全及び低ホスファターゼ症、不適栄養、加齢性障害、変性障害又は症状、例えば、骨粗鬆症及び骨癌（骨肉腫及びユーイング肉腫を含む）によって生じた損傷。内部生物学的過程の結果として生じた損傷の例は、自己免疫疾患である。特に、組織の損傷は、骨関節症、歯周病等によって生じたものであってよく、又はその結果であってもよい。
【００７１】
生物活性ガラスを組織に組み込まずに、組織修復の開始及び／又は刺激によって損傷を予防及び／又は治療するために、ガラスを提供し得る。代替的に又は付加的に、ガラスを組織に組み込んでもよく、そのようなガラスの組込みは組織の再形成を可能にする。組織への生物活性ガラスの組込みは、永久的又は一次的であってもよい。
【００７２】
好ましい実施形態において、ガラスは、軟質組織再生を促進することによる創傷修復に使用される。急性組織傷害の直後に、創傷の微環境は低酸素である。慢性創傷は、不充分な血管形成の結果である。創傷治癒における血管新生の重要性は、創傷治癒を遅らせる血管新生阻害剤（例えば、エンドスタチン）の使用において、及び局所ＶＥＧＦ治療がこの作用を阻止するのに有効であることにおいて、明らかに示されている。興味深いことに、高齢患者における潰瘍及び慢性創傷の数の増加は、低酸素細胞応答の減少と関連付けられている。
【００７３】
従って、他の好ましい実施形態において、ガラスは、潰瘍（例えば、糖尿病性下肢潰瘍）の治療における使用のために提供される。
【００７４】
さらに他の好ましい実施形態において、ガラスは、骨及び硬質組織の再生及び修復を促進するために使用される。骨形成における血管新生の重要性は、長年にわたり認識されている。血管は、栄養、成長因子、前骨芽細胞、並びにインビボでの骨形成及び骨維持に不可欠な他の因子を供給する。強力な血管新生因子ＶＥＧＦの骨芽細胞遺伝子発現の増加が、骨折修復の間に生じ、インビボの骨損傷部位におけるＶＥＧＦの局所低速放出は、骨修復及び骨統合の増強を生じる。ＶＥＧＦは、骨芽細胞の分化及び移動を刺激することによって、骨リモデリングに直接的役割を有することも示されている。
【００７５】
骨又は硬質組織の再生及び修復を促進するのに使用するために、ガラスは、好ましくは、粉末又はモノリスの形態（多孔質足場を含む）で提供され、骨自己移植片の代わりに使用されるか、又は骨自己移植物質と混合される。骨自己移植は、患者から取った健康な骨を、破損骨の間又はまわりのスペースに配置する（骨折）か、又は骨の中に保持する（欠損）。移植に使用可能な骨ストックの限定量により、これは有利である。
【００７６】
好ましい実施形態において、ガラスは、脊椎形成術に使用される。ガラスを、ポリマー又はセメントに組み込み、最小侵襲手術によって脊椎スペースに注入して、骨粗鬆症骨折、及び骨粗鬆症に関連し脊柱湾曲を生じる脊椎崩壊を予防し得る。
【００７７】
さらに他の好ましい実施形態において、ガラスは、感染症の治療に使用される。好都合にも、特定の抗微生物剤に見られる細胞毒性作用が、本発明のガラスの使用によって避けられる。例えば、銀イオンは抗微生物剤として作用し得るが、特定の濃度は、細胞毒性作用を有し、創傷治癒を遅らせる。低酸素経路による「自己回復」過程の活性化（例えば、免疫細胞漸増の促進、及びマクロファージ貪食活性の増強）は、抗微生物特性を増強する代替的方法である。
【００７８】
他の好ましい実施形態において、ガラスは、細胞保護特性の増強に使用され、細胞損傷を制限し、修復細胞（成体幹細胞）を漸増させる。これは、虚血傷害（例えば、心筋梗塞）後のインビボでの重要な生存機構となり得る。特定細胞型における保護作用は、輸送中、手術中及び埋め込み後の両方において、組織工学構成物の生存力を維持するのにも有用である。
【００７９】
好ましい実施形態において、ガラスは、軟骨修復、再構成及び再生に使用される。軟骨は、限られた自己修復能力を有し、従って、組織工学は、軟骨再生において極めて有望である。しかし、軟骨細胞表現型（即ち、それらの軟骨生成能力）の維持は、インビトロにおいて、困難であることが示されている。従って、軟骨ＥＣＭを模倣し、軟骨細胞表現型を維持する環境キューを含有する組織足場を開発する必要がある。３Ｄ環境を提供するのに加えて、低酸素を模倣する足場の開発は、天然軟骨に存在する低酸素レベルに類似した環境キューを与え、それによって軟骨細胞表現型を維持し、軟骨ＴＥを促進し得る。実際に、低酸素環境において３Ｄ足場に増殖する一次軟骨細胞が、それらの表現型を維持することが示されている。さらに、ＨＩＦ−１α、マスター低酸素感受転写因子は、骨端軟骨細胞形成、軟骨細胞生存、軟骨細胞の再分化、及び軟骨細胞前駆体の分化に極めて重要である。
【００８０】
好ましい実施形態において、ガラスは、指向幹細胞分化を誘導するために使用される。低酸素は、幹細胞の可塑性、増殖及び／又はより特殊化した細胞への分化を維持することにおいて、重要なレギュレータであることが示されている。低酸素応答を調節する３Ｄ足場の開発は、「幹細胞性」及び指向分化の維持についての基礎的研究を可能にし、知識を深める。低酸素は、デノボ血液形成のための血管芽細胞（循環内皮細胞前駆体）、ＭＳＣ及び神経細胞の分化を刺激することが公知である。例えば、虚血傷害への応答において、先に移植され、統合された、静止クローン神経幹細胞が、細胞周期に再び入り、低酸素部位に優先的に移動し、神経細胞及び乏突起膠細胞（虚血性脳傷害後に一般に破壊する細胞型）に分化する。インビボでのＴＥ構成物への成体幹細胞の漸増及び増殖は、組織修復、発達及び統合を大いに増強させる。好ましくは、ガラスは足場として提供される。
【００８１】
他の実施形態において、ガラスは、発毛の促進、及び／又は髪の太さの増加、例えば、脱毛症、加齢によるか又は化学療法の結果としての髪減少の治療のために使用される。本発明のガラスによって放出される遷移金属イオンの低酸素模擬作用によって刺激される細胞機構の１つである血管新生は、発毛及び小胞の大きさを調節し得る。従って、ガラスは、シャンプーの形態で提供し得る。
【００８２】
他の実施形態において、本発明のガラスは、分解性ポリマー、例えばポリエステルにおいて、充填剤として提供できる。特に、ガラスは、ポリラクチドにおける充填剤として提供できる。それにより、生物活性ガラスは、骨スクリュー、骨折固定板、多孔質足場等に、生物活性成分を与えることができる。本発明のガラスの使用は、生物活性ガラスが当分野で現在公知のポリエステルの特徴である自己触媒的分解を防止するので、分解性ポリエステルにおける充填剤として使用するのに特に好都合である。エステルの加水分解がアルコール及び酸の形成を生じるので、自己触媒的分解が起こる。エステルの加水分解は酸触媒されるので、酸の生成は、正のフィードバック状況を生じる。
【００８３】
本発明のガラスは、任意の従来法によって投与し得る。ガラスは局所的に投与し得る。局所適用の例は、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、散剤、ゲル剤又はペースト剤の体、例えば、歯又は皮膚への投与である。特に、虫歯、歯周病、歯の知覚過敏症等の患者の歯に投与するためのガラスを含む練り歯磨きとして、ガラスを提供できる。
【００８４】
ガラスは、外科的又は非経口的に投与し得る。外科的また非経口的投与の例は、注射によるデバイスの挿入によるか、又は外科的方法、例えば、埋め込み、組織置換、組織再構成等による、組織へのガラスの投与である。
【００８５】
ガラスは、経口的に投与することもできる。経口投与のために、組成物を、液体又は固体、例えば、液剤、シロップ剤、懸濁剤又は乳濁剤、錠剤、カプセル剤及びロゼンジ剤として、配合することができる。経口又は非経口投与によるガラスの投与は、ガラスを、その作用を必要とする部位に直接的に与え得る。あるいは、例えば全身循環を使用して、ガラスをその作用部位に送達することもできる。ガラスを、例えば、消化管損傷の予防及び／又は治療を必要とする患者に、経口的に投与することができる。
【００８６】
組成物は、粒子、三次元足場、モノリス、被覆物及び／又は繊維等の形態で使用することができ、例えば、下記のために使用できる：血管新生（新しい血管の形成）の刺激；リンパ管新生（新しいリンパ管の形成）の刺激；抗微生物目的；並びに、細胞の増殖及び前駆／幹細胞の分化の指向。これらの特性を、例えば、下記のために使用できる：創傷治癒の増強；感染の阻止；骨成長の刺激；毛包成長の刺激；軟骨組織の再生；及び、他の治療又は美容目的。低酸素経路調節ガラスを、下記の中又は上に組み込むことができる；埋め込み物質、組織再生構成物及び創傷治癒デバイス、例えば、組織足場、縫合糸、プロテーゼインプラント、ポリマーマトリックス、フィブリンゲル、ヒドロゲル、プラスター、創傷被覆材、クリーム剤、シャンプー、エーロゾル剤等。低酸素刺激ガラス組成物は、インビトロ及びエクスビトロ細胞培養に使用されるデバイスにも使用できる。
【００８７】
本発明の各態様の全ての好ましい特徴は、必要な変更を加えて、全ての他の態様に適用される。本発明の種々の実施形態が、組み合わせて存在し得ることも認識される。
【００８８】
本発明は種々の方法で実施でき、多くの特定の実施形態が、添付の図面を参考にして、本発明を説明するために例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】一系列のコバルト含有ガラスからのイオン放出の誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分析の結果を示す：ａ）（上部トレース）ガラス実施例１〜４；ｂ）（下部トレース）ガラス実施例５〜７。
【図２】誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分析による、時間の経過に伴う、トリス緩衝液中の一系列のコバルト含有ガラス（実施例１〜４）からの制御化学組成依存性コバルトイオン放出を示す。
【図３】トリス緩衝液中で３０分間インキュベーション後に、一系列の銅含有ガラス（実施例１〜４、ＣｏをＣｕに置き換えた）から放出されたＣｕ、Ｎａ及びＣａのＩＣＰ分析の結果を示す。
【図４】トリス緩衝液中で３０分間インキュベーション後に、一系列のコバルト含有ガラス（実施例１〜４）から放出されたＣｏ、Ｎａ及びＣａのＩＣＰ分析の結果を示す。
【図５】トリス緩衝液中で３０分間インキュベーション後に、Ｐの増加モル％濃度を有する一系列のコバルト含有ガラス（実施例１３〜１６）から放出されたＰ、Ｃｏ、Ｓｉ及びＣａのＩＣＰ分析の結果を示す。
【図６】蒸留水中、種々の低酸素模倣ガラス（実施例３及び１３〜１５）によって生じたｐＨ変化を示す。
【図７】特定のコバルト含有ガラス組成物（実施例１〜４）の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。
【図８】低酸素模倣ガラスの実施例（組成実施例１〜４、３４、４４及び４５）のＸＲＤトレースを示す。
【図９】コバルト含有ガラス（実施例１〜４及び５〜７）の２９Ｓｉ ＭＡＳ−ＮＭＲ（マジック角度回転−核磁気共鳴）を示す。
【図１０】ゲルキャストフォーミング法を使用して製造した多孔質低酸素生物活性ガラス足場（実施例２４）のＳＥＭ画像を示す。
【図１１】模擬体液（ＳＢＦ）中で３週間インキュベートした種々の組成の低酸素模倣生物活性ガラスのラマンスペクトルを示す。アパタイト（ＰＯ４３− ９６０ｃｍ−１）形成が、これらの全ての特定低酸素模倣生物活性ガラス組成物（実施例１〜４、３４、４４及び４５）に存在したことを示す。
【図１２】図１２ａは、転写因子ＨＩＦ−１α発現を示し（縦軸は、［ＨＩＦ−１α］／［Ｃｙｔ．Ｃ］である）、図１２ｂは、転写因子ＨＩＦ−１α安定化を示し、両方とも、種々の濃度のコバルトイオンを含有するガラス（ＢＧ）（０〜４モル％、実施例１〜４）で４８時間条件付けした培地での細胞培養実験において観測した。
【図１３】種々の低酸素模倣生物活性ガラス（実施例１〜４、３４、４４及び４５）で条件付けした培地中で４８時間及び７日間についての骨芽細胞培養物の生存力（合計ＤＮＡ）を示す（Ｚｎ又はＭｇ含有量が示されているガラスの場合、２％ＣｏＯも存在する）。
【図１４】（ａ）コバルト含有するガラス（実施例３）及びコバルトを含有しないガラスに、種々の濃度において、２４時間暴露させた骨芽細胞（ＭＧ６３）細胞培養物において観測されたＶＥＧＦ発現；及び、（ｂ）これらの培養物において観測された代謝活性。
【図１５】下記において観測されたＶＥＧＦ発現を示す：種々の低酸素模倣生物活性ガラス（０〜４モルＣｏ％、実施例１〜４）で条件付けした培地中で２４時間培養した、（ａ）内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）、及び（ｂ）骨芽細胞（ＳａＯＳ−２）。
【図１６】低酸素模倣ガラス（２％Ｃｏ実施例３）に暴露した場合の非付着性単核細胞の付着性マクロファージ様細胞への分化を示す。
【図１７】図１７ａは、４日間の内皮（ＨＭＥＣ−１）細胞培養後のゲルキャストフォーミング法を使用して製造した多孔質低酸素生物活性ガラス足場（実施例２７）のＥＤＸ画像を示す。図１７ｂは、４日間の培養後のゲルキャスト足場で培養したＨＭＥＣ−１細胞の相対代謝活性を示す（低酸素イオンを含有しない対照に標準化）。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本明細書に使用されている用語の意味を下記に説明し、１つ又はそれ以上の下記の非限定的実施例に関して、本発明をさらに説明する。
【００９１】
本発明に関して、ガラスは生物活性ガラスであり、生体組織に埋め込んだ場合、それはガラスと周囲組織との界面結合の形成を誘導する。生物活性のインビトロ指数は、ガラス表面における、ヒドロキシカーボネート化アパタイト（ＨＣＡ）層の成長速度によって得られる。特定の好ましい実施形態において、生物活性ガラスは、刺激体液（ＳＢＦ）へのガラスの暴露時に、結晶性ＨＣＡ層の付着が３日以内、より好ましくは２４時間以内に起こる生物活性ガラスである。ＳＢＦに暴露した際のＨＣＡ層の付着（Kokubo T., J. Biomed. Mater. Res. 1990;24;721-735に記載されている）は、生物活性の認定試験である。
【００９２】
モルパーセントにおける例示ガラス組成
本発明の特定ガラス組成物を、下記の表に示す。多くのこれらのガラスについて行なった分析を、以下の実施例に記載する。
【００９３】
これらのガラスは、溶融誘導ガラス製造法によって製造することができ、前記方法は下記を含む：適切な酸化物（又は酸化物源、例えばカーボネート）を混合しブレンドし、混合物を約１２５０〜１５００℃の温度で均質化し（例えば、酸素バブリングによる）、混合物を冷却して（例えば、溶融混合物を好適な液体、例えば水に入れることによる）、ガラスフリットを得る。分子量及び下記の表に示されているモル％組成物に基づく標準計算を使用して、ガラス溶融混合物に必要とされる各成分の質量を求めることができる。従って、溶融混合物に使用される種々の酸化物（又は酸化物源）の適切量は、下記の表に示されている数値に基づいて算出できる。例えば、ガラス実施例２６は、４６．５３％ＳｉＯ２、２７．２７％ＣａＣＯ３、６．４７％Ｎａ２ＣＯ３、６．４７％Ｋ２ＣＯ３、２．９４％ＺｎＯ、２．９４％ＭｇＯ、１．９６％ＣｏＣＯ２、２．９４％ＳｒＣＯ３及び１．０５％Ｐ２Ｏ５を混合することによって製造できる。
【表１】
【表２】
【表３】
【００９４】
裏付け実験データ
低酸素模倣イオンは、本発明の再吸収性ガラスのシリカ網状構造に首尾よく組み込まれた。前記表に示されている本発明のガラス組成物は、ＩＣＰ、ｐＨ、ＤＳＣ、Ｘ線回折、ＮＭＲ及びＳＥＭ分析によって特性決定された。ガラスの組成及び製造が首尾よく操作されて、生理的関連範囲における低酸素模倣物の制御放出を可能にした。さらに、低酸素模倣物の制御放出に加えて、他のイオンの放出を制御するようにガラスの化学組成を開発した（これらは、生物学的応答（例えば、アパタイト形成又は細胞挙動）を決定するのに重要である）。これらのガラスの開発、組成及び特性決定が、本明細書に詳しく記載されている。
【００９５】
低酸素模倣ガラスからの溶解生成物（低酸素模倣イオン）は、転写因子低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を、正常酸素圧力環境において（図１２）、毒性を有さずに（図１３及び１４）安定化し、ＨＩＦ−標的遺伝子、例えばＶＥＧＦの転写を誘導し（図１４及び１５）、細胞分化を生じた（図１６）。本発明の低酸素模倣ガラスに対する、種々の細胞型の細胞応答を試験した（ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞（ＳａＯＳ−２及びＭＧ６３）、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び単核細胞（Ｕ９３７）を含む）。例えば、ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞（ＳａＯＳ−２）を、ＲＰＭＩ培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質を含有）において培養し、低酸素イオン含有ガラス条件付け培地又は対照ガラス条件培地を有する４８ウェルプレートに接種した（５０，０００／ｃｍ２）。細胞はさらに、ゲルキャストフォーミング法によって製造した本発明のガラスから形成された３Ｄ足場に直接的に首尾よく成長した（ガラス２７、図１７）。
【００９６】
従って、実験研究は、下記の実現可能性を確認した：低酸素イオン（例えばＣｏイオン）を含有する生物活性ガラス網状構造の形成；低酸素イオン放出速度の制御；及び、細胞毒性を有さない所望の細胞応答の発生、即ち、ＨＩＦ−１α経路の活性化（図１２）及び関連再生応答、例えば、強力血管新生因子ＶＥＧＦの発現増加（図１４及び１５）。例えば、いくつかの実験において、コバルト生物活性ガラス条件付け培地は、たった２４時間後に、毒性を有さずに、ＶＥＧＦ産生の濃度依存性６倍増加（ｐ＜０．０１）を誘導することが示された。
【００９７】
図１及び２は、時間の経過に伴うイオン放出の誘導結合プラズマ分析（ＩＣＰ）を示す。ガラスの組成は、（低酸素模倣）コバルトイオン放出速度を決定し、それによって、予測低酸素模倣放出プロフィールを可能にする。放出プロフィールは、本発明によって決定される製造及びガラス化学組成範囲に依存する。図１ａ及び２における低酸素調節生物活性ガラスの組成物系列は、ガラス実施例１〜４として列挙され、図１ｂにおける帯電平衡ガラス系列の組成物は、ガラス実施例５〜７として列挙される。本明細書に記載されている全ての実験における対照ガラス（０％Ｃｏ）は、ＳｉＯ２（４９．４６モル％）、Ｐ２Ｏ５（１．０７モル％）、ＣａＯ（２３．０８モル％）及びＮａ２Ｏ（２６．３８モル％）からなる。組成物が一定の網状構造結合性を維持するように構成された場合（ＮＣ＝２．１３（図１ｂ））、ガラス内のコバルトのモル％と放出との間に線形相関（０．９９回帰）が存在し、一方、網状構造結合性が増加する場合（図１ａ）、非線形多項相関が存在する。これらの低酸素調節生物活性ガラスの組成物は、公知の生理活性範囲内（４８μＭ〜２４０μＭ）でＣｏ２+を放出した。これらのガラスは生物活性であるので（図１３）、それらは、特に、骨組織再生を必要とする用途に有用である（例えば、骨充填剤として又は骨組織工学において、アパタイト形成と共に血管形成を促進することによる）。
【００９８】
図３及び４は、低酸素模倣物（それぞれＣｕ及びＣｏ）の放出が、ガラスの化学組成によって決定されることを示す。さらに、ガラス網状構造内の低酸素模倣物のモル％を増加させることが、ガラスの網状構造を改変し、他のガラスイオン（例えばＮａ）のイオン放出動態を予測的に変化させる。
【００９９】
図５は、ガラス網状構造内のリンのモル％を増加させることは、低酸素模倣物（Ｃｏ２＋）の放出を減少し、一方、Ｓｉ（ガラス網状構造形成剤）放出プロフィールを維持することを示す。従って、これらの特定の化学組成におけるガラスモル％Ｐは、低酸素模倣放出を制御するのに使用できる。高ホスフェートモル％を有する低酸素模倣ガラスを使用して、より低いモル％Ｐ濃度（１．０４％Ｐ）生物活性ガラス（図６）及びＢｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）によって以前に示された生物活性ガラスで観測されるｐＨ変化を減少させることができる。Ｐモル％を増加させることによって利用可能Ｈ＋イオンの数を減少させることを利用して、生物活性（アパタイト形成能力）を操作し、塩基性ｐＨ環境からの任意潜在的細胞毒性を最小限にすることができる。従って、これらのガラスは、ｐＨ変化を最小限にすることが重要な用途（例えば、細胞培養系、シャンプー）に使用し得る。
【０１００】
図７は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。特定ガラス組成物中の増加濃度のコバルトは、意外にも、ガラスの遷移温度を低下させる。ガラス中における網状構造形成剤又は調節剤としてのコバルトの役割は、ガラスの組成及びコバルトの濃度に依存する。ガラス遷移温度の低下は、ＣｏＯがガラス構造に入っていることを示す。
【０１０１】
図８は、本発明のガラスのＸＲＤトレースを示す。非晶質ハロ及び明確なピークの欠如は、物質が焼結後もなお非晶質であったことを示す。結晶質Ｃｏ相の証拠がなく、Ｃｏはガラス構造に組み込まれている。
【０１０２】
図９は、本発明のガラス（低酸素生物活性ガラス）の２９Ｓｉ ＭＡＳ−ＮＭＲ（マジック角度回転−核磁気共鳴）を示す。２９Ｓｉ ＭＡＳ−ＮＭＲは、試料の線幅はコバルト濃度の増加と共に増加する（コバルトの常磁性作用）が、ガラス構造は変化せず、従って、ガラス特性を維持できることを示した。図９ａは、ガラス実施例１〜４のデータを示し、図９ｂは、帯電平衡系列からのガラス（実施例５〜７）のデータを示す。
【０１０３】
図１０は、ゲルキャストフォーミング法（ガラス実施例２７を含有するガラス粒子スラリーの発泡、及びゲル化剤のインサイチュ重合を含む）を使用して製造した多孔質低酸素生物活性ガラス足場のＳＥＭ画像を示す。次に、ゲル化フォームを、ゲル化の直前に鋳型に注ぎ、熱処理して、ポリマーを除去し、ガラス粒子を焼結する。足場から放出される低酸素模倣イオンの制御放出は、血管新生、新機能骨成長及び生存の重要要素を促進する。
【０１０４】
図１１は、特定低酸素模倣生物活性ガラス組成物が、ＳＢＦと共に３週間インキュベートした場合に、アパタイト（ＰＯ４３− ９６０ｃｍ−１）を形成することを示す。形成されるアパタイトの量（９６０ｃｍ−１の領域）、アパタイトピーク（９６０ｃｍ−１）の全幅半値、及びカーボネート（ＣＯ３２＋）／ホスフェート（ＰＯ４３−）比は、化学組成及びＳＢＦインキュベーション期間に依存して変化した。これは、特定の用途に特異的生物活性を有する低酸素模倣ガラスの製造を可能にする。
【０１０５】
細胞培養実験
低酸素模倣ガラスからの溶解生成物の細胞毒性を最小限にしながらＨＩＦ−１αの発現を安定化し組織再生応答を促進する能力を、ＨＩＦ−１α転写因子アッセイ（Ｒ＆Ｄシステム及びＴｒａｎｓＡＭ（商標）Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）免疫蛍光検査法、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ，ＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ）、全ＤＮＡ及びＭＴＴによってそれぞれ測定した。本発明のガラスからの溶解生成物に対する、種々の細胞型の細胞応答を試験した（前記細胞型は、下記を含む：ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞（ＳａＯＳ−２及びＭＧ６３）、ヒト微小血管内皮細胞系−１（ＨＭＥＣ−１）及びヒト単核細胞系（Ｕ９３７））。
【０１０６】
ヒト微小血管内皮細胞系−１（ＨＭＥＣ−１）は、１％ゼラチン（ウシ皮膚、Ｓｉｇｍａ）被覆７５ｃｍ３フラスコ中で、内皮基本培地、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（ＥＧＦ、Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１％抗生物質−抗真菌剤及び５％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＭＣＤＢ−１３１で培養した。ＳａＯＳ−２及びＵ９３７細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。ヒト骨様骨肉腫細胞系ＭＧ−６３（ＥＣＣＡＣ）は、１０％ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補足したＤＭＥＭで培養した。ガラス（ＢＧ）条件培地は、種々の組成のガラス粒子（＜４５μｍ直径）を、２０ｍＬの所望培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＣＤＢ−１３１）中で、３７℃で４時間インキュベーションし、次に、遠心分離し、濾過して粒子を除去することによって形成した。
【０１０７】
図１２ａは、ＨＩＦ−１α発現のＣｏ−ガラス濃度依存性増加を示す。ＨＩＦ−１α発現を、シトクロムｃ（Ｃｙｔ．Ｃ）に標準化した。ＣｏＣｌ２を、ＨＩＦ−１α発現の正の対照として使用した。図１２ｂは、低酸素模倣ガラスが、濃度依存的に（低酸素模倣物のモル％）、ＨＩＦ−１α発現を安定化し（Ｐ＜０．０５）、それによって、核へのそのトランスロケーション及び低酸素関連遺伝子発現を可能にすることを示している。低酸素模倣物を含有しない対照ガラス（０モル％Ｃｏ）からの条件培地において、ＨＩＦ−１α安定化の有意な増加が観測されなかった。
【０１０８】
図１３は、種々の組成の低酸素模倣ガラスからの条件培地において、４８時間又は７日間培養した骨芽細胞（ＳａＯＳ−２）の細胞生存力（ＤＮＡの量）を示す。７日間培養した４モル％Ｃｏ（実施例４）含有低酸素模倣物を除いて、種々の低酸素模倣ガラス組成物は、この培養期間にわたって、全てのガラス組成において、細胞生存力に影響を与えない。これは、コバルトの低酸素ガラスモル％濃度、及び放出プロフィールが、細胞毒性を最小限にするのに重要であることを示す。
【０１０９】
図１４は、低酸素ガラス（実施例３）及び対照ガラス（０％Ｃｏ、４９．４６モル％Ｓｉ、１．０７モル％Ｐ２Ｏ５、２３．０８モル％ＣａＯ及び２６．３８モル％Ｎａ２Ｏ）によって種々の濃度で条件付けした培地での細胞培養実験の結果を示す。たった２４時間の培養後に、骨芽細胞（ＭＧ６３）による、強力血管新生因子ＶＥＧＦの発現の劇的なコバルト−生物活性ガラス濃度依存性増加が観測された（ａ）。並行実験は、低酸素生物活性ガラス特異的毒性がないことを示した（低酸素刺激Ｃｏイオンを含有しない生物活性ガラスとの比較）（ｂ）。コバルト生物活性ガラス条件付け培地は、たった２４時間後に、毒性を伴わずに、ＶＥＧＦ産生の濃度依存性６倍増加を誘導した（ｐ＜０．０１）（図１２）。
【０１１０】
図１５は、増加するＣｏモル％の低酸素生物活性ガラス（ガラス実施例１〜４）で条件付けした培地において４８時間培養後の単核細胞（Ｕ９３７）及び内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）による、強力血管新生因子ＶＥＧＦ発現の劇的かつ濃度依存性の増加を示す。発現されたＶＥＧＦの量は、細胞型及び低酸素ガラス化学組成に特異的である。
【０１１１】
図１６は、低酸素ガラス誘導単核細胞分化を示す。この例において、非付着性非分化Ｕ９３７に対するものとしての分化付着性単核細胞様細胞（Ｕ９３７）の数を、蛍光ＤＡＰＩ染色（ａ）及び代謝活性（ｂ）によって測定した。対照ガラス（３ｇ／２０ｍＬの０％Ｃｏ２＋対照ガラスを３時間インキュベートした）と比較して、低酸素ガラス（ＢＧ）条件培地（０．０３ｇ／２０ｍＬの組成実施例３を３時間インキュベートした）において、有意に増加したＵ９３７分化が生じた。しかし、低酸素ガラス制御単核細胞分化は、ＰＭＡ（ホルボール−ミリステートアセテート）誘導分化より少なかった。単核細胞の漸増、及びそれらのマクロファージへの分化は、創傷治癒及び潜在的微生物感染との闘いの重要部分である。ＰＭＡは、細胞が分化できること示すための正の対照である。
【０１１２】
多孔質ガラス足場の製造
ゲルキャストフォーミング法を使用して、多孔質ガラス足場を、ガラス実施例２７から製造した。次に、足場をＭＣＤＢ−１３１に２４時間浸漬し、次に、内皮細胞（２０，０００細胞／ｍＬ、ＨＭＥＣ−１細胞）を４日間接種した。足場のＳＥＭ画像は、４日間の細胞培養後に、足場に増殖している半集密内皮細胞層を示した。内皮細胞の充分に拡散した相互接続形態が観察され、これは内皮細胞が生存可能であり、足場が非細胞毒性であることを示している。エネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）分析は、低酸素模倣物（Ｃｏ）が、４日間の細胞培養後にガラス網状構造になお存在することを示した。
【０１１３】
本明細書に記載した現在の好ましい実施形態に関する種々の変更及び改変が、当業者に明らかであることを認識すべきである。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく加え得るそのような変更及び改変は、本発明の範囲内に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞低酸素経路を調節するために特定遷移金属イオンの制御放出を与えるように配合されたガラス組成物、並びに薬剤及び生物医学的研究（罹患組織又は損傷組織の修復、回復又は再生に関する）における、これらの低酸素経路調節ガラスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
体の組織及び器官における酸素圧力は、成長、治癒及び細胞挙動（細胞表現型）を確認するのに重要である。体における低酸素圧力（低酸素）は、特定組織（例えば、軟骨又は骨髄）に自然に存在し、血液（従って、酸素供給）の制限によるか、又は発達組織の代謝要求増大によって、生じ得る。低酸素感受性経路を介する低酸素への細胞応答は、組織損傷後の自然治癒、及び新組織形成に極めて重要である。低酸素は、ヘテロ二量体転写因子低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）によって媒介される多面適応的細胞型特異的応答を誘発する。
【０００３】
酸素正常状態条件下に、ＨＩＦ−１アルファサブユニット（ＨＩＦ−１α）は、ユビキチン化及びプロテアソーム消化によって分解される。これに対して、低酸素条件下において、ＨＩＦ−１α分解が阻害され、タンパク質の蓄積、βサブユニット（ＨＩＦ−１β）での二量化、標的遺伝子内での低酸素応答要素（ＨＲＥ）への結合、及び転写の活性化が生じる。この低酸素経路は、組織修復及び再生に必要な多くの遺伝子及び細胞機構（血管新生、リンパ管新生、細胞分化、前駆細胞漸増、並びに細胞保護及び殺細菌特性の強化を含む）を活性化する。これらの過程は、多くの再生医療戦略（創傷治癒及び組織工学を含む）の極めて重要な標的であり、低酸素経路の誘導は、これらの過程を促進する魅力的経路である。
【０００４】
低酸素経路によって誘導される組織再生過程の１つは、血管新生（虚血組織への酸素輸送の回復を生じる新しい血管の形成）である。血管新生の誘導は、特定の組織工学戦略に極めて重要である。血管は、細胞生存、細胞外基質（ＥＣＭ）リモデリング及び組織再生に極めて重要な、栄養、酸素、増殖因子及び細胞を供給する。従って、組織工学構成物の長時間の機能、統合及び生存は、適切な血管化に依存する。
【０００５】
新しい組織及び組織工学構成物の成長は、新血管成長だけでなく、適切な種類の血管にも依存する。浮腫又は慢性炎症を生じ得る「漏出性」未熟脈管に対するものとして、安定な、成熟した、充分に分化した脈管構造を発生させる必要がある。単一前駆血管形成増殖因子、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の投与は、漏出性未熟血管の形成を助長することが示されている。従って、多くの前駆血管形成因子の細胞産生を生じて、安定成熟血管の形成に導く、低酸素応答を標的とする有効手段が必要とされている。
【０００６】
低酸素経路によって誘導される他の過程は、新リンパ脈管成長（リンパ管新生）である。障害リンパ機能は、浮腫及び遅延創傷治癒を含む多くの病理学的状態に関連付けられている。低酸素は、リンパ球増殖因子ＶＥＧＦ−Ｃの産生を誘導することが公知であり、組換えＶＥＧＦ−Ｃでの治療が、創傷治癒、糖尿病性創傷の治癒を促進し、浮腫を減少させることが示されている。従って、リンパ球増殖を促進する低酸素経路の調節が、再建手術後の浮腫を減少させる望ましい方法である。
【０００７】
低酸素の他の作用は、抗微生物特性の強化である。低酸素勾配は、虚血組織（例えば、創傷）への免疫細胞の漸増を生じ、低酸素は、マクロファージの貪食活性を増大させ、それによって、自然防御機構を活性化し、潜在感染を制限する。感染と戦うことは、生体材料移植後を含む創傷治癒の成功に極めて重要である。
【０００８】
さらに、低酸素は、多くの細胞型（軟骨細胞、神経細胞、成体幹細胞、前駆細胞及び胚性幹細胞）の分化に影響を与える。従って、低酸素経路の標的化を使用して、インビトロ又はインビボで、特定の細胞系列の分化を指向するか、又は他の細胞型の表現型を維持することができる。
【０００９】
低酸素に対する細胞応答を標的とする１つの治療法は、組換え及び遺伝子療法である。潜在的に有効な、組換え及び遺伝子療法は、一般に、長期の費用のかかる分離、製造、精製及び特性決定工程を含むが、得られる治療生成物は、一般に、比較的短い保存期間を有する。
【００１０】
他の方法は、特定の遷移金属イオンの正確な濃度での制御放出によって、組織における低酸素を模倣することである。これらの遷移金属イオン（１つ又はそれ以上のＣｏ、Ｃｕ、Ｆｅ及びＮｉを含む）は、細胞低酸素経路を調節することが公知である（Maxwell, P.ら、Cancer Biol. Ther. 3(1):29-35(2004)）。遷移金属イオンは、正常酸素状態条件下において転写因子ＨＩＦ−１αの分解を阻止し、その結果として、ＶＥＧＦを含むＨＲＥ関連遺伝子の産生を生じることによって、低酸素を模倣する（米国特許第５４８０９７５号）。
【００１１】
細胞低酸素経路を調節するための遷移金属イオンの使用は、組織修復を刺激し、組織構成物を形成し、創傷治癒を促進する方法として、再生医療において大きな可能性を有する。従って、低酸素経路を誘導するのに充分な濃度及び時間において、遷移金属イオンへの組織の制御可能暴露を可能にするのに有効なビヒクルが必要とされている。
【００１２】
生物活性ガラスは、細胞挙動に影響を及ぼし、それによって組織成長に影響を及ぼすことが示されているシリカ又はホスフェート網状構造に基づく再吸収可能な材料群である。シリケートガラスの生物活性は、１９６９年にソーダ−カルシア−ホスホ−シリカガラスにおいて最初に観察された。これらのガラスは、ＳｉＯ２（４０〜５２％）、ＣａＯ（１０〜５０％）、Ｎａ２Ｏ（１０〜３５％）、Ｐ２Ｏ５（２〜８％）、ＣａＦ２（０〜２５％）及びＢ２Ｏ３（０〜１０％）を含んでいた。ＳｉＯ２−Ｐ２Ｏ５−ＣａＯ−Ｎａ２Ｏ生物活性ガラスの特定の例は、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）として製造されている。
【００１３】
生物活性ガラスの生物活性は、表面特性、及び生理学的環境における溶解イオンの局所放出の結果である。生物活性ガラス（例えば、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標））溶解のイオン生成物は、硬質組織及び軟質組織形成の両方に重要な遺伝子の発現を調節することが示されている。
【００１４】
多くの生物活性シリカガラスは、「４５Ｓ５ Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）」と称される配合に基づき、それは、４５ｗｔ％シリコンジオキシド（ＳｉＯ２）及びモル比５：１のカルシウム（Ｃａ）：リン（Ｐ）を表す。しかし、これらの成分の比率の変化、並びに、他の成分、例えば、ボロンオキシド（Ｂ２Ｏ３）、マグネシウムオキシド（ＭｇＯ）、カリウムオキシド（Ｋ２Ｏ）、ストロンチウムオキシド（ＳｒＯ）及びカルシウムフルオライド（ＣａＦ２）の含有は、生物活性ガラスの特性（溶解速度及びアパタイト形成を含む）の改質を可能にしている。
【００１５】
ＳｉＯ２、Ｎａ２Ｏ、ＣａＯ及びＰ２Ｏ５を含む商業的に入手可能な４５Ｓ５ Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）組成物は、ＶＥＧＦアップレギュレーションの誘導において作用を有することがインビトロで示されている（国際公開第２００４／０７１５４２号）。しかし、観察されたＶＥＧＦ産生の増加は最低限であり、ガラスは、低酸素経路を調節せず、ＶＥＧＦ産生を誘導し及び／又は血管新生応答を生じるために改質された組成を有していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第５４８０９７５号
【特許文献２】国際公開第２００４／０７１５４２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Maxwell, P.ら、Cancer Biol. Ther. 3(1):29-35(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
生物学的適合性及び／又は生物活性ガラスの化学組成、濃度、気孔寸法及び製造法の操作によって、低酸素刺激イオン（Ｃｕ、Ｎｉ、Ｆｅ及び／又はＣｏ）の生理活性レベルでの制御放出を与えるガラスを製造することができ、このガラスを使用して、低酸素を有利に模倣し、ＨＩＦ−１αの転写を安定化し、低酸素応答（例えば、低酸素遺伝子発現）を酸素正常状態条件下に誘導し得ることが、現在、確認された。低酸素模倣イオンの制御放出によって低酸素応答を標的にするガラスは、好都合にも、ＶＥＧＦ発現だけでなく、血管新生及び低酸素経路によって誘導される他の応答に重要な、かつ組織再生に重要な、多くの他の因子も刺激する。低酸素経路を調節するのに加えて、ガラス化学組成物は、組織再生及びインプラント統合に重要な他の生物学的過程を活性化する（例えば、骨組織再生におけるアパタイト形成）ために、最適化することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、第一の態様において、本発明は、下記から形成されるガラスを提供する：
３０〜６２％ＳｉＯ２（例えば、４５〜６２％、４７〜５３％、又は４７〜５０％ＳｉＯ２）；
０．１〜１５％Ｐ２Ｏ５；
合計含有率１２〜４５％のＣａＯ及びＳｒＯ；
合計含有率６〜３０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び
０．１〜１０％低酸素模倣イオン源；
前記低酸素模倣イオンは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ及びＦｅイオンから選択される１つ又はそれ以上のものである。
【００２０】
特定の実施形態において、ＳｉＯ２含有率は、４５〜６２％、好ましくは４７〜５３％、より好ましくは４７〜５０％であり、及び／又はＰ２Ｏ５含有率は０．５〜１．５％であり、及び／又はＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏの合計含有率は６〜２８％である。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のガラスは、Ｍｇ源（例えば、ＭｇＯ）０〜１２％、Ｚｎ源（例えば、ＺｎＯ）０〜１０％、ホウ素源（例えば、Ｂ２Ｏ３）０〜１５％、及びフッ素源（例えば、ＣａＦ２）０〜１０％の１つ又はそれ以上をさらに含む。
【００２２】
ガラスは、好ましくは、非晶質ガラス網状構造を含み、低酸素模倣イオンは非晶質ガラス網状構造に組み込まれる。好ましくは、結晶性構造が存在しない。
【００２３】
ガラスの組成は、低酸素模倣イオンがガラスの非晶質網状構造に組み込まれるために、かつ、ガラスが生理学的環境での使用においてイオンの制御放出を与えるために、重要である。低酸素イオンの制御送達と組み合わせて、ガラスの化学組成は、ガラスの物理的及び化学的特性に影響を与える。従って、本発明のガラスの化学組成は、所望される適用及び組織型のために変更できる。好ましい組成を以下に詳述する。
【００２４】
全体的に言及されるガラス組成物のパーセント含有量は、モルパーセントである。ガラス組成物の形成に使用される金属酸化物、例えばＣａＯは、各金属イオンの源を与える。ガラスが特定パーセントの酸化物から形成されるか又は含むと記載されている場合、ガラスの形成の間に、酸化物自体を与えてもよく、又は分解して酸化物を形成する化合物を与えてもよい。従って、低酸素模倣イオンの源は、ＣｏＯ、ＣｕＯ、ＭｎＯ、ＮｉＯ、酸化鉄又はそれらの混合物であってもよい。
【００２５】
好都合には、ガラスの組成は、低酸素経路を誘導するのに適切なレベルでの低酸素模倣イオンのインビボ放出を与えるのが好適である。好ましい実施形態において、低酸素刺激イオンはＣｏ又はＣｕである。より好ましくは、低酸素刺激イオンはＣｏイオンである。
【００２６】
好ましい実施形態において、低酸素刺激イオンの源は、０．２〜１０モル％、好ましくは０．５〜５モル％、より好ましくは０．５〜４モル％、さらに好ましくは１〜３モル％又は２〜４モル％で存在する。
【００２７】
高度に崩壊したガラス網状構造（例えば、生物活性ガラス）において、遷移金属イオンは、成核剤としての使用が公知であり、結晶化を生じる。これは、均質性の固有損失を生じて、予測性の欠如を生じる。好都合には、本発明の組成物は、この作用を回避し、それに代わって、遷移金属イオンの制御放出を与えるように調整される。
【００２８】
好都合には、本発明のガラスは、低酸素刺激遷移金属イオンの制御放出を与える。制御可能低酸放出速度は、低酸素経路を調節するのに極めて重要である。多くの遷移金属は栄養要求物であるが、高濃度及び／又は長期間の遷移金属イオンへの暴露において、局所組織において又は全身的に、毒性を生じ得る。例えば、コバルトはビタミンＢ１２の重要成分であるが、高コバルトレベルは、インビトロ及びインビボにおける細胞死に関連付けられている。低酸素経路模倣物への持続的長期局所組織暴露は、慢性炎症及び関連する病変も生じ得る。
【００２９】
低酸素模倣イオンの局所生理的濃度は、ガラス組成、遷移金属型、適用及び標的組織に依存する。ガラスの組成は、制御放出に極めて重要である。特定の組成範囲でのみ、生理的活性であって病理学的範囲でない制御放出が生じ得る。例えば、高架橋ガラスは、低酸素イオン放出を阻止し、一方、高破壊ガラス(highly disrupted glass)は、多すぎる低酸素イオンをあまりにも速く放出し得る。好ましい実施形態において、本発明のガラスは、０．１μＭ〜５００μＭの遷移金属イオンの局所濃度を、０〜３１日間にわたって与えるように配合される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ガラスは下記から形成される：４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント１８〜２５％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜２％ＺｎＯ；０〜２％ＭｇＯ；及び０．１〜１０％（好ましくは０．５〜１０％、より好ましくは０．５〜５％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、骨／硬質−組織用途、例えば、骨再生材料に使用し得る。
【００３１】
他の実施形態において、ガラスは下記から形成される：４９〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；合計モルパーセント１６〜１８％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント１８〜２０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；１〜１０％フッ素源（例えば、ＣａＦ２）；１〜３％ＺｎＯ；１〜３％ＭｇＯ；及び０．１〜５％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、歯周用途に使用し得る。
【００３２】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記を含む：４６〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；８〜４０％ＣａＯ（好ましくは８〜２７％）；０〜１５％ＳｒＯ；５〜７％Ｎａ２Ｏ；４〜７％Ｋ２Ｏ；０〜４％ＺｎＯ（好ましくは２〜４％）；０〜４％ＭｇＯ（好ましくは２〜４％）；０〜９％ＣａＦ２；及び５％以下の低酸素模倣イオン源。好ましくは、ガラスは下記を含む：４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは約１％）；８〜２７％ＣａＯ；３〜１５％ＳｒＯ；約３％ＺｎＯ；約３％ＭｇＯ；及び約２％ＣｏＯ、ＣｕＯ又はＮｉＯ。ガラス内のＺｎＯ、ＭｇＯ、ＣｏＯ、ＳｒＯ及びＰ２Ｏ５の合計モルパーセントは、１〜１２％であってもよい。ガラスは下記から形成してもよい：４６〜５０％ＳｉＯ２（好ましくは４７〜５０％）；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント２０〜２９％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント１２〜１４％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；２〜４％ＺｎＯ；２〜４％ＭｇＯ；０〜９％ＣａＦ２；及び０．１〜５％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。特定の実施形態において、ガラスは下記を含んでもよい：４６〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５；合計モルパーセント３５〜４０％のＣａＯ、ＺｎＯ、ＭｇＯ及びＳｒＯ；５〜７％Ｎａ２Ｏ；及び５〜７％Ｋ２Ｏ。前記ガラス組成物は、好ましくは、骨の多孔質焼結足場を形成するのに使用されるガラスである。従って、好ましい実施形態において、ガラスは、低酸素を模倣するイオンを含む多孔質焼結足場として提供される。そのような足場は、骨の再生及び修復に有用である。
【００３３】
さらに他の好ましい実施形態において、ガラスは下記から形成される：４８〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；合計モルパーセント３０〜４１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント６〜８％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び０．１〜１０％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、複合材料用の充填剤として使用し得る。ガラスは、４〜６％ＺｎＯ及び４〜６％ＭｇＯをさらに含んでもよく、これらの成分が存在する場合、ガラスは非骨複合材料用の充填剤として使用するのに特に適し得る。
【００３４】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記から形成される：４７〜６２％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント１２〜１７％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント１２〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０．８％ＺｎＯ（好ましくは０〜６％、より好ましくは３〜６％）；０．８％ＭｇＯ（好ましくは０〜３％）；及び０．１〜１０％（好ましくは０．５〜５％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、軟質組織用途に使用し得る。
【００３５】
軟質組織用途のために、ガラスは、生物学的に適合性であるが、好ましくは生物活性でない。生物活性を防止する１つの方法は、ＳｉＯ２含有量を、例えば６２％まで（例えば５５〜６２％）に増加することである。アパタイト形成を防止する他の方法は、ＭｇＯ又はＺｎＯ濃度を増加することである。従って、特定の実施形態において、ガラスは４〜８％ＺｎＯ又はＭｇＯを含む。
【００３６】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記から形成し得る：４７〜６２％ＳｉＯ２（好ましくは４７〜５０％）；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１．５％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モルパーセント１８〜２１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モルパーセント２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜６％ＺｎＯ（好ましくは３〜６％）；及び０．１〜５％（好ましくは２〜５％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、脱毛症の治療用のシャンプーに使用し得る。ガラスは、好ましくは、生物活性ガラスである。
【００３７】
さらに他の実施形態において、ガラスは下記から形成し得る：３０〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（好ましくは０．５〜１１％）；合計モルパーセント２２〜２８％のＣａＯ及びＳｒＯ（これは、ＣａＯのみ、ＳｒＯのみ、又はそれらの組合せであってもよい）；２２〜２８％Ｎａ２Ｏ；及び０．１〜５％（好ましくは１〜３％）低酸素刺激イオン。この組成のガラスは、ｐＨ安定性であり、従って、ｐＨ変化を最小限にすることが重要な用途、例えば、細胞培養系又はシャンプー、又は局所投与に、特に有用である。局所投与する場合、そのようなガラスは、ＨＩＦ−１経路を介して作用して、向上した創傷修復（真皮〜皮下）を与え得るか、又はシャンプーにおける使用の場合、小胞ＶＥＧＦ発現を増加させることによって脱毛を抑制し得る。
【００３８】
低酸素経路の刺激は、血管新生を刺激するために当分野で一般に使用されている他の方法、即ち、血管形成因子の組換え放出と比較して、多くの利点を有する。本発明のガラスは、組換えタンパク質を組み込んだ材料、ゲル及び足場の使用、又は血管新生を刺激する遺伝子導入法と比較して、有効性及び経済性の両方において、利点を有する。
【００３９】
組換えタンパク質又は遺伝子導入と比較して、本発明のガラスは、比較的「低度技術」の製造法を必要とし、安価な原材料を必要とし、極めて長い貯蔵寿命を有する。さらに、前記ガラスは、遺伝子導入用のベクターの使用に関する安全懸念がない。
【００４０】
好ましい実施形態において、ガラスは、生組織（又は、インビトロにおける細胞／小器官）と接触した場合に、有利な生物学的応答を誘発する。有利な生物学的応答、即ち、低酸素経路の誘導は、低酸素経路調節イオンの放出によって生じる。
【００４１】
本発明のガラスは、生物学的に適合性である。特定の好ましい実施形態において、ガラスは、生物活性ガラスである。他の好ましい実施形態において、ガラス組成物は、生物活性でない（しかし、生体適合性である）。軟質組織において石灰化作用を刺激することは望ましくなく、これは軟質組織用途の既存組成物の主要な欠点である。
【００４２】
シリカ基材ガラスにおいて、ＳｉＯ２は、生物活性ガラスの非晶質網状構造を形成し、ガラスにおけるＳｉＯ２のモルパーセントは、その網状構造結合性（ＮＣ）に影響を与える。ＮＣは、ガラス構造物における網状構造形成要素当たりの平均架橋結合数である。ＮＣは、ガラス特性、例えば、粘性、結晶速度及び分解性を決定する。ＮＣ２．０において、無限モル質量の線状シリケート鎖(linear silicate chains)が存在すると考えられる。ＮＣが２．０未満に低下すると共に、シリケート鎖のモル質量及び長さが急激に減少する。２．０より高いＮＣにおいて、ガラスは３次元網状構造になる。ガラスが分解性及びアパタイト形成可能であるために、ＮＣは２．６未満、より好ましくは２．４未満でなければならない。従って、アパタイト形成が重要な骨への適用のために、生物活性ガラスは、２．６又はそれ以下、好ましくは２．４又はそれ以下の網状構造結合性を有する。ＳｉＯ２含有量を増加して、網状構造結合性を２．６又はそれ以上に増加することは、アパタイト形成能力を減少させるか又は除去し得る。
【００４３】
本発明に関する網状構造結合性は、Hill R. J. Mat. Sci. Letts. 1996 Jul 1;15(13):1122-5に記載されている方法によって計算されるが、リンが分離オルトホスフェート相として存在すると考えられ、ガラス網状構造の一部でないことを前提とする。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明のガラスは、生理的条件下に再吸収性である。従って、本発明は、再吸収性ガラスを含む。本発明の１つの態様は、低酸素模倣溶解性ガラスについて詳述し、それは、輸送中、手術中及び埋め込み後の両方において、組織工学構成物の生存力を維持するのに重要な特定の細胞型において、保護作用を生じる。
【００４５】
好ましい実施形態において、ガラス組成物は、Ｌｉ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂ又はＦの１つ又はそれ以上の供給源を含む。
【００４６】
本発明のガラスは、下記から選択される１つ又はそれ以上の成分を含んでもよい：カルシウム、ホスフェート、マグネシウム、ストロンチウム、亜鉛、ホウ素、フッ素、又はアルカリ金属、例えばナトリウム又はカリウムの源。好ましくは、これらの成分は、下記を含むがそれらに限定されない化合物として与えられる：Ｎａ２Ｏ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＮＯ３、Ｎａ２ＳＯ４、ケイ酸ナトリウム、Ｋ２Ｏ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ケイ酸カリウム、ＣａＯ、ＣａＣＯ３、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４、ケイ酸カルシウム、ＭｇＯ、ＭｇＣＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４、ケイ酸マグネシウム、ＺｎＯ、ＺｎＣＯ３、Ｚｎ（ＮＯ３）２、ＺｎＳＯ４、及びケイ酸亜鉛、ＣｏＯ、ＣＯ２Ｏ３、ＣｏＣＯ３、Ｃｏ（ＮＯ３）２、ＣｏＣｌ２、ＣｏＦ２、ＣｏＳＯ４、ケイ酸コバルト、ＮｉＯ、Ｎｉ２Ｏ３、ＮｉＣＯ３、Ｎｉ（ＮＯ３）２、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＮｉＦ２、ケイ酸ニッケル、ＣｕＯ、ＣｕＣＯ３、Ｃｕ（ＮＯ３）２、ＣｕＣｌ２、ＣｕＦ２、ＣｕＳＯ４、ケイ酸銅、及び分解して酸化物を形成する任意のそのような化合物。
【００４７】
本発明のガラスが特定の成分から形成されるか又はそれらを含むと先に記載されている場合、ガラスは、これらの成分から形成されているが、付加的成分もガラス網状構造内に存在し得ることが認識される。しかし、本発明は、付加的成分がガラス網状構造に存在しない、本明細書に記載されているガラス組成を有するガラス、即ち、記載されている成分「から本質的になる」ガラスも含む。例えば、本発明のガラスは、アルミニウム不含であってもよい。ガラスは、銀等のような成分を含有しなくてもよい。
【００４８】
ガラスの成分の正確なモルパーセントは、ガラスの物理的及び生物学的特性に影響を与えることが認識される。ガラスの種々の使用は、種々の特性を必要とし、従って、各成分のモルパーセントを調節することによって、ガラスの特性を特定の意図する使用に合わせて調整し得る。例えば、ガラスの化学組成を、特定用途に合わせて調整することができ、例えば、Ｓｉ、Ｚｎ及び／又はＭｇ濃度を増加することによって、非骨用途のためにアパタイト形成能力を減少又は除去することができる。さらに、低酸素応答は全ての細胞に遍在するが、応答の型は細胞特異的であり、標的組織の構造的及び機械的特性に合わせて調整されたガラスの形成を可能にする。
【００４９】
好ましい実施形態において、ガラスは、カルシウム源を含む。本発明の目的のために、カルシウム源は、カルシウムオキシド、又は分解してカルシウムオキシドを形成する任意の化合物を含む。ガラスにおけるカルシウム源の存在は、ガラス表面からのＣａ２＋イオンの放出を生じ、これは、ガラス表面におけるカルシウムホスフェート豊富層の形成を助け、形成速度を増加させる。この層の形成は骨組織の生成における重要段階であり、従って、カルシウムを含む生物活性ガラスは、骨組織修復及び再生の促進に使用するのに特に好適である。体液自体がカルシウムイオンを含有しているので、カルシウムホスフェート豊富層は、生物活性ガラスによるカルシウムイオンの供給なしに形成できることを認識すべきである。従って、本発明の目的のために、カルシウムを含有しない生物活性ガラスを使用することができる。好ましくは、Ｃａ源（例えばＣａＯ）のモルパーセントは、０％〜４５％、より好ましくは１０％〜４０％である。
【００５０】
本発明のガラスは、Ｐ２Ｏ５を含む。体液自体がホスフェートイオンを含有しているので、ヒドロキシカーボネート化アパタイトは、活性ガラスによるホスフェートイオンの供給なしに形成できるが、生物活性ガラスによるホスフェートイオンの供給は、ヒドロキシカーボネート化アパタイトの形成速度を増加させる。さらに、Ｐ２Ｏ５の供給は、ガラスの粘度−温度依存性に有利な作用を有し、ガラスの製造及び形成に有利な使用温度範囲を増加させる。
【００５１】
本発明のガラスは、好ましくは、下記を含むがそれらに限定されないマグネシウム源を含む：ＭｇＯ、ＭｇＣＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４、ケイ酸マグネシウム、及び分解してマグネシウムオキシドを形成する任意のそのような化合物。マグネシウムイオンは、形成されるヒドロキシカーボネート化アパタイト結晶の大きさを減少させ、熱膨張率を減少させる。それにより、減少したアパタイト結晶の大きさは脆性骨の形成を減少させる。好ましくは、ＭｇＯのモルパーセントは、０％〜１２％、より好ましくは０％〜１０％である。マグネシウムの一部又は全部を、マグネシウムオキシドとして与えることができる。
【００５２】
亜鉛イオンの含有（ＺｎＯのモルパーセントは０％〜５％である）も、形成されるヒドロキシカーボネート化アパタイト結晶の大きさを減少させ、熱膨張率を減少させる。熱膨膨張率を減少させることは、ガラスをコーティングとして使用する場合に、有利である。ガラスは、骨折部、又は骨の損傷領域に導入することができる。従って、本発明のガラスは、下記を含むがそれらに限定されない亜鉛源から形成し得る：ＺｎＯ、ＺｎＣＯ３、Ｚｎ（ＮＯ３）２、ＺｎＳＯ４、及びケイ酸亜鉛、並びに分解して酸化亜鉛を形成する任意のそのような化合物。好ましくは、亜鉛源のモルパーセント（ＺｎＯとして測定）は、０〜１０％である。亜鉛源を含むガラスは、創傷治癒、幹細胞分化の指向、及び軟骨組織修復のような用途において、軟質組織の修復及び再生を促進するのに特に有用である。本発明のガラスへの亜鉛の組込みは、創傷治癒を促進し、罹患又は損傷組織の再生を助ける。理論に縛られるわけではないが、研究により、特定組成物における亜鉛イオン源（ＺｎＯ）の４％〜５％モルパーセントより高い含有は、アパタイト形成を阻害することが示されており、これは非骨用途に好ましい。研究により、ＺｎＯ含有量が４％〜５％ＺｎＯモルパーセントより高く増加すると共に、ガラスにおけるその役割が、網状構造調節剤から中間体酸化物に変化し、それによってより安定なガラス構造を形成し、アパタイト形成に必要なイオン交換を防止することが示されている。従って、好ましい実施形態において、本発明は、亜鉛イオン源を５％より高いモルパーセントで含むガラスを提供する。このガラスは、特に軟質組織用途に使用される。
【００５３】
同様に、高ＭｇＯ含有量を使用して、生物活性をノックアウトし、軟質組織用途に好適なガラスを提供することができる。例えば、ＣａＯ及びＳｒＯを、ＭｇＯ及び／又はＺｎＯで置き換えて、生物活性をノックアウトすることができる。Ｚｎ２＋及びＭｇ２＋はガラスのＮＣを増加させ、ガラス分解／溶解を減少させることによって作用する。Ｚｎ２＋及びＭｇ２＋は、さらに、アパタイト結晶格子における面をブロックし、アパタイトの結晶成長を阻害し得る。
【００５４】
他の好ましい実施形態において、本発明のガラスは、ホウ素源を、好ましくはＢ２Ｏ３として含む。Ｐ２Ｏ５の場合と同様に、Ｂ２Ｏ３は、ガラスの粘度−温度依存性に有利な作用を有し、ガラスの製造及び形成に有利な使用温度範囲を増加させると考えられる。Ｂ２Ｏ３は、さらに、生物活性ガラスのガラス転移温度と結晶化開始温度との間の作業ウインドの大きさを増加して、結晶化を伴わないガラス粉末の焼結を可能にすると考えられる。生物活性ガラスにおける結晶の形成はその生物活性を一般に減少させるので、これは有利である。好ましくは、Ｂ２Ｏ３のモルパーセントは０％〜１５％である。より好ましくは、Ｂ２Ｏ３のモルパーセントは０％〜１２％である。
【００５５】
本発明のガラスは、好ましくは、フッ素源（好ましくは１つ又はそれ以上のＣａＦ２、ＳｒＦ２、ＭｇＦ２、ＮａＦ又はＫＦの形態）を含む。フルオリドは、骨芽細胞を刺激し、ヒドロキシカーボネート化アパタイト付着の速度を増加させる。フルオリド及びストロンチウムは、これに関して相乗的に作用する。フルオリドは、さらに、アパタイト格子におけるヒドロキシルイオンと容易に置き換わることによって、自然生物形態により高い類似性を有するより混合型のアパタイト構造の形成を促進する。混合アパタイトは、より熱力学的安定性であり、従って、より低い溶解性及びより低い再吸収性である。フルオリドは、生物活性ガラスの融解温度を低下させるために使用することもできる。好ましくは、フッ素は、０％〜５０％、より好ましくは０％〜２５％のモルパーセントで与えられる。好ましくは、フッ素源（好ましくはＣａＦ２）は、０％〜１０％、又は１％〜７％のモルパーセントで与えられる。好ましくは、少なくとも１％で存在する。
【００５６】
本明細書に記載されているガラスのいくつかの好ましい実施形態において、ＳｉＯ２、Ｐ２Ｏ５及びＢ２Ｏ５の合計モルパーセントは、８０％を超えない。
【００５７】
さらに、本発明のガラスにおけるＳｒＯ、ＣａＯ、ＭｇＯ、Ｎａ２Ｏ及びＫ２Ｏの合計モルパーセントは、４０〜６０％であってもよい。
【００５８】
ガラスは、その意図する使用に依存して、粒子形態において、３Ｄ構造として、又は固形物、例えばディスク又はモノリスとして提供し得る。特に、ガラスは、任意の必要とされる形又は形態において、例えば、ペレット、シート、ディスク、フォーム等として、提供できる。粒子形態において、好ましい粒度は、前記生物活性ガラスの用途に依存するが、好ましい粒度範囲は、１２００ミクロン未満、好ましくは１〜１０００ミクロン、より好ましくは５０〜８００ミクロン、より好ましくは１００〜７００ミクロンである。必要とされる粒度の範囲は、ガラスの用途及び生物活性に依存する。例えば、複合材料又は焼結ガラス用の充填剤は、４５ミクロン又はそれ以下の粒度で提供される。粒子形態、例えば粉末において、ガラスを、セメント、ペースト又は複合材料に含有し得る。アクリル、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルメタクリレート（Ｂｉｓ ＧＭＡ）及びポリアクチドを含むがそれらに限定されない物質に、ガラスを含有し得る（例えば充填剤として）。被覆剤を形成するか、又は足場として使用される多孔質固形物を形成するために、ガラス粉末を焼結してもよい。さらに、ガラスを、分解性ポリマー足場に組み込んでもよい。ガラスは、グラニュールの形態であってもよい。
【００５９】
本発明のガラスは、ゲルキャストフォーミング法を使用して、多孔質低酸素経路調節足場を形成するためにも使用し得る。このゲルキャスト法は、低酸素刺激生体適合性多孔質足場の製造を可能にする。この足場は独特の性質を有し、それにより、前記足場は、３次元での骨成長用のテンプレートとして機能し、支持部位における骨再生に適した機械的特性を有し、制御速度で分解でき、生物活性を与えるためにカルシウムイオン源を含有し、血管成長を刺激することができ、骨成長を刺激することができ、工業生産及び臨床用に滅菌することができる。ゲルキャストフォーミング法は、界面活性剤を使用するガラス粒子スラリーの発泡、及びゲル化剤のインサイチュ重合を含む。次に、ゲル化フォームを、ゲル化の直前に鋳型に注ぎ、熱処理して、ポリマーを除去し、ガラス粒子を焼結する。従って、本発明のガラスは、低酸素を模倣するイオンを含む多孔質焼結足場として提供でき、従って、本発明は、本発明の第一態様のガラスを含む多孔質焼結足場を含む。好ましい実施形態において、本発明は、濃度勾配の低酸素模倣イオンを含有する多孔質生物活性足場を提供する。そのような足場は、溶融誘導多孔質足場の直接レーザー焼結及び多層焼結によって形成できる。これらのイオン放出勾配は、天然インビボ低酸素勾配を模倣し、それによって、細胞移動及び漸増のための細胞シグナル伝達濃度勾配を模倣する。
【００６０】
ガラスは、好ましくは、溶融誘導ガラスとして提供される。溶融誘導ガラスは、公知の方法でさらに焼結することができる。溶融誘導ガラスは、好ましくは、適切なカーボネート又は酸化物の粒子を混合及びブレンドし、約１２５０℃〜１５００℃の温度で混合物を溶融し均質化することによって製造される。均質化は、好ましくは、酸素バブリングによって行なわれる。次に、混合物を、好ましくは、好適な液体、例えば脱イオン水への溶融混合物のキャスティングによって冷却して、ガラスフリットを製造する。
【００６１】
ガラスの化学組成及び形態は、用途に依存する。低酸素経路調節生物活性ガラスは、粒子形態において、前記形態のモノリス、３Ｄ多孔質足場、繊維及び／又は被覆剤として、又は埋め込み材料、組織再生構造物及び創傷治癒デバイス、例えば、組織工学足場、縫合糸、プロテーゼインプラント、ポリマーマトリックス、フィブリンゲル、ヒドロゲル、プラスター、創傷被覆材、クリーム、シャンプー等の中又は上に組み込まれた低酸素模倣ガラスとして使用できる。低酸素刺激ガラス組成物は、インビトロ及びエクスビトロ細胞培養に使用されるデバイスにも使用できる。さらに、ガラスは、インビボでの細胞の治療使用の前に、インビトロで特定の細胞応答を誘発するのに使用し得る。
【００６２】
本発明のガラスを、他の材料、例えば、ヒドロゲル、ゲル、クリーム、足場及び／又はポリマー複合材料に組み込むことができる。他の材料へのガラスの組込みは、多くの再生医療用途のためにガラスイオン放出特性を利用することを可能にする。
【００６３】
ヒドロゲルは、水溶性ポリマーの架橋によって得られ、例えば、架橋ポリアクリルアミドゲル又はポリサッカリドゲルが特に好ましい。好ましいポリサッカリドヒドロゲルは、アルギネート、カラギーナン、アガー及びアガロ−スを含み；他のポリサッカリド、例えば、カードラン、プルラン、ゲラン等も、ヒドロゲル形成成分として有用である。
【００６４】
他の好ましい実施形態において、ガラスは、局所適用用の組成物として提供され、例えば、創傷又は火傷を治療するために、皮膚移植における使用のために提供され、その場合、組成物はドナー組織の適用前に移植部位に適用されるか又はドナー組織自体に適用され、又は手術における使用のために、創傷治癒を促進する間に手術部位における術後浮腫及び感染を最小限にするために手術部位に適用される。
【００６５】
本発明の組成物は、ガラス粒子の形態のガラスを含んでもよい。ガラス粒子は、単独で、又は、下記の物質を含むがそれらに限定されない他の物質と組み合わせて、提供し得る：抗生物質、例えば、エリスロマイシン及びテトラサイクリン、抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル及びガンシクロビル、治癒促進剤、抗炎症剤、例えば、コルチコステロイド及びヒドロコルチゾン、免疫抑制剤、成長因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子、抗代謝剤、細胞接着分子、骨形成タンパク質、血管新生化剤、抗凝固剤及び局所麻酔剤、例えば、ベンゾカイン及びリドカイン。
【００６６】
第二の態様において、本発明は、医療における使用、好ましくは、組織損傷の予防及び／治療における使用のための前記ガラスを提供する。本発明の目的のために、組織は、骨組織、皮膚、軟骨、軟質組織（結合組織を含む）、及び歯組織（石灰化歯組織、例えば、エナメル質及び象牙質を含む）であってもよい。組織は、動物組織、より好ましくは哺乳類又はヒト組織であってもよい。
【００６７】
好ましい実施形態において、ガラスは、血管新生又はリンパ管新生の誘発、抗細菌活性の促進、又は細胞生存力の維持に使用するために提供される。
【００６８】
本明細書全体を通して、予防及び／又は治療は、任意の損傷又は任意の医学的障害を任意の程度に緩和する任意の作用を意味し、損傷自体の予防及び治療、並びに損傷の制御も含む。「治療」という用語は、障害、疾患、症候群、症状、疼痛、又は１つ若しくはそれ以上のそれらの組合せの任意の改善を意味する。「制御」という用語は、必ずしも症状を改善させないが、疾患の進行を止めることによって症状が増悪又は悪化するのを防止することを意味する。「予防」という用語は、症状が起こらないようにするか、又は症状の開始を遅らせるか、又は症状の開始の重篤度を減少させることを意味する。
【００６９】
特に、予防及び／又は治療という用語は、組織の修復及び／又は再構成を含む。本発明の目的のために、「修復」という用語は、例えば生物学的過程のインビボ刺激によって、組織を正常作動可能状態に回復することを意味する。「再構成」という用語は、組織の再建を意味し、外部成分、例えば、足場、模型等の組織への一時的又は永久的組込みを含む。
【００７０】
本発明の目的のために、損傷は、機械的損傷であってもよく、外部物質によって生じてもよく、又は内部生物学的過程の結果であってもよい。機械的損傷の例は、外傷、手術、加齢性摩耗等によって生じた損傷である。外部物質によって生じた損傷の例は、下記の損傷である：薬剤、毒素又は治療法（例えば、化学療法又は放射線療法）、例えば透析関連アミロイドーシスによって生じた損傷；疾患、例えば、細菌、ウイルス又は真菌感染症、例えば骨髄炎、遺伝子疾患、例えば骨形成不全及び低ホスファターゼ症、不適栄養、加齢性障害、変性障害又は症状、例えば、骨粗鬆症及び骨癌（骨肉腫及びユーイング肉腫を含む）によって生じた損傷。内部生物学的過程の結果として生じた損傷の例は、自己免疫疾患である。特に、組織の損傷は、骨関節症、歯周病等によって生じたものであってよく、又はその結果であってもよい。
【００７１】
生物活性ガラスを組織に組み込まずに、組織修復の開始及び／又は刺激によって損傷を予防及び／又は治療するために、ガラスを提供し得る。代替的に又は付加的に、ガラスを組織に組み込んでもよく、そのようなガラスの組込みは組織の再形成を可能にする。組織への生物活性ガラスの組込みは、永久的又は一次的であってもよい。
【００７２】
好ましい実施形態において、ガラスは、軟質組織再生を促進することによる創傷修復に使用される。急性組織傷害の直後に、創傷の微環境は低酸素である。慢性創傷は、不充分な血管形成の結果である。創傷治癒における血管新生の重要性は、創傷治癒を遅らせる血管新生阻害剤（例えば、エンドスタチン）の使用において、及び局所ＶＥＧＦ治療がこの作用を阻止するのに有効であることにおいて、明らかに示されている。興味深いことに、高齢患者における潰瘍及び慢性創傷の数の増加は、低酸素細胞応答の減少と関連付けられている。
【００７３】
従って、他の好ましい実施形態において、ガラスは、潰瘍（例えば、糖尿病性下肢潰瘍）の治療における使用のために提供される。
【００７４】
さらに他の好ましい実施形態において、ガラスは、骨及び硬質組織の再生及び修復を促進するために使用される。骨形成における血管新生の重要性は、長年にわたり認識されている。血管は、栄養、成長因子、前骨芽細胞、並びにインビボでの骨形成及び骨維持に不可欠な他の因子を供給する。強力な血管新生因子ＶＥＧＦの骨芽細胞遺伝子発現の増加が、骨折修復の間に生じ、インビボの骨損傷部位におけるＶＥＧＦの局所低速放出は、骨修復及び骨統合の増強を生じる。ＶＥＧＦは、骨芽細胞の分化及び移動を刺激することによって、骨リモデリングに直接的役割を有することも示されている。
【００７５】
骨又は硬質組織の再生及び修復を促進するのに使用するために、ガラスは、好ましくは、粉末又はモノリスの形態（多孔質足場を含む）で提供され、骨自己移植片の代わりに使用されるか、又は骨自己移植物質と混合される。骨自己移植は、患者から取った健康な骨を、破損骨の間又はまわりのスペースに配置する（骨折）か、又は骨の中に保持する（欠損）。移植に使用可能な骨ストックの限定量により、これは有利である。
【００７６】
好ましい実施形態において、ガラスは、脊椎形成術に使用される。ガラスを、ポリマー又はセメントに組み込み、最小侵襲手術によって脊椎スペースに注入して、骨粗鬆症骨折、及び骨粗鬆症に関連し脊柱湾曲を生じる脊椎崩壊を予防し得る。
【００７７】
さらに他の好ましい実施形態において、ガラスは、感染症の治療に使用される。好都合にも、特定の抗微生物剤に見られる細胞毒性作用が、本発明のガラスの使用によって避けられる。例えば、銀イオンは抗微生物剤として作用し得るが、特定の濃度は、細胞毒性作用を有し、創傷治癒を遅らせる。低酸素経路による「自己回復」過程の活性化（例えば、免疫細胞漸増の促進、及びマクロファージ貪食活性の増強）は、抗微生物特性を増強する代替的方法である。
【００７８】
他の好ましい実施形態において、ガラスは、細胞保護特性の増強に使用され、細胞損傷を制限し、修復細胞（成体幹細胞）を漸増させる。これは、虚血傷害（例えば、心筋梗塞）後のインビボでの重要な生存機構となり得る。特定細胞型における保護作用は、輸送中、手術中及び埋め込み後の両方において、組織工学構成物の生存力を維持するのにも有用である。
【００７９】
好ましい実施形態において、ガラスは、軟骨修復、再構成及び再生に使用される。軟骨は、限られた自己修復能力を有し、従って、組織工学は、軟骨再生において極めて有望である。しかし、軟骨細胞表現型（即ち、それらの軟骨生成能力）の維持は、インビトロにおいて、困難であることが示されている。従って、軟骨ＥＣＭを模倣し、軟骨細胞表現型を維持する環境キューを含有する組織足場を開発する必要がある。３Ｄ環境を提供するのに加えて、低酸素を模倣する足場の開発は、天然軟骨に存在する低酸素レベルに類似した環境キューを与え、それによって軟骨細胞表現型を維持し、軟骨ＴＥを促進し得る。実際に、低酸素環境において３Ｄ足場に増殖する一次軟骨細胞が、それらの表現型を維持することが示されている。さらに、ＨＩＦ−１α、マスター低酸素感受転写因子は、骨端軟骨細胞形成、軟骨細胞生存、軟骨細胞の再分化、及び軟骨細胞前駆体の分化に極めて重要である。
【００８０】
好ましい実施形態において、ガラスは、指向幹細胞分化を誘導するために使用される。低酸素は、幹細胞の可塑性、増殖及び／又はより特殊化した細胞への分化を維持することにおいて、重要なレギュレータであることが示されている。低酸素応答を調節する３Ｄ足場の開発は、「幹細胞性」及び指向分化の維持についての基礎的研究を可能にし、知識を深める。低酸素は、デノボ血液形成のための血管芽細胞（循環内皮細胞前駆体）、ＭＳＣ及び神経細胞の分化を刺激することが公知である。例えば、虚血傷害への応答において、先に移植され、統合された、静止クローン神経幹細胞が、細胞周期に再び入り、低酸素部位に優先的に移動し、神経細胞及び乏突起膠細胞（虚血性脳傷害後に一般に破壊する細胞型）に分化する。インビボでのＴＥ構成物への成体幹細胞の漸増及び増殖は、組織修復、発達及び統合を大いに増強させる。好ましくは、ガラスは足場として提供される。
【００８１】
他の実施形態において、ガラスは、発毛の促進、及び／又は髪の太さの増加、例えば、脱毛症、加齢によるか又は化学療法の結果としての髪減少の治療のために使用される。本発明のガラスによって放出される遷移金属イオンの低酸素模擬作用によって刺激される細胞機構の１つである血管新生は、発毛及び小胞の大きさを調節し得る。従って、ガラスは、シャンプーの形態で提供し得る。
【００８２】
他の実施形態において、本発明のガラスは、分解性ポリマー、例えばポリエステルにおいて、充填剤として提供できる。特に、ガラスは、ポリラクチドにおける充填剤として提供できる。それにより、生物活性ガラスは、骨スクリュー、骨折固定板、多孔質足場等に、生物活性成分を与えることができる。本発明のガラスの使用は、生物活性ガラスが当分野で現在公知のポリエステルの特徴である自己触媒的分解を防止するので、分解性ポリエステルにおける充填剤として使用するのに特に好都合である。エステルの加水分解がアルコール及び酸の形成を生じるので、自己触媒的分解が起こる。エステルの加水分解は酸触媒されるので、酸の生成は、正のフィードバック状況を生じる。
【００８３】
本発明のガラスは、任意の従来法によって投与し得る。ガラスは局所的に投与し得る。局所適用の例は、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、散剤、ゲル剤又はペースト剤の体、例えば、歯又は皮膚への投与である。特に、虫歯、歯周病、歯の知覚過敏症等の患者の歯に投与するためのガラスを含む練り歯磨きとして、ガラスを提供できる。
【００８４】
ガラスは、外科的又は非経口的に投与し得る。外科的また非経口的投与の例は、注射によるデバイスの挿入によるか、又は外科的方法、例えば、埋め込み、組織置換、組織再構成等による、組織へのガラスの投与である。
【００８５】
ガラスは、経口的に投与することもできる。経口投与のために、組成物を、液体又は固体、例えば、液剤、シロップ剤、懸濁剤又は乳濁剤、錠剤、カプセル剤及びロゼンジ剤として、配合することができる。経口又は非経口投与によるガラスの投与は、ガラスを、その作用を必要とする部位に直接的に与え得る。あるいは、例えば全身循環を使用して、ガラスをその作用部位に送達することもできる。ガラスを、例えば、消化管損傷の予防及び／又は治療を必要とする患者に、経口的に投与することができる。
【００８６】
組成物は、粒子、三次元足場、モノリス、被覆物及び／又は繊維等の形態で使用することができ、例えば、下記のために使用できる：血管新生（新しい血管の形成）の刺激；リンパ管新生（新しいリンパ管の形成）の刺激；抗微生物目的；並びに、細胞の増殖及び前駆／幹細胞の分化の指向。これらの特性を、例えば、下記のために使用できる：創傷治癒の増強；感染の阻止；骨成長の刺激；毛包成長の刺激；軟骨組織の再生；及び、他の治療又は美容目的。低酸素経路調節ガラスを、下記の中又は上に組み込むことができる；埋め込み物質、組織再生構成物及び創傷治癒デバイス、例えば、組織足場、縫合糸、プロテーゼインプラント、ポリマーマトリックス、フィブリンゲル、ヒドロゲル、プラスター、創傷被覆材、クリーム剤、シャンプー、エーロゾル剤等。低酸素刺激ガラス組成物は、インビトロ及びエクスビトロ細胞培養に使用されるデバイスにも使用できる。
【００８７】
本発明の各態様の全ての好ましい特徴は、必要な変更を加えて、全ての他の態様に適用される。本発明の種々の実施形態が、組み合わせて存在し得ることも認識される。
【００８８】
本発明は種々の方法で実施でき、多くの特定の実施形態が、添付の図面を参考にして、本発明を説明するために例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】一系列のコバルト含有ガラスからのイオン放出の誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分析の結果を示す：ａ）（上部トレース）ガラス実施例１〜４；ｂ）（下部トレース）ガラス実施例５〜７。
【図２】誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分析による、時間の経過に伴う、トリス緩衝液中の一系列のコバルト含有ガラス（実施例１〜４）からの制御化学組成依存性コバルトイオン放出を示す。
【図３】トリス緩衝液中で３０分間インキュベーション後に、一系列の銅含有ガラス（実施例１〜４、ＣｏをＣｕに置き換えた）から放出されたＣｕ、Ｎａ及びＣａのＩＣＰ分析の結果を示す。
【図４】トリス緩衝液中で３０分間インキュベーション後に、一系列のコバルト含有ガラス（実施例１〜４）から放出されたＣｏ、Ｎａ及びＣａのＩＣＰ分析の結果を示す。
【図５】トリス緩衝液中で３０分間インキュベーション後に、Ｐの増加モル％濃度を有する一系列のコバルト含有ガラス（実施例１３〜１６）から放出されたＰ、Ｃｏ、Ｓｉ及びＣａのＩＣＰ分析の結果を示す。
【図６】蒸留水中、種々の低酸素模倣ガラス（実施例３及び１３〜１５）によって生じたｐＨ変化を示す。
【図７】特定のコバルト含有ガラス組成物（実施例１〜４）の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。
【図８】低酸素模倣ガラスの実施例（組成実施例１〜４、３４、４４及び４５）のＸＲＤトレースを示す。
【図９】コバルト含有ガラス（実施例１〜４及び５〜７）の２９Ｓｉ ＭＡＳ−ＮＭＲ（マジック角度回転−核磁気共鳴）を示す。
【図１０】ゲルキャストフォーミング法を使用して製造した多孔質低酸素生物活性ガラス足場（実施例２４）のＳＥＭ画像を示す。
【図１１】模擬体液（ＳＢＦ）中で３週間インキュベートした種々の組成の低酸素模倣生物活性ガラスのラマンスペクトルを示す。アパタイト（ＰＯ４３− ９６０ｃｍ−１）形成が、これらの全ての特定低酸素模倣生物活性ガラス組成物（実施例１〜４、３４、４４及び４５）に存在したことを示す。
【図１２】図１２ａは、転写因子ＨＩＦ−１α発現を示し（縦軸は、［ＨＩＦ−１α］／［Ｃｙｔ．Ｃ］である）、図１２ｂは、転写因子ＨＩＦ−１α安定化を示し、両方とも、種々の濃度のコバルトイオンを含有するガラス（ＢＧ）（０〜４モル％、実施例１〜４）で４８時間条件付けした培地での細胞培養実験において観測した。
【図１３】種々の低酸素模倣生物活性ガラス（実施例１〜４、３４、４４及び４５）で条件付けした培地中で４８時間及び７日間についての骨芽細胞培養物の生存力（合計ＤＮＡ）を示す（Ｚｎ又はＭｇ含有量が示されているガラスの場合、２％ＣｏＯも存在する）。
【図１４】（ａ）コバルト含有するガラス（実施例３）及びコバルトを含有しないガラスに、種々の濃度において、２４時間暴露させた骨芽細胞（ＭＧ６３）細胞培養物において観測されたＶＥＧＦ発現；及び、（ｂ）これらの培養物において観測された代謝活性。
【図１５】下記において観測されたＶＥＧＦ発現を示す：種々の低酸素模倣生物活性ガラス（０〜４モルＣｏ％、実施例１〜４）で条件付けした培地中で２４時間培養した、（ａ）内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）、及び（ｂ）骨芽細胞（ＳａＯＳ−２）。
【図１６】低酸素模倣ガラス（２％Ｃｏ実施例３）に暴露した場合の非付着性単核細胞の付着性マクロファージ様細胞への分化を示す。
【図１７】図１７ａは、４日間の内皮（ＨＭＥＣ−１）細胞培養後のゲルキャストフォーミング法を使用して製造した多孔質低酸素生物活性ガラス足場（実施例２７）のＥＤＸ画像を示す。図１７ｂは、４日間の培養後のゲルキャスト足場で培養したＨＭＥＣ−１細胞の相対代謝活性を示す（低酸素イオンを含有しない対照に標準化）。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本明細書に使用されている用語の意味を下記に説明し、１つ又はそれ以上の下記の非限定的実施例に関して、本発明をさらに説明する。
【００９１】
本発明に関して、ガラスは生物活性ガラスであり、生体組織に埋め込んだ場合、それはガラスと周囲組織との界面結合の形成を誘導する。生物活性のインビトロ指数は、ガラス表面における、ヒドロキシカーボネート化アパタイト（ＨＣＡ）層の成長速度によって得られる。特定の好ましい実施形態において、生物活性ガラスは、刺激体液（ＳＢＦ）へのガラスの暴露時に、結晶性ＨＣＡ層の付着が３日以内、より好ましくは２４時間以内に起こる生物活性ガラスである。ＳＢＦに暴露した際のＨＣＡ層の付着（Kokubo T., J. Biomed. Mater. Res. 1990;24;721-735に記載されている）は、生物活性の認定試験である。
【００９２】
モルパーセントにおける例示ガラス組成
本発明の特定ガラス組成物を、下記の表に示す。多くのこれらのガラスについて行なった分析を、以下の実施例に記載する。
【００９３】
これらのガラスは、溶融誘導ガラス製造法によって製造することができ、前記方法は下記を含む：適切な酸化物（又は酸化物源、例えばカーボネート）を混合しブレンドし、混合物を約１２５０〜１５００℃の温度で均質化し（例えば、酸素バブリングによる）、混合物を冷却して（例えば、溶融混合物を好適な液体、例えば水に入れることによる）、ガラスフリットを得る。分子量及び下記の表に示されているモル％組成物に基づく標準計算を使用して、ガラス溶融混合物に必要とされる各成分の質量を求めることができる。従って、溶融混合物に使用される種々の酸化物（又は酸化物源）の適切量は、下記の表に示されている数値に基づいて算出できる。例えば、ガラス実施例２６は、４６．５３％ＳｉＯ２、２７．２７％ＣａＣＯ３、６．４７％Ｎａ２ＣＯ３、６．４７％Ｋ２ＣＯ３、２．９４％ＺｎＯ、２．９４％ＭｇＯ、１．９６％ＣｏＣＯ２、２．９４％ＳｒＣＯ３及び１．０５％Ｐ２Ｏ５を混合することによって製造できる。
【表１】
【表２】
【表３】
【００９４】
裏付け実験データ
低酸素模倣イオンは、本発明の再吸収性ガラスのシリカ網状構造に首尾よく組み込まれた。前記表に示されている本発明のガラス組成物は、ＩＣＰ、ｐＨ、ＤＳＣ、Ｘ線回折、ＮＭＲ及びＳＥＭ分析によって特性決定された。ガラスの組成及び製造が首尾よく操作されて、生理的関連範囲における低酸素模倣物の制御放出を可能にした。さらに、低酸素模倣物の制御放出に加えて、他のイオンの放出を制御するようにガラスの化学組成を開発した（これらは、生物学的応答（例えば、アパタイト形成又は細胞挙動）を決定するのに重要である）。これらのガラスの開発、組成及び特性決定が、本明細書に詳しく記載されている。
【００９５】
低酸素模倣ガラスからの溶解生成物（低酸素模倣イオン）は、転写因子低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を、正常酸素圧力環境において（図１２）、毒性を有さずに（図１３及び１４）安定化し、ＨＩＦ−標的遺伝子、例えばＶＥＧＦの転写を誘導し（図１４及び１５）、細胞分化を生じた（図１６）。本発明の低酸素模倣ガラスに対する、種々の細胞型の細胞応答を試験した（ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞（ＳａＯＳ−２及びＭＧ６３）、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び単核細胞（Ｕ９３７）を含む）。例えば、ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞（ＳａＯＳ−２）を、ＲＰＭＩ培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質を含有）において培養し、低酸素イオン含有ガラス条件付け培地又は対照ガラス条件培地を有する４８ウェルプレートに接種した（５０，０００／ｃｍ２）。細胞はさらに、ゲルキャストフォーミング法によって製造した本発明のガラスから形成された３Ｄ足場に直接的に首尾よく成長した（ガラス２７、図１７）。
【００９６】
従って、実験研究は、下記の実現可能性を確認した：低酸素イオン（例えばＣｏイオン）を含有する生物活性ガラス網状構造の形成；低酸素イオン放出速度の制御；及び、細胞毒性を有さない所望の細胞応答の発生、即ち、ＨＩＦ−１α経路の活性化（図１２）及び関連再生応答、例えば、強力血管新生因子ＶＥＧＦの発現増加（図１４及び１５）。例えば、いくつかの実験において、コバルト生物活性ガラス条件付け培地は、たった２４時間後に、毒性を有さずに、ＶＥＧＦ産生の濃度依存性６倍増加（ｐ＜０．０１）を誘導することが示された。
【００９７】
図１及び２は、時間の経過に伴うイオン放出の誘導結合プラズマ分析（ＩＣＰ）を示す。ガラスの組成は、（低酸素模倣）コバルトイオン放出速度を決定し、それによって、予測低酸素模倣放出プロフィールを可能にする。放出プロフィールは、本発明によって決定される製造及びガラス化学組成範囲に依存する。図１ａ及び２における低酸素調節生物活性ガラスの組成物系列は、ガラス実施例１〜４として列挙され、図１ｂにおける帯電平衡ガラス系列の組成物は、ガラス実施例５〜７として列挙される。本明細書に記載されている全ての実験における対照ガラス（０％Ｃｏ）は、ＳｉＯ２（４９．４６モル％）、Ｐ２Ｏ５（１．０７モル％）、ＣａＯ（２３．０８モル％）及びＮａ２Ｏ（２６．３８モル％）からなる。組成物が一定の網状構造結合性を維持するように構成された場合（ＮＣ＝２．１３（図１ｂ））、ガラス内のコバルトのモル％と放出との間に線形相関（０．９９回帰）が存在し、一方、網状構造結合性が増加する場合（図１ａ）、非線形多項相関が存在する。これらの低酸素調節生物活性ガラスの組成物は、公知の生理活性範囲内（４８μＭ〜２４０μＭ）でＣｏ２+を放出した。これらのガラスは生物活性であるので（図１３）、それらは、特に、骨組織再生を必要とする用途に有用である（例えば、骨充填剤として又は骨組織工学において、アパタイト形成と共に血管形成を促進することによる）。
【００９８】
図３及び４は、低酸素模倣物（それぞれＣｕ及びＣｏ）の放出が、ガラスの化学組成によって決定されることを示す。さらに、ガラス網状構造内の低酸素模倣物のモル％を増加させることが、ガラスの網状構造を改変し、他のガラスイオン（例えばＮａ）のイオン放出動態を予測的に変化させる。
【００９９】
図５は、ガラス網状構造内のリンのモル％を増加させることは、低酸素模倣物（Ｃｏ２＋）の放出を減少し、一方、Ｓｉ（ガラス網状構造形成剤）放出プロフィールを維持することを示す。従って、これらの特定の化学組成におけるガラスモル％Ｐは、低酸素模倣放出を制御するのに使用できる。高ホスフェートモル％を有する低酸素模倣ガラスを使用して、より低いモル％Ｐ濃度（１．０４％Ｐ）生物活性ガラス（図６）及びＢｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）によって以前に示された生物活性ガラスで観測されるｐＨ変化を減少させることができる。Ｐモル％を増加させることによって利用可能Ｈ＋イオンの数を減少させることを利用して、生物活性（アパタイト形成能力）を操作し、塩基性ｐＨ環境からの任意潜在的細胞毒性を最小限にすることができる。従って、これらのガラスは、ｐＨ変化を最小限にすることが重要な用途（例えば、細胞培養系、シャンプー）に使用し得る。
【０１００】
図７は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。特定ガラス組成物中の増加濃度のコバルトは、意外にも、ガラスの遷移温度を低下させる。ガラス中における網状構造形成剤又は調節剤としてのコバルトの役割は、ガラスの組成及びコバルトの濃度に依存する。ガラス遷移温度の低下は、ＣｏＯがガラス構造に入っていることを示す。
【０１０１】
図８は、本発明のガラスのＸＲＤトレースを示す。非晶質ハロ及び明確なピークの欠如は、物質が焼結後もなお非晶質であったことを示す。結晶質Ｃｏ相の証拠がなく、Ｃｏはガラス構造に組み込まれている。
【０１０２】
図９は、本発明のガラス（低酸素生物活性ガラス）の２９Ｓｉ ＭＡＳ−ＮＭＲ（マジック角度回転−核磁気共鳴）を示す。２９Ｓｉ ＭＡＳ−ＮＭＲは、試料の線幅はコバルト濃度の増加と共に増加する（コバルトの常磁性作用）が、ガラス構造は変化せず、従って、ガラス特性を維持できることを示した。図９ａは、ガラス実施例１〜４のデータを示し、図９ｂは、帯電平衡系列からのガラス（実施例５〜７）のデータを示す。
【０１０３】
図１０は、ゲルキャストフォーミング法（ガラス実施例２７を含有するガラス粒子スラリーの発泡、及びゲル化剤のインサイチュ重合を含む）を使用して製造した多孔質低酸素生物活性ガラス足場のＳＥＭ画像を示す。次に、ゲル化フォームを、ゲル化の直前に鋳型に注ぎ、熱処理して、ポリマーを除去し、ガラス粒子を焼結する。足場から放出される低酸素模倣イオンの制御放出は、血管新生、新機能骨成長及び生存の重要要素を促進する。
【０１０４】
図１１は、特定低酸素模倣生物活性ガラス組成物が、ＳＢＦと共に３週間インキュベートした場合に、アパタイト（ＰＯ４３− ９６０ｃｍ−１）を形成することを示す。形成されるアパタイトの量（９６０ｃｍ−１の領域）、アパタイトピーク（９６０ｃｍ−１）の全幅半値、及びカーボネート（ＣＯ３２＋）／ホスフェート（ＰＯ４３−）比は、化学組成及びＳＢＦインキュベーション期間に依存して変化した。これは、特定の用途に特異的生物活性を有する低酸素模倣ガラスの製造を可能にする。
【０１０５】
細胞培養実験
低酸素模倣ガラスからの溶解生成物の細胞毒性を最小限にしながらＨＩＦ−１αの発現を安定化し組織再生応答を促進する能力を、ＨＩＦ−１α転写因子アッセイ（Ｒ＆Ｄシステム及びＴｒａｎｓＡＭ（商標）Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）免疫蛍光検査法、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ，ＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ）、全ＤＮＡ及びＭＴＴによってそれぞれ測定した。本発明のガラスからの溶解生成物に対する、種々の細胞型の細胞応答を試験した（前記細胞型は、下記を含む：ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞（ＳａＯＳ−２及びＭＧ６３）、ヒト微小血管内皮細胞系−１（ＨＭＥＣ−１）及びヒト単核細胞系（Ｕ９３７））。
【０１０６】
ヒト微小血管内皮細胞系−１（ＨＭＥＣ−１）は、１％ゼラチン（ウシ皮膚、Ｓｉｇｍａ）被覆７５ｃｍ３フラスコ中で、内皮基本培地、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（ＥＧＦ、Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１％抗生物質−抗真菌剤及び５％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＭＣＤＢ−１３１で培養した。ＳａＯＳ−２及びＵ９３７細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。ヒト骨様骨肉腫細胞系ＭＧ−６３（ＥＣＣＡＣ）は、１０％ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補足したＤＭＥＭで培養した。ガラス（ＢＧ）条件培地は、種々の組成のガラス粒子（＜４５μｍ直径）を、２０ｍＬの所望培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＣＤＢ−１３１）中で、３７℃で４時間インキュベーションし、次に、遠心分離し、濾過して粒子を除去することによって形成した。
【０１０７】
図１２ａは、ＨＩＦ−１α発現のＣｏ−ガラス濃度依存性増加を示す。ＨＩＦ−１α発現を、シトクロムｃ（Ｃｙｔ．Ｃ）に標準化した。ＣｏＣｌ２を、ＨＩＦ−１α発現の正の対照として使用した。図１２ｂは、低酸素模倣ガラスが、濃度依存的に（低酸素模倣物のモル％）、ＨＩＦ−１α発現を安定化し（Ｐ＜０．０５）、それによって、核へのそのトランスロケーション及び低酸素関連遺伝子発現を可能にすることを示している。低酸素模倣物を含有しない対照ガラス（０モル％Ｃｏ）からの条件培地において、ＨＩＦ−１α安定化の有意な増加が観測されなかった。
【０１０８】
図１３は、種々の組成の低酸素模倣ガラスからの条件培地において、４８時間又は７日間培養した骨芽細胞（ＳａＯＳ−２）の細胞生存力（ＤＮＡの量）を示す。７日間培養した４モル％Ｃｏ（実施例４）含有低酸素模倣物を除いて、種々の低酸素模倣ガラス組成物は、この培養期間にわたって、全てのガラス組成において、細胞生存力に影響を与えない。これは、コバルトの低酸素ガラスモル％濃度、及び放出プロフィールが、細胞毒性を最小限にするのに重要であることを示す。
【０１０９】
図１４は、低酸素ガラス（実施例３）及び対照ガラス（０％Ｃｏ、４９．４６モル％Ｓｉ、１．０７モル％Ｐ２Ｏ５、２３．０８モル％ＣａＯ及び２６．３８モル％Ｎａ２Ｏ）によって種々の濃度で条件付けした培地での細胞培養実験の結果を示す。たった２４時間の培養後に、骨芽細胞（ＭＧ６３）による、強力血管新生因子ＶＥＧＦの発現の劇的なコバルト−生物活性ガラス濃度依存性増加が観測された（ａ）。並行実験は、低酸素生物活性ガラス特異的毒性がないことを示した（低酸素刺激Ｃｏイオンを含有しない生物活性ガラスとの比較）（ｂ）。コバルト生物活性ガラス条件付け培地は、たった２４時間後に、毒性を伴わずに、ＶＥＧＦ産生の濃度依存性６倍増加を誘導した（ｐ＜０．０１）（図１２）。
【０１１０】
図１５は、増加するＣｏモル％の低酸素生物活性ガラス（ガラス実施例１〜４）で条件付けした培地において４８時間培養後の単核細胞（Ｕ９３７）及び内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）による、強力血管新生因子ＶＥＧＦ発現の劇的かつ濃度依存性の増加を示す。発現されたＶＥＧＦの量は、細胞型及び低酸素ガラス化学組成に特異的である。
【０１１１】
図１６は、低酸素ガラス誘導単核細胞分化を示す。この例において、非付着性非分化Ｕ９３７に対するものとしての分化付着性単核細胞様細胞（Ｕ９３７）の数を、蛍光ＤＡＰＩ染色（ａ）及び代謝活性（ｂ）によって測定した。対照ガラス（３ｇ／２０ｍＬの０％Ｃｏ２＋対照ガラスを３時間インキュベートした）と比較して、低酸素ガラス（ＢＧ）条件培地（０．０３ｇ／２０ｍＬの組成実施例３を３時間インキュベートした）において、有意に増加したＵ９３７分化が生じた。しかし、低酸素ガラス制御単核細胞分化は、ＰＭＡ（ホルボール−ミリステートアセテート）誘導分化より少なかった。単核細胞の漸増、及びそれらのマクロファージへの分化は、創傷治癒及び潜在的微生物感染との闘いの重要部分である。ＰＭＡは、細胞が分化できること示すための正の対照である。
【０１１２】
多孔質ガラス足場の製造
ゲルキャストフォーミング法を使用して、多孔質ガラス足場を、ガラス実施例２７から製造した。次に、足場をＭＣＤＢ−１３１に２４時間浸漬し、次に、内皮細胞（２０，０００細胞／ｍＬ、ＨＭＥＣ−１細胞）を４日間接種した。足場のＳＥＭ画像は、４日間の細胞培養後に、足場に増殖している半集密内皮細胞層を示した。内皮細胞の充分に拡散した相互接続形態が観察され、これは内皮細胞が生存可能であり、足場が非細胞毒性であることを示している。エネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）分析は、低酸素模倣物（Ｃｏ）が、４日間の細胞培養後にガラス網状構造になお存在することを示した。
【０１１３】
本明細書に記載した現在の好ましい実施形態に関する種々の変更及び改変が、当業者に明らかであることを認識すべきである。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく加え得るそのような変更及び改変は、本発明の範囲内に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０〜６２％ＳｉＯ２；
０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；
合計含有率１２〜４５％のＣａＯ及びＳｒＯ；
合計含有率６〜３０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び
０．１〜１０％低酸素模倣イオン源；
を含み、前記低酸素模倣イオンが、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ及びＦｅイオンから選択される１つ又はそれ以上のものである、ガラス。
【請求項２】
４５〜６２％ＳｉＯ２、０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５、並びに合計含有率６〜２８％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏを含み、そして／又は、ＭｇＯ ０〜１２％、ＺｎＯ ０〜１０％、Ｂ２Ｏ３ ０〜１５％、及びフッ素源（例えば、ＣａＦ２）０〜１０％を含む、請求項１に記載のガラス。
【請求項３】
非晶質ガラス網状構造を含み、前記低酸素模倣イオンが非晶質ガラス網状構造に組み込まれている、請求項１又は２に記載のガラス。
【請求項４】
前記低酸素刺激イオンがＣｏ又はＣｕである、請求項１から３のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項５】
前記低酸素刺激イオン源が０．５〜５モル％で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項６】
４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％１８〜２５％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜２％ＺｎＯ；０〜２％ＭｇＯ；及び０．１〜１０％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項７】
骨又は硬質組織用途、例えば、骨又は硬質組織の修復又は再生を促進するために使用される、請求項６に記載のガラス。
【請求項８】
４９〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５（例えば０〜１０％）；合計モル％１６〜１８％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％１８〜２０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；１〜３％ＺｎＯ；１〜３％ＭｇＯ；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項９】
歯周用途に使用される、請求項８に記載のガラス。
【請求項１０】
４６〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（例えば０〜１０％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％２０〜２９％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％１２〜１４％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；２〜４％ＺｎＯ；２〜４％ＭｇＯ；０〜９％ＣａＦ２；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１１】
多孔質骨足場の形成に使用される、請求項１０に記載のガラス。
【請求項１２】
４８〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（例えば０〜１０％）；合計モル％３０〜４１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％６〜８％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び０．１〜１０％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１３】
４〜６％ＺｎＯ及び４〜６％ＭｇＯをさらに含む、請求項１２に記載のガラス。
【請求項１４】
複合材料用の充填剤に使用される、請求項１２又は１３に記載のガラス。
【請求項１５】
４７〜６２％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％１２〜１７％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％１２〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜６％ＺｎＯ；０〜３％ＭｇＯ；及び０．１〜１０％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１６】
軟質組織用途に使用される、請求項１５に記載のガラス。
【請求項１７】
４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％１８〜２１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜６％ＺｎＯ；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１８】
脱毛症を治療するためのシャンプーに使用される、請求項１７に記載のガラス。
【請求項１９】
３０〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；合計モル％２２〜２８％のＣａＯ及びＳｒＯ；２２〜２８％のＮａ２Ｏ；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２０】
ガラスが生物活性ガラスである、請求項１から１４又は１７から１８のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２１】
ガラスが生物活性でない、請求項１から５、１５又は１６のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２２】
ＳｉＯ２、Ｐ２Ｏ５及びＢ２Ｏ５の合計モル％が、８０％を超えない、請求項１から２１のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２３】
ＳｒＯ、ＣａＯ、ＭｇＯ、Ｎａ２Ｏ及びＫ２Ｏの合計モル％が、４０〜６０％である、請求項１から２２のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２４】
０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２５】
粒子形態において、３Ｄ構造物として、固形物、例えばディスク又はモノリスとして、分解性ポリマー足場に組み込まれる足場として使用される多孔質固形物として、提供される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラスを含む、３Ｄ多孔質足場、繊維、被覆埋め込み可能物質、骨代替物、組織再生構成物、創傷治癒デバイス、組織工学足場、縫合糸、プロテーゼインプラント、ポリマーマトリックス、フィブリンゲル、ヒドロゲル、プラスター、創傷被覆材、クリーム又はシャンプー。
【請求項２７】
医薬に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２８】
組織の損傷の予防及び／又は治療に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２９】
血管新生又はリンパ管新生の誘導、抗微生物活性の促進、又は細胞生存力の維持に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３０】
軟質組織再生を促進することによる創傷修復に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３１】
創傷、火傷、潰瘍（糖尿病性、神経障害性、血管性）、褥瘡、術後皮膚創傷、アクネ、脱毛症、歯周病、虫歯、脱灰歯、歯の知覚過敏、脊椎形成術、骨折の予防及び／又は治療に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３２】
骨及び／又は硬質組織の再生及び修復の促進、感染症の治療、細胞保護特性の増強、細胞損傷の抑制及び修復細胞（成体幹細胞）の漸増、軟骨の修復、再建及び再生、指向幹細胞分化、発毛の促進及び／又は髪の太さの増加、例えば、脱毛症、加齢によるか又は化学療法の結果としての髪減少の治療に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３３】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラスを含む組成物であって、歯科用複合材料、分解性ポリマー、ポリマー足場複合材料、天然ポリマー複合材料、ポリマー縫合糸、生物活性多孔質足場、創傷被覆材、ポリペプチドゲル、アルギネートビーズ、骨代替物、ヒドロゲル、フィブリン構成物、散剤、クリーム剤、シャンプー、生物活性ガラス充填アクリル、ガラス充填ポリアクチド又は他のポリマー、ガラス充填Ｂｉｓ ＧＭＡ又は歯科用複合材料、ガラスグラニュール又は焼結ガラスである組成物。
【請求項３４】
組織の損傷の予防及び／又は治療に使用される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス又は請求項３３又は３４に記載の組成物と、培養細胞、又は患者若しくはドナーから直接分離した細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、幹細胞及び神経細胞の１つ又はそれ以上を含むがそれらに限定されない）を含む組成物。
【請求項３６】
成体幹細胞、胚性幹細胞、多能性細胞の分化を指向するか、インビトロ培養細胞の表現型を維持するか、又はインビボでの細胞表現系を維持するために使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス、又は請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項３７】
成体幹細胞及び胚性幹細胞の軟骨細胞型への分化を指向するために使用される、請求項３６に記載のガラス。
【請求項３８】
組織の損傷を予防及び／又は治療する方法であって、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス、又は請求項３３から３５のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項３９】
骨折、歯周病、潰瘍、創傷治癒及び軟骨修復の治療に使用される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
任意の１つ又はそれ以上の実施例及び／又は図面に関して本明細書に実質的に記載されているガラス又は組成物。
【請求項１】
３０〜６２％ＳｉＯ２；
０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；
合計含有率１２〜４５％のＣａＯ及びＳｒＯ；
合計含有率６〜３０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び
０．１〜１０％低酸素模倣イオン源；
を含み、前記低酸素模倣イオンが、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ及びＦｅイオンから選択される１つ又はそれ以上のものである、ガラス。
【請求項２】
４５〜６２％ＳｉＯ２、０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５、並びに合計含有率６〜２８％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏを含み、そして／又は、ＭｇＯ ０〜１２％、ＺｎＯ ０〜１０％、Ｂ２Ｏ３ ０〜１５％、及びフッ素源（例えば、ＣａＦ２）０〜１０％を含む、請求項１に記載のガラス。
【請求項３】
非晶質ガラス網状構造を含み、前記低酸素模倣イオンが非晶質ガラス網状構造に組み込まれている、請求項１又は２に記載のガラス。
【請求項４】
前記低酸素刺激イオンがＣｏ又はＣｕである、請求項１から３のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項５】
前記低酸素刺激イオン源が０．５〜５モル％で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項６】
４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％１８〜２５％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜２％ＺｎＯ；０〜２％ＭｇＯ；及び０．１〜１０％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項７】
骨又は硬質組織用途、例えば、骨又は硬質組織の修復又は再生を促進するために使用される、請求項６に記載のガラス。
【請求項８】
４９〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５（例えば０〜１０％）；合計モル％１６〜１８％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％１８〜２０％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；１〜３％ＺｎＯ；１〜３％ＭｇＯ；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項９】
歯周用途に使用される、請求項８に記載のガラス。
【請求項１０】
４６〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（例えば０〜１０％）；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％２０〜２９％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％１２〜１４％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；２〜４％ＺｎＯ；２〜４％ＭｇＯ；０〜９％ＣａＦ２；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１１】
多孔質骨足場の形成に使用される、請求項１０に記載のガラス。
【請求項１２】
４８〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５（例えば０〜１０％）；合計モル％３０〜４１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％６〜８％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；及び０．１〜１０％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１３】
４〜６％ＺｎＯ及び４〜６％ＭｇＯをさらに含む、請求項１２に記載のガラス。
【請求項１４】
複合材料用の充填剤に使用される、請求項１２又は１３に記載のガラス。
【請求項１５】
４７〜６２％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％１２〜１７％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％１２〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜６％ＺｎＯ；０〜３％ＭｇＯ；及び０．１〜１０％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１６】
軟質組織用途に使用される、請求項１５に記載のガラス。
【請求項１７】
４７〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；０〜２％Ｂ２Ｏ３；合計モル％１８〜２１％のＣａＯ及びＳｒＯ；合計モル％２４〜２７％のＮａ２Ｏ及びＫ２Ｏ；０〜６％ＺｎＯ；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項１８】
脱毛症を治療するためのシャンプーに使用される、請求項１７に記載のガラス。
【請求項１９】
３０〜５０％ＳｉＯ２；０．５〜１５％Ｐ２Ｏ５；合計モル％２２〜２８％のＣａＯ及びＳｒＯ；２２〜２８％のＮａ２Ｏ；及び０．１〜５％低酸素刺激イオン源を含む、請求項１又は３から５のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２０】
ガラスが生物活性ガラスである、請求項１から１４又は１７から１８のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２１】
ガラスが生物活性でない、請求項１から５、１５又は１６のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２２】
ＳｉＯ２、Ｐ２Ｏ５及びＢ２Ｏ５の合計モル％が、８０％を超えない、請求項１から２１のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２３】
ＳｒＯ、ＣａＯ、ＭｇＯ、Ｎａ２Ｏ及びＫ２Ｏの合計モル％が、４０〜６０％である、請求項１から２２のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２４】
０．５〜１．５％Ｐ２Ｏ５を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２５】
粒子形態において、３Ｄ構造物として、固形物、例えばディスク又はモノリスとして、分解性ポリマー足場に組み込まれる足場として使用される多孔質固形物として、提供される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラスを含む、３Ｄ多孔質足場、繊維、被覆埋め込み可能物質、骨代替物、組織再生構成物、創傷治癒デバイス、組織工学足場、縫合糸、プロテーゼインプラント、ポリマーマトリックス、フィブリンゲル、ヒドロゲル、プラスター、創傷被覆材、クリーム又はシャンプー。
【請求項２７】
医薬に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２８】
組織の損傷の予防及び／又は治療に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項２９】
血管新生又はリンパ管新生の誘導、抗微生物活性の促進、又は細胞生存力の維持に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３０】
軟質組織再生を促進することによる創傷修復に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３１】
創傷、火傷、潰瘍（糖尿病性、神経障害性、血管性）、褥瘡、術後皮膚創傷、アクネ、脱毛症、歯周病、虫歯、脱灰歯、歯の知覚過敏、脊椎形成術、骨折の予防及び／又は治療に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３２】
骨及び／又は硬質組織の再生及び修復の促進、感染症の治療、細胞保護特性の増強、細胞損傷の抑制及び修復細胞（成体幹細胞）の漸増、軟骨の修復、再建及び再生、指向幹細胞分化、発毛の促進及び／又は髪の太さの増加、例えば、脱毛症、加齢によるか又は化学療法の結果としての髪減少の治療に使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス。
【請求項３３】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラスを含む組成物であって、歯科用複合材料、分解性ポリマー、ポリマー足場複合材料、天然ポリマー複合材料、ポリマー縫合糸、生物活性多孔質足場、創傷被覆材、ポリペプチドゲル、アルギネートビーズ、骨代替物、ヒドロゲル、フィブリン構成物、散剤、クリーム剤、シャンプー、生物活性ガラス充填アクリル、ガラス充填ポリアクチド又は他のポリマー、ガラス充填Ｂｉｓ ＧＭＡ又は歯科用複合材料、ガラスグラニュール又は焼結ガラスである組成物。
【請求項３４】
組織の損傷の予防及び／又は治療に使用される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス又は請求項３３又は３４に記載の組成物と、培養細胞、又は患者若しくはドナーから直接分離した細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、幹細胞及び神経細胞の１つ又はそれ以上を含むがそれらに限定されない）を含む組成物。
【請求項３６】
成体幹細胞、胚性幹細胞、多能性細胞の分化を指向するか、インビトロ培養細胞の表現型を維持するか、又はインビボでの細胞表現系を維持するために使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス、又は請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項３７】
成体幹細胞及び胚性幹細胞の軟骨細胞型への分化を指向するために使用される、請求項３６に記載のガラス。
【請求項３８】
組織の損傷を予防及び／又は治療する方法であって、請求項１から２４のいずれか一項に記載のガラス、又は請求項３３から３５のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項３９】
骨折、歯周病、潰瘍、創傷治癒及び軟骨修復の治療に使用される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
任意の１つ又はそれ以上の実施例及び／又は図面に関して本明細書に実質的に記載されているガラス又は組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１１−５２４３２４（Ｐ２０１１−５２４３２４Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１０８０（Ｐ２０１１−５１１０８０）
【出願日】平成２１年５月２７日（２００９．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１３２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４４４５３
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５０８０４７６７９）インペリアル イノベーションズ リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２７日（２００９．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１３２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４４４５３
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５０８０４７６７９）インペリアル イノベーションズ リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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