併用化学療法の奏効性判定方法、奏効性判定プログラム及び奏効性判定装置
【課題】本発明の目的は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性のより信頼性の高い判定方法を提供することである。
【解決手段】本発明は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程とを有する併用化学療法の奏効性判定方法である。
【解決手段】本発明は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程とを有する併用化学療法の奏効性判定方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、併用化学療法の奏効性判定方法、奏効性判定プログラム及び奏効性判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の一般的な治療法の一つに化学療法があり、この化学療法として各種の抗癌剤投与が行われている。特に最近では、抗癌剤のそれぞれの特性を生かし、２剤以上の抗癌剤を組み合わせて使用する併用化学療法により、手術の不可能な進行癌も治療できるようになってきている。しかし、このような併用化学療法の有効性は、癌の種類や患者毎に大きく異なることが知られている。従って、抗癌剤の選択を誤り効果的でない抗癌剤を投与した場合や、適切でない組み合わせの抗癌剤を併用した場合等は、癌の再発可能性が高まるばかりでなく、抗癌剤の副作用により患者の体力が低下し、次に有効な別の抗癌剤を投与しても十分な効果を得られない恐れがある。このことから、個々の患者に有効な抗癌剤及び併用化学療法に用いる抗癌剤の適切な組み合わせをその投与前に正確に特定することができるシステムの開発が切望されている。
【０００３】
一方、癌に対する抗癌剤の選定方法としては、従来、患者から単離した癌細胞に様々な抗癌剤を接触させ、癌細胞の増殖抑制等を指標として、その癌細胞に有効と思われる抗癌剤を特定する方法が採用されてきた。しかしながら、このような試行錯誤的方法では、検査結果の再現性が不十分な場合も多いため、その検査結果が臨床治療効果に反映されないという不都合がある。また、上記感受性判定方法には、大量の癌細胞が必要となるため、患者への負担が大きいという不都合もある。そこで、抗癌剤を用いた併用化学療法の奏効性を予め判定できるシステムの確立は非常に重要である。
【０００４】
そのための試みのひとつとして、抗癌剤の毒性を弱めることに関与していると考えられているグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼπ（ＧＳＴπ）の癌組織における発現量に基づき、乳癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する方法が知られている（非特許文献１参照）。また、癌患者から採取した悪性腫瘍中のサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ：ＣＤＫ）１及びＣＤＫ２の比活性値に基づき、癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する方法が報告されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０５７４８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１１３，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０２−１０８，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性について、より信頼性の高い判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するためになされた発明は、
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、
上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程と
を有する併用化学療法の奏効性判定方法である。
【０００９】
上記癌細胞としては乳癌の癌細胞が好ましい。
【００１０】
当該奏効性判定方法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法に好適に使用される。
【００１１】
当該奏効性判定方法は、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から下記式（１）を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含み、
上記判定工程は、上記算出工程で算出したリスクスコア及び上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定するとよい。
リスクスコア＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ） ・・・（１）
（式（１）中、ｘは、ＣＤＫ１の比活性値である。ｙは、ＣＤＫ１の比活性値に対するＣＤＫ２の比活性値の比である。）
【００１２】
上記Ｆ（ｘ）を下記式（２）で表し、Ｇ（ｙ）を下記式（３）で表すとよい。
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ）） ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ）） ・・・（３）
（式（２）及び（３）中、ａ〜ｆは定数である。）
【００１３】
上記判定工程は、上記リスクスコアと第１の閾値を比較し、上記ＧＳＴπの発現量と第２の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定するとよい。
【００１４】
上記判定工程は、上記リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定するとよい。
【００１５】
当該奏効性判定方法の上記判定工程は、奏効性判定プログラムとコンピュータとの協働によって、又は奏効性判定装置によって実現させることができる。
【００１６】
すなわち、本発明の奏効性判定プログラムは、
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する機能と、
取得されたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する機能と
をコンピュータに実現させるためのプログラムである。
【００１７】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能が、ＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値をＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報として取得してもよい。
【００１８】
また、本発明の併用化学療法の奏効性判定装置は、
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報を取得する取得部と、
上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定部と
を備える。
【００１９】
上記取得部が、ＣＤＫ１の比活性値の情報としてＣＤＫ１の活性値と発現量を取得し、ＣＤＫ２の比活性値の情報としてＣＤＫ２の活性値と発現量を取得し、
上記判定部が、上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の併用化学療法の奏効性判定方法によれば、信頼性高く、かつ簡易に、癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施の形態２における併用化学療法の奏効性判定システムの概略構成図である。
【図２】図１のＣＰＵが行う各手順を示すフローチャートである。
【図３】リスクスコアを用いてＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線である。
【図４】ＧＳＴπを用いてＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線である。
【図５】リスクスコア及びＧＳＴπを用いてＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明の実施形態を詳説するが、本発明は以下の実施の形態に限定されない。
【００２３】
［実施の形態１］併用化学療法の奏効性判定方法
当該奏効性判定方法は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程とを有する。また、上記ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から、上記式（１）を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含むことが好ましい。以下、各工程について詳述する。
【００２４】
（第１取得工程）
第１取得工程は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する工程である。
【００２５】
上記第１取得工程における癌細胞としては、悪性腫瘍を構成する細胞であれば特に制限されるものではなく、例えば乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、白血病細胞等の癌細胞が挙げられる。これらのうち、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、皮膚癌、及び白血病細胞の癌細胞が好ましく、これらのうち乳癌の癌細胞がより好ましい。
【００２６】
上記生体試料は、癌患者から採取された癌細胞を含む試料であれば特に限定されない。この生体試料としては、具体的には、癌患者の血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、及び手術や生検により癌患者から採取した細胞や組織等が挙げられる。また、癌患者から採取した細胞や組織を培養して得られた試料を生体試料として用いることもできる。
【００２７】
上記ＣＤＫ１は、細胞周期のＧ２期からＭ期に移行する際に活性を示すタンパク質である。一方、ＣＤＫ２は、細胞周期のＧ１期からＳ期に移行する際に活性を示すタンパク質である。一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行われていることから、ＤＮＡの複製期であるＳ期と、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間であるＧ２期にある細胞の割合が多いと考えられる。また、癌細胞に見られる異数倍体性は、細胞が細胞分裂期であるＭ期を異常な状態で経過した場合、又はＭ期を経ずにＧ１期に進みそのままＳ期に移行した場合に発生するとされているため、Ｍ期に存在する細胞の割合が少ないと考えられる。このように、癌細胞においては細胞周期の制御に異常を来していることが多いため、細胞周期を制御する上記ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量や活性値は、細胞が癌化しているか否かを判断する上でも、重要な因子であると考えられている。
【００２８】
例えば、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２（以下、「ＣＤＫ］ともいう）の比活性比（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）は、Ｓ期またはＧ２期にある細胞が、Ｍ期にある細胞に比べてどれだけ多く存在するかを反映する数値であると考えることができ、細胞の増殖能を正確に反映するパラメータとして用いることができる。
【００２９】
上記ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値は、癌細胞を含む生体試料中のそれぞれのＣＤＫ活性値をＣＤＫ発現量で割って得られる値である。なお、当該奏効性判定方法の第１取得工程は、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得できればよく、ＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量を測定するＣＤＫ測定工程と、上記ＣＤＫ測定工程で得られた結果からそれぞれの比活性値を算出する比活性値算出工程を有してもよい。
【００３０】
上記ＣＤＫ活性値は、例えば、ＣＤＫによってリン酸化される基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で表す）等で表される。なお、ＣＤＫがリン酸化する基質として、例えばヒストンＨ１等が挙げられる。
【００３１】
上記ＣＤＫ測定工程においては、上記ＣＤＫ活性値を公知のＣＤＫ活性測定方法によって測定することができる。上記公知の方法のうち、放射性物質を用いる方法としては、例えば測定試料の細胞可溶化液からＣＤＫを含む試料を調製し、この試料と３２Ｐ標識したアデノシントリホスフェート（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、３２Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定する方法等が挙げられる。また、放射性物質を用いない方法としては、米国特許出願第２００２／０１６４６７３号に記載された方法等が挙げられる。この方法は、まず検体の細胞可溶化液から目的のＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質タンパク質を反応させて、この基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入する。導入された上記モノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量を測定する方法である。
【００３２】
上記測定試料の細胞可溶化液からＣＤＫを含む試料を調製する方法としては、測定対象となる癌細胞を含む生体試料の可溶化液から、例えば抗ＣＤＫ抗体等を用いてＣＤＫを特異的に捕捉することにより調製する方法等が挙げられる。
【００３３】
上記ＣＤＫ発現量は、測定対象となる癌細胞を含む生体試料の可溶化液に含まれる目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）である。また、上記ＣＤＫ測定工程において、上記ＣＤＫ発現量は、上記の可溶化液からＣＤＫ量を測定する公知の方法で測定することができる。上記ＣＤＫ発現量の測定方法としては、例えば目的のＣＤＫを抗ＣＤＫ抗体等の特異的抗体を用いて捕捉し、捕捉されたＣＤＫを定量する方法等を用いることができ、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、米国特許出願第２００４／０２１４１８０号に記載された方法等が挙げられる。
【００３４】
（第２取得工程）
当該奏効性判定方法における第２取得工程とは、ＧＳＴπの発現量を取得する工程である。
【００３５】
上記ＧＳＴπとは、ヒトのグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ファミリーに属する酵素のうち、ＧＳＴＰ１遺伝子にコードされた分子量約２２．５ｋＤａのタンパク質である。ＧＳＴπは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と抗癌剤との抱合体形成を触媒することにより、抗癌剤の毒性を弱めることに関与している。そのため、一般的にＧＳＴπが高発現している癌細胞は、ＧＳＴπが低発現している癌細胞に比べ、抗癌剤に対する耐性が高まると考えられている。
【００３６】
当該奏効性判定方法の第２取得工程においては、ＧＳＴπの発現量を取得するのみでもよいし、ＧＳＴπの発現量を測定するＧＳＴπ測定工程をさらに含んでいてもよい。
【００３７】
上記ＧＳＴπ測定工程におけるＧＳＴπの発現量の測定方法としては、ＧＳＴπタンパクの発現量、ｍＲＮＡの発現量等を測定することができる方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、２次元電気泳動法、プロテインチップによる解析法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、免疫蛍光法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法及びＤＮＡチップによる方法等が挙げられる。これらのうち、定量性、再現性、簡便さ等の観点から、ＧＳＴπタンパクの発現量の測定方法としてはウエスタンブロット法、ドットブロット法及びＥＬＩＳＡ法が好ましく、ＧＳＴπのｍＲＮＡの発現量の測定方法としてはノーザンブロット法が好ましい。なかでも、当該判定方法の正確性の観点から、ＧＳＴπタンパクの発現量の測定方法であるドットブロット法及びウエスタンブロット法がより好ましい。
【００３８】
（算出工程）
算出工程とは、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から上記式（１）を用いてリスクスコアを算出する工程である。
【００３９】
上記式（１）中、ｘは、ＣＤＫ１の比活性値である。ｙは、ＣＤＫ１の比活性値に対するＣＤＫ２の比活性値の比である。
【００４０】
ここで、ＣＤＫ１比活性値ｘを第１のリスク要素とし、ＣＤＫ比活性比（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）ｙを第２のリスク要素とし、第１及び第２リスク要素それぞれの値と併用化学療法が奏効しないリスクとの関係を評価することができる。併用化学療法が奏効しないリスクの数値的な評価のうち、第１リスク要素に基づく評価を関数Ｆ（ｘ）で表す。また、併用化学療法が奏効しないリスクの数値的な評価のうち第２リスク要素に基づく評価を関数Ｇ（ｙ）で表す。さらに、併用化学療法が奏効しないリスクの数値的な評価のうち、第１及び第２リスク要素に基づく評価をリスクスコアとし、このリスクスコアは、Ｆ（ｘ）とＧ（ｙ）の積で与えられるものとする。
【００４１】
上記Ｆ（ｘ）が上記式（２）で表され、Ｇ（ｙ）が上記式（３）で表されることが好ましい。上記式（２）及び（３）中、ａ〜ｆは定数である。
【００４２】
上記定数ａ〜ｃは、ＣＤＫ１比活性値と併用化学療法が奏効しない確率との関係で定まる定数であり、定数ｄ〜ｆは、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値と併用化学療法が奏効しない確率との関係で定まる定数である。
【００４３】
（判定工程）
本発明の判定工程は、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する工程である。
【００４４】
上記併用化学療法とは、抗癌剤を２剤以上組み合わせて行う治療法である。具体的な併用化学療法としては、アンスラサイクリン系抗癌剤と他の抗癌剤とを用いる併用療法（１）、タキサン系抗癌剤と他の抗癌剤とを用いる併用療法（２）、アンスラサイクリン系抗癌剤とタキサン系抗癌剤とを用いる併用療法（３）、その他の抗癌剤を用いる併用療法（４）等に分類される。
【００４５】
上記併用療法（１）としては、例えばＡＣ、ＦＡＣ、ＦＥＣ、ＥＣ等が挙げられる。上記併用療法（２）としては、例えばＴＣ等が挙げられる。上記併用療法（３）としては、例えばＴＡＣ、ＡＣ−Ｔ、ＦＥＣ−Ｔ、Ｔ−ＦＥＣ等が挙げられる。上記併用療法（４）としては、ＣＭＦ等が挙げられる。なお、上記併用療法におけるＡ、Ｃ、Ｆ、Ｅ、Ｔは下記抗癌剤を示す。
【００４６】
Ａ：ドキソルビシン（アンスラサイクリン系）
Ｃ：シクロフォスファミド
Ｆ：フルオロウラシル
Ｅ：エピルビシン（アンスラサイクリン系）
Ｔ：パクリタキセル又はドセタキセル（タキサン系）
【００４７】
また、ＡＣ−Ｔとは、Ａ及びＣの投与を行い、次いでＴの投与を行う治療法を示し、ＦＥＣ−Ｔとは、Ｆ、Ｅ及びＣの投与を行い、次いでＴの投与を行う治療法を示す。Ｔ−ＦＥＣとは、逆にＴの投与を先に行い、次いでＦ、Ｅ及びＣの投与を行う治療法を示す。このように、全ての抗癌剤を同時に投与するだけでなく、時間をずらして投与する治療法も併用化学療法に含まれる。
【００４８】
上記併用化学療法としては、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法であることが好ましく、これらのうち、Ｔ−ＦＥＣ、ＡＣ−Ｔ、ＴＡＣ、ＦＥＣ−Ｔがより好ましい。
【００４９】
上記判定工程は、上記リスクスコアと第１の閾値を比較し、上記ＧＳＴπの発現量と第２の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定することが好ましい。
【００５０】
上記判定工程は、上記リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定することが好ましい。
【００５１】
上記第１の閾値としては、癌細胞の種類、生体試料の種類、ＣＤＫの発現量の測定方法等に応じて適切な値を適宜設定することができる。例えば、複数の癌患者から採取した生体試料中のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量及び活性値から算出されるリスクスコアと、それぞれの癌患者の併用化学療法に対する奏効性、すなわち併用化学療法による病理学的腫瘍消失（ｐＣＲ）の有無とから閾値を算出することができる。これらのデータから閾値を設定する方法としては、例えばＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）分析、中央値の算出、平均値±標準偏差の算出等の方法が挙げられる。生体試料中のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量及び活性値から算出されるリスクスコアがこの閾値以下である場合には、その癌患者に対して併用化学療法は奏効性が低いと判定される。また、上記リスクスコアが上記閾値より大きい場合には、癌患者に対しての併用化学療法の奏効性について一定の傾向は得られないため、奏効性を判定することはできない。なお、ここで癌患者に対して併用化学療法が奏効性を示すとは、例えばＴ−ＦＥＣ等の併用化学療法により腫瘍が消失すること等をいう。但し、併用化学療法が奏効性を示すと判断する基準は、癌の種類等によりそれぞれ適切な基準を設定する必要がある。
【００５２】
上記第２の閾値としては、癌細胞の種類、生体試料の種類、ＧＳＴπの発現量の測定方法等に応じて適切な値を適宜設定することができる。例えば、複数の癌患者から採取した生体試料中のＧＳＴπの発現量と、それぞれの癌患者の併用化学療法に対する奏効性、すなわち併用化学療法による病理学的腫瘍消失（ｐＣＲ）の有無とから閾値を算出することができる。これらのデータから閾値を設定する方法としては、上記第1の閾値と同様の方法等を挙げることができる。生体試料中のＧＳＴπの発現量が設定された閾値より大きい場合には、併用化学療法の奏効性が低いと判定される。なお、上記ＧＳＴπの発現量が上記閾値以下である場合には、癌患者に対しての併用化学療法の奏効性について一定の傾向は得られないため、奏効性を判定することはできない。
【００５３】
なお、併用化学療法の奏効性判定において、リスクスコアとＧＳＴπの発現量を組み合わせてその指標とすることにより、リスクスコア、ＧＳＴπの発現量それぞれを単独で用いた場合と比較して、より信頼性が高くなり、特に陰性適中率（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ：ＮＰＶ）に優れる。ここで、上記奏効性判定の信頼性は、Ｐ−ｖａｌｕｅにより判断することができ、その信頼性がより高い場合はＰ−ｖａｌｕｅがより小さい値となり、逆にその信頼性が低い場合はＰ−ｖａｌｕｅは大きい値となる。このように、リスクスコア及びＧＳＴπの発現量を併用化学療法の奏効性判定の指標とすることは、Ｔ−ＦＥＣ等の併用化学療法後ｐＣＲ予測に有用である。
【００５４】
［実施の形態２］奏効性判定プログラム
次に、実施の形態１の併用化学療法の奏効性判定方法をコンピュータに実現させる形態を図１及び２を用いて説明する。先ず、図１のシステム１００の構成を説明する。図１のシステム１００は、コンピュータ１と、キーボード２と、マウス３と、ＣＤＫ測定装置４と、ＧＳＴπ測定装置５と、表示装置６とを有する。コンピュータ１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４、ＧＳＴπ測定装置５及び表示装置６のそれぞれと通信ケーブルによって接続されている。
【００５５】
コンピュータ１は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得すると共に、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得し、取得した情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する装置である。コンピュータ１の構成の詳細は後述する。キーボード２及びマウス３は、医師等の使用者が上記の情報をコンピュータ１に入力するための装置である。
【００５６】
ＣＤＫ測定装置４は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する装置である。また、ＣＤＫ測定装置４は、上記生体試料中のＣＤＫ２の活性値及び発現量を測定する装置でもある。なお、ＣＤＫ測定装置４は、測定したＣＤＫの活性値を発現量で除してＣＤＫの比活性値を算出する機能を有してもよい。ＣＤＫ測定装置４は、ＣＤＫ１の比活性値に関する情報（ＣＤＫ１の活性値及び発現量、又はＣＤＫ１の比活性値）、及びＣＤＫ２の比活性値に関する情報（ＣＤＫ２の活性値及び発現量、又はＣＤＫ２の比活性値）をコンピュータ１に入力する。ＧＳＴπ測定装置５は、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を測定し、測定結果をＧＳＴπの発現量の情報としてコンピュータ１に入力する装置である。表示装置６は、コンピュータ１によって得られた判定結果をコンピュータ１から受け取って表示する装置である。
【００５７】
次に、コンピュータ１の構成を説明する。コンピュータ１は、入力ポート１１と、ＣＰＵ１２と、ＨＤＤ１３と、ＲＡＭ１４と、出力ポート１５とを有する。入力ポート１１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４及びＧＳＴπ測定装置５のそれぞれと通信ケーブルによって接続されており、ＣＰＵ１２がキーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４及びＧＳＴπ測定装置５のいずれかからＣＤＫ１の比活性値に関する情報、ＣＤＫ２の比活性値に関する情報、及びＧＳＴπの発現量の情報を取得するためのインタフェイスである。
【００５８】
ＣＰＵ１２は、入力ポート１１、ＨＤＤ１３、ＲＡＭ１４及び出力ポート１５のそれぞれと通信バスによって接続されており、下記の奏効性判定プログラムに含まれる機能を実現する。ＨＤＤ１３は、ＣＰＵ１２によって実現させる六つの機能を含む奏効性判定プログラムを記憶している。以下に、それら六つの機能を説明する。
【００５９】
第１の機能は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能である。第２の機能は、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する機能である。第３の機能は、第１の機能によって取得されたＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報と、実施の形態１において示した式（１）とを用いてリスクスコアを算出する機能である。
【００６０】
第４の機能は、第３の機能によって算出されたリスクスコアと第１の閾値とを比較する機能である。第５の機能は、第２の機能によって取得された情報が示すＧＳＴπの発現量と第２の閾値とを比較する機能である。第６の機能は、リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する機能である。併用化学療法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法である。
【００６１】
更に、ＨＤＤ１３は、上記の式（１）、第１の閾値及び第２の閾値を記憶している。上記の式（１）に含まれる関数Ｆ（ｘ）は実施の形態１において示した式（２）により表現される関数であり、上記の式（１）に含まれる関数Ｇ（ｙ）は実施の形態１において示した式（３）により表現される関数であって、関数Ｆ（ｘ）には定数ａ〜ｃが含まれており、関数Ｇ（ｙ）には定数ｄ〜ｆが含まれている。そのため、ＨＤＤ１３は、上記の式（２）及び（３）並びに定数ａ〜ｆも記憶している。上記の式（２）における変数ｘはＣＤＫ１の比活性値であり、上記の式（３）における変数ｙはＣＤＫ２の比活性値である。上記の式（２）及び（３）並びに第１の閾値及び第２の閾値については、実施の形態１において詳述したので説明を省略する。
【００６２】
次に、コンピュータ１のＣＰＵ１２の動作を、図２を用いて説明する。ＣＰＵ１２は、入力ポート１１を介して、キーボード２、マウス３又はＣＤＫ測定装置４から、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する（Ｓ１）。ＣＰＵ１２は、使用者がキーボード２又はマウス３を用いて入力したＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を受け付けることによってそれらの情報を取得してもよい。また、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ測定装置４からＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を受け取ることによってそれらの情報を取得してもよい。ＣＰＵ１２は、取得したＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報をＲＡＭ１４に格納する。ここで、キーボード２、マウス３又はＣＤＫ測定装置４から入力されたＣＤＫ１の比活性値の情報が、ＣＤＫ１の活性値とＣＤＫ１の発現量の場合、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の活性値をＣＤＫ１の発現量で除してＣＤＫ１の比活性値を求める。そして、求めたＣＤＫ１の比活性値を、ＣＤＫ１の比活性値の情報として、ＲＡＭ１４に格納する。また、入力されたＣＤＫ２の比活性値の情報が、ＣＤＫ２の活性値とＣＤＫ２の発現量の場合、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ２の活性値をＣＤＫ２の発現量で除してＣＤＫ２の比活性値を求める。そして、求めたＣＤＫ２の比活性値を、ＣＤＫ２の比活性値の情報として、ＲＡＭ１４に格納する。
【００６３】
次に、ＣＰＵ１２は、入力ポート１１を介して、キーボード２、マウス３又はＧＳＴπ測定装置５から、上記癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する（Ｓ２）。ＣＰＵ１２は、使用者がキーボード２又はマウス３を用いて入力したＧＳＴπの発現量の情報を受け付けることによってその情報を取得してもよいし、ＧＳＴπ測定装置５からからその情報を受け取ることによってその情報を取得してもよい。ＣＰＵ１２は、取得したＧＳＴπの発現量の情報をＲＡＭ１４に格納する。
【００６４】
そして、ＣＰＵ１２は、ＲＡＭ１４からＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得するとともに、ＨＤＤ１３から上記の式（１）、（２）及び（３）並びに定数ａ〜ｆを取得し、ＣＤＫ１の比活性値をｘとし、かつＣＤＫ２の比活性値をｙとして、上記（１）、（２）及び（３）を用いてリスクスコアを算出する（Ｓ３）。
【００６５】
次に、ＣＰＵ１２は、ＨＤＤ１３から第１の閾値を取得し、取得した第１の閾値とステップＳ３において算出したリスクスコアとを比較する（Ｓ４）。ＣＰＵ１２は、リスクスコアが第１の閾値以下であることを示す比較結果を得た場合（Ｓ４でＹｅｓ）、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する（Ｓ５）。
【００６６】
他方、リスクスコアが第１の閾値より大きいことを示す比較結果を得た場合（Ｓ４でＮｏ）、ＣＰＵ１２は、ＲＡＭ１４からＧＳＴπの発現量の情報を取得するとともにＨＤＤ１３から第２の閾値を取得し、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値とを比較する（Ｓ６）。ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きいことを示す比較結果を得た場合（Ｓ６でＹｅｓ）、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する（Ｓ７）。それに対して、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値以下であることを示す比較結果を得た場合（Ｓ６でＮｏ）、ＣＰＵ１２は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かは不明であると判定する（Ｓ８）。ＣＰＵ１２は、判定結果を出力ポート１５を介して表示装置６に出力する。これにより、ＣＰＵ１２の動作は終了する。表示装置６は、コンピュータ１の出力ポート１５から判定結果を受け取って表示する。
【００６７】
上述の通り、ＣＰＵ１２は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得するとともに、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得し、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値からリスクスコアを算出する。そして、ＣＰＵ１２は、リスクスコアと第１の閾値とを比較し、リスクスコアが第１の閾値以下である場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。また、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。表示装置６は判定結果を表示する。したがって、使用者は、コンピュータ１を用いることにより、簡便にかつ客観的に、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かを認識することができる。すなわち、使用者は、高い信頼性で、癌患者に対する併用化学療法の効果を推定することができる。
【００６８】
なお、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２は、ステップＳ４においてリスクスコアと第１の閾値とを比較し、リスクスコアが第１の閾値より大きいことを示す比較結果を得た場合（Ｓ４でＮｏ）、ステップＳ６においてＧＳＴπの発現量と第２の閾値とを比較する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値との比較をリスクスコアと第１の閾値との比較より前に行ってもよい。すなわち、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値以下であることを示す比較結果を得た場合、リスクスコアと第１の閾値とを比較してもよい。又は、ＣＰＵ１２は、リスクスコアと第１の閾値との比較と、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値との比較とを、実質上同時に行ってもよい。いずれの場合であっても、ＣＰＵ１２は、リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。
【００６９】
また、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２によって実現させる機能を含む奏効性判定プログラムは、ＨＤＤ１３によって記憶されている。しかしながら、その奏効性判定プログラムは例えば携帯可能な記憶媒体に記憶されていて、コンピュータ１のＨＤＤ１３又はＲＡＭ１４に格納された後にＣＰＵ１２によって用いられてもよい。したがって、その奏効性判定プログラムの実施態様は、記憶媒体に記憶されること、及び、記憶媒体に記憶された状態で流通すること等を含む。
【００７０】
また、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値からリスクスコアを算出する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、リスクスコアを用いることなく、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値並びにＧＳＴπの発現量に基づいて癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定することができれば、リスクスコアを算出することなく、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値並びにＧＳＴπの発現量に基づいて癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
【００７１】
また、上述した実施の形態２では、リスクスコアを算出するための式（１）に含まれる関数Ｆ（ｘ）は式（２）によって表現され、式（１）に含まれる関数Ｇ（ｙ）は式（３）によって表現される。しかしながら、リスクスコアを算出するために式（１）を用いる場合であっても、関数Ｆ（ｘ）及びＧ（ｙ）のそれぞれは、式（２）又は式（３）以外の式によって表現されてもよい。
【００７２】
また、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２は、リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。しかしながら、その判定方法以外の方法を用いて癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かを判定することができれば、ＣＰＵ１２は、リスクスコアと第１の閾値との比較と、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値以上との比較との一方又は双方を行うことなく、ＣＤＫ１の比活性値、ＣＤＫ２の比活性値、及びＧＳＴπの発現量に基づいて、癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
【００７３】
また、上述した実施の形態２では、併用化学療法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法である。しかしながら、併用化学療法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる方法に限定されない。
【００７４】
また、上述した実施の形態２では、図２のステップＳ１において、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を受動的に取得する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ測定装置４にそれらの情報を出力することを定期的に又は不定期に要求してそれらの情報を能動的に取得してもよい。同様に、上述した実施の形態２では、図２のステップＳ２において、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量の情報を受動的に取得する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπ測定装置５にその情報を出力することを定期的に又は不定期に要求してその情報を能動的に取得してもよい。
【００７５】
また、上述した実施の形態２では、ＣＤＫ測定装置４は、ＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報をコンピュータ１に入力する。しかしながら、ＣＤＫ測定装置４は、ＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報をコンピュータ１に入力せずに、ＣＤＫ１の活性値及び発現量の情報と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の情報とをコンピュータ１に入力してもよい。その場合、ＣＰＵ１２は、入力ポート１１を介して、ＣＤＫ測定装置４からのＣＤＫ１の活性値及び発現量の情報と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の情報とを受け取る。そして、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の活性値をＣＤＫ１の発現量により除してＣＤＫ１の比活性値を算出し、それによりＣＤＫ１の比活性値を取得する。同様に、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ２の活性値をＣＤＫ２の発現量により除してＣＤＫ２の比活性値を算出し、それによりＣＤＫ２の比活性値を取得する。ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ測定装置４に、ＣＤＫ１の活性値及び発現量の情報と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の情報とを定期的に又は不定期に要求してそれらの情報を能動的に取得してもよい。
【００７６】
また、上述した実施の形態２では、上記の第１の閾値、第２の閾値、式（１）、式（２）、式（３）、及び定数ａ〜ｃは、ＨＤＤ１３によって記憶されている。それらは、使用者がキーボード２又はマウス３を用いてコンピュータ１に入力することによって、又はＣＤＫ測定装置４若しくはＧＳＴπ測定装置５がコンピュータ１に入力することによって、ＣＰＵ１２によって取得された後にＨＤＤ１３によって記憶されてもよい。
【００７７】
また、上述した実施の形態２では、コンピュータ１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４、ＧＳＴπ測定装置５、及び表示装置６のそれぞれと通信ケーブルによって接続されている。しかしながら、コンピュータ１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４、ＧＳＴπ測定装置５、及び表示装置６の全部又は一部と無線によって接続されてもよい。
【００７８】
また、上述した実施の形態２では、コンピュータ１は表示装置６と接続されているが、コンピュータ１は、表示装置６の代わりに又は表示装置６とともに、スピーカ、印刷装置、又は携帯通信端末装置等と接続されてもよい。その場合、スピーカ等は判定結果を報知するので、使用者は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かを認識することができる。
【００７９】
更に、上述した実施の形態２の癌細胞は、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、又は白血病細胞等の癌細胞である。また、上述した実施の形態２の生体試料は、癌患者から採取された癌細胞を含む試料である。例えば、実施の形態２の生体試料は、癌患者の血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、又は、手術若しくは生検により癌患者から採取した細胞若しくは組織等である。生体試料は、癌患者から採取した細胞や組織を培養して得られた試料であってもよい。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００８１】
＜ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の測定＞
［測定用試料の調製］
（試薬の調整）
コンプリート溶解液：
コンプリート錠（Ｒｏｃｈｅ社）１錠を２ｍＬの超純水に溶解し、調製した。
【００８２】
緩衝液Ａ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ ＮＰ−４０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を最終濃度として含む溶液中に、コンプリート溶解液が２５倍希釈されるよう添加し、調製した。
【００８３】
（測定用試料の調整）
乳癌患者からマンモトームにより採取した腫瘍細胞塊を、チューブ内で緩衝液Ａに懸濁した。緩衝液Ａは、４ｍｍ角相当の腫瘍細胞塊に４００μＬ、３ｍｍ角相当の腫瘍細胞塊に２００μＬ、中間の大きさの腫瘍細胞塊に３００μＬ添加した。電動ホモジナイザーを用いて、上記腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。上記細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、得られた上清を測定用試料として用いた。なお、上記乳癌患者から採取した腫瘍細胞塊は合計１１２検体であった。
【００８４】
［ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の測定］
（試薬及び標準品の調整）
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：
１０×ＴＢＳ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ２５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ １．５Ｍを最終濃度として含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調製した溶液）を１０倍希釈して、ＴＢＳを調製した。
【００８５】
ブロッキング試薬：
上述のＴＢＳ中に、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を最終濃度が４％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、ブロッキング試薬を調製した。
【００８６】
１次抗体試薬：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（粉末）（大日本住友製薬社）を最終濃度が３．２％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように超純水に溶解した溶液に、抗ＣＤＫ１抗体を１２μｇ／ｍＬとなるように溶解し、抗ＣＤＫ１抗体試薬を調製した。同様に、抗ＣＤＫ１抗体に代えて、抗ＣＤＫ２抗体を７．５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、抗ＣＤＫ２抗体試薬を調製した。
【００８７】
２次抗体試薬：
上述のＴＢＳ中に、ＢＳＡを最終濃度が１％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解した溶液に、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を８μｇ／ｍＬとなるように溶解し、２次抗体試薬を調製した。
【００８８】
蛍光標識試薬：
上述のＴＢＳ中に、ＢＳＡを最終濃度が１％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解した溶液に、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を１０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調製した。
【００８９】
蛍光増強試薬：
３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ １００ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含み、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．９となるよう調製した。
【００９０】
発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液：
上述のＴＢＳ中に、Ｓｕｃｒｏｓｅ ８７６．４ｍＭ、ＢＳＡ ０．００５％（ｗ／ｖ）、ＮＰ４０ ０．００５％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液を調製した。
【００９１】
ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品：
上述のＴＢＳ中に、ＢＳＡ ０．００５％（ｗ／ｖ）、ＮＰ４０ ０．００５％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品を調製した。
【００９２】
ＣＤＫ１発現量測定用標準品：
ＣＤＫ１／ｃｙｃｌｉｎＢ１， ａｃｔｉｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液に添加し、１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。この希釈液３ｍＬを発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液９５ｍＬに添加し、ＣＤＫ１発現量測定用標準品を調製した。
【００９３】
ＣＤＫ２発現量測定用標準品：
ｃｄｋ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液に添加し、１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。この希釈液１．３ｍＬを発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液９８ｍＬに添加し、ＣＤＫ２発現量測定用標準品を調製した。
【００９４】
（ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の測定）
フィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＰＳＱＰｌａｔｅｓ）を３０％エタノールで親水処理後、ＴＢＳを各ウェル２００μＬ添加し、吸引することで洗浄を行った。各測定用試料を各ウェルに１００μＬ添加し、吸引により水分を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を行った。その後、ブロッキング試薬を各ウェル１００μＬ添加し、吸引した。ブロッキング試薬を吸引後、抗ＣＤＫ１抗体試薬（１次抗体試薬）を各ウェル５０μＬ添加し、吸引した。再度抗ＣＤＫ１抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加し、２３℃で２時間静置した。その後、吸引により１次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った。洗浄後、２次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加し、吸引した。再度２次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加し、２３℃で４５分間静置した。その後、吸引により２次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光標識試薬を各ウェル１００μＬ添加し、吸引した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った。洗浄後、蛍光増強試薬を各ウェル２００μＬ添加し、吸引した。その後、フィルタープレートを乾燥させた。
【００９５】
乾燥後、上記フィルタープレート中の各ウェルについて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（Ｔｅｃａｎ社）で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の算出は、キャリブレーターを用いて作成した検量線により行った。キャリブレーターは、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品３００μＬ、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品２７０μＬにＣＤＫ１発現量測定用標準品３０μＬを添加したもの、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品１５０μＬにＣＤＫ１発現量測定用標準品１５０μＬを添加したもの、ＣＤＫ１発現量測定用標準品３００μＬを使用した。これらをそれぞれフィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ）に各ウェル１００μＬ添加し、上記測定用試料について行ったのと同様の方法によりブロッキング、１次抗体反応、２次抗体反応、蛍光標識反応等を行い、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いてそれぞれの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。
【００９６】
ＣＤＫ２の発現量の測定は、１次抗体として抗ＣＤＫ１抗体試薬の代わりに抗ＣＤＫ２抗体試薬を用いること、キャリブレーターとしてＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品とＣＤＫ２発現量測定用標準品を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の手順で行った。
【００９７】
［ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性の測定］
（試薬及び標準品の調整）
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：
２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ １Ｍ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４となるよう調製した。
【００９８】
免疫沈降緩衝液：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮＰ４０ ０．１％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降緩衝液を調製した。
【００９９】
２０％プロテインＡビーズ溶液：
プロテインＡビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）３００μＬを２ｍＬエッペンドルフチューブに加え、免疫沈降緩衝液９００μＬを加えて転倒混和し、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離を行って上清を除去する操作を２回行った。ここに免疫沈降緩衝液１０８０μＬを添加し、２０％プロテインＡビーズ溶液を調製した。
【０１００】
ＣＤＫ抗体希釈液：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを４０倍希釈した溶液中に、Ｓｕｃｒｏｓｅ１Ｍ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、ＣＤＫ抗体希釈液を調製した。
【０１０１】
抗ＣＤＫ１抗体試薬：
ＣＤＫ抗体希釈液１．９ｍＬに１０％ ＮａＮ３溶液（ｗ／ｖ）を１９０μＬ添加し、この溶液中に抗ＣＤＫ１抗体（４４８μｇ／ｍＬ）を１７．５ｍＬ添加して希釈した。この希釈液４８０μＬに免疫沈降緩衝液８４０μＬを添加し、抗ＣＤＫ１抗体試薬を調製した。
【０１０２】
抗ＣＤＫ２抗体試薬：
ＣＤＫ抗体希釈液１．６ｍＬに１０％ ＮａＮ３溶液（ｗ／ｖ）を１００μＬ添加し、この溶液中に抗ＣＤＫ２抗体（３６０μｇ／ｍＬ）を８．３ｍＬ添加して希釈した。この希釈液２４０μＬに免疫沈降緩衝液９６０μＬを添加し抗ＣＤＫ２抗体試薬を調製した。
【０１０３】
免疫沈降洗浄液１：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮＰ４０ １％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液１を調製した。
【０１０４】
免疫沈降洗浄液２：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮａＣｌ ３００ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液２を調製した。
【０１０５】
免疫沈降洗浄液３：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液３を調製した。
【０１０６】
Ｋｉｎａｓｅ反応試薬：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１８．４倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２ ２０ｍＭ、ＡＴＰ−γＳ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）２ｍＭ、Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ社）０．２ｍｇ／ｍＬを最終濃度として含むよう添加し、Ｋｉｎａｓｅ反応試薬を調製した。
【０１０７】
２．２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ：
３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２．２Ｍ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を含み、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４となるよう調製した。
【０１０８】
蛍光標識反応緩衝液：
２．２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨを７．３倍希釈した溶液中に、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、蛍光標識反応緩衝液を調製した。
【０１０９】
蛍光標識試薬：
５−（Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５ｍｇ、ＤＭＳＯ ６ｍＬを蛍光標識反応緩衝液１１６ｍＬ添加し、蛍光標識試薬を調製した。
【０１１０】
蛍光標識反応停止液：
２．２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨを１．１倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加した。この溶液４９８．９５ｍＬ中にＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ２．４５ｇを溶解し、蛍光標識反応停止液を調製した。
【０１１１】
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：
１０×ＴＢＳ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ２５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ １．５Ｍを最終濃度として含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調製した溶液）を１０倍希釈して、ＴＢＳを調製した。
【０１１２】
蛍光増強試薬：
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）を１０倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、調製した。
【０１１３】
ＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、Ｓｕｃｒｏｓｅ ８１０．７ｍＭ、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本住友製薬社）１％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＮＰ４０ ０．１％を最終濃度として含むよう添加し、ＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液を調製した。
【０１１４】
ＣＤＫ１／２活性測定用標準品：
ＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液中に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＤＫ１／ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１， ａｃｔｉｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）３ｎｇ／μＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ Ｅ， ａｃｔｉｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）１ｎｇ／μＬを最終濃度として含むよう希釈し、ＣＤＫ１／２活性測定用標準品を調製した。
【０１１５】
（ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性の測定）
フィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ）の各ウェルに２０％ プロテインＡビーズ溶液を３０μＬ、抗ＣＤＫ１抗体希釈液を９０μＬ、各測定用試料を３０μＬ添加した。これを４℃で１２０分間攪拌し、測定用試料中のＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。反応後、吸引により水分を除去した。次に、免疫沈降洗浄液１を各ウェル２００μＬ添加し、吸引してビーズを洗浄した。続いて免疫沈降洗浄液２を各ウェル２００μＬ添加し、吸引してビーズを洗浄した。更に、免疫沈降洗浄液３を各ウェル２００μＬ添加し、吸引してビーズを洗浄した。これにより、抗ＣＤＫ１抗体を介して各測定試料中のＣＤＫ１が結合したセファロースビーズをフィルタープレート上に得た。
【０１１６】
このフィルタープレートの各ウェルに、Ｋｉｎａｓｅ反応試薬を５０μＬ添加し、３７℃で６０分間攪拌して反応させた。
【０１１７】
Ｋｉｎａｓｅ反応後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、反応生成物を採取し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の各ウェルに１４μＬ添加した。この反応生成物に、蛍光標識試薬を各ウェル１４μＬ添加し、２５℃で２０分間攪拌して反応させ、蛍光標識反応停止液を各ウェル２００μＬ添加して反応を停止させた。
【０１１８】
フィルタープレートに７０％エタノールを各ウェル１００μＬ添加し、吸引により７０％エタノールを除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル２００μＬ添加し、吸引する洗浄を２回行った。次に、Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ中の蛍光標識反応停止後の反応液を、フィルタープレートの各ウェルに１００μＬ添加し、吸引して反応液を除去した。続いて、ＴＢＳを各ウェル２００μＬ添加し、吸引して除去する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光増強試薬を各ウェル２００μＬ添加し、吸引して蛍光増強試薬を除去する反応を６回行った。その後、フィルタープレートを乾燥させた。
【０１１９】
乾燥後、上記フィルタープレート中の各ウェルについて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（Ｔｅｃａｎ社）で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のＣＤＫ１の活性の算出は、キャリブレーターとしてＣＤＫ１／２活性測定用標準品を用いて作成した検量線により行った。なお、検量線の作成は、以下の方法により行った。ＣＤＫ１／２活性測定用標準品をＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液で１／４希釈したもの、同様に１／２希釈したもの、ＣＤＫ１／２活性測定用標準品をそれぞれフィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ）に各ウェル３０μＬ添加し、上記測定用試料について行ったのと同様の方法により免疫沈降、Ｋｉｎａｓｅ反応、蛍光標識反応等を行い、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いてそれぞれの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。
【０１２０】
ＣＤＫ２活性の測定は、抗ＣＤＫ１抗体の代わりに抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１活性測定と同様の手順で行った。
【０１２１】
［ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の算出］
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性は、下記のように算出した。
各測定用試料について、検量線から算出したＣＤＫ１活性をもとに、測定用試料１μＬ中に含まれるＣＤＫ１活性（Ａ）を算出した。また、各測定用試料について、検量線から算出したＣＤＫ１発現量をもとに、測定用試料１μＬ中に含まれるＣＤＫ１発現量（Ｂ）を算出した。ＣＤＫ１比活性は、Ａ／Ｂにより算出した。ＣＤＫ２についても同様に比活性の算出を行った。
【０１２２】
＜ＧＳＴπの発現量の測定＞
［ＧＳＴπの発現量の測定に用いる試薬の調製］
ＧＳＴπの発現量を測定するために、ブロッキング試薬、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、１次抗体試薬、２次抗体試薬及び蛍光標識試薬を調製した。それぞれの試薬の調製法を以下に示す。
【０１２３】
ブロッキング試薬：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（粉末）（大日本住友製薬社）を、最終濃度が４％となるように超純水に溶解し、ブロッキング試薬を調製した。
【０１２４】
１次抗体試薬：
ブロッキング試薬を１０倍希釈して調製したブロッキング溶液に、抗ＧＳＴπ抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社）を、５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、１次抗体試薬を調製した。
【０１２５】
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：
１０×ＴＢＳ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ３０．２８ｇ、ＮａＣｌ ８７．７ｇ、６Ｎ ＨＣｌ １１０ｇを超純水に添加し、最終量を１Ｌとした溶液）を１０倍希釈して、ＴＢＳを調製した。
【０１２６】
２次抗体試薬：
ＴＢＳに、ウシ血清アルブミンＢＳＡを、最終濃度が１％となるように超純水に溶解し、ＴＢＳ（１％ＢＳＡ）を調製した。得られたＴＢＳ（１％ＢＳＡ）に、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＢＩＯＴ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を、３０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、２次抗体試薬を調製した。
【０１２７】
蛍光標識試薬：
上述のＴＢＳ（１％ＢＳＡ）に、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を、１０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調製した。
【０１２８】
［ＧＳＴπの発現量の測定］
フィルタープレート（Ｍｕｌｔｉ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＰＳＱ Ｐｌａｔｅｓ）を３０％エタノールで親水処理後、各測定用試料を各ウェルに１０μｇ添加し、吸引により水分を除去した。なお、測定用試料としては、上記第１取得工程において調製した試料を用いた。その後、ブロッキング試薬を各ウェル１００μＬ加え吸引した。ブロッキング試薬を吸引後、１次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加しすぐに吸引した。吸引後、再び１次抗体試薬を各ウェル５０ｕＬ添加し２時間静置した。その後、吸引により１次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを、各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った。洗浄後、２次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加しすぐに吸引した。吸引後、再び２次抗体試薬を各ウェル５０ｕＬ添加し１時間静置した。その後、吸引により２次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加し、吸引する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光標識試薬を各ウェル１００μＬ添加しすぐに吸引した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った後、フィルタープレートを乾燥させた。
【０１２９】
乾燥後、上記フィルタープレート中の各ウェルについて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（Ｔｅｃａｎ社）で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のＧＳＴπの発現量の算出は、キャリブレーターとしてＧＳＴＰ１ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｂｎｏｖａ社 Ｃａｔ Ｎｏ．Ｈ００００２９５０−Ｐ０１）を用いて作成した検量線により行った。なお、検量線の作成は、以下の方法により行った。０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェル、１０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェル、３０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェル、５０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェルの各濃度となるようにフィルタープレート上に上記ＧＳＴＰ１ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎを添加し、上記測定用生体試料について行ったのと同様の方法によりブロッキング、１次抗体反応、２次抗体反応及び蛍光標識試薬反応等を行い、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いてそれぞれの蛍光強度を測定し検量線を作成した。
【０１３０】
＜リスクスコアの算定＞
得られたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値を用いて、下記式に基づきリスクスコア（ＲＳ）を算出した。
【０１３１】
Ｆ（ｘ）＝０．１５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−１．６）×７）
Ｇ（ｙ）＝０．２５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−１．０）×６）
ＲＳ＝３０００×Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）
ｘ＝ｌｏｇ（ＣＤＫ１比活性値）
ｙ＝ｌｏｇ（ＣＤＫ２比活性値）−ｌｏｇ（ＣＤＫ１比活性値）
【０１３２】
＜奏効性の判定＞
上記乳癌患者に対して、マンモトーム生検の後、週１回のパクリタキセル投与（Ｔ）を１２サイクル、２１日毎の５−ＦＵ、エピルビシン及びシクロフォスファミド投与（ＦＥＣ）を４サイクル行い、病理学的腫瘍消失の有無を評価した。この評価において、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）となった患者を奏効例とした。
【０１３３】
上記ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値から算出されるリスクスコア（ＲＳ）を単独で指標として用い、Ｔ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線を図３に示す。このＲＯＣ曲線のＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）＝０．６１５、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ Ｐ （ａｒｅａ＝０．５）＝０．１１２４となった。また、ＧＳＴπを単独で指標として用い、同様にＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線を図４に示す。このＲＯＣ曲線のＡＵＣ＝０．６０８、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ Ｐ （ａｒｅａ＝０．５）＝０．１０４１となった。
【０１３４】
これに対し、リスクスコアとＧＳＴπを組み合わせて指標として用い、Ｔ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線を図５に示す。このＲＯＣ曲線のＡＵＣ＝０．６８２、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ Ｐ （ａｒｅａ＝０．５）＝０．００２５となった。リスクスコアに対してＲＯＣ曲線を作成し、リスクスコアに関するカットオフを設定した後に、更にＧＳＴπのＲＯＣ曲線を作成してＧＳＴπのカットオフを設定すると、表３が得られる。リスクスコアのカットオフ（閾値）は０．１２１に、ＧＳＴπのカットオフ（閾値）は９３．１８６５に設定した。この時の陽性適中率（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ：ＰＰＶ）＝３４（％）、陰性適中率（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ：ＮＰＶ）＝９３．８（％）であった。この結果から、リスクスコアとＧＳＴπの組み合わせは、Ｔ−ＦＥＣに対して奏効しない患者を精度よく抽出できることが示唆され、奏効しない患者への不要な抗癌剤の投与を回避することで患者のＱＯＬ向上に貢献できると考えられる。
ＲＯＣ曲線のＡＵＣ、並びにＡＵＣのＰ−ｖａｌｕｅは、リスクスコアとＧＳＴπを組み合わせることにより、リスクスコア、ＧＳＴπそれぞれを単独で用いた場合と比較して大幅に改善が認められた。これらの結果から、リスクスコアとＧＳＴπの組み合わせはＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測に有用であると考えられる。
【０１３５】
リスクスコア（ＲＳ）及びＧＳＴπの発現量（表中では「ＧＳＴπ」と表記）と、Ｔ−ＦＥＣの奏効性の関係を表１に示す。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
表１に示す通り、リスクスコアが低値又はＧＳＴπの発現量が高値の乳癌患者は、Ｔ−ＦＥＣによる奏効性を示さないｎｏｎ−ｐＣＲの割合が顕著に高かった。従って、マンモトーム等により採取された生体試料のリスクスコアが低値又はＧＳＴπの発現量が高値である乳癌患者については、Ｔ−ＦＥＣによる併用化学療法以外の療法を選択することが好ましいと判定することができる。また、リスクスコアが高値かつＧＳＴπが低値である乳癌患者は、Ｔ−ＦＥＣによる奏効性について一定の傾向は示さなかった。なお、リスクスコアが高値とは上記閾値より大きいことをいい、リスクスコアが低値とは上記閾値以下であることをいう。また、ＧＳＴπの発現量が高値とは上記閾値より大きいことをいい、ＧＳＴπが低値とは上記閾値以下であることをいう。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明によると、癌患者への併用化学療法の奏効性について、より信頼性の高い判定方法を提供することができる。当該奏効性判定方法によると、患者は効果的でない可能性が高い不要な抗癌剤治療を回避することが可能となる。また当該奏効性判定方法を実現するための奏効性判定プログラム、及び奏効性判定装置は、癌患者への併用化学療法の奏効性を判定する手段として有用である。
【符号の説明】
【０１３９】
１００ システム
１ コンピュータ
２ キーボード
３ マウス
４ ＣＤＫ測定装置
５ ＧＳＴπ測定装置
６ 表示装置
１１ 入力ポート
１２ ＣＰＵ
１３ ＨＤＤ
１４ ＲＡＭ
１５ 出力ポート
【技術分野】
【０００１】
本発明は、併用化学療法の奏効性判定方法、奏効性判定プログラム及び奏効性判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の一般的な治療法の一つに化学療法があり、この化学療法として各種の抗癌剤投与が行われている。特に最近では、抗癌剤のそれぞれの特性を生かし、２剤以上の抗癌剤を組み合わせて使用する併用化学療法により、手術の不可能な進行癌も治療できるようになってきている。しかし、このような併用化学療法の有効性は、癌の種類や患者毎に大きく異なることが知られている。従って、抗癌剤の選択を誤り効果的でない抗癌剤を投与した場合や、適切でない組み合わせの抗癌剤を併用した場合等は、癌の再発可能性が高まるばかりでなく、抗癌剤の副作用により患者の体力が低下し、次に有効な別の抗癌剤を投与しても十分な効果を得られない恐れがある。このことから、個々の患者に有効な抗癌剤及び併用化学療法に用いる抗癌剤の適切な組み合わせをその投与前に正確に特定することができるシステムの開発が切望されている。
【０００３】
一方、癌に対する抗癌剤の選定方法としては、従来、患者から単離した癌細胞に様々な抗癌剤を接触させ、癌細胞の増殖抑制等を指標として、その癌細胞に有効と思われる抗癌剤を特定する方法が採用されてきた。しかしながら、このような試行錯誤的方法では、検査結果の再現性が不十分な場合も多いため、その検査結果が臨床治療効果に反映されないという不都合がある。また、上記感受性判定方法には、大量の癌細胞が必要となるため、患者への負担が大きいという不都合もある。そこで、抗癌剤を用いた併用化学療法の奏効性を予め判定できるシステムの確立は非常に重要である。
【０００４】
そのための試みのひとつとして、抗癌剤の毒性を弱めることに関与していると考えられているグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼπ（ＧＳＴπ）の癌組織における発現量に基づき、乳癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する方法が知られている（非特許文献１参照）。また、癌患者から採取した悪性腫瘍中のサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ：ＣＤＫ）１及びＣＤＫ２の比活性値に基づき、癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する方法が報告されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０５７４８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１１３，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０２−１０８，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性について、より信頼性の高い判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するためになされた発明は、
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、
上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程と
を有する併用化学療法の奏効性判定方法である。
【０００９】
上記癌細胞としては乳癌の癌細胞が好ましい。
【００１０】
当該奏効性判定方法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法に好適に使用される。
【００１１】
当該奏効性判定方法は、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から下記式（１）を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含み、
上記判定工程は、上記算出工程で算出したリスクスコア及び上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定するとよい。
リスクスコア＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ） ・・・（１）
（式（１）中、ｘは、ＣＤＫ１の比活性値である。ｙは、ＣＤＫ１の比活性値に対するＣＤＫ２の比活性値の比である。）
【００１２】
上記Ｆ（ｘ）を下記式（２）で表し、Ｇ（ｙ）を下記式（３）で表すとよい。
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ）） ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ）） ・・・（３）
（式（２）及び（３）中、ａ〜ｆは定数である。）
【００１３】
上記判定工程は、上記リスクスコアと第１の閾値を比較し、上記ＧＳＴπの発現量と第２の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定するとよい。
【００１４】
上記判定工程は、上記リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定するとよい。
【００１５】
当該奏効性判定方法の上記判定工程は、奏効性判定プログラムとコンピュータとの協働によって、又は奏効性判定装置によって実現させることができる。
【００１６】
すなわち、本発明の奏効性判定プログラムは、
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する機能と、
取得されたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する機能と
をコンピュータに実現させるためのプログラムである。
【００１７】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能が、ＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値をＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報として取得してもよい。
【００１８】
また、本発明の併用化学療法の奏効性判定装置は、
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報を取得する取得部と、
上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定部と
を備える。
【００１９】
上記取得部が、ＣＤＫ１の比活性値の情報としてＣＤＫ１の活性値と発現量を取得し、ＣＤＫ２の比活性値の情報としてＣＤＫ２の活性値と発現量を取得し、
上記判定部が、上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の併用化学療法の奏効性判定方法によれば、信頼性高く、かつ簡易に、癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施の形態２における併用化学療法の奏効性判定システムの概略構成図である。
【図２】図１のＣＰＵが行う各手順を示すフローチャートである。
【図３】リスクスコアを用いてＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線である。
【図４】ＧＳＴπを用いてＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線である。
【図５】リスクスコア及びＧＳＴπを用いてＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明の実施形態を詳説するが、本発明は以下の実施の形態に限定されない。
【００２３】
［実施の形態１］併用化学療法の奏効性判定方法
当該奏効性判定方法は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程とを有する。また、上記ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から、上記式（１）を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含むことが好ましい。以下、各工程について詳述する。
【００２４】
（第１取得工程）
第１取得工程は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する工程である。
【００２５】
上記第１取得工程における癌細胞としては、悪性腫瘍を構成する細胞であれば特に制限されるものではなく、例えば乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、白血病細胞等の癌細胞が挙げられる。これらのうち、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、皮膚癌、及び白血病細胞の癌細胞が好ましく、これらのうち乳癌の癌細胞がより好ましい。
【００２６】
上記生体試料は、癌患者から採取された癌細胞を含む試料であれば特に限定されない。この生体試料としては、具体的には、癌患者の血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、及び手術や生検により癌患者から採取した細胞や組織等が挙げられる。また、癌患者から採取した細胞や組織を培養して得られた試料を生体試料として用いることもできる。
【００２７】
上記ＣＤＫ１は、細胞周期のＧ２期からＭ期に移行する際に活性を示すタンパク質である。一方、ＣＤＫ２は、細胞周期のＧ１期からＳ期に移行する際に活性を示すタンパク質である。一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行われていることから、ＤＮＡの複製期であるＳ期と、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間であるＧ２期にある細胞の割合が多いと考えられる。また、癌細胞に見られる異数倍体性は、細胞が細胞分裂期であるＭ期を異常な状態で経過した場合、又はＭ期を経ずにＧ１期に進みそのままＳ期に移行した場合に発生するとされているため、Ｍ期に存在する細胞の割合が少ないと考えられる。このように、癌細胞においては細胞周期の制御に異常を来していることが多いため、細胞周期を制御する上記ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量や活性値は、細胞が癌化しているか否かを判断する上でも、重要な因子であると考えられている。
【００２８】
例えば、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２（以下、「ＣＤＫ］ともいう）の比活性比（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）は、Ｓ期またはＧ２期にある細胞が、Ｍ期にある細胞に比べてどれだけ多く存在するかを反映する数値であると考えることができ、細胞の増殖能を正確に反映するパラメータとして用いることができる。
【００２９】
上記ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値は、癌細胞を含む生体試料中のそれぞれのＣＤＫ活性値をＣＤＫ発現量で割って得られる値である。なお、当該奏効性判定方法の第１取得工程は、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得できればよく、ＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量を測定するＣＤＫ測定工程と、上記ＣＤＫ測定工程で得られた結果からそれぞれの比活性値を算出する比活性値算出工程を有してもよい。
【００３０】
上記ＣＤＫ活性値は、例えば、ＣＤＫによってリン酸化される基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で表す）等で表される。なお、ＣＤＫがリン酸化する基質として、例えばヒストンＨ１等が挙げられる。
【００３１】
上記ＣＤＫ測定工程においては、上記ＣＤＫ活性値を公知のＣＤＫ活性測定方法によって測定することができる。上記公知の方法のうち、放射性物質を用いる方法としては、例えば測定試料の細胞可溶化液からＣＤＫを含む試料を調製し、この試料と３２Ｐ標識したアデノシントリホスフェート（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、３２Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定する方法等が挙げられる。また、放射性物質を用いない方法としては、米国特許出願第２００２／０１６４６７３号に記載された方法等が挙げられる。この方法は、まず検体の細胞可溶化液から目的のＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質タンパク質を反応させて、この基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入する。導入された上記モノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量を測定する方法である。
【００３２】
上記測定試料の細胞可溶化液からＣＤＫを含む試料を調製する方法としては、測定対象となる癌細胞を含む生体試料の可溶化液から、例えば抗ＣＤＫ抗体等を用いてＣＤＫを特異的に捕捉することにより調製する方法等が挙げられる。
【００３３】
上記ＣＤＫ発現量は、測定対象となる癌細胞を含む生体試料の可溶化液に含まれる目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）である。また、上記ＣＤＫ測定工程において、上記ＣＤＫ発現量は、上記の可溶化液からＣＤＫ量を測定する公知の方法で測定することができる。上記ＣＤＫ発現量の測定方法としては、例えば目的のＣＤＫを抗ＣＤＫ抗体等の特異的抗体を用いて捕捉し、捕捉されたＣＤＫを定量する方法等を用いることができ、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、米国特許出願第２００４／０２１４１８０号に記載された方法等が挙げられる。
【００３４】
（第２取得工程）
当該奏効性判定方法における第２取得工程とは、ＧＳＴπの発現量を取得する工程である。
【００３５】
上記ＧＳＴπとは、ヒトのグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ファミリーに属する酵素のうち、ＧＳＴＰ１遺伝子にコードされた分子量約２２．５ｋＤａのタンパク質である。ＧＳＴπは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と抗癌剤との抱合体形成を触媒することにより、抗癌剤の毒性を弱めることに関与している。そのため、一般的にＧＳＴπが高発現している癌細胞は、ＧＳＴπが低発現している癌細胞に比べ、抗癌剤に対する耐性が高まると考えられている。
【００３６】
当該奏効性判定方法の第２取得工程においては、ＧＳＴπの発現量を取得するのみでもよいし、ＧＳＴπの発現量を測定するＧＳＴπ測定工程をさらに含んでいてもよい。
【００３７】
上記ＧＳＴπ測定工程におけるＧＳＴπの発現量の測定方法としては、ＧＳＴπタンパクの発現量、ｍＲＮＡの発現量等を測定することができる方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、２次元電気泳動法、プロテインチップによる解析法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、免疫蛍光法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法及びＤＮＡチップによる方法等が挙げられる。これらのうち、定量性、再現性、簡便さ等の観点から、ＧＳＴπタンパクの発現量の測定方法としてはウエスタンブロット法、ドットブロット法及びＥＬＩＳＡ法が好ましく、ＧＳＴπのｍＲＮＡの発現量の測定方法としてはノーザンブロット法が好ましい。なかでも、当該判定方法の正確性の観点から、ＧＳＴπタンパクの発現量の測定方法であるドットブロット法及びウエスタンブロット法がより好ましい。
【００３８】
（算出工程）
算出工程とは、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から上記式（１）を用いてリスクスコアを算出する工程である。
【００３９】
上記式（１）中、ｘは、ＣＤＫ１の比活性値である。ｙは、ＣＤＫ１の比活性値に対するＣＤＫ２の比活性値の比である。
【００４０】
ここで、ＣＤＫ１比活性値ｘを第１のリスク要素とし、ＣＤＫ比活性比（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）ｙを第２のリスク要素とし、第１及び第２リスク要素それぞれの値と併用化学療法が奏効しないリスクとの関係を評価することができる。併用化学療法が奏効しないリスクの数値的な評価のうち、第１リスク要素に基づく評価を関数Ｆ（ｘ）で表す。また、併用化学療法が奏効しないリスクの数値的な評価のうち第２リスク要素に基づく評価を関数Ｇ（ｙ）で表す。さらに、併用化学療法が奏効しないリスクの数値的な評価のうち、第１及び第２リスク要素に基づく評価をリスクスコアとし、このリスクスコアは、Ｆ（ｘ）とＧ（ｙ）の積で与えられるものとする。
【００４１】
上記Ｆ（ｘ）が上記式（２）で表され、Ｇ（ｙ）が上記式（３）で表されることが好ましい。上記式（２）及び（３）中、ａ〜ｆは定数である。
【００４２】
上記定数ａ〜ｃは、ＣＤＫ１比活性値と併用化学療法が奏効しない確率との関係で定まる定数であり、定数ｄ〜ｆは、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値と併用化学療法が奏効しない確率との関係で定まる定数である。
【００４３】
（判定工程）
本発明の判定工程は、上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する工程である。
【００４４】
上記併用化学療法とは、抗癌剤を２剤以上組み合わせて行う治療法である。具体的な併用化学療法としては、アンスラサイクリン系抗癌剤と他の抗癌剤とを用いる併用療法（１）、タキサン系抗癌剤と他の抗癌剤とを用いる併用療法（２）、アンスラサイクリン系抗癌剤とタキサン系抗癌剤とを用いる併用療法（３）、その他の抗癌剤を用いる併用療法（４）等に分類される。
【００４５】
上記併用療法（１）としては、例えばＡＣ、ＦＡＣ、ＦＥＣ、ＥＣ等が挙げられる。上記併用療法（２）としては、例えばＴＣ等が挙げられる。上記併用療法（３）としては、例えばＴＡＣ、ＡＣ−Ｔ、ＦＥＣ−Ｔ、Ｔ−ＦＥＣ等が挙げられる。上記併用療法（４）としては、ＣＭＦ等が挙げられる。なお、上記併用療法におけるＡ、Ｃ、Ｆ、Ｅ、Ｔは下記抗癌剤を示す。
【００４６】
Ａ：ドキソルビシン（アンスラサイクリン系）
Ｃ：シクロフォスファミド
Ｆ：フルオロウラシル
Ｅ：エピルビシン（アンスラサイクリン系）
Ｔ：パクリタキセル又はドセタキセル（タキサン系）
【００４７】
また、ＡＣ−Ｔとは、Ａ及びＣの投与を行い、次いでＴの投与を行う治療法を示し、ＦＥＣ−Ｔとは、Ｆ、Ｅ及びＣの投与を行い、次いでＴの投与を行う治療法を示す。Ｔ−ＦＥＣとは、逆にＴの投与を先に行い、次いでＦ、Ｅ及びＣの投与を行う治療法を示す。このように、全ての抗癌剤を同時に投与するだけでなく、時間をずらして投与する治療法も併用化学療法に含まれる。
【００４８】
上記併用化学療法としては、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法であることが好ましく、これらのうち、Ｔ−ＦＥＣ、ＡＣ−Ｔ、ＴＡＣ、ＦＥＣ−Ｔがより好ましい。
【００４９】
上記判定工程は、上記リスクスコアと第１の閾値を比較し、上記ＧＳＴπの発現量と第２の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定することが好ましい。
【００５０】
上記判定工程は、上記リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定することが好ましい。
【００５１】
上記第１の閾値としては、癌細胞の種類、生体試料の種類、ＣＤＫの発現量の測定方法等に応じて適切な値を適宜設定することができる。例えば、複数の癌患者から採取した生体試料中のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量及び活性値から算出されるリスクスコアと、それぞれの癌患者の併用化学療法に対する奏効性、すなわち併用化学療法による病理学的腫瘍消失（ｐＣＲ）の有無とから閾値を算出することができる。これらのデータから閾値を設定する方法としては、例えばＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）分析、中央値の算出、平均値±標準偏差の算出等の方法が挙げられる。生体試料中のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量及び活性値から算出されるリスクスコアがこの閾値以下である場合には、その癌患者に対して併用化学療法は奏効性が低いと判定される。また、上記リスクスコアが上記閾値より大きい場合には、癌患者に対しての併用化学療法の奏効性について一定の傾向は得られないため、奏効性を判定することはできない。なお、ここで癌患者に対して併用化学療法が奏効性を示すとは、例えばＴ−ＦＥＣ等の併用化学療法により腫瘍が消失すること等をいう。但し、併用化学療法が奏効性を示すと判断する基準は、癌の種類等によりそれぞれ適切な基準を設定する必要がある。
【００５２】
上記第２の閾値としては、癌細胞の種類、生体試料の種類、ＧＳＴπの発現量の測定方法等に応じて適切な値を適宜設定することができる。例えば、複数の癌患者から採取した生体試料中のＧＳＴπの発現量と、それぞれの癌患者の併用化学療法に対する奏効性、すなわち併用化学療法による病理学的腫瘍消失（ｐＣＲ）の有無とから閾値を算出することができる。これらのデータから閾値を設定する方法としては、上記第1の閾値と同様の方法等を挙げることができる。生体試料中のＧＳＴπの発現量が設定された閾値より大きい場合には、併用化学療法の奏効性が低いと判定される。なお、上記ＧＳＴπの発現量が上記閾値以下である場合には、癌患者に対しての併用化学療法の奏効性について一定の傾向は得られないため、奏効性を判定することはできない。
【００５３】
なお、併用化学療法の奏効性判定において、リスクスコアとＧＳＴπの発現量を組み合わせてその指標とすることにより、リスクスコア、ＧＳＴπの発現量それぞれを単独で用いた場合と比較して、より信頼性が高くなり、特に陰性適中率（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ：ＮＰＶ）に優れる。ここで、上記奏効性判定の信頼性は、Ｐ−ｖａｌｕｅにより判断することができ、その信頼性がより高い場合はＰ−ｖａｌｕｅがより小さい値となり、逆にその信頼性が低い場合はＰ−ｖａｌｕｅは大きい値となる。このように、リスクスコア及びＧＳＴπの発現量を併用化学療法の奏効性判定の指標とすることは、Ｔ−ＦＥＣ等の併用化学療法後ｐＣＲ予測に有用である。
【００５４】
［実施の形態２］奏効性判定プログラム
次に、実施の形態１の併用化学療法の奏効性判定方法をコンピュータに実現させる形態を図１及び２を用いて説明する。先ず、図１のシステム１００の構成を説明する。図１のシステム１００は、コンピュータ１と、キーボード２と、マウス３と、ＣＤＫ測定装置４と、ＧＳＴπ測定装置５と、表示装置６とを有する。コンピュータ１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４、ＧＳＴπ測定装置５及び表示装置６のそれぞれと通信ケーブルによって接続されている。
【００５５】
コンピュータ１は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得すると共に、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得し、取得した情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する装置である。コンピュータ１の構成の詳細は後述する。キーボード２及びマウス３は、医師等の使用者が上記の情報をコンピュータ１に入力するための装置である。
【００５６】
ＣＤＫ測定装置４は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する装置である。また、ＣＤＫ測定装置４は、上記生体試料中のＣＤＫ２の活性値及び発現量を測定する装置でもある。なお、ＣＤＫ測定装置４は、測定したＣＤＫの活性値を発現量で除してＣＤＫの比活性値を算出する機能を有してもよい。ＣＤＫ測定装置４は、ＣＤＫ１の比活性値に関する情報（ＣＤＫ１の活性値及び発現量、又はＣＤＫ１の比活性値）、及びＣＤＫ２の比活性値に関する情報（ＣＤＫ２の活性値及び発現量、又はＣＤＫ２の比活性値）をコンピュータ１に入力する。ＧＳＴπ測定装置５は、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を測定し、測定結果をＧＳＴπの発現量の情報としてコンピュータ１に入力する装置である。表示装置６は、コンピュータ１によって得られた判定結果をコンピュータ１から受け取って表示する装置である。
【００５７】
次に、コンピュータ１の構成を説明する。コンピュータ１は、入力ポート１１と、ＣＰＵ１２と、ＨＤＤ１３と、ＲＡＭ１４と、出力ポート１５とを有する。入力ポート１１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４及びＧＳＴπ測定装置５のそれぞれと通信ケーブルによって接続されており、ＣＰＵ１２がキーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４及びＧＳＴπ測定装置５のいずれかからＣＤＫ１の比活性値に関する情報、ＣＤＫ２の比活性値に関する情報、及びＧＳＴπの発現量の情報を取得するためのインタフェイスである。
【００５８】
ＣＰＵ１２は、入力ポート１１、ＨＤＤ１３、ＲＡＭ１４及び出力ポート１５のそれぞれと通信バスによって接続されており、下記の奏効性判定プログラムに含まれる機能を実現する。ＨＤＤ１３は、ＣＰＵ１２によって実現させる六つの機能を含む奏効性判定プログラムを記憶している。以下に、それら六つの機能を説明する。
【００５９】
第１の機能は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能である。第２の機能は、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する機能である。第３の機能は、第１の機能によって取得されたＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報と、実施の形態１において示した式（１）とを用いてリスクスコアを算出する機能である。
【００６０】
第４の機能は、第３の機能によって算出されたリスクスコアと第１の閾値とを比較する機能である。第５の機能は、第２の機能によって取得された情報が示すＧＳＴπの発現量と第２の閾値とを比較する機能である。第６の機能は、リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する機能である。併用化学療法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法である。
【００６１】
更に、ＨＤＤ１３は、上記の式（１）、第１の閾値及び第２の閾値を記憶している。上記の式（１）に含まれる関数Ｆ（ｘ）は実施の形態１において示した式（２）により表現される関数であり、上記の式（１）に含まれる関数Ｇ（ｙ）は実施の形態１において示した式（３）により表現される関数であって、関数Ｆ（ｘ）には定数ａ〜ｃが含まれており、関数Ｇ（ｙ）には定数ｄ〜ｆが含まれている。そのため、ＨＤＤ１３は、上記の式（２）及び（３）並びに定数ａ〜ｆも記憶している。上記の式（２）における変数ｘはＣＤＫ１の比活性値であり、上記の式（３）における変数ｙはＣＤＫ２の比活性値である。上記の式（２）及び（３）並びに第１の閾値及び第２の閾値については、実施の形態１において詳述したので説明を省略する。
【００６２】
次に、コンピュータ１のＣＰＵ１２の動作を、図２を用いて説明する。ＣＰＵ１２は、入力ポート１１を介して、キーボード２、マウス３又はＣＤＫ測定装置４から、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する（Ｓ１）。ＣＰＵ１２は、使用者がキーボード２又はマウス３を用いて入力したＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を受け付けることによってそれらの情報を取得してもよい。また、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ測定装置４からＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を受け取ることによってそれらの情報を取得してもよい。ＣＰＵ１２は、取得したＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報をＲＡＭ１４に格納する。ここで、キーボード２、マウス３又はＣＤＫ測定装置４から入力されたＣＤＫ１の比活性値の情報が、ＣＤＫ１の活性値とＣＤＫ１の発現量の場合、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の活性値をＣＤＫ１の発現量で除してＣＤＫ１の比活性値を求める。そして、求めたＣＤＫ１の比活性値を、ＣＤＫ１の比活性値の情報として、ＲＡＭ１４に格納する。また、入力されたＣＤＫ２の比活性値の情報が、ＣＤＫ２の活性値とＣＤＫ２の発現量の場合、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ２の活性値をＣＤＫ２の発現量で除してＣＤＫ２の比活性値を求める。そして、求めたＣＤＫ２の比活性値を、ＣＤＫ２の比活性値の情報として、ＲＡＭ１４に格納する。
【００６３】
次に、ＣＰＵ１２は、入力ポート１１を介して、キーボード２、マウス３又はＧＳＴπ測定装置５から、上記癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する（Ｓ２）。ＣＰＵ１２は、使用者がキーボード２又はマウス３を用いて入力したＧＳＴπの発現量の情報を受け付けることによってその情報を取得してもよいし、ＧＳＴπ測定装置５からからその情報を受け取ることによってその情報を取得してもよい。ＣＰＵ１２は、取得したＧＳＴπの発現量の情報をＲＡＭ１４に格納する。
【００６４】
そして、ＣＰＵ１２は、ＲＡＭ１４からＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得するとともに、ＨＤＤ１３から上記の式（１）、（２）及び（３）並びに定数ａ〜ｆを取得し、ＣＤＫ１の比活性値をｘとし、かつＣＤＫ２の比活性値をｙとして、上記（１）、（２）及び（３）を用いてリスクスコアを算出する（Ｓ３）。
【００６５】
次に、ＣＰＵ１２は、ＨＤＤ１３から第１の閾値を取得し、取得した第１の閾値とステップＳ３において算出したリスクスコアとを比較する（Ｓ４）。ＣＰＵ１２は、リスクスコアが第１の閾値以下であることを示す比較結果を得た場合（Ｓ４でＹｅｓ）、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する（Ｓ５）。
【００６６】
他方、リスクスコアが第１の閾値より大きいことを示す比較結果を得た場合（Ｓ４でＮｏ）、ＣＰＵ１２は、ＲＡＭ１４からＧＳＴπの発現量の情報を取得するとともにＨＤＤ１３から第２の閾値を取得し、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値とを比較する（Ｓ６）。ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きいことを示す比較結果を得た場合（Ｓ６でＹｅｓ）、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する（Ｓ７）。それに対して、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値以下であることを示す比較結果を得た場合（Ｓ６でＮｏ）、ＣＰＵ１２は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かは不明であると判定する（Ｓ８）。ＣＰＵ１２は、判定結果を出力ポート１５を介して表示装置６に出力する。これにより、ＣＰＵ１２の動作は終了する。表示装置６は、コンピュータ１の出力ポート１５から判定結果を受け取って表示する。
【００６７】
上述の通り、ＣＰＵ１２は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得するとともに、上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得し、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値からリスクスコアを算出する。そして、ＣＰＵ１２は、リスクスコアと第１の閾値とを比較し、リスクスコアが第１の閾値以下である場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。また、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。表示装置６は判定結果を表示する。したがって、使用者は、コンピュータ１を用いることにより、簡便にかつ客観的に、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かを認識することができる。すなわち、使用者は、高い信頼性で、癌患者に対する併用化学療法の効果を推定することができる。
【００６８】
なお、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２は、ステップＳ４においてリスクスコアと第１の閾値とを比較し、リスクスコアが第１の閾値より大きいことを示す比較結果を得た場合（Ｓ４でＮｏ）、ステップＳ６においてＧＳＴπの発現量と第２の閾値とを比較する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値との比較をリスクスコアと第１の閾値との比較より前に行ってもよい。すなわち、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量が第２の閾値以下であることを示す比較結果を得た場合、リスクスコアと第１の閾値とを比較してもよい。又は、ＣＰＵ１２は、リスクスコアと第１の閾値との比較と、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値との比較とを、実質上同時に行ってもよい。いずれの場合であっても、ＣＰＵ１２は、リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。
【００６９】
また、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２によって実現させる機能を含む奏効性判定プログラムは、ＨＤＤ１３によって記憶されている。しかしながら、その奏効性判定プログラムは例えば携帯可能な記憶媒体に記憶されていて、コンピュータ１のＨＤＤ１３又はＲＡＭ１４に格納された後にＣＰＵ１２によって用いられてもよい。したがって、その奏効性判定プログラムの実施態様は、記憶媒体に記憶されること、及び、記憶媒体に記憶された状態で流通すること等を含む。
【００７０】
また、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値からリスクスコアを算出する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、リスクスコアを用いることなく、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値並びにＧＳＴπの発現量に基づいて癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定することができれば、リスクスコアを算出することなく、ＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値並びにＧＳＴπの発現量に基づいて癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
【００７１】
また、上述した実施の形態２では、リスクスコアを算出するための式（１）に含まれる関数Ｆ（ｘ）は式（２）によって表現され、式（１）に含まれる関数Ｇ（ｙ）は式（３）によって表現される。しかしながら、リスクスコアを算出するために式（１）を用いる場合であっても、関数Ｆ（ｘ）及びＧ（ｙ）のそれぞれは、式（２）又は式（３）以外の式によって表現されてもよい。
【００７２】
また、上述した実施の形態２では、ＣＰＵ１２は、リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する。しかしながら、その判定方法以外の方法を用いて癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かを判定することができれば、ＣＰＵ１２は、リスクスコアと第１の閾値との比較と、ＧＳＴπの発現量と第２の閾値以上との比較との一方又は双方を行うことなく、ＣＤＫ１の比活性値、ＣＤＫ２の比活性値、及びＧＳＴπの発現量に基づいて、癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
【００７３】
また、上述した実施の形態２では、併用化学療法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法である。しかしながら、併用化学療法は、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる方法に限定されない。
【００７４】
また、上述した実施の形態２では、図２のステップＳ１において、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報を受動的に取得する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ測定装置４にそれらの情報を出力することを定期的に又は不定期に要求してそれらの情報を能動的に取得してもよい。同様に、上述した実施の形態２では、図２のステップＳ２において、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπの発現量の情報を受動的に取得する。しかしながら、ＣＰＵ１２は、ＧＳＴπ測定装置５にその情報を出力することを定期的に又は不定期に要求してその情報を能動的に取得してもよい。
【００７５】
また、上述した実施の形態２では、ＣＤＫ測定装置４は、ＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報をコンピュータ１に入力する。しかしながら、ＣＤＫ測定装置４は、ＣＤＫ１の比活性値の情報及びＣＤＫ２の比活性値の情報をコンピュータ１に入力せずに、ＣＤＫ１の活性値及び発現量の情報と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の情報とをコンピュータ１に入力してもよい。その場合、ＣＰＵ１２は、入力ポート１１を介して、ＣＤＫ測定装置４からのＣＤＫ１の活性値及び発現量の情報と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の情報とを受け取る。そして、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ１の活性値をＣＤＫ１の発現量により除してＣＤＫ１の比活性値を算出し、それによりＣＤＫ１の比活性値を取得する。同様に、ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ２の活性値をＣＤＫ２の発現量により除してＣＤＫ２の比活性値を算出し、それによりＣＤＫ２の比活性値を取得する。ＣＰＵ１２は、ＣＤＫ測定装置４に、ＣＤＫ１の活性値及び発現量の情報と、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の情報とを定期的に又は不定期に要求してそれらの情報を能動的に取得してもよい。
【００７６】
また、上述した実施の形態２では、上記の第１の閾値、第２の閾値、式（１）、式（２）、式（３）、及び定数ａ〜ｃは、ＨＤＤ１３によって記憶されている。それらは、使用者がキーボード２又はマウス３を用いてコンピュータ１に入力することによって、又はＣＤＫ測定装置４若しくはＧＳＴπ測定装置５がコンピュータ１に入力することによって、ＣＰＵ１２によって取得された後にＨＤＤ１３によって記憶されてもよい。
【００７７】
また、上述した実施の形態２では、コンピュータ１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４、ＧＳＴπ測定装置５、及び表示装置６のそれぞれと通信ケーブルによって接続されている。しかしながら、コンピュータ１は、キーボード２、マウス３、ＣＤＫ測定装置４、ＧＳＴπ測定装置５、及び表示装置６の全部又は一部と無線によって接続されてもよい。
【００７８】
また、上述した実施の形態２では、コンピュータ１は表示装置６と接続されているが、コンピュータ１は、表示装置６の代わりに又は表示装置６とともに、スピーカ、印刷装置、又は携帯通信端末装置等と接続されてもよい。その場合、スピーカ等は判定結果を報知するので、使用者は、癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いか否かを認識することができる。
【００７９】
更に、上述した実施の形態２の癌細胞は、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、又は白血病細胞等の癌細胞である。また、上述した実施の形態２の生体試料は、癌患者から採取された癌細胞を含む試料である。例えば、実施の形態２の生体試料は、癌患者の血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、又は、手術若しくは生検により癌患者から採取した細胞若しくは組織等である。生体試料は、癌患者から採取した細胞や組織を培養して得られた試料であってもよい。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００８１】
＜ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の測定＞
［測定用試料の調製］
（試薬の調整）
コンプリート溶解液：
コンプリート錠（Ｒｏｃｈｅ社）１錠を２ｍＬの超純水に溶解し、調製した。
【００８２】
緩衝液Ａ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ ＮＰ−４０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を最終濃度として含む溶液中に、コンプリート溶解液が２５倍希釈されるよう添加し、調製した。
【００８３】
（測定用試料の調整）
乳癌患者からマンモトームにより採取した腫瘍細胞塊を、チューブ内で緩衝液Ａに懸濁した。緩衝液Ａは、４ｍｍ角相当の腫瘍細胞塊に４００μＬ、３ｍｍ角相当の腫瘍細胞塊に２００μＬ、中間の大きさの腫瘍細胞塊に３００μＬ添加した。電動ホモジナイザーを用いて、上記腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。上記細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、得られた上清を測定用試料として用いた。なお、上記乳癌患者から採取した腫瘍細胞塊は合計１１２検体であった。
【００８４】
［ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の測定］
（試薬及び標準品の調整）
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：
１０×ＴＢＳ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ２５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ １．５Ｍを最終濃度として含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調製した溶液）を１０倍希釈して、ＴＢＳを調製した。
【００８５】
ブロッキング試薬：
上述のＴＢＳ中に、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を最終濃度が４％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、ブロッキング試薬を調製した。
【００８６】
１次抗体試薬：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（粉末）（大日本住友製薬社）を最終濃度が３．２％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように超純水に溶解した溶液に、抗ＣＤＫ１抗体を１２μｇ／ｍＬとなるように溶解し、抗ＣＤＫ１抗体試薬を調製した。同様に、抗ＣＤＫ１抗体に代えて、抗ＣＤＫ２抗体を７．５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、抗ＣＤＫ２抗体試薬を調製した。
【００８７】
２次抗体試薬：
上述のＴＢＳ中に、ＢＳＡを最終濃度が１％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解した溶液に、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を８μｇ／ｍＬとなるように溶解し、２次抗体試薬を調製した。
【００８８】
蛍光標識試薬：
上述のＴＢＳ中に、ＢＳＡを最終濃度が１％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３を最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解した溶液に、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を１０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調製した。
【００８９】
蛍光増強試薬：
３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ １００ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含み、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．９となるよう調製した。
【００９０】
発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液：
上述のＴＢＳ中に、Ｓｕｃｒｏｓｅ ８７６．４ｍＭ、ＢＳＡ ０．００５％（ｗ／ｖ）、ＮＰ４０ ０．００５％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液を調製した。
【００９１】
ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品：
上述のＴＢＳ中に、ＢＳＡ ０．００５％（ｗ／ｖ）、ＮＰ４０ ０．００５％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品を調製した。
【００９２】
ＣＤＫ１発現量測定用標準品：
ＣＤＫ１／ｃｙｃｌｉｎＢ１， ａｃｔｉｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液に添加し、１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。この希釈液３ｍＬを発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液９５ｍＬに添加し、ＣＤＫ１発現量測定用標準品を調製した。
【００９３】
ＣＤＫ２発現量測定用標準品：
ｃｄｋ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液に添加し、１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。この希釈液１．３ｍＬを発現量用ＣＤＫ標準品緩衝液９８ｍＬに添加し、ＣＤＫ２発現量測定用標準品を調製した。
【００９４】
（ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の測定）
フィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＰＳＱＰｌａｔｅｓ）を３０％エタノールで親水処理後、ＴＢＳを各ウェル２００μＬ添加し、吸引することで洗浄を行った。各測定用試料を各ウェルに１００μＬ添加し、吸引により水分を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を行った。その後、ブロッキング試薬を各ウェル１００μＬ添加し、吸引した。ブロッキング試薬を吸引後、抗ＣＤＫ１抗体試薬（１次抗体試薬）を各ウェル５０μＬ添加し、吸引した。再度抗ＣＤＫ１抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加し、２３℃で２時間静置した。その後、吸引により１次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った。洗浄後、２次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加し、吸引した。再度２次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加し、２３℃で４５分間静置した。その後、吸引により２次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光標識試薬を各ウェル１００μＬ添加し、吸引した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った。洗浄後、蛍光増強試薬を各ウェル２００μＬ添加し、吸引した。その後、フィルタープレートを乾燥させた。
【００９５】
乾燥後、上記フィルタープレート中の各ウェルについて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（Ｔｅｃａｎ社）で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量の算出は、キャリブレーターを用いて作成した検量線により行った。キャリブレーターは、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品３００μＬ、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品２７０μＬにＣＤＫ１発現量測定用標準品３０μＬを添加したもの、ＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品１５０μＬにＣＤＫ１発現量測定用標準品１５０μＬを添加したもの、ＣＤＫ１発現量測定用標準品３００μＬを使用した。これらをそれぞれフィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ）に各ウェル１００μＬ添加し、上記測定用試料について行ったのと同様の方法によりブロッキング、１次抗体反応、２次抗体反応、蛍光標識反応等を行い、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いてそれぞれの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。
【００９６】
ＣＤＫ２の発現量の測定は、１次抗体として抗ＣＤＫ１抗体試薬の代わりに抗ＣＤＫ２抗体試薬を用いること、キャリブレーターとしてＣＤＫ１／２発現量ＢＧ測定用標準品とＣＤＫ２発現量測定用標準品を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の手順で行った。
【００９７】
［ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性の測定］
（試薬及び標準品の調整）
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：
２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ １Ｍ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４となるよう調製した。
【００９８】
免疫沈降緩衝液：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮＰ４０ ０．１％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降緩衝液を調製した。
【００９９】
２０％プロテインＡビーズ溶液：
プロテインＡビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）３００μＬを２ｍＬエッペンドルフチューブに加え、免疫沈降緩衝液９００μＬを加えて転倒混和し、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離を行って上清を除去する操作を２回行った。ここに免疫沈降緩衝液１０８０μＬを添加し、２０％プロテインＡビーズ溶液を調製した。
【０１００】
ＣＤＫ抗体希釈液：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを４０倍希釈した溶液中に、Ｓｕｃｒｏｓｅ１Ｍ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、ＣＤＫ抗体希釈液を調製した。
【０１０１】
抗ＣＤＫ１抗体試薬：
ＣＤＫ抗体希釈液１．９ｍＬに１０％ ＮａＮ３溶液（ｗ／ｖ）を１９０μＬ添加し、この溶液中に抗ＣＤＫ１抗体（４４８μｇ／ｍＬ）を１７．５ｍＬ添加して希釈した。この希釈液４８０μＬに免疫沈降緩衝液８４０μＬを添加し、抗ＣＤＫ１抗体試薬を調製した。
【０１０２】
抗ＣＤＫ２抗体試薬：
ＣＤＫ抗体希釈液１．６ｍＬに１０％ ＮａＮ３溶液（ｗ／ｖ）を１００μＬ添加し、この溶液中に抗ＣＤＫ２抗体（３６０μｇ／ｍＬ）を８．３ｍＬ添加して希釈した。この希釈液２４０μＬに免疫沈降緩衝液９６０μＬを添加し抗ＣＤＫ２抗体試薬を調製した。
【０１０３】
免疫沈降洗浄液１：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮＰ４０ １％、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液１を調製した。
【０１０４】
免疫沈降洗浄液２：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮａＣｌ ３００ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液２を調製した。
【０１０５】
免疫沈降洗浄液３：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液３を調製した。
【０１０６】
Ｋｉｎａｓｅ反応試薬：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１８．４倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２ ２０ｍＭ、ＡＴＰ−γＳ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）２ｍＭ、Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ社）０．２ｍｇ／ｍＬを最終濃度として含むよう添加し、Ｋｉｎａｓｅ反応試薬を調製した。
【０１０７】
２．２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ：
３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２．２Ｍ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を含み、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４となるよう調製した。
【０１０８】
蛍光標識反応緩衝液：
２．２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨを７．３倍希釈した溶液中に、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、蛍光標識反応緩衝液を調製した。
【０１０９】
蛍光標識試薬：
５−（Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５ｍｇ、ＤＭＳＯ ６ｍＬを蛍光標識反応緩衝液１１６ｍＬ添加し、蛍光標識試薬を調製した。
【０１１０】
蛍光標識反応停止液：
２．２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨを１．１倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加した。この溶液４９８．９５ｍＬ中にＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ２．４５ｇを溶解し、蛍光標識反応停止液を調製した。
【０１１１】
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：
１０×ＴＢＳ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ２５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ １．５Ｍを最終濃度として含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調製した溶液）を１０倍希釈して、ＴＢＳを調製した。
【０１１２】
蛍光増強試薬：
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）を１０倍希釈した溶液中に、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）を最終濃度として含むよう添加し、調製した。
【０１１３】
ＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液：
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２０倍希釈した溶液中に、Ｓｕｃｒｏｓｅ ８１０．７ｍＭ、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本住友製薬社）１％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．１％（ｗ／ｖ）、ＮＰ４０ ０．１％を最終濃度として含むよう添加し、ＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液を調製した。
【０１１４】
ＣＤＫ１／２活性測定用標準品：
ＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液中に、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＤＫ１／ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１， ａｃｔｉｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）３ｎｇ／μＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ Ｅ， ａｃｔｉｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）１ｎｇ／μＬを最終濃度として含むよう希釈し、ＣＤＫ１／２活性測定用標準品を調製した。
【０１１５】
（ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性の測定）
フィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ）の各ウェルに２０％ プロテインＡビーズ溶液を３０μＬ、抗ＣＤＫ１抗体希釈液を９０μＬ、各測定用試料を３０μＬ添加した。これを４℃で１２０分間攪拌し、測定用試料中のＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。反応後、吸引により水分を除去した。次に、免疫沈降洗浄液１を各ウェル２００μＬ添加し、吸引してビーズを洗浄した。続いて免疫沈降洗浄液２を各ウェル２００μＬ添加し、吸引してビーズを洗浄した。更に、免疫沈降洗浄液３を各ウェル２００μＬ添加し、吸引してビーズを洗浄した。これにより、抗ＣＤＫ１抗体を介して各測定試料中のＣＤＫ１が結合したセファロースビーズをフィルタープレート上に得た。
【０１１６】
このフィルタープレートの各ウェルに、Ｋｉｎａｓｅ反応試薬を５０μＬ添加し、３７℃で６０分間攪拌して反応させた。
【０１１７】
Ｋｉｎａｓｅ反応後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、反応生成物を採取し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の各ウェルに１４μＬ添加した。この反応生成物に、蛍光標識試薬を各ウェル１４μＬ添加し、２５℃で２０分間攪拌して反応させ、蛍光標識反応停止液を各ウェル２００μＬ添加して反応を停止させた。
【０１１８】
フィルタープレートに７０％エタノールを各ウェル１００μＬ添加し、吸引により７０％エタノールを除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル２００μＬ添加し、吸引する洗浄を２回行った。次に、Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ中の蛍光標識反応停止後の反応液を、フィルタープレートの各ウェルに１００μＬ添加し、吸引して反応液を除去した。続いて、ＴＢＳを各ウェル２００μＬ添加し、吸引して除去する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光増強試薬を各ウェル２００μＬ添加し、吸引して蛍光増強試薬を除去する反応を６回行った。その後、フィルタープレートを乾燥させた。
【０１１９】
乾燥後、上記フィルタープレート中の各ウェルについて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（Ｔｅｃａｎ社）で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のＣＤＫ１の活性の算出は、キャリブレーターとしてＣＤＫ１／２活性測定用標準品を用いて作成した検量線により行った。なお、検量線の作成は、以下の方法により行った。ＣＤＫ１／２活性測定用標準品をＣＤＫ１／２活性測定用標準品希釈液で１／４希釈したもの、同様に１／２希釈したもの、ＣＤＫ１／２活性測定用標準品をそれぞれフィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ）に各ウェル３０μＬ添加し、上記測定用試料について行ったのと同様の方法により免疫沈降、Ｋｉｎａｓｅ反応、蛍光標識反応等を行い、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いてそれぞれの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。
【０１２０】
ＣＤＫ２活性の測定は、抗ＣＤＫ１抗体の代わりに抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１活性測定と同様の手順で行った。
【０１２１】
［ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の算出］
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性は、下記のように算出した。
各測定用試料について、検量線から算出したＣＤＫ１活性をもとに、測定用試料１μＬ中に含まれるＣＤＫ１活性（Ａ）を算出した。また、各測定用試料について、検量線から算出したＣＤＫ１発現量をもとに、測定用試料１μＬ中に含まれるＣＤＫ１発現量（Ｂ）を算出した。ＣＤＫ１比活性は、Ａ／Ｂにより算出した。ＣＤＫ２についても同様に比活性の算出を行った。
【０１２２】
＜ＧＳＴπの発現量の測定＞
［ＧＳＴπの発現量の測定に用いる試薬の調製］
ＧＳＴπの発現量を測定するために、ブロッキング試薬、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、１次抗体試薬、２次抗体試薬及び蛍光標識試薬を調製した。それぞれの試薬の調製法を以下に示す。
【０１２３】
ブロッキング試薬：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（粉末）（大日本住友製薬社）を、最終濃度が４％となるように超純水に溶解し、ブロッキング試薬を調製した。
【０１２４】
１次抗体試薬：
ブロッキング試薬を１０倍希釈して調製したブロッキング溶液に、抗ＧＳＴπ抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社）を、５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、１次抗体試薬を調製した。
【０１２５】
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）：
１０×ＴＢＳ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ３０．２８ｇ、ＮａＣｌ ８７．７ｇ、６Ｎ ＨＣｌ １１０ｇを超純水に添加し、最終量を１Ｌとした溶液）を１０倍希釈して、ＴＢＳを調製した。
【０１２６】
２次抗体試薬：
ＴＢＳに、ウシ血清アルブミンＢＳＡを、最終濃度が１％となるように超純水に溶解し、ＴＢＳ（１％ＢＳＡ）を調製した。得られたＴＢＳ（１％ＢＳＡ）に、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＢＩＯＴ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を、３０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、２次抗体試薬を調製した。
【０１２７】
蛍光標識試薬：
上述のＴＢＳ（１％ＢＳＡ）に、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を、１０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調製した。
【０１２８】
［ＧＳＴπの発現量の測定］
フィルタープレート（Ｍｕｌｔｉ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＰＳＱ Ｐｌａｔｅｓ）を３０％エタノールで親水処理後、各測定用試料を各ウェルに１０μｇ添加し、吸引により水分を除去した。なお、測定用試料としては、上記第１取得工程において調製した試料を用いた。その後、ブロッキング試薬を各ウェル１００μＬ加え吸引した。ブロッキング試薬を吸引後、１次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加しすぐに吸引した。吸引後、再び１次抗体試薬を各ウェル５０ｕＬ添加し２時間静置した。その後、吸引により１次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを、各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った。洗浄後、２次抗体試薬を各ウェル５０μＬ添加しすぐに吸引した。吸引後、再び２次抗体試薬を各ウェル５０ｕＬ添加し１時間静置した。その後、吸引により２次抗体試薬を除去した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加し、吸引する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光標識試薬を各ウェル１００μＬ添加しすぐに吸引した。次に、ＴＢＳを各ウェル３００μＬ添加して吸引する洗浄を４回行った後、フィルタープレートを乾燥させた。
【０１２９】
乾燥後、上記フィルタープレート中の各ウェルについて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（Ｔｅｃａｎ社）で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のＧＳＴπの発現量の算出は、キャリブレーターとしてＧＳＴＰ１ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｂｎｏｖａ社 Ｃａｔ Ｎｏ．Ｈ００００２９５０−Ｐ０１）を用いて作成した検量線により行った。なお、検量線の作成は、以下の方法により行った。０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェル、１０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェル、３０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェル、５０ｎｇ／１００ｕＬ／ウェルの各濃度となるようにフィルタープレート上に上記ＧＳＴＰ１ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎを添加し、上記測定用生体試料について行ったのと同様の方法によりブロッキング、１次抗体反応、２次抗体反応及び蛍光標識試薬反応等を行い、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いてそれぞれの蛍光強度を測定し検量線を作成した。
【０１３０】
＜リスクスコアの算定＞
得られたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値を用いて、下記式に基づきリスクスコア（ＲＳ）を算出した。
【０１３１】
Ｆ（ｘ）＝０．１５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−１．６）×７）
Ｇ（ｙ）＝０．２５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−１．０）×６）
ＲＳ＝３０００×Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）
ｘ＝ｌｏｇ（ＣＤＫ１比活性値）
ｙ＝ｌｏｇ（ＣＤＫ２比活性値）−ｌｏｇ（ＣＤＫ１比活性値）
【０１３２】
＜奏効性の判定＞
上記乳癌患者に対して、マンモトーム生検の後、週１回のパクリタキセル投与（Ｔ）を１２サイクル、２１日毎の５−ＦＵ、エピルビシン及びシクロフォスファミド投与（ＦＥＣ）を４サイクル行い、病理学的腫瘍消失の有無を評価した。この評価において、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）となった患者を奏効例とした。
【０１３３】
上記ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値から算出されるリスクスコア（ＲＳ）を単独で指標として用い、Ｔ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線を図３に示す。このＲＯＣ曲線のＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）＝０．６１５、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ Ｐ （ａｒｅａ＝０．５）＝０．１１２４となった。また、ＧＳＴπを単独で指標として用い、同様にＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線を図４に示す。このＲＯＣ曲線のＡＵＣ＝０．６０８、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ Ｐ （ａｒｅａ＝０．５）＝０．１０４１となった。
【０１３４】
これに対し、リスクスコアとＧＳＴπを組み合わせて指標として用い、Ｔ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測を行った際のＲＯＣ曲線を図５に示す。このＲＯＣ曲線のＡＵＣ＝０．６８２、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ Ｐ （ａｒｅａ＝０．５）＝０．００２５となった。リスクスコアに対してＲＯＣ曲線を作成し、リスクスコアに関するカットオフを設定した後に、更にＧＳＴπのＲＯＣ曲線を作成してＧＳＴπのカットオフを設定すると、表３が得られる。リスクスコアのカットオフ（閾値）は０．１２１に、ＧＳＴπのカットオフ（閾値）は９３．１８６５に設定した。この時の陽性適中率（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ：ＰＰＶ）＝３４（％）、陰性適中率（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ：ＮＰＶ）＝９３．８（％）であった。この結果から、リスクスコアとＧＳＴπの組み合わせは、Ｔ−ＦＥＣに対して奏効しない患者を精度よく抽出できることが示唆され、奏効しない患者への不要な抗癌剤の投与を回避することで患者のＱＯＬ向上に貢献できると考えられる。
ＲＯＣ曲線のＡＵＣ、並びにＡＵＣのＰ−ｖａｌｕｅは、リスクスコアとＧＳＴπを組み合わせることにより、リスクスコア、ＧＳＴπそれぞれを単独で用いた場合と比較して大幅に改善が認められた。これらの結果から、リスクスコアとＧＳＴπの組み合わせはＴ−ＦＥＣ後ｐＣＲ予測に有用であると考えられる。
【０１３５】
リスクスコア（ＲＳ）及びＧＳＴπの発現量（表中では「ＧＳＴπ」と表記）と、Ｔ−ＦＥＣの奏効性の関係を表１に示す。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
表１に示す通り、リスクスコアが低値又はＧＳＴπの発現量が高値の乳癌患者は、Ｔ−ＦＥＣによる奏効性を示さないｎｏｎ−ｐＣＲの割合が顕著に高かった。従って、マンモトーム等により採取された生体試料のリスクスコアが低値又はＧＳＴπの発現量が高値である乳癌患者については、Ｔ−ＦＥＣによる併用化学療法以外の療法を選択することが好ましいと判定することができる。また、リスクスコアが高値かつＧＳＴπが低値である乳癌患者は、Ｔ−ＦＥＣによる奏効性について一定の傾向は示さなかった。なお、リスクスコアが高値とは上記閾値より大きいことをいい、リスクスコアが低値とは上記閾値以下であることをいう。また、ＧＳＴπの発現量が高値とは上記閾値より大きいことをいい、ＧＳＴπが低値とは上記閾値以下であることをいう。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明によると、癌患者への併用化学療法の奏効性について、より信頼性の高い判定方法を提供することができる。当該奏効性判定方法によると、患者は効果的でない可能性が高い不要な抗癌剤治療を回避することが可能となる。また当該奏効性判定方法を実現するための奏効性判定プログラム、及び奏効性判定装置は、癌患者への併用化学療法の奏効性を判定する手段として有用である。
【符号の説明】
【０１３９】
１００ システム
１ コンピュータ
２ キーボード
３ マウス
４ ＣＤＫ測定装置
５ ＧＳＴπ測定装置
６ 表示装置
１１ 入力ポート
１２ ＣＰＵ
１３ ＨＤＤ
１４ ＲＡＭ
１５ 出力ポート
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、
上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程と
を有する併用化学療法の奏効性判定方法。
【請求項２】
上記癌細胞が乳癌の癌細胞である請求項１に記載の奏効性判定方法。
【請求項３】
上記併用化学療法が、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法である請求項１又は請求項２に記載の奏効性判定方法。
【請求項４】
上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から下記式（１）を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含み、
上記判定工程は、上記算出工程で算出したリスクスコア及び上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する請求項１、請求項２又は請求項３に記載の奏効性判定方法。
リスクスコア＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ） ・・・（１）
（式（１）中、ｘは、ＣＤＫ１の比活性値である。ｙは、ＣＤＫ１の比活性値に対するＣＤＫ２の比活性値の比である。）
【請求項５】
上記Ｆ（ｘ）が下記式（２）で表され、Ｇ（ｙ）が下記式（３）で表される請求項４に記載の奏効性判定方法。
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ）） ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ）） ・・・（３）
（式（２）及び（３）中、ａ〜ｆは定数である。）
【請求項６】
上記判定工程は、上記リスクスコアと第１の閾値を比較し、上記ＧＳＴπの発現量と第２の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する請求項４又は請求項５に記載の奏効性判定方法。
【請求項７】
上記判定工程は、上記リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する請求項６に記載の奏効性判定方法。
【請求項８】
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する機能と、
取得されたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する機能と
をコンピュータに実現させるための奏効性判定プログラム。
【請求項９】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能が、ＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値をＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報として取得する、請求項８に記載の奏効性判定プログラム。
【請求項１０】
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報を取得する取得部と、
上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定部と
を備える併用化学療法の奏効性判定装置。
【請求項１１】
上記取得部が、ＣＤＫ１の比活性値の情報としてＣＤＫ１の活性値と発現量を取得し、ＣＤＫ２の比活性値の情報としてＣＤＫ２の活性値と発現量を取得し、
上記判定部が、上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する、
請求項１０に記載の奏効性判定装置。
【請求項１】
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値を取得する第１取得工程と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量を取得する第２取得工程と、
上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値、並びに上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程と
を有する併用化学療法の奏効性判定方法。
【請求項２】
上記癌細胞が乳癌の癌細胞である請求項１に記載の奏効性判定方法。
【請求項３】
上記併用化学療法が、アンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法である請求項１又は請求項２に記載の奏効性判定方法。
【請求項４】
上記第１取得工程で取得したＣＤＫ１の比活性値及びＣＤＫ２の比活性値から下記式（１）を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含み、
上記判定工程は、上記算出工程で算出したリスクスコア及び上記第２取得工程で取得したＧＳＴπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する請求項１、請求項２又は請求項３に記載の奏効性判定方法。
リスクスコア＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ） ・・・（１）
（式（１）中、ｘは、ＣＤＫ１の比活性値である。ｙは、ＣＤＫ１の比活性値に対するＣＤＫ２の比活性値の比である。）
【請求項５】
上記Ｆ（ｘ）が下記式（２）で表され、Ｇ（ｙ）が下記式（３）で表される請求項４に記載の奏効性判定方法。
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ）） ・・・（２）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ）） ・・・（３）
（式（２）及び（３）中、ａ〜ｆは定数である。）
【請求項６】
上記判定工程は、上記リスクスコアと第１の閾値を比較し、上記ＧＳＴπの発現量と第２の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する請求項４又は請求項５に記載の奏効性判定方法。
【請求項７】
上記判定工程は、上記リスクスコアが第１の閾値以下である場合又はＧＳＴπの発現量が第２の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する請求項６に記載の奏効性判定方法。
【請求項８】
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能と、
上記生体試料中のＧＳＴπの発現量の情報を取得する機能と、
取得されたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する機能と
をコンピュータに実現させるための奏効性判定プログラム。
【請求項９】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報を取得する機能が、ＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値をＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値の情報として取得する、請求項８に記載の奏効性判定プログラム。
【請求項１０】
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報を取得する取得部と、
上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の比活性値の情報、ＣＤＫ２の比活性値の情報、及びＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定部と
を備える併用化学療法の奏効性判定装置。
【請求項１１】
上記取得部が、ＣＤＫ１の比活性値の情報としてＣＤＫ１の活性値と発現量を取得し、ＣＤＫ２の比活性値の情報としてＣＤＫ２の活性値と発現量を取得し、
上記判定部が、上記取得部によって取得されたＣＤＫ１の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性値を求め、ＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ２の比活性値を求め、求められたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値、並びにＧＳＴπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する、
請求項１０に記載の奏効性判定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２２８２３３（Ｐ２０１２−２２８２３３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１００１８４（Ｐ２０１１−１００１８４）
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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