使用方法
【課題】被験体における関節リウマチまたは多発性硬化症などの障害を治療する方法は、前記被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップによって実施される。
【解決手段】被験体における関節リウマチを治療する方法であって、前記被験体に、Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【解決手段】被験体における関節リウマチを治療する方法であって、前記被験体に、Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチや多発性硬化症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原に遭遇すると、天然ＣＤ４＋ヘルパーＴ前駆（Ｔｈｐ）細胞は、２つの別個のサブセットである１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）および２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）に分化する。これらの分化したＴｈ細胞は、それらの別個の機能能力および固有のサイトカインプロファイルの両方によって規定される。詳細には、Ｔｈ１細胞は、インターフェロン−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−βを産生するが、これらはマクロファージを活性化し、細胞媒介性免疫および食細胞依存性保護応答に関与する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生することが公知であるが、これらは強力な抗体産生、好酸球活性化、および数種のマクロファージ機能の阻害に対して役割を果たすので、食細胞非依存性保護応答を提供する。したがって、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、様々な免疫病理学的応答と関連している。
【０００３】
さらに、各タイプのＴｈ細胞の発生は、様々なサイトカイン経路によって媒介される。詳細には、ＩＬ−４はＴｈ２分化を促進し、同時にＴｈ１発生を遮断することが証明されている。対照的に、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞の発生に対して重大なサイトカインである。したがって、これらのサイトカイン自体がＴｈ分極を駆動し、Ｔｈ１とＴｈ２との間の平衡を維持する正および負のフィードバック系を形成する。ＰＥＧ２は、さらにまたインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生およびＴ細胞増殖の抑制によってＴＨ１応答を調節することに役割を果たすことも証明されている。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、様々な臓器特異的自己免疫疾患、クローン病、ヘリコバクター・ピロリ誘導性消化性潰瘍、急性腎臓同種移植拒絶反応、および原因不明の反復性流産の病因に関係している。対照的に、アレルゲン特異的Ｔｈ２応答は、遺伝的に感受性の強い個体におけるアトピー性疾患の原因である。さらに、Ｔｈ２は、オーメン（Ｏｍｅｎｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）症候群、特発性肺線維症、および進行性全身性硬化症において優勢である依然として未知の抗原に対して応答する。ＩＬ−１７（Ｔｈ−１７サイトカインの符号）ノックアウトマウスは、炎症性関節炎の発生に対して顕著な耐性を示す。ＣＩＡモデルにおける関節破壊は、抗ＩＬ−１７中和抗体の投与によって改善することができる。
【０００５】
そこで、不均衡なＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞分化に関連する様々な状態を治療する際に有用である新規な治療的処置を開発する高度な満たされていない医療的必要性が残っている。これらの多くの状態のために現在利用できる治療選択肢は不適切である。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２およびＴｈ１７のパラダイムは、アレルギー性および自己免疫障害を治療する戦略を開発するための論理的根拠を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，１８９，７１５号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔ−ｂｅｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＩｇＧ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｕｔｏ Ａｂ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（８）：５５４５−５０（２００２）；Ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｏｆ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ） ４５（８）：９５１−７（２００６）
【非特許文献２】Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ，Ｔ−ｂｅｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１１（３）：１７７−８４（２００４）；Ｔ−ｂｅｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ＣＤ８ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９（８）：１１５３−６２（２００４）
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ８１（８）： ４７１−８０ （２００３）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（５）：１５９６−６０１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
脂質メディエータであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、免疫応答の様々な段階を変調することが証明されている。ＰＧＥ２が細胞内ｃＡＭＰの上昇およびＩｃｋの不活性化を通してＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を抑制することは周知である。しかし、本明細書に記載したように、ＥＰ４受容体によるＰＧＥ２刺激は反対の作用も有する可能性があり、つまり、活性化ＣＤ４＋細胞内でのＴｈ１分化およびＩＬ−１７産生を促進することがある。これに一致して、ＥＰ４と新規な選択的ＥＰ４アンタゴニストまたはＰＧＥ２中和抗体いずれかとの拮抗作用は、Ｔｈ１分化、Ｔｈ１７増殖、ならびに活性化された樹状細胞によるＩＬ−２３分泌を抑制する。ＰＧＥ２によるＴｈ１分化の誘導はＰＩ３Ｋシグナリングによって媒介されるが、他方ＩＬ−１７産生の刺激はｃＡＭＰシグナリングを必要とする。さらに、ＥＰ４アンタゴニストのＤＢＡ／１またはＣ５７ＢＬ／６マウスへの投与は先天性および適応的免疫応答を抑制し、さらにコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）および実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける疾患を抑制したので、これはＰＧＥ２／ＥＰ４シグナリングがこれらの自己免疫病理に極めて重要に関係することを示した。これらの結果は、ＰＧＥ２／ＥＰ４シグナリングの抑制が例えば関節リウマチおよび多発性硬化症などの炎症性自己免疫疾患を改善することに治療的価値を有する可能性があることを示唆している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１態様は、被験体における関節リウマチを治療する方法であって、該被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化１】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１０】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品は調節因子化合物を含み、該調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化２】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１１】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物である。
【００１２】
本発明のまた別の態様は、被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、該被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化３】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１３】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品は調節因子化合物を含み、該調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化４】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１４】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物である。
【００１５】
本発明のまた別の態様は、被験体における関節リウマチを治療する方法であって、該被験体にＥＰ４アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化５】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１６】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化６】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１７】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するためのＥＰ４アンタゴニストである。一部の実施形態では
【００１８】
本発明のまた別の態様は、被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、該被験体にＥＰ４アンタゴニストを投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化７】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１９】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化８】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００２０】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するためのＥＰ４アンタゴニストである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法によれば、関節リウマチや多発性硬化症を治療することができる。
【００２２】
本発明の他の態様については、本明細書において開示し、以下でより詳細に考察する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＥＰ４結合アッセイにおけるＥＲ−８１９９２４−０１およびそのエナンチオマーであるＥＲ−８１９９２５−０１の滴定試験を示す図である。
【図２】ＥＲ−８１９９２４およびＥＲ−８１９７６２が、ＳＥ３０２細胞におけるＰＧＥ２誘導性ＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーター活性に対する強力な阻害活性を示した図である。どちらの化合物も０．３ｎＭ〜１０μＭの濃度で試験した。
【図３】ＰＧＥ２／ＥＰ４アゴニストが抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いて刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−１７産生に及ぼす作用を示す図である。
【図４（２−１）】ＥＲ−８１９７６２が活性化ＣＤ４＋細胞からのＰＧＥ２／ＰＧＥ１−ＯＨ強化ＩＬ−１７産生を抑制することを示す図である。
【図４（２−２）】ＥＲ−８１９７６２が活性化ＣＤ４＋細胞からのＰＧＥ２／ＰＧＥ１−ＯＨ強化ＩＬ−１７産生を抑制することを示す図である。
【図５】抗ＰＧＥ２抗体がＩＬ−２３媒介性Ｔｈ１７増殖に及ぼす作用を示す図である。
【図６（２−１）】ＰＧＥ２／ＥＰ４アゴニストがマウスＴｈ１分化に及ぼす作用を示す図である。
【図６（２−２）】ＰＧＥ２／ＥＰ４アゴニストがマウスＴｈ１分化に及ぼす作用を示す図である（ＩＦＮｇ-Ｔｈ１）。
【図７】抗ＰＧＥ２抗体がマウスＴｈ１分化に及ぼす作用を示す図である。抗ＰＧＥ２抗体は、Ｔｈ１分化中に加えられた。
【図８】マウスＴｈ１分化における抗ＰＧＥ２抗体にＥＲ−８１９７６２は相加作用を及ぼさないことを示す図である。
【図９】インビトロでのマウスＩＬ−１７増殖の抑制を示す図である。
【図１０】ＣＩＡにおけるＥＲ−８１９９２４−０１の部分的治療評価を示す図である。
【図１１】ＣＩＡにおけるＥＲ−８１９９２４−０１の完全治療評価を示す図である。
【図１２】完全治療的ＣＩＡ試験からのマウス足のＸ線分析を示す図である。Ｘ線スコアは、骨減少症、骨浸食および新規骨形成の組み合わせの測定値の指標である。
【図１３】ヒトＣＤ１４＋単球を７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を用いてｉｍＤＣに分化させ、外因性ＰＧＥ１−ＯＨ（１〜１００ｎＭ）の存在下もしくは非存在下で、そしてＥＲ−８１９７６２を用いて、および用いずに、ＬＰＳ／Ｒ−８４８を用いて再刺激した。
【図１４】ヒトＣＤ１４＋単球を７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を用いてｉｍＤＣ内に分化させ、外因性ＰＧＥ１−ＯＨ（１〜１００ｎＭ）の存在下もしくは非存在下で、そしてＥＲ−８１９９２４もしくは抗ＰＧＥ２抗体を用いて、および用いずに、ＬＰＳ／Ｒ−８４８を用いて再刺激した。
【図１５】ＥＡＥにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７応答のエックスビボ抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ａ．定義
本明細書で使用する用語「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子」または「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物」または本明細書で使用する用語「調節因子化合物」は、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を抑制する、減少させる、または阻害する化合物を意味する。一部の実施形態では、用語「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子」または本明細書で使用する用語「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物」は、ＩＬ−１７産生ＣＤ４＋細胞の数または活性化ＣＤ４＋細胞内でのＩＬ−１７産生を抑制する、減少させる、または阻害する化合物を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する「エナンチオマー的に純粋」は、ステレオマー的に純粋な化合物、または１つのキラル中心を有する化合物の組成物を意味している。
【００２６】
本明細書で使用する「ステレオマー的に純粋」は、化合物の１つの立体異性体を含み、その化合物の他方の立体異性体を実際的に含んでいない化合物または組成物を意味している。例えば、１つのキラル中心を有する化合物のステレオマー的に純粋な組成物は、実質的に該化合物の反対エナンチオマーを含んでいない。２つのキラル中心を有する化合物のステレオマー的に純粋な組成物は、該化合物の他方のジアステレオマーを実質的に含んでいない。典型的なステレオマー的に純粋な化合物は、約８０重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約２０重量％未満の該化合物の他方の立体異性体、より好ましくは約９０重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約１０重量％未満の該化合物の他方の立体異性体、一層より好ましくは約９５重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約５重量％未満の該化合物の他方の立体異性体、および最も好ましくは約９７重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約３重量％未満の該化合物の他方の立体異性体を含んでいる（例えば、特許文献１）。
【００２７】
本明細書で使用する「安定性」は、本明細書に開示した１つ以上の目的のためにそれらの産生、検出、ならびに好ましくはそれらの回収、精製、および使用を許容する条件に受けさせたときに、実質的に変化しない化合物に関する。一部の実施形態では、安定性化合物または化学的に実行可能な化合物は、少なくとも１週間にわたり、水分またはその他の化学的反応性条件の存在下で、４０℃以下の温度で維持された場合に実質的に変化させられない化合物である。
【００２８】
本明細書で使用する「アルキル」または「アルキル基」は、完全に飽和している直鎖状（すなわち、非分枝状）、分枝状、または環状炭化水素鎖を意味する。所定の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を含有している。さらに他の実施形態では、アルキル基は２〜３個の炭素原子を含有し、そしてさらに他の実施形態では、アルキル基は１〜２個の炭素原子を含有している。所定の実施形態では、用語「アルキル」または「アルキル基」は、炭素環としても公知であるシクロアルキル基を意味する。典型的なＣ１−３アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、およびシクロプロピルが含まれる。
【００２９】
本明細書で使用する「アルケニル」または「アルケニル基」は、１つ以上の二重結合を有する直鎖状（すなわち、非分枝状）、分枝状、または環状炭化水素鎖を意味する。所定の実施形態では、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を含有している。さらに他の実施形態では、アルケニル基は３〜４個の炭素原子を含有し、そしてさらに他の実施形態では、アルケニル基は２〜３個の炭素原子を含有している。また別の態様によると、用語「アルケニル」は、２つの二重結合を有する直鎖状炭化水素を意味し、「ジエン」とも呼ばれる。他の実施形態では、用語「アルケニル」または「アルケニル基」は、シクロアルケニル基を意味する。典型的なＣ２−４アルケニル基には、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリルとも呼ばれる）、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、およびシクロブテニルが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用する「アルコキシ」または「アルキルチオ」は、以前に規定したように、アルキル基を意味し、酸素（「アルコキシ」）または硫黄（「アルキルチオ」）原子を通して主要炭素鎖に結合した。
【００３１】
本明細書で使用する「メチレン」、「エチレン」、および「プロピレン」は、二価成分であるＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を各々意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「エテニレン」、「プロペニレン」、および「ブテニレン」は、二価成分である−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、を意味するが、このとき各エテニレン基、プロペニレン基、およびブテニレン基はｃｉｓまたはｔｒａｎｓ配列にあってよい。所定の実施形態では、エテニレン基、プロペニレン基、またはブテニレン基は、ｔｒａｎｓ配列にあってよい。
【００３３】
「アルキリデン」は、メチレンのモノまたはジアルキル置換によって形成された二価炭化水素基を意味する。所定の実施形態では、アルキリデン基は、１〜６個の炭素原子を有する。他の実施形態では、アルキリデン基は、２〜６、１〜５、２〜４、または１〜３個の炭素原子を有する。そのような基には、プロピリデン（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝）、エチリデン（ＣＨ３ＣＨ＝）、およびイソプロピリデン（ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ＝）などが含まれる。
【００３４】
「アルケニリデン」は、メチレンのモノまたはジアルケニル置換によって形成された１つ以上の二重結合を有する二価炭化水素基を意味する。所定の実施形態では、アルケニリデン基は、２〜６個の炭素原子を有する。他の実施形態では、アルケニリデン基は、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３個の炭素原子を有する。１つの態様によると、アルケニリデンは、２つの二重結合を有する。典型的なアルケニリデン基には、ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ＝、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ＝、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝、およびＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝が含まれる。
【００３５】
「Ｃ１−６アルキルエステルもしくはアミド」は、Ｃ１−６アルキルエステルもしくはＣ１−６アルキルアミドを意味するが、このとき各Ｃ１−６アルキル基は上記に規定したとおりである。そのようなＣ１−６アルキルエステル基は、式（Ｃ１−６アルキル）ＯＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−の基である。そのようなＣ１−６アルキルアミド基は、式（Ｃ１−６アルキル）ＮＨＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−の基である。
【００３６】
「Ｃ２−６アルケニルエステルもしくはアミド」は、Ｃ２−６アルケニルエステルもしくはＣ２−６アルケニルアミドを意味し、ここで、各Ｃ２−６アルケニル基が上記に規定されている。そのようなＣ２−６アルキルエステル基は、式（Ｃ２−６アルケニル）ＯＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ２−６アルケニル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−の基である。そのようなＣ２−６アルケニルアミド基は、式（Ｃ２−６アルケニル）ＮＨＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ２−６アルケニル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−の基である。
【００３７】
「治療」、「治療する」および「治療するステップ」は、本明細書に記載した疾患または障害の発生を逆転させる、軽減する、遅延させる、進行を阻害する、または予防することを意味する。一部の実施形態では、治療は、１つ以上の症状が発生した後に投与されてよい。他の実施形態では、治療は、症状の非存在下で投与されてよい。例えば、治療は、症状の発生前に（例えば、症状の履歴に照らして、および／または遺伝的もしくはその他の感受性因子に照らして）感受性のある個体に投与されてよい。治療はさらにまた、症状が消散した後に、例えば症状の再発を予防または遅延させるために継続されてよい。
【００３８】
本明細書で使用する「患者」または「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、動物被験体、好ましくは哺乳動物被験体（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サルなど）、および特にヒト被験者（男性および女性被験者の両方を含み、さらに新生児、幼児、少年、青年、成人および高齢被験者を含む）を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「医薬上許容される担体」は、それが一緒に調製される化合物の薬理学的活性を破壊しない、非毒性の担体、アジュバント、またはビヒクルを意味する。本発明の組成物中に使用できる医薬上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルには、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、例えばヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、例えばリン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩類または電解質類、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースをベースとする物質、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート類、ワックス類、ポリエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー類、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるがそれらに限定されない。
【００４０】
他に特に指示しない限り、本明細書で使用する化学基または成分を記載するために使用する術語は慣習に従うが、このとき名称は左から右へ読み、分子の残りへの結合点は名称の右側にある。例えば、「（Ｃ１−３アルコキシ）Ｃ１−３アルキル」基は、アルキル末端で分子の残りに結合している。また別の例には、結合点がエチル末端にあるメトキシエチル、および結合点がアミン末端にあるメチルアミノが含まれる。
【００４１】
他に特に指示しない限り、二価基が「−」によって指示される２つの末端結合成分を含む化学式によって記載される場合は、その結合は左から右へ読まれると理解される。
【００４２】
他に特に指示しない限り、本明細書に示した構造はさらにまたその構造の全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的（または立体配座）形、例えば各不斉中心に対するＲおよびＳ立体配置、（Ｚ）および（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）および（Ｅ）配座異性体を含むことが意図されている。このため、本発明の化合物の単一立体化学的異性体ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的（または立体配座）混合物は、本発明の範囲内に含まれる。他に特に指示しない限り、本発明の化合物の全ての互変異性体形は、本発明の範囲内に含まれる。さらに、他に特に指示しない限り、本明細書に記載した構造は、さらにまた１つ以上の同位体が濃縮された原子の存在に関してのみ相違する化合物を含むことも意図されている。例えば、ジューテリウム（重水素）またはトリチウムによる水素の置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素による炭素の置換を除いて、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内に含まれる。そのような化合物は、例えば、生物学的アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
【００４３】
Ｂ．活性化合物／調節因子化合物／ＥＰ４アンタゴニスト
本明細書で記載する本発明の活性化合物（本明細書では「調節因子化合物」および／または「ＥＰ４アンタゴニスト」と呼ぶこともある）は、一般に上記で例示したような、または本発明の特定のクラス、サブクラス、および種によって例示されるような１つ以上の置換基と任意で置換されてよい。一般に、用語「置換（された）」は、所定の構造内の水素ラジカルと特定の置換基のラジカルとの置換を意味する。他に特に指示しない限り、置換基は、その基の各置換可能な位置で置換基を有していてよく、任意の所定の構造内での２つ以上の位置が特定の基より選択される２つ以上の置換基と置換されてよい場合は、該置換基は１つ１つの位置で同一であっても相違していてもよい。
【００４４】
上述したように、本発明は、式Ｉ：
【化９】
のエナンチオマー的に純粋な化合物、もしくは活性な化合物、
またはより詳細には式Ｉａもしくは式Ｉｂ：
【化１０】
（式中、
Ｒ１はＣ１−３アルキルであり；
Ｘは、メチレン、エチレン、プロピレン、エテニレン、プロペニレン、またはブテニレンであり；
Ｒ５は、フェニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、インダゾリル、ピリジニル、イミダゾピリジニル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアジアゾリル、ピリジミジニル、ベンゾピラノニル、チアゾリル、チアジアゾリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、キノキサリニル、もしくはナフチルであり、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、Ｃ１−３アルキルチオ、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、トリフルオロメトキシ、５−メチルイソキサゾリル、ピラゾリル、ベンジルオキシ、アセチル、（シアニル）Ｃ１−３アルキル、（フェニル）Ｃ２−３アルケニルおよびハロよりなる群から独立して選択された０〜５個の置換基で置換されており；
Ｒ８は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、（Ｃ１−３アルコキシ）Ｃ１−３アルキル、（Ｃ１−３アルキルチオ）Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３ヒドロキシアルキル、フェニル、ベンジル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、およびチエニルであり；
（このとき、Ｒ８は、メチル、エチル、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ１−３アルキルチオ、（Ｃ１−３アルコキシ）Ｃ１−３アルキル、（Ｃ１−３アルキルチオ）Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３ヒドロキシアルキル、（Ｃ１−３メルカプトアルキル）フェニル、ベンジル、フリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、およびチエニルより独立して選択される０〜３個の置換基で置換されており）；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの各々は、水素、ヒドロキシル、メトキシ、ベンジルオキシ、フルオロ、クロロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、およびフェノキシより独立して選択され；
またはＲａおよびＲｂ、ならびにＲｂおよびＲｃより選択される１対は、一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−である）
またはその医薬上許容される塩、Ｃ１−６アルキルエステルもしくはアミド、またはＣ２−６アルケニルエステルもしくはアミドを提供する。
【００４５】
上記の一部の実施形態では：
Ｒ１はＣ１−２アルキルである；
Ｒ５は、フェニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、インダゾリル、ピリジニル、イミダゾピリジニル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアジアゾリル、ピリジミジニル、ベンゾピラノニル、チアゾリル、チアジアゾリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、キノキサリニル、もしくはナフチルであり、およびＣ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、Ｃ１−３アルキルチオ、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、トリフルオロメトキシ、５−メチルイソキサゾリル、ピラゾリル、ベンジルオキシ、アセチル、（シアニル）Ｃ１−３アルキル、（フェニル）Ｃ２−３アルケニルおよびハロよりなる群から独立して選択された０〜５個の置換基で置換されている；
Ｒ８は、メチル、エチル、またはプロピルである（このときＲ８は０〜３個のヒドロキシル置換基で置換されている）；
Ｘは、メチレンもしくはエチレンである；および
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの各々は、Ｈおよびメトキシよりなる群から独立して選択される；
またはそれらの医薬上許容される塩、Ｃ１−６アルキルエステルもしくはアミド、またはＣ２−６アルケニルエステルもしくはアミドである。
【００４６】
上記の一部の実施形態では：
Ｒ１は、メチルである；
Ｒ５は、フェニル、ピロリルもしくはピラゾリルであり、それらの各々はメチルで０、１または２回置換される；
Ｒ８は、エチルである；
Ｘは、メチレンである；
ＲａおよびＲｃの各々は、メトキシである；および
Ｒｂは、Ｈである；
またはその医薬上許容される塩である。
【００４７】
上記の特定の実施形態では、本化合物は：
【化１１】
またはそれらの医薬上許容される塩である。
【００４８】
本発明の活性化合物には、上記の医薬上許容される塩類が含まれる。医薬上許容される塩類には、医薬上許容される無機塩および有機酸および塩基に由来する塩類が含まれる。適切な酸性塩類の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が含まれる。例えばシュウ酸などのその他の酸は、それら自体は医薬上許容されないが、本発明の化合物およびそれらの医薬上許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩類の調製において使用することができる。
【００４９】
適切な塩基に由来する塩類には、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウムおよびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩類が含まれる。本発明は、さらにまた本明細書に開示した化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定している。そのような四級化によって、水溶性もしくは油溶性または分散性生成物を入手できる。
【００５０】
Ｃ．医薬調製物
本発明の活性化合物（調節因子化合物および／またはＥＰ４アンタゴニストを含む）は、それらの医薬調製物を提供するために医薬上許容される担体と結合することができる。担体および調製物の特定の選択は、該組成物の予定される特定投与経路に依存する。
【００５１】
本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、経直腸、経鼻腔、経口腔、経膣または埋め込みリザーバ投与などのために適合する可能性がある。好ましくは、本組成物は、経口、腹腔内または静脈内投与される。本発明の組成物の無菌注射剤形は、水性または油性懸濁剤であってよい。これらの懸濁剤は、適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当分野において公知の技術にしたがって調製できる。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用液剤または懸濁剤であってもよい。特に使用できる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、慣習的には溶媒または懸濁化剤として使用される。
【００５２】
この目的で、合成モノ−またはジ−グリセリド類を含む任意のブランドの不揮発性油を使用できる。例えばオレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、例えば、特にそれらのポリオキシエチル化形にあるオリーブ油またはヒマシ油などの天然の医薬上許容される油と同様に、注射剤の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、例えばエマルジョンおよび懸濁液を含む医薬上許容される剤形の調製において一般に使用されるカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤または分散剤をさらに含有していてもよい。例えばＴｗｅｅｎ類、Ｓｐａｎ類および医薬上許容される固体、液体、またはその他の剤形の製造において一般に使用されるその他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ強化剤などの他の一般に使用される界面活性剤類もまた調製のために使用できる。
【００５３】
本発明の医薬上許容される組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含む任意の経口投与に許容される剤形で経口投与することができるが、それらに限定されない。経口使用するための錠剤の場合には、一般に使用される担体には、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。典型的には、例えばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤もまた加えられる。カプセル形での経口投与のために有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが含まれる。経口使用のために水性懸濁剤が必要とされる場合は、有効成分が乳化剤および懸濁化剤と結合される。所望であれば、所定の甘味料、フレーバー剤または着色剤もまた加えることができる。
【００５４】
または、本発明の医薬上許容される組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。これらは、該物質を室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤と混合する工程によって調製することができるので、このため直腸内で融解して薬物を放出する。そのような材料には、カカオ脂、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【００５５】
本発明の医薬上許容される組成物は、特に治療の標的が目、皮膚、または下部消化管の疾患を含む、局所適用によって容易に接近できる領域または器官を含む場合には、局所投与することもできる。適切な局所用調製物は、これらの領域または器官の各々のために容易に調製される。
【００５６】
下部消化管に対する局所適用は、直腸坐剤調製物（上記参照）または適切な浣腸調製物で実行することができる。局所用経皮パッチもまた使用できる。
【００５７】
局所適用のためには、医薬上許容される組成物は、１つ以上の担体中に懸濁化または溶解した活性成分を含有する適切な軟膏剤に調製することができる。本発明の化合物を局所投与するための担体には、鉱油、流動ワセリン（ｌｉｑｕｉｄ ｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ）、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が含まれるがそれらに限定されない。または、医薬上許容される組成物は、１つ以上の医薬上許容される担体中に懸濁化または溶解した活性成分を含有する適切なローション剤またはクリーム剤に調製することができる。適切な担体には、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステル類ロウ、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるがそれらに限定されない。
【００５８】
眼科使用のためには、医薬上許容される組成物は、等張性のｐＨ調整無菌食塩液中の微粉化懸濁剤として、または好ましくは、等張性のｐＨ調整無菌食塩液中の液剤として、例えば塩化ベンジルアルコニウムなどの保存料を含めて、または含めずに調製することができる。または、眼科使用のためには、医薬上許容される組成物は、例えばワセリンなどの軟膏剤で調製することができる。
【００５９】
本発明の医薬上許容される組成物は、さらにまた鼻腔エーロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、医薬調製物の分野において周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な保存料、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来型可溶化剤もしくは分散剤を使用して、食塩液中の液剤として調製することができる。
【００６０】
最も好ましくは、本発明の医薬上許容される組成物は、経口投与のために調製される。
【００６１】
Ｄ．被験体および使用方法
本発明の活性化合物（調節因子化合物および／またはＥＰ４アンタゴニストを含む）は、様々な相違する状態を治療するために患者または被験体に、特に以下に罹患している患者または被験体に投与することができる。
（ａ）関節リウマチ；
（ｂ）多発性硬化症；
（ｃ）全身性エリテマトーデス（例えば、非特許文献１）；
（ｄ）１型糖尿病（例えば、非特許文献２）；
（ｅ）乾癬（例えば、非特許文献３）；および
（ｆ）アテローム硬化症（例えば、非特許文献４）
【００６２】
活性化合物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所的、経直腸、経鼻腔、経口腔、経膣または埋め込みリザーバなどの任意の適切な経路によって被験体に投与されてもよい。本明細書で使用する用語「非経口」には、皮下、静脈下、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。好ましくは、本組成物は、経口、腹腔内または静脈内投与される。
【００６３】
本活性化合物は、被験体に治療有効量、または治療的に有効な量で投与される。単位製剤形にある組成物を製造するために担体材料と結合できる本発明の化合物の量は、治療される宿主、および特定投与経路に依存して変動する。好ましくは、本組成物は、これらの組成物を摂取する患者に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の阻害剤を投与できるように調製されなければならない。所定の実施形態では、本発明の組成物は、０．０１ｍｇ〜５０ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、０．１〜２５ｍｇまたは５ｍｇ〜４０ｍｇの用量が提供される。
【００６４】
任意の特定患者のための特定の用量および治療レジメンは、使用される特定化合物の活性、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与回数、排出速度、併用薬、ならびに治療担当医師の判断および治療される特定疾患の重症度を含む様々な因子に依存することもまた理解されたい。組成物中の本発明の化合物の量は、さらに本組成物中の特定化合物に依存する。
【００６５】
以下では、本明細書に記載した本発明をより完全に理解できるように、実施例を記載する。これらの実施例は単に例示するためであり、決していかなる様式でも本発明を限定すると解釈すべきではないと理解されたい。
【実施例】
【００６６】
［実施例１〜４１］
化合物の合成
Ｂｉｏｔａｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社によって供給されるＥｍｒｙｓ Ｌｉｂｅｒａｔｏｒ機器を用いて、マイクロ波援用反応を実施した。溶媒除去は、Ｂｕｅｃｈｉロータリー・エバポレータまたはＧｅｎｅｖａｃ遠心式エバポレータのどちらかを使用して実施した。分析および分取クロマトグラフィは、酸性、中性、または塩基性条件下のいずれかで、順相または逆相いずれかのＨＰＬＣカラムを用いて、Ｗａｔｅｒｓ ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ機器を用いて実施した。化合物はＥＬＳＤクロマトグラムの面積百分率によって決定して、＞９０％純粋であると推定された。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ３００ＭＨｚ分光計を用いて記録した。
【００６７】
以下では本発明の化合物を調製するための一般的方法および実験について記載する。所定の場合には、例として特定化合物について記載する。しかし、各場合において、一連の本発明の化合物は以下に記載するスキームおよび実験にしたがって調製されたことは理解される。
【００６８】
スキーム１
【化１２】
ＥＲ−８１１１６０．上記のスキーム１に図示したように、水（５０ｍＬ）中のシアン化カリウム（２２．５ｇ、０．３３５Ｍ（モル））を５分間かけて、水（９０ｍＬ）およびメタノール（１１０ｍＬ）中の１−Ｂｏｃ−ピペリドン（３２．４８ｇ、０．１５９８Ｍ）および炭酸アンモニウム（３３．８ｇ、０．３５１Ｍ）の溶液に滴下した。添加の完了直後に、オフホワイトの沈降物が形成し始めた。反応フラスコを密封し、懸濁液を室温で７２時間にわたり攪拌した。結果として生じた浅黄色の沈降物を濾過し、少量の水で洗浄すると、無色の固体としてＥＲ−８１１１６０（３７．１ｇ、８６％）が得られた。
【００６９】
スキーム２
【化１３】
ＥＲ−８１８０３９．上記のスキーム２に図示したように、アセトン（５５５ｍＬ）中のＥＲ−８１１１６０（３０．０ｇ、０．１１１Ｍ）、３，５−ジメトキシベンジルブロミド（３０．９ｇ、０．１３４Ｍ）、および炭酸カリウム（１８．５ｇ、０．１３４Ｍ）の懸濁液を一晩還流させながら加熱した。反応溶液を室温へ冷却し、濾過し、インバキュオで濃縮した。橙色の粗残留物を最小量のＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）中に溶解させた。少量（５０ｍＬ）のヘキサンを加え、生成物を無色の固体として（約２時間かけて）沈殿させ、これを真空濾過によって単離した。フィルターケーキを少量のＭＴＢＥで洗浄し、インバキュオで乾燥させると、無色の固体としてＥＲ−８１８０３９（３９．６ｇ、８５％）が得られた。
【００７０】
スキーム３
【化１４】
ＥＲ−８２３１４３−０１．上記のスキーム３に図示したように、ＥＲ−８１８０３９（２．１５ｇ、０．００５１２Ｍ）を含有する１口丸底フラスコに１，４−ジオキサン（３．８ｍＬ、０．０４９Ｍ）中の４Ｎ ＨＣｌの溶液を緩徐に加えた。出発材料は２０分間かけて緩徐に溶解し、３０分後に無色の沈降物が形成された。次にＭＴＢＥ（３ｍＬ）を加えた。２時間後、反応液を濾過し、ＭＴＢＥを用いて洗浄すると、無色の固体としてＥＲ−８２３１４３−０１（１．８１ｇ、９９％）が得られた。
【００７１】
スキーム４
【化１５】
ＥＲ−８１７０９８：上記のスキーム４に図示したように、窒素雰囲気下で１，２−ジメトキシエタン（０．５ｍＬ、０．００４Ｍ）中のＥＲ−８２３１４３−０１（４１．５ｍｇ、０．０００１１７Ｍ）および４Åモレキュラーシーブの懸濁液に、３，５−ジメトキシベンズアルデヒド（２１．３ｍｇ、０．０００１２８Ｍ）、その後にトリエチルアミン（１６．２μＬ、０．０００１１７Ｍ）を加えた。この反応液を１時間にわたり攪拌した。トリアセトキシホウ化水素ナトリウム（３４．６ｍｇ、０．０００１６３Ｍ）を加え、この反応液を一晩攪拌した。シリカゲル・フラッシュ・クロマトグラフィーは、無色の固体としてＥＲ−８１７０９８（４５．３ｍｇ、８３％）を産生した。
【００７２】
スキーム５
【化１６】
ＥＲ−８１７１１６：上記のスキーム５に図示したように、Ｎ−メチルピロリジノン（１．０ｍＬ、０．０１０Ｍ）中のＥＲ−８１７０９８−００（５０．０ｍｇ、０．０００１０６Ｍ）および１−ブロモ−２−メトキシエタン（１５．６μＬ、０．０００１６０Ｍ）の溶液にテトラヒドロフラン（０．１６ｍＬ）中の１．０Ｍリチウムヘキサメチルジシラジド溶液を加えた。温度を８０℃へ上昇させ、反応混合液を一晩攪拌した。反応混合液を室温に冷却し、水を用いて急冷し、次にＭＴＢＥを用いて数回抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を結合し、水（２×）および食塩液（１×）を用いて洗浄した。有機層は硫酸マグネシウムの上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。フラッシュ・クロマトグラフィーは、無色油としてＥＲ−８１７１１６（３２．２ｍｇ、５８％）を生じさせた。
【００７３】
スキーム６
【化１７】
ＥＲ−８１７１１８：上記のスキーム６に図示したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中のＥＲ−８１７０９８（２．８５ｇ、０．００６０７Ｍ）の溶液に水素化ナトリウム（３６４ｍｇ、０．００９１０Ｍ）、次にヨードエタン（７５８μＬ、０．００９１０Ｍ）を加えた。この反応混合液を一晩攪拌した。水を極めて緩徐に加え、反応混合液はＭＴＢＥを用いて数回抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を結合し、水（２×）および食塩液（１×）を用いて洗浄した。有機層は硫酸マグネシウムの上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。溶離液として酢酸エチルを用いるフラッシュ・クロマトグラフィーは、無色油としてＥＲ−８１７１１８（２．８９ｇ、９６％）を生じさせた。
【００７４】
スキーム７
【化１８】
ＥＲ−８２３９１４：上記のスキーム７に図示したように、−７８℃でテトラヒドロフラン（３０．０ｍＬ、０．３７０Ｍ）中のＥＲ−８２３１４３−０１（５．０３ｇ、０．０１４１Ｍ）の溶液に、エーテル（７１ｍＬ）中の１．０Ｍの臭化アリルマグネシウムを緩徐に加えた。この反応混合液を室温へ加温し、一晩攪拌した。反応混合液を−７８℃へ冷却し、トリフルオロ酢酸（２１．８ｍＬ、０．２８３Ｍ）を滴下して処理し、次に少量の残留物量へインバキュオで濃縮した。残留ＴＦＡを中和するためにトリエチルアミンを加え、次にこの混合物を乾燥するまでインバキュオで濃縮した。残留した赤色油をメタノール（１３８ｍＬ、３．４１Ｍ）中に溶解させ、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３．３４ｇ、０．０１４８Ｍ）、次にトリエチルアミン（２．３８ｍＬ、０．０１６９Ｍ）で処理し、室温で一晩攪拌した。反応混合液をインバキュオで濃縮し、フラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル中の５０％ヘキサン）によって精製すると、無色の固体としてＥＲ−８２３９１４（３．２５ｇ、５２％）が得られた。
【００７５】
スキーム８
【化１９】
ＥＲ−８２３９１５：上記のスキーム８に図示したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２．４ｍＬ、０．１６０Ｍ）中のＥＲ−８２３９１４（２．２０ｇ、０．００４９６Ｍ）の溶液に水素化ナトリウム（２９８ｍｇ、０．００７４４Ｍ）、次にヨードエタン（６０７μＬ、０．００７４４Ｍ）を加えた。反応混合液を一晩攪拌し、水を用いて急冷し、次にＭＴＢＥを用いて数回抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を結合し、水および食塩液を用いて洗浄した。有機層は硫酸マグネシウムの上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。フラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル中の４０％ヘキサン）は、無色の泡としてＥＲ■８２３９１５（０．８０ｇ、３４％）を生じさせた。
【００７６】
スキーム９
【化２０】
ＥＲ−８２３９１７−０１：上記のスキーム９に図示したように、ＥＲ−８２３９１５（７９９．２ｍｇ、０．００１６９５Ｍ）を１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）中の４Ｍ塩化水素の溶液中に溶解させた。反応混合液を一晩攪拌し、次にインバキュオで濃縮すると、橙色の固体としてＥＲ−８２３９１７−０１（０．６９ｇ、定量的）が得られた。
【００７７】
スキーム１０
【化２１】
ＥＲ−８２４１８４およびＥＲ−８２４１８５：上記のスキーム１０に図示したように、アセトニトリル（１ｍＬ）中のＥＲ−８２３９１５（２００ｍｇ）の溶液をＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＳ−Ｈ ＳＦＣカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、粒径：５ミクロン）上に注入し、９５：５のｎ−ヘプタン：ｉ−プロパノールを用いて４０ｍＬ／分の流量で溶出した。溶出フラクションは、２９０ｎｍに設定した波長を用いてＵＶ検出器を使用して検出した。第１溶出フラクションを単離し、インバキュオで回転式蒸発によって濃縮するとＥＲ−８２４１８４が得られた；第２溶出フラクションを単離し、インバキュオで回転式蒸発によって濃縮するとＥＲ−８２４１８５が得られた。
【００７８】
スキーム１１
【化２２】
ＥＲ−８２４１８８−０１：上記のスキーム１１に図示したように、ＥＲ−８２４１８４（２５．３３ｇ、０．０５３７１Ｍ）を１，４−ジオキサン（１３５ｍＬ）中の４Ｍ塩化水素の溶液中に溶解させた。反応混合液を一晩攪拌し、次にインバキュオで濃縮すると、橙色の固体としてＥＲ−８２４１８８−０１（２１．９ｇ、定量的）が得られた。ＥＲ−８２４１８８−０１の単結晶Ｘ線回折分析は、立体中心の絶対配置がスキーム１１に図示したようにＳであることを証明した。
【００７９】
スキーム１２
【化２３】
ＥＲ−８２４２８０−０１：上記のスキーム１２に図示したように、ＥＲ−８２４１８５（４５７．２ｍｇ、０．０００９６９５Ｍ）を１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中の４Ｍ塩化水素の溶液中に溶解させた。反応混合液を一晩攪拌し、次にインバキュオで濃縮すると、橙色の固体としてＥＲ−８２４２８０−０１（３８３．２ｍｇ、９７％）が得られた。ＥＲ−８２４１８８−０１のＭｏｓｈｅｒアミド誘導体の単結晶Ｘ線回折分析は、立体中心の絶対配置がスキーム１１に図示したようにＲであることを証明した。
【００８０】
スキーム１３
【化２４】
ＥＲ−８１９９２４：上記のスキーム１３に図示したように、ＥＲ−８２４１８８−０１（６２．４ｍｇ、０．０００１５３Ｍ）およびＮ−メチルピロール−２−カルバルデヒド（０．０００２２９Ｍ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６２ｍＬ）中に溶解／懸濁させた。３０分間にわたり攪拌した後、トリアセトキシホウ化水素ナトリウム（４７．８ｍｇ、０．０００２１４Ｍ）を加えた。反応混合液を一晩攪拌し、次に逆相クロマトグラフィによって精製すると、油としてＥＲ−８１９９２４（７１．１ｍｇ、８３．４％）が得られた。
【００８１】
スキーム１４
【化２５】
ＥＲ−８１９９２５：上記のスキーム１４に図示したように、ＥＲ−８２４２８０−０１（５９．５ｍｇ、０．０００１４６Ｍ）およびＮ−メチルピロール−２−カルバルデヒド（０．０００２１９Ｍ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）中に溶解／懸濁させた。３０分間にわたり攪拌した後、トリアセトキシホウ化水素ナトリウム（４５．６ｍｇ、０．０００２０４Ｍ）を加えた。反応混合液を一晩攪拌し、次に逆相クロマトグラフィによって精製すると、油としてＥＲ−８１９９２５（５１．９ｍｇ、７６．６％）が得られた。
【００８２】
スキーム１５
【化２６】
ＥＲ−８１９７６２：上記のスキーム１５に図示したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中のＥＲ−８２４１８８−０１（５．７ｇ、０．０１４０Ｍ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（４．４ｍＬ、０．０２９Ｍ）および３，５−ジメチルベンジルブロミド（４．７ｇ、０．０２４Ｍ）の溶液を９７℃で一晩加熱した。水系後処理およびフラッシュ・クロマトグラフィーによる精製によって、無色の固体としてＥＲ−８１９７６２（４．８６ｇ、７１％）が得られた。
【００８３】
スキーム１６
【化２７】
ＥＲ−８１９７６２−０１：上記のスキーム１６に図示したように、水（１１ｍＬ）中のＥＲ−８１９７６２（４．７７ｇ、０．００９７４Ｍ）、アセトニトリル（１０ｍＬ）および１Ｍ ＨＣｌの溶液を室温でおよそ５分間攪拌した。この溶液を濃縮すると、凍結乾燥後の無色の結晶固体としてＥＲ−８１９７６２−０１（５．１ｇ、定量的）が得られた。ＥＲ−８１９７６２−０１の単結晶Ｘ線回折分析は、立体中心の絶対配置がスキーム１６に図示したようにＳであることを証明した。
【００８４】
スキーム１７
【化２８】
ＥＲ−８１９７６３：上記のスキーム１７に図示したように、Ｎ−メチルピロリジノン（６６９ｍＬ）中のＥＲ−８２４２８０−０１（６６．９ｇ、０．１６４０Ｍ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（５４ｍＬ、０．３６１Ｍ）および３，５−ジメチルベンジルクロリド（４２．４ｇ、０．２１３Ｍ）の溶液を２時間にわたり７２℃で加熱した。冷却後、水を加えると、所望の生成物が沈降した。濾過および真空下での乾燥は、無色の固体としてＥＲ−８１９７６３（７４．４ｇ、９２％）を生じさせた。
【００８５】
スキーム１８
【化２９】
ＥＲ−８２４１０２：上記のスキーム１８に図示したように、室温にあるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）中のＥＲ−８２３１４３−０１（４．００ｇ、０．０１１２Ｍ）の溶液にα−ブロモメシチレン（３．１３ｇ、０．０１５７Ｍ）、次にＤＢＵ（４．３７ｍＬ、０．０２９２Ｍ）を加えた。１時間にわたり攪拌した後、反応液を半飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷し、酢酸エチルを用いて希釈し、１時間攪拌すると２つの透明層が得られた。有機層を分離し、水層は酢酸エチルにより抽出した（２×）。結合抽出物はＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。ＭＴＢＥからの結晶化により、無色の固体としてＥＲ−８２４１０２（４．３０ｇ、８７％）が得られた。
【００８６】
スキーム１９
【化３０】
ＥＲ−８１９９２９：上記のスキーム１９に図示したように、−６５℃のテトラヒドロフラン（３５ｍＬ）中のＥＲ−８２４１０２（３．７２ｇ、０．００８５Ｍ）の溶液に、−５０℃未満の内部温度を維持しながら１０分間かけてエーテル（２５．５ｍＬ、０．０２５５Ｍ）中の１．０Ｍ臭化アリルマグネシウムを加えた。反応混合液を０℃へ加温させた。０℃で３時間置いた後、反応液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷し、酢酸エチルおよび水を用いて希釈し、１０分間攪拌すると２つの透明層が得られた。有機層を分離し、水層は酢酸エチルにより抽出した。結合抽出物を水、食塩液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮すると無色の固体として粗生成物のＥＲ−８１９９２９（４．１５ｇ、定量的）が得られたので、これをそれ以上精製せずに次の工程に使用した。
【００８７】
スキーム２０
【化３１】
ＥＲ−８１９９３０：上記のスキーム２０に図示したように、トリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）中のＥＲ−８１９９２９（３７ｍｇ、０．００００７７Ｍ）の溶液を室温で１６時間にわたり攪拌した。暗赤褐色の反応混合液をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ、注意：ガス発生）を用いて中和した。２層の混合液を１０分間攪拌すると、ほぼ無色の２つの透明層が得られた。２つの有機層を分離し、水層はＥｔＯＡｃで抽出した。結合有機抽出物はＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。１：１ヘプタン−ＥｔＯＡｃ、１：３ヘプタン−ＥｔＯＡｃ、１００％ＥｔＯＡｃを用いて溶出させるフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製すると、無色の固体としてＥＲ−８１９９３０（２６ｍｇ、７３％）が得られた。
【００８８】
スキーム２１
【化３２】
ＥＲ−８２０００６およびＥＲ−８２０００７：上記のスキーム２１に図示したように、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＥＲ−８１９９３０（１１０ｍｇ、０．０００２３８Ｍ）および臭化メタリル（７２μＬ、０．０００７１５Ｍ）の溶液にテトラヒドロフラン中の１．０Ｍリチウムヘキサメチルジシラジド溶液（０．５２ｍＬ、０．０００５２Ｍ）を加えた。室温で１８時間攪拌した後、反応混合液をＭＴＢＥで希釈し、半飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷した。水層を分離し、ＭＴＢＥで抽出した。結合抽出物はＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。３：２ヘプタン−ＥｔＯＡｃ、１：１ヘプタン−ＥｔＯＡｃを用いて溶出させるフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製すると、無色油としてラセミ生成物（６８ｍｇ、５５％）が得られた。ラセミ生成物（５５ｍｇ）は、ヘプタン−イソプロパノール（９：１）を用いて溶出させるＣｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳカラム上でのキラルＨＰＬＣにかけると、第１溶出エナンチオマーであるＥＲ−８２０００６（２１ｍｇ、３８％、［ａ］Ｄ＝＋８３．７°（ｃ＝０．３５、ＣＨＣｌ３）および第２溶出エナンチオマーであるＥＲ−８２０００７（２３ｍｇ、４２％、［ａ］Ｄ＝−７４．２°（ｃ＝０．３８、ＣＨＣｌ３）が得られた。絶対立体化学は、エナンチオマーのＥＲ−８１９７６２／ＥＲ−８１９７６３対を用いて旋光度およびキラルＨＰＬＣ保持時間における共通点に基づいて暫定的に指定した。
【００８９】
スキーム２２
【化３３】
ＥＲ−８１９７８６およびＥＲ−８１９７８７：上記のスキーム２２に図示したように、攪拌棒を装備した５ｍＬマイクロ波反応器バイアルに、ＥＲ−８１９９３０（１１０ｍｇ、０．０００２３８Ｍ）、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）、２−（２−ブロモエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（１０８μＬ、０．０００７１５Ｍ）およびテトラヒドロフラン（５２０μＬ、０．０００５２Ｍ）中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジドを装填した。反応器バイアルを、２００℃で１５分間にわたりマイクロ波反応器にかけた。さらに２−（２−ブロモメトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（１０８μＬ、０．０００７１５Ｍ）およびテトラヒドロフラン中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジド（５２０μＬ、０．０００５２Ｍ）を加え、反応混合液をマイクロ波照射によってさらに１５分間、２００℃で加熱した。分取的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、無色のガラス質の油としてラセミ生成物（２５ｍｇ、２１％）が得られた。ラセミ生成物（１７ｍｇ）は、ヘプタン−イソプロパノール（９：１）を用いて溶出させるＣｈｉｒａｌｐａｃ ＡＳカラム上でのキラルＨＰＬＣにかけると、第１溶出エナンチオマーであるＥＲ−８１９７８６（７．２ｍｇ、４２％、［α］Ｄ＝＋７２．０°（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ３）および第２溶出エナンチオマーであるＥＲ−８１９７８７（７．５ｍｇ、４４％、［α］Ｄ＝−７３．０°（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ３）が得られた。絶対立体化学は、エナンチオマーのＥＲ−８１９７６２／ＥＲ−８１９７６３対を用いて旋光度およびキラルＨＰＬＣ保持時間における共通点に基づいて暫定的に指定した。
【００９０】
スキーム２３
【化３４】
ＥＲ−８１９９９３およびＥＲ−８１９９９４：上記のスキーム２３に図示したように、攪拌棒を装備した５ｍＬマイクロ波反応器バイアルに、ＥＲ−８１９９３０（１１０ｍｇ、０．０００２３８Ｍ）、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）、（（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル４−メチルベンゼンスルホネート（２０５ｍｇ、０．０００７１５ｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（５２０μＬ、０．０００５２Ｍ）中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジドを装填した。反応器バイアルを、２００℃で１５分間にわたりマイクロ波照射によって加熱した。さらに（（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル４−メチルベンゼンスルホネート（１５７ｍｇ、０．０００５４８Ｍ）およびテトラヒドロフラン中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジド（４７７μＬ、０．０００４７７Ｍ）を加え、反応混合液をマイクロ波照射によってさらに１５分間、２００℃で加熱した。分取的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、ジアステレオマーの１：１混合物としてアセトニドであるＥＲ−８１９９９３（４０ｍｇ、３０％）およびジオール材料（１８ｍｇ、１４％）が得られた。ヘプタン−イソプロパノール（９：１）を用いて溶出させるＣｈｉｒａｌｐａｃ ＡＳカラム上でのキラルＨＰＬＣによるジアステレオマージオールの分離によって、第１溶出ジアステレオマーであるＥＲ−８１９７８８（５．０ｍｇ）および第２溶出ジアステレオマーであるＥＲ−８１９７８９（５．２ｍｇ）が得られた。絶対立体化学は、エナンチオマーのＥＲ−８１９７６２／ＥＲ−８１９７６３対を用いてキラルＨＰＬＣ保持時間における共通点に基づいて暫定的に指定した。
【００９１】
スキーム２４
【化３５】
ＥＲ−８１９９０：上記のスキーム２４に図示したように、塩化メチレン（５００μＬ）中のＥＲ−８２４２２０−００（５１．８ｍｇ、０．０００１３９Ｍ）、トリエチルアミン（９７μＬ、０．０００７０Ｍ）、４−ジメチルアミノピリジン（３．４ｍｇ、０．００００２８Ｍ）および（Ｒ）−（−）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニルアセチルクロリド（０．０５２ｍＬ、０．０００２８Ｍ）の溶液を室温で５時間にわたり攪拌した。フラッシュ・クロマトグラフィーによる精製後に、酢酸エチル／ヘプタン／ペンタンから結晶化させると、結晶としてＥＲ−８１９９９０（４９．２ｍｇ、６０％）が得られた。
【００９２】
以下のセクションおよび以下の表１〜２に例示するが上記で明確には図示していない化合物は、スキーム１３および／またはスキーム１５に一致する一般方法を使用して合成できる。塩酸塩形で例示した化合物については、それらは対応する遊離塩基にスキーム１６に記載した一般条件を受けさせることによって調製することができる。
【００９３】
表１．式Ｉの典型的化合物についての分析データ
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【表１Ｄ】
【表１Ｅ】
【表１Ｆ】
【表１Ｇ】
【表１Ｈ】
【表１Ｉ】
【表１Ｊ】
【表１Ｋ】
【表１Ｌ】
【表１Ｍ】
【表１Ｎ】
【表１Ｏ】
【表１Ｐ】
【表１Ｑ】
【表１Ｒ】
【表１Ｓ】
【表１Ｔ】
【００９４】
分析方法：
方法Ａ１
溶媒Ａ：水中の０．２％ Ｅｔ３Ｎ
溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．２％ Ｅｔ３Ｎ
流量：２．０ｍＬ／分
線形勾配：
【表１Ｕ】
方法Ｃ１
移動相：エタノール中の０．１％ Ｅｔ２ＮＨ
流量：１．０ｍＬ／分
均一濃度
【００９５】
［実施例４２〜１２６］
インビトロ生物学的活性
ＨＥＫＴ−ｂｅｔ−ｌｕｃアッセイ：本アッセイは、ルシフェラーゼレポーターを駆動するヒトＴ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｏｘ応答エレメントを発現する遺伝子組換えＨＥＫ細胞内のＴ−ｂｅｔ依存性レポーター（ルシフェラーゼ）活性を測定する。ＨＥＫＴ−ｂｅｔ細胞は２×１０４／ウエルで９６ウエルプレート内で平板培養し、化合物を２４時間にわたり細胞培養中へ加えた。ルシフェラーゼ活性は、５０μＬのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えることによって測定し、サンプルをＶｉｃｔｏｒ Ｖリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で読み取った。化合物の活性は、化合物処理サンプルを非化合物処理ビヒクル対照と比較することによって決定した。ＩＣ５０値は、試験化合物の非存在下でのルシフェラーゼの量に対応する最大値および最大阻害で得られた試験化合物値に対応する最小値を利用して計算した。
【００９６】
正規化ＨＥＫＴ−ｂｅｔ ＩＣ５０値の決定：化合物は、マイクロタイタープレート内でアッセイした。各プレートは、ＥＲ−８１９５４４である参照化合物を含んでいた。特定化合物についての非正規化ＩＣ５０値を同一マイクロタイタープレート内で参照化合物について決定したＩＣ５０値で割ると、相対効力値が得られた。次に相対効力値に参照化合物の確定効力を掛けると、正規化ＨＥＫＴ−ｂｅｔ ＩＣ５０値が得られた。本アッセイでは、ＥＲ−８１９５４４の確定効力は０．０３５ｍＭであった。本明細書に提供したＩＣ５０値は、正規化法を使用して入手した。
【００９７】
本発明の典型的な化合物は、上記に記載したＨＥＫＴ−ｂｅｔ−ｌｕｃアッセイにおいて上述した方法にしたがってアッセイした。以下の表２は、上記に記載した正規化ＨＥＫＴ−ｂｅｔ−ｌｕｃアッセイによって決定した指示量（μＭ）までのＩＣ５０を有する本発明の典型的な化合物を記載している。
【００９８】
表２．典型的な化合物のＩＣ５０値
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【表２Ｆ】
【表２Ｇ】
【表２Ｈ】
【表２Ｉ】
【表２Ｊ】
【表２Ｋ】
【表２Ｌ】
【表２Ｍ】
【表２Ｎ】
【表２Ｏ】
【表２Ｐ】
【表２Ｑ】
【表２Ｒ】
【表２Ｓ】
【表２Ｔ】
【表２Ｕ】
【表２Ｖ】
【表２Ｗ】
【表２Ｘ】
【表２Ｙ】
【表２Ｚ】
【００９９】
［実施例１２６］
インビボ生物学的活性：能動免疫
ＣＩＡにおける関節炎発生の抑制。ＤＢＡ１／Ｊマウスを第０日にｂＣＩＩ／ＣＦＡで免疫し、その後第２１日にｂＣＩＩ／ＩＦＡで追加免疫した。関節炎の発生を試験経過にわたって監視した。関節炎のスコアは、以下の通りである：０＝正常な足、スコア１＝１〜２本の指が炎症を起こしている足、スコア２＝３本または１〜２本の指＋手関節または足関節が炎症を起こしている、スコア３＝手＋３本以上の指が炎症を起こしている；およびスコア４＝多数の指（３〜４）＋重大な手関節または足関節の炎症。
【０１００】
（Ａ）化合物の部分的治療評価。活性化合物は、コラーゲンＩＩに対する抗体の誘導後第２０日から、しかし疾患発生の前に指示した用量で１日１回の経口投与によって与えた。（Ｂ）化合物の完全治療評価。活性化合物は、疾患が発生した後（第２免疫後第７日から）投与した。（Ｃ）完全治療ＣＩＡ試験からのマウス足についてのＸ線分析。Ｘ線スコアは、骨減少症、骨浸食および新規骨形成の組み合わせの測定値の指標である。（Ｄ）代表的なＸ線写真。
【０１０１】
データは、以下の表３に示した。一般に、これらのデータは好都合にこのモデルにおけるメトトレキセートの活性を比較する。
【０１０２】
［実施例１２７］
インビボ生物学的活性：受動免疫
ＣＡＩＡにおける関節炎発生の抑制。ＢＡＬＢ／ｃマウスに第０日に１ｍｇの抗タイプＩＩコラーゲン抗体をｉ．ｖ．（静脈内）注射し、３日後に２５μｇのＬＰＳを活性化合物とともにｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、メトトレキセート（ＭＴＸ）は第０日〜第７日にわたり１日１回ＰＯ投与した。関節炎スコアおよび体重は、試験の全経過にわたって監視した。
【０１０３】
データは、以下の表３に示した。一般に、これらのデータは好都合にもこのモデルにおけるにおいて特に活性ではないメトトレキセートと比較する。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
［実施例１２８〜１３４］
材料および方法
マウスおよび試薬。ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＯ１１．１０マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。マウスＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびヒトＧＭ−ＣＳＦは、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ヒトＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社からである。抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ２８（クローン３７．５１）、抗ＩＬ−４（クローン１１Ｂ１１）、抗ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１２）およびＰＥ−抗マウスＩＬ−１７（クローンＴＣ１１−１８Ｈ１０）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入した。抗ＴＣＲ（クローンＨ５７−５９７）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。ＯＶＡペプチドおよびマイトマイシンＣは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。ＰＧＥ２、ＰＧＥ１−アルコールおよび抗ＰＧＥ２は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。ＬＰＳおよびＲ−８４８は、ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ社からである。ＣＤ１４＋細胞単離キットは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社からである。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社またはＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からである。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキットはＰＩＥＲＣＥ社からである；ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社からである；ＩＬ−２３ ＥＬＩＳＡキットは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社からである。Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ試薬は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社からである。Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａ社からである。
【０１０６】
放射性リガンドＥＰ４結合。放射性リガンドＥＰ４結合アッセイは、ＥＰ４発現性膜標本からの放射標識ＰＧＥ２の置換を測定する。放射性リガンドＥＰ４結合アッセイキットは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入し、このアッセイは、製造業者の取扱説明書にしたがって実施した。
【０１０７】
ＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーターアッセイ。内因性ＥＰ４を発現するＳＥ３０２細胞は、一晩にわたりＥＲ−８１９７６２の存在下または非存在下でＰＧＥ２を用いて刺激し、ＰＬＡＰ活性を測定した。
【０１０８】
インビトロＴ細胞アッセイ。天然ＣＤ４＋Ｔ細胞は、製造業者によって記載されたようにＲｏｂｏｓｅｐによってＢＡＬＢ／ｃまたはＤＯ１１．１０マウスのいずれかの脾臓から精製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスについては、１×１０５のＣＤ４＋Ｔ細胞を、中性条件下（１μｇ／ｍＬの平板結合抗ＣＤ３＋１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８＋１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−２）またはＴｈ１促進条件下（中性＋５ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−１２＋１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−４）またはＴｈ２分化条件下（中性＋１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−４＋１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−４）のいずれかで、１０％の正常ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）または活性炭処理ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）（外因性ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストが培養に加えられた場合）のいずれかを含有する１００μＬの完全ＲＰＭＩ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中で９６７ウエルプレート内で３〜６日間培養した。培養上清中のＩＦＮγまたはＩＬ−４はＥＬＩＳＡによって検出した。細胞ペレットを使用して、製造業者の取扱説明書にしたがってＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬のいずれかを用いて細胞増殖を測定した。ＤＯ１１．１０マウスに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマイトマイシンＣ処置脾臓細胞を抗原提示細胞として使用し、５：１の比率（１００μＬ培地中の５×１０５のマイトマイシンＣ処置脾臓細胞＋１００μＬ培地中の１×１０５ ＣＤ４＋Ｔ細胞）で天然ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、上述したように中性、Ｔｈ１またはＴｈ２促進条件下のいずれかでＯＶＡペプチド（０．３ｎｇ／ｍＬ）を用いて刺激した。ＥＰ４アゴニスト、アンタゴニストまたは抗ＰＧＥ２抗体をＴｈ細胞分化中に加えた。
【０１０９】
ＥＰ４アゴニスト／アンタゴニストがＩＬ−１７産生に及ぼす作用を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の全ＣＤ４＋Ｔ細胞を３〜５日間にわたり指示した濃度のＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＥＰ４アゴニスト／アンタゴニストの存在下または非存在下において平板結合抗ＣＤ３（２μｇ／ｍＬ）＋可溶性抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ）により活性化した。培養上清をＩＬ−１７ ＥＬＩＳＡによって分析し、細胞ペレットを使用してＣｅｌｌＴｉｔｅ−Ｇｌｏ試薬を用いた細胞増殖を測定した。
【０１１０】
ＩＬ−２３誘導性Ｔｈ１７増殖。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、５日間にわたり、ＩＬ−２３（３０ｎｇ／ｍＬ）を伴う、または伴わない、抗ＴＣＲ（１μｇ／ｍＬ平板結合）および抗Ｉ−ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ、可溶性）を用いて活性化した。ＩＬ−１７産生細胞は、製造業者（ＢＤ社）によって記載されたようにＩＬ−１７細胞内染色によって分析した。
【０１１１】
インビトロヒト単球由来ＤＣアッセイ。ＣＤ１４＋細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ１４マイクロビーズを用いてヒトＰＢＭＣから精製し、１０％木炭処理したＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ培地中でヒトＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍＬ）＋ヒトＩＬ−４（５００Ｕ／ｍＬ）を用いて８日間にわたり分化させた。未結合ｉｍＤＣ（未成熟樹状細胞）は、２４時間にわたり指示した濃度にあるＥＰ４アゴニスト／アンタゴニストまたは抗ＰＧＥ２抗体の添加を伴って、または伴わずに、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｒ−８４８（２．５μｇ／ｍＬ）を用いて刺激した。培養上清中のＩＬ−２３は、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって測定した。
【０１１２】
コラーゲン誘導性関節炎モデル。雄性ＤＢＡ／１マウスをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中で乳化した１５０μｇのウシＩＩ型コラーゲンを含有する、０．１ｍＬエマルジョンを用いて尾の基部で皮内免疫した。初回免疫の３週間後、全マウスにＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント中に乳化させたウシＩＩ型コラーゲンを用いて追加免疫した。各マウスの足における関節炎の症状の重症度は、公知の技術にしたがったＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．の方法によって判定した。
【０１１３】
ＰＬＰ誘導性ＥＡＥモデル。ＳＪＬマウスに、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント中に乳化させた３５μｇのＰＬＰ１３９−１５１を含有する０．１ｍＬエマルジョンを皮下注射した。１×１０９／２００μＬの百日咳菌を各マウスへ第０日および第２日に注射した。ＥＡＥスコアは、公知の技術にしたがって評価した。
【０１１４】
エックスビボＬＮまたは脾臓細胞試験。単一懸濁細胞は、ｂＣＩＩを用いた一次免疫の後第１５日マウスまたはＥＡＥ試験終了時に排液ＬＮまたは脾臓から調製し、ｂＣＩＩ（５０μｇ／ｍＬ）、ＭＯＧ３５−５５（１２．５μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ／培地のいずれかを用いて４８〜７２時間にわたり刺激した。培養上清中のサイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって分析し、細胞増殖はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬のいずれかによって測定した。「ミックス・アンド・マッチ（ｍｉｘ ＆ ｍａｔｃｈ）」リンパ球反応のためには、排液ＬＮ由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を１：５の比率でＡＰＣ（マイトマイシンＣ処理全ＬＮ細胞）と共培養し、上述したように刺激して分析した。
【０１１５】
［実施例１２８］
選択的ＥＰ４受容体アンタゴニストとして同定されたＥＲ−８１９９２４
ＥＲ−８１９９２４−０１は、競合的放射性リガンド結合アッセイ（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ社による）においてＥＰ４へ選択的に結合するが他のＥＰ／プロスタノイド／ロイコトリエン受容体には結合しないことが見いだされた（表４および図１）。さらに、１μＭでのＥＲ−８１９９２４−０１は、ＦＬＩＰＲ機能的スクリーンにおいてＥＰ４受容体に対してのみ活性を示し、他の１３２ＧＰＣＲのいずれに対しても活性を示さなかった（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社が外部委託したデータ）（表５）。ＥＲ−８１９９２４−０１はさらに、ＰＧＥ２に対する強力な阻害活性がＳＥ３０２細胞においてＣＲＥ−ＰＬＡＰ受容体活性を誘導することも証明した（２８ｎＭのＩＣ５０値を伴う）（図２）。
【０１１６】
表４：プロスタノイド／ロイコトリエン受容体に対するＥＲ−８１９９２４−０１の競合的リガンド結合アッセイ
【表４】
【０１１７】
表５：１３２ ＧＰＣＲに対するＥＲ−８１９９２４−０１のＦＬＩＰＲスクリーン。アゴニストモードおよびアンタゴニストモードの両方を測定したが、表にはアンタゴニスト活性だけを示した。
【表５】
【０１１８】
［実施例１２９］
活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞中でのＩＬ−１７産生にＰＧＥ２／ＥＰ４が及ぼす作用
ＥＰ４がさらにＴｈ１７応答においても役割を果たすかどうかを調査するために、ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストによるＥＰ４活性化が活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞内でのＩＬ−１７産生に及ぼす作用を試験した。全ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３〜５日間にわたり、ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストＰＧＥ１−ＯＨ（０．１ｎＭ〜１，０００ｎＭ）の存在下または非存在下でＩＬ−２３を伴う、または伴わずに、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激した。培養上清中のＩＬ−１７はＥＬＩＳＡによって測定し、細胞増殖はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏによって測定した。結果は、ＥＰ４アゴニストが抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞中の細胞増殖を抑制しながら、ＩＬ−１７産生を増強することを証明した（図３）。同様に高度に選択的なＥＰ４アンタゴニストであるまた別のＢＯＡＴ化合物であるＥＲ−８１９７６２−０１は、この系における活性を抑制した（図４）。さらに、抗ＰＧＥ２抗体は、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−２３の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いて活性化されるとＩＬ−１７産生細胞の数を減少させた（図５）。これらをまとめると、これらの結果は、ＥＰ４拮抗作用がＴｈ１７応答を抑制できるという仮説を裏付けた。
【０１１９】
［実施例１３０］
マウスＴｈ１分化においてＰＧＥ２／ＥＰ４が果たす役割
ＥＰ４活性化がＴｈ１分化において役割を果たすかどうかを調査するために、ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストおよび抗ＰＧＥ２抗体が及ぼす作用をマウスＴｈ１分化アッセイにおいて試験した。天然ＣＤ４Ｔ細胞は、３日間にわたりＴｈ１促進剤を用いて分化した。培養上清中のＴｈ１サイトカインＩＦＮγはＥＬＩＳＡによって測定した。細胞増殖は、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって測定した。ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストＰＧＥ１−ＯＨをＴｈ１分化中に加えた。結果は、ＰＧＥ２およびＥＰ４アゴニスト（ＰＧＥ１−ＯＨ）はＴｈ１分化を強化するが（図６）、他方ＰＧＥ２に対する抗体が分化Ｔｈ１細胞におけるＩＦＮ−γ産生を部分的に抑制することを証明したが（図７）、これはＰＧＥ２／ＥＰ４がＴｈ１分化を調節することにある役割を果たすことを示している。さらに、ＥＲ−８１９７６２は抗ＰＧＥ２抗体に活性を加えなかったが（図８）、これはＥＲ−８１９７６２によるＴｈ１分化の抑制が主としてＥＰ４に対する活性に起因することを示唆していた。
【０１２０】
［実施例１３１］
インビトロでのマウスＩＬ−１７増殖の抑制
ＥＲ−８１９９２４−０１がＩＬ−２３誘導性Ｔｈ１７増殖に及ぼす作用をインビトロで試験した（図９）。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、５日間にわたりＥＲ−８１９９２４−０１または抗ＰＧＥ２抗体の存在下または非存在下において抗ＴＣＲ／抗ＣＤ２８モノクロール抗体およびＩＬ−２３（３０ｎｇ／ｍＬ）とともに培養した。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞は、細胞内染色のＦＡＣＳによって分析した。ＥＲ−８１９９２４−０１は、約１０〜１００ｎＭのＩＣ５０値を備えるＩＬ−２３誘導性Ｔｈ１７産生細胞の数を減少させた。
【０１２１】
［実施例１３２］
ＣＩＡにおける関節炎発生の抑制
ＥＲ−８１９９２４−０１の抗関節炎作用を評価するために、マウスＣＩＡモデルにおいて幾つかの試験を実施した。最初にＥＲ−８１９９２４−０１は、化合物が第２０日から毎日経口投与される（すなわち、病原性抗ＩＩ型コラーゲン抗体の誘導後で、関節炎発生の前に）部分治療投与レジメンにおいて試験した。関節炎スコア（炎症を起こした足の炎症反応指数として測定した）および体重を２週間にわたって監視した。部分治療投与条件下で、ＥＲ−８１９９２４−０１は、約１０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を備えて関節炎の発生を効果的に抑制した（図１０）。本発明者らは、さらに化合物が疾患の誘導後に投与される完全治療投与レジメンにおいてＥＲ−８１９９２４−０１について試験した。完全治療投与条件下で、ＥＲ−８１９９２４−０１は、約１０ｍｇ／ｋｇの用量でさらに関節炎の発生を効果的に防止した（図１１）。さらに、ＥＲ−８１９９２４−０１は、別個の試験において３０ｍｇ／ｋｇの用量でＸ線スコアを有意に改善した（図１２）。
【０１２２】
［実施例１３３］
活性化ヒトＭｏＤＣ（単球由来樹状細胞）における最適なＩＬ−２３産生のためには、ＰＧＥ２／ＥＰ４シグナリングが必要とされ、化合物はこの活性を抑制する
ヒトＣＤ１４＋単球を７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を用いてｉｍＤＣに分化させ、外因性ＰＧＥ１−ＯＨ（１〜１００ｎＭ）の存在下または非存在下において、そしてＥＲ−８１９７６２（図１３）もしくはＥＲ−８１９９２４または抗ＰＧＥ２抗体（図１４）を用いて、または用いずに、ＬＰＳ／Ｒ−８４８を用いて２４時間にわたり再刺激した。培養上清中のＩＬ−２３分泌は、ＥＬＩＳＡによって測定した。表６は、ヒトＭｏＤＣ ＩＬ−２３分泌アッセイにおける代表的化合物のＩＣ５０値を示している。
【０１２３】
表６：活性化ヒトＭｏＤＣにおけるＰＧＥ１−ＯＨ（１０ｎＭ）強化ＩＬ−２３産生を阻害する際の代表的な化合物のＩＣ５０値。
【表６】
【０１２４】
［実施例１３４］
ＥＡＥにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７反応のエックスビボ抑制
排液リンパ節は、治療的ＭＯＧ ＥＡＥ試験の終了時にマウスから採取した。単一細胞懸濁液を調製し、４８時間にわたりＭＯＧまたは培地のいずれかを用いて刺激した。上清は、Ｓｅａｒｃｈ Ｌｉｇｈｔ複数サイトカイン分析（ＰＩＥＲＣＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のために収集した。データは、図１５に示した。
【０１２５】
本発明の多数の実施形態について記載してきたが、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供するために基本的実施例を変化させられ得ることは明白である。このため本発明の範囲は、例として提示してきた特定実施形態によってではなく添付の特許請求項によって規定されることは理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明にかかる方法は、関節リウマチや多発性硬化症の治療に有効である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチや多発性硬化症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原に遭遇すると、天然ＣＤ４＋ヘルパーＴ前駆（Ｔｈｐ）細胞は、２つの別個のサブセットである１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）および２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）に分化する。これらの分化したＴｈ細胞は、それらの別個の機能能力および固有のサイトカインプロファイルの両方によって規定される。詳細には、Ｔｈ１細胞は、インターフェロン−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−βを産生するが、これらはマクロファージを活性化し、細胞媒介性免疫および食細胞依存性保護応答に関与する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生することが公知であるが、これらは強力な抗体産生、好酸球活性化、および数種のマクロファージ機能の阻害に対して役割を果たすので、食細胞非依存性保護応答を提供する。したがって、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、様々な免疫病理学的応答と関連している。
【０００３】
さらに、各タイプのＴｈ細胞の発生は、様々なサイトカイン経路によって媒介される。詳細には、ＩＬ−４はＴｈ２分化を促進し、同時にＴｈ１発生を遮断することが証明されている。対照的に、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞の発生に対して重大なサイトカインである。したがって、これらのサイトカイン自体がＴｈ分極を駆動し、Ｔｈ１とＴｈ２との間の平衡を維持する正および負のフィードバック系を形成する。ＰＥＧ２は、さらにまたインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生およびＴ細胞増殖の抑制によってＴＨ１応答を調節することに役割を果たすことも証明されている。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、様々な臓器特異的自己免疫疾患、クローン病、ヘリコバクター・ピロリ誘導性消化性潰瘍、急性腎臓同種移植拒絶反応、および原因不明の反復性流産の病因に関係している。対照的に、アレルゲン特異的Ｔｈ２応答は、遺伝的に感受性の強い個体におけるアトピー性疾患の原因である。さらに、Ｔｈ２は、オーメン（Ｏｍｅｎｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）症候群、特発性肺線維症、および進行性全身性硬化症において優勢である依然として未知の抗原に対して応答する。ＩＬ−１７（Ｔｈ−１７サイトカインの符号）ノックアウトマウスは、炎症性関節炎の発生に対して顕著な耐性を示す。ＣＩＡモデルにおける関節破壊は、抗ＩＬ−１７中和抗体の投与によって改善することができる。
【０００５】
そこで、不均衡なＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞分化に関連する様々な状態を治療する際に有用である新規な治療的処置を開発する高度な満たされていない医療的必要性が残っている。これらの多くの状態のために現在利用できる治療選択肢は不適切である。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２およびＴｈ１７のパラダイムは、アレルギー性および自己免疫障害を治療する戦略を開発するための論理的根拠を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，１８９，７１５号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔ−ｂｅｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＩｇＧ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｕｔｏ Ａｂ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（８）：５５４５−５０（２００２）；Ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｏｆ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ） ４５（８）：９５１−７（２００６）
【非特許文献２】Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ，Ｔ−ｂｅｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１１（３）：１７７−８４（２００４）；Ｔ−ｂｅｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ＣＤ８ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９（８）：１１５３−６２（２００４）
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ８１（８）： ４７１−８０ （２００３）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（５）：１５９６−６０１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
脂質メディエータであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、免疫応答の様々な段階を変調することが証明されている。ＰＧＥ２が細胞内ｃＡＭＰの上昇およびＩｃｋの不活性化を通してＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を抑制することは周知である。しかし、本明細書に記載したように、ＥＰ４受容体によるＰＧＥ２刺激は反対の作用も有する可能性があり、つまり、活性化ＣＤ４＋細胞内でのＴｈ１分化およびＩＬ−１７産生を促進することがある。これに一致して、ＥＰ４と新規な選択的ＥＰ４アンタゴニストまたはＰＧＥ２中和抗体いずれかとの拮抗作用は、Ｔｈ１分化、Ｔｈ１７増殖、ならびに活性化された樹状細胞によるＩＬ−２３分泌を抑制する。ＰＧＥ２によるＴｈ１分化の誘導はＰＩ３Ｋシグナリングによって媒介されるが、他方ＩＬ−１７産生の刺激はｃＡＭＰシグナリングを必要とする。さらに、ＥＰ４アンタゴニストのＤＢＡ／１またはＣ５７ＢＬ／６マウスへの投与は先天性および適応的免疫応答を抑制し、さらにコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）および実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける疾患を抑制したので、これはＰＧＥ２／ＥＰ４シグナリングがこれらの自己免疫病理に極めて重要に関係することを示した。これらの結果は、ＰＧＥ２／ＥＰ４シグナリングの抑制が例えば関節リウマチおよび多発性硬化症などの炎症性自己免疫疾患を改善することに治療的価値を有する可能性があることを示唆している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１態様は、被験体における関節リウマチを治療する方法であって、該被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化１】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１０】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品は調節因子化合物を含み、該調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化２】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１１】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物である。
【００１２】
本発明のまた別の態様は、被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、該被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化３】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１３】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品は調節因子化合物を含み、該調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用である。一部の実施形態では、調節因子化合物は、式：
【化４】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１４】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物である。
【００１５】
本発明のまた別の態様は、被験体における関節リウマチを治療する方法であって、該被験体にＥＰ４アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化５】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１６】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化６】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１７】
本発明のまた別の態様は、関節リウマチを治療するためのＥＰ４アンタゴニストである。一部の実施形態では
【００１８】
本発明のまた別の態様は、被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、該被験体にＥＰ４アンタゴニストを投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化７】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００１９】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、該医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用である。一部の実施形態では、ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化８】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である。
【００２０】
本発明のまた別の態様は、多発性硬化症を治療するためのＥＰ４アンタゴニストである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法によれば、関節リウマチや多発性硬化症を治療することができる。
【００２２】
本発明の他の態様については、本明細書において開示し、以下でより詳細に考察する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＥＰ４結合アッセイにおけるＥＲ−８１９９２４−０１およびそのエナンチオマーであるＥＲ−８１９９２５−０１の滴定試験を示す図である。
【図２】ＥＲ−８１９９２４およびＥＲ−８１９７６２が、ＳＥ３０２細胞におけるＰＧＥ２誘導性ＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーター活性に対する強力な阻害活性を示した図である。どちらの化合物も０．３ｎＭ〜１０μＭの濃度で試験した。
【図３】ＰＧＥ２／ＥＰ４アゴニストが抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いて刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−１７産生に及ぼす作用を示す図である。
【図４（２−１）】ＥＲ−８１９７６２が活性化ＣＤ４＋細胞からのＰＧＥ２／ＰＧＥ１−ＯＨ強化ＩＬ−１７産生を抑制することを示す図である。
【図４（２−２）】ＥＲ−８１９７６２が活性化ＣＤ４＋細胞からのＰＧＥ２／ＰＧＥ１−ＯＨ強化ＩＬ−１７産生を抑制することを示す図である。
【図５】抗ＰＧＥ２抗体がＩＬ−２３媒介性Ｔｈ１７増殖に及ぼす作用を示す図である。
【図６（２−１）】ＰＧＥ２／ＥＰ４アゴニストがマウスＴｈ１分化に及ぼす作用を示す図である。
【図６（２−２）】ＰＧＥ２／ＥＰ４アゴニストがマウスＴｈ１分化に及ぼす作用を示す図である（ＩＦＮｇ-Ｔｈ１）。
【図７】抗ＰＧＥ２抗体がマウスＴｈ１分化に及ぼす作用を示す図である。抗ＰＧＥ２抗体は、Ｔｈ１分化中に加えられた。
【図８】マウスＴｈ１分化における抗ＰＧＥ２抗体にＥＲ−８１９７６２は相加作用を及ぼさないことを示す図である。
【図９】インビトロでのマウスＩＬ−１７増殖の抑制を示す図である。
【図１０】ＣＩＡにおけるＥＲ−８１９９２４−０１の部分的治療評価を示す図である。
【図１１】ＣＩＡにおけるＥＲ−８１９９２４−０１の完全治療評価を示す図である。
【図１２】完全治療的ＣＩＡ試験からのマウス足のＸ線分析を示す図である。Ｘ線スコアは、骨減少症、骨浸食および新規骨形成の組み合わせの測定値の指標である。
【図１３】ヒトＣＤ１４＋単球を７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を用いてｉｍＤＣに分化させ、外因性ＰＧＥ１−ＯＨ（１〜１００ｎＭ）の存在下もしくは非存在下で、そしてＥＲ−８１９７６２を用いて、および用いずに、ＬＰＳ／Ｒ−８４８を用いて再刺激した。
【図１４】ヒトＣＤ１４＋単球を７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を用いてｉｍＤＣ内に分化させ、外因性ＰＧＥ１−ＯＨ（１〜１００ｎＭ）の存在下もしくは非存在下で、そしてＥＲ−８１９９２４もしくは抗ＰＧＥ２抗体を用いて、および用いずに、ＬＰＳ／Ｒ−８４８を用いて再刺激した。
【図１５】ＥＡＥにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７応答のエックスビボ抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ａ．定義
本明細書で使用する用語「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子」または「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物」または本明細書で使用する用語「調節因子化合物」は、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を抑制する、減少させる、または阻害する化合物を意味する。一部の実施形態では、用語「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子」または本明細書で使用する用語「Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物」は、ＩＬ−１７産生ＣＤ４＋細胞の数または活性化ＣＤ４＋細胞内でのＩＬ−１７産生を抑制する、減少させる、または阻害する化合物を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する「エナンチオマー的に純粋」は、ステレオマー的に純粋な化合物、または１つのキラル中心を有する化合物の組成物を意味している。
【００２６】
本明細書で使用する「ステレオマー的に純粋」は、化合物の１つの立体異性体を含み、その化合物の他方の立体異性体を実際的に含んでいない化合物または組成物を意味している。例えば、１つのキラル中心を有する化合物のステレオマー的に純粋な組成物は、実質的に該化合物の反対エナンチオマーを含んでいない。２つのキラル中心を有する化合物のステレオマー的に純粋な組成物は、該化合物の他方のジアステレオマーを実質的に含んでいない。典型的なステレオマー的に純粋な化合物は、約８０重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約２０重量％未満の該化合物の他方の立体異性体、より好ましくは約９０重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約１０重量％未満の該化合物の他方の立体異性体、一層より好ましくは約９５重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約５重量％未満の該化合物の他方の立体異性体、および最も好ましくは約９７重量％超の該化合物の１つの立体異性体および約３重量％未満の該化合物の他方の立体異性体を含んでいる（例えば、特許文献１）。
【００２７】
本明細書で使用する「安定性」は、本明細書に開示した１つ以上の目的のためにそれらの産生、検出、ならびに好ましくはそれらの回収、精製、および使用を許容する条件に受けさせたときに、実質的に変化しない化合物に関する。一部の実施形態では、安定性化合物または化学的に実行可能な化合物は、少なくとも１週間にわたり、水分またはその他の化学的反応性条件の存在下で、４０℃以下の温度で維持された場合に実質的に変化させられない化合物である。
【００２８】
本明細書で使用する「アルキル」または「アルキル基」は、完全に飽和している直鎖状（すなわち、非分枝状）、分枝状、または環状炭化水素鎖を意味する。所定の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を含有している。さらに他の実施形態では、アルキル基は２〜３個の炭素原子を含有し、そしてさらに他の実施形態では、アルキル基は１〜２個の炭素原子を含有している。所定の実施形態では、用語「アルキル」または「アルキル基」は、炭素環としても公知であるシクロアルキル基を意味する。典型的なＣ１−３アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、およびシクロプロピルが含まれる。
【００２９】
本明細書で使用する「アルケニル」または「アルケニル基」は、１つ以上の二重結合を有する直鎖状（すなわち、非分枝状）、分枝状、または環状炭化水素鎖を意味する。所定の実施形態では、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を含有している。さらに他の実施形態では、アルケニル基は３〜４個の炭素原子を含有し、そしてさらに他の実施形態では、アルケニル基は２〜３個の炭素原子を含有している。また別の態様によると、用語「アルケニル」は、２つの二重結合を有する直鎖状炭化水素を意味し、「ジエン」とも呼ばれる。他の実施形態では、用語「アルケニル」または「アルケニル基」は、シクロアルケニル基を意味する。典型的なＣ２−４アルケニル基には、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリルとも呼ばれる）、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、およびシクロブテニルが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用する「アルコキシ」または「アルキルチオ」は、以前に規定したように、アルキル基を意味し、酸素（「アルコキシ」）または硫黄（「アルキルチオ」）原子を通して主要炭素鎖に結合した。
【００３１】
本明細書で使用する「メチレン」、「エチレン」、および「プロピレン」は、二価成分であるＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を各々意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「エテニレン」、「プロペニレン」、および「ブテニレン」は、二価成分である−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、を意味するが、このとき各エテニレン基、プロペニレン基、およびブテニレン基はｃｉｓまたはｔｒａｎｓ配列にあってよい。所定の実施形態では、エテニレン基、プロペニレン基、またはブテニレン基は、ｔｒａｎｓ配列にあってよい。
【００３３】
「アルキリデン」は、メチレンのモノまたはジアルキル置換によって形成された二価炭化水素基を意味する。所定の実施形態では、アルキリデン基は、１〜６個の炭素原子を有する。他の実施形態では、アルキリデン基は、２〜６、１〜５、２〜４、または１〜３個の炭素原子を有する。そのような基には、プロピリデン（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝）、エチリデン（ＣＨ３ＣＨ＝）、およびイソプロピリデン（ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ＝）などが含まれる。
【００３４】
「アルケニリデン」は、メチレンのモノまたはジアルケニル置換によって形成された１つ以上の二重結合を有する二価炭化水素基を意味する。所定の実施形態では、アルケニリデン基は、２〜６個の炭素原子を有する。他の実施形態では、アルケニリデン基は、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３個の炭素原子を有する。１つの態様によると、アルケニリデンは、２つの二重結合を有する。典型的なアルケニリデン基には、ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ＝、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ＝、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝、およびＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝が含まれる。
【００３５】
「Ｃ１−６アルキルエステルもしくはアミド」は、Ｃ１−６アルキルエステルもしくはＣ１−６アルキルアミドを意味するが、このとき各Ｃ１−６アルキル基は上記に規定したとおりである。そのようなＣ１−６アルキルエステル基は、式（Ｃ１−６アルキル）ＯＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−の基である。そのようなＣ１−６アルキルアミド基は、式（Ｃ１−６アルキル）ＮＨＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−の基である。
【００３６】
「Ｃ２−６アルケニルエステルもしくはアミド」は、Ｃ２−６アルケニルエステルもしくはＣ２−６アルケニルアミドを意味し、ここで、各Ｃ２−６アルケニル基が上記に規定されている。そのようなＣ２−６アルキルエステル基は、式（Ｃ２−６アルケニル）ＯＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ２−６アルケニル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−の基である。そのようなＣ２−６アルケニルアミド基は、式（Ｃ２−６アルケニル）ＮＨＣ（＝Ｏ）−または（Ｃ２−６アルケニル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−の基である。
【００３７】
「治療」、「治療する」および「治療するステップ」は、本明細書に記載した疾患または障害の発生を逆転させる、軽減する、遅延させる、進行を阻害する、または予防することを意味する。一部の実施形態では、治療は、１つ以上の症状が発生した後に投与されてよい。他の実施形態では、治療は、症状の非存在下で投与されてよい。例えば、治療は、症状の発生前に（例えば、症状の履歴に照らして、および／または遺伝的もしくはその他の感受性因子に照らして）感受性のある個体に投与されてよい。治療はさらにまた、症状が消散した後に、例えば症状の再発を予防または遅延させるために継続されてよい。
【００３８】
本明細書で使用する「患者」または「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、動物被験体、好ましくは哺乳動物被験体（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サルなど）、および特にヒト被験者（男性および女性被験者の両方を含み、さらに新生児、幼児、少年、青年、成人および高齢被験者を含む）を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「医薬上許容される担体」は、それが一緒に調製される化合物の薬理学的活性を破壊しない、非毒性の担体、アジュバント、またはビヒクルを意味する。本発明の組成物中に使用できる医薬上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルには、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、例えばヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、例えばリン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩類または電解質類、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースをベースとする物質、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート類、ワックス類、ポリエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー類、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるがそれらに限定されない。
【００４０】
他に特に指示しない限り、本明細書で使用する化学基または成分を記載するために使用する術語は慣習に従うが、このとき名称は左から右へ読み、分子の残りへの結合点は名称の右側にある。例えば、「（Ｃ１−３アルコキシ）Ｃ１−３アルキル」基は、アルキル末端で分子の残りに結合している。また別の例には、結合点がエチル末端にあるメトキシエチル、および結合点がアミン末端にあるメチルアミノが含まれる。
【００４１】
他に特に指示しない限り、二価基が「−」によって指示される２つの末端結合成分を含む化学式によって記載される場合は、その結合は左から右へ読まれると理解される。
【００４２】
他に特に指示しない限り、本明細書に示した構造はさらにまたその構造の全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的（または立体配座）形、例えば各不斉中心に対するＲおよびＳ立体配置、（Ｚ）および（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）および（Ｅ）配座異性体を含むことが意図されている。このため、本発明の化合物の単一立体化学的異性体ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的（または立体配座）混合物は、本発明の範囲内に含まれる。他に特に指示しない限り、本発明の化合物の全ての互変異性体形は、本発明の範囲内に含まれる。さらに、他に特に指示しない限り、本明細書に記載した構造は、さらにまた１つ以上の同位体が濃縮された原子の存在に関してのみ相違する化合物を含むことも意図されている。例えば、ジューテリウム（重水素）またはトリチウムによる水素の置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素による炭素の置換を除いて、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内に含まれる。そのような化合物は、例えば、生物学的アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
【００４３】
Ｂ．活性化合物／調節因子化合物／ＥＰ４アンタゴニスト
本明細書で記載する本発明の活性化合物（本明細書では「調節因子化合物」および／または「ＥＰ４アンタゴニスト」と呼ぶこともある）は、一般に上記で例示したような、または本発明の特定のクラス、サブクラス、および種によって例示されるような１つ以上の置換基と任意で置換されてよい。一般に、用語「置換（された）」は、所定の構造内の水素ラジカルと特定の置換基のラジカルとの置換を意味する。他に特に指示しない限り、置換基は、その基の各置換可能な位置で置換基を有していてよく、任意の所定の構造内での２つ以上の位置が特定の基より選択される２つ以上の置換基と置換されてよい場合は、該置換基は１つ１つの位置で同一であっても相違していてもよい。
【００４４】
上述したように、本発明は、式Ｉ：
【化９】
のエナンチオマー的に純粋な化合物、もしくは活性な化合物、
またはより詳細には式Ｉａもしくは式Ｉｂ：
【化１０】
（式中、
Ｒ１はＣ１−３アルキルであり；
Ｘは、メチレン、エチレン、プロピレン、エテニレン、プロペニレン、またはブテニレンであり；
Ｒ５は、フェニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、インダゾリル、ピリジニル、イミダゾピリジニル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアジアゾリル、ピリジミジニル、ベンゾピラノニル、チアゾリル、チアジアゾリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、キノキサリニル、もしくはナフチルであり、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、Ｃ１−３アルキルチオ、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、トリフルオロメトキシ、５−メチルイソキサゾリル、ピラゾリル、ベンジルオキシ、アセチル、（シアニル）Ｃ１−３アルキル、（フェニル）Ｃ２−３アルケニルおよびハロよりなる群から独立して選択された０〜５個の置換基で置換されており；
Ｒ８は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、（Ｃ１−３アルコキシ）Ｃ１−３アルキル、（Ｃ１−３アルキルチオ）Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３ヒドロキシアルキル、フェニル、ベンジル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、およびチエニルであり；
（このとき、Ｒ８は、メチル、エチル、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ１−３アルキルチオ、（Ｃ１−３アルコキシ）Ｃ１−３アルキル、（Ｃ１−３アルキルチオ）Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３ヒドロキシアルキル、（Ｃ１−３メルカプトアルキル）フェニル、ベンジル、フリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、およびチエニルより独立して選択される０〜３個の置換基で置換されており）；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの各々は、水素、ヒドロキシル、メトキシ、ベンジルオキシ、フルオロ、クロロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、およびフェノキシより独立して選択され；
またはＲａおよびＲｂ、ならびにＲｂおよびＲｃより選択される１対は、一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−である）
またはその医薬上許容される塩、Ｃ１−６アルキルエステルもしくはアミド、またはＣ２−６アルケニルエステルもしくはアミドを提供する。
【００４５】
上記の一部の実施形態では：
Ｒ１はＣ１−２アルキルである；
Ｒ５は、フェニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、インダゾリル、ピリジニル、イミダゾピリジニル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアジアゾリル、ピリジミジニル、ベンゾピラノニル、チアゾリル、チアジアゾリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、キノキサリニル、もしくはナフチルであり、およびＣ１−４アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、Ｃ１−３アルキルチオ、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、トリフルオロメトキシ、５−メチルイソキサゾリル、ピラゾリル、ベンジルオキシ、アセチル、（シアニル）Ｃ１−３アルキル、（フェニル）Ｃ２−３アルケニルおよびハロよりなる群から独立して選択された０〜５個の置換基で置換されている；
Ｒ８は、メチル、エチル、またはプロピルである（このときＲ８は０〜３個のヒドロキシル置換基で置換されている）；
Ｘは、メチレンもしくはエチレンである；および
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの各々は、Ｈおよびメトキシよりなる群から独立して選択される；
またはそれらの医薬上許容される塩、Ｃ１−６アルキルエステルもしくはアミド、またはＣ２−６アルケニルエステルもしくはアミドである。
【００４６】
上記の一部の実施形態では：
Ｒ１は、メチルである；
Ｒ５は、フェニル、ピロリルもしくはピラゾリルであり、それらの各々はメチルで０、１または２回置換される；
Ｒ８は、エチルである；
Ｘは、メチレンである；
ＲａおよびＲｃの各々は、メトキシである；および
Ｒｂは、Ｈである；
またはその医薬上許容される塩である。
【００４７】
上記の特定の実施形態では、本化合物は：
【化１１】
またはそれらの医薬上許容される塩である。
【００４８】
本発明の活性化合物には、上記の医薬上許容される塩類が含まれる。医薬上許容される塩類には、医薬上許容される無機塩および有機酸および塩基に由来する塩類が含まれる。適切な酸性塩類の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が含まれる。例えばシュウ酸などのその他の酸は、それら自体は医薬上許容されないが、本発明の化合物およびそれらの医薬上許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩類の調製において使用することができる。
【００４９】
適切な塩基に由来する塩類には、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウムおよびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩類が含まれる。本発明は、さらにまた本明細書に開示した化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定している。そのような四級化によって、水溶性もしくは油溶性または分散性生成物を入手できる。
【００５０】
Ｃ．医薬調製物
本発明の活性化合物（調節因子化合物および／またはＥＰ４アンタゴニストを含む）は、それらの医薬調製物を提供するために医薬上許容される担体と結合することができる。担体および調製物の特定の選択は、該組成物の予定される特定投与経路に依存する。
【００５１】
本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、経直腸、経鼻腔、経口腔、経膣または埋め込みリザーバ投与などのために適合する可能性がある。好ましくは、本組成物は、経口、腹腔内または静脈内投与される。本発明の組成物の無菌注射剤形は、水性または油性懸濁剤であってよい。これらの懸濁剤は、適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当分野において公知の技術にしたがって調製できる。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用液剤または懸濁剤であってもよい。特に使用できる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、慣習的には溶媒または懸濁化剤として使用される。
【００５２】
この目的で、合成モノ−またはジ−グリセリド類を含む任意のブランドの不揮発性油を使用できる。例えばオレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、例えば、特にそれらのポリオキシエチル化形にあるオリーブ油またはヒマシ油などの天然の医薬上許容される油と同様に、注射剤の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、例えばエマルジョンおよび懸濁液を含む医薬上許容される剤形の調製において一般に使用されるカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤または分散剤をさらに含有していてもよい。例えばＴｗｅｅｎ類、Ｓｐａｎ類および医薬上許容される固体、液体、またはその他の剤形の製造において一般に使用されるその他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ強化剤などの他の一般に使用される界面活性剤類もまた調製のために使用できる。
【００５３】
本発明の医薬上許容される組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含む任意の経口投与に許容される剤形で経口投与することができるが、それらに限定されない。経口使用するための錠剤の場合には、一般に使用される担体には、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。典型的には、例えばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤もまた加えられる。カプセル形での経口投与のために有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが含まれる。経口使用のために水性懸濁剤が必要とされる場合は、有効成分が乳化剤および懸濁化剤と結合される。所望であれば、所定の甘味料、フレーバー剤または着色剤もまた加えることができる。
【００５４】
または、本発明の医薬上許容される組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。これらは、該物質を室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤と混合する工程によって調製することができるので、このため直腸内で融解して薬物を放出する。そのような材料には、カカオ脂、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【００５５】
本発明の医薬上許容される組成物は、特に治療の標的が目、皮膚、または下部消化管の疾患を含む、局所適用によって容易に接近できる領域または器官を含む場合には、局所投与することもできる。適切な局所用調製物は、これらの領域または器官の各々のために容易に調製される。
【００５６】
下部消化管に対する局所適用は、直腸坐剤調製物（上記参照）または適切な浣腸調製物で実行することができる。局所用経皮パッチもまた使用できる。
【００５７】
局所適用のためには、医薬上許容される組成物は、１つ以上の担体中に懸濁化または溶解した活性成分を含有する適切な軟膏剤に調製することができる。本発明の化合物を局所投与するための担体には、鉱油、流動ワセリン（ｌｉｑｕｉｄ ｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ）、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が含まれるがそれらに限定されない。または、医薬上許容される組成物は、１つ以上の医薬上許容される担体中に懸濁化または溶解した活性成分を含有する適切なローション剤またはクリーム剤に調製することができる。適切な担体には、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステル類ロウ、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるがそれらに限定されない。
【００５８】
眼科使用のためには、医薬上許容される組成物は、等張性のｐＨ調整無菌食塩液中の微粉化懸濁剤として、または好ましくは、等張性のｐＨ調整無菌食塩液中の液剤として、例えば塩化ベンジルアルコニウムなどの保存料を含めて、または含めずに調製することができる。または、眼科使用のためには、医薬上許容される組成物は、例えばワセリンなどの軟膏剤で調製することができる。
【００５９】
本発明の医薬上許容される組成物は、さらにまた鼻腔エーロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、医薬調製物の分野において周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な保存料、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来型可溶化剤もしくは分散剤を使用して、食塩液中の液剤として調製することができる。
【００６０】
最も好ましくは、本発明の医薬上許容される組成物は、経口投与のために調製される。
【００６１】
Ｄ．被験体および使用方法
本発明の活性化合物（調節因子化合物および／またはＥＰ４アンタゴニストを含む）は、様々な相違する状態を治療するために患者または被験体に、特に以下に罹患している患者または被験体に投与することができる。
（ａ）関節リウマチ；
（ｂ）多発性硬化症；
（ｃ）全身性エリテマトーデス（例えば、非特許文献１）；
（ｄ）１型糖尿病（例えば、非特許文献２）；
（ｅ）乾癬（例えば、非特許文献３）；および
（ｆ）アテローム硬化症（例えば、非特許文献４）
【００６２】
活性化合物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所的、経直腸、経鼻腔、経口腔、経膣または埋め込みリザーバなどの任意の適切な経路によって被験体に投与されてもよい。本明細書で使用する用語「非経口」には、皮下、静脈下、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。好ましくは、本組成物は、経口、腹腔内または静脈内投与される。
【００６３】
本活性化合物は、被験体に治療有効量、または治療的に有効な量で投与される。単位製剤形にある組成物を製造するために担体材料と結合できる本発明の化合物の量は、治療される宿主、および特定投与経路に依存して変動する。好ましくは、本組成物は、これらの組成物を摂取する患者に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の阻害剤を投与できるように調製されなければならない。所定の実施形態では、本発明の組成物は、０．０１ｍｇ〜５０ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、０．１〜２５ｍｇまたは５ｍｇ〜４０ｍｇの用量が提供される。
【００６４】
任意の特定患者のための特定の用量および治療レジメンは、使用される特定化合物の活性、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与回数、排出速度、併用薬、ならびに治療担当医師の判断および治療される特定疾患の重症度を含む様々な因子に依存することもまた理解されたい。組成物中の本発明の化合物の量は、さらに本組成物中の特定化合物に依存する。
【００６５】
以下では、本明細書に記載した本発明をより完全に理解できるように、実施例を記載する。これらの実施例は単に例示するためであり、決していかなる様式でも本発明を限定すると解釈すべきではないと理解されたい。
【実施例】
【００６６】
［実施例１〜４１］
化合物の合成
Ｂｉｏｔａｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社によって供給されるＥｍｒｙｓ Ｌｉｂｅｒａｔｏｒ機器を用いて、マイクロ波援用反応を実施した。溶媒除去は、Ｂｕｅｃｈｉロータリー・エバポレータまたはＧｅｎｅｖａｃ遠心式エバポレータのどちらかを使用して実施した。分析および分取クロマトグラフィは、酸性、中性、または塩基性条件下のいずれかで、順相または逆相いずれかのＨＰＬＣカラムを用いて、Ｗａｔｅｒｓ ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ機器を用いて実施した。化合物はＥＬＳＤクロマトグラムの面積百分率によって決定して、＞９０％純粋であると推定された。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ３００ＭＨｚ分光計を用いて記録した。
【００６７】
以下では本発明の化合物を調製するための一般的方法および実験について記載する。所定の場合には、例として特定化合物について記載する。しかし、各場合において、一連の本発明の化合物は以下に記載するスキームおよび実験にしたがって調製されたことは理解される。
【００６８】
スキーム１
【化１２】
ＥＲ−８１１１６０．上記のスキーム１に図示したように、水（５０ｍＬ）中のシアン化カリウム（２２．５ｇ、０．３３５Ｍ（モル））を５分間かけて、水（９０ｍＬ）およびメタノール（１１０ｍＬ）中の１−Ｂｏｃ−ピペリドン（３２．４８ｇ、０．１５９８Ｍ）および炭酸アンモニウム（３３．８ｇ、０．３５１Ｍ）の溶液に滴下した。添加の完了直後に、オフホワイトの沈降物が形成し始めた。反応フラスコを密封し、懸濁液を室温で７２時間にわたり攪拌した。結果として生じた浅黄色の沈降物を濾過し、少量の水で洗浄すると、無色の固体としてＥＲ−８１１１６０（３７．１ｇ、８６％）が得られた。
【００６９】
スキーム２
【化１３】
ＥＲ−８１８０３９．上記のスキーム２に図示したように、アセトン（５５５ｍＬ）中のＥＲ−８１１１６０（３０．０ｇ、０．１１１Ｍ）、３，５−ジメトキシベンジルブロミド（３０．９ｇ、０．１３４Ｍ）、および炭酸カリウム（１８．５ｇ、０．１３４Ｍ）の懸濁液を一晩還流させながら加熱した。反応溶液を室温へ冷却し、濾過し、インバキュオで濃縮した。橙色の粗残留物を最小量のＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）中に溶解させた。少量（５０ｍＬ）のヘキサンを加え、生成物を無色の固体として（約２時間かけて）沈殿させ、これを真空濾過によって単離した。フィルターケーキを少量のＭＴＢＥで洗浄し、インバキュオで乾燥させると、無色の固体としてＥＲ−８１８０３９（３９．６ｇ、８５％）が得られた。
【００７０】
スキーム３
【化１４】
ＥＲ−８２３１４３−０１．上記のスキーム３に図示したように、ＥＲ−８１８０３９（２．１５ｇ、０．００５１２Ｍ）を含有する１口丸底フラスコに１，４−ジオキサン（３．８ｍＬ、０．０４９Ｍ）中の４Ｎ ＨＣｌの溶液を緩徐に加えた。出発材料は２０分間かけて緩徐に溶解し、３０分後に無色の沈降物が形成された。次にＭＴＢＥ（３ｍＬ）を加えた。２時間後、反応液を濾過し、ＭＴＢＥを用いて洗浄すると、無色の固体としてＥＲ−８２３１４３−０１（１．８１ｇ、９９％）が得られた。
【００７１】
スキーム４
【化１５】
ＥＲ−８１７０９８：上記のスキーム４に図示したように、窒素雰囲気下で１，２−ジメトキシエタン（０．５ｍＬ、０．００４Ｍ）中のＥＲ−８２３１４３−０１（４１．５ｍｇ、０．０００１１７Ｍ）および４Åモレキュラーシーブの懸濁液に、３，５−ジメトキシベンズアルデヒド（２１．３ｍｇ、０．０００１２８Ｍ）、その後にトリエチルアミン（１６．２μＬ、０．０００１１７Ｍ）を加えた。この反応液を１時間にわたり攪拌した。トリアセトキシホウ化水素ナトリウム（３４．６ｍｇ、０．０００１６３Ｍ）を加え、この反応液を一晩攪拌した。シリカゲル・フラッシュ・クロマトグラフィーは、無色の固体としてＥＲ−８１７０９８（４５．３ｍｇ、８３％）を産生した。
【００７２】
スキーム５
【化１６】
ＥＲ−８１７１１６：上記のスキーム５に図示したように、Ｎ−メチルピロリジノン（１．０ｍＬ、０．０１０Ｍ）中のＥＲ−８１７０９８−００（５０．０ｍｇ、０．０００１０６Ｍ）および１−ブロモ−２−メトキシエタン（１５．６μＬ、０．０００１６０Ｍ）の溶液にテトラヒドロフラン（０．１６ｍＬ）中の１．０Ｍリチウムヘキサメチルジシラジド溶液を加えた。温度を８０℃へ上昇させ、反応混合液を一晩攪拌した。反応混合液を室温に冷却し、水を用いて急冷し、次にＭＴＢＥを用いて数回抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を結合し、水（２×）および食塩液（１×）を用いて洗浄した。有機層は硫酸マグネシウムの上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。フラッシュ・クロマトグラフィーは、無色油としてＥＲ−８１７１１６（３２．２ｍｇ、５８％）を生じさせた。
【００７３】
スキーム６
【化１７】
ＥＲ−８１７１１８：上記のスキーム６に図示したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中のＥＲ−８１７０９８（２．８５ｇ、０．００６０７Ｍ）の溶液に水素化ナトリウム（３６４ｍｇ、０．００９１０Ｍ）、次にヨードエタン（７５８μＬ、０．００９１０Ｍ）を加えた。この反応混合液を一晩攪拌した。水を極めて緩徐に加え、反応混合液はＭＴＢＥを用いて数回抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を結合し、水（２×）および食塩液（１×）を用いて洗浄した。有機層は硫酸マグネシウムの上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。溶離液として酢酸エチルを用いるフラッシュ・クロマトグラフィーは、無色油としてＥＲ−８１７１１８（２．８９ｇ、９６％）を生じさせた。
【００７４】
スキーム７
【化１８】
ＥＲ−８２３９１４：上記のスキーム７に図示したように、−７８℃でテトラヒドロフラン（３０．０ｍＬ、０．３７０Ｍ）中のＥＲ−８２３１４３−０１（５．０３ｇ、０．０１４１Ｍ）の溶液に、エーテル（７１ｍＬ）中の１．０Ｍの臭化アリルマグネシウムを緩徐に加えた。この反応混合液を室温へ加温し、一晩攪拌した。反応混合液を−７８℃へ冷却し、トリフルオロ酢酸（２１．８ｍＬ、０．２８３Ｍ）を滴下して処理し、次に少量の残留物量へインバキュオで濃縮した。残留ＴＦＡを中和するためにトリエチルアミンを加え、次にこの混合物を乾燥するまでインバキュオで濃縮した。残留した赤色油をメタノール（１３８ｍＬ、３．４１Ｍ）中に溶解させ、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３．３４ｇ、０．０１４８Ｍ）、次にトリエチルアミン（２．３８ｍＬ、０．０１６９Ｍ）で処理し、室温で一晩攪拌した。反応混合液をインバキュオで濃縮し、フラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル中の５０％ヘキサン）によって精製すると、無色の固体としてＥＲ−８２３９１４（３．２５ｇ、５２％）が得られた。
【００７５】
スキーム８
【化１９】
ＥＲ−８２３９１５：上記のスキーム８に図示したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２．４ｍＬ、０．１６０Ｍ）中のＥＲ−８２３９１４（２．２０ｇ、０．００４９６Ｍ）の溶液に水素化ナトリウム（２９８ｍｇ、０．００７４４Ｍ）、次にヨードエタン（６０７μＬ、０．００７４４Ｍ）を加えた。反応混合液を一晩攪拌し、水を用いて急冷し、次にＭＴＢＥを用いて数回抽出した。ＭＴＢＥ抽出物を結合し、水および食塩液を用いて洗浄した。有機層は硫酸マグネシウムの上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。フラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル中の４０％ヘキサン）は、無色の泡としてＥＲ■８２３９１５（０．８０ｇ、３４％）を生じさせた。
【００７６】
スキーム９
【化２０】
ＥＲ−８２３９１７−０１：上記のスキーム９に図示したように、ＥＲ−８２３９１５（７９９．２ｍｇ、０．００１６９５Ｍ）を１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）中の４Ｍ塩化水素の溶液中に溶解させた。反応混合液を一晩攪拌し、次にインバキュオで濃縮すると、橙色の固体としてＥＲ−８２３９１７−０１（０．６９ｇ、定量的）が得られた。
【００７７】
スキーム１０
【化２１】
ＥＲ−８２４１８４およびＥＲ−８２４１８５：上記のスキーム１０に図示したように、アセトニトリル（１ｍＬ）中のＥＲ−８２３９１５（２００ｍｇ）の溶液をＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＳ−Ｈ ＳＦＣカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、粒径：５ミクロン）上に注入し、９５：５のｎ−ヘプタン：ｉ−プロパノールを用いて４０ｍＬ／分の流量で溶出した。溶出フラクションは、２９０ｎｍに設定した波長を用いてＵＶ検出器を使用して検出した。第１溶出フラクションを単離し、インバキュオで回転式蒸発によって濃縮するとＥＲ−８２４１８４が得られた；第２溶出フラクションを単離し、インバキュオで回転式蒸発によって濃縮するとＥＲ−８２４１８５が得られた。
【００７８】
スキーム１１
【化２２】
ＥＲ−８２４１８８−０１：上記のスキーム１１に図示したように、ＥＲ−８２４１８４（２５．３３ｇ、０．０５３７１Ｍ）を１，４−ジオキサン（１３５ｍＬ）中の４Ｍ塩化水素の溶液中に溶解させた。反応混合液を一晩攪拌し、次にインバキュオで濃縮すると、橙色の固体としてＥＲ−８２４１８８−０１（２１．９ｇ、定量的）が得られた。ＥＲ−８２４１８８−０１の単結晶Ｘ線回折分析は、立体中心の絶対配置がスキーム１１に図示したようにＳであることを証明した。
【００７９】
スキーム１２
【化２３】
ＥＲ−８２４２８０−０１：上記のスキーム１２に図示したように、ＥＲ−８２４１８５（４５７．２ｍｇ、０．０００９６９５Ｍ）を１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中の４Ｍ塩化水素の溶液中に溶解させた。反応混合液を一晩攪拌し、次にインバキュオで濃縮すると、橙色の固体としてＥＲ−８２４２８０−０１（３８３．２ｍｇ、９７％）が得られた。ＥＲ−８２４１８８−０１のＭｏｓｈｅｒアミド誘導体の単結晶Ｘ線回折分析は、立体中心の絶対配置がスキーム１１に図示したようにＲであることを証明した。
【００８０】
スキーム１３
【化２４】
ＥＲ−８１９９２４：上記のスキーム１３に図示したように、ＥＲ−８２４１８８−０１（６２．４ｍｇ、０．０００１５３Ｍ）およびＮ−メチルピロール−２−カルバルデヒド（０．０００２２９Ｍ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６２ｍＬ）中に溶解／懸濁させた。３０分間にわたり攪拌した後、トリアセトキシホウ化水素ナトリウム（４７．８ｍｇ、０．０００２１４Ｍ）を加えた。反応混合液を一晩攪拌し、次に逆相クロマトグラフィによって精製すると、油としてＥＲ−８１９９２４（７１．１ｍｇ、８３．４％）が得られた。
【００８１】
スキーム１４
【化２５】
ＥＲ−８１９９２５：上記のスキーム１４に図示したように、ＥＲ−８２４２８０−０１（５９．５ｍｇ、０．０００１４６Ｍ）およびＮ−メチルピロール−２−カルバルデヒド（０．０００２１９Ｍ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）中に溶解／懸濁させた。３０分間にわたり攪拌した後、トリアセトキシホウ化水素ナトリウム（４５．６ｍｇ、０．０００２０４Ｍ）を加えた。反応混合液を一晩攪拌し、次に逆相クロマトグラフィによって精製すると、油としてＥＲ−８１９９２５（５１．９ｍｇ、７６．６％）が得られた。
【００８２】
スキーム１５
【化２６】
ＥＲ−８１９７６２：上記のスキーム１５に図示したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中のＥＲ−８２４１８８−０１（５．７ｇ、０．０１４０Ｍ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（４．４ｍＬ、０．０２９Ｍ）および３，５−ジメチルベンジルブロミド（４．７ｇ、０．０２４Ｍ）の溶液を９７℃で一晩加熱した。水系後処理およびフラッシュ・クロマトグラフィーによる精製によって、無色の固体としてＥＲ−８１９７６２（４．８６ｇ、７１％）が得られた。
【００８３】
スキーム１６
【化２７】
ＥＲ−８１９７６２−０１：上記のスキーム１６に図示したように、水（１１ｍＬ）中のＥＲ−８１９７６２（４．７７ｇ、０．００９７４Ｍ）、アセトニトリル（１０ｍＬ）および１Ｍ ＨＣｌの溶液を室温でおよそ５分間攪拌した。この溶液を濃縮すると、凍結乾燥後の無色の結晶固体としてＥＲ−８１９７６２−０１（５．１ｇ、定量的）が得られた。ＥＲ−８１９７６２−０１の単結晶Ｘ線回折分析は、立体中心の絶対配置がスキーム１６に図示したようにＳであることを証明した。
【００８４】
スキーム１７
【化２８】
ＥＲ−８１９７６３：上記のスキーム１７に図示したように、Ｎ−メチルピロリジノン（６６９ｍＬ）中のＥＲ−８２４２８０−０１（６６．９ｇ、０．１６４０Ｍ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（５４ｍＬ、０．３６１Ｍ）および３，５−ジメチルベンジルクロリド（４２．４ｇ、０．２１３Ｍ）の溶液を２時間にわたり７２℃で加熱した。冷却後、水を加えると、所望の生成物が沈降した。濾過および真空下での乾燥は、無色の固体としてＥＲ−８１９７６３（７４．４ｇ、９２％）を生じさせた。
【００８５】
スキーム１８
【化２９】
ＥＲ−８２４１０２：上記のスキーム１８に図示したように、室温にあるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）中のＥＲ−８２３１４３−０１（４．００ｇ、０．０１１２Ｍ）の溶液にα−ブロモメシチレン（３．１３ｇ、０．０１５７Ｍ）、次にＤＢＵ（４．３７ｍＬ、０．０２９２Ｍ）を加えた。１時間にわたり攪拌した後、反応液を半飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷し、酢酸エチルを用いて希釈し、１時間攪拌すると２つの透明層が得られた。有機層を分離し、水層は酢酸エチルにより抽出した（２×）。結合抽出物はＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。ＭＴＢＥからの結晶化により、無色の固体としてＥＲ−８２４１０２（４．３０ｇ、８７％）が得られた。
【００８６】
スキーム１９
【化３０】
ＥＲ−８１９９２９：上記のスキーム１９に図示したように、−６５℃のテトラヒドロフラン（３５ｍＬ）中のＥＲ−８２４１０２（３．７２ｇ、０．００８５Ｍ）の溶液に、−５０℃未満の内部温度を維持しながら１０分間かけてエーテル（２５．５ｍＬ、０．０２５５Ｍ）中の１．０Ｍ臭化アリルマグネシウムを加えた。反応混合液を０℃へ加温させた。０℃で３時間置いた後、反応液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷し、酢酸エチルおよび水を用いて希釈し、１０分間攪拌すると２つの透明層が得られた。有機層を分離し、水層は酢酸エチルにより抽出した。結合抽出物を水、食塩液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮すると無色の固体として粗生成物のＥＲ−８１９９２９（４．１５ｇ、定量的）が得られたので、これをそれ以上精製せずに次の工程に使用した。
【００８７】
スキーム２０
【化３１】
ＥＲ−８１９９３０：上記のスキーム２０に図示したように、トリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）中のＥＲ−８１９９２９（３７ｍｇ、０．００００７７Ｍ）の溶液を室温で１６時間にわたり攪拌した。暗赤褐色の反応混合液をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ、注意：ガス発生）を用いて中和した。２層の混合液を１０分間攪拌すると、ほぼ無色の２つの透明層が得られた。２つの有機層を分離し、水層はＥｔＯＡｃで抽出した。結合有機抽出物はＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。１：１ヘプタン−ＥｔＯＡｃ、１：３ヘプタン−ＥｔＯＡｃ、１００％ＥｔＯＡｃを用いて溶出させるフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製すると、無色の固体としてＥＲ−８１９９３０（２６ｍｇ、７３％）が得られた。
【００８８】
スキーム２１
【化３２】
ＥＲ−８２０００６およびＥＲ−８２０００７：上記のスキーム２１に図示したように、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＥＲ−８１９９３０（１１０ｍｇ、０．０００２３８Ｍ）および臭化メタリル（７２μＬ、０．０００７１５Ｍ）の溶液にテトラヒドロフラン中の１．０Ｍリチウムヘキサメチルジシラジド溶液（０．５２ｍＬ、０．０００５２Ｍ）を加えた。室温で１８時間攪拌した後、反応混合液をＭＴＢＥで希釈し、半飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷した。水層を分離し、ＭＴＢＥで抽出した。結合抽出物はＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、インバキュオで濃縮した。３：２ヘプタン−ＥｔＯＡｃ、１：１ヘプタン−ＥｔＯＡｃを用いて溶出させるフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製すると、無色油としてラセミ生成物（６８ｍｇ、５５％）が得られた。ラセミ生成物（５５ｍｇ）は、ヘプタン−イソプロパノール（９：１）を用いて溶出させるＣｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳカラム上でのキラルＨＰＬＣにかけると、第１溶出エナンチオマーであるＥＲ−８２０００６（２１ｍｇ、３８％、［ａ］Ｄ＝＋８３．７°（ｃ＝０．３５、ＣＨＣｌ３）および第２溶出エナンチオマーであるＥＲ−８２０００７（２３ｍｇ、４２％、［ａ］Ｄ＝−７４．２°（ｃ＝０．３８、ＣＨＣｌ３）が得られた。絶対立体化学は、エナンチオマーのＥＲ−８１９７６２／ＥＲ−８１９７６３対を用いて旋光度およびキラルＨＰＬＣ保持時間における共通点に基づいて暫定的に指定した。
【００８９】
スキーム２２
【化３３】
ＥＲ−８１９７８６およびＥＲ−８１９７８７：上記のスキーム２２に図示したように、攪拌棒を装備した５ｍＬマイクロ波反応器バイアルに、ＥＲ−８１９９３０（１１０ｍｇ、０．０００２３８Ｍ）、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）、２−（２−ブロモエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（１０８μＬ、０．０００７１５Ｍ）およびテトラヒドロフラン（５２０μＬ、０．０００５２Ｍ）中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジドを装填した。反応器バイアルを、２００℃で１５分間にわたりマイクロ波反応器にかけた。さらに２−（２−ブロモメトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（１０８μＬ、０．０００７１５Ｍ）およびテトラヒドロフラン中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジド（５２０μＬ、０．０００５２Ｍ）を加え、反応混合液をマイクロ波照射によってさらに１５分間、２００℃で加熱した。分取的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、無色のガラス質の油としてラセミ生成物（２５ｍｇ、２１％）が得られた。ラセミ生成物（１７ｍｇ）は、ヘプタン−イソプロパノール（９：１）を用いて溶出させるＣｈｉｒａｌｐａｃ ＡＳカラム上でのキラルＨＰＬＣにかけると、第１溶出エナンチオマーであるＥＲ−８１９７８６（７．２ｍｇ、４２％、［α］Ｄ＝＋７２．０°（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ３）および第２溶出エナンチオマーであるＥＲ−８１９７８７（７．５ｍｇ、４４％、［α］Ｄ＝−７３．０°（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ３）が得られた。絶対立体化学は、エナンチオマーのＥＲ−８１９７６２／ＥＲ−８１９７６３対を用いて旋光度およびキラルＨＰＬＣ保持時間における共通点に基づいて暫定的に指定した。
【００９０】
スキーム２３
【化３４】
ＥＲ−８１９９９３およびＥＲ−８１９９９４：上記のスキーム２３に図示したように、攪拌棒を装備した５ｍＬマイクロ波反応器バイアルに、ＥＲ−８１９９３０（１１０ｍｇ、０．０００２３８Ｍ）、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）、（（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル４−メチルベンゼンスルホネート（２０５ｍｇ、０．０００７１５ｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（５２０μＬ、０．０００５２Ｍ）中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジドを装填した。反応器バイアルを、２００℃で１５分間にわたりマイクロ波照射によって加熱した。さらに（（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル４−メチルベンゼンスルホネート（１５７ｍｇ、０．０００５４８Ｍ）およびテトラヒドロフラン中の１．００Ｍのリチウムヘキサメチルジシラジド（４７７μＬ、０．０００４７７Ｍ）を加え、反応混合液をマイクロ波照射によってさらに１５分間、２００℃で加熱した。分取的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、ジアステレオマーの１：１混合物としてアセトニドであるＥＲ−８１９９９３（４０ｍｇ、３０％）およびジオール材料（１８ｍｇ、１４％）が得られた。ヘプタン−イソプロパノール（９：１）を用いて溶出させるＣｈｉｒａｌｐａｃ ＡＳカラム上でのキラルＨＰＬＣによるジアステレオマージオールの分離によって、第１溶出ジアステレオマーであるＥＲ−８１９７８８（５．０ｍｇ）および第２溶出ジアステレオマーであるＥＲ−８１９７８９（５．２ｍｇ）が得られた。絶対立体化学は、エナンチオマーのＥＲ−８１９７６２／ＥＲ−８１９７６３対を用いてキラルＨＰＬＣ保持時間における共通点に基づいて暫定的に指定した。
【００９１】
スキーム２４
【化３５】
ＥＲ−８１９９０：上記のスキーム２４に図示したように、塩化メチレン（５００μＬ）中のＥＲ−８２４２２０−００（５１．８ｍｇ、０．０００１３９Ｍ）、トリエチルアミン（９７μＬ、０．０００７０Ｍ）、４−ジメチルアミノピリジン（３．４ｍｇ、０．００００２８Ｍ）および（Ｒ）−（−）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニルアセチルクロリド（０．０５２ｍＬ、０．０００２８Ｍ）の溶液を室温で５時間にわたり攪拌した。フラッシュ・クロマトグラフィーによる精製後に、酢酸エチル／ヘプタン／ペンタンから結晶化させると、結晶としてＥＲ−８１９９９０（４９．２ｍｇ、６０％）が得られた。
【００９２】
以下のセクションおよび以下の表１〜２に例示するが上記で明確には図示していない化合物は、スキーム１３および／またはスキーム１５に一致する一般方法を使用して合成できる。塩酸塩形で例示した化合物については、それらは対応する遊離塩基にスキーム１６に記載した一般条件を受けさせることによって調製することができる。
【００９３】
表１．式Ｉの典型的化合物についての分析データ
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【表１Ｄ】
【表１Ｅ】
【表１Ｆ】
【表１Ｇ】
【表１Ｈ】
【表１Ｉ】
【表１Ｊ】
【表１Ｋ】
【表１Ｌ】
【表１Ｍ】
【表１Ｎ】
【表１Ｏ】
【表１Ｐ】
【表１Ｑ】
【表１Ｒ】
【表１Ｓ】
【表１Ｔ】
【００９４】
分析方法：
方法Ａ１
溶媒Ａ：水中の０．２％ Ｅｔ３Ｎ
溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．２％ Ｅｔ３Ｎ
流量：２．０ｍＬ／分
線形勾配：
【表１Ｕ】
方法Ｃ１
移動相：エタノール中の０．１％ Ｅｔ２ＮＨ
流量：１．０ｍＬ／分
均一濃度
【００９５】
［実施例４２〜１２６］
インビトロ生物学的活性
ＨＥＫＴ−ｂｅｔ−ｌｕｃアッセイ：本アッセイは、ルシフェラーゼレポーターを駆動するヒトＴ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｏｘ応答エレメントを発現する遺伝子組換えＨＥＫ細胞内のＴ−ｂｅｔ依存性レポーター（ルシフェラーゼ）活性を測定する。ＨＥＫＴ−ｂｅｔ細胞は２×１０４／ウエルで９６ウエルプレート内で平板培養し、化合物を２４時間にわたり細胞培養中へ加えた。ルシフェラーゼ活性は、５０μＬのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えることによって測定し、サンプルをＶｉｃｔｏｒ Ｖリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で読み取った。化合物の活性は、化合物処理サンプルを非化合物処理ビヒクル対照と比較することによって決定した。ＩＣ５０値は、試験化合物の非存在下でのルシフェラーゼの量に対応する最大値および最大阻害で得られた試験化合物値に対応する最小値を利用して計算した。
【００９６】
正規化ＨＥＫＴ−ｂｅｔ ＩＣ５０値の決定：化合物は、マイクロタイタープレート内でアッセイした。各プレートは、ＥＲ−８１９５４４である参照化合物を含んでいた。特定化合物についての非正規化ＩＣ５０値を同一マイクロタイタープレート内で参照化合物について決定したＩＣ５０値で割ると、相対効力値が得られた。次に相対効力値に参照化合物の確定効力を掛けると、正規化ＨＥＫＴ−ｂｅｔ ＩＣ５０値が得られた。本アッセイでは、ＥＲ−８１９５４４の確定効力は０．０３５ｍＭであった。本明細書に提供したＩＣ５０値は、正規化法を使用して入手した。
【００９７】
本発明の典型的な化合物は、上記に記載したＨＥＫＴ−ｂｅｔ−ｌｕｃアッセイにおいて上述した方法にしたがってアッセイした。以下の表２は、上記に記載した正規化ＨＥＫＴ−ｂｅｔ−ｌｕｃアッセイによって決定した指示量（μＭ）までのＩＣ５０を有する本発明の典型的な化合物を記載している。
【００９８】
表２．典型的な化合物のＩＣ５０値
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【表２Ｆ】
【表２Ｇ】
【表２Ｈ】
【表２Ｉ】
【表２Ｊ】
【表２Ｋ】
【表２Ｌ】
【表２Ｍ】
【表２Ｎ】
【表２Ｏ】
【表２Ｐ】
【表２Ｑ】
【表２Ｒ】
【表２Ｓ】
【表２Ｔ】
【表２Ｕ】
【表２Ｖ】
【表２Ｗ】
【表２Ｘ】
【表２Ｙ】
【表２Ｚ】
【００９９】
［実施例１２６］
インビボ生物学的活性：能動免疫
ＣＩＡにおける関節炎発生の抑制。ＤＢＡ１／Ｊマウスを第０日にｂＣＩＩ／ＣＦＡで免疫し、その後第２１日にｂＣＩＩ／ＩＦＡで追加免疫した。関節炎の発生を試験経過にわたって監視した。関節炎のスコアは、以下の通りである：０＝正常な足、スコア１＝１〜２本の指が炎症を起こしている足、スコア２＝３本または１〜２本の指＋手関節または足関節が炎症を起こしている、スコア３＝手＋３本以上の指が炎症を起こしている；およびスコア４＝多数の指（３〜４）＋重大な手関節または足関節の炎症。
【０１００】
（Ａ）化合物の部分的治療評価。活性化合物は、コラーゲンＩＩに対する抗体の誘導後第２０日から、しかし疾患発生の前に指示した用量で１日１回の経口投与によって与えた。（Ｂ）化合物の完全治療評価。活性化合物は、疾患が発生した後（第２免疫後第７日から）投与した。（Ｃ）完全治療ＣＩＡ試験からのマウス足についてのＸ線分析。Ｘ線スコアは、骨減少症、骨浸食および新規骨形成の組み合わせの測定値の指標である。（Ｄ）代表的なＸ線写真。
【０１０１】
データは、以下の表３に示した。一般に、これらのデータは好都合にこのモデルにおけるメトトレキセートの活性を比較する。
【０１０２】
［実施例１２７］
インビボ生物学的活性：受動免疫
ＣＡＩＡにおける関節炎発生の抑制。ＢＡＬＢ／ｃマウスに第０日に１ｍｇの抗タイプＩＩコラーゲン抗体をｉ．ｖ．（静脈内）注射し、３日後に２５μｇのＬＰＳを活性化合物とともにｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、メトトレキセート（ＭＴＸ）は第０日〜第７日にわたり１日１回ＰＯ投与した。関節炎スコアおよび体重は、試験の全経過にわたって監視した。
【０１０３】
データは、以下の表３に示した。一般に、これらのデータは好都合にもこのモデルにおけるにおいて特に活性ではないメトトレキセートと比較する。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
［実施例１２８〜１３４］
材料および方法
マウスおよび試薬。ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＯ１１．１０マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。マウスＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびヒトＧＭ−ＣＳＦは、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ヒトＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社からである。抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ２８（クローン３７．５１）、抗ＩＬ−４（クローン１１Ｂ１１）、抗ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１２）およびＰＥ−抗マウスＩＬ−１７（クローンＴＣ１１−１８Ｈ１０）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入した。抗ＴＣＲ（クローンＨ５７−５９７）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。ＯＶＡペプチドおよびマイトマイシンＣは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。ＰＧＥ２、ＰＧＥ１−アルコールおよび抗ＰＧＥ２は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。ＬＰＳおよびＲ−８４８は、ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ社からである。ＣＤ１４＋細胞単離キットは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社からである。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社またはＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からである。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキットはＰＩＥＲＣＥ社からである；ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社からである；ＩＬ−２３ ＥＬＩＳＡキットは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社からである。Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ試薬は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社からである。Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａ社からである。
【０１０６】
放射性リガンドＥＰ４結合。放射性リガンドＥＰ４結合アッセイは、ＥＰ４発現性膜標本からの放射標識ＰＧＥ２の置換を測定する。放射性リガンドＥＰ４結合アッセイキットは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入し、このアッセイは、製造業者の取扱説明書にしたがって実施した。
【０１０７】
ＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーターアッセイ。内因性ＥＰ４を発現するＳＥ３０２細胞は、一晩にわたりＥＲ−８１９７６２の存在下または非存在下でＰＧＥ２を用いて刺激し、ＰＬＡＰ活性を測定した。
【０１０８】
インビトロＴ細胞アッセイ。天然ＣＤ４＋Ｔ細胞は、製造業者によって記載されたようにＲｏｂｏｓｅｐによってＢＡＬＢ／ｃまたはＤＯ１１．１０マウスのいずれかの脾臓から精製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスについては、１×１０５のＣＤ４＋Ｔ細胞を、中性条件下（１μｇ／ｍＬの平板結合抗ＣＤ３＋１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８＋１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−２）またはＴｈ１促進条件下（中性＋５ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−１２＋１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−４）またはＴｈ２分化条件下（中性＋１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−４＋１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−４）のいずれかで、１０％の正常ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）または活性炭処理ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）（外因性ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストが培養に加えられた場合）のいずれかを含有する１００μＬの完全ＲＰＭＩ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中で９６７ウエルプレート内で３〜６日間培養した。培養上清中のＩＦＮγまたはＩＬ−４はＥＬＩＳＡによって検出した。細胞ペレットを使用して、製造業者の取扱説明書にしたがってＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬のいずれかを用いて細胞増殖を測定した。ＤＯ１１．１０マウスに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマイトマイシンＣ処置脾臓細胞を抗原提示細胞として使用し、５：１の比率（１００μＬ培地中の５×１０５のマイトマイシンＣ処置脾臓細胞＋１００μＬ培地中の１×１０５ ＣＤ４＋Ｔ細胞）で天然ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、上述したように中性、Ｔｈ１またはＴｈ２促進条件下のいずれかでＯＶＡペプチド（０．３ｎｇ／ｍＬ）を用いて刺激した。ＥＰ４アゴニスト、アンタゴニストまたは抗ＰＧＥ２抗体をＴｈ細胞分化中に加えた。
【０１０９】
ＥＰ４アゴニスト／アンタゴニストがＩＬ−１７産生に及ぼす作用を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の全ＣＤ４＋Ｔ細胞を３〜５日間にわたり指示した濃度のＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＥＰ４アゴニスト／アンタゴニストの存在下または非存在下において平板結合抗ＣＤ３（２μｇ／ｍＬ）＋可溶性抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ）により活性化した。培養上清をＩＬ−１７ ＥＬＩＳＡによって分析し、細胞ペレットを使用してＣｅｌｌＴｉｔｅ−Ｇｌｏ試薬を用いた細胞増殖を測定した。
【０１１０】
ＩＬ−２３誘導性Ｔｈ１７増殖。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、５日間にわたり、ＩＬ−２３（３０ｎｇ／ｍＬ）を伴う、または伴わない、抗ＴＣＲ（１μｇ／ｍＬ平板結合）および抗Ｉ−ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ、可溶性）を用いて活性化した。ＩＬ−１７産生細胞は、製造業者（ＢＤ社）によって記載されたようにＩＬ−１７細胞内染色によって分析した。
【０１１１】
インビトロヒト単球由来ＤＣアッセイ。ＣＤ１４＋細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ１４マイクロビーズを用いてヒトＰＢＭＣから精製し、１０％木炭処理したＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ培地中でヒトＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍＬ）＋ヒトＩＬ−４（５００Ｕ／ｍＬ）を用いて８日間にわたり分化させた。未結合ｉｍＤＣ（未成熟樹状細胞）は、２４時間にわたり指示した濃度にあるＥＰ４アゴニスト／アンタゴニストまたは抗ＰＧＥ２抗体の添加を伴って、または伴わずに、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｒ−８４８（２．５μｇ／ｍＬ）を用いて刺激した。培養上清中のＩＬ−２３は、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって測定した。
【０１１２】
コラーゲン誘導性関節炎モデル。雄性ＤＢＡ／１マウスをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中で乳化した１５０μｇのウシＩＩ型コラーゲンを含有する、０．１ｍＬエマルジョンを用いて尾の基部で皮内免疫した。初回免疫の３週間後、全マウスにＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント中に乳化させたウシＩＩ型コラーゲンを用いて追加免疫した。各マウスの足における関節炎の症状の重症度は、公知の技術にしたがったＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．の方法によって判定した。
【０１１３】
ＰＬＰ誘導性ＥＡＥモデル。ＳＪＬマウスに、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント中に乳化させた３５μｇのＰＬＰ１３９−１５１を含有する０．１ｍＬエマルジョンを皮下注射した。１×１０９／２００μＬの百日咳菌を各マウスへ第０日および第２日に注射した。ＥＡＥスコアは、公知の技術にしたがって評価した。
【０１１４】
エックスビボＬＮまたは脾臓細胞試験。単一懸濁細胞は、ｂＣＩＩを用いた一次免疫の後第１５日マウスまたはＥＡＥ試験終了時に排液ＬＮまたは脾臓から調製し、ｂＣＩＩ（５０μｇ／ｍＬ）、ＭＯＧ３５−５５（１２．５μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ／培地のいずれかを用いて４８〜７２時間にわたり刺激した。培養上清中のサイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって分析し、細胞増殖はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬のいずれかによって測定した。「ミックス・アンド・マッチ（ｍｉｘ ＆ ｍａｔｃｈ）」リンパ球反応のためには、排液ＬＮ由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を１：５の比率でＡＰＣ（マイトマイシンＣ処理全ＬＮ細胞）と共培養し、上述したように刺激して分析した。
【０１１５】
［実施例１２８］
選択的ＥＰ４受容体アンタゴニストとして同定されたＥＲ−８１９９２４
ＥＲ−８１９９２４−０１は、競合的放射性リガンド結合アッセイ（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ社による）においてＥＰ４へ選択的に結合するが他のＥＰ／プロスタノイド／ロイコトリエン受容体には結合しないことが見いだされた（表４および図１）。さらに、１μＭでのＥＲ−８１９９２４−０１は、ＦＬＩＰＲ機能的スクリーンにおいてＥＰ４受容体に対してのみ活性を示し、他の１３２ＧＰＣＲのいずれに対しても活性を示さなかった（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社が外部委託したデータ）（表５）。ＥＲ−８１９９２４−０１はさらに、ＰＧＥ２に対する強力な阻害活性がＳＥ３０２細胞においてＣＲＥ−ＰＬＡＰ受容体活性を誘導することも証明した（２８ｎＭのＩＣ５０値を伴う）（図２）。
【０１１６】
表４：プロスタノイド／ロイコトリエン受容体に対するＥＲ−８１９９２４−０１の競合的リガンド結合アッセイ
【表４】
【０１１７】
表５：１３２ ＧＰＣＲに対するＥＲ−８１９９２４−０１のＦＬＩＰＲスクリーン。アゴニストモードおよびアンタゴニストモードの両方を測定したが、表にはアンタゴニスト活性だけを示した。
【表５】
【０１１８】
［実施例１２９］
活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞中でのＩＬ−１７産生にＰＧＥ２／ＥＰ４が及ぼす作用
ＥＰ４がさらにＴｈ１７応答においても役割を果たすかどうかを調査するために、ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストによるＥＰ４活性化が活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞内でのＩＬ−１７産生に及ぼす作用を試験した。全ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３〜５日間にわたり、ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストＰＧＥ１−ＯＨ（０．１ｎＭ〜１，０００ｎＭ）の存在下または非存在下でＩＬ−２３を伴う、または伴わずに、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激した。培養上清中のＩＬ−１７はＥＬＩＳＡによって測定し、細胞増殖はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏによって測定した。結果は、ＥＰ４アゴニストが抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞中の細胞増殖を抑制しながら、ＩＬ−１７産生を増強することを証明した（図３）。同様に高度に選択的なＥＰ４アンタゴニストであるまた別のＢＯＡＴ化合物であるＥＲ−８１９７６２−０１は、この系における活性を抑制した（図４）。さらに、抗ＰＧＥ２抗体は、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−２３の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いて活性化されるとＩＬ−１７産生細胞の数を減少させた（図５）。これらをまとめると、これらの結果は、ＥＰ４拮抗作用がＴｈ１７応答を抑制できるという仮説を裏付けた。
【０１１９】
［実施例１３０］
マウスＴｈ１分化においてＰＧＥ２／ＥＰ４が果たす役割
ＥＰ４活性化がＴｈ１分化において役割を果たすかどうかを調査するために、ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストおよび抗ＰＧＥ２抗体が及ぼす作用をマウスＴｈ１分化アッセイにおいて試験した。天然ＣＤ４Ｔ細胞は、３日間にわたりＴｈ１促進剤を用いて分化した。培養上清中のＴｈ１サイトカインＩＦＮγはＥＬＩＳＡによって測定した。細胞増殖は、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって測定した。ＰＧＥ２またはＥＰ４アゴニストＰＧＥ１−ＯＨをＴｈ１分化中に加えた。結果は、ＰＧＥ２およびＥＰ４アゴニスト（ＰＧＥ１−ＯＨ）はＴｈ１分化を強化するが（図６）、他方ＰＧＥ２に対する抗体が分化Ｔｈ１細胞におけるＩＦＮ−γ産生を部分的に抑制することを証明したが（図７）、これはＰＧＥ２／ＥＰ４がＴｈ１分化を調節することにある役割を果たすことを示している。さらに、ＥＲ−８１９７６２は抗ＰＧＥ２抗体に活性を加えなかったが（図８）、これはＥＲ−８１９７６２によるＴｈ１分化の抑制が主としてＥＰ４に対する活性に起因することを示唆していた。
【０１２０】
［実施例１３１］
インビトロでのマウスＩＬ−１７増殖の抑制
ＥＲ−８１９９２４−０１がＩＬ−２３誘導性Ｔｈ１７増殖に及ぼす作用をインビトロで試験した（図９）。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、５日間にわたりＥＲ−８１９９２４−０１または抗ＰＧＥ２抗体の存在下または非存在下において抗ＴＣＲ／抗ＣＤ２８モノクロール抗体およびＩＬ−２３（３０ｎｇ／ｍＬ）とともに培養した。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞は、細胞内染色のＦＡＣＳによって分析した。ＥＲ−８１９９２４−０１は、約１０〜１００ｎＭのＩＣ５０値を備えるＩＬ−２３誘導性Ｔｈ１７産生細胞の数を減少させた。
【０１２１】
［実施例１３２］
ＣＩＡにおける関節炎発生の抑制
ＥＲ−８１９９２４−０１の抗関節炎作用を評価するために、マウスＣＩＡモデルにおいて幾つかの試験を実施した。最初にＥＲ−８１９９２４−０１は、化合物が第２０日から毎日経口投与される（すなわち、病原性抗ＩＩ型コラーゲン抗体の誘導後で、関節炎発生の前に）部分治療投与レジメンにおいて試験した。関節炎スコア（炎症を起こした足の炎症反応指数として測定した）および体重を２週間にわたって監視した。部分治療投与条件下で、ＥＲ−８１９９２４−０１は、約１０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を備えて関節炎の発生を効果的に抑制した（図１０）。本発明者らは、さらに化合物が疾患の誘導後に投与される完全治療投与レジメンにおいてＥＲ−８１９９２４−０１について試験した。完全治療投与条件下で、ＥＲ−８１９９２４−０１は、約１０ｍｇ／ｋｇの用量でさらに関節炎の発生を効果的に防止した（図１１）。さらに、ＥＲ−８１９９２４−０１は、別個の試験において３０ｍｇ／ｋｇの用量でＸ線スコアを有意に改善した（図１２）。
【０１２２】
［実施例１３３］
活性化ヒトＭｏＤＣ（単球由来樹状細胞）における最適なＩＬ−２３産生のためには、ＰＧＥ２／ＥＰ４シグナリングが必要とされ、化合物はこの活性を抑制する
ヒトＣＤ１４＋単球を７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を用いてｉｍＤＣに分化させ、外因性ＰＧＥ１−ＯＨ（１〜１００ｎＭ）の存在下または非存在下において、そしてＥＲ−８１９７６２（図１３）もしくはＥＲ−８１９９２４または抗ＰＧＥ２抗体（図１４）を用いて、または用いずに、ＬＰＳ／Ｒ−８４８を用いて２４時間にわたり再刺激した。培養上清中のＩＬ−２３分泌は、ＥＬＩＳＡによって測定した。表６は、ヒトＭｏＤＣ ＩＬ−２３分泌アッセイにおける代表的化合物のＩＣ５０値を示している。
【０１２３】
表６：活性化ヒトＭｏＤＣにおけるＰＧＥ１−ＯＨ（１０ｎＭ）強化ＩＬ−２３産生を阻害する際の代表的な化合物のＩＣ５０値。
【表６】
【０１２４】
［実施例１３４］
ＥＡＥにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７反応のエックスビボ抑制
排液リンパ節は、治療的ＭＯＧ ＥＡＥ試験の終了時にマウスから採取した。単一細胞懸濁液を調製し、４８時間にわたりＭＯＧまたは培地のいずれかを用いて刺激した。上清は、Ｓｅａｒｃｈ Ｌｉｇｈｔ複数サイトカイン分析（ＰＩＥＲＣＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のために収集した。データは、図１５に示した。
【０１２５】
本発明の多数の実施形態について記載してきたが、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供するために基本的実施例を変化させられ得ることは明白である。このため本発明の範囲は、例として提示してきた特定実施形態によってではなく添付の特許請求項によって規定されることは理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明にかかる方法は、関節リウマチや多発性硬化症の治療に有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における関節リウマチを治療する方法であって、前記被験体に、Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記調節因子化合物は、式：
【化１】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品は調節因子化合物を含み、前記調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用。
【請求項４】
前記調節因子化合物は、式：
【化２】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
関節リウマチを治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物。
【請求項６】
被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、前記被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項７】
前記調節因子化合物は、式：
【化３】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品は調節因子化合物を含み、前記調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用。
【請求項９】
前記調節因子化合物は、式：
【化４】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
多発性硬化症を治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物。
【請求項１１】
被験体における関節リウマチを治療する方法であって、前記被験体にＥＰ４アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化５】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用。
【請求項１４】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化６】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
関節リウマチを治療するためのＥＰ４アンタゴニスト。
【請求項１６】
被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、前記被験体にＥＰ４アンタゴニストを投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化７】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用。
【請求項１９】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化８】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
多発性硬化症を治療するためのＥＰ４アンタゴニスト。
【請求項１】
被験体における関節リウマチを治療する方法であって、前記被験体に、Ｔｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記調節因子化合物は、式：
【化１】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品は調節因子化合物を含み、前記調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用。
【請求項４】
前記調節因子化合物は、式：
【化２】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
関節リウマチを治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物。
【請求項６】
被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、前記被験体にＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項７】
前記調節因子化合物は、式：
【化３】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品は調節因子化合物を含み、前記調節因子化合物はＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子である使用。
【請求項９】
前記調節因子化合物は、式：
【化４】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
多発性硬化症を治療するためのＴｈ１分化もしくはＴｈ１７増殖の調節因子化合物。
【請求項１１】
被験体における関節リウマチを治療する方法であって、前記被験体にＥＰ４アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化５】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
関節リウマチを治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用。
【請求項１４】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化６】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
関節リウマチを治療するためのＥＰ４アンタゴニスト。
【請求項１６】
被験体における多発性硬化症を治療する方法であって、前記被験体にＥＰ４アンタゴニストを投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化７】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多発性硬化症を治療するための医薬品の製造における化合物の使用であって、前記医薬品はＥＰ４アンタゴニストを含む使用。
【請求項１９】
前記ＥＰ４アンタゴニストは、式：
【化８】
の化合物、またはその医薬上許容される塩である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
多発性硬化症を治療するためのＥＰ４アンタゴニスト。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５０３１８２（Ｐ２０１１−５０３１８２Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４０３５（Ｐ２０１０−５３４０３５）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４４３１
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４４３１
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
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