保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤、経口用剤
【課題】優れた細胞賦活作用、美白作用、抗酸化作用等を有する有効成分を見出し、皮膚外用剤、経口用剤などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤を提供する。
【解決手段】優れた細胞賦活作用等を有するクワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤として用いる。また、得られた保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤を皮膚外用剤、経口用剤等の組成物に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミといった種々の皮膚症状の防止や改善、中性脂肪の蓄積抑制を発揮する。
【解決手段】優れた細胞賦活作用等を有するクワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤として用いる。また、得られた保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤を皮膚外用剤、経口用剤等の組成物に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミといった種々の皮膚症状の防止や改善、中性脂肪の蓄積抑制を発揮する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤に関する。さらに詳しくは、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤及び抗炎症剤、並びにイヌビワの抽出物を含有する皮膚外用剤及び経口用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シワ、タルミ、色素沈着・色調変化、皮膚の弾性低下、皮膚表面形態の乱れなどの皮膚症状の悪化の要因としては、例えばシワやタルミは、乾燥、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、皮膚の色黒などを含む色素沈着・色調変化は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因であると考えられている。
【０００３】
このような悩みを解決するために、様々な方法が従来から検討されている。例えば、細胞賦活剤としては、トケイソウ科トケイソウ属のエッセンス（特許文献１参照）等、抗酸化剤としては、トチュウの抽出物（特許文献２参照）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、シンビジューム属植物の抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１３１９４５号公報
【特許文献２】特開平１０−１７４３６号公報
【特許文献３】特開２００２−３３３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などが皮膚外用剤や飲経口用剤などの分野に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、美白作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような有効成分を見出すためになされたものであり、皮膚外用剤や経口用剤に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤及び免疫賦活剤、並びにこれらを含有する皮膚外用剤、経口用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、皮膚外用剤や経口用剤などに幅広く応用が可能な保湿剤等を見出すために、天然由来の種々の物質について鋭意研究を行った。その結果、イヌビワの抽出物に優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、中性脂肪蓄積抑制作用、美白作用、抗炎症作用、免疫賦活作用を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、イヌビワの抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤及び免疫賦活剤、並びにイヌビワの抽出物を含有する皮膚外用剤及び経口用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤及び免疫賦活剤を提供することができる。また、これらを有効成分として含有する皮膚外用剤、経口用剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いられるイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）は、クワ科イチジク属の落葉小高木で、関東地方以西の本州、四国、九州、沖縄、台湾に分布する。
【０００９】
本発明におけるイヌビワは、原体や乾燥粉砕したものをそのまま使用することができるが、溶媒等を用いて抽出した抽出物を用いることが好ましい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが望ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬する方法や超臨界流体等を用いた抽出方法など一般的な方法で行うことができる。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが好ましい。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが好ましい。
【００１０】
抽出溶媒としては、例えば、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。また、オートクレーブなどを用いて、加圧下で抽出することも可能である。
【００１１】
得られた抽出物は、そのままでも用いることができるが、濃縮、乾固したものを水や溶媒に再度溶解したり、あるいはこれらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理を行ったり、カラムクロマトグラフィーによる分画処理を行った後に用いてもよい。また、保存のため、精製処理の後凍結乾燥し、使用時に溶媒に溶解して用いることもできる。
【００１２】
イヌビワの抽出物を用いる時、その使用部位は特に限定されるものではなく、全体または花、葉、茎、枝、根、種子、樹皮、樹液、果皮、実などいずれの部位を用いても構わない。利用性、有効性の点からは葉、実、枝を用いるのがより好ましい。
【００１３】
イヌビワの抽出物は、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、中性脂肪蓄積抑制作用、美白作用、抗炎症作用、免疫賦活作用を有し、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤として利用することができる。また、イヌビワの抽出物を有効成分とする保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、医薬品、医薬部外品、化粧品あるいは経口用剤などに応用することが可能である。
【００１４】
イヌビワの抽出物を含有する保湿剤は、皮膚や毛髪に対して優れた保湿作用を発揮し、特に皮膚に対する保湿効果が高い。
【００１５】
イヌビワの抽出物を含有する抗老化剤は、種々の細胞に対して優れた細胞賦活作用を発揮するが、特に真皮線維芽細胞及びヒト表皮角化細胞に対して優れた効果を発揮し、真皮線維芽細胞賦活剤、ヒト表皮角化細胞賦活剤として有用である。
【００１６】
イヌビワの抽出物を含有する抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を発揮し、抗酸化剤として有用である。
【００１７】
イヌビワの抽出物を含有する中性脂肪蓄積抑制剤は、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を発揮し、中性脂肪蓄積抑制剤として有用である。中性脂肪の過剰な蓄積が原因として起こる疾患としては、高脂血症、動脈硬化、脂肪肝などが知られており、イヌビワの抽出物を有効成分とする中性脂肪蓄積抑制剤は、肥満の予防・改善だけでなく、このような疾患の予防・改善にも効果を期待することができる。また痩身効果も期待することができる。
イヌビワの抽出物を含有する美白剤は、優れた美白作用を発揮するが、特にメラニン産生促進作用に対して優れた効果を発揮し、美白剤として有用である。
【００１８】
イヌビワの抽出物を含有する美白剤は、優れた美白作用を発揮するが、特にメラニン産生促進作用に対して優れた効果を発揮し、美白剤として有用である。
【００１９】
イヌビワの抽出物を含有する抗炎症剤は、優れた抗炎症作用を発揮し、抗炎症剤として有用である。
【００２０】
イヌビワの抽出物を含有する免疫賦活剤は、優れた免疫賦活作用を発揮し、免疫賦活剤として有用である。
【００２１】
また、イヌビワの抽出物を皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミ、乾燥、小じわ等の皮膚症状の防止・改善や、腹部、太腿、顔などの部分的な肥満防止・改善に優れた効果を発揮する皮膚外用剤を得ることができ、保湿用皮膚外用剤、老化防止改善用皮膚外用剤、美白用皮膚外用剤、あるいは中性脂肪蓄積抑制用皮膚外用剤としても用いることができる。さらに、イヌビワの抽出物は、美容、健康維持、又は栄養補給を目的とする医薬品、医薬部外品、経口用剤などに用いることもできる。
【００２２】
イヌビワの抽出物を皮膚外用剤や経口用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤や経口用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜２５．０質量％である。
【００２３】
イヌビワの抽出物を皮膚外用剤に配合する場合その剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系，カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール，軟膏剤，粉末，顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。
【００２４】
イヌビワの抽出物を配合する皮膚外用剤には、必要に応じて、通常医薬品，医薬部外品，皮膚化粧料，毛髪用化粧料及び洗浄料などに配合される、油性成分，保湿剤，粉体，色素，乳化剤，可溶化剤，洗浄剤，紫外線吸収剤，増粘剤，薬剤，香料，樹脂，防菌防黴剤，アルコール類等の他の成分を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、痩身剤、抗老化剤、美白剤、抗炎症剤、との併用も可能である。
【００２５】
イヌビワの抽出物を経口用剤に配合する場合その形態は特に限定されないが、液剤等の液状の形態や、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、飴剤等の固形剤、あるいはゼリー、グミ、ガムなどの様々な形態に加工し使用することができ、医薬品、医薬部外品、栄養補助経口用剤、健康経口用剤等として用いることができる。その際、他の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、防腐剤、コーティング剤、保存剤、矯味剤、香料、着色剤、可塑剤などを添加することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、痩身剤、抗老化剤、美白剤、抗炎症剤、との併用も可能である。
【実施例】
【００２６】
以下に、イヌビワの抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や経口用剤の処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２７】
［製造例１］イヌビワの葉の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの精製水に分散させ、オートクレーブを用い１２０℃で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物１を得た。
【００２８】
［製造例２］イヌビワの葉の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、攪拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物２を得た。
【００２９】
［製造例３］イヌビワの実の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの精製水に分散させ、オートクレーブを用い１２０℃で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物３を得た。
【００３０】
［製造例４］イヌビワの実の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、攪拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物４を得た。
【００３１】
［製造例５］イヌビワの枝の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの精製水に分散させ、オートクレーブを用い１２０℃で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物５を得た。
【００３２】
［製造例６］イヌビワの枝の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、攪拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物６を得た。
【００３３】
上記製造例を用いて、イヌビワの抽出物の有効性評価試験を行った。
【００３４】
［試験例１］ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用（保湿効果）
試料として、抽出物３（イヌビワ（実）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００３５】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表１に示す濃度になるように抽出物３を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに３日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１に示す。
有効性評価試験結果について、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊で表す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から明らかなように、抽出物３には、有意なヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められ、優れた保湿作用を有することが明らかとなった。
【００３８】
［試験例２］ヒト真皮線維芽細胞賦活作用（抗老化効果）
試料として、抽出物５（イヌビワ（枝）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００３９】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表２に示す濃度になるように抽出物５を添加した１％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに４８時間培養した。次に４００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価では、試料培養液の他に、コントロールとして１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを、ポジティブコントロールとして５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを用いた。評価結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２から明らかなように、抽出物５には、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められ、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００４２】
［試験例３］ヒト真皮繊維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用（抗老化効果）
試料として、抽出物４（イヌビワ（実）５０％容量エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００４３】
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表３に示す濃度になるように抽出物４を添加した０．５質量％ ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量には、ＥＬＩＳＡ法を用い、標識された２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩ型コラーゲン産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３から明らかなように、抽出物４には、有意なヒト真皮繊維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物は、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００４６】
［試験例４］ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用（抗老化効果）
試料として、抽出物２（イヌビワ（葉）５０％容量エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００４７】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表４に示す濃度になるように抽出物２を添加した１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製 ＡＴＰ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。評価結果を試料無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にて表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
表４から明らかなように、抽出物２には、有意なヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物は、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００５０】
［試験例５］ヒト表皮角化細胞賦活作用（抗老化効果）
試料として、抽出物４（イヌビワ（実）５０％容量エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００５１】
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表５に示す濃度になるように抽出物４を添加した５質量％ ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５から明らかなように、抽出物４には、有意なヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物は、ヒト表皮角化細胞賦活作用が認められ、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００５４】
［試験例６］ＤＰＰＨラジカル消去作用（抗酸化作用）
試料として、抽出物３（イヌビワ（実）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００５５】
５０質量％エタノールに、表６に示す濃度になるように抽出物３を添加した試料溶液１００μＬに、０．２ｍＭ １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液１００μＬを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて２４時間静置し、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、ＤＰＰＨラジカル消去率は式（１）に定義される。
消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００ 式（１）
評価結果を表６に示す。
【００５６】
【表６】
【００５７】
表６から明らかなように、抽出物３には、有意なＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ＤＰＰＨラジカル消去作用が認められ、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００５８】
［試験例７］ＳＯＤ様活性作用（抗酸化作用）
試料として、抽出物５（イヌビワ（枝）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００５９】
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬに、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）に表７に示す濃度になるように抽出物５を添加した試料溶液２５μＬを添加した。さらに、Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ ２５μＬ（０．００７５Ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃にて１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率は式（２）に定義される。
消去率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００ 式（２）
評価結果を表７に示す。
【００６０】
【表７】
【００６１】
表５から明らかなように、抽出物５には、有意なＳＯＤ様活性作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ＳＯＤ様活性作用が認められ、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００６２】
［試験例８］中性脂肪蓄積抑制作用
試料として、抽出物３（イヌビワ（実）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００６３】
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ ＨＰＲＡＤ−ＳＱを１ウェル当り５．０×１０３個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％ＦＢＳ，２ｍＭＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。４８時間培養後、抽出物３を添加して表８に示す濃度になるように調整したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬインシュリン，１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，２００μＭ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、０．５質量／体積％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、メタノールを添加し、色素を抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける中性脂肪蓄積量を１００とした時の相対値にて表８に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
表８から明らかなように、抽出物３には、有意なヒト前駆脂肪細胞中性脂肪蓄積抑制作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。
【００６６】
［試験例９］ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用（美白作用）
試料として、抽出物４（イヌビワ（葉）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００６７】
正常ヒト表皮メラニン細胞を１ウェル当り３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＭｅｄｉｕｍ ２５４Ｓを用いた。２４時間後、抽出物３を添加して表９に示す濃度になるように調整したＭｅｄｉｕｍ ２５４Ｓに交換し、さらに４８時間培養した。次に１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するリン酸緩衝液７５μＬに交換し、細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる５０μＬの０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、３７℃で２時間静置した。基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式（式３）に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量
＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）−２．１６６｝／５．２３８（式３）
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較し、表９に示す。
【００６８】
【表９】
【００６９】
［試験例１０］メラニン産生抑制作用（美白作用）
試料として、抽出物４（イヌビワ（葉）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００７０】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、抽出物４を添加して表１０に示す濃度になるように調整した５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を目視判定した。評価ではネガティブコントロールに５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを用いた。これらの目視判定結果は判定５及び判定１とし、試料判定の指標とした。目視判定は表１０に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表１１に示す。
【００７１】
【表１０】
【００７２】
【表１１】
【００７３】
表９、表１１から明らかなように、抽出物４は、色素細胞内のメラニン産生を著しく抑制することが認められた。また、表１１から色素細胞内のメラニン産生を著しく抑制することが明らかとなった。これらのことから、イヌビワの抽出物には、優れたメラニン産生抑制作用が認められ、高い美白作用を有することが明らかとなった。
【００７４】
［試験例１１］Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）阻害作用（抗炎症作用）
試料として、抽出物６（イヌビワ（枝）５０容量％エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００７５】
６０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整したＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）、抽出物６を添加して表１２に示す濃度になるように調製した試料、および１０ｍＭとなるよう調整したＤＴＮＢ（５，５−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ））を各１０μＬずつ混合し、室温で１０分間静置した。さらに基質として１．６６ｍＭのＤｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ Ｔｈｉｏ−ＰＣを５０μＬ添加し、室温で４５分間反応させ、４１４ｎｍの吸光度を測定した。また、ＰＬＡ２溶液にかえてバッファー添加時の吸光度を測定し、両測定値の差を求めた。試料無添加のコントロールの値を（Ａ）、試料添加時の値を（Ｂ）とした時、ＰＬＡ２阻害作用は次式（式４）に定義される。
阻害率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００ （式４）
評価結果を表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
【００７７】
表１２から明らかなように、イヌビワの抽出物には、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）阻害作用を有することが認められた。このことから、イヌビワの抽出物にはＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）阻害作用が認められ、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。
【００７８】
［試験例１２］ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を用いた細胞賦活作用（免疫賦活作用）
試料として、抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００７９】
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。２４時間後、Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、抽出物２を添加して表１３に示す濃度になるように調製した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表１３に示す。
【００８０】
【表１３】
【００８１】
表１３から明らかなように、イヌビワの抽出物には、ヒト急性単球白血病細胞に対する細胞賦活作用が認められ、優れた免疫賦活効果を有することが明らかとなった。
【００８２】
本発明を実施した処方例を示す。
【００８３】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（１０）精製水 ５３．８５
（１１）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（１２）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（１１）と（１２）を順次加え、均一に混合する。
【００８４】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 ７８．３８
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００８５】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（１０）精製水 ４０．７
（１１）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（１２）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） １．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（１１）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００８６】
［処方例４］美容液
（１）精製水 ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（１０）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（１１）ベヘニルアルコール ０．７５
（１２）ミツロウ １．０
（１３）ホホバ油 １．０
（１４）１、３−ブチレングリコール １０．０
（１５）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（１６）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（１５）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（１６）を加え、均一に混合する。
【００８７】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 ８６．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ２．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００８８】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン ５０．５（質量％）
（２）２−エチルヘキサンサンセチル ２３．０
（３）パルミチン酸オクチル １０．５
（４）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（５）精製水 ０．５
（６）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ０．５
製法：（１）〜（３）の油相成分を均一に溶解する。これに、（４）〜（６）を順次加え、均一に混合する。
【００８９】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２０．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 ３６．５
（８）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） １．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００９０】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．０(質量％)
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 ６９．４
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（１０）黄酸化鉄 ０．４
（１１）香料 ０．１
（１２）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） １．２
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（１０）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００９１】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０(質量％)
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）精製水 ５７．４
（１１）酸化チタン ９．０
（１２）タルク ７．４
（１３）ベンガラ ０．５
（１４）黄酸化鉄 １．１
（１５）黒酸化鉄 ０．１
（１６）香料 ０．１
（１７）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） １．２
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（１１）〜（１５）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（１６）と（１７）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００９２】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） １．０
（１１）精製水 ４７．４
（１２）香料 ０．１
製法：（５）と（６）を（１１）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（１０）を（１１）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００９３】
［処方例１１］パック
（１）精製水 ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） ５．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００９４】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料 ０．３(質量％)
（２）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） １．０
（３）炭酸水素ナトリウム ５０．０
（４）硫酸ナトリウム ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００９５】
［処方例１５］内服液
（１）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ８．０(質量％)
（２）エリスリトール １．０
（３）クエン酸 ０．１
（４）ステビア ０．０１
（５）精製水 ９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。
【００９６】
［処方例１６］顆粒剤
（１）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） ０．２（質量部）
（２）乳糖 ０．６５
（３）トウモロコシデンプン ０．１５
製法：（１）〜（３）をし過して混合し、造粒機にて造粒し、乾燥、整粒して全量が１５００ｍｇの顆粒剤を得た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤に関する。さらに詳しくは、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤及び抗炎症剤、並びにイヌビワの抽出物を含有する皮膚外用剤及び経口用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シワ、タルミ、色素沈着・色調変化、皮膚の弾性低下、皮膚表面形態の乱れなどの皮膚症状の悪化の要因としては、例えばシワやタルミは、乾燥、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、皮膚の色黒などを含む色素沈着・色調変化は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因であると考えられている。
【０００３】
このような悩みを解決するために、様々な方法が従来から検討されている。例えば、細胞賦活剤としては、トケイソウ科トケイソウ属のエッセンス（特許文献１参照）等、抗酸化剤としては、トチュウの抽出物（特許文献２参照）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、シンビジューム属植物の抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１３１９４５号公報
【特許文献２】特開平１０−１７４３６号公報
【特許文献３】特開２００２−３３３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などが皮膚外用剤や飲経口用剤などの分野に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、美白作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような有効成分を見出すためになされたものであり、皮膚外用剤や経口用剤に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤及び免疫賦活剤、並びにこれらを含有する皮膚外用剤、経口用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、皮膚外用剤や経口用剤などに幅広く応用が可能な保湿剤等を見出すために、天然由来の種々の物質について鋭意研究を行った。その結果、イヌビワの抽出物に優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、中性脂肪蓄積抑制作用、美白作用、抗炎症作用、免疫賦活作用を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、イヌビワの抽出物を含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤及び免疫賦活剤、並びにイヌビワの抽出物を含有する皮膚外用剤及び経口用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤及び免疫賦活剤を提供することができる。また、これらを有効成分として含有する皮膚外用剤、経口用剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いられるイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）は、クワ科イチジク属の落葉小高木で、関東地方以西の本州、四国、九州、沖縄、台湾に分布する。
【０００９】
本発明におけるイヌビワは、原体や乾燥粉砕したものをそのまま使用することができるが、溶媒等を用いて抽出した抽出物を用いることが好ましい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが望ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬する方法や超臨界流体等を用いた抽出方法など一般的な方法で行うことができる。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが好ましい。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが好ましい。
【００１０】
抽出溶媒としては、例えば、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。また、オートクレーブなどを用いて、加圧下で抽出することも可能である。
【００１１】
得られた抽出物は、そのままでも用いることができるが、濃縮、乾固したものを水や溶媒に再度溶解したり、あるいはこれらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理を行ったり、カラムクロマトグラフィーによる分画処理を行った後に用いてもよい。また、保存のため、精製処理の後凍結乾燥し、使用時に溶媒に溶解して用いることもできる。
【００１２】
イヌビワの抽出物を用いる時、その使用部位は特に限定されるものではなく、全体または花、葉、茎、枝、根、種子、樹皮、樹液、果皮、実などいずれの部位を用いても構わない。利用性、有効性の点からは葉、実、枝を用いるのがより好ましい。
【００１３】
イヌビワの抽出物は、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、中性脂肪蓄積抑制作用、美白作用、抗炎症作用、免疫賦活作用を有し、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤として利用することができる。また、イヌビワの抽出物を有効成分とする保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤、美白剤、抗炎症剤、免疫賦活剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、医薬品、医薬部外品、化粧品あるいは経口用剤などに応用することが可能である。
【００１４】
イヌビワの抽出物を含有する保湿剤は、皮膚や毛髪に対して優れた保湿作用を発揮し、特に皮膚に対する保湿効果が高い。
【００１５】
イヌビワの抽出物を含有する抗老化剤は、種々の細胞に対して優れた細胞賦活作用を発揮するが、特に真皮線維芽細胞及びヒト表皮角化細胞に対して優れた効果を発揮し、真皮線維芽細胞賦活剤、ヒト表皮角化細胞賦活剤として有用である。
【００１６】
イヌビワの抽出物を含有する抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を発揮し、抗酸化剤として有用である。
【００１７】
イヌビワの抽出物を含有する中性脂肪蓄積抑制剤は、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を発揮し、中性脂肪蓄積抑制剤として有用である。中性脂肪の過剰な蓄積が原因として起こる疾患としては、高脂血症、動脈硬化、脂肪肝などが知られており、イヌビワの抽出物を有効成分とする中性脂肪蓄積抑制剤は、肥満の予防・改善だけでなく、このような疾患の予防・改善にも効果を期待することができる。また痩身効果も期待することができる。
イヌビワの抽出物を含有する美白剤は、優れた美白作用を発揮するが、特にメラニン産生促進作用に対して優れた効果を発揮し、美白剤として有用である。
【００１８】
イヌビワの抽出物を含有する美白剤は、優れた美白作用を発揮するが、特にメラニン産生促進作用に対して優れた効果を発揮し、美白剤として有用である。
【００１９】
イヌビワの抽出物を含有する抗炎症剤は、優れた抗炎症作用を発揮し、抗炎症剤として有用である。
【００２０】
イヌビワの抽出物を含有する免疫賦活剤は、優れた免疫賦活作用を発揮し、免疫賦活剤として有用である。
【００２１】
また、イヌビワの抽出物を皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミ、乾燥、小じわ等の皮膚症状の防止・改善や、腹部、太腿、顔などの部分的な肥満防止・改善に優れた効果を発揮する皮膚外用剤を得ることができ、保湿用皮膚外用剤、老化防止改善用皮膚外用剤、美白用皮膚外用剤、あるいは中性脂肪蓄積抑制用皮膚外用剤としても用いることができる。さらに、イヌビワの抽出物は、美容、健康維持、又は栄養補給を目的とする医薬品、医薬部外品、経口用剤などに用いることもできる。
【００２２】
イヌビワの抽出物を皮膚外用剤や経口用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤や経口用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜２５．０質量％である。
【００２３】
イヌビワの抽出物を皮膚外用剤に配合する場合その剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系，カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール，軟膏剤，粉末，顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。
【００２４】
イヌビワの抽出物を配合する皮膚外用剤には、必要に応じて、通常医薬品，医薬部外品，皮膚化粧料，毛髪用化粧料及び洗浄料などに配合される、油性成分，保湿剤，粉体，色素，乳化剤，可溶化剤，洗浄剤，紫外線吸収剤，増粘剤，薬剤，香料，樹脂，防菌防黴剤，アルコール類等の他の成分を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、痩身剤、抗老化剤、美白剤、抗炎症剤、との併用も可能である。
【００２５】
イヌビワの抽出物を経口用剤に配合する場合その形態は特に限定されないが、液剤等の液状の形態や、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、飴剤等の固形剤、あるいはゼリー、グミ、ガムなどの様々な形態に加工し使用することができ、医薬品、医薬部外品、栄養補助経口用剤、健康経口用剤等として用いることができる。その際、他の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、防腐剤、コーティング剤、保存剤、矯味剤、香料、着色剤、可塑剤などを添加することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、痩身剤、抗老化剤、美白剤、抗炎症剤、との併用も可能である。
【実施例】
【００２６】
以下に、イヌビワの抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や経口用剤の処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２７】
［製造例１］イヌビワの葉の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの精製水に分散させ、オートクレーブを用い１２０℃で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物１を得た。
【００２８】
［製造例２］イヌビワの葉の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、攪拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物２を得た。
【００２９】
［製造例３］イヌビワの実の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの精製水に分散させ、オートクレーブを用い１２０℃で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物３を得た。
【００３０】
［製造例４］イヌビワの実の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、攪拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物４を得た。
【００３１】
［製造例５］イヌビワの枝の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの精製水に分散させ、オートクレーブを用い１２０℃で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物５を得た。
【００３２】
［製造例６］イヌビワの枝の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、攪拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物６を得た。
【００３３】
上記製造例を用いて、イヌビワの抽出物の有効性評価試験を行った。
【００３４】
［試験例１］ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用（保湿効果）
試料として、抽出物３（イヌビワ（実）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００３５】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表１に示す濃度になるように抽出物３を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに３日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１に示す。
有効性評価試験結果について、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊で表す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から明らかなように、抽出物３には、有意なヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められ、優れた保湿作用を有することが明らかとなった。
【００３８】
［試験例２］ヒト真皮線維芽細胞賦活作用（抗老化効果）
試料として、抽出物５（イヌビワ（枝）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００３９】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表２に示す濃度になるように抽出物５を添加した１％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに４８時間培養した。次に４００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価では、試料培養液の他に、コントロールとして１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを、ポジティブコントロールとして５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを用いた。評価結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２から明らかなように、抽出物５には、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められ、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００４２】
［試験例３］ヒト真皮繊維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用（抗老化効果）
試料として、抽出物４（イヌビワ（実）５０％容量エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００４３】
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表３に示す濃度になるように抽出物４を添加した０．５質量％ ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量には、ＥＬＩＳＡ法を用い、標識された２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩ型コラーゲン産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３から明らかなように、抽出物４には、有意なヒト真皮繊維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物は、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００４６】
［試験例４］ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用（抗老化効果）
試料として、抽出物２（イヌビワ（葉）５０％容量エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００４７】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表４に示す濃度になるように抽出物２を添加した１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製 ＡＴＰ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。評価結果を試料無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にて表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
表４から明らかなように、抽出物２には、有意なヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物は、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００５０】
［試験例５］ヒト表皮角化細胞賦活作用（抗老化効果）
試料として、抽出物４（イヌビワ（実）５０％容量エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００５１】
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、表５に示す濃度になるように抽出物４を添加した５質量％ ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５から明らかなように、抽出物４には、有意なヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物は、ヒト表皮角化細胞賦活作用が認められ、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００５４】
［試験例６］ＤＰＰＨラジカル消去作用（抗酸化作用）
試料として、抽出物３（イヌビワ（実）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００５５】
５０質量％エタノールに、表６に示す濃度になるように抽出物３を添加した試料溶液１００μＬに、０．２ｍＭ １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液１００μＬを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて２４時間静置し、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、ＤＰＰＨラジカル消去率は式（１）に定義される。
消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００ 式（１）
評価結果を表６に示す。
【００５６】
【表６】
【００５７】
表６から明らかなように、抽出物３には、有意なＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ＤＰＰＨラジカル消去作用が認められ、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００５８】
［試験例７］ＳＯＤ様活性作用（抗酸化作用）
試料として、抽出物５（イヌビワ（枝）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００５９】
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬに、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）に表７に示す濃度になるように抽出物５を添加した試料溶液２５μＬを添加した。さらに、Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ ２５μＬ（０．００７５Ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃にて１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率は式（２）に定義される。
消去率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００ 式（２）
評価結果を表７に示す。
【００６０】
【表７】
【００６１】
表５から明らかなように、抽出物５には、有意なＳＯＤ様活性作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、ＳＯＤ様活性作用が認められ、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００６２】
［試験例８］中性脂肪蓄積抑制作用
試料として、抽出物３（イヌビワ（実）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００６３】
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ ＨＰＲＡＤ−ＳＱを１ウェル当り５．０×１０３個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％ＦＢＳ，２ｍＭＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。４８時間培養後、抽出物３を添加して表８に示す濃度になるように調整したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬインシュリン，１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，２００μＭ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、０．５質量／体積％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、メタノールを添加し、色素を抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける中性脂肪蓄積量を１００とした時の相対値にて表８に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
表８から明らかなように、抽出物３には、有意なヒト前駆脂肪細胞中性脂肪蓄積抑制作用が認められた。このことから、イヌビワの抽出物には、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。
【００６６】
［試験例９］ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用（美白作用）
試料として、抽出物４（イヌビワ（葉）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００６７】
正常ヒト表皮メラニン細胞を１ウェル当り３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＭｅｄｉｕｍ ２５４Ｓを用いた。２４時間後、抽出物３を添加して表９に示す濃度になるように調整したＭｅｄｉｕｍ ２５４Ｓに交換し、さらに４８時間培養した。次に１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するリン酸緩衝液７５μＬに交換し、細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる５０μＬの０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、３７℃で２時間静置した。基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式（式３）に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量
＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）−２．１６６｝／５．２３８（式３）
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較し、表９に示す。
【００６８】
【表９】
【００６９】
［試験例１０］メラニン産生抑制作用（美白作用）
試料として、抽出物４（イヌビワ（葉）熱水抽出物）を用いて評価を行った。
【００７０】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、抽出物４を添加して表１０に示す濃度になるように調整した５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を目視判定した。評価ではネガティブコントロールに５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５％質量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを用いた。これらの目視判定結果は判定５及び判定１とし、試料判定の指標とした。目視判定は表１０に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表１１に示す。
【００７１】
【表１０】
【００７２】
【表１１】
【００７３】
表９、表１１から明らかなように、抽出物４は、色素細胞内のメラニン産生を著しく抑制することが認められた。また、表１１から色素細胞内のメラニン産生を著しく抑制することが明らかとなった。これらのことから、イヌビワの抽出物には、優れたメラニン産生抑制作用が認められ、高い美白作用を有することが明らかとなった。
【００７４】
［試験例１１］Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）阻害作用（抗炎症作用）
試料として、抽出物６（イヌビワ（枝）５０容量％エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００７５】
６０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整したＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）、抽出物６を添加して表１２に示す濃度になるように調製した試料、および１０ｍＭとなるよう調整したＤＴＮＢ（５，５−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ））を各１０μＬずつ混合し、室温で１０分間静置した。さらに基質として１．６６ｍＭのＤｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ Ｔｈｉｏ−ＰＣを５０μＬ添加し、室温で４５分間反応させ、４１４ｎｍの吸光度を測定した。また、ＰＬＡ２溶液にかえてバッファー添加時の吸光度を測定し、両測定値の差を求めた。試料無添加のコントロールの値を（Ａ）、試料添加時の値を（Ｂ）とした時、ＰＬＡ２阻害作用は次式（式４）に定義される。
阻害率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００ （式４）
評価結果を表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
【００７７】
表１２から明らかなように、イヌビワの抽出物には、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）阻害作用を有することが認められた。このことから、イヌビワの抽出物にはＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（ＰＬＡ２）阻害作用が認められ、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。
【００７８】
［試験例１２］ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を用いた細胞賦活作用（免疫賦活作用）
試料として、抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物）を用いて評価を行った。
【００７９】
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。２４時間後、Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、抽出物２を添加して表１３に示す濃度になるように調製した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表１３に示す。
【００８０】
【表１３】
【００８１】
表１３から明らかなように、イヌビワの抽出物には、ヒト急性単球白血病細胞に対する細胞賦活作用が認められ、優れた免疫賦活効果を有することが明らかとなった。
【００８２】
本発明を実施した処方例を示す。
【００８３】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（１０）精製水 ５３．８５
（１１）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（１２）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（１１）と（１２）を順次加え、均一に混合する。
【００８４】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 ７８．３８
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００８５】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（１０）精製水 ４０．７
（１１）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（１２）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） １．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（１１）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００８６】
［処方例４］美容液
（１）精製水 ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（１０）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（１１）ベヘニルアルコール ０．７５
（１２）ミツロウ １．０
（１３）ホホバ油 １．０
（１４）１、３−ブチレングリコール １０．０
（１５）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（１６）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（１５）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（１６）を加え、均一に混合する。
【００８７】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 ８６．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ２．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００８８】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン ５０．５（質量％）
（２）２−エチルヘキサンサンセチル ２３．０
（３）パルミチン酸オクチル １０．５
（４）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（５）精製水 ０．５
（６）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ０．５
製法：（１）〜（３）の油相成分を均一に溶解する。これに、（４）〜（６）を順次加え、均一に混合する。
【００８９】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２０．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 ３６．５
（８）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） １．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００９０】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．０(質量％)
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 ６９．４
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（１０）黄酸化鉄 ０．４
（１１）香料 ０．１
（１２）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） １．２
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（１０）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００９１】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０(質量％)
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）精製水 ５７．４
（１１）酸化チタン ９．０
（１２）タルク ７．４
（１３）ベンガラ ０．５
（１４）黄酸化鉄 １．１
（１５）黒酸化鉄 ０．１
（１６）香料 ０．１
（１７）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） １．２
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（１１）〜（１５）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（１６）と（１７）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００９２】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） １．０
（１１）精製水 ４７．４
（１２）香料 ０．１
製法：（５）と（６）を（１１）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（１０）を（１１）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００９３】
［処方例１１］パック
（１）精製水 ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） ５．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００９４】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料 ０．３(質量％)
（２）抽出物３（イヌビワ（実）５０容量％エタノール抽出物） １．０
（３）炭酸水素ナトリウム ５０．０
（４）硫酸ナトリウム ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００９５】
［処方例１５］内服液
（１）抽出物２（イヌビワ（葉）５０容量％エタノール抽出物） ８．０(質量％)
（２）エリスリトール １．０
（３）クエン酸 ０．１
（４）ステビア ０．０１
（５）精製水 ９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。
【００９６】
［処方例１６］顆粒剤
（１）抽出物１（イヌビワ（葉）熱水抽出物） ０．２（質量部）
（２）乳糖 ０．６５
（３）トウモロコシデンプン ０．１５
製法：（１）〜（３）をし過して混合し、造粒機にて造粒し、乾燥、整粒して全量が１５００ｍｇの顆粒剤を得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する保湿剤。
【請求項２】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する抗老化剤。
【請求項３】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する抗酸化剤。
【請求項４】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する中性脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する美白剤。
【請求項６】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する抗炎症剤。
【請求項７】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する免疫賦活剤。
【請求項８】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する皮膚外用剤。
【請求項９】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する経口用剤。
【請求項１】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する保湿剤。
【請求項２】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する抗老化剤。
【請求項３】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する抗酸化剤。
【請求項４】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する中性脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する美白剤。
【請求項６】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する抗炎症剤。
【請求項７】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する免疫賦活剤。
【請求項８】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する皮膚外用剤。
【請求項９】
クワ科イチジク属イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｎｂ．）の抽出物を含有する経口用剤。
【公開番号】特開２０１０−１５０２０７（Ｐ２０１０−１５０２０７Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３１７２６（Ｐ２００８−３３１７２６）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
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