修飾されたアネキシン蛋白質および血栓症を防ぐための方法
【課題】修飾されたアネキシン蛋白質、好ましくはアネキシンＶを用いることにより出血を増加させることなしに血栓症を防ぐ。
【解決手段】血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質をスクリーニングする方法であって、ａ）血栓症試験システムを、血栓症を許容する条件下で、少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質に接触させ；ｂ）上記試験修飾アネキシン蛋白質の存在下で抗血栓活性を評価し；そしてｃ）試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性を、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓活性と比較し、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性の変化が血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質の指標である、上記方法が提供される。
【解決手段】血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質をスクリーニングする方法であって、ａ）血栓症試験システムを、血栓症を許容する条件下で、少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質に接触させ；ｂ）上記試験修飾アネキシン蛋白質の存在下で抗血栓活性を評価し；そしてｃ）試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性を、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓活性と比較し、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性の変化が血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質の指標である、上記方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、血栓症を治療するための方法及び組成物に関する。特定すれば、本発明は、修飾されたアネキシン蛋白質およびそれらの使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
血栓症は、血管の中の血液クロット（血栓）の形成、成長又は存在であり、最も共通の重度の医学上の障害である。動脈の血栓症の最も頻繁な例は冠動脈の血栓症であり、冠動脈の閉塞を導いて、しばしば心筋梗塞（心臓発作）を導く。１３０万人より多い患者が北米において毎年心筋梗塞のために病院に入院する。標準の治療は点滴による血栓溶解蛋白質はの投与である。急性の心筋梗塞の血栓溶解治療は治療された１０００人の患者あたり３０人の生命を救うと見積もられる；にもかかわらず、この障害の３０日の死亡率が実在したままである（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５６：４４９−４５４（２０００）、引用により本明細書に編入される）。全量一回投与（bolus）の注射による抗血栓剤及び血栓溶解剤の投与が便利なのは、付加的な利益を伴う病院への入院の前に使用されるかもしれないからである（Ｒａｗｌｅｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：１１８１−１１８６（１９９７）、引用により本明細書に編入される）。しかしながら、全量一回投与（bolus）は（より漸次の静脈内点滴とは対照的に）、大脳の出血の危険を顕著に増加させる（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。出血なしに血栓症を防ぐか及び／又は血栓溶解を増加させることができる薬剤の開発が望まれる。
【０００３】
冠動脈の閉塞による心臓への不十分な酸素の到達により引き起こされる不安定なアンギナは、病院への入院の最もありふれた原因であり、合衆国のみで１年に１５０万ケースである。冠動脈の閉塞の患者を血管形成術及びステント術により治療する場合、血小板ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体の使用が再狭窄の可能性を低下させる。しかしながら、同じ抗体は血管形成術なしに不安定なアンギナにおいて利益を示さなかったし、これらの患者において冠動脈の閉塞を防ぐための良好な方法が要求される。
【０００４】
動脈の血栓症の別の重要な例は大脳の血栓症である。静脈内の組換え組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｒｔＰＡ）は食品医薬品局により認定される急性の貧血性の脈拍のための唯一の治療である。投与が早いほど良好である（Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ３１：２５５２−２５５７（２０００），引用により本明細書に編入される）。しかしながら、静脈内のｒｔＰＡの投与は大脳内の出血の危険の増加を付随する。成熟期の（full-blown）脈拍はしばしば一過性の貧血性の発作（ＴＩＡ）が先に来て、合衆国において毎年約３００，０００人がＴＩＡを患うと見積もられる。全量一回投与として投与できる安全で有効な薬剤を有することが望まれて、且つ、数日間大脳の出血の危険を増加させることなしに大脳の血栓症の再発を防ぐはずである。血栓症は糖尿病及び他の患者の末梢動脈の閉塞の一因ともなり、そのような患者のための有効で安全な抗血栓剤が要求される。
【０００５】
静脈の血栓症は、臀部及び膝の関節形成術のような外科的処置の頻繁な合併症である。手術の分野においては出血を増加させることなく血栓症を防ぐことが望まれている。妊娠及び分娩に付随する静脈の血栓症にも類似の考察があてはまる。何人かは繰返しの静脈の血栓症になりがちであり、クマリンタイプの薬剤のような抗血栓剤により現在治療されている。そのような薬剤の用量は各患者において定量（titrated）されなければならず、有効な抗血栓剤の用量と出血を増加させる用量の間の余裕は小さい。出血の危険を増加させることからの抗血栓活性の良好な分離による治療法を有することが望まれる。血小板ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａのリガンド、低分子量ヘパリン、及び因子Ｘａのペンタサッカライド阻害剤を含む、最近導入された抗血栓治療の全ては、出血の危険を増加させ得る（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ １１９：１０８Ｓ−１２１Ｓ（２００１），引用により本明細書に編入される）。よって、出血の危険を増加させることなしに動脈及び静脈の血栓症を防ぐための別の戦略を探索する要求が存在する。
【０００６】
出血を増加させることなしに動脈又は静脈の血栓の拡大を阻害するためには、造血に関与する機構と大血管内の血栓症に関与する機構の間の潜在的な違いを探索することが必要である。主要な造血機構は血小板のマイクロ凝集物の形成を含み、毛細血管を塞いで、小血管内の損傷したか又は活性化された内皮細胞にわたり蓄積する。血小板の凝集物の阻害剤は、トロンボキサンＡ2の形成又は作用を抑圧する剤、ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａのリガンド、及びＡＤＰ受容体上に作用する薬剤、例えばクロピドグレル（clopidogrel）（Ｈａｌｌｏｐｅｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：２０２−２０７（２００１），引用により本明細書に編入される）を含み、このプロセスを干渉し、よって、出血の危険を増加させる（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。マイクロ凝集物の形成に加えて、動脈又は静脈の血栓による閉塞は、血小板の血栓への連続する補充と取り込みを必要とする。大血管内の剪断力による脱離に打ち勝つために、血小板は互いに、そしてそれらを取り巻いて被覆するフィブリンのネットワークに、強固に結合していなければならない。
【０００７】
血小板の密なマクロ凝集物の形成が細胞及び体液の増幅機構により促進されて、互いを補強しあうという証拠が蓄積してきた。細胞の機構においては、適度な濃度のアゴニスト、例えばＡＤＰ，トロンボキサン、Ａ2、又はコラーゲンにより誘導される、血小板の相対的にルーズなマイクロ凝集が、８５−ｋＤ蛋白質Ｇａｓ６の血小板α顆粒からの放出により達成される（Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：２１５−２２１（２００１），引用により本明細書に編入される）。放出されたＧａｓ６の、血小板表面上に発現される受容体チロシンキナーゼ（Ａｘｌ，Ｓｋｙ，Ｍｅｒ）への結合は、完全な脱顆粒化及びこれらの細胞の強固なマクロ凝集の形成を誘導する。体液の増幅機構においては、プロトロンビナーゼ複合体が活性化された血小板及び微小胞の表面上に形成される。これによりトロンビンとフィブリンが生じる。トロンビンはそれ自体有力な血小板アクティベーター並びにＧａｓ６の放出の誘導因子である（Ｉｓｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｎａｋａｎｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４６：１９７−１９９（２９９９）、引用により本明細書に編入される）。完全に活性化された血小板はその周囲に付着したフィブリンの新たなネットワークに強く結合する。細胞組織学上の観察は、血小板とフィブリンの両方がヒトにおける安定な冠動脈の血栓の形成に必要であることを示す（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｖａｎｓｔｒａｅｔｅ ｅｔ ａｌ．（編纂）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｔｈｒｏｍｂｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８），ｐｐ．４５−５８，引用により本明細書に編入される）。別の血小板接着分子であるアンフォテリンは活性化の間に血小板表面に位置を変え、そしてアニオン性ホスホリピッドを結合する（Ｒｏｕｈａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．８４：１０８７−１０９４（２０００）、引用により本明細書に編入される）。Ｇａｓ６のように、アンフォテリンは血小板の凝集の間にブリッジを形成できた。
【０００８】
これらの増幅機構を阻害するが初期血小板凝集を阻害せず、それにより出血を増加させることなく血栓症を防ぐことができるか否かという疑問が生じる。細胞の増幅の重要性は、Ｇａｓ６の標的化不活性化によるマウスの研究により最近確立されてきた（Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。Ｇａｓ６−／−マウスはコラーゲンとエピネフィリンにより誘導された血栓症と塞栓症に対して保護されることがわかった。しかしながら、Ｇａｓ６−／−マウスは自発的な出血を患うことがなく、尾部のクリッピング後に通常の出血があった。さらに、Ｇａｓ６に対する抗体は、インビトロにて血小板の凝集を、並びにコラーゲン及びエピネフィリンによりインビボにて誘導された血栓症を阻害した。原則として、そのような抗体、又は受容体チロシンキナーゼに結合するＧａｓ６に関して競合するリガンドは、血栓症を阻害するのに使用されるかもしれない。しかしながら、体液の増幅の能力に照らすと、その工程を阻害することは好ましいかもしれない。理想的には、そのような阻害剤はＧａｓ６−媒介性細胞増幅機構に対して、付加的な抑圧活性も有するはずである。
【０００９】
血小板凝集の細胞性増幅及び体液性増幅の両方を防ぐ戦略は、アネキシンにより提供され、その１０の高相同性の抗血栓蛋白質のファミリーがいくつかのヒト組織内で発現される（Ｂｅｎｚ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：１７７−１８３（１９９７）、引用により本明細書に編入される）。アネキシンは、共に血液の凝固に必要なカルシウムと陰性荷電ホスホリピッドの結合特性を共有する。生理学上の条件下では、陰性荷電ホスホリピッドは、主に、活性化されたか又は損傷した細胞膜中でホスファチジルセリン（ＰＳ）により供給される。完全な細胞においては、ＰＳはプラズマ膜の二層の内部のリーフレットに閉じ込められて、表面上には接近できない。血小板が活性化されたら、それらの表面上に接近可能なＰＳの量、即ちアネキシン結合の程度が大いに増大する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．６９：２８９−２９６（１９９３）、引用により本明細書に編入される）。血小板の活性化の間、微小胞がそれらの表面から放出されて、前凝血活性を有するアニオン性ホスホリピッドを発現する表面積を大いに増大させる（Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２５７７−２５８２（１９９９）；Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１３５：６６−７２（２０００）、共に引用により本明細書に編入される）。これらは、血小板媒介性の動脈の血栓の拡大において重要な役割を担うかもしれない。
【００１０】
血液の凝血カスケードに関与する蛋白質（因子Ｘ，Ｘａ，及びＶａ）は、それらの表面上の膜生産（bearing）ＰＳに、及び互いに、結合して、安定で強固に結合したプロトロンビナーゼ複合体を形成する。ＩＩ，Ｖ，及びＶＩＩを含むいくつかのアネキシンは高い親和性でＰＳを結合して、それによりプロトロンビナーゼ複合体の形成を防いで、抗血栓活性を及ぼす。アネキシンＶはＰＳを極めて高い親和性（Ｋｄ＝１．７ｍｍｏｌ／Ｌ）にて結合するが、陰性荷電ホスホリピッドに関する因子Ｘ，Ｘａ，及びＶａの親和性よりも高い（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｔａｉｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７４２０−１７４２３）１９９０）、引用により本明細書に編入される）。活性化されたか又は損傷を受けた内皮細胞上の組織因子依存性の血液凝固も、ＰＳの表面発現を必要とし、そしてアネキシンＶはこのプロセスを阻害することができる（ｖａｎ Ｈｅｅｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：８２４−８３０（１９９４），引用により本明細書に編入される）が、アネキシンはプロトロンビナーゼ生成の阻害におけるよりも、この活性において有効性が劣る（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６２：５１７−５３１（１９９２）、引用により本明細書に編入される）。
【００１１】
アネキシンＶの活性化された血小板への結合及び損傷を受けた細胞への結合は、血栓における蛋白質の選択的な停留をおそらくは説明する。これは、静脈及び動脈の血栓症の実験動物モデルにおいて示されており（Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２：３１１３−３１２１（１９９５）；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９６：２３３９−２３４７（１９９７）、共に引用により本明細書に編入される）、そして標識されたアネキシンは、ノイズの減少と安全性の増加をもって、ヒトにおける血管の血栓の医療用イメージングに関して提案されてきた（Ｒｅｎｏ ａｎｄ Ｋａｓｉｎａ，国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７５９９（ＷＯ ９５／３４３１５）（１９９５年１２月２１日公開）、引用により本明細書に編入される）。血栓への有力な抗血栓剤、例えばアネキシンＶの結合は、血栓症の拡大又は再発を防ぐ戦略を提供する。一過性の心筋の貧血もアネキシンＶの結合を増加させる（Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：１５６４−１５６８（２０００），引用により本明細書に編入される）。ヒトにおけるアネキシンＶイメージングは、心内膜心筋の生検が血管の拒絶を示したときに、移植された心臓において蛋白質の結合の増加を示した（Ａｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．４１（補遺５）：１２７Ｐ（２０００），引用により本明細書に編入される）。この結合は、おそらく、損傷を受けた内皮細胞並びに拒絶されつつある心臓内のアポトーシス性筋細胞の表面上に外面化されたＰＳのためである。当然の結果として、心筋梗塞の後のアネキシンの投与は血小板細胞及び内皮細胞の両方の上の前血栓症複合体の形成を妨害して、それにより、血栓症の拡大と再発を防ぐ。アネキシンＶの結合もヒトにおける大脳の低酸素症後に増加し（Ｄ’Ａｒｃｅｕｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２０００：２６９２−２７００（２０００），引用により本明細書に編入される）、ＴＩＡ後のアネキシンの投与が成熟期の（full-blown）脈拍を生じさせる見込みを低下させるかもしれないという仮説を支持する。
【００１２】
アネキシンは、いくつかのインビトロトロンビン依存性アッセイにおいて、並びに静脈血栓症（Ｒｏｍｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．６１：９３−１０４（１９９１）；Ｖａｎ Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６９：２２７−２３０（１９９３），共に引用により本明細書に編入される）及び動脈血栓症（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）の実験動物モデルにおいて、抗凝血活性を示した。注目すべきは、抗血栓症用量中のアネキシンは治療されたウサギにおいて伝統的なエクスビボのクロット形成試験に対して証明可能な効果を有さず（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）、そして治療されたラットの出血時間を顕著に延長させなかった（Ｖａｎ Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。治療されたウサギにおいて、アネキシンは外科手術の切開部への出血を増加させなかった（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）。これまでに調査された全ての薬剤の間で唯一、アネキシンは出血を増加させることなしに、抗血栓症活性を発揮する。アネキシンは、トロンビン以外のアゴニストにより引き起こされる血小板の凝集を阻害しなかった（ｖａｎ Ｈｅｅｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）が、血小板の凝集は主要な止血機構である。損傷した血管の壁及び血管外組織においては、組織因子／ＶＩＩａ複合体も止血作用を発揮し、そしてこのシステムはプロトロンビナーゼ複合体よりもアネキシンＶによる阻害に対する感受性が劣る（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。これは、可能な限りの血管区画への投与されたアネキシンＶの閉じ込めに関する一つの議論である；出血の危険は低下しそうである。
【００１３】
血栓症の防御に関するそのような有望な結果にも拘わらず、アネキシンの治療上の使用に付随する主要な問題は、循環におけるそれらの短い半減期であり、実験動物においては５から１５分であると計算される（Ｒｏｍｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）；アネキシンＶもヒトの循環において短い半減期を有する（Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．４１（補遺５）：１４９Ｐ（２０００），引用により本明細書に編入される）。アネキシンのほとんどは尿中へ失われ、３６ｋＤａ蛋白質と予測される（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）。よって、血管区画から血管外の区画及び尿へのアネキシンの損失を防ぎ、それにより一回の注射後に抗血栓症活性を延長させる方法に関する要求が存在する。
発明の概要
本発明は、出血を増加させることなく動脈又は静脈の血栓症を防ぐための組成物及び方法を提供する。組換えヒトアネキシン、好ましくはアネキシンＶを、血管区画内でのその半減期を延長させるように修飾する。これは様々な様式により達成できる；３つの好ましい態様は、ポリエチレングリコールにカップリングさせたアネキシン、アネキシンのヘテロポリマー又はホモポリマー、及びアネキシンと別の蛋白質（例えば、イムノグロブリンのＦｃ部分）との融合蛋白質である。修飾されたアネキシンは高い親和性をもって、活性化された血小板又は損傷した細胞の表面上のホスファチジルセリンに結合し、それにより、Ｇａｓ６並びに前凝血蛋白質の結合及びプロトロンビナーゼ複合体の形成を防ぐ。修飾されたアネキシンは、よって、血小板の凝固が増幅される細胞機構及び体液機構の両方を阻害して、それにより血栓症を防ぐ。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングしたアネキシン蛋白質、好ましくはアネキシンＶを含む、単離された、修飾されたアネキシン蛋白質を提供する。好ましくは、少なくとも２つのＰＥＧ鎖を単一のアネキシン分子にカップリングするが、各ＰＥＧ鎖は少なくとも約５ｋＤａ、好ましくは約１０ｋＤａ、そしてもっとも好ましくは少なくとも１５ｋＤａの分子量を有する。別の態様において、単離された修飾アネキシン蛋白質は、少なくとも一つの別の蛋白質、例えば別のアネキシン蛋白質（ホモダイマーを形成する）又はイムノグロブリンのＦｃ部分にカップリングされたアネキシン蛋白質を含む。別の蛋白質は、好ましくは、少なくとも３０ｋＤａの分子量を有する。本発明により提供されるのは、発明の修飾されたアネキシン蛋白質のいずれかを抗血栓に有効な量で含む薬剤組成物でもある。
【００１５】
発明の方法において、修飾されたアネキシンは、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質のいずれか一つを抗血栓に有効な量で含む薬剤組成物中にて、血栓症の危険性のある被験者に投与される。例えば、上記薬剤組成物は、動脈の血栓症、例えば冠動脈の血栓症、大脳の血栓症、又は一過性の大脳性貧血の発作の後に投与することができる。それは、静脈の血栓症に付随した外科手術後に投与することもできる。付加的に、それは、動脈血栓症又は静脈血栓症を有する患者、例えば糖尿病、妊婦又は分娩の被験者に投与することもできる。
【００１６】
また、アネキシンのホモダイマーをコードする単離された核酸分子、当該核酸の少なくとも一部を含む組換え分子、及び当該核酸分子の少なくとも一部を含む組換え細胞も、本発明により提供される。上記組換え細胞は、アネキシンホモダイマーを生産するために本発明の方法において適切な条件下で培養する。
【００１７】
本発明は、血栓症試験システムを用いて血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質をスクリーニングする方法も提供する。上記試験システムを試験修飾アネキシン蛋白質と接触させ、その後、血栓溶解活性を評価して、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下で上記システムの活性と比較する。好ましくは、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を測定する。また、活性化された血小板を試験修飾アネキシン蛋白質に接触させて、血小板結合と蛋白質Ｓ−結合活性を評価することにより修飾アネキシン蛋白質を同定する方法も提供される。
【００１８】
また、修飾されたアネキシン蛋白質をインビボにてスクリーニングする方法も本発明により提供される。この方法においては、血栓症動物モデルを試験修飾アネキシン蛋白質に接触させて、その後、試験修飾アネキシン蛋白質のインビボ抗凝血活性及び出血における増加を評価する。抗凝血の活性と時間をアネキシンの抗凝血の活性と時間と比較して、出血量を試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での動物モデルにおける出血と比較する。
発明の詳細な説明
本発明は、出血を増加させることなく哺乳類において血栓症を防ぐための化合物及び方法を提供する。発明は、血小板凝集の主要な機構が動脈と静脈の血栓の形成に必要な血小板凝集を増幅させる機構とは異なるという認識に一部基づく。血栓の形成は阻害するが主要な血小板の凝集は阻害しないことにより、血栓症が出血の増加なしに防ぐことができる。
【００１９】
発明の化合物は、ヒト又は他の動物において生成物の半減期を増加させるように修飾されたアネキシンアミノ酸配列を含む如何なる生成物も含む。「アミノ酸配列」と本明細書にて詳説して天然に生じる蛋白質分子のアミノ酸配列に言及する場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語、例えば「ポリペプチド」又は「蛋白質」は、詳説された蛋白質に関連した、完全な、天然アミノ酸配列に対するアミノ酸配列に限定されることを意図しない。アネキシンは相同なホスホリピッド結合膜蛋白質のファミリーであり、そのうちの１０個は哺乳類において発現される別々の遺伝子を表す（Ｂｅｎｚ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ，１９９７）。結晶解析は、アネキシンＶに代表される、これまでに研究されたファミリーメンバーの全てに関する共通の三次構造を明らかにした（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：３８６７（１９９０），引用により本明細書に編入される）。コアのドメインは、ホスホリピッド膜に密に向かい合うことができる凹型の円盤状の構造である。それは４つのサブドメインを含み、各々が５つのαヘリックスからなる７０アミノ酸のアネキシンリピートからなる。アネキシンは、異なるアネキシンの間では、長さ及びアミノ酸配列が変化する、より親水性の尾部ドメインも有する。アネキシンをコードする遺伝子の配列はよく知られている（例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：８０８７−８０９２（１９８７）（アネキシンＶ），引用により本明細書に編入される）。
【００２０】
本発明においては、アネキシン蛋白質を修飾することにより、ヒト又は他の動物においてそれらの半減期を増加させる。好ましい態様において、アネキシン蛋白質はアネキシンＶである。他の適切なアネキシン修飾はその有効なサイズの増加であり、血管の区画からの血管外の区画及び尿への損失を防ぎ、それにより１回の注射の後の抗血栓活性を延長させる。ホスファチジルセリンとの十分な結合親和性を保持する有効サイズの如何なる増加も本発明の範囲内である。
【００２１】
発明の一つの態様においては、修飾されたアネキシンがホスファチジルセリン（ＰＳ）−結合アッセイにおいてアネキシンの機能を実行することが可能なように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングされた組換えヒトアネキシンを修飾アネキシンが含む。静脈内投与されたアネキシンＰＥＧコンジュゲートの抗血栓作用が遊離のアネキシンの作用に比較して延長される。ＰＥＧにカップリングされた組換えアネキシン蛋白質は、アネキシンＶ蛋白質又は別のアネキシン蛋白質であり得る。
【００２２】
ＰＥＧは、直鎖又は幾つかの場合には分枝鎖の何れかの末端上のヒドロキシル基で終わるエチレンオキシドの繰返しユニットからなる。カップリングしたＰＥＧのサイズと分子量は、それが含むエチレンオキシドのユニットの数に依存し、選択することができる。本発明に関しては、アネキシン分子あたり、何れのサイズのＰＥＧも何れの数のＰＥＧ鎖も、アネキシンに比較して、修飾されたアネキシンの半減期が増加するが、修飾分子のＰＳへの結合機能を保持するように使用することができる。上記のとおり、十分な結合は、未修飾アネキシンの結合からは低下した結合を含むが、Ｇａｓ６とプロトロンビナーゼ複合体の因子の結合とは競合し、よって、血栓症を防ぐことができる。コンジュゲートしたＰＥＧの最適な分子量はＰＥＧ鎖の数と共に変化する。もっとも好ましい態様において、各々少なくとも約１５ｋＤａの分子量の２つのＰＥＧ分子を各アネキシン分子とカップリングさせる。上記ＰＥＧ分子は直鎖又は分枝であり得る。アネキシンのＰＳへのカルシウム依存性結合は、カップリングしたＰＥＧ分子のサイズばかりでなく、ＰＥＧが結合する蛋白質の位置にも影響される。最適な選択は、所望の特性が保持されることを確実にする。ＰＥＧ結合部位の選択は、当該分子の３次元構造の知見及び当該分子のホスホリピッド膜との相互作用の変異分析及び結晶学分析により促進される（Ｃａｍｐｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：８００４−８００８（１９９８），引用により本明細書に編入される）。
【００２３】
薬剤送達のエリアにおいては、ＰＥＧ誘導体が蛋白質への共有結合に広く使用されることにより、可溶性を増強し、並びに免疫原性、蛋白質溶解、及び腎臓浄化値を低下させてきた。ＰＥＧにカップリングさせた組換え生成物の優秀な臨床上の効果は、よく確立されている。例えば、ＰＥＧ−インターフェロンアルファ−２ａを１週に一度投与すると、Ｃ型肝炎ウイルスに対して遊離インターフェロンの３週用量よりも顕著に有効である（Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１６７３−１６８０（２０００），引用により本明細書に編入される）。ＰＥＧへのカップリングはインビボにおいて組換え蛋白質の半減期を延長させるため（Ｋｎａｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２７９６−２８０４（１９８８），引用により本明細書に編入される）並びに組換え蛋白質の酵素分解を防いで相同な生成物においてときどき観察された免疫原性を低下させるため（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６），ｐｐ．１７３−１７６，引用により本明細書に編入される）に、使用されてきた。
【００２４】
発明の別の態様において、修飾されたアネキシン蛋白質は、増加した有効サイズを有するアネキシン蛋白質のポリマーである。有効なサイズの増加は血管区画内での延長された半減期及び延長された抗血栓活性をもたらすと信じられる。一つのそのような修飾アネキシンは、アネキシンＶのダイマーである。別のそのようなポリマーは、アネキシンＩＩと、カルシウム結合蛋白質のＳ１００ファミリーのメンバーであるｐ１１とのヘテロテトラマーである。Ｓ１００のアネキシンへの結合は、アネキシンのＣａ2+への親和性を増加させる。アネキシンのホモポリマー又はヘテロポリマーは、バイオコンジュゲート法又は組換え法により生成することができて、それ自身又はＰＥＧコンジュゲート形態において投与することができる。
【００２５】
発明の別の態様において、組換えアネキシンは、別の蛋白質、例えばイムノグロブリンのＦｃ部分と共に発現されるか、又は化学的にカップリングされる。そのような発現又はカップリングは分子の有効サイズを増加させ、血管区画からのアネキシンの損失を防いで、その抗凝血作用を延長させる。
【００２６】
好ましくは、発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、アネキシンＩＩ，アネキシンＶ、又はアネキシンＶＩＩＩを含む。好ましい態様において、上記蛋白質は修飾されたヒトアネキシンである。特に好ましい態様において、上記の修飾されたアネキシンは組換えヒトアネキシンを含む。本発明によれば、単離されたか又は生物学上純粋な蛋白質は、その天然の環境から取り出された蛋白質である。そういうものとして、「単離された」及び「生物学上純粋な」は、蛋白質が精製された程度を必ずしも反映はしない。本発明の単離された修飾アネキシン蛋白質は、その天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生成できるか、又は化学合成により生成できる。本明細書にて使用されるとおり、単離された修飾アネキシン蛋白質は完全長の修飾蛋白質であるか又はそのような蛋白質のあらゆる相同体であり得る。それは、（例えば、ペギル化された（pegylated）蛋白質に関して）修飾された完全長の蛋白質であるか又はそのような蛋白質の修飾された相同体でもあり得る。
【００２７】
本発明の蛋白質相同体の最小のサイズは、相当する天然蛋白質をコードする核酸分子の相補配列を有する、安定なハイブリッドを形成できる核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。そういうものとして、そのような蛋白質相同体をコードする核酸分子のサイズは、上記核酸分子と相補配列の間の核酸の組成及びパーセント相同性並びにハイブリダイゼーション条件それ自体に依存する（例えば、温度、塩濃度、及びホルムアミド濃度）。そのような核酸分子の最小サイズは、典型的には、上記核酸がＧＣリッチであれば少なくとも約１２から約１５ヌクレオチドの長さであり、上記核酸がＡＴリッチであれば少なくとも約１５から約１７ヌクレオチドの長さである。そいうものとして、本発明の蛋白質相同体をコードするのに使用される核酸分子の最小サイズは、約１２から約１８のヌクレオチドの長さである。上記核酸分子が遺伝子の一部、遺伝子全体又は複数の遺伝子又はその一部を含むことにおいて、そのような核酸分子の最大サイズに制限はない。同様に、本発明のアネキシン蛋白質相同体又は修飾されたアネキシン蛋白質相同体の最小サイズは約４から約６アミノ酸の長さであり、好ましいサイズは完全長、多価（即ち、一つより多いドメインを有する融合蛋白質であって、各々が機能を有する）蛋白質、そのような蛋白質の機能部分が望まれるか否かに依存する。本発明のアネキシン及び修飾されたアネキシン相同体は、好ましくは、天然蛋白質に相当する活性を有し、血栓の形成を防ぐことにおいてアネキシン蛋白質の活性を担うことが可能なようなものである。
【００２８】
アネキシン蛋白質及び修飾されたアネキシン相同体は、天然の対立遺伝子又は天然変異の結果であり得る。本発明の蛋白質相同体は当業界公知の技術を用いて生産することもでき、限定ではないが、例えば古典的なＤＮＡ技術又は組換えＤＮＡ技術を用いてランダム又は標的化変異導入を作用させる、蛋白質に対する直接の修飾又は蛋白質をコードする核酸に対する修飾を含む。
【００２９】
アミノ酸配列の配列番号：３、配列番号：６、又はこれらの配列の何れかを含む蛋白質をコードする核酸分子のあらゆるバリアントによりコードされた蛋白質に、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そしてもっとも好ましくは少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む修飾アネキシン蛋白質も好ましい。アミノ酸配列間及び核酸配列間のパーセント同一性を決定する方法は、当業者に知られている。配列間のパーセント同一性を決定するための好ましい方法は、コンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧ（登録商標）ウイスコンシンパッケージ（商標名）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社より利用可能）、ＤＮＡｓｉｓ（登録商標）プログラム（ヒタチソフトウエア、Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，ＣＡより利用可能）、ベクターＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ（インフォマックス社、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより利用可能）、又はＮＣＢＩウエブサイト上で利用可能なＢＬＡＳＴソフトウエアを含む。
【００３０】
一つの態様において、好ましい修飾アネキシン蛋白質は、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３００アミノ酸、そしてもっとも好ましくは少なくとも約３１９アミノ酸又は完全長のアネキシン蛋白質のアミノ酸を含み、どれでも短いものである。別の態様において、好ましいアネキシン蛋白質は、完全長の蛋白質、即ち、完全長のコード領域によりコードされる蛋白質、又はその翻訳後修飾された蛋白質、例えば開始メチオニン及び／又はシグナル配列又は「プロ」配列が除去された成熟蛋白質を含む。
【００３１】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質の断片は、好ましくは、少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１００アミノ酸の長さを含む。
【００３２】
一つの態様において、本発明の好ましい単離された修飾アネキシン蛋白質は、核酸配列の配列番号：４を有する核酸分子又はこの配列を有する核酸分子の対立遺伝子バリアントによりコードされた修飾蛋白質である。あるいは、修飾されたアネキシン蛋白質は、核酸配列の配列番号：１を有する核酸分子又はこの配列を有する核酸分子の対立遺伝子バリアントによりコードされた蛋白質を含む。
【００３３】
本発明の一つの態様は、アネキシン遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされた非天然修飾アネキシン蛋白質を含む。本明細書にて使用されるとおり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子が類似の核酸配列を有する分子を同定するために使用される標準のハイブリダイゼーション条件を意味する。そのような標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に開示されており、引用により本明細書に編入される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応において釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約７０％核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容する。３０％又はそれ未満のヌクレオチドのミスマッチを許容するハイブリダイゼーションを達成するために適切なハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を計算するための式は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）に開示されており、引用により本明細書に編入される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容することになる。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容することになる。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容することになる。
【００３４】
好ましい修飾アネキシン蛋白質は、少なくとも約５０ヌクレオチドであり、そして好ましくは約２０％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約１５％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約１０％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約５％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、そしてさらにより好ましくは約２％の塩基対のミスマッチを許容する条件下にて、配列番号：１、配列番号：４からなる群から選択される核酸分子、又はこれらの分子の何れかの相補体とハイブリダイズする核酸分子である。
【００３５】
本明細書にて使用されるとおり、アネキシン遺伝子は、天然のアネキシン遺伝子に関連する全ての核酸配列、例えば、その遺伝子によりコードされるアネキシン蛋白質の生産を調節する制御領域（例えば、限定ではないが、翻訳、転写又は翻訳後調節領域）並びにコーディング領域それ自体を含む。一つの態様において、アネキシン遺伝子は核酸配列、配列番号：１を含む。核酸配列決定技術は完全にエラーがないわけではないので、配列番号：１（並びに本明細書に提示される他の配列）は、せいぜい、本発明のアネキシン蛋白質をコードする核酸分子の見かけ上の核酸配列を代表することに注意するべきである。
別の態様において、アネキシン遺伝子は、配列番号：１に類似であるが同一ではない配列を含む全ての対立遺伝子バリアントであり得る。配列番号：１を含むアネキシン遺伝子の全ての対立遺伝子バリアントは、配列番号：１を含むが、例えば変異又は組換えにより引き起こされる天然の変化により類似ではあるが同一ではない配列を有する遺伝子として、ゲノム内の同じ位置（又は座）にて本質的に生じる遺伝子である。対立遺伝子バリアントは、典型的には、それらが比較される遺伝子によりコードされる蛋白質と類似の活性を有する蛋白質をコードする。蛋白質バリアントは、遺伝子の５’又は３’未翻訳領域内の変化も含み得る（例えば、制御調節領域中）。対立遺伝子バリアントは、当業者にはよく知られており、既知の（given）ヒトにおいて見いだされることが予測されるはずであるが、ゲノムが二倍体であり、及び又は、２人又はそれ以上のヒトを含む集団の間の中にあるからである。
【００３６】
本発明の単離された修飾アネキシン蛋白質は、その天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生産できるか、又は化学合成により生産できる。本明細書にて使用されるとおり、単離された修飾アネキシン蛋白質は、完全長の蛋白質又はそのような蛋白質のあらゆる相同体を含み得る。アネキシン及び修飾されたアネキシン相同体の例は、アミノ酸が欠失するか（例えば、蛋白質の末端削除バージョン、例えばペプチド又はインテインが除去されたか又は２つのエクステインが連結した場合の蛋白質スプライシング反応による）、挿入されるか、転位するか、置換されるか、及び／又は誘導された（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの追加による）アネキシン及び修飾されたアネキシン蛋白質を含み、当該相同体がアネキシン蛋白質に対する免疫応答性を引き出すことが可能な少なくとも一つのエピトープを含むようなものである。即ち、当該相同体を動物に対して免疫源として当業者に知られた技術を用いて投与する場合、動物は、アネキシン蛋白質の少なくとも一つのエピトープに対して体液性及び／又は細胞性の免疫応答を生じることになる。アネキシン及び修飾されたアネキシン相同体は、免疫血清に選択的に結合するそれらの能力により選択することもできる。そのような活性を測定する方法は、本明細書に開示される。アネキシン及び修飾されたアネキシン相同体、機能アッセイにおいて天然アネキシンの機能を果たすことができる蛋白質も含む；即ち、ホスファチジルセリン又は活性化された血小板に結合できるか又は抗血栓活性を呈することができる蛋白質である。そのようなアッセイの方法は、実施例のセクション及び本明細書のどこかに記載される。
【００３７】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、機能アッセイにおいてアネキシン蛋白質の機能を果たすその能力により同定してよい。「機能アッセイにおいてその蛋白質の機能を果たすことができる」なる句は、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約１０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約２０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約３０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約４０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約５０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約６０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約７０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約８０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約９０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。機能アッセイの例は本明細書に記載される。
【００３８】
本発明の単離された蛋白質は様々な方法により生産することができ、細菌からそのような蛋白質を回収し、そしてそのような蛋白質を組換えにより生産することを含む。本発明の一つの態様は、組換えＤＮＡ技術を用いた本発明の単離修飾アネキシン蛋白質を生産する方法である。そのような方法は、（ａ）本発明の修飾されたアネキシン蛋白質をコードする核酸分子を含む組換え細胞を培養し、そして（ｂ）蛋白質をそれから回収する工程を含む。組換え細胞を生産すること及びそれの培養についての詳細は、以下に提示される。「蛋白質を回収する」なる句は、蛋白質を含む全発酵培地を回収することを単に意味し、そして分離又は精製の追加工程を含意する必要はない。本発明の蛋白質は、様々な標準の蛋白質精製技術を用いて精製することができる。
【００３９】
本発明の単離された蛋白質は、好ましくは、「実質上精製された」形態にて復活させる（retrieved）。本明細書にて使用されるとおり、「実質上精製された」なる句は、機能アッセイにおいて蛋白質の有効な使用を可能にさせる精製度を意味する。
修飾されたアネキシン核酸分子又は遺伝子
本発明の別の態様は、アネキシンＶのホモダイマーのような修飾されたアネキシン蛋白質をコードする遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、単離された核酸分子である。そのような核酸分子は、修飾されたアネキシン核酸分子とも呼ばれる。特に好ましいのは、ストリンジェント条件下で修飾されたアネキシン遺伝子とハイブリダイズする単離された核酸分子である。そのような遺伝子の特性は、本明細書に開示される。本発明によれば、単離された核酸分子は、その天然環境から取り出された核酸分子である（即ち、人の操作に供された）。そいうものとして、「単離された」は、上記核酸分子が精製された程度を反映しない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ，又はＤＮＡ又はＲＮＡの何れかの誘導体を含み得る。
【００４０】
上記のとおり、修飾されたアネキシン遺伝子は、天然アネキシン遺伝子に関連する全ての核酸配列、例えばその遺伝子によりコードされるアネキシン蛋白質の生産を調節する制御領域（例えば、限定ではないが、翻訳、転写又は翻訳後調節領域）並びにコーディング領域それ自体を含む。本発明の核酸分子は、単離された修飾アネキシン核酸分子又はその相同体であり得る。本発明の核酸分子は、一つ又はそれ以上の制御領域、完全長又は部分的なコーディング領域、またそれらの組み合わせを含み得る。本発明の修飾されたアネキシン核酸分子の最小サイズは、対応する天然遺伝子とストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成することができる最小のサイズである。アネキシン核酸分子は、ハイブリッド蛋白質、融合蛋白質、多価蛋白質又は末端削除された断片をコードする核酸分子も含み得る。
【００４１】
本発明の単離された核酸分子は、全部の（即ち、完全な）遺伝子又はその遺伝子と安定なハイブリッドを形成できる一部の何れかとしてその天然源から得ることができる。本明細書にて使用されるとおり、実在物の「少なくとも一部（portion）」なる句は、その実在物の機能的な側面を有するのに少なくとも十分なかなりの量の（an amount of）実在物を意味する。例えば、本明細書にて使用される、核酸配列の少なくとも一部とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相当する遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができる、かなりの量の核酸配列である。
【００４２】
本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローン化等）又は化学合成を用いて生産することもできる。単離された修飾アネキシン核酸分子は、天然の核酸分子及びその相同体を含み、限定ではないが、ヌクレオチドが挿入されるか、欠失するか、置換されるか及び／又は転位した天然対立遺伝子バリアント及び修飾された核酸分子を含み、そのような修飾が、本発明の修飾アネキシン蛋白質をコードするか又は天然核酸分子単離物とストリンジェントな条件下で安定なハイブリッドを形成する、核酸分子の能力を実質上干渉しないようなものである。
【００４３】
修飾されたアネキシン核酸分子相同体は、当業者に知られた多数の方法を用いて生産できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照）。例えば、核酸分子は、様々な技術を用いて修飾することができ、限定ではないが、古典的な変異導入技術及び組換えＤＮＡ技術、例えば、部位特異的変異導入、核酸分子の化学処理による変異の導入、核酸断片の制限酵素分割、核酸断片の連結、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の変異導入、オリゴヌクレオチド混合物の合成、及び混合群の連結による核酸分子の混合物及びその組み合わせの「構築（build）」を含む。核酸分子相同体は、核酸によりコードされる蛋白質の機能に関してのスクリーニング（例えば、アネキシン蛋白質に対する免疫応答を引き出すか及び／又はクロット形成アッセイにおいて機能する相同体の能力）及び／又はストリンジェント条件下での単離されたアネキシンコード核酸とのハイブリダイゼーションにより、修飾された核酸の混合物から選択することができる。
【００４４】
本発明の単離された修飾アネキシン核酸分子は、本発明の少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質をコードする核酸配列を含むことができ、そのような蛋白質の例は本明細書に開示される。「核酸分子」なる句は主として物質の核酸分子を意味し、そして「核酸配列」なる句は主として核酸分子上の配列を意味するが、２つの句は、特に核酸分子又は核酸配列であって修飾アネキシン蛋白質をコードできるものに関しては、交換可能に使用することができる。
【００４５】
本発明の一つの態様は、修飾されたアネキシン蛋白質の少なくとも一部をコードする核酸鎖又はその相同体又はそのような核酸鎖に対する相補体に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズできる修飾アネキシン核酸分子である。本発明の何れかの核酸配列の核酸配列相補体は、配列が引用される鎖に相補な（即ち、完全な二重鎖を形成できる）核酸鎖の核酸配列を意味する。配列番号により表される、一方の鎖に関して核酸配列を決定する、本発明の二重鎖核酸分子は、配列番号の相補体である配列を有する相補鎖も含む。そいうものとして、本発明の核酸分子は、二重鎖又は一本鎖の何れかであり得て、本明細書にて記載された所定の配列番号及び／又は本明細書にて示されていてもいなくてもよいその配列の相補体の何れかとストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補配列を演繹する方法は、当業者には知られている。好ましいのは、修飾されたアネキシン蛋白質の少なくとも一部をコードする核酸配列の対応する一つ又は複数の領域と、少なくとも約６５パーセント、好ましくは少なくとも約７０パーセント、より好ましくは約７５パーセント、より好ましくは少なくとも約８０パーセント、より好ましくは少なくとも約８５パーセント、より好ましくは少なくとも約９０パーセント、そしてよりさらに好ましくは少なくとも約９５パーセント相同性を有する核酸配列を含む修飾されたアネキシン核酸分子を含む。特に好ましいのは、アネキシン蛋白質又はその相同体のホモダイマーをコードすることができる修飾されたアネキシン核酸分子である好ましいアネキシン核酸分子は、配列番号：４及び配列番号：４の対立遺伝子バリアントを含む。
【００４６】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質の核酸分子を知ることは、当業者が、その核酸分子のコピーを作成すること並びにアネキシン蛋白質コーディング遺伝子（例えば、翻訳開始部位及び／又は転写及び／又は翻訳調節領域を含む核酸分子）及び／又はアネキシン核酸分子相同体の追加の部分を含む核酸分子を得ることを可能にさせる。本発明のアネキシン蛋白質のアミノ酸配列の一部を知ることは、当業者が、そのようなアネキシン蛋白質をコードする核酸配列をクローン化することを可能にさせる。さらに、所望の修飾されたアネキシン核酸分子は、本発明のアネキシン蛋白質に結合する抗体により適当な発現ライブラリーをスクリーニングすること；本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いた慣用クローン化技術により適当なライブラリー又はＤＮＡをスクリーニング；及び本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた適当なライブラリー、又はＲＮＡ又はＤＮＡのＰＣＲ増幅（ゲノミック及び／又はｃＤＮＡライブラリーを用いることができる）を含む様々な方法において得ることができる。
【００４７】
本発明は、修飾されたアネキシン蛋白質の少なくとも一部をコードする本発明の他の好ましくはより長い核酸分子の相補領域とストリンジェント条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドである核酸分子も含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は何れかの誘導体であり得る。そのようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、与えられたオリゴヌクレオチドと、本発明の別の核酸分子上の相補配列の間で安定なハイブリッドを形成するために必要なサイズである。
【００４８】
最小サイズの特徴は、本明細書に開示される。オリゴヌクレオチドのサイズは、本発明に従ったオリゴヌクレオチドの使用にも十分でなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、様々な応用、例えば限定ではないが、追加の核酸分子を同定するためのプローブとして、核酸分子を増幅又は伸長合成するためのプライマーとして、又は修飾されたアネキシンの生産を変調するための治療上の応用において使用することができる。そのような治療上の応用は、例えば、アンチセンス−、３重鎖形成−、リボザイム−、及び／又はＲＮＡ薬剤−に基づく技術におけるそのようなオリゴヌクレオチドの使用を含む。本発明は、よって、そのような技術の一つ又は複数の使用による修飾アネキシン蛋白質の生産を変調するための、そのようなオリゴヌクレオチド及び方法を含む。
天然野生型細菌細胞及び組換え分子及び細胞
本発明は、上記核酸分子を宿主細胞へ送達することができるあらゆるベクターに挿入された本発明の修飾されたアネキシン核酸分子を含む、組換えベクターも含む。そのようなベクターは、異種核酸配列、即ち本発明の修飾されたアネキシン核酸分子に隣接した、天然では見いだされない核酸配列を含む。当該ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか、原核又は真核の何れか、そして典型的にはウイルス又はプラスミドであり得る。組換えベクターは、本発明の修飾されたアネキシン核酸分子のクローン化、配列決定、及び／又は他の操作において使用することができる。本明細書において組換え分子と呼ばれて以下に詳細に説明される一つの種類の組換えベクターを、本発明の核酸分子の発現において使用することができる。好ましい組換えベクターは、形質転換された細胞中で複製することができる。本発明の組換えベクター中に含まれる好ましい核酸分子は、本明細書に開示される。
【００４９】
これまで開示されたとおり、本発明の一つの態様は、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質を生産する方法であって、当該蛋白質を生産するのに有効な条件下で当該蛋白質を発現する細胞を培養し、そして当該蛋白質を回収することによる。別の態様において、上記方法は、アネキシン蛋白質を生産するのに有効な条件下で蛋白質を発現できる細胞を培養し、当該蛋白質を回収し、そしてその有効なサイズを増加させるための因子（agent）にそれをカップリングさせることによりアネキシン蛋白質を生産することを含む。
【００５０】
好ましい態様において、培養する細胞は天然の細菌細胞であり、そして修飾されたアネキシン蛋白質をこれらの細胞から単離する。別の態様において、培養される好ましい細胞は、修飾されたアネキシン蛋白質を発現できる組換え細胞であり、そして当該組換え細胞は本発明の核酸分子一つ又は複数により宿主細胞を形質転換することにより製造される。細胞の核酸分子による形質転換は、核酸分子が細胞に挿入できるあらゆる方法により達成できる。形質転換技術は、限定ではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含む。組換え細胞は、単細胞のままでよく、あるいは組織、器官又は多細胞生物中で成育させてよい。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外のままであることができるか、又はそれらが発現される能力を保持する様式にて形質転換（即ち、組換え）細胞の染色体内の一つ又は複数の部位に組込まれることができる。宿主細胞を形質転換する好ましい核酸分子は、本明細書に開示される。
【００５１】
形質転換する適当な宿主細胞は、形質転換されることができて、且つ導入された修飾アネキシン蛋白質を発現することができるあらゆる細胞を含む。そのような細胞は、よって、本発明の少なくとも一つの核酸分子により形質転換された後に、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質を生産できる。宿主細胞は、未形質転換細胞か又は少なくとも一つの核酸分子により既に形質転換された細胞の何れかであり得る。本発明の適当な宿主細胞は、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物及び植物細胞を含み得る。好ましい宿主細胞は細菌細胞を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は特に好ましい。別の好ましい宿主細胞は、同起源の修飾されたアネキシン蛋白質を生産する未形質転換（野生型）細菌細胞であり、適宜、病原性を低下させた弱毒化の株を含む。
【００５２】
組換え細胞は、一つ又は複数の組換え分子により宿主細胞を形質転換することにより生産することが好ましく、各々が、一つ又は複数の転写調節配列を含む発現ベクターに作動可能なように連結した本発明の一つ又は複数の核酸分子を含む。「作動可能なように連結した」なる句は、宿主細胞したときに核酸分子が発現され得るような、発現ベクターへの核酸分子の挿入を意味する。本明細書にて使用されるとおり、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができて、特定の核酸分子の発現を果たすことができるＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。好ましくは、上記発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核又は真核の何れかであり得て、そして典型的にはウイルス又はプラスミドであり得る。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、昆虫、動物、及び植物細胞を含む、本発明の組換え細胞内で機能する（即ち、遺伝子発現を指令する）あらゆるベクターを含む。そういうものとして、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終結配列、複製起点、及び組換え細胞と和合性の他の制御配列のような制御配列を含むベクターを発現するため及び本発明の核酸分子の発現を調節するために作動可能なように連結することができる。本明細書にて使用されるとおり、転写調節配列は、転写の開始、伸長及び終結を調節することができる配列を含む。特に重要な転写調節配列は、転写開始を調節する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びリプレッサー配列である。適切な転写調節配列は、本発明の組換え細胞の少なくとも一つにおいて機能し得るあらゆる転写調節配列を含む。そのような転写調節配列の様々なものが、当業界で公知である。好ましい転写調節配列は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞において機能するものを含み、限定ではないが、ｔａｃ，ｌａｃ，ｔｚｐ，ｔｒｃ，ｏｘｙ−ｐｒｏ，ｏｍｐ／ｌｐｐ，ｒｒｎＢ，バクテリオファージラムダ（λ）（例えば、λｐL及びλｐR及びそのようなプロモーターの融合物）、バクテリオファージＴ７，Ｔ７ｌａｃ，バクテリオファージＴ３，バクテリオファージＳＰ６，バクテリオファージＳＰ０１，メタロチオネイン、アルファ交配因子、ピキアアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスサブゲノミックプロモーター）、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓトウモロコシ属昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスアクチン、レトロウイルスロングターミナルリピート、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス、ヒートショック、リン酸塩及び硝酸塩転写調節配列並びに原核細胞又は真核細胞において遺伝子発現を調節できる他の配列を含む。追加の適切な転写調節配列は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン−誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。本発明の転写調節配列は、アネキシン蛋白質をコードするＤＮＡ配列に天然において結合している天然の転写調節配列も含み得る。好ましい転写調節配列は、Ｋｏｚａｋ強力プロモーターと開始配列である。
【００５３】
本発明の発現ベクターは、発現されたアネキシン蛋白質が、当該蛋白質を生産する細胞から分泌されることを可能にさせる分泌シグナル（即ち、シグナルセグメント核酸配列）も含んでよい。適切なシグナルセグメントは、アネキシン蛋白質シグナルセグメント又は融合蛋白質を含む本発明のアネキシン蛋白質の分泌を指令することができるあらゆる異種シグナルセグメントを含む。好ましいシグナルセグメントは、限定ではないが、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエンベロープ糖蛋白質シグナルセグメントを含む。
【００５４】
本発明の発現ベクターは、本発明の挿入された核酸分子を融合蛋白質として発現させることを導く融合配列を含んでもよい。本発明の修飾されたアネキシン核酸分子の一部としての融合配列の包含は、当該核酸分子によりコードされた蛋白質の生産、保存及び使用の間の安定性を増強することができる。さらに、融合セグメントは、親和性クロマトグラフィーを用いた、結果の融合蛋白質の精製を可能にさせるような、修飾アネキシン蛋白質の精製を単純化させる手段として機能し得る。蛋白質の精製に使用できる好ましい融合セグメントは、８−アミノ酸ペプチド配列ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ（配列番号：９）である。
【００５５】
適切な融合セグメントは、所望の機能を有するあらゆるサイズのドメインであり得る（例えば、増加した安定性及び／又は精製手段）。一つ又は複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、アネキシン蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に連結することができる。別の種類の好ましい融合蛋白質は、融合セグメントを、２つ又はそれより多いアネキシン蛋白質又は修飾されたアネキシン蛋白質に接続した融合蛋白質である。融合セグメントとアネキシン蛋白質の間の結合は、アネキシン又は修飾アネキシン蛋白質の直接の回収を可能にさせるように、分割に感受性なように構築することができる。融合蛋白質は、アネキシン蛋白質のカルボキシル末端及び／又はアミノ末端の何れかに結合した融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸配列により形質転換された組換え細胞を培養することにより生産することが好ましい。
【００５６】
本発明の組換え分子は、形質転換される細胞において核酸分子の発現を有効に制御できるあらゆる転写調節配列の少なくとも一つに作動可能なように連結した、前記のあらゆる核酸少なくとも一つを含むことができる分子である。好ましい組換え分子は、本発明の一つ又は複数の核酸分子を含み、一つ又は複数の修飾されたアネキシン蛋白質をコードするものが特に好ましい。本発明の好ましい組換え分子及びそれらの生産は実施例のセクションに記載される。同様に、好ましい組換え細胞は本発明の一つ又は複数の核酸分子を含み、それらは一つ又は複数の修飾されたアネキシン蛋白質をコードする。本発明の好ましい組換え細胞は、実施例のセクションに開示されたものを含む。
【００５７】
当業者には認識されるとおり、例えば、宿主細胞内での核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その結果の転写物が翻訳される効率、及び翻訳後の修飾の効率を操作することにより、組換えＤＮＡ技術の使用が形質転換された核酸分子の発現を改善することができる。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術は、限定ではないが、核酸分子の高コピー数のプラスミドへの作動可能な連結、核酸分子の一つ又は複数の宿主細胞染色体への組込み、ベクター安定化配列のプラスミドへの追加、転写調節配列（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳置換配列（例えば、リボソーム結合部位、シャインダルガノ配列）の置換又は修飾、本発明の核酸分子の修飾による宿主細胞のコドン使用度への対応、転写物を脱安定化する配列の欠失、及び発酵の間の組換え蛋白質生産から組換え細胞の成育を時間的に分離する調節シグナルの使用を含む。本発明の発現された組換え蛋白質の活性は、結果の蛋白質を断片化するか、修飾するか、又は誘導することにより改善してよい。
【００５８】
本発明によれば、組換え細胞を用いてアネキシン又は本発明の修飾されたアネキシン蛋白質を生産することができ、そのような蛋白質を生産するのに有効な条件下でそのような細胞を培養して、当該蛋白質を回収することによる。蛋白質を生産するための有効な条件は、限定ではないが、蛋白質の生産を可能にする、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件を含む。適切か又は有効な培地は、培養されたときに本発明の細胞がアネキシン又は修飾アネキシン蛋白質を生産することができるあらゆる培地を意味する。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸源並びに適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養、例えばビタミンを含む水性培地である。当該培地は、複合体、栄養を含んでよいか又は規定された最小培地であってよい。
【００５９】
本発明の細胞は、限定ではないが、バッチ、飼育バッチ、細胞リサイクル、及び連続発光器を含む慣用の発酵バイオリアクター中で培養することができる。培養は、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリ皿においても実施することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨ、及び酸素含有量にて実施する。そのような培養条件は、当業者の一人の専門技術の範囲内で容易である。
【００６０】
生産に使用されるベクター及び宿主に依存して、結果の修飾アネキシン蛋白質は、組換え細胞中に残るか；発酵培地中に分泌されるか；２つの細胞膜の間、例えばＥ．ｃｏｌｉにおいてはペリプラズミック層に分泌されるか；又は細胞膜又はウイルス膜の外部表面上に残るかの何れかであってよい。そのような蛋白質を精製する方法は実施例のセクションに開示される。
抗体
本発明は、単離された抗−修飾アネキシン蛋白質及びそれらの用途も含む。抗−修飾アネキシン抗体は、修飾されたアネキシン蛋白質に選択的に結合できる抗体である。単離された抗体は、それらの天然の環境から取り出された抗体である。用語「単離された」は、そのような抗体の精製の状態を意味しない。そういうものとして、単離された抗体は、そのような抗体を含む抗体血清、又は程度を変えて精製された抗体を含む。本明細書にて使用されるとおり、用語「選択的に結合する」は、抗体を生じさせた蛋白質に好適に結合するそのような抗体の能力を意味する（即ち、混合物中の無関係の成分からその蛋白質を識別することができる）。結合親和性は、平衡結合定数として共通に表現されるが、典型的には、約１０3Ｍ-1から約１０12Ｍ-1の範囲である。結合は、当業者に知られている様々な方法を用いて測定することができ、例えば、イムノブロットアッセイ、免疫沈殿アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体アッセイ及び免疫電子顕微鏡を含み；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい。
【００６１】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れかであり得る。本発明の抗体は機能上の均等物、例えば抗体断片及び遺伝子操作された抗体を含み、上記抗体を得るのに使用された蛋白質のエピトープの少なくとも一つに選択的に結合することができる単鎖抗体を含む。本発明の抗体は、一つより多いエピトープに結合できるキメラ抗体も含む。好ましい抗体は、少なくとも一部は本発明の修飾されたアネキシン核酸分子によりコードされる蛋白質に応答して生じる。
【００６２】
本発明の抗−修飾アネキシン抗体は、修飾されたアネキシンを投与された動物において生じさせた抗体を含む。本発明の抗修飾アネキシン抗体は、当業者に知られた技術を用いて細胞から次に回収される本発明の一つ又は複数の修飾アネキシン蛋白質に対して動物内で生じさせた抗体も含む。本発明のまた別の抗体は、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質に関して前で開示された技術を用いて組換えにより生産される。規定された蛋白質に対して生産された抗体は有利であり得るが、何故ならば、診断アッセイにおいて干渉を、又は治療用組成物中で使用されるならば副作用を別に引き起こすかもしれない他の物質に対する抗体により、そのような抗体が実質上汚染されていないからである。
【００６３】
本発明の抗−修飾アネキシン抗体は、本発明の範囲内で様々な用途を有する。抗−修飾アネキシン抗体は、発現ライブラリーをスクリーニングするか、及び／又は、蛋白質と他の汚染物の混合物から本発明の所望の蛋白質を回収するための手段として使用することができる。
【００６４】
本発明の好ましい抗−修飾アネキシン抗体は、修飾アネキシン蛋白質に選択的に結合できる。
治療方法
上記の修飾されたアネキシン蛋白質の何れもが、発明の方法において使用することにより、あらゆる医療上の手法又は条件により引き起こされる動脈又は静脈の血栓症を治療する。一般的に、発明において使用され治療剤は、有効量にて動物に投与される。一般的に、有効な量は、（１）治療されることが求められる疾患の兆候を軽減するか又は（２）治療されることが求められる疾患を治療することに関連して薬学上の変化を誘導するかの何れかに有効な量である。
【００６５】
血栓症に関して、有効量は、出血の危険を実質上増加させることなしに延長された抗血栓活性を及ぼすか、又は罹患した動物の期待寿命を増加させるのに有効な量を含む。本明細書にて使用されるとおり、延長された抗血栓活性は、同じ量（モル）の未修飾のアネキシン蛋白質の活性の時間に比較した（with respect to）修飾アネキシン蛋白質の活性の時間を意味する。好ましくは、抗血栓活性は、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、そしてもっとも好ましくは少なくとも約１０倍に延長される。好ましくは、有効な量は、修飾されたアネキシンを投与されていなかった同じ被験者の出血の危険性に比較して、出血の危険性を実質上増加させない。好ましくは、出血の危険性は極めて小さく、そして、せいぜい当業界にて利用可能な別の抗血栓治療により付与されるのよりも下回る。治療剤の治療上有効な量は、所望の抗血栓効果をもたらすのに十分な何れの量又は用量であることができ、そして一部、血栓の状態、種類及び位置、患者の大きさ及び症状、並びに当業者に知られている別の因子に依存する。用量は、単一用量としてか、又は例えば数週間の期間にわたり分割される複数回の用量として提供され得る。
【００６６】
投与は、全量一回投与（bolus）の注射によるか又は静脈内点滴により、血栓症のあとの血栓症を防ぐか又は患者が血栓症に感受性であるか又はその危険のある症状の何れかにおいて生じることが好ましい。
【００６７】
本発明の治療剤は、あらゆる適切な手段により投与することができ、例えば、非経口又は局所投与、例えば静脈内又は皮下注射を含み、又はエアロゾルにより投与することができる。治療用組成物は、投与の方法に依存して様々なユニット用量にて投与することができる。本発明の治療用組成物の好ましい送達方法は、例えば注射による静脈内投与及び局所投与を含む。特定の送達様式に関して、本発明の治療用組成物は本発明の賦形剤中に製剤化することができる。本発明の治療剤は、何れの動物にも投与することができ、好ましくは哺乳類、そしてより好ましくはヒトに投与できる。
【００６８】
一つの適切な投与時間は、冠動脈の血栓症のあとに起こり、それにより、出血の危険性を実質上増加させることなく、血栓症の再発を防ぐ。修飾されたアネキシンの全量一回投与の注射は、血栓症後間もなく、例えば病院への入院前に実施することが好ましい。修飾されたアネキシンは、血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲンアクティベーター、ウロキナーゼ、又は細菌酵素と共に投与することができる。
【００６９】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質の使用方法は、その必要のある患者に有効量の修飾アネキシン蛋白質を投与することにより、過度な大脳血栓症又は一過性の大脳虚血性発作を含む大脳の血栓症を治療する方法を含む。一過性の大脳の虚血性発作は、成熟期の（full-blown）脈拍よりしばしば勝る。修飾されたアネキシンは、末梢の動脈における血栓症の危険性が増加した糖尿病又は他の患者にも投与することができる。従って、本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することを含む、血栓症の危険性が増加した患者における血栓症の危険性を軽減する方法を提供する。成人の患者に関しては、修飾されたアネキシンは、約１から約１００ｍｇの範囲で、静脈内又は全量一回投与として投与することができる。
【００７０】
本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することにより、いくつかの外科手術、例えば臀部及び膝の関節形成術に付随した静脈の血栓症の危険性を低下させる方法も提供する。修飾されたアネキシンの治療は、手術範囲への出血の増加なしに血栓症を防ぐことができる。別の態様において、本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することにより、出血を増加させることなしに妊娠及び分娩に付随した血栓症の危険性を低下させる方法も提供する。別の態様において、本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することにより、再発性の静脈の血栓症を治療する方法を提供する。成人の患者に関しては、修飾されたアネキシンは、約１から約１００ｍｇの範囲で、静脈内又は全量一回投与として投与することができる。
【００７１】
本発明は、血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質のスクリーニング方法も提供し、血栓症試験システムを、血栓症に関して許容される条件下で少なくとも一つの試験修飾アネキシン蛋白質に接触させ、そして試験修飾アネキシン蛋白質の存在下の抗血栓活性を試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓活性と比較することによるが、その際、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性が血栓活性を変調する修飾アネキシン蛋白質の指標である。好ましい態様において、血栓症試験システムは、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を測定するシステムである。この方法により同定された血栓症を変調する修飾アネキシン蛋白質も本発明の範囲内である。
【００７２】
本発明は、アネキシン活性に関して修飾アネキシン蛋白質を同定する方法も提供し、結合に関して許容される条件下で、活性化血小板を、少なくとも一つの試験修飾アネキシン蛋白質に接触させ、そして試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での血小板の試験修飾アネキシン−結合活性及び蛋白質Ｓ−結合活性を、未修飾のアネキシン蛋白質の存在下での試験修飾アネキシン−結合活性及び蛋白質Ｓ−結合活性と比較することを含み、それにより、アネキシン活性を有する修飾アネキシン蛋白質を同定する。上記方法により同定された修飾アネキシン蛋白質も本発明の範囲内である。
【００７３】
別の態様において、本発明は、血栓症を変調する修飾アネキシン蛋白質のスクリーニング方法を提供し、インビボ血栓症試験システムを、少なくとも一つの修飾アネキシン蛋白質と、血栓症に関して許容された条件下で接触させ、そして試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓症活性を、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓症活性と比較することによる。試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓症活性の変化は、血栓活性を変調する修飾アネキシン蛋白質の指標である。さらに、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下で抗血栓症活性が保持される全時間を、未修飾のアネキシンの存在下での抗血栓活性の時間と比較することにより、試験修飾アネキシン蛋白質に付随した抗血栓活性の延長を測定する。試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での出血の程度は、例えば、尾部の出血の時間を測定し、そして試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での出血の程度を比較することにより評価される。好ましい態様において、インビボ血栓症試験システムは、精巣挙筋（cremaster）内の光化学誘導性血栓のマウスモデルである。上記方法により同定された修飾アネキシン蛋白質も本発明の範囲内である。
【００７４】
別の態様において、本発明の治療剤は、遺伝子治療に有用である。本明細書にて使用されるとおり、「遺伝子治療」なる句は、遺伝によるか又は後天的な疾患又は症状を治療するか又は防ぐために宿主に興味のある遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を移し替えることを意味する。興味のある遺伝物質は、そのインビボの生産が望まれる生成物（例えば、蛋白質ポリペプチド、ペプチド又は機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば、興味のある遺伝物質は、治療上貴重なホルモン、受容体、酵素又は（ポリ）ペプチドをコードし得る。特定の態様において、主題の発明は、引用により本明細書に編入されるＨｕｇｈｅｓらの米国特許第６，１６９，０７８号に記載されたように、ジスルフィドリンカーが脂質のヘッドの極性基とテイルの親油性基の間に提供されるように、核酸と複合することができる非ウイルス性遺伝子治療における用途のために脂質分子のクラスを利用する。
【００７５】
本発明のこれらの治療化合物は、ＤＮＡと有効に複合して、異種ＤＮＡにより形質転換されるための細胞の細胞内空間への細胞膜を通したＤＮＡ移送を促進する。さらに、これらの脂質分子は、細胞のサイトプラズム内への異種ＤＮＡの放出を促進して、それによりヒト又は動物における治療の間、遺伝子のトランスフェクションを増加させる。
【００７６】
カチオン性脂質−ポリアニオンマクロ分子の凝集は、当業界において公知の様々な方法により形成してよい。代表的な方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８９７，３５５号；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６９８２−６９８６（１９８９）；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８−２５２（１９６５）；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ９（１９７９）；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４（１９７８）；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９（１９８４）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９（１９８３）；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７（１９８４）に開示されており、全て引用により本明細書に編入される。通常、凝集物は、（１）カチオン性脂質か又は（２）コリピッド（colipid）と混合されたカチオン性脂質の何れかからなる脂質粒子を調製し、次にポリアニオン性マクロ分子をほぼ室温（約１８から２６℃）において上記脂質粒子に添加することにより作成してよい。通常、保護された基の脱保護の助けとならない条件が選択される。一つの態様において、上記混合物を次に約１０分から約２０時間の期間にわたり凝集物を形成するようにするが、約１５から６０分がもっとも便利に使用される。他の時間の期間は、特定の脂質種に適切かもしれない。上記複合体は長期間にわたり形成してよいが、トランスフェクション効率の追加の増強は長期間の複合化により通常は得られない。
【００７７】
主題の発明の化合物及び方法は、所望の分子、例えばポリヌクレオチドを標的細胞へ細胞内送達するのに使用することができる。所望のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡまたはそれらの類似物からなり得る。本発明を用いて送達される所望のポリヌクレオチドは、制御機能、例えばプロモーター配列を有するヌクレオチド、又はポリペプチドをコードするヌクレオチドのような、別の機能又は活性を提供するヌクレオチド配列からなり得る。所望のポリヌクレオチドは、細胞内の他のヌクレオチド配列に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列を提供することもできる。例えば、所望のポリヌクレオチドは、細胞内で転写される場合、細胞内の他のヌクレオチド配列に対するアンチセンスの配列を有する。当該アンチセンス配列は、細胞内のセンス鎖配列にハイブリダイズできる。アンチセンス配列を提供するポリヌクレオチドは、当業者により容易に製造することができる。細胞へ送達される所望のポリヌクレオチドは、細胞内で二重鎖ＤＮＡと三重複合体を形成できるヌクレオチド配列を含むこともできる。
【００７８】
以下の実施例は、発明の修飾されたアネキシン蛋白質の製造と、修飾されたアネキシン蛋白質の抗凝血活性のインビトロ及びインビボのアッセイを例示する。発明が記載された例示の作業又は実施例において記載された特定の詳細に限定されないことは理解されるべきである。
【００７９】
実施例
実施例１：修飾されたアネキシンの製造
アネキシンは、ヒトの組織から精製するか又は組換え技術により生産することができる。例えば、アネキシンＶは、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９８７）により記載されたとおりにヒト胎盤から精製することができる。組換え生成物の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中のアネキシンＩＩとアネキシンＶの発現である（Ｋａｎｇ，Ｈ．−Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．９：９２−１０２（１９９９）；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７，２０００）。組換えＶの迅速かつ有効な精製方法は、ホスファチジルセリン含有リポソームへのＣａ2+−増強結合に基づき、ＥＤＴＡによるＢｅｒｇｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３２９：２５−２８（１９９３）に記載された。この手法は、固相支持体にカップリングされたホスファチジルセリンの使用により改善され得る。
【００８０】
アネキシンは、ペギレーション（pegylation）と呼ばれるプロセスにおけるいくつかのよく確立された手法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６により総説）の何れかによりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へカップリングされ得る。本発明は、モノ−又はポリ−（例えば２−４）ＰＥＧモイエティを有する化学誘導性アネキシン分子を含む。ペギル化された（pegylated）アネキシンを製造する方法は、（ａ）アネキシンが一つ又は複数のＰＥＧ群に結合するようになる条件下でポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）にアネキシンを反応させ、そして（ｂ）一つ又は複数の反応生成物を得る工程を含む。通常、上記反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーター及び所望の結果に基づいてケースバイケースにて決定されなければならない。さらに、上記の反応は異なる数のＰＥＧ鎖を有する異なる生成物を生産してよく、そして所望の生成物を得るためにさらに精製が必要になるかもしれない。
【００８１】
ＰＥＧのアネキシンＶへのコンジュゲートは、ＥＤＣプラススルフォＮＨＳ手法を用いて実施することができる。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド）を用いることにより、スルフォ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルフォサクシニミド）を用いて、カルボキシル酸基と活性エステル基を形成する。これは活性な中間体の安定性を増加させ、安定なアミド結合を提供するためにアミンと反応させる。上記コンジュゲーションはＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６に記載されたとおりに実施することができる。
【００８２】
バイオコンジュゲート法を用いることによりアネキシンのホモポリマー又はヘテロポリマーを生成することができる；方法はＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６に総説される。組換え法を用いることにより、融合蛋白質、例えばイムノグロブリンのＦｃ部分又は他の蛋白質と共に発現されたアネキシンを生成することもできる。アネキシンＩＩとＰ１１とのヘテロテトラマーもＥ．ｃｏｌｉにおいて生成された（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらの手法の全てはアネキシンの分子量を増加させ、そして循環におけるアネキシンの半減期を増加させる能力を有し、そしてその抗凝血作用を延長させる。
【００８３】
アネキシンＶのホモダイマーは図１に模式的に示され（５’−３’センス鎖）（配列番号：４）、且つ配列番号：６により表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ構築物を用いて生成することができる。この実施例においては、アネキシンＶ遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位において発現ベクターｐＣＭＶ ＦＬＡＧ２（シグマアルドリッチから利用可能）にクローン化する。アネキシンＶ配列の前と後の正確な配列は未知であり、「ｘ」と記す。よって、正確なコドンの整列化を保証するための修飾の前に、上記構築物を配列決定する必要がある。ｐＣＭＶ ＦＬＡＧ２ベクターは、内蔵の（built in）強力なプロモーター及び開始配列（Ｋｏｚａｋ）及び開始（ＡＴＧ）を付属する。各アネキシンＶ遺伝子前の開始コドンは、よって、除去されなければならず、そして厳重な発現のための停止コドンを第２アネキシンＶ遺伝子の末端に添加するべきである。当該ベクターは、蛋白質の精製のために使用できる８−アミノ酸のペプチド配列も付属する（ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ）（配列番号：９）。グリシン−セリンの回転（swivel）末端を有する１４−アミノ酸のスペーサーは、一列に並んだ遺伝子間の最適な回転を可能にする。制限部位ＰｖｕＩＩとＳｃａＩの追加は、必要であれば上記リンカーの除去を可能にする。プロテアーゼ部位の追加は発現に続く一列の蛋白質の分割を可能にする。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼはアマシャムファルマシアバイオテックから利用可能であり、一列に並んだ蛋白質を分割するのに使用できる。
アネキシンＶは以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＡＬＲＧＴＶＴＤＦＳＧＦＤＧＲＡＤＡＥＶＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＳＩＬＮＬＬＴＡＲＳＮＡＱＲＱＱＩＡＥＥＦＫＴＬＦＧＲＤＬＶＮＤＭＫＳＥＬＴＧＫＦＥＫＬＩＶＡＬＭＫＰＳＲＬＹＤＡＹＥＬＫＨＡＫＬＧＡＧＴＤＥＫＶＬＴＥＩＬＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱＡＹＥＥＥＹＧＳＮＬＥＤＤＶＶＧＤＴＳＧＹＹＱＲＭＬＶＶＬＬＱＡＮＲＤＰＤＴＡＩＤＤＡＱＶＥＬＤＡＱＡＬＦＱＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＥＫＦＩＴＩＬＧＴＲＳＶＳＨＬＲＲＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩＤＲＥＴＳＧＮＬＥＮＬＬＬＡＶＶＫＳＩＲＳＩＰＡＹＬＡＥＴＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＤＤＨＴＬＩＲＶＩＶＳＲＳＥＩＤＬＦＮＩＲＫＥＦＲＫＮＦＡＴＳＬＹＳＭＩＫＧＤＴＳＧＤＹＫＫＡＬＬＬＬＣＧＧＥＤＤ（＊停止）（配列番号：３）。
【００８４】
図１に例示されたＤＮＡ構築物内に示されるアネキシンＶのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＡＣＴＧＡ（配列番号：１）。
【００８５】
実施例２：インビトロ及びインビボアッセイ
インビトロアッセイは、修飾されたアネキシン蛋白質が活性化された血小板に結合する能力を決定する。アネキシンＶは血小板に結合し、この結合は血栓による血小板の活性化によりインビトロにおいて顕著に増加する（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｔａｉｔ，１９９０；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。好ましくは、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、それらが血小板に結合して蛋白質Ｓが血小板に結合するのを防ぐことにおいて、アネキシンの機能を果たすような方法で製造される（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。修飾されたアネキシン蛋白質は、未修飾のアネキシン蛋白質が呈するのと同じ抗凝血活性をインビトロにて呈する機能も果たす。クロット形成時間を測定する方法は、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間である（Ｆｒｉｔｓｍａ，ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｒｒｉｖｅａｕ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓｍａ，Ｇ．Ａ．，編纂）Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８９），ｐｐ．９２−１２４，引用により本明細書に編入される）。
【００８６】
インビボアッセイはアネキシン蛋白質の抗血栓活性を測定する。アネキシンＶは、レーザーによるか又は光化学によりラット内で誘導された静脈の血栓症を軽減することが示された（Ｒｏｍｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。最大の抗凝血作用は、トロンボエラストグラフィーによる機能測定によれば、アネキシンＶの静脈内投与の１５分から３０分後に観察された。本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、未修飾のアネキシンの活性よりもそのようなモデルの方が、より長い延長された活性を好適に示す。アネキシンＶは、頸静脈の血栓症のウサギモデルにおいてフィブリンの累積（accretion）を低下させることもわかった（Ｖａｎ Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．１９９３）。空気注入を使用することにより内皮を除去し、そしてアネキシンＶは処置された静脈に結合するが、対照の反対側の静脈に結合しないことがわかった。損傷した静脈内のフィブリンの蓄積の低下は、全身性の抗凝血とは関連しなかった。ヘパリンは損傷した静脈内でフィブリンの蓄積を阻害しなかった。本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、この静脈血栓症のモデルにおいてアネキシンの機能を好適に果たす。動脈の血栓症のウサギモデルは、Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７により使用された。部分的に閉塞させる血栓を、電流の適用により左の頸動脈に形成させた。アネキシンＶの注入が血栓症を強く阻害したことが、血流、血流重量、標識されたフィブリンの堆積及び標識された血小板の蓄積の測定により証明された。最近、精巣挙筋内で光化学誘導された血栓のマウスモデルが導入された（Ｖｏｌｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：１６０−１６４（２００１），引用により本明細書に編入される）。この技術を用いて、血栓症はあらゆる所望の動脈又は静脈において誘導することができる。本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、全量一回投与の注射により投与された場合でさえも、そのようなモデルにおいてアネキシンの機能を好適に果たす。
【００８７】
実施例３
ヒト組換えアネキシンＶ及びペギル化ヒト組換えアネキシンＶの抗凝血能力をインビトロにて比較した。
アネキシンＶ生産。ポリメラーゼ鎖反応を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからの特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、イニシエーターメチオニンから停止コドンまでのｃＤＮＡを増幅した。フォワードプライマーはＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣ（配列番号：７）であり、そしてリバースプライマーはＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧ（配列番号：８）であった。増幅された１．１ｋｂの断片をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化して、原核発現ベクターｐＴＲＣ９９Ａに連結した。連結生成物を用いて、コンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５を形質転換して、配列決定した。
【００８８】
組換えアネキシンＶを、Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３により記載されたとおりに、いくらかの修飾を加えて、細菌溶解物から単離した。ｐＴＲＣ ９９Ａ−アネキシンＶにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５の一晩培養物を、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む新しいＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で５０倍に増殖させた。２時間後に、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌまで添加した。誘導１６時間後に、細菌を３５００ｇにて１５分間で４℃にて沈殿させた。細菌の沈殿物を、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ，５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含むＴＢＳ，ｐＨ７．５に懸濁した。上記の細菌の懸濁液を超音波プローブによりセッティング６にて氷上で３分間音波処理した。溶解物を１０，０００ｇにて１５分間遠心分離して、上清を、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む５０容のＴＢＳに対して２回透析して、５０容のＴＢＳに対して１回透析した。
【００８９】
マルチラメラリポソームを、ホスファチジルセリン、凍結乾燥したウシ脳抽出物、コレステロール及びクロロホルム中のジセチルホスフェートをモル比１０：１５：１にて溶解することにより作成して、コニカルフラスコ中で窒素流にて乾燥させた。ＴＢＳ（５ｍＬ）を上記フラスコに添加して、１分間激しくボルテックスミキサーにて振動させた。当該リポソームを１５分間３５００ｇの遠心分離により洗浄して、次に、上記細菌抽出物と共にインキュベートし、そして塩化カルシウムを最終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加した。３７℃における１５分間のインキュベーション後に、上記リポソームを１０，０００ｇにて１０分間の遠心分離により沈降させ、そして結合したアネキシンＶＩＩＩを１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡにより溶出した。溶出したアネキシンＶをアミコン限外濾過により濃縮して、セファクリル２００カラム上に負荷した。上記アネキシンＶを包含された容量に回収したが、ほとんどのリポソームは空隙容量内であった。アネキシンＶを含む画分をプールして、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ及び２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．１中で透析して、アニオン交換カラム上に負荷して、同じバッファー中の０から２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの直線勾配により溶出した。精製された調製物は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示した。
【００９０】
上記のとおりに生成されたアネキシンＶを、上記のとおり、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６の方法によりペギル化した。
抗−凝血アッセイ。
アネキシンＶ及びペギル化されたアネキシンＶにより誘導されたクロット形成時間（活性化された部分的なトロンボプラスチン時間）の延長を比較した。活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を、Ｆｒｉｔｓｍａ，１９８９において記載されたとおりに、クエン酸化された正常なプールされた血漿とアッセイした。異なる濃度の上記のとおりに生成されたアネキシンＶ及びペギル化されたアネキシンＶを用いて、クロット形成時間の延長に関する用量応答曲線を得た。結果を図２に示すが、クロット形成時間対アネキシンＶ及びペギル化されたアネキシンＶのプロットである。当該図面において示されるとおり、組換えヒトアネキシンＶとペギル化組換えヒトアネキシンＶの抗凝血能力は実質等価であった。観察された小さな違いは、ペギレーション後の分子量の変化に帰する。この実験は、アネキシンＶのペギレーションがその抗凝血作用を実質上減じることなしに達成できるという、本明細書になされた主張を確認する。
【００９１】
上記記載は発明の例示に過ぎないことに注意するべきである。様々な変更及び修飾が発明を逸脱することなしに当業者により工夫され得る。従って、本発明は、開示された発明の範囲内に入るそのような変更、修飾及び変動を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、アネキシンＶのホモダイマーを作成するためのＤＮＡ構築物を示す。
【図２】図２は、組換えヒトアネキシンＶとペギル化（pegylated）組換えヒトアネキシンＶの抗凝血能力を比較するインビトロアッセイの凝血時間のプロットを示す。
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、血栓症を治療するための方法及び組成物に関する。特定すれば、本発明は、修飾されたアネキシン蛋白質およびそれらの使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
血栓症は、血管の中の血液クロット（血栓）の形成、成長又は存在であり、最も共通の重度の医学上の障害である。動脈の血栓症の最も頻繁な例は冠動脈の血栓症であり、冠動脈の閉塞を導いて、しばしば心筋梗塞（心臓発作）を導く。１３０万人より多い患者が北米において毎年心筋梗塞のために病院に入院する。標準の治療は点滴による血栓溶解蛋白質はの投与である。急性の心筋梗塞の血栓溶解治療は治療された１０００人の患者あたり３０人の生命を救うと見積もられる；にもかかわらず、この障害の３０日の死亡率が実在したままである（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５６：４４９−４５４（２０００）、引用により本明細書に編入される）。全量一回投与（bolus）の注射による抗血栓剤及び血栓溶解剤の投与が便利なのは、付加的な利益を伴う病院への入院の前に使用されるかもしれないからである（Ｒａｗｌｅｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：１１８１−１１８６（１９９７）、引用により本明細書に編入される）。しかしながら、全量一回投与（bolus）は（より漸次の静脈内点滴とは対照的に）、大脳の出血の危険を顕著に増加させる（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。出血なしに血栓症を防ぐか及び／又は血栓溶解を増加させることができる薬剤の開発が望まれる。
【０００３】
冠動脈の閉塞による心臓への不十分な酸素の到達により引き起こされる不安定なアンギナは、病院への入院の最もありふれた原因であり、合衆国のみで１年に１５０万ケースである。冠動脈の閉塞の患者を血管形成術及びステント術により治療する場合、血小板ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体の使用が再狭窄の可能性を低下させる。しかしながら、同じ抗体は血管形成術なしに不安定なアンギナにおいて利益を示さなかったし、これらの患者において冠動脈の閉塞を防ぐための良好な方法が要求される。
【０００４】
動脈の血栓症の別の重要な例は大脳の血栓症である。静脈内の組換え組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｒｔＰＡ）は食品医薬品局により認定される急性の貧血性の脈拍のための唯一の治療である。投与が早いほど良好である（Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ３１：２５５２−２５５７（２０００），引用により本明細書に編入される）。しかしながら、静脈内のｒｔＰＡの投与は大脳内の出血の危険の増加を付随する。成熟期の（full-blown）脈拍はしばしば一過性の貧血性の発作（ＴＩＡ）が先に来て、合衆国において毎年約３００，０００人がＴＩＡを患うと見積もられる。全量一回投与として投与できる安全で有効な薬剤を有することが望まれて、且つ、数日間大脳の出血の危険を増加させることなしに大脳の血栓症の再発を防ぐはずである。血栓症は糖尿病及び他の患者の末梢動脈の閉塞の一因ともなり、そのような患者のための有効で安全な抗血栓剤が要求される。
【０００５】
静脈の血栓症は、臀部及び膝の関節形成術のような外科的処置の頻繁な合併症である。手術の分野においては出血を増加させることなく血栓症を防ぐことが望まれている。妊娠及び分娩に付随する静脈の血栓症にも類似の考察があてはまる。何人かは繰返しの静脈の血栓症になりがちであり、クマリンタイプの薬剤のような抗血栓剤により現在治療されている。そのような薬剤の用量は各患者において定量（titrated）されなければならず、有効な抗血栓剤の用量と出血を増加させる用量の間の余裕は小さい。出血の危険を増加させることからの抗血栓活性の良好な分離による治療法を有することが望まれる。血小板ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａのリガンド、低分子量ヘパリン、及び因子Ｘａのペンタサッカライド阻害剤を含む、最近導入された抗血栓治療の全ては、出血の危険を増加させ得る（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ １１９：１０８Ｓ−１２１Ｓ（２００１），引用により本明細書に編入される）。よって、出血の危険を増加させることなしに動脈及び静脈の血栓症を防ぐための別の戦略を探索する要求が存在する。
【０００６】
出血を増加させることなしに動脈又は静脈の血栓の拡大を阻害するためには、造血に関与する機構と大血管内の血栓症に関与する機構の間の潜在的な違いを探索することが必要である。主要な造血機構は血小板のマイクロ凝集物の形成を含み、毛細血管を塞いで、小血管内の損傷したか又は活性化された内皮細胞にわたり蓄積する。血小板の凝集物の阻害剤は、トロンボキサンＡ2の形成又は作用を抑圧する剤、ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａのリガンド、及びＡＤＰ受容体上に作用する薬剤、例えばクロピドグレル（clopidogrel）（Ｈａｌｌｏｐｅｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：２０２−２０７（２００１），引用により本明細書に編入される）を含み、このプロセスを干渉し、よって、出血の危険を増加させる（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。マイクロ凝集物の形成に加えて、動脈又は静脈の血栓による閉塞は、血小板の血栓への連続する補充と取り込みを必要とする。大血管内の剪断力による脱離に打ち勝つために、血小板は互いに、そしてそれらを取り巻いて被覆するフィブリンのネットワークに、強固に結合していなければならない。
【０００７】
血小板の密なマクロ凝集物の形成が細胞及び体液の増幅機構により促進されて、互いを補強しあうという証拠が蓄積してきた。細胞の機構においては、適度な濃度のアゴニスト、例えばＡＤＰ，トロンボキサン、Ａ2、又はコラーゲンにより誘導される、血小板の相対的にルーズなマイクロ凝集が、８５−ｋＤ蛋白質Ｇａｓ６の血小板α顆粒からの放出により達成される（Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：２１５−２２１（２００１），引用により本明細書に編入される）。放出されたＧａｓ６の、血小板表面上に発現される受容体チロシンキナーゼ（Ａｘｌ，Ｓｋｙ，Ｍｅｒ）への結合は、完全な脱顆粒化及びこれらの細胞の強固なマクロ凝集の形成を誘導する。体液の増幅機構においては、プロトロンビナーゼ複合体が活性化された血小板及び微小胞の表面上に形成される。これによりトロンビンとフィブリンが生じる。トロンビンはそれ自体有力な血小板アクティベーター並びにＧａｓ６の放出の誘導因子である（Ｉｓｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｎａｋａｎｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４６：１９７−１９９（２９９９）、引用により本明細書に編入される）。完全に活性化された血小板はその周囲に付着したフィブリンの新たなネットワークに強く結合する。細胞組織学上の観察は、血小板とフィブリンの両方がヒトにおける安定な冠動脈の血栓の形成に必要であることを示す（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｖａｎｓｔｒａｅｔｅ ｅｔ ａｌ．（編纂）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｔｈｒｏｍｂｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８），ｐｐ．４５−５８，引用により本明細書に編入される）。別の血小板接着分子であるアンフォテリンは活性化の間に血小板表面に位置を変え、そしてアニオン性ホスホリピッドを結合する（Ｒｏｕｈａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．８４：１０８７−１０９４（２０００）、引用により本明細書に編入される）。Ｇａｓ６のように、アンフォテリンは血小板の凝集の間にブリッジを形成できた。
【０００８】
これらの増幅機構を阻害するが初期血小板凝集を阻害せず、それにより出血を増加させることなく血栓症を防ぐことができるか否かという疑問が生じる。細胞の増幅の重要性は、Ｇａｓ６の標的化不活性化によるマウスの研究により最近確立されてきた（Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。Ｇａｓ６−／−マウスはコラーゲンとエピネフィリンにより誘導された血栓症と塞栓症に対して保護されることがわかった。しかしながら、Ｇａｓ６−／−マウスは自発的な出血を患うことがなく、尾部のクリッピング後に通常の出血があった。さらに、Ｇａｓ６に対する抗体は、インビトロにて血小板の凝集を、並びにコラーゲン及びエピネフィリンによりインビボにて誘導された血栓症を阻害した。原則として、そのような抗体、又は受容体チロシンキナーゼに結合するＧａｓ６に関して競合するリガンドは、血栓症を阻害するのに使用されるかもしれない。しかしながら、体液の増幅の能力に照らすと、その工程を阻害することは好ましいかもしれない。理想的には、そのような阻害剤はＧａｓ６−媒介性細胞増幅機構に対して、付加的な抑圧活性も有するはずである。
【０００９】
血小板凝集の細胞性増幅及び体液性増幅の両方を防ぐ戦略は、アネキシンにより提供され、その１０の高相同性の抗血栓蛋白質のファミリーがいくつかのヒト組織内で発現される（Ｂｅｎｚ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：１７７−１８３（１９９７）、引用により本明細書に編入される）。アネキシンは、共に血液の凝固に必要なカルシウムと陰性荷電ホスホリピッドの結合特性を共有する。生理学上の条件下では、陰性荷電ホスホリピッドは、主に、活性化されたか又は損傷した細胞膜中でホスファチジルセリン（ＰＳ）により供給される。完全な細胞においては、ＰＳはプラズマ膜の二層の内部のリーフレットに閉じ込められて、表面上には接近できない。血小板が活性化されたら、それらの表面上に接近可能なＰＳの量、即ちアネキシン結合の程度が大いに増大する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．６９：２８９−２９６（１９９３）、引用により本明細書に編入される）。血小板の活性化の間、微小胞がそれらの表面から放出されて、前凝血活性を有するアニオン性ホスホリピッドを発現する表面積を大いに増大させる（Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２５７７−２５８２（１９９９）；Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１３５：６６−７２（２０００）、共に引用により本明細書に編入される）。これらは、血小板媒介性の動脈の血栓の拡大において重要な役割を担うかもしれない。
【００１０】
血液の凝血カスケードに関与する蛋白質（因子Ｘ，Ｘａ，及びＶａ）は、それらの表面上の膜生産（bearing）ＰＳに、及び互いに、結合して、安定で強固に結合したプロトロンビナーゼ複合体を形成する。ＩＩ，Ｖ，及びＶＩＩを含むいくつかのアネキシンは高い親和性でＰＳを結合して、それによりプロトロンビナーゼ複合体の形成を防いで、抗血栓活性を及ぼす。アネキシンＶはＰＳを極めて高い親和性（Ｋｄ＝１．７ｍｍｏｌ／Ｌ）にて結合するが、陰性荷電ホスホリピッドに関する因子Ｘ，Ｘａ，及びＶａの親和性よりも高い（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｔａｉｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７４２０−１７４２３）１９９０）、引用により本明細書に編入される）。活性化されたか又は損傷を受けた内皮細胞上の組織因子依存性の血液凝固も、ＰＳの表面発現を必要とし、そしてアネキシンＶはこのプロセスを阻害することができる（ｖａｎ Ｈｅｅｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：８２４−８３０（１９９４），引用により本明細書に編入される）が、アネキシンはプロトロンビナーゼ生成の阻害におけるよりも、この活性において有効性が劣る（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６２：５１７−５３１（１９９２）、引用により本明細書に編入される）。
【００１１】
アネキシンＶの活性化された血小板への結合及び損傷を受けた細胞への結合は、血栓における蛋白質の選択的な停留をおそらくは説明する。これは、静脈及び動脈の血栓症の実験動物モデルにおいて示されており（Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２：３１１３−３１２１（１９９５）；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９６：２３３９−２３４７（１９９７）、共に引用により本明細書に編入される）、そして標識されたアネキシンは、ノイズの減少と安全性の増加をもって、ヒトにおける血管の血栓の医療用イメージングに関して提案されてきた（Ｒｅｎｏ ａｎｄ Ｋａｓｉｎａ，国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７５９９（ＷＯ ９５／３４３１５）（１９９５年１２月２１日公開）、引用により本明細書に編入される）。血栓への有力な抗血栓剤、例えばアネキシンＶの結合は、血栓症の拡大又は再発を防ぐ戦略を提供する。一過性の心筋の貧血もアネキシンＶの結合を増加させる（Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：１５６４−１５６８（２０００），引用により本明細書に編入される）。ヒトにおけるアネキシンＶイメージングは、心内膜心筋の生検が血管の拒絶を示したときに、移植された心臓において蛋白質の結合の増加を示した（Ａｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．４１（補遺５）：１２７Ｐ（２０００），引用により本明細書に編入される）。この結合は、おそらく、損傷を受けた内皮細胞並びに拒絶されつつある心臓内のアポトーシス性筋細胞の表面上に外面化されたＰＳのためである。当然の結果として、心筋梗塞の後のアネキシンの投与は血小板細胞及び内皮細胞の両方の上の前血栓症複合体の形成を妨害して、それにより、血栓症の拡大と再発を防ぐ。アネキシンＶの結合もヒトにおける大脳の低酸素症後に増加し（Ｄ’Ａｒｃｅｕｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２０００：２６９２−２７００（２０００），引用により本明細書に編入される）、ＴＩＡ後のアネキシンの投与が成熟期の（full-blown）脈拍を生じさせる見込みを低下させるかもしれないという仮説を支持する。
【００１２】
アネキシンは、いくつかのインビトロトロンビン依存性アッセイにおいて、並びに静脈血栓症（Ｒｏｍｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．６１：９３−１０４（１９９１）；Ｖａｎ Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ６９：２２７−２３０（１９９３），共に引用により本明細書に編入される）及び動脈血栓症（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）の実験動物モデルにおいて、抗凝血活性を示した。注目すべきは、抗血栓症用量中のアネキシンは治療されたウサギにおいて伝統的なエクスビボのクロット形成試験に対して証明可能な効果を有さず（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）、そして治療されたラットの出血時間を顕著に延長させなかった（Ｖａｎ Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。治療されたウサギにおいて、アネキシンは外科手術の切開部への出血を増加させなかった（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）。これまでに調査された全ての薬剤の間で唯一、アネキシンは出血を増加させることなしに、抗血栓症活性を発揮する。アネキシンは、トロンビン以外のアゴニストにより引き起こされる血小板の凝集を阻害しなかった（ｖａｎ Ｈｅｅｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）が、血小板の凝集は主要な止血機構である。損傷した血管の壁及び血管外組織においては、組織因子／ＶＩＩａ複合体も止血作用を発揮し、そしてこのシステムはプロトロンビナーゼ複合体よりもアネキシンＶによる阻害に対する感受性が劣る（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。これは、可能な限りの血管区画への投与されたアネキシンＶの閉じ込めに関する一つの議論である；出血の危険は低下しそうである。
【００１３】
血栓症の防御に関するそのような有望な結果にも拘わらず、アネキシンの治療上の使用に付随する主要な問題は、循環におけるそれらの短い半減期であり、実験動物においては５から１５分であると計算される（Ｒｏｍｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）；アネキシンＶもヒトの循環において短い半減期を有する（Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．４１（補遺５）：１４９Ｐ（２０００），引用により本明細書に編入される）。アネキシンのほとんどは尿中へ失われ、３６ｋＤａ蛋白質と予測される（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７）。よって、血管区画から血管外の区画及び尿へのアネキシンの損失を防ぎ、それにより一回の注射後に抗血栓症活性を延長させる方法に関する要求が存在する。
発明の概要
本発明は、出血を増加させることなく動脈又は静脈の血栓症を防ぐための組成物及び方法を提供する。組換えヒトアネキシン、好ましくはアネキシンＶを、血管区画内でのその半減期を延長させるように修飾する。これは様々な様式により達成できる；３つの好ましい態様は、ポリエチレングリコールにカップリングさせたアネキシン、アネキシンのヘテロポリマー又はホモポリマー、及びアネキシンと別の蛋白質（例えば、イムノグロブリンのＦｃ部分）との融合蛋白質である。修飾されたアネキシンは高い親和性をもって、活性化された血小板又は損傷した細胞の表面上のホスファチジルセリンに結合し、それにより、Ｇａｓ６並びに前凝血蛋白質の結合及びプロトロンビナーゼ複合体の形成を防ぐ。修飾されたアネキシンは、よって、血小板の凝固が増幅される細胞機構及び体液機構の両方を阻害して、それにより血栓症を防ぐ。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングしたアネキシン蛋白質、好ましくはアネキシンＶを含む、単離された、修飾されたアネキシン蛋白質を提供する。好ましくは、少なくとも２つのＰＥＧ鎖を単一のアネキシン分子にカップリングするが、各ＰＥＧ鎖は少なくとも約５ｋＤａ、好ましくは約１０ｋＤａ、そしてもっとも好ましくは少なくとも１５ｋＤａの分子量を有する。別の態様において、単離された修飾アネキシン蛋白質は、少なくとも一つの別の蛋白質、例えば別のアネキシン蛋白質（ホモダイマーを形成する）又はイムノグロブリンのＦｃ部分にカップリングされたアネキシン蛋白質を含む。別の蛋白質は、好ましくは、少なくとも３０ｋＤａの分子量を有する。本発明により提供されるのは、発明の修飾されたアネキシン蛋白質のいずれかを抗血栓に有効な量で含む薬剤組成物でもある。
【００１５】
発明の方法において、修飾されたアネキシンは、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質のいずれか一つを抗血栓に有効な量で含む薬剤組成物中にて、血栓症の危険性のある被験者に投与される。例えば、上記薬剤組成物は、動脈の血栓症、例えば冠動脈の血栓症、大脳の血栓症、又は一過性の大脳性貧血の発作の後に投与することができる。それは、静脈の血栓症に付随した外科手術後に投与することもできる。付加的に、それは、動脈血栓症又は静脈血栓症を有する患者、例えば糖尿病、妊婦又は分娩の被験者に投与することもできる。
【００１６】
また、アネキシンのホモダイマーをコードする単離された核酸分子、当該核酸の少なくとも一部を含む組換え分子、及び当該核酸分子の少なくとも一部を含む組換え細胞も、本発明により提供される。上記組換え細胞は、アネキシンホモダイマーを生産するために本発明の方法において適切な条件下で培養する。
【００１７】
本発明は、血栓症試験システムを用いて血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質をスクリーニングする方法も提供する。上記試験システムを試験修飾アネキシン蛋白質と接触させ、その後、血栓溶解活性を評価して、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下で上記システムの活性と比較する。好ましくは、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を測定する。また、活性化された血小板を試験修飾アネキシン蛋白質に接触させて、血小板結合と蛋白質Ｓ−結合活性を評価することにより修飾アネキシン蛋白質を同定する方法も提供される。
【００１８】
また、修飾されたアネキシン蛋白質をインビボにてスクリーニングする方法も本発明により提供される。この方法においては、血栓症動物モデルを試験修飾アネキシン蛋白質に接触させて、その後、試験修飾アネキシン蛋白質のインビボ抗凝血活性及び出血における増加を評価する。抗凝血の活性と時間をアネキシンの抗凝血の活性と時間と比較して、出血量を試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での動物モデルにおける出血と比較する。
発明の詳細な説明
本発明は、出血を増加させることなく哺乳類において血栓症を防ぐための化合物及び方法を提供する。発明は、血小板凝集の主要な機構が動脈と静脈の血栓の形成に必要な血小板凝集を増幅させる機構とは異なるという認識に一部基づく。血栓の形成は阻害するが主要な血小板の凝集は阻害しないことにより、血栓症が出血の増加なしに防ぐことができる。
【００１９】
発明の化合物は、ヒト又は他の動物において生成物の半減期を増加させるように修飾されたアネキシンアミノ酸配列を含む如何なる生成物も含む。「アミノ酸配列」と本明細書にて詳説して天然に生じる蛋白質分子のアミノ酸配列に言及する場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語、例えば「ポリペプチド」又は「蛋白質」は、詳説された蛋白質に関連した、完全な、天然アミノ酸配列に対するアミノ酸配列に限定されることを意図しない。アネキシンは相同なホスホリピッド結合膜蛋白質のファミリーであり、そのうちの１０個は哺乳類において発現される別々の遺伝子を表す（Ｂｅｎｚ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ，１９９７）。結晶解析は、アネキシンＶに代表される、これまでに研究されたファミリーメンバーの全てに関する共通の三次構造を明らかにした（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：３８６７（１９９０），引用により本明細書に編入される）。コアのドメインは、ホスホリピッド膜に密に向かい合うことができる凹型の円盤状の構造である。それは４つのサブドメインを含み、各々が５つのαヘリックスからなる７０アミノ酸のアネキシンリピートからなる。アネキシンは、異なるアネキシンの間では、長さ及びアミノ酸配列が変化する、より親水性の尾部ドメインも有する。アネキシンをコードする遺伝子の配列はよく知られている（例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：８０８７−８０９２（１９８７）（アネキシンＶ），引用により本明細書に編入される）。
【００２０】
本発明においては、アネキシン蛋白質を修飾することにより、ヒト又は他の動物においてそれらの半減期を増加させる。好ましい態様において、アネキシン蛋白質はアネキシンＶである。他の適切なアネキシン修飾はその有効なサイズの増加であり、血管の区画からの血管外の区画及び尿への損失を防ぎ、それにより１回の注射の後の抗血栓活性を延長させる。ホスファチジルセリンとの十分な結合親和性を保持する有効サイズの如何なる増加も本発明の範囲内である。
【００２１】
発明の一つの態様においては、修飾されたアネキシンがホスファチジルセリン（ＰＳ）−結合アッセイにおいてアネキシンの機能を実行することが可能なように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングされた組換えヒトアネキシンを修飾アネキシンが含む。静脈内投与されたアネキシンＰＥＧコンジュゲートの抗血栓作用が遊離のアネキシンの作用に比較して延長される。ＰＥＧにカップリングされた組換えアネキシン蛋白質は、アネキシンＶ蛋白質又は別のアネキシン蛋白質であり得る。
【００２２】
ＰＥＧは、直鎖又は幾つかの場合には分枝鎖の何れかの末端上のヒドロキシル基で終わるエチレンオキシドの繰返しユニットからなる。カップリングしたＰＥＧのサイズと分子量は、それが含むエチレンオキシドのユニットの数に依存し、選択することができる。本発明に関しては、アネキシン分子あたり、何れのサイズのＰＥＧも何れの数のＰＥＧ鎖も、アネキシンに比較して、修飾されたアネキシンの半減期が増加するが、修飾分子のＰＳへの結合機能を保持するように使用することができる。上記のとおり、十分な結合は、未修飾アネキシンの結合からは低下した結合を含むが、Ｇａｓ６とプロトロンビナーゼ複合体の因子の結合とは競合し、よって、血栓症を防ぐことができる。コンジュゲートしたＰＥＧの最適な分子量はＰＥＧ鎖の数と共に変化する。もっとも好ましい態様において、各々少なくとも約１５ｋＤａの分子量の２つのＰＥＧ分子を各アネキシン分子とカップリングさせる。上記ＰＥＧ分子は直鎖又は分枝であり得る。アネキシンのＰＳへのカルシウム依存性結合は、カップリングしたＰＥＧ分子のサイズばかりでなく、ＰＥＧが結合する蛋白質の位置にも影響される。最適な選択は、所望の特性が保持されることを確実にする。ＰＥＧ結合部位の選択は、当該分子の３次元構造の知見及び当該分子のホスホリピッド膜との相互作用の変異分析及び結晶学分析により促進される（Ｃａｍｐｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：８００４−８００８（１９９８），引用により本明細書に編入される）。
【００２３】
薬剤送達のエリアにおいては、ＰＥＧ誘導体が蛋白質への共有結合に広く使用されることにより、可溶性を増強し、並びに免疫原性、蛋白質溶解、及び腎臓浄化値を低下させてきた。ＰＥＧにカップリングさせた組換え生成物の優秀な臨床上の効果は、よく確立されている。例えば、ＰＥＧ−インターフェロンアルファ−２ａを１週に一度投与すると、Ｃ型肝炎ウイルスに対して遊離インターフェロンの３週用量よりも顕著に有効である（Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１６７３−１６８０（２０００），引用により本明細書に編入される）。ＰＥＧへのカップリングはインビボにおいて組換え蛋白質の半減期を延長させるため（Ｋｎａｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２７９６−２８０４（１９８８），引用により本明細書に編入される）並びに組換え蛋白質の酵素分解を防いで相同な生成物においてときどき観察された免疫原性を低下させるため（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６），ｐｐ．１７３−１７６，引用により本明細書に編入される）に、使用されてきた。
【００２４】
発明の別の態様において、修飾されたアネキシン蛋白質は、増加した有効サイズを有するアネキシン蛋白質のポリマーである。有効なサイズの増加は血管区画内での延長された半減期及び延長された抗血栓活性をもたらすと信じられる。一つのそのような修飾アネキシンは、アネキシンＶのダイマーである。別のそのようなポリマーは、アネキシンＩＩと、カルシウム結合蛋白質のＳ１００ファミリーのメンバーであるｐ１１とのヘテロテトラマーである。Ｓ１００のアネキシンへの結合は、アネキシンのＣａ2+への親和性を増加させる。アネキシンのホモポリマー又はヘテロポリマーは、バイオコンジュゲート法又は組換え法により生成することができて、それ自身又はＰＥＧコンジュゲート形態において投与することができる。
【００２５】
発明の別の態様において、組換えアネキシンは、別の蛋白質、例えばイムノグロブリンのＦｃ部分と共に発現されるか、又は化学的にカップリングされる。そのような発現又はカップリングは分子の有効サイズを増加させ、血管区画からのアネキシンの損失を防いで、その抗凝血作用を延長させる。
【００２６】
好ましくは、発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、アネキシンＩＩ，アネキシンＶ、又はアネキシンＶＩＩＩを含む。好ましい態様において、上記蛋白質は修飾されたヒトアネキシンである。特に好ましい態様において、上記の修飾されたアネキシンは組換えヒトアネキシンを含む。本発明によれば、単離されたか又は生物学上純粋な蛋白質は、その天然の環境から取り出された蛋白質である。そういうものとして、「単離された」及び「生物学上純粋な」は、蛋白質が精製された程度を必ずしも反映はしない。本発明の単離された修飾アネキシン蛋白質は、その天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生成できるか、又は化学合成により生成できる。本明細書にて使用されるとおり、単離された修飾アネキシン蛋白質は完全長の修飾蛋白質であるか又はそのような蛋白質のあらゆる相同体であり得る。それは、（例えば、ペギル化された（pegylated）蛋白質に関して）修飾された完全長の蛋白質であるか又はそのような蛋白質の修飾された相同体でもあり得る。
【００２７】
本発明の蛋白質相同体の最小のサイズは、相当する天然蛋白質をコードする核酸分子の相補配列を有する、安定なハイブリッドを形成できる核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。そういうものとして、そのような蛋白質相同体をコードする核酸分子のサイズは、上記核酸分子と相補配列の間の核酸の組成及びパーセント相同性並びにハイブリダイゼーション条件それ自体に依存する（例えば、温度、塩濃度、及びホルムアミド濃度）。そのような核酸分子の最小サイズは、典型的には、上記核酸がＧＣリッチであれば少なくとも約１２から約１５ヌクレオチドの長さであり、上記核酸がＡＴリッチであれば少なくとも約１５から約１７ヌクレオチドの長さである。そいうものとして、本発明の蛋白質相同体をコードするのに使用される核酸分子の最小サイズは、約１２から約１８のヌクレオチドの長さである。上記核酸分子が遺伝子の一部、遺伝子全体又は複数の遺伝子又はその一部を含むことにおいて、そのような核酸分子の最大サイズに制限はない。同様に、本発明のアネキシン蛋白質相同体又は修飾されたアネキシン蛋白質相同体の最小サイズは約４から約６アミノ酸の長さであり、好ましいサイズは完全長、多価（即ち、一つより多いドメインを有する融合蛋白質であって、各々が機能を有する）蛋白質、そのような蛋白質の機能部分が望まれるか否かに依存する。本発明のアネキシン及び修飾されたアネキシン相同体は、好ましくは、天然蛋白質に相当する活性を有し、血栓の形成を防ぐことにおいてアネキシン蛋白質の活性を担うことが可能なようなものである。
【００２８】
アネキシン蛋白質及び修飾されたアネキシン相同体は、天然の対立遺伝子又は天然変異の結果であり得る。本発明の蛋白質相同体は当業界公知の技術を用いて生産することもでき、限定ではないが、例えば古典的なＤＮＡ技術又は組換えＤＮＡ技術を用いてランダム又は標的化変異導入を作用させる、蛋白質に対する直接の修飾又は蛋白質をコードする核酸に対する修飾を含む。
【００２９】
アミノ酸配列の配列番号：３、配列番号：６、又はこれらの配列の何れかを含む蛋白質をコードする核酸分子のあらゆるバリアントによりコードされた蛋白質に、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そしてもっとも好ましくは少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む修飾アネキシン蛋白質も好ましい。アミノ酸配列間及び核酸配列間のパーセント同一性を決定する方法は、当業者に知られている。配列間のパーセント同一性を決定するための好ましい方法は、コンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧ（登録商標）ウイスコンシンパッケージ（商標名）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社より利用可能）、ＤＮＡｓｉｓ（登録商標）プログラム（ヒタチソフトウエア、Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，ＣＡより利用可能）、ベクターＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ（インフォマックス社、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより利用可能）、又はＮＣＢＩウエブサイト上で利用可能なＢＬＡＳＴソフトウエアを含む。
【００３０】
一つの態様において、好ましい修飾アネキシン蛋白質は、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３００アミノ酸、そしてもっとも好ましくは少なくとも約３１９アミノ酸又は完全長のアネキシン蛋白質のアミノ酸を含み、どれでも短いものである。別の態様において、好ましいアネキシン蛋白質は、完全長の蛋白質、即ち、完全長のコード領域によりコードされる蛋白質、又はその翻訳後修飾された蛋白質、例えば開始メチオニン及び／又はシグナル配列又は「プロ」配列が除去された成熟蛋白質を含む。
【００３１】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質の断片は、好ましくは、少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１００アミノ酸の長さを含む。
【００３２】
一つの態様において、本発明の好ましい単離された修飾アネキシン蛋白質は、核酸配列の配列番号：４を有する核酸分子又はこの配列を有する核酸分子の対立遺伝子バリアントによりコードされた修飾蛋白質である。あるいは、修飾されたアネキシン蛋白質は、核酸配列の配列番号：１を有する核酸分子又はこの配列を有する核酸分子の対立遺伝子バリアントによりコードされた蛋白質を含む。
【００３３】
本発明の一つの態様は、アネキシン遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされた非天然修飾アネキシン蛋白質を含む。本明細書にて使用されるとおり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子が類似の核酸配列を有する分子を同定するために使用される標準のハイブリダイゼーション条件を意味する。そのような標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に開示されており、引用により本明細書に編入される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応において釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約７０％核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容する。３０％又はそれ未満のヌクレオチドのミスマッチを許容するハイブリダイゼーションを達成するために適切なハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を計算するための式は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）に開示されており、引用により本明細書に編入される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容することになる。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容することになる。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容することになる。
【００３４】
好ましい修飾アネキシン蛋白質は、少なくとも約５０ヌクレオチドであり、そして好ましくは約２０％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約１５％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約１０％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約５％の塩基対のミスマッチを許容する条件下、そしてさらにより好ましくは約２％の塩基対のミスマッチを許容する条件下にて、配列番号：１、配列番号：４からなる群から選択される核酸分子、又はこれらの分子の何れかの相補体とハイブリダイズする核酸分子である。
【００３５】
本明細書にて使用されるとおり、アネキシン遺伝子は、天然のアネキシン遺伝子に関連する全ての核酸配列、例えば、その遺伝子によりコードされるアネキシン蛋白質の生産を調節する制御領域（例えば、限定ではないが、翻訳、転写又は翻訳後調節領域）並びにコーディング領域それ自体を含む。一つの態様において、アネキシン遺伝子は核酸配列、配列番号：１を含む。核酸配列決定技術は完全にエラーがないわけではないので、配列番号：１（並びに本明細書に提示される他の配列）は、せいぜい、本発明のアネキシン蛋白質をコードする核酸分子の見かけ上の核酸配列を代表することに注意するべきである。
別の態様において、アネキシン遺伝子は、配列番号：１に類似であるが同一ではない配列を含む全ての対立遺伝子バリアントであり得る。配列番号：１を含むアネキシン遺伝子の全ての対立遺伝子バリアントは、配列番号：１を含むが、例えば変異又は組換えにより引き起こされる天然の変化により類似ではあるが同一ではない配列を有する遺伝子として、ゲノム内の同じ位置（又は座）にて本質的に生じる遺伝子である。対立遺伝子バリアントは、典型的には、それらが比較される遺伝子によりコードされる蛋白質と類似の活性を有する蛋白質をコードする。蛋白質バリアントは、遺伝子の５’又は３’未翻訳領域内の変化も含み得る（例えば、制御調節領域中）。対立遺伝子バリアントは、当業者にはよく知られており、既知の（given）ヒトにおいて見いだされることが予測されるはずであるが、ゲノムが二倍体であり、及び又は、２人又はそれ以上のヒトを含む集団の間の中にあるからである。
【００３６】
本発明の単離された修飾アネキシン蛋白質は、その天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生産できるか、又は化学合成により生産できる。本明細書にて使用されるとおり、単離された修飾アネキシン蛋白質は、完全長の蛋白質又はそのような蛋白質のあらゆる相同体を含み得る。アネキシン及び修飾されたアネキシン相同体の例は、アミノ酸が欠失するか（例えば、蛋白質の末端削除バージョン、例えばペプチド又はインテインが除去されたか又は２つのエクステインが連結した場合の蛋白質スプライシング反応による）、挿入されるか、転位するか、置換されるか、及び／又は誘導された（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの追加による）アネキシン及び修飾されたアネキシン蛋白質を含み、当該相同体がアネキシン蛋白質に対する免疫応答性を引き出すことが可能な少なくとも一つのエピトープを含むようなものである。即ち、当該相同体を動物に対して免疫源として当業者に知られた技術を用いて投与する場合、動物は、アネキシン蛋白質の少なくとも一つのエピトープに対して体液性及び／又は細胞性の免疫応答を生じることになる。アネキシン及び修飾されたアネキシン相同体は、免疫血清に選択的に結合するそれらの能力により選択することもできる。そのような活性を測定する方法は、本明細書に開示される。アネキシン及び修飾されたアネキシン相同体、機能アッセイにおいて天然アネキシンの機能を果たすことができる蛋白質も含む；即ち、ホスファチジルセリン又は活性化された血小板に結合できるか又は抗血栓活性を呈することができる蛋白質である。そのようなアッセイの方法は、実施例のセクション及び本明細書のどこかに記載される。
【００３７】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、機能アッセイにおいてアネキシン蛋白質の機能を果たすその能力により同定してよい。「機能アッセイにおいてその蛋白質の機能を果たすことができる」なる句は、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約１０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約２０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約３０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約４０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、それは、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約５０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約６０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約７０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約８０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約９０％を蛋白質又は修飾蛋白質が有する。機能アッセイの例は本明細書に記載される。
【００３８】
本発明の単離された蛋白質は様々な方法により生産することができ、細菌からそのような蛋白質を回収し、そしてそのような蛋白質を組換えにより生産することを含む。本発明の一つの態様は、組換えＤＮＡ技術を用いた本発明の単離修飾アネキシン蛋白質を生産する方法である。そのような方法は、（ａ）本発明の修飾されたアネキシン蛋白質をコードする核酸分子を含む組換え細胞を培養し、そして（ｂ）蛋白質をそれから回収する工程を含む。組換え細胞を生産すること及びそれの培養についての詳細は、以下に提示される。「蛋白質を回収する」なる句は、蛋白質を含む全発酵培地を回収することを単に意味し、そして分離又は精製の追加工程を含意する必要はない。本発明の蛋白質は、様々な標準の蛋白質精製技術を用いて精製することができる。
【００３９】
本発明の単離された蛋白質は、好ましくは、「実質上精製された」形態にて復活させる（retrieved）。本明細書にて使用されるとおり、「実質上精製された」なる句は、機能アッセイにおいて蛋白質の有効な使用を可能にさせる精製度を意味する。
修飾されたアネキシン核酸分子又は遺伝子
本発明の別の態様は、アネキシンＶのホモダイマーのような修飾されたアネキシン蛋白質をコードする遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、単離された核酸分子である。そのような核酸分子は、修飾されたアネキシン核酸分子とも呼ばれる。特に好ましいのは、ストリンジェント条件下で修飾されたアネキシン遺伝子とハイブリダイズする単離された核酸分子である。そのような遺伝子の特性は、本明細書に開示される。本発明によれば、単離された核酸分子は、その天然環境から取り出された核酸分子である（即ち、人の操作に供された）。そいうものとして、「単離された」は、上記核酸分子が精製された程度を反映しない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ，又はＤＮＡ又はＲＮＡの何れかの誘導体を含み得る。
【００４０】
上記のとおり、修飾されたアネキシン遺伝子は、天然アネキシン遺伝子に関連する全ての核酸配列、例えばその遺伝子によりコードされるアネキシン蛋白質の生産を調節する制御領域（例えば、限定ではないが、翻訳、転写又は翻訳後調節領域）並びにコーディング領域それ自体を含む。本発明の核酸分子は、単離された修飾アネキシン核酸分子又はその相同体であり得る。本発明の核酸分子は、一つ又はそれ以上の制御領域、完全長又は部分的なコーディング領域、またそれらの組み合わせを含み得る。本発明の修飾されたアネキシン核酸分子の最小サイズは、対応する天然遺伝子とストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成することができる最小のサイズである。アネキシン核酸分子は、ハイブリッド蛋白質、融合蛋白質、多価蛋白質又は末端削除された断片をコードする核酸分子も含み得る。
【００４１】
本発明の単離された核酸分子は、全部の（即ち、完全な）遺伝子又はその遺伝子と安定なハイブリッドを形成できる一部の何れかとしてその天然源から得ることができる。本明細書にて使用されるとおり、実在物の「少なくとも一部（portion）」なる句は、その実在物の機能的な側面を有するのに少なくとも十分なかなりの量の（an amount of）実在物を意味する。例えば、本明細書にて使用される、核酸配列の少なくとも一部とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相当する遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができる、かなりの量の核酸配列である。
【００４２】
本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローン化等）又は化学合成を用いて生産することもできる。単離された修飾アネキシン核酸分子は、天然の核酸分子及びその相同体を含み、限定ではないが、ヌクレオチドが挿入されるか、欠失するか、置換されるか及び／又は転位した天然対立遺伝子バリアント及び修飾された核酸分子を含み、そのような修飾が、本発明の修飾アネキシン蛋白質をコードするか又は天然核酸分子単離物とストリンジェントな条件下で安定なハイブリッドを形成する、核酸分子の能力を実質上干渉しないようなものである。
【００４３】
修飾されたアネキシン核酸分子相同体は、当業者に知られた多数の方法を用いて生産できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照）。例えば、核酸分子は、様々な技術を用いて修飾することができ、限定ではないが、古典的な変異導入技術及び組換えＤＮＡ技術、例えば、部位特異的変異導入、核酸分子の化学処理による変異の導入、核酸断片の制限酵素分割、核酸断片の連結、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の変異導入、オリゴヌクレオチド混合物の合成、及び混合群の連結による核酸分子の混合物及びその組み合わせの「構築（build）」を含む。核酸分子相同体は、核酸によりコードされる蛋白質の機能に関してのスクリーニング（例えば、アネキシン蛋白質に対する免疫応答を引き出すか及び／又はクロット形成アッセイにおいて機能する相同体の能力）及び／又はストリンジェント条件下での単離されたアネキシンコード核酸とのハイブリダイゼーションにより、修飾された核酸の混合物から選択することができる。
【００４４】
本発明の単離された修飾アネキシン核酸分子は、本発明の少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質をコードする核酸配列を含むことができ、そのような蛋白質の例は本明細書に開示される。「核酸分子」なる句は主として物質の核酸分子を意味し、そして「核酸配列」なる句は主として核酸分子上の配列を意味するが、２つの句は、特に核酸分子又は核酸配列であって修飾アネキシン蛋白質をコードできるものに関しては、交換可能に使用することができる。
【００４５】
本発明の一つの態様は、修飾されたアネキシン蛋白質の少なくとも一部をコードする核酸鎖又はその相同体又はそのような核酸鎖に対する相補体に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズできる修飾アネキシン核酸分子である。本発明の何れかの核酸配列の核酸配列相補体は、配列が引用される鎖に相補な（即ち、完全な二重鎖を形成できる）核酸鎖の核酸配列を意味する。配列番号により表される、一方の鎖に関して核酸配列を決定する、本発明の二重鎖核酸分子は、配列番号の相補体である配列を有する相補鎖も含む。そいうものとして、本発明の核酸分子は、二重鎖又は一本鎖の何れかであり得て、本明細書にて記載された所定の配列番号及び／又は本明細書にて示されていてもいなくてもよいその配列の相補体の何れかとストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補配列を演繹する方法は、当業者には知られている。好ましいのは、修飾されたアネキシン蛋白質の少なくとも一部をコードする核酸配列の対応する一つ又は複数の領域と、少なくとも約６５パーセント、好ましくは少なくとも約７０パーセント、より好ましくは約７５パーセント、より好ましくは少なくとも約８０パーセント、より好ましくは少なくとも約８５パーセント、より好ましくは少なくとも約９０パーセント、そしてよりさらに好ましくは少なくとも約９５パーセント相同性を有する核酸配列を含む修飾されたアネキシン核酸分子を含む。特に好ましいのは、アネキシン蛋白質又はその相同体のホモダイマーをコードすることができる修飾されたアネキシン核酸分子である好ましいアネキシン核酸分子は、配列番号：４及び配列番号：４の対立遺伝子バリアントを含む。
【００４６】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質の核酸分子を知ることは、当業者が、その核酸分子のコピーを作成すること並びにアネキシン蛋白質コーディング遺伝子（例えば、翻訳開始部位及び／又は転写及び／又は翻訳調節領域を含む核酸分子）及び／又はアネキシン核酸分子相同体の追加の部分を含む核酸分子を得ることを可能にさせる。本発明のアネキシン蛋白質のアミノ酸配列の一部を知ることは、当業者が、そのようなアネキシン蛋白質をコードする核酸配列をクローン化することを可能にさせる。さらに、所望の修飾されたアネキシン核酸分子は、本発明のアネキシン蛋白質に結合する抗体により適当な発現ライブラリーをスクリーニングすること；本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いた慣用クローン化技術により適当なライブラリー又はＤＮＡをスクリーニング；及び本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた適当なライブラリー、又はＲＮＡ又はＤＮＡのＰＣＲ増幅（ゲノミック及び／又はｃＤＮＡライブラリーを用いることができる）を含む様々な方法において得ることができる。
【００４７】
本発明は、修飾されたアネキシン蛋白質の少なくとも一部をコードする本発明の他の好ましくはより長い核酸分子の相補領域とストリンジェント条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドである核酸分子も含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は何れかの誘導体であり得る。そのようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、与えられたオリゴヌクレオチドと、本発明の別の核酸分子上の相補配列の間で安定なハイブリッドを形成するために必要なサイズである。
【００４８】
最小サイズの特徴は、本明細書に開示される。オリゴヌクレオチドのサイズは、本発明に従ったオリゴヌクレオチドの使用にも十分でなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、様々な応用、例えば限定ではないが、追加の核酸分子を同定するためのプローブとして、核酸分子を増幅又は伸長合成するためのプライマーとして、又は修飾されたアネキシンの生産を変調するための治療上の応用において使用することができる。そのような治療上の応用は、例えば、アンチセンス−、３重鎖形成−、リボザイム−、及び／又はＲＮＡ薬剤−に基づく技術におけるそのようなオリゴヌクレオチドの使用を含む。本発明は、よって、そのような技術の一つ又は複数の使用による修飾アネキシン蛋白質の生産を変調するための、そのようなオリゴヌクレオチド及び方法を含む。
天然野生型細菌細胞及び組換え分子及び細胞
本発明は、上記核酸分子を宿主細胞へ送達することができるあらゆるベクターに挿入された本発明の修飾されたアネキシン核酸分子を含む、組換えベクターも含む。そのようなベクターは、異種核酸配列、即ち本発明の修飾されたアネキシン核酸分子に隣接した、天然では見いだされない核酸配列を含む。当該ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか、原核又は真核の何れか、そして典型的にはウイルス又はプラスミドであり得る。組換えベクターは、本発明の修飾されたアネキシン核酸分子のクローン化、配列決定、及び／又は他の操作において使用することができる。本明細書において組換え分子と呼ばれて以下に詳細に説明される一つの種類の組換えベクターを、本発明の核酸分子の発現において使用することができる。好ましい組換えベクターは、形質転換された細胞中で複製することができる。本発明の組換えベクター中に含まれる好ましい核酸分子は、本明細書に開示される。
【００４９】
これまで開示されたとおり、本発明の一つの態様は、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質を生産する方法であって、当該蛋白質を生産するのに有効な条件下で当該蛋白質を発現する細胞を培養し、そして当該蛋白質を回収することによる。別の態様において、上記方法は、アネキシン蛋白質を生産するのに有効な条件下で蛋白質を発現できる細胞を培養し、当該蛋白質を回収し、そしてその有効なサイズを増加させるための因子（agent）にそれをカップリングさせることによりアネキシン蛋白質を生産することを含む。
【００５０】
好ましい態様において、培養する細胞は天然の細菌細胞であり、そして修飾されたアネキシン蛋白質をこれらの細胞から単離する。別の態様において、培養される好ましい細胞は、修飾されたアネキシン蛋白質を発現できる組換え細胞であり、そして当該組換え細胞は本発明の核酸分子一つ又は複数により宿主細胞を形質転換することにより製造される。細胞の核酸分子による形質転換は、核酸分子が細胞に挿入できるあらゆる方法により達成できる。形質転換技術は、限定ではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含む。組換え細胞は、単細胞のままでよく、あるいは組織、器官又は多細胞生物中で成育させてよい。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外のままであることができるか、又はそれらが発現される能力を保持する様式にて形質転換（即ち、組換え）細胞の染色体内の一つ又は複数の部位に組込まれることができる。宿主細胞を形質転換する好ましい核酸分子は、本明細書に開示される。
【００５１】
形質転換する適当な宿主細胞は、形質転換されることができて、且つ導入された修飾アネキシン蛋白質を発現することができるあらゆる細胞を含む。そのような細胞は、よって、本発明の少なくとも一つの核酸分子により形質転換された後に、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質を生産できる。宿主細胞は、未形質転換細胞か又は少なくとも一つの核酸分子により既に形質転換された細胞の何れかであり得る。本発明の適当な宿主細胞は、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物及び植物細胞を含み得る。好ましい宿主細胞は細菌細胞を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は特に好ましい。別の好ましい宿主細胞は、同起源の修飾されたアネキシン蛋白質を生産する未形質転換（野生型）細菌細胞であり、適宜、病原性を低下させた弱毒化の株を含む。
【００５２】
組換え細胞は、一つ又は複数の組換え分子により宿主細胞を形質転換することにより生産することが好ましく、各々が、一つ又は複数の転写調節配列を含む発現ベクターに作動可能なように連結した本発明の一つ又は複数の核酸分子を含む。「作動可能なように連結した」なる句は、宿主細胞したときに核酸分子が発現され得るような、発現ベクターへの核酸分子の挿入を意味する。本明細書にて使用されるとおり、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができて、特定の核酸分子の発現を果たすことができるＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。好ましくは、上記発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核又は真核の何れかであり得て、そして典型的にはウイルス又はプラスミドであり得る。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、昆虫、動物、及び植物細胞を含む、本発明の組換え細胞内で機能する（即ち、遺伝子発現を指令する）あらゆるベクターを含む。そういうものとして、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終結配列、複製起点、及び組換え細胞と和合性の他の制御配列のような制御配列を含むベクターを発現するため及び本発明の核酸分子の発現を調節するために作動可能なように連結することができる。本明細書にて使用されるとおり、転写調節配列は、転写の開始、伸長及び終結を調節することができる配列を含む。特に重要な転写調節配列は、転写開始を調節する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びリプレッサー配列である。適切な転写調節配列は、本発明の組換え細胞の少なくとも一つにおいて機能し得るあらゆる転写調節配列を含む。そのような転写調節配列の様々なものが、当業界で公知である。好ましい転写調節配列は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞において機能するものを含み、限定ではないが、ｔａｃ，ｌａｃ，ｔｚｐ，ｔｒｃ，ｏｘｙ−ｐｒｏ，ｏｍｐ／ｌｐｐ，ｒｒｎＢ，バクテリオファージラムダ（λ）（例えば、λｐL及びλｐR及びそのようなプロモーターの融合物）、バクテリオファージＴ７，Ｔ７ｌａｃ，バクテリオファージＴ３，バクテリオファージＳＰ６，バクテリオファージＳＰ０１，メタロチオネイン、アルファ交配因子、ピキアアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスサブゲノミックプロモーター）、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓトウモロコシ属昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスアクチン、レトロウイルスロングターミナルリピート、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス、ヒートショック、リン酸塩及び硝酸塩転写調節配列並びに原核細胞又は真核細胞において遺伝子発現を調節できる他の配列を含む。追加の適切な転写調節配列は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン−誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。本発明の転写調節配列は、アネキシン蛋白質をコードするＤＮＡ配列に天然において結合している天然の転写調節配列も含み得る。好ましい転写調節配列は、Ｋｏｚａｋ強力プロモーターと開始配列である。
【００５３】
本発明の発現ベクターは、発現されたアネキシン蛋白質が、当該蛋白質を生産する細胞から分泌されることを可能にさせる分泌シグナル（即ち、シグナルセグメント核酸配列）も含んでよい。適切なシグナルセグメントは、アネキシン蛋白質シグナルセグメント又は融合蛋白質を含む本発明のアネキシン蛋白質の分泌を指令することができるあらゆる異種シグナルセグメントを含む。好ましいシグナルセグメントは、限定ではないが、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエンベロープ糖蛋白質シグナルセグメントを含む。
【００５４】
本発明の発現ベクターは、本発明の挿入された核酸分子を融合蛋白質として発現させることを導く融合配列を含んでもよい。本発明の修飾されたアネキシン核酸分子の一部としての融合配列の包含は、当該核酸分子によりコードされた蛋白質の生産、保存及び使用の間の安定性を増強することができる。さらに、融合セグメントは、親和性クロマトグラフィーを用いた、結果の融合蛋白質の精製を可能にさせるような、修飾アネキシン蛋白質の精製を単純化させる手段として機能し得る。蛋白質の精製に使用できる好ましい融合セグメントは、８−アミノ酸ペプチド配列ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ（配列番号：９）である。
【００５５】
適切な融合セグメントは、所望の機能を有するあらゆるサイズのドメインであり得る（例えば、増加した安定性及び／又は精製手段）。一つ又は複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、アネキシン蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に連結することができる。別の種類の好ましい融合蛋白質は、融合セグメントを、２つ又はそれより多いアネキシン蛋白質又は修飾されたアネキシン蛋白質に接続した融合蛋白質である。融合セグメントとアネキシン蛋白質の間の結合は、アネキシン又は修飾アネキシン蛋白質の直接の回収を可能にさせるように、分割に感受性なように構築することができる。融合蛋白質は、アネキシン蛋白質のカルボキシル末端及び／又はアミノ末端の何れかに結合した融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸配列により形質転換された組換え細胞を培養することにより生産することが好ましい。
【００５６】
本発明の組換え分子は、形質転換される細胞において核酸分子の発現を有効に制御できるあらゆる転写調節配列の少なくとも一つに作動可能なように連結した、前記のあらゆる核酸少なくとも一つを含むことができる分子である。好ましい組換え分子は、本発明の一つ又は複数の核酸分子を含み、一つ又は複数の修飾されたアネキシン蛋白質をコードするものが特に好ましい。本発明の好ましい組換え分子及びそれらの生産は実施例のセクションに記載される。同様に、好ましい組換え細胞は本発明の一つ又は複数の核酸分子を含み、それらは一つ又は複数の修飾されたアネキシン蛋白質をコードする。本発明の好ましい組換え細胞は、実施例のセクションに開示されたものを含む。
【００５７】
当業者には認識されるとおり、例えば、宿主細胞内での核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その結果の転写物が翻訳される効率、及び翻訳後の修飾の効率を操作することにより、組換えＤＮＡ技術の使用が形質転換された核酸分子の発現を改善することができる。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術は、限定ではないが、核酸分子の高コピー数のプラスミドへの作動可能な連結、核酸分子の一つ又は複数の宿主細胞染色体への組込み、ベクター安定化配列のプラスミドへの追加、転写調節配列（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳置換配列（例えば、リボソーム結合部位、シャインダルガノ配列）の置換又は修飾、本発明の核酸分子の修飾による宿主細胞のコドン使用度への対応、転写物を脱安定化する配列の欠失、及び発酵の間の組換え蛋白質生産から組換え細胞の成育を時間的に分離する調節シグナルの使用を含む。本発明の発現された組換え蛋白質の活性は、結果の蛋白質を断片化するか、修飾するか、又は誘導することにより改善してよい。
【００５８】
本発明によれば、組換え細胞を用いてアネキシン又は本発明の修飾されたアネキシン蛋白質を生産することができ、そのような蛋白質を生産するのに有効な条件下でそのような細胞を培養して、当該蛋白質を回収することによる。蛋白質を生産するための有効な条件は、限定ではないが、蛋白質の生産を可能にする、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件を含む。適切か又は有効な培地は、培養されたときに本発明の細胞がアネキシン又は修飾アネキシン蛋白質を生産することができるあらゆる培地を意味する。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸源並びに適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養、例えばビタミンを含む水性培地である。当該培地は、複合体、栄養を含んでよいか又は規定された最小培地であってよい。
【００５９】
本発明の細胞は、限定ではないが、バッチ、飼育バッチ、細胞リサイクル、及び連続発光器を含む慣用の発酵バイオリアクター中で培養することができる。培養は、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリ皿においても実施することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨ、及び酸素含有量にて実施する。そのような培養条件は、当業者の一人の専門技術の範囲内で容易である。
【００６０】
生産に使用されるベクター及び宿主に依存して、結果の修飾アネキシン蛋白質は、組換え細胞中に残るか；発酵培地中に分泌されるか；２つの細胞膜の間、例えばＥ．ｃｏｌｉにおいてはペリプラズミック層に分泌されるか；又は細胞膜又はウイルス膜の外部表面上に残るかの何れかであってよい。そのような蛋白質を精製する方法は実施例のセクションに開示される。
抗体
本発明は、単離された抗−修飾アネキシン蛋白質及びそれらの用途も含む。抗−修飾アネキシン抗体は、修飾されたアネキシン蛋白質に選択的に結合できる抗体である。単離された抗体は、それらの天然の環境から取り出された抗体である。用語「単離された」は、そのような抗体の精製の状態を意味しない。そういうものとして、単離された抗体は、そのような抗体を含む抗体血清、又は程度を変えて精製された抗体を含む。本明細書にて使用されるとおり、用語「選択的に結合する」は、抗体を生じさせた蛋白質に好適に結合するそのような抗体の能力を意味する（即ち、混合物中の無関係の成分からその蛋白質を識別することができる）。結合親和性は、平衡結合定数として共通に表現されるが、典型的には、約１０3Ｍ-1から約１０12Ｍ-1の範囲である。結合は、当業者に知られている様々な方法を用いて測定することができ、例えば、イムノブロットアッセイ、免疫沈殿アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体アッセイ及び免疫電子顕微鏡を含み；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい。
【００６１】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れかであり得る。本発明の抗体は機能上の均等物、例えば抗体断片及び遺伝子操作された抗体を含み、上記抗体を得るのに使用された蛋白質のエピトープの少なくとも一つに選択的に結合することができる単鎖抗体を含む。本発明の抗体は、一つより多いエピトープに結合できるキメラ抗体も含む。好ましい抗体は、少なくとも一部は本発明の修飾されたアネキシン核酸分子によりコードされる蛋白質に応答して生じる。
【００６２】
本発明の抗−修飾アネキシン抗体は、修飾されたアネキシンを投与された動物において生じさせた抗体を含む。本発明の抗修飾アネキシン抗体は、当業者に知られた技術を用いて細胞から次に回収される本発明の一つ又は複数の修飾アネキシン蛋白質に対して動物内で生じさせた抗体も含む。本発明のまた別の抗体は、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質に関して前で開示された技術を用いて組換えにより生産される。規定された蛋白質に対して生産された抗体は有利であり得るが、何故ならば、診断アッセイにおいて干渉を、又は治療用組成物中で使用されるならば副作用を別に引き起こすかもしれない他の物質に対する抗体により、そのような抗体が実質上汚染されていないからである。
【００６３】
本発明の抗−修飾アネキシン抗体は、本発明の範囲内で様々な用途を有する。抗−修飾アネキシン抗体は、発現ライブラリーをスクリーニングするか、及び／又は、蛋白質と他の汚染物の混合物から本発明の所望の蛋白質を回収するための手段として使用することができる。
【００６４】
本発明の好ましい抗−修飾アネキシン抗体は、修飾アネキシン蛋白質に選択的に結合できる。
治療方法
上記の修飾されたアネキシン蛋白質の何れもが、発明の方法において使用することにより、あらゆる医療上の手法又は条件により引き起こされる動脈又は静脈の血栓症を治療する。一般的に、発明において使用され治療剤は、有効量にて動物に投与される。一般的に、有効な量は、（１）治療されることが求められる疾患の兆候を軽減するか又は（２）治療されることが求められる疾患を治療することに関連して薬学上の変化を誘導するかの何れかに有効な量である。
【００６５】
血栓症に関して、有効量は、出血の危険を実質上増加させることなしに延長された抗血栓活性を及ぼすか、又は罹患した動物の期待寿命を増加させるのに有効な量を含む。本明細書にて使用されるとおり、延長された抗血栓活性は、同じ量（モル）の未修飾のアネキシン蛋白質の活性の時間に比較した（with respect to）修飾アネキシン蛋白質の活性の時間を意味する。好ましくは、抗血栓活性は、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、そしてもっとも好ましくは少なくとも約１０倍に延長される。好ましくは、有効な量は、修飾されたアネキシンを投与されていなかった同じ被験者の出血の危険性に比較して、出血の危険性を実質上増加させない。好ましくは、出血の危険性は極めて小さく、そして、せいぜい当業界にて利用可能な別の抗血栓治療により付与されるのよりも下回る。治療剤の治療上有効な量は、所望の抗血栓効果をもたらすのに十分な何れの量又は用量であることができ、そして一部、血栓の状態、種類及び位置、患者の大きさ及び症状、並びに当業者に知られている別の因子に依存する。用量は、単一用量としてか、又は例えば数週間の期間にわたり分割される複数回の用量として提供され得る。
【００６６】
投与は、全量一回投与（bolus）の注射によるか又は静脈内点滴により、血栓症のあとの血栓症を防ぐか又は患者が血栓症に感受性であるか又はその危険のある症状の何れかにおいて生じることが好ましい。
【００６７】
本発明の治療剤は、あらゆる適切な手段により投与することができ、例えば、非経口又は局所投与、例えば静脈内又は皮下注射を含み、又はエアロゾルにより投与することができる。治療用組成物は、投与の方法に依存して様々なユニット用量にて投与することができる。本発明の治療用組成物の好ましい送達方法は、例えば注射による静脈内投与及び局所投与を含む。特定の送達様式に関して、本発明の治療用組成物は本発明の賦形剤中に製剤化することができる。本発明の治療剤は、何れの動物にも投与することができ、好ましくは哺乳類、そしてより好ましくはヒトに投与できる。
【００６８】
一つの適切な投与時間は、冠動脈の血栓症のあとに起こり、それにより、出血の危険性を実質上増加させることなく、血栓症の再発を防ぐ。修飾されたアネキシンの全量一回投与の注射は、血栓症後間もなく、例えば病院への入院前に実施することが好ましい。修飾されたアネキシンは、血栓溶解剤、例えば組織プラスミノーゲンアクティベーター、ウロキナーゼ、又は細菌酵素と共に投与することができる。
【００６９】
本発明の修飾されたアネキシン蛋白質の使用方法は、その必要のある患者に有効量の修飾アネキシン蛋白質を投与することにより、過度な大脳血栓症又は一過性の大脳虚血性発作を含む大脳の血栓症を治療する方法を含む。一過性の大脳の虚血性発作は、成熟期の（full-blown）脈拍よりしばしば勝る。修飾されたアネキシンは、末梢の動脈における血栓症の危険性が増加した糖尿病又は他の患者にも投与することができる。従って、本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することを含む、血栓症の危険性が増加した患者における血栓症の危険性を軽減する方法を提供する。成人の患者に関しては、修飾されたアネキシンは、約１から約１００ｍｇの範囲で、静脈内又は全量一回投与として投与することができる。
【００７０】
本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することにより、いくつかの外科手術、例えば臀部及び膝の関節形成術に付随した静脈の血栓症の危険性を低下させる方法も提供する。修飾されたアネキシンの治療は、手術範囲への出血の増加なしに血栓症を防ぐことができる。別の態様において、本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することにより、出血を増加させることなしに妊娠及び分娩に付随した血栓症の危険性を低下させる方法も提供する。別の態様において、本発明は、その必要のある患者に修飾されたアネキシン蛋白質を有効量投与することにより、再発性の静脈の血栓症を治療する方法を提供する。成人の患者に関しては、修飾されたアネキシンは、約１から約１００ｍｇの範囲で、静脈内又は全量一回投与として投与することができる。
【００７１】
本発明は、血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質のスクリーニング方法も提供し、血栓症試験システムを、血栓症に関して許容される条件下で少なくとも一つの試験修飾アネキシン蛋白質に接触させ、そして試験修飾アネキシン蛋白質の存在下の抗血栓活性を試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓活性と比較することによるが、その際、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性が血栓活性を変調する修飾アネキシン蛋白質の指標である。好ましい態様において、血栓症試験システムは、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を測定するシステムである。この方法により同定された血栓症を変調する修飾アネキシン蛋白質も本発明の範囲内である。
【００７２】
本発明は、アネキシン活性に関して修飾アネキシン蛋白質を同定する方法も提供し、結合に関して許容される条件下で、活性化血小板を、少なくとも一つの試験修飾アネキシン蛋白質に接触させ、そして試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での血小板の試験修飾アネキシン−結合活性及び蛋白質Ｓ−結合活性を、未修飾のアネキシン蛋白質の存在下での試験修飾アネキシン−結合活性及び蛋白質Ｓ−結合活性と比較することを含み、それにより、アネキシン活性を有する修飾アネキシン蛋白質を同定する。上記方法により同定された修飾アネキシン蛋白質も本発明の範囲内である。
【００７３】
別の態様において、本発明は、血栓症を変調する修飾アネキシン蛋白質のスクリーニング方法を提供し、インビボ血栓症試験システムを、少なくとも一つの修飾アネキシン蛋白質と、血栓症に関して許容された条件下で接触させ、そして試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓症活性を、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓症活性と比較することによる。試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓症活性の変化は、血栓活性を変調する修飾アネキシン蛋白質の指標である。さらに、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下で抗血栓症活性が保持される全時間を、未修飾のアネキシンの存在下での抗血栓活性の時間と比較することにより、試験修飾アネキシン蛋白質に付随した抗血栓活性の延長を測定する。試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での出血の程度は、例えば、尾部の出血の時間を測定し、そして試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での出血の程度を比較することにより評価される。好ましい態様において、インビボ血栓症試験システムは、精巣挙筋（cremaster）内の光化学誘導性血栓のマウスモデルである。上記方法により同定された修飾アネキシン蛋白質も本発明の範囲内である。
【００７４】
別の態様において、本発明の治療剤は、遺伝子治療に有用である。本明細書にて使用されるとおり、「遺伝子治療」なる句は、遺伝によるか又は後天的な疾患又は症状を治療するか又は防ぐために宿主に興味のある遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を移し替えることを意味する。興味のある遺伝物質は、そのインビボの生産が望まれる生成物（例えば、蛋白質ポリペプチド、ペプチド又は機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば、興味のある遺伝物質は、治療上貴重なホルモン、受容体、酵素又は（ポリ）ペプチドをコードし得る。特定の態様において、主題の発明は、引用により本明細書に編入されるＨｕｇｈｅｓらの米国特許第６，１６９，０７８号に記載されたように、ジスルフィドリンカーが脂質のヘッドの極性基とテイルの親油性基の間に提供されるように、核酸と複合することができる非ウイルス性遺伝子治療における用途のために脂質分子のクラスを利用する。
【００７５】
本発明のこれらの治療化合物は、ＤＮＡと有効に複合して、異種ＤＮＡにより形質転換されるための細胞の細胞内空間への細胞膜を通したＤＮＡ移送を促進する。さらに、これらの脂質分子は、細胞のサイトプラズム内への異種ＤＮＡの放出を促進して、それによりヒト又は動物における治療の間、遺伝子のトランスフェクションを増加させる。
【００７６】
カチオン性脂質−ポリアニオンマクロ分子の凝集は、当業界において公知の様々な方法により形成してよい。代表的な方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８９７，３５５号；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６９８２−６９８６（１９８９）；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８−２５２（１９６５）；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ９（１９７９）；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４（１９７８）；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９（１９８４）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９（１９８３）；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７（１９８４）に開示されており、全て引用により本明細書に編入される。通常、凝集物は、（１）カチオン性脂質か又は（２）コリピッド（colipid）と混合されたカチオン性脂質の何れかからなる脂質粒子を調製し、次にポリアニオン性マクロ分子をほぼ室温（約１８から２６℃）において上記脂質粒子に添加することにより作成してよい。通常、保護された基の脱保護の助けとならない条件が選択される。一つの態様において、上記混合物を次に約１０分から約２０時間の期間にわたり凝集物を形成するようにするが、約１５から６０分がもっとも便利に使用される。他の時間の期間は、特定の脂質種に適切かもしれない。上記複合体は長期間にわたり形成してよいが、トランスフェクション効率の追加の増強は長期間の複合化により通常は得られない。
【００７７】
主題の発明の化合物及び方法は、所望の分子、例えばポリヌクレオチドを標的細胞へ細胞内送達するのに使用することができる。所望のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡまたはそれらの類似物からなり得る。本発明を用いて送達される所望のポリヌクレオチドは、制御機能、例えばプロモーター配列を有するヌクレオチド、又はポリペプチドをコードするヌクレオチドのような、別の機能又は活性を提供するヌクレオチド配列からなり得る。所望のポリヌクレオチドは、細胞内の他のヌクレオチド配列に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列を提供することもできる。例えば、所望のポリヌクレオチドは、細胞内で転写される場合、細胞内の他のヌクレオチド配列に対するアンチセンスの配列を有する。当該アンチセンス配列は、細胞内のセンス鎖配列にハイブリダイズできる。アンチセンス配列を提供するポリヌクレオチドは、当業者により容易に製造することができる。細胞へ送達される所望のポリヌクレオチドは、細胞内で二重鎖ＤＮＡと三重複合体を形成できるヌクレオチド配列を含むこともできる。
【００７８】
以下の実施例は、発明の修飾されたアネキシン蛋白質の製造と、修飾されたアネキシン蛋白質の抗凝血活性のインビトロ及びインビボのアッセイを例示する。発明が記載された例示の作業又は実施例において記載された特定の詳細に限定されないことは理解されるべきである。
【００７９】
実施例
実施例１：修飾されたアネキシンの製造
アネキシンは、ヒトの組織から精製するか又は組換え技術により生産することができる。例えば、アネキシンＶは、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９８７）により記載されたとおりにヒト胎盤から精製することができる。組換え生成物の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中のアネキシンＩＩとアネキシンＶの発現である（Ｋａｎｇ，Ｈ．−Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．９：９２−１０２（１９９９）；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７，２０００）。組換えＶの迅速かつ有効な精製方法は、ホスファチジルセリン含有リポソームへのＣａ2+−増強結合に基づき、ＥＤＴＡによるＢｅｒｇｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３２９：２５−２８（１９９３）に記載された。この手法は、固相支持体にカップリングされたホスファチジルセリンの使用により改善され得る。
【００８０】
アネキシンは、ペギレーション（pegylation）と呼ばれるプロセスにおけるいくつかのよく確立された手法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６により総説）の何れかによりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へカップリングされ得る。本発明は、モノ−又はポリ−（例えば２−４）ＰＥＧモイエティを有する化学誘導性アネキシン分子を含む。ペギル化された（pegylated）アネキシンを製造する方法は、（ａ）アネキシンが一つ又は複数のＰＥＧ群に結合するようになる条件下でポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）にアネキシンを反応させ、そして（ｂ）一つ又は複数の反応生成物を得る工程を含む。通常、上記反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーター及び所望の結果に基づいてケースバイケースにて決定されなければならない。さらに、上記の反応は異なる数のＰＥＧ鎖を有する異なる生成物を生産してよく、そして所望の生成物を得るためにさらに精製が必要になるかもしれない。
【００８１】
ＰＥＧのアネキシンＶへのコンジュゲートは、ＥＤＣプラススルフォＮＨＳ手法を用いて実施することができる。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド）を用いることにより、スルフォ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルフォサクシニミド）を用いて、カルボキシル酸基と活性エステル基を形成する。これは活性な中間体の安定性を増加させ、安定なアミド結合を提供するためにアミンと反応させる。上記コンジュゲーションはＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６に記載されたとおりに実施することができる。
【００８２】
バイオコンジュゲート法を用いることによりアネキシンのホモポリマー又はヘテロポリマーを生成することができる；方法はＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６に総説される。組換え法を用いることにより、融合蛋白質、例えばイムノグロブリンのＦｃ部分又は他の蛋白質と共に発現されたアネキシンを生成することもできる。アネキシンＩＩとＰ１１とのヘテロテトラマーもＥ．ｃｏｌｉにおいて生成された（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらの手法の全てはアネキシンの分子量を増加させ、そして循環におけるアネキシンの半減期を増加させる能力を有し、そしてその抗凝血作用を延長させる。
【００８３】
アネキシンＶのホモダイマーは図１に模式的に示され（５’−３’センス鎖）（配列番号：４）、且つ配列番号：６により表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ構築物を用いて生成することができる。この実施例においては、アネキシンＶ遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位において発現ベクターｐＣＭＶ ＦＬＡＧ２（シグマアルドリッチから利用可能）にクローン化する。アネキシンＶ配列の前と後の正確な配列は未知であり、「ｘ」と記す。よって、正確なコドンの整列化を保証するための修飾の前に、上記構築物を配列決定する必要がある。ｐＣＭＶ ＦＬＡＧ２ベクターは、内蔵の（built in）強力なプロモーター及び開始配列（Ｋｏｚａｋ）及び開始（ＡＴＧ）を付属する。各アネキシンＶ遺伝子前の開始コドンは、よって、除去されなければならず、そして厳重な発現のための停止コドンを第２アネキシンＶ遺伝子の末端に添加するべきである。当該ベクターは、蛋白質の精製のために使用できる８−アミノ酸のペプチド配列も付属する（ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ）（配列番号：９）。グリシン−セリンの回転（swivel）末端を有する１４−アミノ酸のスペーサーは、一列に並んだ遺伝子間の最適な回転を可能にする。制限部位ＰｖｕＩＩとＳｃａＩの追加は、必要であれば上記リンカーの除去を可能にする。プロテアーゼ部位の追加は発現に続く一列の蛋白質の分割を可能にする。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼはアマシャムファルマシアバイオテックから利用可能であり、一列に並んだ蛋白質を分割するのに使用できる。
アネキシンＶは以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＡＬＲＧＴＶＴＤＦＳＧＦＤＧＲＡＤＡＥＶＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＳＩＬＮＬＬＴＡＲＳＮＡＱＲＱＱＩＡＥＥＦＫＴＬＦＧＲＤＬＶＮＤＭＫＳＥＬＴＧＫＦＥＫＬＩＶＡＬＭＫＰＳＲＬＹＤＡＹＥＬＫＨＡＫＬＧＡＧＴＤＥＫＶＬＴＥＩＬＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱＡＹＥＥＥＹＧＳＮＬＥＤＤＶＶＧＤＴＳＧＹＹＱＲＭＬＶＶＬＬＱＡＮＲＤＰＤＴＡＩＤＤＡＱＶＥＬＤＡＱＡＬＦＱＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＥＫＦＩＴＩＬＧＴＲＳＶＳＨＬＲＲＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩＤＲＥＴＳＧＮＬＥＮＬＬＬＡＶＶＫＳＩＲＳＩＰＡＹＬＡＥＴＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＤＤＨＴＬＩＲＶＩＶＳＲＳＥＩＤＬＦＮＩＲＫＥＦＲＫＮＦＡＴＳＬＹＳＭＩＫＧＤＴＳＧＤＹＫＫＡＬＬＬＬＣＧＧＥＤＤ（＊停止）（配列番号：３）。
【００８４】
図１に例示されたＤＮＡ構築物内に示されるアネキシンＶのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＡＣＴＧＡ（配列番号：１）。
【００８５】
実施例２：インビトロ及びインビボアッセイ
インビトロアッセイは、修飾されたアネキシン蛋白質が活性化された血小板に結合する能力を決定する。アネキシンＶは血小板に結合し、この結合は血栓による血小板の活性化によりインビトロにおいて顕著に増加する（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｔａｉｔ，１９９０；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。好ましくは、本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、それらが血小板に結合して蛋白質Ｓが血小板に結合するのを防ぐことにおいて、アネキシンの機能を果たすような方法で製造される（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。修飾されたアネキシン蛋白質は、未修飾のアネキシン蛋白質が呈するのと同じ抗凝血活性をインビトロにて呈する機能も果たす。クロット形成時間を測定する方法は、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間である（Ｆｒｉｔｓｍａ，ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｒｒｉｖｅａｕ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓｍａ，Ｇ．Ａ．，編纂）Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８９），ｐｐ．９２−１２４，引用により本明細書に編入される）。
【００８６】
インビボアッセイはアネキシン蛋白質の抗血栓活性を測定する。アネキシンＶは、レーザーによるか又は光化学によりラット内で誘導された静脈の血栓症を軽減することが示された（Ｒｏｍｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。最大の抗凝血作用は、トロンボエラストグラフィーによる機能測定によれば、アネキシンＶの静脈内投与の１５分から３０分後に観察された。本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、未修飾のアネキシンの活性よりもそのようなモデルの方が、より長い延長された活性を好適に示す。アネキシンＶは、頸静脈の血栓症のウサギモデルにおいてフィブリンの累積（accretion）を低下させることもわかった（Ｖａｎ Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．１９９３）。空気注入を使用することにより内皮を除去し、そしてアネキシンＶは処置された静脈に結合するが、対照の反対側の静脈に結合しないことがわかった。損傷した静脈内のフィブリンの蓄積の低下は、全身性の抗凝血とは関連しなかった。ヘパリンは損傷した静脈内でフィブリンの蓄積を阻害しなかった。本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、この静脈血栓症のモデルにおいてアネキシンの機能を好適に果たす。動脈の血栓症のウサギモデルは、Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，１９９７により使用された。部分的に閉塞させる血栓を、電流の適用により左の頸動脈に形成させた。アネキシンＶの注入が血栓症を強く阻害したことが、血流、血流重量、標識されたフィブリンの堆積及び標識された血小板の蓄積の測定により証明された。最近、精巣挙筋内で光化学誘導された血栓のマウスモデルが導入された（Ｖｏｌｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：１６０−１６４（２００１），引用により本明細書に編入される）。この技術を用いて、血栓症はあらゆる所望の動脈又は静脈において誘導することができる。本発明の修飾されたアネキシン蛋白質は、全量一回投与の注射により投与された場合でさえも、そのようなモデルにおいてアネキシンの機能を好適に果たす。
【００８７】
実施例３
ヒト組換えアネキシンＶ及びペギル化ヒト組換えアネキシンＶの抗凝血能力をインビトロにて比較した。
アネキシンＶ生産。ポリメラーゼ鎖反応を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからの特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、イニシエーターメチオニンから停止コドンまでのｃＤＮＡを増幅した。フォワードプライマーはＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣ（配列番号：７）であり、そしてリバースプライマーはＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧ（配列番号：８）であった。増幅された１．１ｋｂの断片をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化して、原核発現ベクターｐＴＲＣ９９Ａに連結した。連結生成物を用いて、コンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５を形質転換して、配列決定した。
【００８８】
組換えアネキシンＶを、Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３により記載されたとおりに、いくらかの修飾を加えて、細菌溶解物から単離した。ｐＴＲＣ ９９Ａ−アネキシンＶにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５の一晩培養物を、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む新しいＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で５０倍に増殖させた。２時間後に、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌまで添加した。誘導１６時間後に、細菌を３５００ｇにて１５分間で４℃にて沈殿させた。細菌の沈殿物を、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ，５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含むＴＢＳ，ｐＨ７．５に懸濁した。上記の細菌の懸濁液を超音波プローブによりセッティング６にて氷上で３分間音波処理した。溶解物を１０，０００ｇにて１５分間遠心分離して、上清を、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む５０容のＴＢＳに対して２回透析して、５０容のＴＢＳに対して１回透析した。
【００８９】
マルチラメラリポソームを、ホスファチジルセリン、凍結乾燥したウシ脳抽出物、コレステロール及びクロロホルム中のジセチルホスフェートをモル比１０：１５：１にて溶解することにより作成して、コニカルフラスコ中で窒素流にて乾燥させた。ＴＢＳ（５ｍＬ）を上記フラスコに添加して、１分間激しくボルテックスミキサーにて振動させた。当該リポソームを１５分間３５００ｇの遠心分離により洗浄して、次に、上記細菌抽出物と共にインキュベートし、そして塩化カルシウムを最終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加した。３７℃における１５分間のインキュベーション後に、上記リポソームを１０，０００ｇにて１０分間の遠心分離により沈降させ、そして結合したアネキシンＶＩＩＩを１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡにより溶出した。溶出したアネキシンＶをアミコン限外濾過により濃縮して、セファクリル２００カラム上に負荷した。上記アネキシンＶを包含された容量に回収したが、ほとんどのリポソームは空隙容量内であった。アネキシンＶを含む画分をプールして、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ及び２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．１中で透析して、アニオン交換カラム上に負荷して、同じバッファー中の０から２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの直線勾配により溶出した。精製された調製物は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示した。
【００９０】
上記のとおりに生成されたアネキシンＶを、上記のとおり、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６の方法によりペギル化した。
抗−凝血アッセイ。
アネキシンＶ及びペギル化されたアネキシンＶにより誘導されたクロット形成時間（活性化された部分的なトロンボプラスチン時間）の延長を比較した。活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を、Ｆｒｉｔｓｍａ，１９８９において記載されたとおりに、クエン酸化された正常なプールされた血漿とアッセイした。異なる濃度の上記のとおりに生成されたアネキシンＶ及びペギル化されたアネキシンＶを用いて、クロット形成時間の延長に関する用量応答曲線を得た。結果を図２に示すが、クロット形成時間対アネキシンＶ及びペギル化されたアネキシンＶのプロットである。当該図面において示されるとおり、組換えヒトアネキシンＶとペギル化組換えヒトアネキシンＶの抗凝血能力は実質等価であった。観察された小さな違いは、ペギレーション後の分子量の変化に帰する。この実験は、アネキシンＶのペギレーションがその抗凝血作用を実質上減じることなしに達成できるという、本明細書になされた主張を確認する。
【００９１】
上記記載は発明の例示に過ぎないことに注意するべきである。様々な変更及び修飾が発明を逸脱することなしに当業者により工夫され得る。従って、本発明は、開示された発明の範囲内に入るそのような変更、修飾及び変動を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、アネキシンＶのホモダイマーを作成するためのＤＮＡ構築物を示す。
【図２】図２は、組換えヒトアネキシンＶとペギル化（pegylated）組換えヒトアネキシンＶの抗凝血能力を比較するインビトロアッセイの凝血時間のプロットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質をスクリーニングする方法であって、
ａ）血栓症試験システムを、血栓症を許容する条件下で、少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質に接触させ；
ｂ）上記試験修飾アネキシン蛋白質の存在下で抗血栓活性を評価し；そして
ｃ）試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性を、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓活性と比較し、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性の変化が血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質の指標である、上記方法。
【請求項２】
血栓症試験システムが、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を測定するシステムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法により同定された、血栓症を変調させる、修飾されたアネキシン蛋白質。
【請求項４】
アネキシン活性に関して修飾アネキシン蛋白質を同定する方法であって、
ａ）活性化された血小板を、結合を許容する条件下で、少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質に接触させ；
ｂ）上記血小板の試験修飾アネキシン蛋白質−結合活性を評価し；
ｃ）上記試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での蛋白質Ｓ−結合活性を評価し；そして
ｄ）試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での試験修飾アネキシン−結合活性と蛋白質−Ｓ結合活性を、未修飾のアネキシン蛋白質の存在下での未修飾アネキシン−結合活性と蛋白質Ｓ−結合活性と比較し、アネキシン活性を有する修飾されたアネキシン蛋白質を同定する、上記方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法により同定された、修飾されたアネキシン蛋白質。
【請求項１】
血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質をスクリーニングする方法であって、
ａ）血栓症試験システムを、血栓症を許容する条件下で、少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質に接触させ；
ｂ）上記試験修飾アネキシン蛋白質の存在下で抗血栓活性を評価し；そして
ｃ）試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性を、試験修飾アネキシン蛋白質の不在下での抗血栓活性と比較し、試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での抗血栓活性の変化が血栓症を変調させる修飾アネキシン蛋白質の指標である、上記方法。
【請求項２】
血栓症試験システムが、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間を測定するシステムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法により同定された、血栓症を変調させる、修飾されたアネキシン蛋白質。
【請求項４】
アネキシン活性に関して修飾アネキシン蛋白質を同定する方法であって、
ａ）活性化された血小板を、結合を許容する条件下で、少なくとも一つの修飾されたアネキシン蛋白質に接触させ；
ｂ）上記血小板の試験修飾アネキシン蛋白質−結合活性を評価し；
ｃ）上記試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での蛋白質Ｓ−結合活性を評価し；そして
ｄ）試験修飾アネキシン蛋白質の存在下での試験修飾アネキシン−結合活性と蛋白質−Ｓ結合活性を、未修飾のアネキシン蛋白質の存在下での未修飾アネキシン−結合活性と蛋白質Ｓ−結合活性と比較し、アネキシン活性を有する修飾されたアネキシン蛋白質を同定する、上記方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法により同定された、修飾されたアネキシン蛋白質。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２６３９９１（Ｐ２００８−２６３９９１Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３７７２８（Ｐ２００８−１３７７２８）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【分割の表示】特願２００２−５６７２２９（Ｐ２００２−５６７２２９）の分割
【原出願日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２１）
【出願人】（５０１０７２３７１）サーロメッド・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【分割の表示】特願２００２−５６７２２９（Ｐ２００２−５６７２２９）の分割
【原出願日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２１）
【出願人】（５０１０７２３７１）サーロメッド・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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