【課題】個体において骨形成を促進させること。
【解決手段】本発明は、ＧＰＲ１１９受容体を用いて、個体において骨質量を増加させるために有用な化合物を同定する方法に関する。ＧＰＲ１１９受容体のアゴニストは、骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療するためまたは予防するための、および個体において骨質量を増加させるための治療剤として有用である。ＧＰＲ１１９受容体のアゴニストは、個体において骨形成を促進する。ある実施形態において、上記個体はヒトである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＰＲ１１９受容体を用いて個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物を同定する方法に関する。ＧＰＲ１１９受容体のアゴニストは、骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するための、および個体において骨質量を増加させるための治療剤として有用である。ＧＰＲ１１９受容体のアゴニストは、個体において骨形成を促進する。
【背景技術】
【０００２】
以下の議論は、本発明の理解を容易とさせることを意図するが、本発明に対する先行技術であることを認めることを意図しない。
Ａ．骨粗鬆症
骨粗鬆症は骨質量の喪失および骨格構造のミクロ造型的劣化によって特徴付けられる廃疾病であり、危うい骨強度に導き、このことは患者を脆性骨折の増大した危険性に対して素因があるようにする。欧州、日本および合衆国において骨粗鬆症は７５００万人を超える人々が罹っており、欧州および合衆国単独において２３０万を超える骨折を引き起こす。合衆国において、骨粗鬆症は、全ての閉経後白人の婦人の少なくとも２５％が罹っており、該割合は８０歳を超える婦人で７０％まで上昇する。５０歳を超える３人の婦人のうち一人は骨粗鬆症的骨折を有し、これは社会に対してかなりの社会的かつ経済的負担を引き起こす。該疾患は婦人に限定されず；老齢の男性も罹り得る。２０５０年までには、男性における臀部骨折の世界的な発生率は３１０％まで増加すると試算されており、女性においては２４０％まで増加すると試算されている。臀部、前腕、および脊椎骨折の臨床的に示される人生における危険性は合計４０％程度であり、心血管病に対する危険性と匹敵する。従って、骨粗鬆症の特徴は実質的な死亡率、有病率、および経済的コストを引き起こす。老齢の集団では、骨粗鬆症骨折の数およびそのコストは、効果的な予防戦略が開発されるのでなければ、次の５０年で少なくとも２倍となるであろう（例えば、非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３参照）。
Ｂ．グルコース−依存性インスリン向性ポリペプチド（ＧＩＰ）
グルコース−依存性インスリン向性ポリペプチド（胃阻害性ポリペプチドとしても知られたＧＩＰ）は、食事摂取後に十二指腸内分泌Ｋ細胞から放出される４２アミノ酸のペプチドインクレチンホルモンである。放出されるＧＩＰの量は消費されるグルコースの量に大いに依存する。ＧＩＰは、膵臓ベータ細胞においてグルコース−依存性インスリン分泌を刺激することが示されている。ＧＩＰは特異的Ｇプロテイン−結合受容体、すなわち、ＧＩＰＲを介してその作用を媒介する。
【０００３】
ＧＩＰは２位においてアラニンを含有するため、ＧＩＰの分解を調節する酵素であるジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−ＩＶ）に対する優れた基質である。全長ＧＩＰ（１−４２）は腸Ｋ細胞からの分泌から数分以内に迅速に生物不活性ＧＩＰ（３−４２）に変換される。ＤＰＰ−ＩＶの阻害は、ＧＩＰ生物活性を増加させることが示されている（例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７参照）。例えば、血液中の全長生物活性ＧＩＰの分析は、Ｎ−末端−特異的アッセイを用いて行うことができる（例えば、非特許文献８参照）。
【０００４】
最近、ＧＩＰは骨形成を促進することが示されている。ＧＩＰは骨芽細胞受容体を活性化し、その結果、共に骨形成に関連する、コラーゲンＩ型合成およびアルカリ性ホスファターゼ活性の増加をもたらす。ＧＩＰはイン・ビトロにて破骨細胞の活性および分化を阻害することが示されている。ＧＩＰの投与は卵巣摘出による骨喪失を妨げることが示されている。ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）ノックアウトマウスは減少した骨のサイズ、より低い骨質量、変化した骨ミクロ造型（ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）および生化学的特性、および骨代謝回転についてのパラメーターの変化を、特に骨形成において示す（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；および非特許文献１３参照）。
【０００５】
骨の密度または形成を維持し、または増大させるためのＧＩＰの有用性は、ＧＩＰペプチドの投与による低下した骨ミネラル化の治療のための、特許文献１の発行によって合衆国特許商標局によって認められている。しかしながら、現在のＧＩＰペプチドアゴニストは経口生物学的利用性の欠如に悩んでおり、患者のコンプライアンスに負の影響を与える。魅力的な代替アプローチは、ＧＩＰ活性の内因性レベルを増加させるための経口的に活性な組成物を開発することである。
Ｃ．ＧＰＲ１１９
ＧＰＲ１１９はＧプロテイン−結合受容体である（ＧＰＲ１１９：例えば、ヒトＧＰＲ１１９、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセション Ｎｏ．ＡＡＰ７２１２５およびその対立遺伝子：例えば、マウスＧＰＲ１１９、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセション Ｎｏ．ＡＹ２８８４２３およびその対立遺伝子）。アゴニストによるようなＧＰＲ１１９活性化は細胞内ｃＡＭＰのレベルの上昇に至り、Ｇｓに結合しているＧＰＲ１１９に合致する。特許文献においては、ＧＰＲ１１９はＲＵＰ３と言われてきた（例えば、特許文献２）；ＧＰＲ１１９はグルコース−依存性インスリン向性受容体（ＧＤＩＲ）とも言われてきた。
Ｄ．Ｇプロテイン−結合受容体
多数の受容体クラスがヒトに存在するが、これまでに、最も豊富であって治療的に重要なのはＧプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）クラスによって示される。ヒトゲノム内には３０，０００〜４０，０００ほどの遺伝子があると見積もられており、これらの内、ほぼ２％はＧＰＣＲをコードすると見積もられている。
【０００６】
ＧＰＣＲは医薬製品の開発のための重要な領域を代表する。ＧＰＣＲにおいて活性な薬物は、疼痛、認識障害、高血圧、ペプシン潰瘍、鼻炎、および喘息のように多用なヒト疾患の広域スペクトルにわたって治療的効果を有する。ほぼ５００の臨床的に市販されている薬物の内、３０％を超えるものがＧＰＣＲ機能のモジュレーターである。これらの薬物はほぼ３０のよく性質決定されているＧＰＣＲにおいてその活性を発揮する（例えば、非特許文献１４参照）。
【０００７】
ＧＰＣＲは、その各々が膜を貫く７つのアルファヘリックスを形成する２２〜２４の間の疎水性アミノ酸の７つの配列を有する共通の構造的モチーフを保有する（各スパンは数字によって確認される、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）等）。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外部または「細胞外」側の膜貫通−２および膜貫通−３、膜貫通−４および膜貫通−５、および膜貫通−６および膜貫通−７の間のアミノ酸の鎖によって連結される（これらを、各々、「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）という）。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の内部または「細胞内」側の膜貫通−１および膜貫通−２、膜貫通−３および膜貫通−４、および膜貫通−５および膜貫通−６の間のアミノ酸の鎖によってやはり連結されている（これらを、各々、「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２およびＩＣ−３）という）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間に存在し、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の外側の細胞外空間に存在する。
【０００８】
一般に、リガンドは受容体と結合する場合（しばしば、受容体の「活性化」という）、細胞内領域および細胞内「Ｇプロテイン」の間の結合を容易とする受容体の立体配座の変化がある。ＧＰＣＲはＧプロテインに対して「無差別的（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」であり、すなわち、ＧＰＣＲは１を超えるＧプロテインと相互作用できると報告されている（非特許文献１５参照）。他のＧプロテインが存在するが、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏが同定されているＧプロテインである。リガンド−活性化ＧＰＣＲとＧ−プロテインとの結合はシグナルカスケードプロセス（「シグナル変換」という）を開始させる。通常の条件下では、シグナル変換は、最終的には、細胞活性化または細胞阻害をもたらす。理論に拘束されるつもりはないが、受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端はＧプロテインと相互作用すると考えられている。
【０００９】
また、Ｇ１５またはＧ１６のような、ＧＰＣＲの数個のクラスをホスホリパーゼＣ経路に結合させるように見える無差別的なＧプロテイン（非特許文献１６）、または非常に多数のＧＰＣＲを同じ経路（例えば、ホスホリパーゼＣ経路）に結合させるように設計されたキメラＧプロテイン（非特許文献１７）がある。
【００１０】
生理学的な条件下では、ＧＰＣＲは二つの異なる立体配座：「不活性な」状態および「活性な」状態の間が平衡して細胞膜に存在する。不活性な状態の受容体は細胞内シグナリング変換経路に結合して、生物学的応答に導くシグナル変換を開始することができない。受容体の立体配座を活性な状態に変化させることは、（Ｇ−プロテインを介する）変換経路への連結を可能とし、生物学的応答を生じる。
【００１１】
受容体はリガンド、または薬物のような化合物によって活性な状態に安定化させることができる。受容体のアミノ酸配列に対する改変を含むが、それに限定されない最近の発見は、活性な状態の立体配座において受容体を促進し、および安定化するためのリガンドまたは薬物以外の手段を提供する。これらの手段は、受容体へのリガンド結合の効果を刺激することによって活性な状態に受容体を効果的に安定化させる。そのようなリガンド−非依存性手段による安定化は「構成的受容体活性化」といわれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
本発明をここで添付する図面との関係で説明する。
【図１Ａ】図１は、野生型マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果の薬物動態学分析を示す。Ａ．ＧＰＲ１１９アゴニストとしての化合物１を用いて行うタイムコース分析。
【図１Ｂ】図１は、野生型マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果の薬物動態学分析を示す。Ｂ．ＧＰＲ１１９アゴニストとしての化合物３を用いて行われるタイムコース分析。
【図１Ｃ】図１は、野生型マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果の薬物動態学分析を示す。Ｃ．ＧＰＲ１１９アゴニストとしての化合物３を用いて行われる用量力価決定分析。
【図２Ａ】図２は、野生型マウスと比較した、ＧＰＲ１１９−欠損（ノックアウト）マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果を示す。Ａ．ＧＰＲ１１９アゴニストとしての化合物１を用いて比較を行った。
【図２Ｂ】図２は、野生型マウスと比較した、ＧＰＲ１１９−欠損（ノックアウト）マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果を示す。Ｂ．比較は、ＧＰＲ１１９アゴニストとしての化合物２を用いて比較を行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＧＰＲ１１９受容体を用いて、個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物を同定する方法をその要旨とする。ＧＰＲ１１９受容体のアゴニストは、骨粗しょう症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するための、および個体において骨質量を増加させるための治療剤として有用である。本発明は、少なくとも部分的には、経口投与によるなどの、ＧＰＲ１１９アゴニストの個体への投与は、ＧＰＲ１１９受容体において作用して、個体においてＧＩＰレベルを増加させることができるという出願による驚くべき発見に基づく。
【０２２８】
本明細書中で用いるように、用語「リガンド」は、ＧＰＲ１１９のような、ポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、テスト化合物）を意味するべきである。リガンドは、例えば、ポリペプチド、脂質、小分子、抗体であってよい。化合物１はＧＰＲ１１９受容体ポリペプチドの例示的なリガンドである（化合物１の化学的構造および化学的名称を記載する表Ａ参照）。化合物１は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１２６７（ＷＯ ２００４／０６５３８０として公開）に開示された化合物と同一である。（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミン（表Ａ参照）は、ＧＰＲ１１９受容体ポリペプチドの例示的なリガンドである。化合物２は、ＧＰＲ１１９受容体ポリペプチドの例示的なリガンドである。化合物２は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２４１７（ＷＯ ２００５／００７６５８として公開）に開示された化合物と同一である。化合物３はＧＰＲ１１９受容体ポリペプチドの例示的なリガンドである。化合物３は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２３２７（ＷＯ ２００５／００７６４７として公開）に開示された化合物と同一である。内因性リガンドは、ＧＰＲ１１９のような天然ポリペプチドに対する内因性天然リガンドであるリガンドである。リガンドは「アンタゴニスト」、「アゴニスト」、「部分的アゴニスト」または「逆アゴニスト」などであってよい。
表Ａ．
【０２２９】
【化１】

本明細書中で用いるように、用語「アゴニスト」は、ＧＰＣＲへの結合によって、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘導するようにＧＰＣＲを活性化する剤（例えば、リガンド、テスト化合物）を意味するべきである。
【０２３０】
用語「部分的アゴニスト」は、本明細書中で用いるように、ＧＰＣＲへの結合によって、全アゴニストよりも程度は低いが、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘導するようにＧＰＣＲを活性化する剤（例えば、リガンド、テスト化合物）を意味すべきである。
【０２３１】
用語「アンタゴニスト」は、アゴニストまたは部分的アゴニストと同一の部位の辺りにてＧＰＣＲに結合し、好ましくは競合的に結合するが、ＧＰＣＲの活性な形態によって開始される細胞内応答を活性化せず、それにより、アゴニストまたは部分的アゴニストによって細胞内応答を阻害することができる剤（例えば、リガンド、テスト化合物）を意味すべきである。アンタゴニストは、典型的には、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下でベースライン細胞内応答を減少させない。
【０２３２】
用語「逆アゴニスト（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）」は、ＧＰＣＲに結合し、かつアゴニストまたは部分的アゴニストの非存在下で観察される正常な基礎レベル活性未満の受容体の活性形態によって開始されるベースライン細胞内応答を阻害する剤（例えば、リガンド、テスト化合物）を意味すべきである。
【０２３３】
本明細書中で用いるように、用語「ＧＰＲ１１９アゴニスト」とは、ＧＰＲ１１９受容体に結合し、アゴニストとして作用する化合物をいう。化合物１は例示的なＧＰＲ１１９アゴニストである（化合物１の化学的構造および化学的名称を記載する表Ａ参照）。化合物１は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１２６７（ＷＯ ２００４／０６５３８０として公開）に開示された化合物と同一である。（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンは例示的なＧＰＲ１１９アゴニストである。化合物２は例示的なＧＰＲ１１９アゴニストである。化合物２は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２４１７（ＷＯ ２００５／００７６５８として公開）に開示された化合物と同一である。化合物３は例示的なＧＰＲ１１９アゴニストである。化合物３は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２３２７（ＷＯ ２００５／００７６４７として公開）に開示された化合物と同一である。
【０２３４】
本明細書中で用いるように、用語「選択的ＧＰＲ１１９アゴニスト」とは、コルチコトロピン−放出因子−１（ＣＲＦ−１）受容体のような１以上の関連受容体に対する選択性を超えるＧＰＲ１１９受容体に対する選択性を有するＧＰＲ１１９アゴニストをいう。化合物１は例示的な選択的ＧＰＲ１１９アゴニストである（化合物１の化学的構造および化学的名称を記載する表Ａ参照）。化合物１は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１２６７（ＷＯ ２００４／０６５３８０として公開）に開示された化合物と同一である。（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンは例示的な選択的ＧＰＲ１１９アゴニストである。化合物２は例示的な選択的ＧＰＲ１１９アゴニストである。化合物２は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２４１７（ＷＯ ２００５／００７６５８として公開）に開示された化合物と同一である。化合物３は例示的な選択的ＧＰＲ１１９アゴニストである。化合物３は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２３２７（ＷＯ ２００５／００７６４７として公開）に開示された化合物と同一である。
【０２３５】
用語「ＧＩＰ分泌促進薬」は、細胞、例えば、腸内分泌細胞においてＧＩＰの分泌を促進する、または脊椎動物または哺乳動物のような個体への投与に際して、全ＧＩＰのレベル、例えば、血中または血漿中全ＧＩＰのレベルを増加させる剤（例えば、リガンド、テスト化合物）を意味すべきである。ある実施形態において、ＧＩＰ分泌促進薬は、個体において、全ＧＩＰのレベル、例えば、血中または血漿中全ＧＩＰのレベルを増加させるのに適当な化合物である。
【０２３６】
本明細書中で用いるように、用語「個体」とは、限定されるものではないが、（商業的に養殖された魚類、ペット魚類等のような）魚類、（カエル、ヒキガエル、ペット両生類等のような）両生類、（ヘビ、トカゲ、カメ、ペット爬虫類等のような）爬虫類、（ニワトリ、シチメンチョウ、ペット鳥類等のような）鳥類、および（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、非−ヒト霊長類、非−ヒト哺乳動物、ペット非−ヒト哺乳動物、ヒト等のような）哺乳動物を含めた脊椎動物をいう。ある実施形態において、個体は魚類である。ある実施形態において、個体は両生類である。ある実施形態において、個体は爬虫類である。ある実施形態において、個体は鳥類である。ある実施形態において、個体はシチメンチョウである。過去２５年以上にわたって、より大きな胸筋肉質量を持つシチメンチョウに対する商業的な選択圧がかけられ、骨格一体性に対する要求を増大させた。しかしながら、増大した胸筋肉質量は、骨格の補償的変化によって達成されており、シチメンチョウ産業が脚問題の増加を経験するという結果を招いた。若い成体雄シチメンチョウにおける長骨の骨折が報告されている（例えば、Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ（２０００）７９：６０２−６０８参照）。ある実施形態において、個体は哺乳動物である。ある実施形態において、個体はマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、非−ヒト霊長類または非−ヒトである（これは個々に、あるいはいずれかの組合せにて本発明の実施形態に含むことができる）。ある実施形態において、個体はウマである。競馬、馬術および他の競争イベントのような活動に関与するウマであるパフォーマンスウマは骨折に罹りやすい。ある実施形態において、個体はイヌまたはネコである。ある実施形態において、個体は（イヌ、ネコ等のような）ヒト愛玩動物、（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ等のような）農場動物、（ウマ、イヌ等のような）スポーツ動物、（ラバ、ラクダ等のような）荷役用動物、または（動物園で見出される動物等のような）外国産動物であり、これは個々に、またはいずれかの組合せにて本発明の実施形態に含むことができる。ある実施形態において、個体は非−ヒト哺乳動物である。ある実施形態において、個体は（アカゲザル、チンパンジー等のような）非−ヒト霊長類である。ある実施形態において、個体はヒトである。
【０２３７】
本明細書中で用いるように、用語「予防または治療を必要とする」とは、個体が処置を必要とする、または処置から利益を受けるであろうという看護人（例えば、ヒトの場合には、医師、看護師、看護実行者；非−ヒト脊椎動物、および特別な実施形態において、非−ヒト哺乳動物の場合には獣医）によってなされる判断をここではいう。
【０２３８】
本明細書中で用いるように、用語「治療有効量」または「治療有効用量」とは、研究者、獣医、医療医師または他の臨床家によって求められている、組織、系、動物、個体またはヒトにおいて生物学的または医学的応答を誘導する活性な化合物または医薬剤の量をいい、該応答は以下のうちの１以上を含む：
（１）疾患の予防；例えば、疾患、状態または障害に対して素因があるが、疾患の病理学または兆候学を未だ経験したことがなく、または示したことがない個体における疾患、状態または障害の予防、
（２）疾患の阻害；例えば、疾患、状態または障害の病理学または兆候学を経験している、または示している個体における疾患、状態または障害の阻害（すなわち、病理学および／または兆候学のさらなる発生の阻止）、および
（３）疾患の緩和；例えば、疾患、状態または障害の病理学または兆候学を経験している、または示している個体における疾患、状態または障害の緩和（すなわち、病理学および／または兆候学の逆行）。
【０２３９】
本明細書中で用いるように、用語「治療効果」とは、研究者、獣医、医療医師または他の臨床家によって求められている組織、系、動物、個体またはヒトにおける生物学的または医学的応答の誘導をいい、それは以下のうちの１以上を含む：
（１）疾患の予防；例えば、疾患、状態または障害に対して素因があるが、疾患の病理学または兆候学を未だ経験していない、または示していない固体における疾患、状態または障害の予防、
（２）疾患の阻害；例えば、疾患、状態または障害の病理学または兆候学を経験している、または示している個体における疾患、状態または障害の阻害（すなわち、病理学および／または兆候学のさらなる発生の阻止）、および
（３）疾患の緩和；例えば、疾患、状態または障害の病理学または兆候学を経験している、または示している個体における、疾患、状態または障害の緩和（すなわち、病理学および／または、兆候学の逆行）。
【０２４０】
用語「予防するのに有効な量」とは、予防することが求められている生物学的または医学的事象の発生の危険性を予防し、または低下させる薬物の量をいう。多くの場合、予防するのに有効な量は治療有効量と同一である。
【０２４１】
用語「組成物」は、少なくとも１つの成分を含む物質を意味すべきである。
【０２４２】
用語「有効成分」は、疾患の診断、治癒、軽減、治療または予防において薬理学的活性または他の直接的効果を供するいずれの成分も意味すべきである。
【０２４３】
用語「医薬組成物」は、少なくとも１つの有効成分を含む組成物を意味し、それにより、該組成物は哺乳動物における調査および処置に使用することができる。
【０２４４】
「医学上許容できる」とは、担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または塩が処方の他の成分と適合し、その受容者に有害でないことを意味する。
【０２４５】
用語「投与形態」は、錠剤、カプセル、または注射剤のような、薬物が生産され、分注される物理的形態を意味すべきである。
【０２４６】
「骨」とは、密な有機マトリックスおよび無機のミネラル成分を含む、ほとんどの脊椎動物の骨格の主な部分を形成する密な、半−剛性の、多孔性の石灰化された結合組織を意図する。骨は、脊椎動物の骨格を作り上げる多数の解剖学的に区別される構造のいずれかである。
【０２４７】
用語「骨質量」および「骨ミネラル密度（ＢＭＤ）」は、本明細書中においては相互交換的に使用される。ヒトにおけるＢＭＤは、通常、標準的なＸ線写真撮影技術、デュアルエネルギーＸ−線吸収測定（ＤＸＡ）によって決定される。ＢＭＤにアクセスするために開発された多くの技術のうち、ＤＸＡは最も高度に技術的に開発され、かつ最も徹底的に生物学的に確証されている。適切に適合されたソフトウェアと共にＤＸＡ技術を用いて、動物実験において信頼性よくＢＭＤを評価することもできる。ＤＸＡは骨粗鬆症の診断、予後（骨折予測）、障害の天然履歴のモニタリング、および治療に対する応答の評価で用いられる。
【０２４８】
本明細書中で用いるように、用語「低骨質量」は、個体における骨ミネラル密度（ＢＭＤ）のいずれの減少または低下もいい、世界保健機構（ＷＨＯ）による提案で定義されたように骨粗鬆症および骨減少症を共に含む。ＷＨＯは、若い成人参照平均の１標準偏差内のＢＭＤの値として正常を定義している（Ｔ−スコア≧−１）。ＷＨＯは、若い成人平均から１標準偏差未満を超えるが、この値から２．５標準偏差未満未満であるＢＭＤの値として骨減少症を定義している（Ｔ−スコア＜−１および＞−２．５）。ＷＨＯは、骨減少症のよりひどい形態として骨粗鬆症を特徴付けており、それを、若い成人の平均から２．５標準偏差以上低いＢＭＤの値によってそれを定義している（Ｔ−スコア≦−２．５）（例えば、その開示をここで引用してその全体を援用するＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ９２１（２００３），Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍａｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ参照）。より通常には、骨減少症は−１未満かつ−２を超えるＴ−スコアとして定義されており、骨粗鬆症は−２未満またはそれと同等なＴ−スコアとして定義されている。本発明のある実施形態において、Ｔ−スコアはＤＸＡにて臀部で決定される。
【０２４９】
本明細書中で用いるように、用語「骨粗鬆症」は若い成人参照平均から２標準偏差以上低いＢＭＤ２の値によって定義され（Ｔ−スコア≦−２）、あるいは看護人（例えば、ヒトの場合には医師、看護師、看護実行者；非−ヒト脊椎動物の場合には獣医）によってなされた診断をいう。
【０２５０】
骨粗鬆症は一次または二次いずれかとして分類することができる（例えば、Ｗｏｒｌｄ
Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ９２１（２００３），Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍａｎｔ
ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ参照）。本明細書中で用いるように、用語「骨粗鬆症」は一次骨粗鬆症および二次骨粗鬆症を含む。ある実施形態において、骨粗鬆症は一次骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は二次骨粗鬆症である。
【０２５１】
本明細書中で用いるように、「一次骨粗鬆症」は閉経（天然、未熟または外科的）、老化または双方に伴う。本発明においては、閉経（天然、未成熟または外科的）に関連する一次骨粗鬆症、老化に関連する一次骨粗鬆症、および閉経および老化に関連する一次骨粗鬆症は個々にまたはいずれかの組合せにて実施形態に含めることができる。
【０２５２】
本明細書中で用いるように、「二次骨粗鬆症」とは、閉経または老化に関連しないが、むしろ、医学的状態に、または投薬または薬物の使用に関連する骨粗鬆症をいう。骨粗鬆症の増大した危険性は、限定されるものではないが、内分泌および代謝障害、および悪性状態を含めた医学的状態の宿主に、およびある投薬および薬物（その例は当業者によく知られている）の使用に関連する（例えば、その開示をここで引用してその全体を援用するＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ９２１（２００３），Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍａｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；参照）。二次骨粗鬆症は固定化にも関連し得る。医学的状態、投薬または薬物の使用に、または固定化に対して二次的である骨粗鬆症の診断は看護人（例えば、ヒトの場合には医師、看護師、看護実行者；非−ヒト脊椎動物の場合における獣医）によってなされ得る。
【０２５３】
「骨折」とは、骨の完全なまたは不完全な破断、または破壊またはひび割れを意図する。骨折の診断は、通常、臨床的調査および放射線学的知見に依存する。本発明においては、骨折は、限定されるものではないが、外傷骨折、長期骨折、および病理学的骨折を含む。
【０２５４】
本明細書中で用いるように、「外傷骨折」とは、骨の天然弾性を超える局所的損傷の程度を伴う閾値上外傷を含む即座の骨折をいうべきである。それには、柔軟組織および、非常にしばしば、皮膚に対する同時負傷を伴い得る。外傷骨折は閉鎖的であり得る（隣接する柔軟組織は負傷し得るが、被覆する柔軟部分はかなり維持される）。外傷骨折は開放的であり得る（骨の破断した端部は広範な柔軟組織負傷によって遊離され、従って、外側からの病原体が直接的に創傷に進入し得る）。
【０２５５】
本明細書中で用いるように、「長期骨折」とは、慢性骨折、疲労骨折、ストレス骨折または自然発生骨折型Ｉをいうべきである。
【０２５６】
本明細書中で用いるように、「病原性骨折」とは、自然発生骨折ＩＩ型をいうべきである。病理学的骨折は、それを占める適切な外傷なくして、自然発生的に生起する。該骨は前進病（例えば、骨粗鬆症、骨ジストロフィー、またはパジェット変形性骨炎）によって、または局所的骨疾患病巣（例えば、転移、放射線骨壊死、または骨腫瘍）によって、従前に損傷されている。Ａｄｌｅｒ，Ｃｌａｕｓ−Ｐｅｔｅｒ，ＢＯＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，ｐ．１１４（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ ２０００）参照。
【０２５７】
骨折は、限定されるものではないが、斜めトーション（ｏｂｌｉｑｕｅ ｔｏｒｓｉｏｎ）骨折、横方向骨折、細分化骨折、圧縮骨折、肋骨骨折、クリーピング骨折、および骨折した大腿頸部も含む（Ａｄｌｅｒ，Ｃｌａｕｓ−Ｐｅｔｅｒ，ＢＯＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ ２０００））。
【０２５８】
本明細書中で用いるように、用語「低骨質量によって特徴付けられる状態」は、限定されるものではないが、骨減少症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、歯周状態、歯槽骨喪失、骨摘出骨喪失、子供時代の原発性骨喪失、脊髄の湾曲、および身長の喪失を含む。ある実施形態において、骨粗鬆症は一次骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は二次骨粗鬆症である。ある実施形態において、二次骨粗鬆症は医学的状態に関連する。ある実施形態において、二次骨粗鬆症は投薬または薬物の使用に関連する。ある実施形態において、二次骨粗鬆症は固定化に関連する。低骨質量によって特徴付けられる状態は、限定されるものではないが、パジェット病、転移性癌による骨喪失、および新形成病、放射線療法または化学療法によって引き起こされるもののような骨溶解病巣も含む。低骨質量によって特徴付けられる状態は、限定されるものではないが、脊髄の湾曲、高さの喪失、および補綴外科的処置のような骨粗鬆症の長期合併症を含む。本発明においては、低骨質量によって特徴付けられる状態は、個々に、またはいずれかの組合せにて実施形態に含めることができる（例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を援用するＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ９２１（２００３），Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．（２００２），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；およびＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｅｌｉｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．（２００１），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ
Ｃｏｍｐａｎｙ参照）。
【０２５９】
本明細書中で用いるように、「骨疾患」とは、骨の異常に関連する障害または状態をいう。骨質量または骨成長を増加させることによって、本発明に従って治療することができる骨疾患は、限定されるものではないが、骨減少症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、歯周病、歯槽骨喪失、骨摘出骨喪失、子供時代の原発性骨喪失、脊髄の湾曲、および身長の喪失を含む。ある実施形態において、骨粗鬆症は一次骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は二次骨粗鬆症である。ある実施形態において、二次骨粗鬆症は医学的状態に関連する。ある実施形態において、二次骨粗鬆症は投薬または薬物の使用に関連する。ある実施形態において、二次骨粗鬆症は固定化に関連する。骨質量または骨成長を増加させることによって、本発明に従って治療することができる骨疾患は、限定されるものではないが、パジェット病および転移性癌による骨喪失も含む。骨質量または成長を増加させることによって、本発明に従って治療することができる破壊的骨障害は、限定されるものではないが、骨粗鬆症、変形性関節症、および新形成病、放射線療法もしくは化学療法によって引き起こされるもののような骨溶解病巣を含む。本発明において、骨の質量または成長を増加させることによって、本発明に従って治療することができる骨疾患は、個々に、またはいずれかの組合せにて実施形態に含めることができることは理解されるべきである。（例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を援用するＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ
Ｓｅｒｉｅｓ ９２１（２００３），Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．（２００２），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；およびＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｅｌｉｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．（２００１），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ参照）。
【０２６０】
本発明は、限定されるものではないが、顔面再形成、上顎再形成、下顎再形成、歯周病または抜歯後の増強された骨治癒、増強された長骨延長、増強された補綴内部成長および増大した骨結合を含めた、骨質量または骨成長を増加させることによって、本発明に従う治療からの利益を奪う他の状態にも関連する。
【０２６１】
用語「内因性」は、個体（例えば、限定されるものではないが、ヒト）が天然に生じる物質を意味すべきである。対照的には、「非−内因性」は、個体（例えば、限定されるものではないが、ヒト）によって天然に生産されないものを意味すべきである。
【０２６２】
Ｇプロテイン−結合受容体の、用語「生物学的に活性な断片」は、天然に生じるＧＰＣＲの構造的および生化学的機能を有するＧＰＣＲの断片を意味すべきである。ある実施形態において、生物学的に活性な断片はＧプロテインに結合する。ある実施形態において、生物学的に活性な断片はＧＰＣＲの公知のリガンドに結合する。
【０２６３】
用語「プライマー」は、本明細書中においては、標的ヌクレオチド配列に対して相補的であって、それを用いて、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする特異的ヌクレオチド配列を示すように用いる。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合についての開始点として働く。
【０２６４】
用語「発現ベクター」は、発現ベクターのための適切な宿主細胞組換え体において、クローン化ＤＮＡの転写、および転写されたｍＲＮＡの翻訳で必要なＤＮＡ配列を意味すべきである。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数の能力、および活性なプロモーターを含むべきである。転写すべきクローン化されたＤＮＡは、発現ベクター内の構成的にまたは条件的に活性なプロモーターに作動可能に連結される。
【０２６５】
用語「宿主細胞」は、その中に取り込まれたベクターを有することができる細胞を意味すべきである。この関係においては、ベクターは、典型的には、適当なプロモーター配列と作動可能に連結された、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ融合蛋白質をコードする核酸を含有して、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ融合蛋白質の発現を起こるようにする。特別な実施形態において、宿主細胞は真核生物宿主細胞である。ある実施形態において、真核生物宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。ある実施形態において、真核生物宿主細胞は酵母宿主細胞である。ある実施形態において、真核生物宿主細胞はメラニン保有宿主細胞である。
【０２６６】
用語「接触する」または「接触している」は、少なくとも２つの部位を一緒にすることを意味すべきである。
【０２６７】
用語「調節する」または「改変する」は、特定の活性、機能または分子の量、質、または効果の増加または減少をいうように採用されるべきである。説明として、かつ限定されるものではないが、Ｇプロテイン−結合受容体のアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストは受容体のモジュレーターである。
【０２６８】
用語「小分子」は、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物を含む）、ならびにその塩、エステルおよび他の医薬的に許容される形態を含めた、モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有する化合物を意味するように採用されるべきである。ある実施形態において、小分子は、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物である。ある実施形態において、小分子はモル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物である。ある実施形態において、小分子はモル当たり約８００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物である。ある実施形態において、小分子は分子当たり約６００グラム未満の分子量を有する無機または有機化合物である。ある実施形態において、小分子はモル当たり約５００グラム未満の分子量を有する無機または有機化合物である。
【０２６９】
本明細書中で用いるアミノ酸の略語は表Ｂに記載する：
表Ｂ
【０２７０】
【化２−１】

【０２７１】
【化２−２】

用語「ポリペプチド」とは、ポリマーの長さに関係することなくアミノ酸のポリマーをいうべきである。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、蛋白質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後改変を特定したり排除したりしない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドは、用語ポリペプチドによって例示的に含まれる。
【０２７２】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単一鎖形態または二本鎖形態いずれかにて、１を超えるヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列をいうべきである。本発明のポリヌクレオチドは、合成、組換え、エクス・ビボ生成、またはその組合せを含めたいずれかの公知の方法、ならびに当該分野で知られたいずれかの精製方法の利用によって調製することができる。
【０２７３】
用語「抗体」は、本明細書中においては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことを意図する。
【０２７４】
用語「第二のメッセンジャー」は、受容体活性化の結果として生じる細胞内応答を意味すべきである。第二のメッセンジャーは、例えば、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ_３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ^２＋を含むことができる。第二のメッセンジャー応答は、受容体活性化の決定のために決定することができる。
【０２７５】
用語「受容体機能性」とは、限定されるものではないが、遺伝子転写の調節、イオンの流入または流失の調節、触媒反応の実行、および／または第二のメッセンジャー応答の誘導のようなＧ−プロテインを介する活性の調節を含めた、細胞において刺激を受け取り、および効果を和らげる受容体の正常な作動をいうべきである。
【０２７６】
用語「応答」または「受容体機能性」との関係での用語「刺激する」または「刺激している」は、受容体の応答または機能性が化合物の非存在下におけるのとは反対に化合物の存在下で増加することを意味すべきである。
【０２７７】
用語「応答」または「受容体機能性」との関係での用語「阻害する」または「阻害している」は、受容体の機能性の応答が化合物の非存在下におけるのとは反対に化合物の存在下で減少し、または予防されることを意味すべきである。
【０２７８】
用語「化合物の効力」は、受容体結合親和性とは反対に、受容体機能性を阻害し、または刺激する化合物の能力の測定値を意味すべきである。
【０２７９】
「候補化合物」と本明細書中においては相互交換的に用いられる用語「テスト化合物」は、スクリーニング技術に使用できる分子（例えば、限定されるものではないが、化学的化合物）を意味すべきである。
【０２８０】
Ｇプロテイン−結合受容体との関係での用語「構成的に活性」は、Ｇプロテイン−結合受容体がアゴニスト−非依存性活性を呈することを意味すべきである。
【０２８１】
句「テスト化合物」との関係での用語「直接的に同定する」または「直接的に同定された」は、Ｇプロテイン−結合受容体に対する公知のリガンド（例えば、公知アゴニスト）の非存在下におけるＧプロテイン−結合受容体に対する化合物のスクリーニングを意味すべきである。
【０２８２】
ある範囲の値が供される場合、その範囲の上方および下方限界、および述べられた範囲におけるいずれかの他の述べられたまたは介入する値の間の、より低い限界の１／１０に対する各介入値は、文脈が明瞭にそうではないことを指令するのでなければ、本発明に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の情報および下方限界は、独立して、より小さな範囲に含むことができ、また、述べられた範囲におけるいずれかの具体的に排除された範囲に従い、本発明にやはり含まれる。述べられた範囲が限界の一方または双方を含む場合、それらの含まれた限界のいずれかまたは双方を排除する範囲も本発明に含まれる。
Ａ．導入
以下のセクションの順序は提示効率について記載されるものであって、開示または特許請求の範囲に対する限定と指定とされるものではなく、又そう解釈されるべきではない。Ｂ．受容体の発現
１．目的のＧＰＣＲポリペプチド
本発明のＧＰＣＲは；
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５、ここで、ＧＰＣＲは配列番号２のアミノ酸配列を含まない；
（ｄ）特異的なプライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体のアミノ酸配列；
（ｅ）高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２の改変体；
（ｇ）
（ｉ）配列番号２に対して少なくとも約８０％同一性を有するＧプロテイン−結合受容体のアミノ酸配列；および
（ｉｉ）配列番号２の少なくとも２０連続アミノ酸を含むＧプロテイン−結合受容体のアミノ酸配列；
よりなる群から選択される場合の（ｆ）アミノ酸配列
（ｈ）配列番号２を有するＧプロテイン−結合受容体の構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；および
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれか１つの生物学的活性な断片；
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は内因性Ｇプロテイン−結合受容体である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされ、かつ内因性Ｇプロテイン−結合受容体であるＧプロテイン−結合受容体は哺乳動物Ｇプロテイン−結合受容体であるいくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされ、かつ内因性Ｇプロテイン−結合受容体であるＧプロテイン−結合受容体は哺乳動物ＧＰＲ１１９受容体である。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応のよって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、配列番号２またはその対立遺伝子である。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、配列番号２の対立遺伝子である。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は特異的に化合物１に結合する（化合物１の化学的構造および化学的名称を記載する表Ａ参照）。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、特異的に（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに結合する。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値にて、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値にて（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが約５μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける該受容体にてＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。ある実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおいて該受容体にてＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧプロテイン−結合受容体は検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、ヒトＤＮＡはゲノムＤＮＡである。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲ技術は当業者によく知られている。いくつかの実施形態において、ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ１１９を発現する組織または細胞型に由来するヒトｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ１１９を発現するヒト組織は膵臓または膵臓島である。ある実施形態において、ｃＤＮＡは、ＧＰＲ１１９を発現するヒト細胞型からのものである。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは膵臓ベータ細胞系からのものである。いくつかの実施形態において、本発明のＧＰＣＲは組換え体である。いくつかの実施形態において、組換えＧＰＣＲは組換えヒトＧＰＲ１１９である。
【０２８６】
ある実施形態において、主題の方法で用いてもよいＧＰＣＲは検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、本発明のＧＰＣＲは内因性である。いくつかの実施形態において、本発明のＧＰＣＲは哺乳動物ＧＰＲ１１９である。いくつかの実施形態において、内因性である本発明のＧＰＣＲは哺乳動物ＧＰＲ１１９である。
【０２８７】
説明であって限定されるものではないが、Ｎ−末端メチオニン残基の欠失は、主題の発明で用いてもよい生物学的活性な断片を供すると考えられる。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片は、そのＮ−末端において、化合物１に特異的に結合するＮ−末端メチオニン残基および（ヘマグルチニンインフルエンザウィルスからの）ＨＡエピトープタグを含むペプチドに所望により融合した断片である。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片は、そのＮ−末端において、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合するＮ−末端メチオニン残基および（ヘマグルチニンインフルエンザウィルスからの）ＨＡエピトープタグを含むペプチドに所望により融合した断片である。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片は、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値にて、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する、Ｎ−末端メチオニン残基およびＨＡエピトープタグを含むペプチドにそのＮ−末端において所望により融合した断片である。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片は、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値にて、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する、Ｎ−末端メチオニン残基およびＨＡエピトープタグを含むペプチドにそのＮ−末端において所望により融合した断片である。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおいて当該ペプチドにそのＮ−末端にて所望により融合した当該断片にてＥＣ_５０値を有するアゴニストである、Ｎ−末端メチオニン残基およびＨＡエピトープタグを含むペプチドにそのＮ−末端にて所望により融合した断片である。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片であって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う前細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおいて当該ペプチドにそのＮ−末端において所望により融合した当該断片におけるＥＣ_５０値を有するアゴニストである、Ｎ−末端メチオニン残基およびＨＡエピトープタグを含むペプチドにそのＮ−末端において所望により融合した断片である。いくつかの実施形態において、本発明の生物学的に活性な断片は、検出可能なレベルの構成的な活性を呈するＮ−末端メチオニン残基およびＨＡエピトープタグを含むペプチドにそのＮ−末端において所望により融合した断片である。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。ある実施形態において、断片は、実質的に、Ｎ−末端メチオリン残基およびＨＡエピトープタグよりなるペプチドにそのＮ−末端にて融合している。Ｎ−末端メチオニン残基およびＨＡエピトープタグを含む、または実質的にそれよりなるペプチドをポリペプチド断片のＮ−末端に融合させる技術は当該分野で良く知られており、商業的に入手することができる（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
【０２８８】
配列番号２のヒトＧＰＲ１１９の対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。ヒトＧＰＲ１１９は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２８９】
配列番号２のヒトＧＰＲ１１９の脊椎動物オルソログである改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。配列番号２のヒトＧＰＲ１１９の哺乳動物オルソログである改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。説明として、かつ限定されるものではないが、マウスＧＰＲ１１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセションＮｏ．ＡＹ２８８４２３）、ラットＧＰＲ１１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセションＮｏ．ＡＡＮ９５１９５）、ハムスターＧＰＲ１１９、イヌＧＰＲ１１９、および非−ヒト霊長類ＧＰＲ１１９は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２９０】
ある実施形態において、配列番号２の改変体はＧＰＣＲである。
【０２９１】
配列番号２に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一性を有する配列番号２の改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。ある実施形態において、配列番号２に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一性を有する配列番号２の改変体はＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、配列番号２の改変体は内因性ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、配列番号２の改変体は非−内因性ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、内因性ＧＰＣＲである配列番号２の改変体は哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２の改変体は特異的に化合物１に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、特異的に、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約１０μＭ未満、５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従った受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値をもって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値をもって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける当該受容体におけるＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける当該受容体でのＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。いくつかの実施形態において、配列番号２の改変体は検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性は、メラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。パーセント同一性は、公知のコンピュータプログラムを用いて慣用的に決定することができる。
【０２９２】
ある実施形態において、主題の方法で用いることができる改変体ＧＰＣＲは、配列番号２に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号２に対して９５％「同一性」を有する改変体ＧＰＣＲとは、それが配列番号２の各１００アミノ酸当たり５までのアミノ酸改変を含むことができる以外は、該改変体のアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸１〜３３５に対して同一であることを意味する。したがって、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を得るためには、配列中のアミノ酸残基の５％（１００のうち５）までが、配列番号２のアミノ酸１〜３３５と比較して挿入され得るか、欠失され得るか、またはもう１つのアミノ酸で置き換え得る。これらの改変は、アミノまたはカルボキシ末端における箇所、あるいはそれらの末端位置の間の、配列中の残基の間で各々に、あるいは配列内の１以上の連続基にとして介在した箇所の、いずれかの箇所で起こることができる。
【０２９３】
ある実施形態において、主題の方法で用いることができる改変体Ｇプロテイン−結合受容体は、いくつかのアミノ酸の欠失、置換、および／または付加を有する配列番号２に由来するアミノ酸配列を有するＧプロテイン−結合受容体である。ある実施形態において、主題の方法で用いることができる改変体Ｇプロテイン−結合受容体は、配列番号２のアミノ酸配列において、１０以下の保存的アミノ酸置換および／または３以下の非−保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２に由来するアミノ酸配列を有するＧプロテイン−結合受容体である。ある実施形態において、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは、相互の代わりに保存的に置き換えることができ；グルタミン酸およびアスパラギン酸は相互に保存的に置き換えることができ；グルタミンおよびアスパラギン酸は相互に保存的に置き換えることができ；ロイシン、イソロイシンおよびバリンは相互に保存的に置き換えることができ；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは相互に保存的に置き換えることができ；およびグリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニンは相互に保存的に置き換えることができる。アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加はいずれの位置（例えば、Ｃ−またはＮ−末端、または内部位置）におけるものであってもよい。いくつかの実施形態において、改変体は内因性Ｇプロテイン−結合受容体である。いくつかの実施形態において、改変体は内因性脊椎動物Ｇプロテイン−結合受容体である。いくつかの実施形態において、改変体は内因性哺乳動物Ｇプロテイン−結合受容体である。いくつかの実施形態において、改変体は内因性ヒトＧプロテイン−結合受容体である。いくつかの実施形態において、改変体は非−内因性Ｇプロテイン−結合受容体である。いくつかの実施形態において、改変体は検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。ある実施形態において、配列番号２に由来するアミノ酸配列を有する該Ｇプロテイン−結合受容体は、化合物１がリガンドであるＧプロテイン−結合受容体である。ある実施形態において、配列番号２に由来するアミノ酸配列を有する該Ｇプロテイン−結合受容体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値を有するリガンドであるＧプロテイン−結合受容体である。ある実施形態において、配列番号２に由来するアミノ酸配列を有する該Ｇプロテイン−結合受容体は、化合物１がアゴニストであるＧプロテイン−結合受容体である。ある実施形態において、配列番号２に由来するアミノ酸配列を有する該Ｇプロテイン−結合受容体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおけるＥＣ_５０値を有するアゴニストであるＧプロテイン−結合受容体である。
【０２９４】
配列番号２の少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００連続アミノ酸を含むＧプロテイン−結合受容体である配列番号２の改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。ある実施形態において、配列番号２の少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００連続アミノ酸を含む配列番号２の改変体はＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、配列番号２の改変体は内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２の改変体は非−内因性ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、内因性ＧＰＣＲである配列番号２の改変体は哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２の改変体は化合物１に特異的に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０でもって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従った受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値でもって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける当該受容体でのＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。ある実施形態において、配列番号２の改変体は、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける当該受容体でのＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。いくつかの実施形態において、配列番号２の改変体は検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。いくつかの実施形態において、配列番号２の少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００連続アミノ酸を含むＧプロテイン−結合受容体は検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、主題の方法で用いることができる改変体ＧＰＣＲは、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲである。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは内因性ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは非−内因性ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ内因性ＧＰＣＲであるＧＰＣＲは、哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、配列番号２またはその対立遺伝子である。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、配列番号２の対立遺伝子である。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは配列番号２のオルソログである。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは化合物１に特異的に結合する。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値でもって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、約１０μＭ未満、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満の、後記実施例１２に従う受容体結合アッセイにおけるＩＣ_５０値でもって、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンに特異的に結合する。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約５μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける当該受容体でのＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。ある実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミンが、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の、後記実施例８に従う全細胞アデニリルシクラーゼアッセイにおける当該受容体でのＥＣ_５０値を有するアゴニストである受容体である。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を呈する。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られている。いくつかの実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェンシーの条件）は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｎＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍＬの変性された剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃における一晩のインキュベーション、続いての約６５℃における０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を含む。いくつかの実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェンシーの条件）は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｎＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃における一晩のインキュベーション、続いての、約５０℃、約５５℃、約６０℃、または約６５℃における０．１ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中での、または０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中での洗浄を含む。いくつかの実施形態において、該高ストリンジェンシーの条件は０．１×ＳＳＣでの６５℃における洗浄を含む。いくつかの実施形態において、該高ストリンジェンシーの条件は、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳでの、または０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳでの約５０℃、約５５℃、約６０℃、または約６５℃における洗浄を含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、主題の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む非−内因性の構成的に活性化された受容体であり、ここで、配列番号２のアミノ酸２２４位におけるロイシンはロイシン以外のアミノ酸で置き換えられている。いくつかの実施形態において、ロイシン以外のアミノ酸はリジンである。いくつかの実施形態において、ロイシン以外のアミノ酸はアラニンである。いくつかの実施形態において、ロイシン以外のアミノ酸はアルギニンである。いくつかの実施形態において、ロイシン以外のアミノ酸はヒスチジンである。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。
【０２９７】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、配列番号２を有するＧプロテイン−結合受容体の構成的に活性なバージョンを含む。いくつかの実施形態において、受容体の構成的に活性なバージョンは、配列番号２を有する内因性の構成的に活性なバージョンである。いくつかの実施形態において、受容体の構成的に活性はバージョンは、配列番号２のアミノ酸２２４位に位置する突然変異を有する非−内因性の構成的に活性なバージョンである。いくつかの実施形態において、突然変異した残基はロイシン以外の残基に突然変異している。いくつかの実施形態において、突然変異した残基はリジン残基に突然変している。いくつかの実施形態において、突然変異した残基はアラニン残基に突然変異している。いくつかの実施形態において、突然変異した残基はアルギニン残基に突然変異している。いくつかの実施形態において、突然変異した残基はヒスチジン残基に突然変異している。いくつかの実施形態において、構成的活性は細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させるためのものである。いくつかの実施形態において、構成的な活性はメラニン保有細胞が色素分散を受けるようにするためのものである。
【０２９８】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲはＧプロテインとで融合蛋白質の一部を形成する。
ａ．配列同一性
ある実施形態において、パーセント同一性は、当該分野で良く知られたＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（基本的局所整列サーチツール）（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価される［例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を援用するＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−２７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２参照］。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトパラメーターにて、またはユーザーによって供された改変されたパラメーターにて用いることができる。好ましくは、パラメーターはデフォルトパラメーターである。
【０２９９】
ある実施形態において、グローバル配列整列とも言われる、クエリー配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）および照会される配列の間の最良な総マッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．（その開示をここで引用してその全体を援用するＣｏｍｐ Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列整列において、クエリー配列および照会された配列は共にアミノ酸配列である。該グローバル配列整列の結果はパーセント同一性で表す。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列で用いる好ましいパラメーターは：マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−組＝２、ミスマッチペナルティ＝１、接合ペナルティ＝２０、ランダム化群＝２５、長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列の長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７、またはいずれがより短いかにかかわらず、照会されたアミノ酸配列の長さである。もし照会された配列が、内部欠失のためにではなく、Ｎ−またはＣ−末端欠失のためにクエリー配列よりも短いならば、パーセント同一性で表した結果は手動で修正しなければならない。なぜならば、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバルパーセント同一性を計算する場合に、照会された配列のＮ−およびＣ−末端切断を説明しないからである。クエリー配列に対し、Ｎ−およびＣ−末端において切断された照会された配列では、パーセント同一性は、対応する照会された配列残基とマッチ／整列しない、照会された配列のＮ−およびＣ−末端であるクエリー配列の残基の数を、クエリー配列の合計塩基のパーセントとして計算することによって修正される。残基がマッチ／整列されたか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセンテージを、特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性から差し引いて、最終パーセント同一性スコアに到達する。この最終パーセント同一性スコアは、本発明の目的のために用いられるものである。クエリー配列とマッチ／整列しない照会された配列のＮ−およびＣ−末端に対する残基のみ（すなわち、照会された配列の最もＮ−およびＣ−末端側の残基の外側のクエリーアミノ酸残基のみ）が、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的で考慮される。
【０３００】
例えば、９０アミノ酸残基の照会された配列を１００−残基クエリー配列と整列させて、パーセント同一性を決定する。欠失は照会された配列のＮ−末端で起こり、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列はＮ−末端における第一の残基とマッチ／整列しない。１０の不対残基は配列の１０％を表し（マッチしないＮ−およびＣ−末端における残基の数／クエリー配列における残基の合計数）、従って、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから１０％を差し引く。もし残りの９０残基が完全にマッチすれば、最終パーセント同一性は９０％となろう。もう１つの例において、９０−残基の照会された配列は１００−残基クエリー配列と比較される。今回、欠失は内部であり、従って、クエリーとマッチ／整列しない、照会された配列のＮ−またはＣ−末端において残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性は手動では修正されない。もう一度言うと、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、クエリー配列とマッチ／整列されない、主題の配列のＮ−およびＣ−末端の外側の残基位置のみが手動で修正される。本発明の目的では他の修正はなされない。
ｂ．融合蛋白質
ある実施形態において、目的のポリペプチドは融合蛋白質であり、例えば、アフィニティータグドメインまたはレポータードメインを含有することができる。適当なアフィニティータグは、もう１つの部位、通常もう１つのポリペプチド、最も通常には抗体に特異的に結合することができるいずれのアミノ酸配列も含む。適当なアフィニティータグは、当該分野で知られているように、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、（ヘマグルチニンインフルエンザウィルスからの）ＨＡタグ、ｍｙｃタグなどを含む。適当なアフィニティータグは、当該分野で公知のように、結合基質が知られているドメイン、例えば、ＨＩＳ、ＧＳＴおよびＭＢＰタグ、および特異的結合パートナー、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体が利用できる他の蛋白質からのドメインも含む。適当なアフィニティータグは、適当な結合パートナー、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ受容体を用いて特異的に結合し、検出することができる、ＩｇＧ Ｆｃ領域のようないずれかの蛋白質−蛋白質相互作用ドメインも含む。そのような融合蛋白質が、そのＮ−末端メチオニン残基が欠失されているか、または代替アミノ酸で置換されたかのいずれかであるＧＰＣＲとイン−フレーム融合された異種Ｎ−末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含有することができると明示的に考えられる。
【０３０１】
適当なレポータードメインは、ポリペプチドの存在を報告することができるいずれのドメインも含む。アフィニティータグを用いて、例えば、タグに特異的に結合する標識された抗体を用いてポリペプチドの存在を報告することができるが、発光レポータードメインがより通常に用いられる。適当な発光レポータードメインは（例えば、ホタル、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＲｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉからの）ルシフェラーゼ、またはその発光改変体を含む。他の適当なレポータードメインは（例えば、クラゲ、サンゴ、およびＡｅｑｕｏｒｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｒｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種からのもののような他の腔腸動物からの）蛍光蛋白質、またはその発光改変体を含む。これらのレポーター蛋白質の発光改変体は当該分野で非常によく知られており、天然レポーター蛋白質と比べてより明るく、より暗く、または異なる励起および／または発光スペクトルを有することができる。例えば、当該分野で知られているように、いくつかの改変体はそれらがもはや緑色ではなく、青色、シアン、黄色、増強された黄赤色（各々、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ ｅＹＦＰおよびＲＦＰという）に見え得、または他の発光スペクトルを有し得るように改変される。他の適当なレポータードメインは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚性アルカリ性ホスファターゼのような、生化学的または色の変化を通じてポリペプチドの存在を報告することができるドメインを含む。
【０３０２】
また、当該分野で知られているように、アフィニティータグまたはレポータードメインは目的のポリペプチドにおけるいずれの位置に存在してもよい。しかしながら、ほとんどの実施形態において、それらは目的のポリペプチドのＣ−またはＮ−末端に存在する。
２．目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸 核酸を操作するための遺伝子暗号および組換え技術は知られており、かつ目的のＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列は上記のように記載されているため、目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸の設計および生産は十分に当業者の技量内のものである。ある実施形態において、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）方法を用いる。例えば、本明細書中に記載する必要がない種々の組換え技術のいずれか１つ、またはその組合せを用い、ＧＰＣＲコーディング配列をＧＰＣＲコーディング配列のライブラリーから単離することができる。蛋白質をコードする核酸配列におけるヌクレオチドの引き続いての置換、欠失および／または付加もまた標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うこともできる。例えば、部位特異的突然変異誘発およびサブクローニングを用いて、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の核酸残基に導入し／それを欠失し／それを置換することができる。他の実施形態において、ＰＣＲを用いることができる。目的のポリペプチドをコードする核酸分子を、完全にオリゴヌクレオチドからの化学的合成によって作製することもできる（例えば、Ｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７：１０１６−８）。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、例えば、特定の種、特に哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、非−ヒト霊長類、またはヒト種の細胞で最適化される。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に両生類種の細胞における発現のために最適化される。
ａ．ベクター
本発明は、さらに、主題の核酸を含むベクター（「構築体」ともいう）を提供する。本発明の多くの実施形態において、主題の核酸配列は、この配列が、例えば、プロモーターを含めた発現制御配列に作動可能に連結された後に宿主において発現されるであろう。主題の核酸は、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一体的部分として宿主細胞中で複製することができる発現ベクターに入れられる。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能とするために、選択マーカー（例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシン）を含有するであろう（例えば、ここで引用して援用する米国特許第４，７０４，３６２号参照）。単一およびデュアル発現カセットベクターを含めたベクターは当該分野で良く知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。適当なベクターはウィルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体など）、ミニ−染色体などを含む。レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ−関連ウィルスベクターを用いることができる。
【０３０３】
細胞中でポリペプチドを生産する目的で、種々の発現ベクターが当該分野で利用可能であり、それは（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから）商業的に入手可能な発現ベクターを含む。商業的に入手可能な発現ベクターは、非限定的例として、ＣＭＶプロモーター−ベースのベクターを含む。１つの適当な発現ベクターはｐＣＭＶである。発現ベクターはアデノウィルスであってよい。例示的なアデノウィルスベクターはＯｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＡｄＥａｓｙ^ＴＭとして購入することができる（その各々の開示をここで引用してその全体を援用するＨｅＴＣ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９８）９５：２５０９−２５１４；および米国特許第５，９２２，５７６号）。他の発現ベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【０３０４】
主題の核酸は通常、目的の主題のポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、しかしながら、ある実施形態においては、目的のポリペプチドの発現のための宿主細胞は真核生物細胞、例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞であってよいため、オープンリーディングフレームはイントロンによって中断されていてもよい。主題の核酸は、典型的には、主題の核酸に加えて、ＲＮＡ安定性、翻訳効率などを指令できる３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有することができる転写単位の一部である。主題の核酸は、主題の核酸に加えて、目的のポリペプチドの転写および発現を指令するプロモーター、および転写ターミネーターを含有する発現カセットの一部でもあり得る。
【０３０５】
真核生物プロモーターは、ウィルスプロモーターおよび真核生物遺伝子に由来するプロモーターを含めた、真核生物宿主細胞において機能的ないずれのプロモーターでもあり得る。例示的な真核生物プロモーターは限定されるものではないが：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ，１９８４）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン（Ｅｃｄｙｓｏｎｅ）−応答性プロモーター、テトラサイクリン−応答性プロモーターなどを含む。ウィルスプロモーターは一般には特に強力なプロモーターであるため、特に目的のものであり得る。ある実施形態において、標的病原体のプロモーターであるプロモーターを用いる。本発明で用いるプロモーターは、それらが、導入される細胞型（および／または動物）で機能的であるように選択される。ある実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【０３０６】
ある実施形態において、主題のベクターは選択可能なマーカーの発現を提供することができる。適当なベクターおよび選択マーカーは当該分野で良く知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）で議論されている。種々の異なる遺伝子が選択マーカーとして使用されており、選択マーカーとして主題のベクターで使用される特定の遺伝子は便宜のため主として選択される。公知の選択マーカー遺伝子は：チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ｔｅｒｔ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒまたはｃａｔ、ｋａｎｒまたはｎｅｏｒ（アミノグリコシドトランスフェラーゼ遺伝子）ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。上記したように目的のポリペプチドは、アフィニティードメインおよび／またはレポータードメインを含有する融合蛋白質であってもよい。例えば、ＧＰＣＲのＣ−またはＮ−末端における、レポーターまたはタグとＧＰＣＲとの間の融合を行うための方法は、十分に、当業者の技量内のものであり（例えば、ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９ ５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１，３１５−３２３）、さらには記載しない。そのような融合蛋白質は、そのＮ−末端メチオニン残基が欠失されたか、または代替アミノ酸で置換されたかのいずれかのＧＰＣＲとイン−フレーム融合された異種Ｎ−末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含有することができると明示的に考えられる。目的のポリペプチドはまず天然ポリペプチドから作製され、次いで、上記したように適当なレポーター／タグに作動可能に連結することができると認められる。
【０３０７】
主題の核酸は、通常、目的のポリペプチドをコードする核酸の構築を容易とするために、制限部位、多数クローニング部位プライマー結合部位、連結可能末端、組換え部位などを含有してもよい。
ｂ．宿主細胞
本発明は、さらに、主題の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適当な宿主細胞は原核生物、例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ならびに真核生物細胞、例えば、動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類または爬虫類細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞）、または真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）を含む。ある実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現に適したいずれの細胞も宿主細胞として用いることができる。通常、動物宿主細胞系が用いられ、その例は以下の通りである：サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３［「２９３」］，Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ＨＥＫ−２９３Ｔ［「２９３Ｔ」］細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣−細胞（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；シリアンゴールドハムスター細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９５９５）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１）。ある実施形態において、メラニン保有細胞を用いる。メラニン保有細胞は下等脊椎動物で見出される皮膚細胞である。関連する材料および方法は米国特許第５，４６２，８５６号および米国特許第６，０５１，３８６号の開示に従う。これらの特許の開示をここで引用してその全体を援用する。
【０３０８】
さらなる細胞系は当業者に明らかであり、広く種々の細胞系がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９から入手可能である。
Ｃ．候補化合物のスクリーニング
１．遺伝子ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
Ｇプロテイン受容体が活性となると、それはＧプロテイン（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合し、ＧＴＰのＧプロテインへの結合を刺激する。次いで、ＧプロテインはＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰへゆっくりと加水分解し、それにより、受容体は正常な条件下では脱活性化される。しかしながら、活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰへ変化させ続ける。ＧＴＰの加水分解不能アナログである［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、活性化された受容体を発現する膜への増強された結合をモニターすることができる。［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、リガンドの非存在下および存在下において膜へのＧプロテイン結合をモニターすることができる。当業者によく知られ、利用され得る例の中でもこのモニタリングの例は、１９９５年にＴｒｙｎｏｒ ａｎｄ Ｎａｈｏｒｓｋｉによって報告された。このアッセイシステムの好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングのためのものである。何故ならば、システムは、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特別なＧプロテインと無関係に全てのＧプロテイン−結合受容体に総括的に適応可能であるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
一旦、候補化合物が「総括的」Ｇプロテイン−結合受容体アッセイ（すなわち、アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いて同定されたならば、ある実施形態においては、化合物が受容体部位において相互作用したことを確認するためにさらにスクリーニングすることが好ましい。例えば、「総括的」アッセイによって同定された化合物は受容体に結合せず、代わりに、細胞内ドメインからのＧプロテインから「結合解除」するにすぎない場合がある。
ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ
Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）は、他方、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒する；したがって、Ｇｓプロテインに結合する活性化されたＧＰＣＲは増大した細胞レベルのｃＡＭＰと会合する。他方、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）蛋白質に結合する活性化されたＧＰＣＲは減少した細胞レベルのｃＡＭＰに会合する。一般に、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”Ｃｈｐｔ．８，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（３ｒｄ Ｅｄ．）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ ｅｄｓ．Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）参照。したがって、ｃＡＭＰを検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、受容体に対する逆アゴニストであるかを（すなわち、そのような化合物がｃＡＭＰレベルを減少させるかを）決定することができる。ｃＡＭＰを決定するための当分野で知られた種々のアプローチを利用することができ；いくつかの実施形態において、好ましいアプローチはＥＬＩＳＡ−ベースのフォーマットでの抗−ｃＡＭＰ抗体の使用に依拠する。利用することができるもう１つのタイプのアッセイは、全細胞第二メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードする蛋白質の発現を駆動する。環状ＡＭＰは、ｃＡＭＰ−応答性ＤＮＡ結合蛋白質、または次いで、ｃＡＭＰ応答エレメントと呼ばれる特異的部位においてプロモーターに結合する転写因子（ＣＲＥＢ）を促進することによって遺伝子発現を駆動し、遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に複数ｃＡＭＰ応答エレメントを含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。したがって、活性化されたＧｓ−結合受容体はｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、これは、次いで、遺伝子、およびレポーター蛋白質の発現を活性化する。次いで、標準的な生化学アッセイを用い、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポーター蛋白質を検出することができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５）。
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、これは、今度は、リン脂質ＰＩＰ_２を加水分解し、２つの細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ_３）を放出する。ＩＰ_３の増加した蓄積はＧｑ−およびＧｏ−関連受容体の活性化に関連する。一般に、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”Ｃｈｐｔ．８，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（３ｒｄ Ｅｄ．）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ ｅｄｓ．Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）参照。ＩＰ_３蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、Ｇｑ−またはＧｏ−関連受容体に対する逆アゴニストであるか（すなわち、そのような化合物はＩＰ_３のレベルを減少させるのであろうか）を決定することができる。Ｇｑ−関連受容体は、Ｇｑ−依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を引き起こし；したがって、活性化されたＧｑ−関連受容体はそのような遺伝子の発現の増加を証明し、次いで、それに対する逆アゴニストはそのような発現の減少を証明し、アゴニストはそのような発現の増加を証明する点で、ＡＰＩ受容体アッセイを用いて調べることもできる。そのような検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
３．ＧＰＣＲ融合蛋白質
逆アゴニストまたはアゴニストの直接的同定のための候補化合物のスクリーニングで用いるための、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲまたは非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲの使用は、当然のこととして、受容体がそれに結合した内因性リガンドの非存在下においてさえ活性である点で、興味深いスクリーニングチャレンジを供する。したがって、例えば、候補化合物の存在下における非−内因性受容体とその化合物の非存在下における非−内因性受容体との間を、そのような化合物が逆アゴニストまたはアゴニストであり得るか、またはそのような影響を受容体に有しないかに関する理解を供する目的で識別するために、いくつかの実施形態においては、そのような識別を増強することができるアプローチを利用するのが好ましい。いくつかの実施形態において、好ましいアプローチはＧＰＣＲ融合蛋白質の使用である。
【０３０９】
一般に、一旦、上記したアッセイ技術（ならびに当業者に知られた他のアッセイ技術）を用いて非−内因性ＧＰＣＲが構成的に活性化されたことが決定されれば、内因性ＧＰＣＲと結合する支配的なＧプロテインを決定することが可能である。ＧプロテインのＧＰＣＲへの結合は、評価することができるシグナリング経路を提供する。いくつかの実施形態においては、スクリーニングは、哺乳動物またはメラニン保有細胞発現系（系それ自体は、内因性Ｇプロテインをその中で有すると予測される）を用いて行うのが好ましい。したがって、当然のこととして、そのような系においては、非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲは継続的にシグナルを発する。いくつかの実施形態において、このシグナルは、増強されることが好ましく、それにより、例えば、受容体に対する逆アゴニストの存在下で、逆アゴニストと接触する受容体との間を、特にスクリーニングの関係でより容易に識別できるようにする可能性が高い。
【０３１０】
ＧＰＣＲ融合蛋白質は、ＧＰＣＲとのＧプロテイン結合の効率を増強させることを意図する。ＧＰＣＲ融合蛋白質は、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲまたは非−内因性の構成的に活性なＧＰＣＲいずれかでのスクリーニングに好ましいであろう。何故ならば、そのようなアプローチは、そのようなスクリーニング技術で一般化されたシグナルを増加させるからである。これは、有意な「ノイズに対するシグナル」比率を容易化するのに重要であり；そのような有意な比率は、本明細書中に開示された候補化合物のスクリーニングのために好ましい。
【０３１１】
ＧＰＣＲ融合蛋白質の発現で有用な構築体の構築は、当業者の技術範囲内のものである。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系は、研究者の特別な要望に適合し得る種々のアプローチを供する。そのようなＧＰＣＲ融合蛋白質構築体の構築における重要な基準は、限定されるものではないが、ＧＰＣＲ配列およびＧプロテイン配列双方がイン−フレームであること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲについての配列がＧプロテイン配列の上流にある）、およびＧＰＣＲの「停止」コドンは、ＧＰＣＲの発現に際して、Ｇプロテインもまた発現することができるように欠失または置換されることを含む。ＧＰＣＲは直接的にＧプロテインに連結させることができ、あるいは２つの間にスペーサー残基が存在し得る（好ましくは、約１２以下であるが、この数字は当業者によって容易に確認できる）。便宜上、スペーサーを用いるのが好ましい。いくつかの実施形態において、非−内因性ＧＰＣＲに結合するＧ蛋白質はＧＰＣＲ融合蛋白質構築体の作製に先立って同定されているのが好ましい。上記したように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに結合する活性化されたＧＰＣＲは、チャレンジしたＧＰＣＲのタイプに基づいてｃＡＭＰ作製アッセイの形成を阻害すると予測される（すなわち、ｃＡＭＰシグナルは、例えば、アゴニスト（さらにこのシグナルを減少させるであろう）の活性化に際して減少し、それによって、アゴニストの直接的同定を行う）。本明細書中に開示されているように、これらのタイプの受容体について、生（ｖｉａｂｌｅ）シクラーゼベースアッセイを確立する努力において、ＧＰＣＲの内因性Ｇプロテインに基づかないＧＰＣＲ融合蛋白質を作製することが可能であることが確かめられている。したがって、例えば、内因性Ｇｉ結合受容体をＧｓ蛋白質に融合させることができ、そのような融合構築体は、発現に際して、内因性ＧＰＣＲを、シクラーゼ−ベースアッセイを確立することができるように、「天然の」Ｇｉ蛋白質よりはむしろＧｓと結合するよう、「駆動する」または「強いる」。したがって、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏ結合受容体では、いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲ融合蛋白質を用い、かつアッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づく場合、融合構築体がＧｓ（または酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する同等なＧプロテイン）で確立されるのが好ましい。
表Ｃ
【０３１２】
【化３】

同等に有効なのは、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚまたはＧｏ蛋白質と融合したＧｑ蛋白質を利用するＧ蛋白質融合構築体である。いくつかの実施形態において、好ましい融合構築体は、Ｇ−プロテインα−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６つのアミノ酸が欠失され、ＧαｑのＣ−末端における最後の５つのアミノ酸が目的のＧプロテインのＧαの対応するアミノ酸で置き換えられたＧｑ蛋白質で達成することができる。例えば、融合構築体は、Ｇｉ蛋白質と融合したＧｑ（６アミノ酸欠失）を有することができ、その結果、「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築体」がもたらされる。この融合構築体は、第二のメッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがｃＡＭＰ生産の代わりに決定できるように、内因性Ｇｉ結合受容体を、その非−内因性ＧプロテインであるＧｑに結合させるであろう。
４．標的Ｇｉ結合ＧＰＣＲのシグナル−増強剤Ｇｓ結合ＧＰＣＲとの共−トランスフェクション（ｃＡＭＰベースのアッセイ）
Ｇｉ結合受容体はアデニリルシクラーゼを阻害することが知られており、従って、ｃＡＭＰレベルチャレンジの評価をすることができるｃＡＭＰ生産のレベルを低下させる。ある実施形態においては、活性化に際して圧倒的にＧｉに結合する受容体の活性化の表示としてｃＡＭＰの生産の減少を決定する効果的な技術は、活性化に際して圧倒的にＧｓと結合するシグナル増強剤、例えば、非−内因性の構成的に活性化された受容体（例えば、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ；後記参照）を、Ｇｉ結合ＧＰＣＲで共−トランスフェクトすることによって達成することができる。明らかなように、Ｇｓ結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰの生産の増加に基づいて決定することができる。Ｇｉ結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰの生産の減少に導く。したがって、共−トランスフェクションアプローチは、これらの「反対」効果を有利に利用することを意図する。例えば、非−内因性の構成的に活性化されたＧｓ結合受容体（「シグナル増強剤」）の、発現ベクター単独との共−トランスフェクションは、ベースラインｃＡＭＰシグナルを供する（すなわち、Ｇｉ結合受容体はｃＡＭＰレベルを減少させるが、これが、この「減少」は、構成的に活性化されたＧｓ結合シグナル増強剤によって確立されたｃＡＭＰレベルの実質的増加に対するものであろう）。次いで、標的増強剤を「標的受容体」で共−トランスフェクトすることによって、Ｇｉ結合標的受容体の逆アゴニストは測定されるｃＡＭＰシグナルを増加させ、他方、Ｇｉ結合標的受容体のアゴニストはこのシグナルを減少させるであろう。
【０３１３】
このアプローチを用いて直接的に同定される候補化合物を独立して評価して、これらがシグナル増強受容体を標的化しないことを確認すべきである（これは、共−トランスフェクトされた受容体に対するスクリーニングに先立って、または後に行うことができる）。組成物／処方および治療の方法
ＧＰＲ１１９アゴニストは、当該分野でよく知られた技術を用い、本発明に従う使用のために医薬組成物および医薬に処方することができる。適当な処方は選択された投与経路に依存する。ある実施形態において、該投与は非−ヒト脊椎動物に対するもの、または非−ヒト哺乳動物に対するものである。
【０３１４】
本発明の療法、すなわち、ＧＰＲ１１９アゴニストに関する療法に関するように、本発明による化合物はいずれかの適当な方法で投与することができる。適当な投与の経路は、当該分野で知られた方法を用いる、経口、鼻腔、直腸、経粘膜、経皮、または腸投与、筋肉内、皮下、脊髄内注射を含めた非経口送達、ならびにクモ膜下腔内、直接的心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、肺内（吸入）または眼内注射を含む。他の適当な投与経路はエアロゾルおよびデポ処方物である。本発明の医薬の徐放性処方物、特に、デポ剤が明示的に考えられる。ある好ましい実施形態において、本発明による化合物は経口投与される。本発明による化合物は、錠剤、カプセル、粉末、シロップ、エリキシルなど、エアロゾル、滅菌溶液、懸濁液またはエマルジョンなどのような個体または液体形態で作製することができる。ある実施形態において、ＧＰＲ１１９アゴニストは経口投与される。
【０３１５】
経口投与のための処方は、固体の錠剤およびカプセル処方物に加えて、水性溶液および懸濁液の形態とすることができる。水性溶液および懸濁液は滅菌粉末または顆粒から調製することができる。化合物は水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または種々の緩衝液に溶解させることができる。他の補助剤は当該分野でよくかつ広く知られている。
【０３１６】
ＧＰＲ１１９アゴニストの医薬組成物は、例えば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣−作製、混練、乳化、カプセル化、包みこみ、凍結乾燥プロセスまたは噴霧乾燥によって、当該分野で良く知られた方法によって調製することができる。
【０３１７】
本発明に従って用いる医薬組成物は、医薬的に用いることができる製剤への活性化合物の加工を容易とする賦形剤および補助剤を含む１以上の生理学的に活性な担体を用いる慣用的な方法で処方することができる。適当な医薬上許容される担体は当業者に利用可能である（例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．），２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ参照）。適当な処方は、選択された投与の経路に依存する。用語「担体」物質または「賦形剤」物質は、本明細書中においては、担体および／または希釈剤および／または補助剤、または治療剤の対象への送達のためのビヒクルとして用いられるため、またはその取扱いまたは貯蔵特性を改良するため、あるいは経口投与に適したカプセルまたは錠剤のような区別される製品への組成物の投与単位の形成を可能とするため、または容易とするために医薬組成物に加えられるそれ自体は治療剤でないいずれの物質も意味する。賦形剤は、例示として、限定されるものではないが、希釈剤、崩壊剤、結合剤、接着剤、湿潤剤、ポリマー、滑沢剤、グライダント、不快な味または匂いをマスクするかまたはそれに逆作用させるために加えられる物質、フレーバー剤、色素、フラグランス、および組成物の外観を改良するために加えられる物質を含むことができる。許容される賦形剤はステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、炭酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、デキストリン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、デンプン、ゼラチン、アルカン酸のセルロースエステルおよびセルロースアルキルエステルのようなセルロース物質、低融解ワックスカカオ脂または粉末、ポリビニル−ピロリドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコールのようなポリマー、および他の医薬上許容される物質を含む。医薬組成物の成分は簡便な投与のためにカプセル化し、または錠剤化することができる。
【０３１８】
医薬上許容されるとは、薬理学的／毒物学的観点から患者に、および組成、処方、安定性、患者の許容性および生物学的利用性に関する物理的／化学的観点から製薬化学者に許容される特性および／または物質をいう。
【０３１９】
糖衣コアには適当なコーティングを施す。この目的では、濃縮糖溶液を用いることができ、これは、所望により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合液を含有してもよい。色素または顔料を、活性化合物の用量の異なる組合せを識別するためまたは特徴付けるために錠剤または糖衣コーティングに加えてもよい。
【０３２０】
経口的に用いることができる医薬組成物はゼラチンで作成されたプッシュ−フィットカプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で作製された柔軟なシールされたカプセルを含む。プッシュ−フィットカプセルはラクトースのような充填剤、デンプンのようなバインダーおよび／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤および、所望により、安定化剤と混合された有効成分を含有することができる。柔軟なカプセルにおいては、活性な化合物を脂肪油、流動パラフィン、液体ポリエチレングリコール、クレモフォール、カプムル、中鎖または長鎖モノ−、ジ−またはトリグリセリドのような適当な液体に溶解または懸濁することができる。また、安定化剤をこれらの処方物に加えることもできる。
【０３２１】
加えて、ＧＰＲ１１９アゴニストは徐放系を用いて送達することができる。種々の徐放性物質は確立されており、当業者によく知られている。徐放性カプセルは特に好ましい。例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート時間遅延物質を使用することができる。該投与形態は米国特許第４，２５６，１０８号、第４，１６６，４５２号、および第４，２６５，８７４号に記載された技術によって被覆して、制御放出のための浸透圧治療錠剤を形成することもできる。
【０３２２】
本発明の療法、すなわち、ＧＰＲ１１９アゴニストに関する療法は、単独で、あるいは１以上の他の医薬または生理学的な活性な化合物と組み合わせて投与し、または供することができる。本発明の１つの態様において、他の医薬上または薬理学上許容される化合物はＧＰＲ１１９アゴニストではない。本発明の１つの態様において、他の医薬上または生理学上許容される化合物はカルシウム、ビタミンＤ、エストロゲン、チボロン、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ：例えば、ラロキシフェン、タモキシフェン）、ビホスホネート（例えば、エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート）、カルシトニン、ビタミンＤの１α−、ヒドロキシル化代謝産物、フッ化物、チアジド、同化ステロイド、イプリフラボン、ビタミンＫ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ストロンチウム、スタチン、オステオプロテレシン、ＥＰ４受容体選択的アゴニスト、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢ２）選択的アゴニストおよびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤より成る群から選択される医薬剤である。（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ９２１（２００３），Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ参照）。
【０３２３】
１つの態様において、本発明は、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストを含む、または実質的にそれよりなる組成物をその要旨とする。１つの実施形態において、本発明は、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト、および少なくとも１つの医薬上許容される担体を含む、または実質的にそれよりなる医薬組成物をその要旨とする。
【０３２４】
１つの態様において、本発明は、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストを含む、または実質的にそれよりなる組成物をその要旨とする。１つの態様において、本発明は、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト、および少なくとも１つの医薬上許容される担体を含む、または実質的にそれよりなる医薬組成物をその要旨とする。または、本発明は、ＧＰＲ１１９アゴニストは骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療し、または予防するにおいて、および／または個体において骨質量を増加させるにおいて、効果を生じるに十分な量である組成物または医薬組成物の投与形態にも関する。
【０３２５】
１つの態様において、本発明は、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストを含む、または実質的にそれよりなる組成物をその要旨とする。１つの態様において、本発明は、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストおよび少なくとも１つの医薬上許容される担体を含む、または実質的にそれよりなる医薬組成物をその要旨とする。また、本発明はＧＰＲ１１９アゴニストが、個体においてＧＩＰレベルを増加させるにおいて効果を生じるのに十分な量である組成物、または医薬組成物の投与形態にも関する。
【０３２６】
本発明で用いるのに適当な医薬組成物は、それらの意図した目的を達成する量で含有された組成物を含む。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するのに、または個体において骨質量を増加させるのに有用であると理解される。低骨質量によって特徴付けられる状態は、本発明に従うものである。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は個体においてＧＩＰレベルを増加させるのに有用であると理解される。本発明に関するように、本発明による意図した目的を達成するのに十分なＧＰＲ１１９アゴニストの量の決定は、特に、ここで提供する詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力内のものである。
【０３２７】
限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、および非−ヒト霊長類を用いる実験を含めた、動物実験から得られたデータは、ヒトで用いられる一定範囲の用量を処方するのに用いることができる。一般に、当業者であれば、どのようにして動物モデル系で得られたイン・ビボデータをヒトのようなもう一つの動物に外挿するかを理解している。いくつかの状況において、これらの外挿が、ヒトのようなもう一つの動物と比較した、動物モデルの体重に単に基づくことができ；他の状況においては、これらの外挿は単に体重に基づくものではなく、むしろ種々の因子を取り込むものである。代表的な因子は、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食餌および医学的状態、疾患の重症度、投与の経路、治療する特定の化合物の活性、効率、薬物動態学プロフィールおよび毒性学プロフィールのような薬理学的考慮、薬物送達系が利用されるか否か、急性または慢性のいずれの疾患状態が治療または予防が行われるか、あるいは本発明の化合物に加えて、および薬物組合せの一部としてさらなる活性化合物が投与されるか否かを含む。本発明の化合物および／または組成物で疾患状態を治療するための投与養生法は、上記した種々の因子に従って選択される。したがって、使用される現実の投与養生法は広く変動する可能性があり、従って、好ましい投与養生法から隔たる可能性があり、当業者であれば、これらの典型的な範囲外の投与および投与養生法をテストすることができ、適切であれば本発明の方法で用いることができるのを認識するであろう。
【０３２８】
例示的な動物モデル系はラット卵巣摘出（ＯＶＸ）骨喪失モデルである。卵巣摘出ラットは、エストロゲン枯渇ヒト骨格筋の重要な臨床的特徴、および治療剤の応答を正しくエミュレートする優れた前臨床動物モデルである。このモデルにおいては、卵巣摘出に関連する骨喪失は部分的にまたは完全に妨げられる場合に、治療効果が達成される（例えば、Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００１）１７７：３５−４１；およびＪｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ（２００１）１：１９３−２０７参照）。いくつかの実施形態において、卵巣摘出に関連する骨喪失は少なくとも約１０％妨げられ、少なくとも約２０％妨げられ、少なくとも約３０％妨げられ、少なくとも約４０％妨げられ、少なくとも約５０％妨げられ、少なくとも約６０％妨げられ、少なくとも約７０％妨げられ、少なくとも約７５％妨げられ、少なくとも約８０％妨げられ、少なくとも約８５％妨げられ、少なくとも約９０％妨げられ、少なくとも約９５％妨げられ、または１００％妨げられる場合に治療効果が達成される。
【０３２９】
さらなる例示的な動物モデル系は、マウスにおけるグルコースチャレンジ後の血中ＧＩＰレベルの増加である。ある実施形態において、血中ＧＩＰレベルは血漿中ＧＩＰレベルである。ある実施形態において、ＧＩＰレベルはグルコース−非依存性ＧＩＰレベルである。ある実施形態において、ＧＩＰレベルはグルコース−非依存性ＧＩＰレベルである。ある実施形態において、ＧＩＰは合計ＧＩＰである。ある実施形態において、合計ＧＩＰは、中央に向けられたアッセイ、またはＣ−末端に向けられたアッセイを用いて決定される。ある実施形態において、ＧＩＰは生物活性ＧＩＰである。ある実施形態において、生物活性ＧＩＰはＮ−末端特異的アッセイを用いて決定される。ある実施形態において、生物活性ＧＩＰは骨形成を促進するための活性を有する。ある実施形態において、治療効果は、血中ＧＩＰレベルが少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％増加する場合に達成される。
【０３３０】
投与量および間隔を調整して意図した治療効果を供することができる。本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストの正確な用量はＧＰＲ１１９アゴニスト、その能力、投与の形態、患者の年齢および体重、および治療すべき状態の重症度に依存して変化するであろう。正確な処方、投与の経路、および用量は、患者の状態を考慮して個々の意思によって選択され得る。説明として、限定されるものではないが、本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストの量は約０．００１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．００５ｍｇ／ｋｇ未満、約０．０１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．０５ｍｇ／ｋｇ未満、約０．１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ未満、約１ｍｇ／ｋｇ未満、約５ｍｇ／ｋｇ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ未満、約５０ｍｇ／ｋｇ未満、または約１００ｍｇ／ｋｇ未満である。ある実施形態において、本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストの量は約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇ体重未満、または約０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ体重未満である。
【０３３１】
毎日または規則的ベースで投与して所望の結果を達成することができる、本発明のモジュレータ（例えば、ＧＰＲ１１９アゴニスト）の量についての好ましい用量範囲は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい用量範囲は０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい用量範囲は０．１〜１０ｋｇ／ｍｇ体重である。他の好ましい用量範囲は０．１〜３．０ｋｇ／ｍｇ体重である。もちろん、これらの日用量は、１日の間に周期的に少量ずつ送達、投与することができる。これらの用量範囲は好ましい範囲にすぎず、本発明を限定するつもりはないことを注記する。
【０３３２】
投与量および間隔は個々に調整して、意図した治療効果を達成する、本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストの血漿中レベルを供することができる。投与の間隔は、選択された範囲のＧＰＲ１１９アゴニスト濃度についての値を用いて決定して、意図した治療効果を達成することもできる。ＧＰＲ１１９アゴニストは、時間の１０〜９０％の間の、好ましくは、時間の３０〜９９％の間の、最も好ましくは時間の５０〜９０％の間のＧＰＲ１１９アゴニスト濃度の選択された範囲内に血漿中レベルを維持する養生法を用いて投与すべきである。局所的投与または選択的摂取の場合には、意図した治療効果を供するＧＰＲ１１９アゴニスト濃度の範囲は、血漿中濃度に関連しなくてもよい。
【０３３３】
投与される組成物の量はもちろん、治療すべき個体、個体の体重、疾患の重症度、投与の様式、および処方する医師の判断に依存するであろう。
【０３３４】
１つの態様において、本発明は、従って、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストを含む、または実質的にそれよりなる、治療有効量の組成物をそれを必要とする個体に投与することを含む、骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防し、または骨質量を増加させる方法をその要旨とする。他の実施形態において、該組成物は医薬組成物である。
【０３３５】
１つの態様において、本発明は、治療有効量の、一定量の本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストを含む、または実質的にそれよりなる組成物をそれを必要とする個体に投与することを含む、骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防し、または骨質量を増加させる方法に関する。関連する態様において、本発明は、ＧＰＲ１１９アゴニストが、個体においてＧＩＰレベルを増加させるにおいて効果を与えるのに十分な量で投与される該方法をその要旨とする。ある実施形態において、該組成物は医薬組成物である。
【０３３６】
本発明の療法、すなわち、ＧＰＲ１１９アゴニストに関する療法は、個体において低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するにおいて、および個体において骨質量を増加させるのに有用である。
【０３３７】
低骨質量によって特徴付けられる状態は、限定されるものではないが、骨減少症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、歯周状態、歯槽骨喪失、骨摘出術骨喪失、子供時代の特発性骨喪失、パジェット病、転移性癌による骨喪失、骨溶解病巣、脊髄の湾曲、および身長の喪失を含む。ある実施形態において、低骨質量によって特徴付けられる状態は骨粗鬆症である。ある実施形態において、低骨質量において特徴付けられる状態は骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は一次骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は二次骨粗鬆症である。低骨質量によって特徴付けられる状態は、限定されるものではないが、脊髄の湾曲、身長の喪失、および補鉄外科的処置のような骨粗鬆症の長期合併症も含む。低骨質量によって特徴付けられる状態は個々に、あるいはいずれかの組合せにて実施形態に含むことができると理解される。ある実施形態において、低骨質量によって特徴付けられる状態は一次骨粗鬆症である。
【０３３８】
ある実施形態において、増大した骨質量を必要とする個体は、若い成人参照平均の下で１を超える（Ｔ−スコア＜−１）、１．５を超えるまたはそれと等しい（Ｔ−スコア≦―１．５）、２よりも大きな、またはそれと等しい（Ｔ−スコア≦−２）または２．５よりも大きな、またはそれと等しい（Ｔ−スコア≦−２．５）標準偏差の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有する。ある実施形態において、増加した骨質量を必要とする個体は骨折の治療を必要としている。ある実施形態において、骨折の治療を必要とする個体は外傷骨折、長期骨折、または骨粗鬆症骨折を有する。ある実施形態において、個体は骨疾患についての治療を必要としている。ある実施形態において、骨疾患に対する治療を必要とする個体は骨減少症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、歯周状態、歯槽骨喪失、骨摘出術骨喪失、子供時代の特発性骨喪失、パジェット病、転移性癌による骨消失、骨溶解病巣、脊髄の湾曲、または身長の喪失を有する。ある実施形態において、骨疾患に対する治療を必要とする個体は骨粗鬆症を有する。ある実施形態において、骨粗鬆症は一次骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は二次骨粗鬆症である。本発明に従って治療することができる破壊的骨障害は、限定されるものではないが、骨粗鬆症、変形性関節症、および新形成病、放射線療法、または化学療法によって引き起こされるような骨溶解病巣を含む。ある実施形態において、骨粗鬆症は一次骨粗鬆症である。ある実施形態において、骨粗鬆症は二次骨粗鬆症である。
【０３３９】
本発明の療法、すなわち、ＧＰＲ１１９アゴニストに関する療法は、顔面再形成、上顎再形成、下顎再形成、歯周状態または抜歯後の骨治癒、長骨延長の増強、補鉄内部成長の増強または個体における骨結合の増加で有用である。
【０３４０】
ある実施形態において、個体は脊椎動物である。ある実施形態において、脊椎動物である個体は魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳動物である。ある実施形態において、個体または脊椎動物は哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物である個体または脊椎動物はマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、非−ヒト哺乳動物、非−ヒト霊長類、またはヒトである。ある実施形態において、個体はヒトである。ある実施形態において、ヒトは閉経後の婦人、または５０歳を超える男性である。
【０３４１】
さらなる努力を必要とせず、当業者であれば、これまでの記載を用い、本発明をその最大限まで実施することができると考えられる。こ本発明の範囲内にある改変は当業者に明らかとなるように、れまでの詳細な記載は理解の明瞭性のみのために掲げるものであり、不必要な限定と理解されるべきでない。
【０３４２】
本出願は、示された日付に合衆国特許商標局に合衆国速達便を介して出願された以下の仮特許出願からの優先権の利益を主張する：２００６年４月１１日に出願された米国仮特許出願番号６０／７９１，５５０。上記仮特許出願の開示を、ここで、引用してその全体を援用する。
【０３４３】
本出願を通じて、種々の刊行物、特許および特許出願が引用される本出願中で引用されたこれらの刊行物、特許および特許出願の開示をここで引用してその全体を本開示に援用する。刊行物、特許または特許出願の出願人によるここでの引用は、該刊行物、特許または特許出願の出願人による先行技術としての自認ではない。
【実施例】
【０３４４】
さらなる努力を必要とせず、当業者であれば、これまでの記載を用いて本発明をその最大限まで実施することができる。以下の詳細な実施例は、単なる説明として解釈されるべきであり、断じてこれまでの開示を限定するものではない。当業者であれば、該手法から適当な変形をすぐに認識するであろう。
実施例１：野生型マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果の薬物動態学分析
Ａ．Ｃ５７ｂｌｋ／６雄マウスを１８時間絶食させ、各群についてｎ＝６にて１４の群にランダムに帰属させた。図１Ａに示すように、マウスにビヒクル（ＰＥＴ；８０％ＰＥＧ４００、１０％エタノール、１０％Ｔｗｅｅｎ ８０）を、または２０ｍｇ／ｋｇの本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト（化合物１；（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミン）を経口投与した。処理から３０分後、３ｇ／ｋｇのグルコースボーラスを経口送達し、グルコースボーラス後０（グルコースボーラスなし）、２、５、１０、２０、４０および６０分に血漿を収集した。供給業者によって供された指示書に従い、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ｔｏｔａｌ）ＥＬＩＳＡ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＺＲＭＧＩＰ−５５Ｋ］から購入したげっ歯類ＧＩＰ ＥＬＩＳＡキットを用いることによって血漿中ＧＩＰレベルを決定した。図１Ａに示された結果から、ＧＰＲ１１９アゴニストの投与は、マウスの血液中でのＧＩＰのグルコース−依存性およびグルコース−非依存性の双方のレベルを増加させたことは明らかである。化合物１はマウスにおいて血漿中の全ＧＩＰを刺激した。化合物１は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１２６７（ＷＯ ２００４／０６５３８０）として公開）に開示された化合物と同一である。
Ｂ．Ｃ５７ｂｌｋ／６雄マウスを１８時間絶食させ、各群についてｎ＝６にて１４の群にランダムに帰属させた。図１Ｂに示すようにマウスに、ビヒクル（２０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ））を、または１０ｍｇ／ｋｇの本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト（化合物３）を経口投与した。処理から３０分後に３ｇ／ｋｇのグルコースボーラスを経口送達し、グルコースボーラスから０（グルコースボーラスなし）、５、１０、２０、６０および１２０分において血漿を収集した。供給業者によって提供された指示書に従い、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ｔｏｔａｌ）ＥＬＩＳＡ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＺＲＭＧＩＰ−５５Ｋ］から購入されたげっ歯類ＧＩＰ ＥＬＩＳＡキットを用いることによって血漿中ＧＩＰレベルを決定した。統計学的分析を、Ｅｘｃｅｌプログラムを用いて行った。ＧＩＰ濃度の平均値は、各群における６匹のマウスでの結果に基づいて計算し、平均±ＳＥＭとして示される。図１Ｂに示される結果より、ＧＰＲ１１９アゴニストの投与は、マウスの血液中におけるＧＩＰのグルコース−依存性、およびグルコース−非依存性の双方のレベルを増大させたことは明らかである。化合物３は、マウスにおいて血漿中合計ＧＩＰを刺激した。化合物３は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２３２７（ＷＯ ２００５／００７６４７）として公開）に開示された化合物と同一である。
Ｃ．Ｃ５７ｂｌｋ／６雄マウスを１８時間絶食させ、各群についてｎ＝６にて１４の群にランダムに割り当てた。マウスにビヒクル（２０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ））を、または１、３、または１０ｍｇ／ｋｇの本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト（化合物３）を経口投与した。処理から３０分後に３ｇ／ｋｇのグルコースボーラスを経口送達し、血漿をグルコースボーラス後０（グルコースボーラスなし）または５分において収集した。供給業者によって提供された指示書に従い、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ｔｏｔａｌ）ＥＬＩＳＡ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＺＲＭＧＩＰ−５５Ｋ］から購入したげっ歯類ＧＩＰ ＥＬＩＳＡキットを用いることによって血漿中ＧＩＰレベルを決定した。ＧＩＰ濃度の平均値を各群において６匹のマウスでの結果に基づいて計算し、図１Ｃに示す。図１Ｃから、ＧＰＲ１１９アゴニスト（化合物３）はマウスにおいて用量依存的に血漿中合計ＧＩＰを刺激したのは明らかである。化合物３は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２３２７（ＷＯ ２００５／００７６４７として公開）に開示された化合物と同一である。
実施例２：野生型マウスと比較したＧＰＲ１１９−欠損（ノックアウト）マウスにおける血中ＧＩＰレベルに対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果
Ａ．ＧＰＲ１１９−欠損雄マウスおよび野生型同腹子を１８時間絶食させた。マウスに、示したように（ｎ＝５）、ビヒクル（ＰＥＴ；８０％ＰＥＧ４００、１０％エタノール、１０％Ｔｗｅｅｎ８０）を、または２０ｍｇ／ｋｇの本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト（化合物１；（２−フルオロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−｛６−［４−（３−イソプロピル−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イル）−ピペリジン−１−イル］−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル｝−アミン）を経口投与した。処理から３０分後に、眼の眼球後静脈を介して血液（１００μＬ）を収集し（時刻０）、続いて、３ｇ／ｋｇのグルコースボーラスを与えた（経口）。グルコース送達から５分後に、もう一つの血液試料（１００μＬ）を収集した（時刻５分）。血漿を遠心後に収集し、製造業者によって提供された指示書に従い、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ｔｏｔａｌ）ＥＬＩＳＡ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＺＲＭＧＩＰ−５５Ｋ］から購入したげっ歯類ＧＩＰ ＥＬＩＳＡキットを用いることによってＧＩＰレベルを決定した。図２Ａに示される結果より、機能的ＧＰＲ１１９受容体が、マウスの血液中にてＧＩＰのグルコース−非依存性レベルおよびグルコース依存性レベルを増加させるための投与されたＧＰＲ１１９アゴニストで必要であったことが明らかである。化合物１は野生型マウスにおける血漿中合計ＧＩＰを刺激した。化合物１は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１２６７（ＷＯ ２００４／０６５３８０として公開）で開示された化合物と同一である。
Ｂ．ＧＰＲ１１９欠損雄マウスおよび野生型同腹子を１８時間絶食させた。マウスに、示されたように（ｎ＝５）、ビヒクル（４０％ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ））を、または３０ｍｇ／ｋｇの本発明によるＧＰＲ１１９アゴニスト（化合物２）を経口投与した。処理から３０分後に、血液（１００μＬ）を眼の眼球後静脈を介して収集し（時刻０）、続いて３ｇ／ｋｇのグルコースボーラスを（経口）投与した。グルコース送達から５分後に、もう一つの血液試料（１００マイクロリットル）を収集した（時刻５分）。遠心後に血漿を収集し、供給業者によって提供された指示書に従い、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ｔｏｔａｌ）ＥＬＩＳＡ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＺＲＭＧＩＰ−５５Ｋ］から購入されたげっ歯類ＧＩＰ ＥＬＩＳＡキットを用いることによってＧＩＰレベルを決定した。ＧＩＰ濃度の平均値は、各群において５匹のマウスでの結果に基づいて計算した。図２Ｂに示された結果から、投与されたＧＰＲ１１９アゴニストがマウスの血液中でのＧＩＰのグルコース−非依存性レベルおよびグルコース−依存性レベルを増加させるために、機能的ＧＰＲ１１９受容体がで必要であったことは明らかである。化合物２は野生型マウスにおいて血漿中合計ＧＩＰを刺激した。化合物２は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２４１７（ＷＯ２００５／００７６５８として公開）に開示された化合物と同一である。
実施例３：卵巣摘出ラットにおける骨質量に対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果
本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストは、後に記載するイン・ビボ卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットモデル（例えば、Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００１）１７７：３５−４１参照）を用いて、骨粗鬆症のような低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防することにおいて、および／または個体において骨質量を増加することにおいて効果的であることを示すことができる。
【０３４５】
８週齢の２０匹の雌ＯＶＸおよび２０匹の非−ＯＶＸ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ処女ラット（１５０〜１７５ｇ）はＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入する。動物に自由に通常の市販のペレット食餌Ｔｅｋｌａｂ Ｒｏｄｅｎｔ食餌（１．４６％カルシウム）を与え、水に自由にアクセスさせた。ラットを４つの体重がマッチした実験群にランダムに分割し、ビヒクル、または本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストを経口的に受けるように選択する。処理は６週間の間、毎日ベースで継続する。
【０３４６】
１．対照。１０匹の非−ＯＶＸラットにビヒクルを経口投与する。
【０３４７】
２．対照＋処理。１０匹の非−ＯＶＸラットにＧＰＲ１１９アゴニストを経口投与する。
【０３４８】
３．ＯＶＸ。１０匹のＯＶＸラットにビヒクルを経口投与する。
【０３４９】
４．ＯＶＸ＋処理。１０匹のＯＶＸラットにＧＰＲ１１９アゴニストを経口投与する。ラットの体重を毎日計り、ベースラインにおいて、および６週間に再度身長を決定する。Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ１０００／Ｗ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いるデュアルエネルギーＸ線吸収測定（ＤＸＡ）を、処理の開始に先立って、および６週間において全ての動物で行い、ソフトウェアＲａｔ Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙバージョン５．５３を用いてデータを分析する。骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を脊髄において決定する。
【０３５０】
処理から６週間後における脊椎動物の骨密度の％変化を決定する。ＧＰＲ１１９アゴニストの投与は脊椎動物骨密度に対する卵巣摘出の負の効果を減衰させることが示される。脊椎動物骨密度に対する卵巣摘出の負の効果の減衰は、骨粗鬆症のような低骨密度によって特徴付けられる状態を治療および予防するのに、および／または個体において骨密度を増加させることにおいて効果を有する処理を示す。
実施例４：骨折治癒に対するＧＰＲ１１９アゴニストの投与の効果
本発明によるＧＰＲ１１９アゴニストは、後に記載するイン・ビトロアッセイを用いる骨折の治療で効果的であることを示すことができる。
骨折技術
３箇月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをケタミンで麻酔する。右側脛骨、大腿骨の近位部分の前内側態様で１ｃｍ切開を行う。以下に脛骨外科的技術を記載する。切開を骨に至るまで行い、前側隆起に対して２ｍｍ内側の脛骨粗面の末端側態様に対して４ｍｍ近位にて１ｍｍ穴をドリルで開ける。脊髄内ネイリングを０．８ｍｍステンレス鋼チューブで行う（最大負荷３６．３Ｎ、最大硬さ６１．８Ｎ−ｍｍ、骨と同一の条件下でテスト）。脊髄管のリーマ通しは行わない。標準化された閉鎖骨折が、平坦な顎をもつ特別に設計された調整可能な鉗子を用いる３点の曲げによって脛腓接合から２ｍｍ上方に生じる。柔軟組織の損傷を最小化するために、骨折を変位させないように注意を払う。皮膚をモノフィラメントナイロン縫合糸で閉じる。滅菌条件下で手術を実行する。全ての骨折のＸ線写真撮影はネイリング直後に取り、特定の骨幹領域の外側の骨折、または変位した爪を持つラットは排除する。残りの動物を、骨折治癒をテストするための時点当たりの各亜群当たり１０〜１２匹の動物を含む以下の群にランダムに分ける。ラットにビヒクルまたはＧＰＲ１１９アゴニストを日ベースで経口投与する。ＧＰＲ１１９アゴニストは０．００１ｍｇ／ｋｇ体重および１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の量で用いる。処理は１０、２０、４０および８０日の間継続する。
【０３５１】
１０、２０、４０および８０日において、各群からの１０〜１２匹のラットをケタミンで麻酔し、放血によって屠殺する。脛腓骨双方を切開によって取り出し、全ての柔軟組織を切片とする。各群について５〜６匹のラットからの骨を組織学的分析のために７０％エタノール中で保存し、各群についてもう１つの５〜６匹のラットからの骨を、実行するＸ線写真および生体力学テストのために緩衝化されたリンゲル液中に保存する（＋４℃，ｐＨ７．４）。
組織学的分析
骨折した骨の組織学的分析のための方法は、Ｍｏｓｅｋｉｌｄｅ ａｎｄ Ｂａｋ（Ｂｏｎｅ（１９９３）１４：１９−２７）によって従前に公表されている。簡単に述べれば、骨折部位を骨折線の各側に対して８ｍｍ鋸でひき、メタクリル酸メチル中に脱石灰化せずに包埋し、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ Ｐｏｌｙｃｕｔミクロトームで前方セクションを８μｍ厚に切断する。（脛骨および腓骨双方を含めた）マッソン−トリクローム染色中央−前方セクションを、処置の有りおよび無しにて骨折治癒に対する細胞および組織応答の可視化のために用いる。シリウスレッド染色セクションを用いてカルス構造の特徴を示し、骨折部位における織られた骨（ｗｏｖｅｎ ｂｏｎｅ）とラメラ骨（ｌａｍｅｌｌａｒ ｂｏｎｅ）の間を識別する。以下の決定を行う：（１）骨折ギャップ（骨折における骨髄質端部の間の最も短い距離として決定される）、（２）カルス長さおよびカルス直径、（３）カルスの合計骨容量領域、（４）カルス領域の内側の組織面積当たりの骨組織、（５）カルスにおける繊維状組織、（６）カルスにおける軟骨領域。
生体力学分析
生体力学分析のための方法はＢａｋ ａｎｄ Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ（Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ（１９８９）４５：２９２−２９７）によって従前に公表されている。簡単に述べると、全ての骨折のＸ線写真は生体力学テストに先立って撮られる。治癒骨折の機械的特性は破壊的３−または４−点曲げ手法によって分析する。最大負荷、硬さ、最大負荷におけるエネルギー、最大負荷における撓みおよび最大ストレスを決定する。
実施例５
内因性ヒトＧＰＲ１１９の全長クローニング
内因性ヒトＧＰＲ１１９をコードするポリヌクレオチドは、ＧＰＲ１１９特異的プライマー
【０３５２】
【化４】

および鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによってクローン化した。ＴａｑＰｌｕｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を工程２〜工程４を３５回反復する以下のサイクルによる増幅で用いた：９４℃、３分；９４℃、１分；５８℃、１分；７２℃、２分；７２℃、１０分。予測されたサイズの１．０Ｋｂ ＰＣＲ断片を単離し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ^ＴＭ ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｔ７ ＤＮＡシークエナーゼキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列については配列番号１および推定されるアミノ酸配列については配列番号２参照。
実施例６
受容体の発現
種々の細胞がＧプロテイン−結合受容体の発現について当該分野で利用可能であるが、真核生物細胞を利用するのが最も好ましい。ある実施形態において、哺乳動物細胞またはメラニン保有細胞を利用する。以下に例を示す；当業者には、当業者の必要性のため優先的に有利である技術を決定する能力が保証されている。例えば、それがメラニン保有細胞に関する場合、後記実施例９参照。
Ａ．一過的トランスフェクション
１日目に、２９３細胞の６ｘ１０^６／１０ｃｍ皿を平板培養する。２日目に、２つの反応チューブを調製し（各チューブについて以下の割合はプレート当たりである）：チューブＡは、０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で４μｇ ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡなどを持つｐＣＭＶベクター）を混合することによって調製し；チューブＢは０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で２４μＬのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を混合することによって調製する。チューブＡおよびＢは倒置（数回）によって混合し、引き続いて室温で３０〜３５分間インキュベーションする。該混合物を「トランスフェクション混合物」という。平板培養した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍＬの無血清ＤＭＥＭを加える。１ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、３７℃／５％ＣＯ_２において４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を吸引によって取り出し、続いて、１０ｍＬのＤＭＥＭ／１０％で胎児ウシ血清を加える。細胞を３７℃／５％ ＣＯ_２でインキュベートする。４８時間のインキュベーションの後に、細胞を収穫し、分析で利用する。
ｂ．安定な細胞系
ほぼ１２×１０^６ ２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上で平板培養し、１０パーセントの胎児ウシ血清および１パーセントのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で培養する。２９３細胞の平板培養から２４時間後に（または約８０％密集）、細胞を１２μｇのＤＮＡ（例えば、受容体ｃＤＮＡを持つｐＣＭＶ−ｎｅｏ^ｒベクター）を用いて細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを、６０μＬのリポフェクタミン、および血清を含まない２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地と組み合わせる。該培地をプレートから吸引し、細胞を血清を含まない培地で１回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミンおよび培地混合物を、血清無しの１０ｍＬの培地と共に平板培養する。３７℃における４〜５時間のインキュベーションの後、培地を吸引し培地を２５ｍＬの血清を含有する培地を加える。トランスフェクションから２４時間後に培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションから４８時間後に培地を吸引し、ほぼ１２×１０^６ ２９３細胞の最終濃度にてゲンタマイシン（Ｇ４１８薬物）を含有する血清を含む培地を加え、１５ｃｍ組織培養プレート上で平板培養する。１０パーセントの胎児ウシ血清および１パーセントのピルビン酸ナトリウムＬ−グルタミン、および抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。２９３細胞の平板培養から２４時間後に（または約８０％密集まで）、１２μｇのＤＮＡ（例えば、受容体ｃＤＮＡを持つｐＣＭＶベクター）を用いて細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを６０μＬのリポフェクタミンおよび血清を含まない２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。培地をプレートから吸引し、細胞を血清無しの培地で一回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および培地混合物を、血清を含まない１０ｍＬの培地と共にプレートに加える。３７℃における４〜５時間のインキュベーションに続き培地を吸引し血清を含有する２５ｍＬの培地を加える。トランスフェクションから２４時間後に培地を再度吸引し血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションから２８時間後に、培地を吸引し、５００μｇ／ｍＬの最終濃度にてゲンタマイシン（Ｇ４１８薬物）を含有する血清を含む培地を加える。トランスフェクトされた細胞は、ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を含有する正にトランスフェクトされた細胞についての選択を受ける。選択が起こるに連れて、培地を４〜５日ごとに交換する。選択の間、細胞を増殖させて、安定なプールを作製し、または安定なクローン選択のために分割する。
実施例７
例えば、ＧＰＲ１１９アゴニストとしての候補化合物をスクリーニングするためのアッセイ
例えば、ＧＰＲ１１９アゴニストとしての候補化合物をスクリーニングするのに、種々のアプローチが利用可能である。以下に例を示す；当業者は、当業者の必要性について優先的に有利である技術を決定する能力が保証されている。Ｇプロテイン−結合受容体のアゴニストとしての化合物をスクリーニングするためのアッセイは当業者によく知られている（例えば、国際出願ＷＯ ０２／４２４６１参照）。
１．膜結合アッセイ：［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇプロテイン−結合受容体がその活性な状態にある場合、リガンド結合または構成的活性化の結果としてのいずれかで、受容体がＧプロテインに結合し、ＧＤＰの放出、および引き続いてのＧＴＰのＧプロテインへの結合を刺激する。Ｇプロテイン−結合受容体複合体アルファサブユニットはＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解しその時点において受容体は通常は脱活性化される。活性化された受容体はＧＴＰの代わりにＧＤＰで継続的に置き換える。加水分解不能ＧＴＰアナログである［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを利用して、活性化された受容体を発現する膜への［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの増強された結合を示すことができる。活性化を決定するために［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いる利点は；（ａ）それは全てのＧプロテイン−結合受容体に総括的に適応可能であり；（ｂ）それは膜表面において近位であることにより、細胞内カスケードに影響する分子を余りピックアップしないようにする。
【０３５３】
該アッセイは、関連受容体を発現する膜への［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するＧプロテイン結合受容体の能力を利用する。該アッセイは総括的であって、全てのＧプロテイン−結合受容体において薬物発見への適用を有する。
膜調製物
いくつかの実施形態において、本発明のＧプロテイン−結合受容体を含み、かつ例えば、受容体のアゴニストとしての候補化合物の同定で用いる膜は好ましくは以下のように調製される；
ａ．材料
「膜掻き取り緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４よりなり：
「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４よりなり；
「結合緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣＬ、および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ７．４よりなる。
ｂ．手法
全ての材料は該手法を通じて氷上に維持される。最初に、培地を細胞の密集単層から吸引し、続いて、１０ｍＬ冷ＰＢＳで濯ぎ、続いて吸引する。その後、５ｍＬの膜掻取緩衝液を加えて、細胞を掻き取り；これに続いて、細胞抽出物を５０ｍＬの遠心管に移動させる（４℃において２０，０００ｒｐｍで１７分間遠心）。しかる後、上清を吸引し、ペレットを３０ｍＬの膜洗浄緩衝液に再度懸濁させ、続いて、２０，０００ｒｐｍにおいて４℃にて１７分間遠心する。次いで、上清を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再度懸濁させる。次いで、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^ＴＭホモゲナイザーを用いてこれをホモゲナイズする（全ての材料が懸濁するまでに１５〜２０秒のバースト）。これを本発明においては「膜蛋白質」という。
ブラッドフォード蛋白質アッセイ
ホモゲナイゼーションに続いて、膜の蛋白質濃度をブラッドファード蛋白質アッセイを用いて決定する（蛋白質を約１．５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、分注し、後に用いるために凍結することができ（−８０℃）；凍結する場合、用いるプロトコルは以下の通りとなろう：アッセイの日に、凍結された膜蛋白質を室温で解凍し、続いて、ボルテックスし、次いで、約１２×１，０００ｒｐｍにおいて約５〜１０秒間Ｐｏｌｙｔｒｏｎでホモゲナイズする；複数の調製では、ホモゲナイザーを異なる調製物のホモゲナイゼーションの間に徹底的に洗浄すべきである）。
ａ．材料
（上記した）結合緩衝液；ブラッドフォード色素試薬；ブロッドフォード蛋白質標準は、製造業者の指示に従って利用する（Ｂｉｏｒａｄ，ｃａｔ．ｎｏ．５００−０００６）。
【０３５４】
ｂ．手法
二連チューブを調製する。一つは膜を含み、一つは対照（ブランク）としてのものである。各々は８００μＬの結合緩衝液を含有するものであった。しかる後、１０μＬのブラッドフォード蛋白質標準（１ｍｇ／ｍＬ）を各チューブに加え、次いで、１０μＬの膜蛋白質をただ一つのチューブ（ブランクではない）に加える。しかる後、２００μＬのブラッドフォード色素試薬を各チューブに加え、続けて各々をボルテックスする。５分後にチューブを再度ボルテックスし、その中の材料をキュベットに移す。次いで、波長５９５において、ＣＥＣＩＬ ３０４１分光光度計で読み取る。
同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰ緩衝液は３７．５ｍＬの結合緩衝液および２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ−７１２７）よりなり、続いて、結合緩衝液中に系列希釈して、０．２μＭのＧＤＰを得る（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は０．１μＭのＧＤＰであった）；候補化合物を含む各ウェルは１００μＬのＧＤＰ緩衝液（最終濃度）０．１μＬ ＧＤＰ、結合緩衝液中の５０μＬの膜蛋白質、および緩衝溶液中の５０μＬ［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（１０ｍＬ結合緩衝液当たり２．５μＬ［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）よりなる２００μＬの最終容量を有する。
ｂ．手法
候補化合物は、好ましくは、９６−ウェルプレート様式を用いてスクリーニングする（これらを−８０℃で凍結することができる）。膜蛋白質（または対照として、標的ＧＰＣＲを排除する発現ベクターを含む膜）は、懸濁するまで軽くホモゲナイズする。次いで、上記したブラッドフォード蛋白質アッセイを用い、蛋白質濃度を決定する。次いで、膜蛋白質（および対照）を結合緩衝液中で０．２５ｍｇ／ｍＬまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。しかる後、１００ｍＬのＧＤＰ緩衝液をＷａｌｌａｃ Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ^ＴＭ（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに加えた。５μＬのピン−ツールを用いて、５μＬの候補化合物をそのようなウェルに移す（すなわち、２００μＬの合計アッセイ容量中の５μＬは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が１０μＭとなる１：４０の比率である）。再度、汚染を回避するために、各移動工程の後に、水（１×）、エタノール（１×）、水（２×）を含む３つのレザバ中でピンツールを注ぐべきであり−過剰の液体を各濯ぎの後にツールから振り落とし、紙およびキムワイプで乾燥すべきである。その後、５０μＬの膜蛋白質を各ウェルに加え（標的ＧＰＣＲを含まない膜を含む対照ウェルも利用した）、室温にて５〜１０分間プレ−インキュベートした。しかる後、結合緩衝液中の５０μＬの［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに加え、続いて、室温にて６０分間シェーカー上でインキュベートする（再度、本実施例においてはプレートをホイルで被覆する）。次いで、４０００ＲＰＭにおける２２℃での１５分間のプレートの回転によってアッセイを停止させる。次いで、プレートを８チャネルマニホールドで吸引し、プレートカバーでシールする。次いで、（製造業者の指示のように）設定「Ｐｒｏｔ．＃３７」を用いてＷａｌｌａｃ １４５０でプレートを読み取る。
２．アデニリルシクラーゼアッセイ
細胞−ベースのアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ^ＴＭ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）は、粗製原形質膜で用いるために改変することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｎｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含有するシンチラントコーティングを含有することができる。ウェルで発生したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接的競合によって定量することができる。以下は、受容体を発現する細胞におけるｃＡＭＰレベルの変化の決定用の簡単なプロトコルとして働く。
【０３５５】
ある実施形態において、改変されたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ^ＴＭ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）は、以下のプロトコルに従って、例えば、ＧＰＲ１１９アゴニストとしての、候補化合物の同定で利用される。
【０３５６】
本発明のＧプロテイン−結合受容体でトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションからほぼ３日後に収穫される。膜は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中での懸濁化細胞のホモゲナイゼーションによって調製される。ホモゲナイゼーションは、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いて氷上でほぼ１０秒間行う。得られたホモゲネートを４９，０００×ｇにおいて４℃にて１５分間遠心する。次いで、得られたペレットを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に再懸濁させて、１０秒間ホモゲナイズし、続いて、４９，０００×ｇにおいて４℃にて１５分間遠心する。次いで、得られたペレットを利用するまで−８０℃で保存する。直接的な同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解凍し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液に再懸濁し、０．６０ｍｇ／ｍＬの最終蛋白質濃度を得る（再懸濁させた膜を用いるまで氷上に置く）。
【０３５７】
ｃＡＭＰ標準、および（２μＣｉのトレーサー（１１ｍＬ検出緩衝液に対し［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μＬ）））を含む）検出緩衝液を調製し、製造業者の指示に従って維持する。アッセイ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１単位／ｍＬクリアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有するもの）をスクリーニングのために新たに調製し、次いで、アッセイ緩衝液を利用するまで氷上で保存した。
【０３５８】
候補化合物を、４０μＬの膜蛋白質（３０μｇ／ウェル）および５０μＬのアッセイ緩衝液と共に、好ましくは、例えば、９６−ウェルプレートのウェルに加える（３μＬ／ウェル：１２μＭ最終アッセイ濃度）。次いで、温和に震盪しつつ、この混合物を室温にて３０分間インキュベートする。
【０３５９】
インキュベーションに続き、１００μＬの検出緩衝液を各ウェルに加えて、続いて、２〜２４時間インキュベートする。次いで、（製造業者の指示に従い）「Ｐｒｏｔ．＃３１」を用いてＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ^ＴＭプレートリーダーでプレートをカウントする。
３．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ
製造業者の指示に従い、２９３および２９３Ｔ細胞を、ウェル当たり２ｘ１０^４細胞の密度にて９６ウェルプレート上で平板培養し、翌日、リポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトしたＤＮＡ脂質混合物を以下のように、各６−ウェルトランスフェクションのために調製する：１００μＬのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μＬのＤＭＥＭ中の２μＬの脂質と温和に混合する（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、本発明のＧプロテイン−結合受容体を含む５０ｎｇのｐＣＭＶ、またはｐＣＭＶ単独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＧＰＲＳよりなる））。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは以下のように調製した：ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ Ｂｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇＩＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって、ベクターＳＲ１Ｆ−ベータ−ｇａｌを得た。ｃＡＭＰ応答エレメントの８コピーは、アデノウィルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８［その開示をここで引用してその全体を援用する：Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９６）７：１８８３−１８９３参照］からのＰＣＲによって得られ、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにクローン化し、その結果、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを得た。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のベータ−ガクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位において、ｐＧＬ−３−Ｂａｓｉｃ Ｂｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られたルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって作製した。室温における３０分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ／脂質化合物を４００μＬのＤＭＥＭで希釈し、１００μＬの希釈された混合物を各ウェルに加える。細胞培養インキュベーター中での４時間のインキュベーションの後に、１０％ＦＣＳを含む１００μＬのＤＭＥＭを各ウェルに加える。翌日、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＣＳを含む２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭで交換する。８時間後に、ＰＢＳで１回洗浄した後に、ウェルをフェノールレッドを含まない１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに交換する。製造業者の指示に従い、ＬｕｃＬｉｔｅ^ＴＭ レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を用い、ルシフェラーゼ活性を翌日に決定し、１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ^ＴＭ シンチレーションおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で読む。
実施例８：例えば、ＧＰＲ１１９アゴニスト活性についての全細胞アデニリルシクラーゼアッセイ
供給業者のプロトコルに従い、Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ^ＴＭ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）で環状ＡＭＰ決定を行う。ＨＥＫ２９３細胞を、正規の増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中にて、皿当たり１２ｘ１０^６細胞にて、１５−ｃｍ組織培養皿で平板培養する。翌日、製造業者のプロトコルに従い、１０μｇの空のベクターＤＮＡまたは発現プラスミドＤＮＡのいずれかをリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で細胞にトランスフェクトする。２４時間の培養の後、トランスフェクトされた細胞をＧＩＢＣＯ細胞解離緩衝液（Ｃａｔ ＃ １３１５１−０１４）中で収穫し、１，１００ｒｐｍにおける５分間の遠心によってプレート化し、適当な用量のアッセイ緩衝液（５０％１×ＰＢＳおよび５０％刺激緩衝液）に注意深く再懸濁して、２ｘ１０^６細胞／ｍＬの最終細胞カウントを得る。テスト化合物を、示された所望のアッセイ濃度にて５０μＬのアッセイ緩衝液中で調製し、９６−ウェルのＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅのウェルにピペットで入れ、次いで、上記で調製した細胞懸濁液を加えた（ウェル当たり５０μＬ）。室温にて６０分のインキュベーション時間の後に、次いで、トレーサー［^１２５Ｉ］−ｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターでカウントする。ｃＡＭＰ／ウェルの値を、各アッセイプレートに含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０３６０】
空のベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰレベルの増加に対する、ＧＰＲ１１９−トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰレベルの増加は、テスト化合物がＧＰＲ１１９受容体機能性を刺激する化合物であることを示す。
実施例９：例えば、ＧＰＲ１１９アゴニスト活性についてのメラニン保有細胞アッセイ
メラニン保有細胞を、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ［Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９２）５：３７２−３７８］によって報告されているように、培養に維持し、エレクトロポレーションを用い、ＧＰＲ１１９受容体（ＧＰＲ１１９；例えば、ｈｕｍａｎ ＧＰＲ１１９，ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセション Ｎｏ．ＡＡＰ７２１２５およびその対立遺伝子）をコードする発現ベクターでトランスフェクトする。エレクトロポレーションに続き、トランスフェクトされた細胞をアッセイのために９６ウェルプレートに平板培養する。次いで、細胞を４８時間増殖させて、エレクトロポレーション手法から回収すると共に、最大受容体発現レベルを獲得する。
【０３６１】
アッセイの日に、細胞上の増殖培地を、１０ｎＭメラトニンを含有する無血清緩衝液で交換する。メラトニンはメラニン保有細胞において内因性ｇＩ−結合ＧＰＣＲを介して作用して、細胞内ｃＡＭＰレベルを降下させる。降下したｃＡＭＰレベルに応答して、メラニン保有細胞はその色素を細胞の中心に移動させる。この正味の効果は、６００〜６５０ｎＭで決定された、ウェル中の細胞単層の吸光度読み取りの有意な減少である。
【０３６２】
メラトニン中での１時間のインキュベーションの後、細胞は完全に色素−凝集となる。この時点において、ベースライン吸光度の読み取りを収集する。次いで、テスト化合物の系列希釈をプレートに加え、ＧＰＲ１１９アゴニスト活性を有する化合物は、ｃＡＭＰレベルの増加を生じる。これらの増大したｃＡＭＰレベルに応答して、メラニン保有細胞はその色素を細胞周囲に戻す。１時間後、刺激された細胞は、十分に色素が分散する。分散した細胞単層は、６００〜６５０ｎｍ範囲においてより多くの光を吸収する。ベースラインの読みと比較した吸光度の決定された増加は、受容体刺激の程度を定量し、容量−応答曲線をプロットすることを可能とする。
【０３６３】
メラニン保有細胞アッセイに関する材料および方法は、その各々の開示をここで引用してその全体を援用する、米国特許第５，４６２，８５６号および第６，０５１，３８６号に見出される。
【０３６４】
空のベクターでトランスフェクトされたメラニン保有細胞におけるそれに対する、ＧＰＲ１１９でトランスフェクトされたメラニン保有細胞における色素分散の増加は、テスト化合物がＧＰＲ１１９受容体の機能性を刺激する化合物であることを意味する。
【０３６５】
ＧＰＲ１１９アゴニストとしての化合物を同定するための他のアッセイは、当業者に容易に明らかであろう（例えば、上記実施例７参照）。
実施例１０：例えば、ＧＰＲ１１９アゴニスト活性についての酵母レポーターアッセイ
酵母細胞−ベータのレポーターアッセイは文献で従前に記載されている。（例えば、Ｍｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：６８８１−６８８７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ（１９９９）９：２４１３−２４１８；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１２１−１２３；ＷＯ ９９／１４３４４；ＷＯ ００／１２７０４；およびＵＳ
６，１００，０４２参照）。簡単に述べると、酵母細胞は、内因性酵母Ｇ−アルファ（ＧＰＡ１）が欠失されており、多数の技術を用いて構築されたＧ−プロテインキメラで置き換えられているように作製されている。加えて、内因性酵母アルファ−細胞ＧＰＣＲ、Ｓｔｅ３は、選択される哺乳動物ＧＰＣＲの同種発現を可能とするように欠失されている。酵母において、真核生物細胞において保存されたフェロモンシグナリング変換経路（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路）のエレメントは、Ｆｕｓ１の発現を駆動する。Ｆｕｓ１プロモーター（Ｆｕｓ１ｐ）の制御下にβ−ガラクトシターゼ（ＬａｃＺ）を置き換えることによって、系が開発されており、それにより、受容体活性化は酵素読出に導く。
【０３６６】
酵母細胞は、Ａｇａｔｅｐ ｅｔ ａｌ（Ａｇａｔｅｐ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＬｉＡｃ／ｓｓ−ＤＮＡ／ＰＥＧ）ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｔｅｃｈｎｃａｌ Ｔｉｐｓ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｊｏｕｒｎａｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）によって記載された酢酸リチウム方法の適合によって形質転換される。簡単に述べれば、酵母細胞を酵母トリプトンプレート（ＹＴ）上で一晩増殖させる。キャリアー一本鎖ＤＮＡ（１０μｇ）（２つのＦｕｓ１ｐ−ＬａｃＺレポータープラスミド（１つはＵＲＡ選択マーカーを持つものであり、１つはＴＲＰを持つ者である）の各々の２μｇ、酵母発現ベクター（２μｇの複製起点）中の２μｇｋＧＰＲ１１０（例えば、ヒト受容体）、および酢酸リチウム／ポリエチレングリコール／ＴＥ緩衝液をエッペンドルフチューブにピペットで入れる。受容体を含有するが、受容体対照を含有しない酵母発現プラスミドはＬＥＵマーカーである。酵母細胞をこの混合物に摂取し、反応を３０℃にて６０分間進行させる。次いで、酵母細胞を４２℃にて１５分間熱ショックを与える。次いで、細胞を洗浄し、選択プレート上に広げる。選択プレートは合成基底酵母培地からＬＥＵ、ＵＲＡおよびＴＲＰ（ＳＥ−ＬＵＴ）を除いたものである。３０℃における２〜３日間のインキュベーションの後に、次いで、選択プレートで増殖するコロニーをＬａｃＺアッセイでテストする。
【０３６７】
β−ガラクトシダーゼについてのフルオロメトリー酵素アッセイを行うために、主題のＧＰＲ１１９受容体を運ぶ酵母細胞を液体ＳＤ−ＬＵＴ培地中で不飽和濃度まで一晩増殖させる（すなわち、細胞は依然として分裂しており、未だ静止層に到達していない）。それらを新鮮な培地中で最適なアッセイ濃度まで希釈し、９０μＬの酵母細胞を９６−ウェル黒色ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に加える。ＤＭＳＯに溶解させ、１０％ＤＭＳＯ溶液中に１０×濃度まで希釈したテスト化合物をプレートに加え、プレートを３０℃に４時間置く。４時間後に、β−ガラクトシダーゼに対する基質を各ウェルに加える。これらの実験において、フロオレセインジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド（フルオレセインを放出する酵素に対する基質）（ＦＤＧ）を用い、フルオロメトリー読出を行う。５００μＭ ＦＤＧ／２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００のウェル当たり２０μＬを加える（洗剤は細胞を浸透性とするのに必要である）。６０分間の細胞と基質とのインキュベーション後に１Ｍ炭酸ナトリウムのウェル当たり２０μＬを加えて、反応を停止させ、蛍光シグナルを増強させる。次いで、プレートを４８５／５３５ｎｍにおいてフルオロメーターで読む。
【０３６８】
空のベクターで形質転換された酵母細胞における蛍光シグナルの増加に対して、ＧＰＲ１１９−形質転換酵母細胞における蛍光シグナルの増加は、テスト化合物が、ＧＰＲ１１９受容体機能性を刺激する化合物（例えば、ＧＰＲ１１９のアゴニストまたは部分的アゴニストである化合物）であることを示す。ある実施形態において、本発明の化合物は、バックグラウンドシグナル（ビヒクル単独の存在下で得られたシグナル）の蛍光シグナルの増加を超える蛍光シグナルの増加を与える。
実施例１１：放射性標識化合物
ある実施形態において、本発明のＧ−プロテイン結合受容体のリガンドであることが知られた化合物を放射性標識する。本明細書中に記載された放射性標識化合物をスクリーニングアッセイで用いて、化合物を同定／評価することができる。一般的な項目においては、新しく合成された、または同定された化合物（すなわち、テスト化合物）は、放射性標識された公知リガンドおよび受容体の間に複合体の形成を低下させるその能力によって、受容体に対する放射性標識された公知のリガンドの結合を低下させるその能力について評価することができる。本発明の化合物に取り込むことができる適当な放射性核種は、限定されるものではないが、（Ｔとも書かれる）^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１２５Ｉ、^８２Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^１５Ｏ、^１３Ｎ、^３５Ｓおよび^７７Ｂｒを含む。^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^８２Ｂｒを取り込む化合物は一般的には最も有用である。
【０３６９】
「放射性標識された」化合物は、少なくとも１つの放射性核種を取り込んだ化合物であると理解される。いくつかの実施形態において、放射性核種は^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３５Ｓおよび^８２Ｂｒよりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、放射性核種は^３Ｈまたは^１４Ｃである。さらに、本発明のＧプロテイン−結合受容体のリガンドであることが知られた化合物において示される原子の全ては、その原子の最も普通に生じる同位体、あるいはより稀な放射性同位体または非−放射性同位体いずれかであり得ることが理解されるべきである。
【０３７０】
本発明のＧプロテイン−結合受容体のリガンドであることが知られた化合物に適用できるものを含めた有機化合物へ放射性同位体を取り込むための合成方法は当該分野でよく知られており、活性レベルのトリチウムを標的分子に取り込む方法は以下のものを含む：Ａ．トリチウムガスでの接触還元−この手法は、通常、高特異的活性の産物を生じ、ハロゲン化された前駆体または不飽和の前駆体を必要とする。Ｂ．ホウ水素化ナトリウム［^３Ｈ］での還元−この方法はむしろ安価であり、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含有する前駆体を必要とする。Ｃ．水素化アルミニウムリチウム［^３Ｈ］での還元−この手法は、ほとんど理論的な特異的活性における産物を提供する。また、それは、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含有する前駆体も必要とする。Ｄ．トリチウムガス曝露標識：この手法は、適当な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含有する前駆体をトリチウムガスに曝露することを含む。Ｅ．ヨウ化メチル［^３Ｈ］を用いるＮ−メチル化−この手法は、通常、適当な前駆体を高特異的活性のヨウ化メチル（^３Ｈ）で処理することによってＯ−メチルまたはＮ−メチル（^３Ｈ）産物を調製する。この方法は、一般には、約８０〜８７Ｃｉ／ミリモルのような高特異的活性を可能とする。
【０３７１】
活性レベルの^１２５Ｉを標的分子に取り込むための合成方法は以下のものを含む：Ａ．Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ等の反応：この手法は、テトラフルオロボレエート塩のようなジアゾニウム塩へアリールまたはヘテロアリールアミンを変換し、引き続いて、Ｎａ^１２５Ｉを用いて^１２５Ｉ標識化合物へ変換する。代表的な手法はＺｈｕ、Ｄ．−Ｇ．および共同研究者によってＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８において報告された。Ｂ．フェノールのオルト^１２５ヨウ素化−この手法は、Ｃｏｌｌｉｅｒ、Ｔ．Ｌ．および共同研究者によってＪ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ ＣｏｍｐｄＲａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９、４２、Ｓ２６４−Ｓ２６６において報告されているように、フェノールのオルト位置における^１２５Ｉの取込を可能とする。Ｃ．^１２５Ｉでのアリールおよびヘテロアリールブロミド交換−この方法は、一般には、２工程プロセスである。第一の工程は、トリ−アルキルスズハライドまたはヘキサアルキル二スズ（［例えば、（ＣＨ_３）_３ＳｎＳｎ（ＣＨ_３）_３）の存在下における、例えば、ｐＤ触媒反応、すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ_３Ｐ）_４）を用いる、またはアリールまたはヘテロアリールリチウムを介する、アリールまたはヘテロアリールブロミドの対応するトリ−アルキルスズ中間体への変換である。示された手法はＢａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者によってＪ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２において報告された。
【０３７２】
上記した技術は説明的であって、限定する意図のものではない。本発明のＧプロテイン−結合受容体のリガンドであることが知られた化合物を放射性標識するための他の技術は当業者によく知られている。
実施例１２：受容体結合アッセイ
テスト化合物は、本発明のＧプロテイン−結合受容体のリガンドであることが知られている化合物、および該受容体の間の複合体の形成を低下させるその能力について評価することができる。ある実施形態において、公知のリガンドが放射性標識される。放射性標識された公知のリガンドをスクリーニングアッセイで用い、化合物を同定／評価することができる。一般的な項目において、新たに合成されたまたは同定された化合物（すなわち、テスト化合物）は、放射性標識された公知のリガンドと該受容体との間の複合体の形成を低下させるその能力によって放射性標識された公知のリガンドの該受容体への結合を低下させるその能力について評価することができる。
【０３７３】
テスト化合物の非存在下における放射性標識された公知のリガンドの特異的結合のレベル未満のテスト化合物の存在下における放射性標識された公知のリガンドの特異的結合のレベルは、テスト化合物の非存在下におけるよりも、テスト化合物の存在下において該放射性標識された公知のリガンドと該受容体との間のより少ない受容体が形成されることを示す。
【０３７４】
本発明のＧプロテイン−結合受容体のリガンドであることが知られた化合物と該受容体の間の複合体を検出するためのアッセイプロトコル
Ａ．受容体の調製
（１５−ｃｍ皿当たり）６０μＬのリポフェクタミンを用い、本発明のＧプロテイン−結合受容体をコードするポリヌクレオチドを含む１０μｇ発現ベクターで２９３細胞を一過的にトランスフェクトする。一過的にトランスフェクトされた細胞を、培地を交換しつつ、皿中で２４時間増殖させ（７５％密集）、１０ｍＬ／皿のＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）で取り出す。次いで、細胞をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ遠心機にて１７，０００ｒｐｍにおいて細胞を２０分間遠心する（ＪＡ−２５．５０ローター）。引き続いて、ペレットを２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に再懸濁させ、５０−ｍＬ Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザーでホモゲナイズし、再度、遠心する。上清を除去した後、結合アッセイで用いるまで、ペレットを−８０℃で貯蔵する。アッセイで用いる場合、膜を氷上で２０分間解凍し、次いで、１０ｍＬのインキュベーション緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．４）を加える。次いで、膜をボルテックスして、組成膜ペレットを再懸濁させ、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＰＴ−３１００ Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモゲナイザーで設定６において１５秒間ホモゲナイズする。膜蛋白質の濃度は、ＢＲＬブラッドフォード蛋白質アッセイを用いて決定する。
【０３７５】
Ｂ．結合アッセイ
全結合については、合計容量５０μＬの適当に希釈された膜（５０ｍＭ トリス ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するアッセイ緩衝液中に希釈；５〜５０ｕｇ蛋白質）を９６−ウェルのポリプロピレンマイクロタイタープレートに加え、続いて、１００μＬのアッセイ緩衝液および５０μＬの放射性標識された公知のリガンドを加える。非特異的結合では、１００μＬの代わりに５０μＬのアッセイ緩衝液を加え、放射性標識されていない１０ｕＭの該公知のリガンドのさらに５０μＬを加え、その後、５０μＬの該放射性標識された公知のリガンドを加える。次いで、プレートを室温にて６０〜１２０分間インキュベートする。Ｂｒａｎｄｅｌｌ ９６−ウェルプレートハーベスターを備えたＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＧＦ／Ｃ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ濾過プレートをとおしてアッセイプレートを濾過することによって、結合反応を停止させ、引き続いて、０．９％ＮａＣｌを含有する冷５０ｍＭ トリス ＨＣＬ，ｐＨ ７．４で洗浄する。次いで、濾過プレートの底をシールし、５０μＬのＯｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを各ウェルに加え、プレートの頂部をシールし、プレートをＴｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターでカウントする。該放射性標識された公知のリガンドと該受容体との間のより少ない複合体がテスト化合物の存在下で形成されるか否かを決定するために、１００μＬのアッセイ緩衝液を加える代わりに、１００μＬの適当に希釈された該テスト化合物を適当なウェルに加え、引き続いて、５０μＬの該放射性標識された公知のリガンドを加える。
【０３７６】
Ｃ．計算
テスト化合物をまず、１０、１および０．１μＭでアッセイし、次いで、中央の用量が放射性標識された公知のリガンドの結合の約５０％阻害（すなわち、ＩＣ_５０）を引き起こすように選択された濃度の範囲でアッセイする。テスト化合物の非存在下における特異的結合（Ｂ_Ｏ）は、全結合（Ｂ_Ｔ）から非特異的結合（ＮＳＢ）を引いた差であり、（テスト化合物の存在下における）同様に特異的な結合（Ｂ）は、変位結合（Ｂ_Ｄ）から非特異的結合（ＮＳＢ）を引いた差である。ＩＣ_５０は、阻害応答曲線、％Ｂ／Ｂ_０−対−テスト化合物の濃度のｌｏｇｉｔ−ｌｏｇプロットから決定される。
【０３７７】
Ｋ_ｉは、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｔｏｆｆ変換：
Ｋ_ｉ ＝ＩＣ_５０／（Ｉ＋［Ｌ］／Ｋ_Ｄ）
によって計算され、ここで、［Ｌ］はアッセイで用いた放射性標識された公知のリガンドの濃度であって、Ｋ_Ｄは同一の結合条件下で独立して決定される放射性標識公知リガンドの解離定数である。
実施例１３： 腸内分泌細胞系において、または小腸のＫ細胞リッチな領域に由来する組織中の細胞におけるＧＩＰ分泌に対するＧＰＲ１１９アゴニストの効果
本発明に従い、ＧＰＲ１１９アゴニストは、本明細書中に記載されたイン・ビトロアッセイを用い、腸内分泌細胞系において、または小腸のＫ細胞リッチな領域に由来する組織［例えば、十二指腸または空腸組織；例えばＳｏｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．参照 Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｊ（２００６）６：１３１−１４０参照］中の細胞において、ＧＩＰ分泌を刺激することを示すことができる。１日目に、腸内分泌細胞、または小腸のＫ細胞リッチな領域に由来する組織中の細胞を、完全培養培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中で、２４−ウェルプレートに入れる。２日目に、該培養培地を低グルコース培地（ＤＭＥＭ／３ｍＭグルコース／１０％ＦＢＳ）で交換する。３日目に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄する。洗浄された細胞を、組織培養インキュベーターにて、３７℃および５％ＣＯ_２において１時間、ビヒクルで、または（例えば、１ｎＭ〜２０ｕＭの範囲の）種々の濃度のＧＰＲ１１９アゴニストで、または１５ｍＭグルコースを含む無血清ＤＭＥＭ中の陽性対照としてのフォルスコリン（１ｕＭ）で刺激する。次いで、上清を収集し、５００ｇおよび４℃にて５分間の遠心によって、清澄化する。供給業者によって提供された指示に従い、ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［ラット／マウス胃阻害性ポリペプチド（全）ＥＬＩＳＡ カタログ＃ＥＺＲＭＧＩＰ−５５Ｋ］から購入した試薬を用いるＥＬＩＳＡによって、上清に放出されたＧＩＰを決定する。
【０３７８】
これまでの明細書は、説明目的で掲げた実施例と共に本発明の原理を教示するが、本発明の実施は、特許請求の範囲およびその均等物の範囲内に入る、通常の変形、適合または改変の全てを含むと理解されるであろう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＰ分泌促進薬を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ） テスト化合物をイン・ビトロにて宿主細胞またはＧプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）を含む宿主細胞の膜と接触させる工程であって、ここで該ＧＰＣＲが、
（ｉ） 配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｉｉｉ） 特異的プライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｉｖ） ０．１×ＳＳＣ中での６５℃における洗浄をともなう高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｖ） 配列番号２を有するＧＰＣＲの構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；または
（ｖｉ） （ｉ）〜（ｖ）で定義されるアミノ酸配列中の一個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加による、（ｉ）〜（ｖ）のＧＰＣＲ由来のＧＰＣＲ；
を含む、工程；
（ｂ） 該受容体の機能性を刺激するテスト化合物の能力を決定する工程であって、
該ＧＰＣＲの機能性を刺激するテスト化合物の能力が、該テスト化合物がＧＩＰ分泌促進薬であることを示す、工程；
（ｃ） 該化合物が、工程（ｂ）における前記受容体の機能性を刺激する化合物を前もって投与した脊椎動物から得られる試料中のＧＩＰレベルを増加させるか否かを決定する工程を含み、
該脊椎動物におけるＧＩＰレベルを増加させるテスト化合物の能力が、該テスト化合物がＧＩＰ分泌促進薬であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、方法。
【請求項２】
ＧＩＰ分泌促進薬を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ） テスト化合物をイン・ビトロにて宿主細胞またはＧプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）を含む宿主細胞の膜と接触させる工程であって、ここで該ＧＰＣＲが、
（ｉ） 配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｉｉｉ） 特異的プライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｉｖ） ０．１×ＳＳＣ中での６５℃における洗浄をともなう高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｖ） 配列番号２を有するＧＰＣＲの構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；または
（ｖｉ） （ｉ）〜（ｖ）で定義されるアミノ酸配列中の一個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加による、（ｉ）〜（ｖ）のＧＰＣＲ由来のＧＰＣＲ；
を含む、工程；
（ｂ） 該受容体の機能性を刺激するテスト化合物の能力を決定する工程であって、
該ＧＰＣＲの機能性を刺激するテスト化合物の能力が、該テスト化合物がＧＩＰ分泌促進薬であることを示す、工程；
（ｃ） 試料が由来する脊椎動物における骨質量のレベルを該化合物が増加させるか否かを決定する工程であって、該脊椎動物が工程（ｂ）における前記受容体の機能性を刺激する化合物を前もって投与されている工程を含み、
該脊椎動物における骨質量を増加させるテスト化合物の能力が、該テスト化合物が、低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するのに有用な化合物、または個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、方法。
【請求項３】
前記ＧＰＣＲが組換え体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が発現ベクターを含み、該発現ベクターがＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記決定する工程が、第二のメッセンジャーのレベルの決定を介するものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のメッセンジャーが環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ_３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性およびＣａ^２＋よりなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｃＡＭＰのレベルが増加する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記決定する工程が、メラニン保有細胞アッセイの使用を介するもの、前記ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳ結合の決定を介するもの、またはレポーターアッセイを介するものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞がメラニン保有細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記テスト化合物が、モル当たり１０，０００グラム未満の分子量を有する小分子である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分子量が、モル当たり５，０００グラム未満である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＣＲのアミノ酸配列が、配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項１〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）分泌促進薬を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ） Ｇプロテイン−結合受容体１１９（ＧＰＲ１１９）アゴニストが、ＧＰＲ１１９アゴニストを前もって投与した脊椎動物から得られる試料中のＧＩＰレベルを増加させるか否かを決定する工程を含み、
脊椎動物におけるＧＩＰレベルを増加させるＧＰＲ１１９アゴニストの能力が、該ＧＰＲ１１９アゴニストが、ＧＩＰ分泌促進薬であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、方法。
【請求項１７】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストが、モル当たり１０，０００グラム未満の分子量を有する小分子である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分子量が、モル当たり５，０００グラム未満である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストがヒトＧＰＲ１１９のアゴニストである請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストは選択的ＧＰＲ１１９アゴニストであるかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストは１０μＭ、１μＭおよび１００ｎＭよりなる群から選択される値未満のＥＣ_５０を有するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１６〜２０いずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）分泌促進薬を同定するための、Ｇプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）の使用であって、
（ａ） 該ＧＰＣＲがテスト化合物の存在下または非存在下で該受容体に対する公知のリガンドと接触し、ここで該ＧＰＣＲは：
（ｉ） 配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｉｉｉ） 特異的プライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｉｖ） ０．１×ＳＳＣ中での６５℃における洗浄をともなう高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｖ） 配列番号２を有するＧＰＣＲの構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；または
（ｖｉ） （ｉ）〜（ｖ）で定義されるアミノ酸配列中の一個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加による、（ｉ）〜（ｖ）のＧＰＣＲ由来のＧＰＣＲ；
を含み、
（ｂ） 前記公知のリガンドとＧＰＣＲの間の複合体が、検出可能であり；そして
（ｃ） 該テスト化合物の非存在下におけるよりも該テスト化合物の存在下において該複合体のより少数が形成されるか否かを決定する工程が、該テスト化合物が、ＧＩＰ分泌促進薬であることを示し、
（ｉ） 前記テスト化合物が、脊椎動物から得られる試料中のＧＩＰレベルを増加させるか否かを決定する工程であって、該脊椎動物は該テスト化合物を前もって投与されており、該テスト化合物はその存在下で、より少数の前記複合体が形成される、工程をさらに含み、
ここで脊椎動物におけるＧＩＰのレベルを増加させる該テスト化合物の能力が、該テスト化合物が、ＧＩＰ分泌促進薬、低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するのに有用な化合物、または個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、使用。
【請求項２３】
グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）分泌促進薬を同定するための、Ｇプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）の使用であって、
（ａ） 該ＧＰＣＲがテスト化合物の存在下または非存在下で該受容体に対する公知のリガンドと接触し、ここで該ＧＰＣＲは：
（ｉ） 配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｉｉｉ） 特異的プライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｉｖ） ０．１×ＳＳＣ中での６５℃における洗浄をともなう高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｖ） 配列番号２を有するＧＰＣＲの構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；または
（ｖｉ） （ｉ）〜（ｖ）で定義されるアミノ酸配列中の一個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加による、（ｉ）〜（ｖ）のＧＰＣＲ由来のＧＰＣＲ；
を含み、
（ｂ） 前記公知のリガンドとＧＰＣＲの間の複合体が、検出可能であり；そして
（ｃ） 該テスト化合物の非存在下におけるよりも該テスト化合物の存在下において該複合体のより少数が形成されるか否かを決定する工程が、該テスト化合物が、ＧＩＰ分泌促進薬であることを示し、
（ｉ） 前記テスト化合物が、試料の由来する脊椎動物中の骨質量のレベルを増加させるか否かを決定する工程であって、該脊椎動物は該テスト化合物を投与されており、該テスト化合物はその存在下で、より少数の前記複合体が形成される、工程をさらに含み、
ここで脊椎動物における骨質量のレベルを増加させる該テスト化合物の能力が、該テスト化合物が、低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するのに有用な化合物、または個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、使用。
【請求項２４】
前記公知のリガンドが標識されている、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の使用であって、以下：
（ｉ） その存在下で、より少数の前記複合体が形成される前記テスト化合物をイン・ビトロにて脊椎動物腸内分泌細胞またはＧＩＰを分泌可能な細胞と接触させる工程；および、
（ｉｉ） 該化合物が該脊椎動物腸内分泌細胞または該ＧＩＰを分泌可能な細胞からのＧＩＰ分泌を刺激するか否かを決定する工程をさらに含み、
該脊椎動物腸内分泌細胞またはＧＩＰを分泌可能な細胞からのＧＩＰ分泌を刺激するテスト化合物の能力が、該テスト化合物がＧＩＰ分泌促進薬、低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するのに有用な化合物、または個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物であることを示す、使用。
【請求項２６】
前記ＧＰＣＲが、組換え体である請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記宿主細胞が発現ベクターを含み、該発現ベクターがＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記公知のアゴニストがプロテイン−結合受容体１１９（ＧＰＲ１１９）アゴニストである請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストがヒトＧＰＲ１１９のアゴニストである請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストは選択的ＧＰＲ１１９アゴニストであるかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストは１０μＭ、１μＭおよび１００ｎＭよりなる群から選択される値未満のＥＣ_５０を有するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストが、モル当たり１０，０００グラム未満の分子量を有する小分子である請求項２８〜３１のいずれか１項記載の使用。
【請求項３３】
前記アゴニストの分子量が、モル当たり５，０００グラム未満である請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
前記テスト化合物が、モル当たり１０，０００グラム未満の分子量を有する小分子である請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
前記テスト化合物の分子量が、モル当たり５，０００グラム未満である請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記ＧＰＣＲのアミノ酸配列が、配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも８０％同一性を有する請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）分泌促進薬を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ） Ｇプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で該受容体に対する公知のリガンドとイン・ビトロにて接触させる工程であって、ここで該ＧＰＣＲが、
（ｉ） 配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｉｉｉ） 特異的プライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｉｖ） ０．１×ＳＳＣ中での６５℃における洗浄をともなう高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｖ） 配列番号２を有するＧＰＣＲの構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；または
（ｖｉ） （ｉ）〜（ｖ）で定義されるアミノ酸配列中の一個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加による、（ｉ）〜（ｖ）のＧＰＣＲ由来のＧＰＣＲ；
を含む、工程；
（ｂ） 前記公知のリガンドとＧＰＣＲの間の複合体を検出する工程；そして
（ｃ） 該テスト化合物の非存在下におけるよりも該テスト化合物の存在下において該複合体のより少数が形成されるか否かを決定する工程であって、ここで該決定する工程は、該テスト化合物が、ＧＩＰ分泌促進薬であることを示す、工程；
（ｄ）その存在下で、より少数の前記複合体が工程（ｃ）で形成される化合物を、前もって投与した脊椎動物から得られた試料中のＧＩＰのレベルを、テスト化合物が増加させるか否かを決定する工程を含み、
脊椎動物においてＧＩＰのレベルを増加させる該テスト化合物の能力が、該テスト化合物が、ＧＩＰ分泌促進薬であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、方法。
【請求項３９】
グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）分泌促進薬を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ） Ｇプロテイン−結合受容体（ＧＰＣＲ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で該受容体に対する公知のリガンドとイン・ビトロにて接触させる工程であって、ここで該ＧＰＣＲが、
（ｉ） 配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｉｉｉ） 特異的プライマー配列番号３および配列番号４を用いてヒトＤＮＡ試料にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｉｖ） ０．１×ＳＳＣ中での６５℃における洗浄をともなう高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補体とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列；
（ｖ） 配列番号２を有するＧＰＣＲの構成的に活性なバージョンのアミノ酸配列；または
（ｖｉ） （ｉ）〜（ｖ）で定義されるアミノ酸配列中の一個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加による、（ｉ）〜（ｖ）のＧＰＣＲ由来のＧＰＣＲ；
を含む、工程；
（ｂ） 前記公知のリガンドとＧＰＣＲの間の複合体を検出する工程；そして
（ｃ） 該テスト化合物の非存在下におけるよりも該テスト化合物の存在下において該複合体のより少数が形成されるか否かを決定する工程であって、ここで該決定する工程は、該テスト化合物が、ＧＩＰ分泌促進薬であることを示す、工程；
（ｄ）その存在下で、より少数の前記複合体が工程（ｃ）で形成される化合物が、前もって投与される、試料が由来する脊椎動物の骨質量のレベルを、テスト化合物が増加させるか否かを決定する工程を含み、
脊椎動物において骨質量のレベルを増加させる該テスト化合物の能力が、該テスト化合物が、低骨質量によって特徴付けられる状態を治療または予防するのに有用な化合物、または個体において骨質量を増加させるのに有用な化合物であることを示し、ここで該脊椎動物はヒトであり、該ヒトは、工程（ｂ）における受容体の機能性を刺激する該化合物を投与されることに既に同意している、方法。
【請求項４０】
前記公知のリガンドが標識されている、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＧＰＣＲが組換え体である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞が発現ベクターを含み、該発現ベクターがＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記公知のリガンドがＧプロテイン−結合受容体１１９（ＧＰＲ１１９）アゴニストである請求項３８〜４２いずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストがヒトＧＰＲ１１９のアゴニストである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストは選択的ＧＰＲ１１９アゴニストであるかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストが、１０μＭ、１μＭおよび１００ｎＭよりなる群から選択される値未満のＥＣ_５０を有するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＧＰＲ１１９アゴニストが、モル当たり１０，０００グラム未満の分子量を有する小分子である請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記アゴニストの分子量が、モル当たり５，０００グラム未満である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記テスト化合物が、モル当たり１０，０００グラム未満の分子量を有する小分子である請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記テスト化合物の分子量が、モル当たり５，０００グラム未満である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＧＰＣＲのアミノ酸配列が、配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも８０％同一性を有する請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【公開番号】特開２００９−２４０３２８（Ｐ２００９−２４０３２８Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７０６２２（Ｐ２００９−１７０６２２）
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【分割の表示】特願２００９−５０５４４５（Ｐ２００９−５０５４４５）の分割
【原出願日】平成１９年４月１０日（２００７．４．１０）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ　ファーマシューティカルズ，　インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】