説明

催奇形性の予測方法

【課題】本発明は、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、
(1)下記にそれぞれ定義される、阻害活性SD、阻害活性DG、および必要に応じて阻害活性SGを測定する工程、
(2)前記阻害活性SGまたはDGを、予め設定された基準値と比較する工程、および
(3)前記阻害活性SDを、前記阻害活性DGと、比較する工程、
を有する方法。
前記阻害活性SDは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
前記阻害活性DGは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
前記阻害活性SGは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化学物質が有する催奇形性の予測方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
医薬品、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、親動物における配偶子形成、受胎能、妊娠維持といった生殖性及び胎児や出生児の発生に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称され、ほぼ全ての医薬品及び農薬の製造・販売に際して試験の実施が求められている。発生毒性試験の一例として、化学物質を哺乳動物の妊娠期に投与し、該哺乳動物の胎児の生存性及び形態的な変化等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、ラット(げっ歯類)及びウサギ(非げっ歯類)を用いて、化学物質を胎児の器官形成期に投与し、胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、該化学物質の催奇形作用の有無が評価される。
しかしながら、動物個体を使用した催奇形性試験は、妊娠動物の作出から化学物質の投与、熟練した技術を要する胎児観察に至るまで多大な労力と経費を要する他、動物愛護の観点から使用動物数の削減が求められている。そこで、その代替試験法として様々なin vitro試験法が開発されている。このようなin vitro試験法として、例えば、マウス胚性幹細胞(以下、マウスES細胞)を用いた試験法(EST : Embryonic Stem cell Test)、ラット胎児の肢芽を用いる小塊培養法(Micro mass culture)及びラットの初期胚を用いた全胚培養法(Whole embryo culture)等の哺乳動物の細胞や組織等を用いた試験系が確立されている。
例えば、非特許文献1には、マウスES細胞の収縮する心筋細胞への分化、マウスES細胞における毒性、および3T3マウス繊維芽細胞における毒性を分析することを含む、発生毒性の予測における胚性幹細胞の使用が開示されている。
【非特許文献1】Methods in Molecular Biology、2006年、Volume: 329、p.371−395
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかし、いずれの方法も予測精度の問題から、現状ではスクリーニング試験としても汎用されていない。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、株化細胞のみで実施できる優位性をもつマウスES細胞を用いた試験法(EST法)に改良を加え、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者らは、鋭意検討の結果、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性、化学物質が当該化学物質の哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性、および化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性を、特定の方法で比較および評価することにより、従来法よりも高い精度で化学物質の催奇形性を予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
[1]
化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、
(1)下記にそれぞれ定義される、阻害活性SD、阻害活性DG、および必要に応じて阻害活性SGを測定する工程、
(2)前記阻害活性SGまたはDGを、予め設定された基準値と比較する工程、および
(3)前記阻害活性SDを、前記阻害活性DGと、比較する工程、
を有する方法;
前記阻害活性SDは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
前記阻害活性DGは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
前記阻害活性SGは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である;
[2]
前記哺乳動物が、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、およびウサギから選択される、上記[1]に記載の方法;
[3]
前記幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞から選択される、上記[1]または[2]に記載の方法;
[4]
前記分化細胞が、繊維芽細胞、神経細胞、羊膜細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞から選択される上記[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法;
[5]
前記阻害活性DGおよび阻害活性SGの測定が、
哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を用意すること、
前記哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を、それぞれ、化学物質の存在下、培養器内で細胞が飽和する前までの一定期間培養すること、
当該培養後の分化細胞および幹細胞の細胞数を、それぞれ、測定すること
を含む方法により行われる、上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法;
[6]
催奇形性を、陽性および陰性の2段階で判定する、上記[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法;
[7]
前記阻害活性SDが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を50%阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性DGが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性SGが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度である、
上記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法;
[8]
前記阻害活性SDが、前記化学物質がマウスES細胞の心筋への分化を50%阻害する化学物質濃度ES ID50であり、
前記阻害活性DGが、前記化学物質がマウス3T3細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度3T3 IC50であり、および
前記阻害活性SGが、前記化学物質がマウスES細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度ES IC50である、
上記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法;
[9]
SD、DG、およびSGが
条件式1:SGまたはDG≦k1(k1は定数を表す)を満たす場合、または
条件式2:SD/DG≦k2(k2は定数を表す)を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する、上記[7]または[8]に記載の方法;
[10]
k1が0.01〜1μg/mLであり、および
k2が0.9〜1.1である、
上記[9]に記載の方法;ならびに
[11]
k1が0.1μg/mLであり、および
k2が1.0である、
上記[9]に記載の方法
等を提供するものである。
【発明の効果】
【0005】
本発明によれば、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法が、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0006】
本発明において「化学物質」は、医薬、農薬、化粧品、工業製品等の哺乳動物が、摂取または接触により暴露される可能性のある物質の全てを包含し、純物質であってもよく、混合物であってもよい。
本発明において、「催奇形性」とは、哺乳動物の胎児に奇形を起こす性質を意味する。したがって、本発明において、胚・児致死作用を有するものであっても、胎児に奇形を起こす性質を有さない化学物質は、「催奇形性」を有さない。
本発明において「哺乳動物」としては、ヒトおよびサル等の霊長類、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等が挙げられる。
【0007】
本明細書中、前記阻害活性SDは、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
本明細書中、前記阻害活性DGは、化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
本明細書中、前記阻害活性SGは、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。
【0008】
本発明の、化学物質が有する催奇形性の予測方法は、
(1)阻害活性SD、阻害活性DG、および阻害活性SGを測定する工程
を有する。
【0009】
本発明の予測方法で用いられる、「哺乳動物由来の幹細胞」、および「哺乳動物由来の分化細胞」における「哺乳動物」としては、前記で例示したものが挙げられる。なかでも、マウスが特に好ましい。「哺乳動物由来の幹細胞」における「哺乳動物」と「哺乳動物由来の分化細胞」における「哺乳動物」とは、好ましくは、同種である。
本発明の予測方法で用いられる「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。なかでも、胚性幹細胞(例、マウスES細胞)が好ましい。
本発明の予測方法で用いられる「分化細胞」としては、例えば、繊維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞が挙げられる。なかでも、繊維芽細胞が好ましく、マウス胎児由来繊維芽細胞(例、マウス3T3細胞)がより好ましい。
このような細胞は、公知の方法によって調製してもよいが、ATCC等の機関から入手可能である。
【0010】
「阻害活性SD」の測定
前記「阻害活性SD」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の未分化な幹細胞を用意すること(工程1)、
前記幹細胞を、化学物質の存在下で、分化誘導培養すること(工程2)、
前記幹細胞の分化率を計測すること(工程3)、
を含む方法により行われる。
【0011】
以下に、「阻害活性SD」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程1では、例えば、未分化性を維持して培養された哺乳動物由来の幹細胞をトリプシン処理等により分散させる。当該培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の細胞の培養に通常用いられる培地(例、非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地)、マウスES細胞ではカルチセル無血清培地(ES細胞用)(大日本製薬)も使用可)にマウスES細胞ではLIF(白血病阻止因子、leukemia inhibitory factor)を添加したものを用いればよい。培養条件は、哺乳動物由来の細胞の培養に通常用いられる条件を用いればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。
【0012】
前記工程2では、種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地中で、前記分散細胞を、ハンギングドロップ法(懸滴培養法)などにより凝集塊を作らせて胚様体が形成されるまで培養する。分化誘導用の培地は、用いられる未分化細胞および分化により生じさせる分化細胞の種類によって異なるが、例えば、マウスES細胞を心筋細胞に分化させる場合、LIFを含有しない非働化処理済み牛胎児血清を含有する培地を用いればよい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。培養期間は、マウスES細胞であれば好ましくは2〜3日間である。
次いで、前記工程1で得られた胚様体を、種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地で更に(例えば、マウスES細胞であれば2〜3日間(懸滴培養開始から合計5日後まで))、浮遊培養する。「種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地」における培地としては、前記工程1における培地と同じものを用いることが好ましい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。対照としては、化学物質を含有しない媒体のみを添加した群を用いる。前記媒体は、好ましくは、前記化学物質を溶解させる溶媒である。
次いで、胚様体を、接着系のマルチウェルプレートに移し、例えば、マウスES細胞であれば分化誘導開始から合計12日後まで接着培養する。当該接着培養における培地としては、前記工程2における培地と同じものを用いることが好ましい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。
【0013】
前記工程3では、各ウェル内の培養細胞の形態観察などにより、各化学物質濃度における、細胞の分化率を求める。分化の判断は、例えば、心筋細胞の場合、拍動の有無によって、行う事ができる。
このようにして測定された分化率に基づく数値(例えば、分化を50%阻害する化学物質濃度)として、阻害活性SDを得ることができる。
【0014】
「阻害活性DG」の測定
前記「阻害活性DG」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の分化細胞を用意すること(工程1)、
前記哺乳動物由来の分化細胞を、化学物質の存在下で、培養すること(工程2)、
前記分化細胞の細胞数を計測すること(工程3)、
を含む方法により行われる。
【0015】
以下に、「阻害活性DG」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程1では、培養中の哺乳動物由来の分化細胞をトリプシン処理等により分散させ、哺乳動物由来の分化細胞を用意する。当該培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の分化細胞の培養に通常用いられる培地(例、非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地)を用いればよい。培養条件は、哺乳動物由来の分化細胞の培養に通常用いられる条件を用いればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。
前記細胞は、好ましくは、96ウェルプレートに1ウェルあたり500〜2,000の範囲内の所定の細胞数(好ましくは、1,000個/ウェル)になるように播種する。
【0016】
前記工程2では、培地中の前記工程1で用意した分化細胞に、化学物質を加え、次いで、前記分化細胞を前記化学物質の存在下で培養する。前記化学物質は、好ましくは、培地中に溶解または懸濁させて、添加される。当該培地としては、工程1で用いられる培地と同じものを用いることが好ましい。対照としては、化学物質を含有しない媒体のみを添加した群を用いる。前記媒体は、好ましくは、前記化学物質を溶解させる溶媒である。
培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。
培養期間は、用いられる細胞の種類および培養条件に応じて適宜変更することができるが、通常、ウェル内で細胞が飽和する前までの一定期間(マウス3T3細胞の場合は、好ましくは、3〜5日間)である。
これらのように、培養期間を設定することは、化学物質の細胞への影響を正確に検出し、催奇形性を高い精度で予測することを可能にするために重要である。
当該培養においては、好ましくは、培地の交換は行わない。
【0017】
工程(3)では、前記哺乳動物由来の分化細胞の生細胞数を計測する。生細胞数の計測は、例えば、市販の細胞数測定キット(例、Cell Counting Kit 8(同仁化学))等を用いて、行うことができる。
このようにして測定された生細胞数に基づく数値(例えば、細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度)として、阻害活性DGを得ることができる。
【0018】
「阻害活性SG」の測定
前記「阻害活性SG」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の未分化な幹細胞を用意すること(工程1)、
前記幹細胞を、化学物質の存在下で、分化培養すること(工程2)、
前記幹細胞の細胞数を計測すること(工程3)、
を含む方法により行われる。
【0019】
以下に、「阻害活性SG」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程1では、未分化性を維持して培養された哺乳動物由来の幹細胞をトリプシン処理等により培養細胞を分散させ、哺乳動物由来の幹細胞を用意する。当該未分化維持培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の幹細胞の未分化維持培養に通常用いられる培地(例、牛胎児血清含有DMEM培地、マウスES細胞ではカルチセル無血清培地(ES細胞用)(大日本製薬)も使用可)を用いればよい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。
前記細胞は、好ましくは、96ウェルプレートに1ウェルあたり500〜2,000の範囲内の所定の細胞数(好ましくは、1,000個/ウェル)になるように播種する。
【0020】
前記工程2では、培地中の前記工程1で用意した幹細胞に、化学物質を加え、次いで、前記幹細胞を前記化学物質の存在下で未分化維持培養する。前記化学物質は、好ましくは、培地中に溶解または懸濁させて、添加される。当該培地としては、工程1で用いられる培地と同じものを用いることが好ましい。対照としては、化学物質を添加しない群を用いる。
培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、5% CO、37℃が挙げられる。
培養期間は、用いられる細胞の種類および培養条件に応じて適宜変更することができるが、通常、ウェル内で細胞が飽和する前までの一定期間(マウスES細胞の場合は、好ましくは、3〜5日間)である。
これらのように、培養期間を設定することは、化学物質の細胞への影響を正確に検出し、催奇形性を高い精度で予測することを可能にするために重要である。
当該維持培養においては、好ましくは、培地の交換は行わない。
【0021】
工程(3)では、前記哺乳動物由来の幹細胞の生細胞数を計測する。生細胞数の計測は、例えば、市販の細胞数測定キット(例、Cell Counting Kit 8(同仁化学))等を用いて、行うことができる。
【0022】
このようにして測定された生細胞数に基づく数値(例えば、細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度)として、阻害活性SGを得ることができる。
【0023】
本発明の方法は、以下の考えに基づく。
胚・胎児の組織は癌細胞や成体の消化管粘膜、皮膚、骨髄等のように細胞増殖が盛んであるため、細胞毒性が強い化学物質に対して強い影響を受ける。したがって、抗がん剤のような化学物質の多くが催奇形作用を有することが知られている。本条件式では、ある一定の基準以下の阻害活性SGまたはDGを有する場合は、催奇形性が陽性と予測する。
次いで、上記の基準で陰性と判定された化合物に対して、以下の概念から確立された基準を適用する。
阻害活性SDは、胎児の発生および分化に対する毒性を、
阻害活性DGは、親動物に対する毒性を、および
阻害活性SGは、胎児の成長に対する毒性を、
それぞれ表していると仮定する。
この仮定に基づき、化学物質の、親動物に対する毒性を基準とする、胎児の発生および分化に対する相対毒性が高い場合には、化学物質の催奇形性が陽性であると予測する。
したがって、本発明の、化学物質が有する催奇形性の予測方法は、
(2)前記阻害活性SGまたはDGを、予め設定された基準値と比較する工程、および
(3)前記阻害活性SDを、前記阻害活性DGと、比較する工程、
を更に有する。
また、本発明の方法は、上記の原理に基づき、好ましくは、催奇形性を陽性および陰性の2段階で判定する。
ただし、前記仮定は、単に、本発明を発明する契機になったものにすぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
【0024】
本発明の方法において、具体的には、好ましくは、
前記阻害活性SDが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を50%阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性DGが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性SGが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度である。
ここで、SD、DG、およびSGが
条件式1:SGまたはDG≦k1(k1は定数を表す)を満たす場合、または
条件式2:SD/DG≦k2(k2は定数を表す)を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する。
当業者に明らかなように、SD、DG、およびSGの測定値、およびSD/DGの計算値は、適宜、四捨五入されて、条件式に当てはめられる。好ましくは、有効数字2桁になるように四捨五入される。
【0025】
本発明の方法において、具体的には、より好ましくは、
前記阻害活性SDが、前記化学物質がマウスES細胞の心筋への分化を50%阻害する化学物質濃度ES ID50であり、
前記阻害活性DGが、前記化学物質がマウス3T3細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度3T3 IC50であり、および
前記阻害活性SGが、前記化学物質がマウスES細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度ES IC50である。
ここで、ES ID50、3T3 IC50、およびES IC50
条件式1:ES IC50または3T3 IC50≦k1(k1は定数を表す)を満たす場合、または
条件式2:ES ID50/3T3 IC50≦k2(k2は定数を表す)を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する。
当業者に明らかなように、ES ID50、3T3 IC50、およびES IC50の測定値、およびES ID50/3T3 IC50の計算値は、適宜、四捨五入されて、条件式に当てはめられる。好ましくは、有効数字2桁になるように四捨五入される。
【0026】
上記の条件式において、好ましくは、
k1が0.01〜1μg/mLであり、および
k2が0.9〜1.1である。
また、上記の条件式において、より好ましくは、
k1が0.1μg/mLであり、および
k2が1.0である。
【実施例】
【0027】
以下に、本発明を実施例によって、更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0028】
実施例1
(1)マウスES細胞の未分化培養
ATCC(American Type Culture Collection)よりマウスES細胞(ES−D3株)を入手した。ES−D3株はマウスLIF(白血病阻害因子:leukemia inhibitory factor)及びβ−メルカプトエタノールを添加した15%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地あるいはカルチセル無血清培地(ステムセルサイエンス社)を用いて未分化維持培養を行った。ゼラチンコートされた60mm接着系シャーレに30万個の細胞を5mLの培養液を用いて培養した。2日間に1回の頻度で継代を行うが、週末など培養期間が3日間になる場合は、細胞数を10万個に減らした。
(2)マウス3T3細胞の培養
ATCC(American Type Culture Collection)よりマウス3T3細胞(BALB 3T3細胞株)を入手した。BALB 3T3細胞株は、10%の非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて維持培養を行った。60mm接着系シャーレに30万個の細胞を5mLの培養液を用いて培養した。2日間に1回の頻度で継代を行うが、週末など培養期間が3日間になる場合は、細胞数を10万個に減らした。
(3)マウスES細胞あるいはマウス3T3細胞を用いた細胞毒性試験
維持培養中の各細胞を0.25%トリプシン/0.53mM EDTAを用いて細胞を分散させた後、96ウェルプレートに1well当り20,000個/mLの細胞懸濁液を50μL播種した。約2時間後に表1の化学物質を様々な濃度に含有した150μLの培養液を添加し、実験を開始した。本実験で使用した培養液は、ES細胞はLIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地、3T3細胞は維持培養と同じ培地とした。培養開始から培地交換を1度も行わずに、4日後にCell Counting Kit 8(同仁化学)及びマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス社)を用いて対照及び化学物質添加群の細胞数(試薬の発光度して検出)を測定した。得られた結果から対照群の50%相当の細胞増殖度を示す化学物質濃度を算出した。
(4)マウスES細胞の心筋細胞への分化誘導試験
未分化で培養中のマウスES細胞を0.25%トリプシン/0.53mM EDTAを用いて細胞を分散させた。LIFを含まない15%の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、1滴(20μL)あたり約400個の細胞を含むように、直径10cmシャーレの蓋に懸滴培養(本培養方法をハンギングドロップ法とも呼ぶ)により37℃、5%COインキュベーター内で2〜3日間培養を行い、胚様体(embryoid body)を形成した。本培養から実験終了まで、化学物質添加群では、使用する各培地中の化合物濃度が同じになるように、各培地に表1の化学物質を加えた。胚様体は更に2〜3日間、非接着性6cmシャーレ(グライナー社)で浮遊培養した後、懸滴培養開始から合計5日後に胚様体を接着系の24ウェルプレートに1個ずつ計24個移行した。そして、懸滴培養開始から合計12日後に、収縮を繰り返す心筋細胞を顕微鏡下で確認した。通常、対照群は接着させた24個全てに収縮が認められることから、対照群の50%相当の心筋分化度、すなわち24個中12個に収縮がみられる化学物質濃度を算出した。
(5)予測式を用いた判定
細胞毒性試験で得られた2つの指標(ES IC50、3T3 IC50)及び心筋細胞への分化誘導実験で得られた指標(ES ID50)から、
ES ID50、3T3 IC50、およびES IC50
条件式1:ES IC50または3T3 IC50≦k1(k1は定数を表す)を満たす場合、または
条件式2:ES ID50/3T3 IC50≦k2(k2は定数を表す)を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断した。
その結果、催奇形性を有する化合物と催奇形性を有さない化合物とを含む10化合物の全てについて、催奇形性の予測結果と、催奇形性に関する動物実験の公知の知見とが一致した(表1)。
なお、n=1の結果ではあるが、非特許文献1の方法に従って本発明者が試験を行ったところでは、表中の10化合物のうち、ペニシリンG ナトリウム、D-(+)-カンフル、フタル酸ジメチル、メトトレキサート水和物、ホウ酸においては、催奇形性の予測結果と、催奇形性に関する動物実験の公知の知見とが一致しなかった。
【表1】

各指標は2回あるいは3回の平均値。ES IC50(n=3)、3T3 IC50(n=3)、ES ID50(n=2)
【産業上の利用可能性】
【0029】
本発明の方法は、農薬及び医薬の候補化合物等の化学物質の催奇形性の予測に利用することが出来る。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、
(1)下記にそれぞれ定義される、阻害活性SD、阻害活性DG、および必要に応じて阻害活性SGを測定する工程、
(2)前記阻害活性SGまたはDGを、予め設定された基準値と比較する工程、および
(3)前記阻害活性SDを、前記阻害活性DGと、比較する工程、
を有する方法。
前記阻害活性SDは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
前記阻害活性DGは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
前記阻害活性SGは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。
【請求項2】
前記哺乳動物が、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、およびウサギから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記分化細胞が、繊維芽細胞、神経細胞、羊膜細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞から選択される請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記阻害活性DGおよび阻害活性SGの測定が、
哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を用意すること、
前記哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を、それぞれ、化学物質の存在下、培養器内で細胞が飽和する前までの一定期間培養すること、
当該培養後の分化細胞および幹細胞の細胞数を、それぞれ、測定すること
を含む方法により行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
催奇形性を、陽性および陰性の2段階で判定する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記阻害活性SDが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を50%阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性DGが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性SGが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度である、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記阻害活性SDが、前記化学物質がマウスES細胞の心筋への分化を50%阻害する化学物質濃度ES ID50であり、
前記阻害活性DGが、前記化学物質がマウス3T3細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度3T3 IC50であり、および
前記阻害活性SGが、前記化学物質がマウスES細胞の細胞増殖を50%阻害する化学物質濃度ES IC50である、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項9】
SD、DG、およびSGが
条件式1:SGまたはDG≦k1(k1は定数を表す)を満たす場合、または
条件式2:SD/DG≦k2(k2は定数を表す)を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する、請求項7または8に記載の方法。
【請求項10】
k1が0.01〜1μg/mLであり、および
k2が0.9〜1.1である、
請求項9に記載の方法。
【請求項11】
k1が0.1μg/mLであり、および
k2が1.0である、
請求項9に記載の方法。