光学式赤血球および白血球の弁別
【課題】光学式赤血球および白血球の弁別分析をすること。
【解決手段】試料における哺乳類赤血球の容積、ヘモグロビン濃度、成熟度、および赤血球形状を決定し、同時にシステム標準化をモニタするための方法および装置が開示される。
【解決手段】試料における哺乳類赤血球の容積、ヘモグロビン濃度、成熟度、および赤血球形状を決定し、同時にシステム標準化をモニタするための方法および装置が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の概要）
試料中の哺乳類の赤血球の容積、ヘモグロビン濃度、成熟度、および赤血球形状を決定し、同時にシステム標準化をモニタするための方法および装置が開示される。赤血球分析の前に、赤血球を他の細胞粒子から区別するための方法も開示される。方法は、広範囲の可視スペクトルに対して正確に適用することができる。全血試料は、中性ｐＨの等張緩衝溶液に非イオン性界面活性剤を含む試薬溶液で処理され、赤血球は、選択された波長で単一ファイルにおける光のビームを通過し、１つの光損失信号、選択された角度間隔での１つの前方角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさによって、あるいは、選択された角度間隔での２つの前方角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさによって、初期的なサイトグラムを獲得し、容積およびヘモグロビン濃度のグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、１点ずつサイトグラムを投影し、三次元グリッド表面への各投影された交差（インターセプト）の場所によって、赤血球容積およびヘモグロビン濃度の正確な値を決定する。
【０００２】
本発明は、体液における哺乳類の赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の弁別の自動分析とシステム標準化の同時モニタとの方法および装置に関する。本発明は、特に、同一の光学式検出装置を使用してＲＢＣおよびＷＢＣの両方の弁別分析を行うことができる、マルチパラメータヘマトロジーアナライザーまたはフローサイトメータ等の多角光散乱および蛍光装置に関する。本発明は、より詳細には、（ｉ）全血中における容積、ヘモグロビン含有量、細胞形状、および成熟度に関してＲＢＣを分析するための方法、（ｉｉ）未熟ＲＢＣ（網状赤血球）容積およびヘモグロビン含有量を決定するための正確な方法、（ｉｉｉ）ＲＢＣ弁別のために血液試料が分析されている間に、システム標準化を継続してモニタすることができるＲＢＣ方法、（ｉｖ）１つの試薬を使用して、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方の容積およびヘモグロビン含有量を測定することができる方法、および（ｖ）同一の光学式検出システムを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣの両方の弁別分析を行うことができる装置とに関する。
【背景技術】
【０００３】
従来のヘマトロジー方法、すなわち、細胞サイズ、細胞形状、色（ヘモグロビン含有量用）、および封入体に関するＲＢＣ形態学に関する患者血液塗抹標本の顕微鏡的検査は、診断へ導きかつ患者の臨床状態をモニタする豊富な情報を提供する。しかし、この手動方法は、非常に主観的であり、かつ時間がかかるものであるという事実に加えて、標準以下の血液フィルムから、きわめて誤解を招く恐れのある印象を引く可能性がある。過去３０年の間に、大量の実験室作業量を取り扱いかつ労力を減少する、多数の自動ヘマトロジーアナライザーが利用可能になっている。これらの機器の大半は、電気インピーダンス測定によるか、または比色分析ヘモグロビン測定と組み合わされた光散乱光学式測定によって、赤血球の平均血球容積（ＭＣＶ）および平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を測定する。これらのシステムからの細胞分析における形態学的情報の不完全性またはあいまい性から、ヘマトロジー実験室における５から１０パーセントの試料は、日常的に、顕微鏡的方法を使用して細胞形態学に関する塗抹標本検査を受ける。ＲＢＣ形態学的分析の点におけるより進歩したヘマトロジーアナライザーは、テクニコンＨ＊１（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｈ＊１）およびバイエルアドヴィア（Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ）である。両システムは、米国特許第４，７３５，５０４号に記載されたＤ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏの教示にしたがって、細胞１つずつに基づいて同時に赤血球の容積およびヘモグロビン濃度を測定するように構成されている。
【０００４】
Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏに付与された米国特許第４，７３５，５０４号には、粒子の容積および屈折率を決定するための方法および装置が記載されている。ＶおよびＨＣを測定するための方法は、２つの選択された角度間隔の前方光散乱信号Ｓ１およびＳ２による卵形（ｏｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）形状のＲＢＣであり、容積（Ｖ）およびヘモグロビン濃度（ＨＣ）を決定することが開示されている。この方法の欠点は、下記の通りである。１）ＲＢＣからのヘモグロビン吸収を避けるために、光源の波長が十分長くなければならず（たとえば６３３ｎｍ）、これによって、マルチパラメータ血液細胞分析用のより適切な光源（たとえば４８８ｎｍ光源）を選択することができない。２）二次元（２Ｄ）マトリクスは、異常な細胞形状に関するいずれの情報を提供しないが、それは、そのような細胞からの信号は、所定の二次元マトリクスでは誤った場所に入り、したがって、Ｖ＆ＨＣに関する不正確な臨床データを生成するからである。３）二次元マトリクスは、システム標準化におけるシフトに関するいずれの情報を提供せず、これは、一定の血液試料における凝血塊によって生じる流体素子工学的な通過における不安定性、またはシステムの電子工学における不安定性のため、いずれも警告無しで発生する可能性のある現象である。４）二次元散乱方法は、ＷＢＣおよび有核赤血球（ＮＲＢＣ）を、成熟ＲＢＣまたは染色された網状赤血球から識別してはっきりと分離することができない。ＷＢＣおよびＮＲＢＣは、その核のため、赤血球よりもかなり多くの散乱を生成し、ＶおよびＨＣ分析の前に、ＲＢＣ母集団からはっきりと除外されるのでなければ、ＭＣＶ、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ＭＣＨＣ、および平均血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）に関する臨床結果は、上昇ＷＢＣまたはＮＲＢＣ試料では非常に誤解を招きやすい。
【０００５】
Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏに付与された米国特許第５，１９４，９０９号には、赤血球のＶおよびＨＣを測定するための方法および装置が教示されている。この技術と米国特許第４，７３５，５０４号における先の教示との相違は、長い波長（６３３ｎｍ）での１つの前方光散乱信号（予め選択される）と、抵抗パルスサイジング開口部からの第２の信号とを使用して、二次元マトリクスが形成されることである。この方法の欠点は下記の通りである。１）方法は、検出システムの２つの独立した源を必要とし、これは、２つの異なる検出システムからの２つの信号の同期等の不必要な複雑な状態を生み出す。２）ＲＢＣからのヘモグロビン吸収を避けるために、光源の波長が十分長くなければならず、これは、マルチパラメータ血液細胞分析用の光源の選択を限定する。３）二次元マトリクスは、異常な形状のＲＢＣに関するいずれの情報を提供せず、したがって、Ｖ＆ＨＣに関する不正確な臨床データを生成する。４）二次元マトリクスは、システム標準化におけるシフトに関するいずれの情報を提供せず、これは上記に説明されたように、電子工学または流体素子工学における不安定性のため、いずれも警告無しで発生する可能性のある現象である。
【０００６】
Ｆａｎらへ付与された米国特許第５，２８４，７７１号には、試薬組成物および細胞球形化におけるその使用が開示されている。試薬組成物は、向きによるノイズを排除するために赤血球を球形づけるための両性イオン界面活性剤と、網状赤血球を染色するためのＯｚｘａｚｉｎｅ７５０とを含む。光学式検出システムの光源は６３３ｎｍヘリウムネオンレーザであり、染色された網状赤血球は、光散乱／吸収技術によって識別される。網状赤血球の蛍光測定は、この特許では例示されていないか、または請求されていなかった。この開示の発明者らは、網状赤血球のＶ＆ＨＣの測定に関しては請求していなかったが、テクニコンＨ＊１システムを使用して細胞１つずつに基づいて、赤血球の容積およびヘモグロビンを同時に測定する上述のＴｙｃｋｏの方法の使用を記載した。Ｆａｎらの教示において、網状赤血球の染色手順は、手動調製、手動供給、および２分以上の染色時間を必要とする。発明者らは、ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣは、Ｔｙｃｋｏの方法によって測定されるが、ＲＢＣおよび網状赤血球に使用される試薬は、組成が完全に異なると記載した。テクニコンＨ＊１のＲＢＣに関するＴｙｃｋｏの二次元マトリクスを作るために使用される試薬は、Ｔｙｃｋｏの開示に記載されるように、ＲＢＣを球形にして固定し、一方、網状赤血球に関して使用される試薬は、いずれの固定剤を含まない緩衝液内でＲＢＣを球形にする。その上、網状赤血球を染色するのに使用される青染料による吸収は、染色された細胞のＶ＆ＨＣの測定における散乱信号の大きさに干渉する。上述の問題は、Ｆａｎらの教示による網状赤血球のＶ＆ＨＣに関する誤った臨床データへ導く可能性がある。上述のように、Ｖ＆ＨＣ測定に関するＴｙｃｋｏの方法は、ヘモグロビンが非常に透明である領域では単色光を発する光源を必要とする。これは、光源の利用可能性を制限する（λｍａｘは、６００ｎｍより大きくなければならない、赤ヘリウムネオンレーザ等）。別の制限は、吸収のためにまたは蛍光放射のために染料を励起するために、同一波長を使用しなければならないため、利用可能な染料の選択である。この条件下で、染料は、赤光を強力に吸収する青染料でなければならない。この特許では、網状赤血球のＶ＆ＨＣの測定に関しては、何の請求もされなかった。
【０００７】
Ｃｏｌｌｅｌａらに付与された米国特許第５，３５０，６９５号には、疑似吸収に関して測定された吸収信号を調整する方法が加えられていることを除いて、米国特許第５，２８４，７７１号で先に開示されたものと同一の網状赤血球を特徴づけるための方法および試薬が開示されている。この開示の第１２欄、第１段落の記載によると、米国特許第５，２８４，７７１号に開示された方法の主要な問題は、テクニコンＨ＊１機器の吸収信号が、吸収プリアンプのノイズと同一レベルであるということである。したがって、染色された網状赤血球からの吸収信号の信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比を改良するために、数学的モデルを展開しなければならなかった。この特許に開示された数学的訂正を備えてさえ、染色された網状赤血球から吸収信号の満足のいくＳ／Ｎ比を生成することは、この方法の主要な問題であると思われる。その上、光吸収も、粒子の光散乱の大きさに干渉する。
【０００８】
Ｆａｎらへ付与された米国特許第５，３６０，７３９号には、青の励起可能な蛍光染料、すなわちアクリジンオレンジが含まれることを除き、先の４つの特許に開示されたような方法および試薬が開示されている。この方法の教示を実行するために、２つの光源を必要とする。一方の光源は、青の励起可能な蛍光測定用（アルゴン／イオンレーザ）であり、他方の光源は、細胞の容積およびヘモグロビンの測定用（ヘリウムネオンレーザ）である。この方法の欠点は、同期および標準化のために検出システムが不必要に複雑になることであり、機器製造コストが非常に上昇する。
【０００９】
Ｃｏｌｌｅｌａらに付与された米国特許第５，４３８，００３号には、全血における網状赤血球の識別および特徴づけに使用するために、先の４つの特許に示されたものと同一の試薬組成物が開示されている。この特許のすべての請求項は試薬組成物に関しており、網状赤血球のＶ＆ＨＣの測定の方法に関する請求はなされていない。しかし、ヘリウムネオン（６３３ｎｍ）光源を使用する光散乱／吸収によって、成熟ＲＢＣから網状赤血球を分離するにあたり、開示された方法では「疑似吸収」およびヘモグロビン干渉をどのように訂正しているかを、本文内で新規に非常に長く説明している。結果として、米国特許第５，４３８，００３号に示されたサイトグラムは、成熟ＲＢＣ信号から不十分に分離された網状赤血球信号を明らかにしている。開示された光散乱／吸収方法によって、成熟ＲＢＣから母集団がよく分離されない限り、網状赤血球のＶ＆ＨＣを正確に測定することは非常に困難である。さらに、この開示の例は、開示された方法が、Ｖ＆ＨＣの測定に関する二次元マップを作るのに使用される試薬とは、ｐＨ、浸透圧、球形剤、および緩衝液がまったく異なる、２つの試薬を必要とすることを明らかにしている。加えて、Ｈ＊１ＲＢＣ方法は、非常に短いインキュベーション時間を有し、一方、開示された試薬における網状赤血球の染色時間は２分である（３０秒対１２０秒）。ＲＢＣ球形づけプロセスは、非常に敏感な可逆的なプロセスであり、２つの選択された光散乱信号に基づいて、一貫して再現可能なＶ＆ＨＣデータを得るために、正確なタイミングを必要とする。Ｃｏｌｌｅｌａらは、Ｖ＆ＨＣに関するいずれの時間検査データを開示していないし、この特許ではいずれの網状赤血球のＶ＆ＨＣデータも開示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
先行技術のこれらの態様を考慮すると、完全なＲＢＣ弁別分析、およびより正確な網状赤血球計数、およびＶ＆ＨＣ測定のための、改良された方法および装置を提供することが望ましい。本発明の目的は、単一の光源および光学式検出システムを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣの両方の弁別分析を行うことができる装置を提供することである。本発明の別の目的は、細胞１つずつに基づいた臨床的に有用なＭＣＨＣ測定、および異常な形状のＲＢＣの検出および定量化を含む、より完全なＲＢＣ弁別分析を提供することである。本発明のさらに別の目的は、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣ測定のために使用することができる、単一の網状赤血球試薬を提供することである。本発明のさらなる目的は、非常に狭い範囲内に光源の選択を限定しない方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、システムの安定を継続してモニタするためのＲＢＣ／弁別方法を提供することである。本発明のこれらの目的およびさらなる目的は、下記の説明および図面から当業者には明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（１）多角光散乱および蛍光ヘマトロジーアナライザーまたはフローサイトメータでＲＢＣ弁別を自動分析し、システム標準化を同時にモニタするための方法および装置に関し、（２）同一の光源および同一の光学式検出システムを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣの両方の弁別分析を行うことができる装置に関し、（３）特に、全血または体液における、容積、ヘモグロビン含有量、細胞形状、および成熟度に関してＲＢＣを分析するための方法に関し、（４）幼児および血液透析患者における鉄欠乏性貧血の診断に有用な、網状赤血球（未熟ＲＢＣ）のＶ＆ＨＣを決定するための正確な方法に関し、（５）血液試料が分析されている間に、システム標準化を継続してモニタすることができるＲＢＣ方法に関し、特徴は、システムドリフトによって生じる誤った臨床データを報告する可能性を排除する。上記目的は、内蔵測定装置として明確な予め較正された三次元（３Ｄ）表面を使用して達成され、三次元表面は、理論的データ、および多角光散乱および／または光損失測定によって生成される実際のデータ（事象）の両方を使用して形成される。正常なＲＢＣの各事象は、したがって、このごく薄い三次元表面に入らなければならない。細胞特徴の大半が、表面より下または上にあり、別の層を形成する場合には、電子工学的または流体素子工学的なシフトのいずれかのため、対象のチャネルが標準外であることが指摘される。３つまたはそれ以上の光散乱および／または光損失信号の多次元分析は、ある程度の内部一貫性を提供する。異常な形状のＲＢＣは、表面からもっとも近い各事象の距離によって規定されるが、それは、すべての正常なＲＢＣ信号（ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００希釈剤シースで球形づけられる）が、表面に近接するからである。網状赤血球は、ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００網状赤血球試薬における核酸ステインで処理された各事象の蛍光強度によって規定される。細胞のＶ＆ＨＣは、ＡＬＬ／ＩＡＳ’／ＰＳＳ、またはＩＡＳ／ＩＡＳ’／ＰＳＳによって形成された、三次元マトリクスにおける各事象の場所に基づいて決定される。上記目的を達成するために、ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００デテクタは、３つのゾーンを形成するように修正された。中心矩形ゾーン（ゾーン１）は、軸方向光損失（０度、ＡＬＬ）用であり、２．２４度から７．４５度（ＩＡＳ）である現在のＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００中間角度（ゾーン２）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５度から５．５度（ＩＡＳ’）である。修正されたデテクタは、本開示では３リングデテクタと称される。三次元表面は、前述の３リングデテクタによって生成された２つの角度（ＡＬＬおよびＩＡＳ’、またはＩＡＳおよびＩＡＳ’）、および９０度偏光側方散乱（ＰＳＳ）信号を使用して作られる。三次元の原則は、広い範囲の光源波長（たとえば、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、または６３３ｎｍ）を備えた光学式検出システムに適用可能である。
【００１２】
本発明およびその利点をより完全に理解するために、添付の図面とともに取られた下記の説明が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
Ａ）装置
開示された装置の１つの実施態様は、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＦＯＲ ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ ＡＵＯＭＡＴＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ）」に開示された、修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ヘマトロジーアナライザーである。本発明の開示された方法を行うために、ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００システムデテクタおよびプリアンプボードは修正された。修正されたデテクタを示す図が、図１Ａに表される。３つのゾーン（３リング）が形成される。中心矩形ゾーン（ゾーン１）は軸方向光損失（０度、ＡＬＬ）用であり、中間ゾーン（ゾーン２、２．２４から７．４５度、ＩＡＳ）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５から５．５度（ＩＡＳ’）である。ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００プリアンプボードも、図１Ｂに例示されるように修正された。修正されたプリアンプボードは、すべての３つのリングから信号を電気的に加算することによってＩＡＳ出力を形成する。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ＡＬＬおよびＩＡＳであるか、またはＩＡＳ’およびＩＡＳである（または配線し直すならば、ＡＬＬおよびＩＡＳ’である）。ＡＬＬチャネルのゲインが４に設定されるのであれば、ＩＡＳ’は、ＡＬＬの代わりに、出力へルートづけられる。ＩＡＳ’ゲインは、オンボードデュアルインラインパッケージ（ＤＩＰ）スイッチによって設定される。ＡＬＬおよびＩＡＳは、ＷＢＣ／弁別のために使用され、ＡＬＬおよびＩＡＳ’の組み合わせ、またはＩＡＳ’およびＩＡＳの組み合わせのいずれかが、ＲＢＣ／弁別のために使用される。三次元ＲＢＣ／弁別分析ために使用される第３の角度が、側方散乱信号であり、これは、１２５度円錐から構成される。これは、本質的にレーザ光の垂直偏光を保存するため、側方偏光散乱（ＰＳＳ）と呼ばれる。１２５度全角度円錐の同一側方収集システムも、米国特許第５，６９１，２０４号に開示された試薬のＲＮＡステインによって染色された網状赤血球の蛍光信号を収集する。この特徴は、単一の試薬および単一の光源から、網状赤血球の識別を可能にし、且つ成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣ測定を可能にするものであり、これは、本発明の独特な特徴である。
【００１４】
Ｂ）方法および試薬
ＷＢＣ／弁別試薬
ＷＢＣ弁別分析およびＮＲＢＣ定量化に使用されるＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＷＢＣ試薬の組成物は、米国特許第５，５１６，６９５号に開示されており、ＮＲＢＣ分析の方法は、米国特許第５，５５９，０３７号に開示されている。
【００１５】
ＲＢＣ／弁別試薬
ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００希釈剤シースの組成物は、米国特許第５，６５６，４９９号に開示されており、ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００網状赤血球試薬組成物および方法は、米国特許第５，６９１，２０４号に開示されている。希釈剤シースおよび網状赤血球試薬の両方は、システムに予め存在する流体素子工学構成のため、開示された方法をＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００システムで行うためのものであるが、２つの試薬を１つの試薬に化合して、開示された方法を行うことができる。
【００１６】
方法
開示されたＲＢＣ弁別分析を修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００で行うために、３６．１μｌの全血試料が、試料吸引プローブによって、約１０．５１３μｌの希釈剤シースを含んでいるＲＢＣカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、シース状インピーダンス開口部へ運ばれ、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置」に記載されるように、試料の絶対ＲＢＣ計数を電気的に決定する。次いで、約４５０μｌの希釈された試料が、４５０μｌの網状赤血球試薬を含んでいる網状赤血球カップ内に移され、ここで混合され、網状赤血球は染色される。次いで、準備された試料は、検出のために、シース状光学式フローセルへ運ばれる。細胞のストリームは、シースによって囲まれた層流の流体力学的に集束された試料ストリーム内で、本質的に一度に１細胞ずつ、フローセルを通って流れる。フロー軸に垂直な光のビームが、ストリームを照射する。照射された容積における細胞からの光散乱信号は、開示された３リングデテクタ（ＩＡＳおよびＩＡＳ’）によって、および偏光側方散乱（ＰＳＳ）および緑蛍光（ＦＬ１）を検出する２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出される。これらのパルスの振幅は、デジタル化され、リストモードデータとして保管される。本実施態様において、約２０，０００細胞が８秒間に計数される。
【００１７】
ＲＢＣ分析
第１に、図６Ａに示されるＦＬ１対ＩＡＳサイトグラムにおいてＲＢＣの左側に表れる信号は、血小板として識別される。第２のステップは、ＷＢＣおよびＮＲＢＣ（もしあれば）を識別しラベルづけることであり、それらの信号は、ＦＬ１対ＩＡＳサイトグラムにおいてＲＢＣより上に表れる。ＦＬ１ヒストグラム（図６Ｂ）をスキャンして、サイトグラムにおけるＲＢＣゲートの上部縁を決定する。ゲート内の事象は、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球である。
【００１８】
網状赤血球検出
本発明の方法は、十分に高いＳ／Ｎ比（染色された網状赤血球対染色されていない成熟ＲＢＣ）を有するため、信号を分離するために数学的訂正は必要ない。先の開示（米国特許第５，６９１，２０４号）に記載されるように、ゲート内のＲＢＣ母集団のＦＬ１ヒストグラムは、成熟ＲＢＣのピークに関してスキャンされ、このピークと第２のピーク（網状赤血球ピーク）との間の谷か、または傾斜の減少（網状赤血球「先端」）か、のいずれかに関してより高いＦＬ１値でスキャンされ、そこで、網状赤血球を成熟赤血球から分離するために線が引かれる。この線より上の細胞は、網状赤血球とラベルづけられ、網状赤血球のパーセント（％Ｒ）は、合計ＲＢＣ母集団の一部として決定され、ＲＢＣインピーダンス測定から決定されるように、この％Ｒに試料中のＲＢＣの絶対濃度を掛けて、網状赤血球の絶対濃度を得る。
【００１９】
ＲＢＣ／弁別分析
ゲートされたＲＢＣの３つの散乱信号が分析され、標準化三次元表面に表示される。三次元表面構造の詳細は、下記に説明される。
【００２０】
ＲＢＣ／弁別分析に関するシステムゲイン確立
最初に、ＭＣＶおよびＭＣＨＣに関する知られている参照値を備えた１セットの正常血液を、二重に流す。全読取値のＭＣＶおよびＭＣＨＣの総平均が計算される。次いで、９０ｆＬ（正規化された）のＭＣＶおよび３４（正規化された）のＭＣＨＣ’を備えたＲＢＣ母集団の平均散乱信号が、チャネル１２５＋／−３、すなわち各スケールの中心（ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００は、全散乱チャネルに関する２５６チャネルリニアスケールを有する）になるように、各散乱チャネル（ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＩＡＳ’またはＡＬＬ）に関するゲインが調整される。あるいは、適切な屈折率を有する安定したビーズか、または安定したヒトＲＢＣが、標準化されたシステムの各散乱チャネル数の平均でラベル値割り当てされ、標準粒子として使用されることが可能である。
【００２１】
三次元表面構造
第１のステップとして、三次元マップの理論的モデルが、ミー散乱理論に基づいて構成される。知られているＭＣＶおよびＭＣＨＣを備えた赤血球の散乱信号を、完全に表面に適合させるために微調整が行われる（これは、吸収のため、４８８ｎｍでヘモグロビン溶液の屈折率を正確に測定することが困難であるため、誤りが発生する可能性があるからである）。ミー散乱理論は、垂直に照射された均質な球形に関するマクスウェルの方程式の解法に基づいている。理論は、一定の屈折率を有する球形によって散乱される強度の計算方法を提供する（Ｋｅｒｋｅｒ、Ｂｏｈｒｅｎ、およびＨｕｆｆｍａｎ）。理論は、下記の入力パラメータを必要とする。
ａ）球形の屈折率。これは、球形が吸収するときに、複素数である。
ｂ）媒体の屈折率（媒体は、光を吸収してはならない）。
ｃ）照射に使用される光の波長および偏光。
ｄ）容積から計算することができる球形の直径。
【００２２】
モデルの仮定の１つは、球形は、固定された強度で照射されるということである。この近似は、球形を照射するビームの直径が、球形の直径よりも大きい（およそ１０倍）場合に有効である。ＲＢＣのために行われる基本的な仮定は、ＲＢＣが球形であり、均質であるということである。これは、細胞の屈折率が、細胞のいずれの場所でも同一であることを意味する。ミー散乱理論アルゴリズムは、均一電磁場におけるマクスウェルの方程式の数値解法に基づいている。
【００２３】
ミー理論アルゴリズムは、強度分布に角度シータを与えるだけである。これは、ビームが伝播する方向と観察の方向との間の角度である。これは、散乱強度プロファイルが前方方向で対称的であることを意味する。入射直線偏光に関する異なる角度によって収集される強度を計算するために使用される式は、式１によって与えられる。
【数１】
ここで、ｉ１＝｜Ｓ１（θ）｜２
ｉ２＝｜Ｓ２（θ）｜２
Ｉ＝強度（相対数）
λ＝波長（真空）
θ＝レーザ方向と観察の方向との間の角度
φ＝レーザ偏光と観察の方向との間の角度
ｉ１、ｉ２＝２つの異なる偏光方向の強度
である。
【００２４】
関数Ｓｉ（θ）は、プログラムによって計算される。プログラムは、すべてに、０．３度で分離された角度で、０度から１８０度の間でこの関数の値を与える。各角度で、この角度の値は、絶対値の平方によって得られる。角度φは、偏光ベクトルと観察の方向との間の角度である。ＣＤ４０００において、偏光方向は垂直軸である。したがって、関数Ｉ（θ，φ）は、細胞のまわりのすべての場所に散乱光の強度を提供する。前方ＩＡＳデテクタによって収集される光の量を得るために、強度プロファイルは、収集された角度に対して積分することができる。プログラムに使用される積分の数値方法は、トラペジウム方法である。φは２πに対して積分されるため、前方角度における散乱に関する式は下記のようになる。
【数２】
ＡＬＬデテクタからの信号は、細胞がレーザビームを通過するときの最大強度低下に等しい。ＡＬＬ信号は、合計光損失である。これは、散乱吸光係数とも呼ばれ、ＢｏｈｒｅｎおよびＨｕｆｆｍａｎによって開発されたアルゴリズムによって計算することができる。
【００２５】
デテクタが、各水平角度シータに関して異なる垂直角度ファイを収集する以外は、ＰＳＳ信号の計算は簡単ではある。各水平角度φに関して、垂直角度φに関する積分が行われなければならない。この積分は正確であり、そのため近似を行う必要はない。各角度θは、円錐の形状に関連する自己の最小および最大φを有し、これは、ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００の場合には円である。ｓｉｎ２（φ）の積分の解法は、式３によって与えられる。
【数３】
この式の中で角度φは半径方向に与えられ、上記公式の角度φよりも小さいπ／４である。これは、ファイが、９０度プラスマイナスφｍａｘ（垂直収集角度）だからである。ｃｏｓ２（φ）の解法も同様であり、第２項の符号のみが異なる。各角度θに関して、垂直方向に収集される強度を計算することができる。水平最小および最大角度θに対する積分後に、ＰＳＳの値が得られる。
【００２６】
前方散乱角度の選択
ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００前方散乱角度デテクタ（空中でＩＡＳ３度から１０度）は、容積に対して不感受性である。理論は、収集角度が懸濁媒体内で規定されなければならないことを必要とする。媒体（ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００希釈剤シース）の屈折率は、λ２５℃ｍａｘ４８８ｎｍで１．３３９である。したがって、スネルの法則によって、希釈剤の収集角度は２．２４から７．４５である。図２Ａおよび図２Ｂは、希釈剤における相対弁別クロス散乱対角度を表示する。弁別クロス散乱は、式２の積分より下の部分未満のものはない。
【００２７】
曲線より下の区域は、容積（Ｖ）およびヘモグロビン濃度（ＨＣ）の相対強度を表す。３３（ｇ／ｄＬ）のＨＣで異なるＶに関する曲線より下の区域は、２．２４度から７．４５度の間であまり変化しないが、これは、曲線が、４度より下では容積が高くなるにつれて下がり、４度より上では容積とともに上がるからである。最小ヘモグロビン干渉を有する容積を測定することができるために、４．５度から５．５度の間の角度が選択される。上記図２Ａおよび図２Ｂ参照。
【００２８】
異なる角度における測定は、修正された３リングデテクタを使用して達成される。デテクタは、２．２４度から４．５度の角度をカバーする１つの内側リングと、４．５度から５．５度（ＩＡＳ’）の角度をカバーする第２のリングと、５．５度から７．４５度の角度をカバーする第３のリングとを有するように構成される。３つのリングは一緒に、ＷＢＣ弁別分析に使用される現在のＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＩＡＳデテクタによって収集される角度を依然として与える。第２のリングのみから信号を収集することが可能であり、これは、４．５度から５．５度の間である。新しい角度と古い角度とを同時に使用することも可能である。この解決方法は、ＷＢＣ／弁別およびＲＢＣ／弁別分析用に、２つの別個の光学式検出システムが使用される先行技術に対して利点を有する。本発明は、ＷＢＣ／弁別およびＲＢＣ／弁別分析の両方に同時に同一の光学式検出システムを使用することを可能にする。この解決方法は、角度の異なるセットで散乱光を収集する様々な可能性を生み出す。
【００２９】
三次元（３Ｄ）細胞分析
ＲＢＣが完全な球形であると仮定すると、３つの散乱信号、ＩＡＳ、ＩＡＳ’、およびＰＰＳ（またはＡＬＬ、ＩＡＳ’、およびＰＰＳ）は、主に、２つのＲＢＣパラメータすなわちＶおよびＨＣに応じる。すべての可能なＶおよびＨＣの組み合わせが一緒に、空間に表面を形成する。空間におけるＩＡＳ’、ＡＬＬ、およびＰＰＳの表面の簡略にされた説明が、図３に示される。単一細胞のＶおよびＨＣがどのように得られるかという原則を説明するために、三次元における表面の小さな部分のみが表示される。表面は実際には湾曲しているが、表面は平面であると仮定する。しかし、単一のＲＢＣのＶおよびＨＣを見出すために、同一の原則を表面に適用することができる。システムが完全に標準化されるときには、すべての球形ＲＢＣは、表面のまわりに非常に近接して分布される。鎌状細胞等の異常な形状のＲＢＣは、表面からより離れている信号を生成する。このようにして、異常な細胞形状を識別するのに、ＲＢＣ信号の表面からの距離を使用することができる。
【００３０】
正確には表面上にない細胞のＶおよびＨＣ情報を見出す方法は、図３の細胞Ｍを使用して、下記に説明される。この細胞のＶおよびＨＣをもっとも表す可能性がある表面上の点は、表面上のもっとも近接した点である。実際には現実の表面はないが、三次元における所与のＶおよびＨＣ値を備えた知られている点のセットの位置がある。図３の等Ｖ線および等ＨＣ線の交差は、これらの点を表す。正確にはこの表面にはない点のＶおよびＨＣ値を得るために、この表面上のもっとも近接した３点が見出される。この場合、３つのもっとも近接した点は、１、２、および３である。１から２へのベクトルおよび１から３へのベクトルは、法線を計算することができる表面の小さな部分を規定する。点Ｍを通って法線に平行なベクトルの表面との交差を計算して、点Ｉが見出される。点Ｉは、表面上の細胞の投影を表す。交差が見出されると、ベクトルａおよびｂを計算することができる。ａおよびｂの長さを使用して、３点の値の間を補間し、細胞（点Ｍ）のＶおよびＨＣを得ることができる。ＩＡＳ方向のみにおける表面への距離のすべての細胞のヒストグラムを作ることによって、表面がＩＡＳ信号に関して正しい場所にあるか否かを見ることができる。表面がＩＡＳ信号に関して正しく設定される場合には、ヒストグラムのピークはチャネルゼロである。これは、同一数の細胞が表面の両側にあることを意味する。同一のことがＡＬＬおよびＰＰＳ信号に当てはまる。下記に示されるように、３つの信号方向における表面への距離に関する３つのヒストグラムが、正しい表面を見出すために有用なツールであることが判明した。
【００３１】
三次元表面を見出す
ミー散乱理論は、知られている屈折率を有する完全球形からの信号を予測する。屈折率およびＶの範囲に関する信号を計算することによって、表面上の点を見出すことができる。ミー理論は、信号強度の相対数のみを提供する。したがって、信号の三次元の正確なチャネル数は、これらを表面に正確に配置するために、ゲイン係数を掛けることによって計算されなければならない。これらの係数を見出すのを可能にするために、屈折率がヒト赤血球ＭＣＨＣの臨床範囲内に入る３つの異なる炭化水素（ヘプタン、ノナン、およびドデカン）が使用された。３つの炭化水素の各々は、懸濁媒体内で強く混合されるときには、同一の屈折率を有する様々なサイズの滴を生成する。これらの３つのオイルの各々は、屈折率が異なるため（炭化水素は吸収がない）、互いに異なる、明確なＶ信号分布トラックを作る。次に、ミー理論によって作られる表面の正確度は、表面上のもっとも近接した点への実際の信号の距離を測定することによってチェックされる。たとえば、表面が３つの炭化水素によって生成される信号へ完全に適合するのであれば、３つのヒストグラムのピークの表面への距離はゼロである。
【００３２】
血液試料に関する表面を作ることは、４８８ｎｍでのヘモグロビンによる光吸収のため、より複雑である。吸収を訂正するために、炭化水素に関する三次元表面を形成するために使用されるシミュレーションに吸光度が加えられなければならない。理論値をチャネル数へ転換するために３つの炭化水素に関して使用されるすべてのゲイン設定は、一定に保たれる。このようにして、すべての可能なＲＢＣ事象を規定する完全な表面が形成される。正常な試料のＲＢＣは、表面のまわりに正常に分布されなければならない。この表面は、機器の較正および標準化のための日常ＱＣチェックに関してさらに努力することなく、試料が分析されている間にシステム標準化をモニタするツールも提供する。各試料に関して、表面のまわりのＲＢＣの三次元ヒストグラムは、信号処理中に作られる。表面のまわりの正常なＲＢＣ分布が対称的ではない場合には、機器は標準化から外れる（たとえば、流体素子工学的なまたは電子工学的な問題）。
【００３３】
例示のために、ここに検討された好適な実施態様の多数の使用が示される。下記の検討は、例示的な目的のためのみに提供され、この検討は網羅的ではない。具体的に下記に検討されるのは、統合された血液細胞分析、ＷＢＣ弁別分析に使用されるのと同一の光学式検出システムを使用して、多角光散乱および蛍光ヘマトロジーアナライザーにおいて、容積、ヘモグロビン含有量、正常および異常な細胞形状、網状赤血球の容積、およびヘモグロビン含有量用のＲＢＣ弁別分析を行い、かつシステム標準化を同時にモニタするために開示された実施態様を使用する方法である。これは、請求される発明の範囲をいずれにも限定しない。
【００３４】
例１．
開示された装置は、修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００（ＣＤ４０００）システムである。ＣＤ４０００デテクタおよびプリアンプボードは、白血球弁別（ＷＢＣ／弁別）分析と赤血球弁別（ＲＢＣ／弁別）分析との両方に同一のデテクタを使用するために、修正される。修正されたデテクタを示す図は、図１Ａに見られる。３つのゾーンが形成される。中心矩形ゾーン（ゾーン１）は軸方向光損失（０度、ＡＬＬ）用である。中間ゾーン（ゾーン２、２．２４から７．４５度、ＩＡＳ）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５から５．５度（ＩＡＳ’）である。プリアンプボードは、図１Ｂに描かれるように修正された。修正されたプリアンプボードは、すべての３つのリングから信号を電気的に加算することによってＩＡＳ出力を形成する。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ＡＬＬおよびＩＡＳであるか、またはＩＡＳ’およびＩＡＳである（または配線し直すならば、ＡＬＬおよびＩＡＳ’である）。ＩＡＳ’ゲインは、オンボードデュアルインラインパッケージ（ＤＩＰ）スイッチによって設定される。ＡＬＬおよびＩＡＳは、ＷＢＣ弁別のために使用され、ＡＬＬおよびＩＡＳ’か、またはＩＡＳ’およびＩＡＳかの組み合わせのいずれかが、ＲＢＣ弁別分析のために使用される。三次元ＲＢＣ弁別分析ために使用される第３の角度は、９０度側方散乱である。
【００３５】
例２．
この実験のために、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置」に記載されたＣＤ４０００システムが、例１に記載されたように、３リングデテクタおよび新しいプリアンプボードを備えて修正された。約１１２．５μｌの正常全血試料が、試料吸引プローブによって、約１０．５１３μｌのＣＤ４０００希釈剤シースを含んでいるＲＢＣカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、シース状インピーダンス開口部へ運ばれ、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号に記載されるように、絶対ＲＢＣ計数を電気的に決定する。約４５０μｌの希釈された試料は、ＣＤ４０００網状赤血球カップ内に移され、このカップは約４５０μｌの網状赤血球試薬を含んでおり（米国特許第５，６９１，２０４号、１９９７年１１月２５日。「網状赤血球の迅速分析用の組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ）」）、混合される。次いで、準備された試料は、検出のために、シース状光学式フローセルへ運ばれる。ＷＢＣおよびＮＲＢＣは、ＲＢＣゲートによって排除され、網状赤血球は、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号に記載されるように、識別され定量化される。同時に、３つの散乱信号は、各事象に関しても測定され、標準三次元表面に表示される。図４Ａおよび図４Ｂは、三次元表面にきっちりと重なり合う正常血液の正面図および側面図を示す。完全に標準化され較正されたシステムで、図４Ｂに示されるように、約５０％の信号が表面より上になり、５０％が表面より下になる。
【００３６】
例３．
鎌状細胞を含む臨床血液試料が、例２に記載された開示された装置を流れた。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、試料の正面図および側面図を表示する。見ることができるように、異常な形状の鎌状細胞のため、細胞母集団はかなり分散しており、側面図は、信号が三次元表面から外れることを示す。各事象の表面からの距離に基づいて、本発明の方法は、異常な形状のＲＢＣのパーセントを概算することができる。同一試料のＴｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１）による先行技術の二次元分布は、図５Ｃに表示される。図５Ｃから見ることができるように、二次元分布は、異常な細胞形状を球形の正赤血球から区別しない。その上、異常な形状を有するＲＢＣの有意な数は、二次元マップから外れ、それによって容積測定から除外される。
【００３７】
例４．
高ＷＢＣ試料およびＷＢＣのＲＢＣゲートからの分離および除外のＣＤ４０００サイトグラム（ＦＬ１対ＩＡＳ）は、染色された網状赤血球および成熟ＲＢＣを含み、図６Ａに示される。図４Ａに示されるように、本発明の方法は、ＲＢＣ／弁別分析の前に、ＷＢＣをＲＢＣ母集団からはっきりと識別し排除する。ゲートされた母集団のＦＬ１ヒストグラムは、図６Ｂに示される。逆に、Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１）によって開示された先行技術は、ＷＢＣをＲＢＣ母集団からはっきりと区別しないかまたは分離しない（図６Ｃ参照、先行技術による同一試料のＲＢＣ分布）。したがって、先行技術の方法は、様々な白血病の患者、特に、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の患者からの上昇ＷＢＣ試料では、誤った赤血球ＭＣＶおよびＭＣＨＣ結果を生成する可能性があるが、それは、ＣＬＬのリンパ球が、ＲＢＣと同じほど小さいだけではなく、ＲＢＣと同じほど小さい光散乱を生成するには壊れ易いからである。
【００３８】
例５．
小赤血球（図７Ａ）、正赤血球（図７Ｂ）、および大赤血球（図７Ｃ）のＲＢＣ試料の細胞ヘモグロビン含有量（ＨＣ）対容積（Ｖ）の二変数分布が、本発明の方法によって分析された。２本の固定線が、正常範囲のまわりに垂直に且つ水平に引かれ、各試料におけるサイズおよびヘモグロビン含有量のＲＢＣ異常性の異なる組み合わせを識別し計数する。下記の表１ａ、１ｂ、および１ｃは、各カテゴリーの細胞の概算されたパーセンテージを示す。提供された情報に基づいて、患者の状態の赤血球不同症、小赤血球症、大赤血球症、血色素減少症、および血色素増加症の重大度レベルを決定することができる。
【表１ａ】
【表１ｂ】
【表１ｃ】
【００３９】
例６．
平均細胞容積（ＭＣＶ）の回帰統計およびプロット。図８Ａは、本発明対Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１）による先行技術の結果を表し、図８Ｂは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＶ結果（流体力学的に集束された細胞を使用した電気インピーダンス測定）の結果を表す。
【００４０】
例７．
ＭＣＨＣの回帰統計およびプロット。図９Ａは、本発明対Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１ＣＨＣＭ）による先行技術の結果を表示し、図９Ｂは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００ＭＣＨＣ（インピーダンスＭＣＶおよびヘモグロビンのＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００比色分析測定から計算された結果）の結果を表示する。
【００４１】
例８．
ＭＣＨの回帰統計およびプロット。図１０Ａは、本発明対Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１ＭＣＨ）による先行技術の結果であり、図１０Ｂは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＨ（インピーダンスＲＢＣ計数およびヘモグロビンの比色分析測定から計算された）の結果である。
【００４２】
例９．
開示された方法による正常および臨床試料のセットにおける平均網状赤血球容積（ＲＥＴＶ）と合計ＲＢＣＭＣＶとの比較が、図１１Ａに示され、開示された方法による正常および臨床試料の同一のセットにおける網状赤血球ＭＣＨＣ（ＲＥＴＨＣ）と合計ＲＢＣＭＣＨＣとの比較が、図１１Ｂに示される。
【００４３】
例１０．
約１．６７μＬの全血試料が、試料吸引プローブによって、約２８００μｌの上記例２に使用されたものと同一の希釈剤を含んでいるＲＢＣカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、アボットＣＥＬＬ ＤＹＮ３２００シース状光学式フローセルへ運ばれ、細胞１つずつの容積およびヘモグロビン測定に関する信号を収集する。アボットＣＥＬＬ ＤＹＮ３２００の光源は、５ｍワットヘリウムネオンレーザであり、そのデテクタは、１度から３度、および３度から１０度２つの前方光散乱信号、および９０度＋／−３０度の側方散乱信号を収集するように構成される。試料のＦＳＣファイルは較正された三次元表面で分析され、本発明の開示された方法を使用して、ヘリウムネオンシステムに関して作られる。１５７個の正常および臨床試料、および、浸透圧検査からの６６個の試料がシステムに流され、結果の比較は図１２Ａおよび図１２Ｂに示される。浸透圧実験は、血液を希釈するために使用される両方の試薬（ＣＥＬＬ ＤＹＮ３２００およびＨ＊１）の塩濃度を変えることによって行われた。検査された浸透圧範囲は、１７５ｍＯｓｍ／Ｌから５００ｍＯｓｍ／Ｌであった。
【００４４】
上記を考慮して、前述の記載から、先行技術に対して本発明の多くの利点が明らかである。一定の代表的な実施態様および詳細が、発明を例示する目的のために示されているが、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱せずに、様々な変更および修正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】白血球弁別（ＷＢＣ／弁別）分析と赤血球弁別（ＲＢＣ／弁別）との両方の分析に同一のデテクタを使用するために、修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００デテクタを示す図である。３つのゾーンが形成される。中心矩形ゾーン（ゾーン１：ＡＬＬ用に０度）は軸方向光損失用であり、中間ゾーン（ゾーン２：ＩＡＳ用に２．２４から７．４５度）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５から５．５度（ＩＡＳ’）である。
【図１Ｂ】ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００プリアンプボードの修正を示す。ＩＡＳ出力は、すべての３つのリングからの信号を電気的に加算することによって形成される。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ＡＬＬおよびＩＡＳであるか、またはＩＡＳ’およびＩＡＳである（または配線し直すならば、ＡＬＬおよびＩＡＳ’である）。ＷＢＣ弁別および三次元ＲＢＣ弁別の両方分析ために使用される第３の角度は、９０度偏光側方散乱である。
【図２Ａ】４８８ｎｍの波長での容積およびヘモグロビン濃度の異なる値に関する前方角度における弁別クロス散乱を例示する。
【図２Ｂ】４８８ｎｍの波長での容積およびヘモグロビン濃度の異なる値に関する前進角度における弁別クロス散乱を例示する。
【図３】細胞のＶ＆ＨＣデータがどのように三次元表面から得られるかの原則を説明するための三次元表面の小さな部分の例である。
【図４Ａ】開示された三次元表面における正常血液の正面図である。米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号に開示されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００システムが、例１に記載されたように、開示された３リングデテクタおよびプリアンプボードを備えて修正され、示されたデータを収集するために使用された。
【図４Ｂ】上記図４Ａに示されたものと同一の正常な血液の側面図であり、三次元表面を囲む非常に密接な対称分布を示す。完全に標準化され較正されたシステムでは、示されるように、約５０％の信号が表面より上になり、５０％が表面より下になる。シンボル：Ｏは球形の成熟赤血球であり、Ｒは染色された網状赤血球であり、Ｘは非球形の異常形状の赤血球であり、Ｗは白血球であり、Ｐは血小板である。
【図５Ａ】図４Ａに示されたものと同一の三次元表面における鎌状細胞試料の正面図である。図示のように、細胞母集団は、異常な形状の鎌状細胞のためにかなり分散している。
【図５Ｂ】三次元表面における同一の鎌状細胞試料の側面図である。異常な形状の鎌状細胞からの散乱信号は、三次元表面から外れ、それによって、非対称分布になり、正常な赤血球よりも三次元表面からかなり離れる。シンボル：Ｏは球形の成熟赤血球であり、Ｒは染色された網状赤血球であり、Ｘは非球形の異常形状の赤血球であり、Ｗは白血球であり、Ｐは血小板である。
【図５Ｃ】Ｔｙｃｋｏによって開示された先行技術（バイエルＨ＊１）による、同一試料の二次元分布である。
【図６Ａ】高いＷＢＣ試料のＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＲＢＣ／網状赤血球サイトグラム（ＦＬ１対ＩＡＳ）を表示する。これは、染色された網状赤血球および成熟ＲＢＣを含むＲＢＣゲートから、ＷＢＣのはっきりとした分離および除外を明らかにする。ゲートされたＲＢＣ母集団は、網状赤血球計数、および、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣの測定のために使用される。
【図６Ｂ】成熟ＲＢＣに関するおよび網状赤血球に関する領域を示すゲートされたＲＢＣ母集団のＦＬ１ヒストグラムである。
【図６Ｃ】Ｔｙｃｋｏによって開示された先行技術によって分析された同一試料の二次元分布である。ＷＢＣはＲＢＣからはっきりと分離されていない。
【図７Ａ】小赤血球ＲＢＣ試料のＶ＆ＨＣの二変数分布を表示する。
【図７Ｂ】正常なＲＢＣ試料のＶ＆ＨＣの二変数分布を示す。
【図７Ｃ】大赤血球ＲＢＣ試料のＶ＆ＨＣの二変数分布を表示する。
【図８Ａ】正常および臨床試料のセットにおける、本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１）の平均血球容積（ＭＣＶ）の結果の回帰プロットを示す。
【図８Ｂ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＶ結果（流体力学的に集束されたインピーダンス開口部を使用する電気抵抗測定）のＭＣＶ結果の回帰プロットを示す。
【図９Ａ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１ＣＨＣＭ）のＭＣＨＣ結果を表示する。
【図９Ｂ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＨＣ（インピーダンスＭＣＶおよびヘモグロビンのＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００比色分析測定から計算された結果）のＭＣＨＣ結果を表示する。
【図１０Ａ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１ＭＣＨ）のＭＣＨ結果を表示する。
【図１０Ｂ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＨ（インピーダンスＲＢＣ計数およびヘモグロビンの比色分析測定から計算される）のＭＣＨ結果を表示する。
【図１１Ａ】本発明の方法による正常および臨床試料のセットにおける、平均網状赤血球容積（ＲＥＴＶ）と合計ＲＢＣＭＣＶとの比較を示す。
【図１１Ｂ】本発明の方法による同一の正常および臨床試料のセットにおける、網状赤血球ＭＣＨＣ（ＲＥＴＨＣ）と合計ＲＢＣＭＣＨＣとの比較を示す。
【図１２Ａ】１５７個の正常および臨床試料および６６個の浸透圧試料（詳細は例１０参照）を含むセットにおける、６３３ｎｍ（ヘリウムネオンレーザ）光源を使用する本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１）のＭＣＶデータの回帰プロットを示す。
【図１２Ｂ】同一のヘリウムネオンシステムからの本発明対先行技術（バイエルＨ＊１ＣＨＣＭ）のＭＣＨＣ結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の概要）
試料中の哺乳類の赤血球の容積、ヘモグロビン濃度、成熟度、および赤血球形状を決定し、同時にシステム標準化をモニタするための方法および装置が開示される。赤血球分析の前に、赤血球を他の細胞粒子から区別するための方法も開示される。方法は、広範囲の可視スペクトルに対して正確に適用することができる。全血試料は、中性ｐＨの等張緩衝溶液に非イオン性界面活性剤を含む試薬溶液で処理され、赤血球は、選択された波長で単一ファイルにおける光のビームを通過し、１つの光損失信号、選択された角度間隔での１つの前方角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさによって、あるいは、選択された角度間隔での２つの前方角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさによって、初期的なサイトグラムを獲得し、容積およびヘモグロビン濃度のグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、１点ずつサイトグラムを投影し、三次元グリッド表面への各投影された交差（インターセプト）の場所によって、赤血球容積およびヘモグロビン濃度の正確な値を決定する。
【０００２】
本発明は、体液における哺乳類の赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の弁別の自動分析とシステム標準化の同時モニタとの方法および装置に関する。本発明は、特に、同一の光学式検出装置を使用してＲＢＣおよびＷＢＣの両方の弁別分析を行うことができる、マルチパラメータヘマトロジーアナライザーまたはフローサイトメータ等の多角光散乱および蛍光装置に関する。本発明は、より詳細には、（ｉ）全血中における容積、ヘモグロビン含有量、細胞形状、および成熟度に関してＲＢＣを分析するための方法、（ｉｉ）未熟ＲＢＣ（網状赤血球）容積およびヘモグロビン含有量を決定するための正確な方法、（ｉｉｉ）ＲＢＣ弁別のために血液試料が分析されている間に、システム標準化を継続してモニタすることができるＲＢＣ方法、（ｉｖ）１つの試薬を使用して、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方の容積およびヘモグロビン含有量を測定することができる方法、および（ｖ）同一の光学式検出システムを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣの両方の弁別分析を行うことができる装置とに関する。
【背景技術】
【０００３】
従来のヘマトロジー方法、すなわち、細胞サイズ、細胞形状、色（ヘモグロビン含有量用）、および封入体に関するＲＢＣ形態学に関する患者血液塗抹標本の顕微鏡的検査は、診断へ導きかつ患者の臨床状態をモニタする豊富な情報を提供する。しかし、この手動方法は、非常に主観的であり、かつ時間がかかるものであるという事実に加えて、標準以下の血液フィルムから、きわめて誤解を招く恐れのある印象を引く可能性がある。過去３０年の間に、大量の実験室作業量を取り扱いかつ労力を減少する、多数の自動ヘマトロジーアナライザーが利用可能になっている。これらの機器の大半は、電気インピーダンス測定によるか、または比色分析ヘモグロビン測定と組み合わされた光散乱光学式測定によって、赤血球の平均血球容積（ＭＣＶ）および平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を測定する。これらのシステムからの細胞分析における形態学的情報の不完全性またはあいまい性から、ヘマトロジー実験室における５から１０パーセントの試料は、日常的に、顕微鏡的方法を使用して細胞形態学に関する塗抹標本検査を受ける。ＲＢＣ形態学的分析の点におけるより進歩したヘマトロジーアナライザーは、テクニコンＨ＊１（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｈ＊１）およびバイエルアドヴィア（Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ）である。両システムは、米国特許第４，７３５，５０４号に記載されたＤ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏの教示にしたがって、細胞１つずつに基づいて同時に赤血球の容積およびヘモグロビン濃度を測定するように構成されている。
【０００４】
Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏに付与された米国特許第４，７３５，５０４号には、粒子の容積および屈折率を決定するための方法および装置が記載されている。ＶおよびＨＣを測定するための方法は、２つの選択された角度間隔の前方光散乱信号Ｓ１およびＳ２による卵形（ｏｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）形状のＲＢＣであり、容積（Ｖ）およびヘモグロビン濃度（ＨＣ）を決定することが開示されている。この方法の欠点は、下記の通りである。１）ＲＢＣからのヘモグロビン吸収を避けるために、光源の波長が十分長くなければならず（たとえば６３３ｎｍ）、これによって、マルチパラメータ血液細胞分析用のより適切な光源（たとえば４８８ｎｍ光源）を選択することができない。２）二次元（２Ｄ）マトリクスは、異常な細胞形状に関するいずれの情報を提供しないが、それは、そのような細胞からの信号は、所定の二次元マトリクスでは誤った場所に入り、したがって、Ｖ＆ＨＣに関する不正確な臨床データを生成するからである。３）二次元マトリクスは、システム標準化におけるシフトに関するいずれの情報を提供せず、これは、一定の血液試料における凝血塊によって生じる流体素子工学的な通過における不安定性、またはシステムの電子工学における不安定性のため、いずれも警告無しで発生する可能性のある現象である。４）二次元散乱方法は、ＷＢＣおよび有核赤血球（ＮＲＢＣ）を、成熟ＲＢＣまたは染色された網状赤血球から識別してはっきりと分離することができない。ＷＢＣおよびＮＲＢＣは、その核のため、赤血球よりもかなり多くの散乱を生成し、ＶおよびＨＣ分析の前に、ＲＢＣ母集団からはっきりと除外されるのでなければ、ＭＣＶ、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ＭＣＨＣ、および平均血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）に関する臨床結果は、上昇ＷＢＣまたはＮＲＢＣ試料では非常に誤解を招きやすい。
【０００５】
Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏに付与された米国特許第５，１９４，９０９号には、赤血球のＶおよびＨＣを測定するための方法および装置が教示されている。この技術と米国特許第４，７３５，５０４号における先の教示との相違は、長い波長（６３３ｎｍ）での１つの前方光散乱信号（予め選択される）と、抵抗パルスサイジング開口部からの第２の信号とを使用して、二次元マトリクスが形成されることである。この方法の欠点は下記の通りである。１）方法は、検出システムの２つの独立した源を必要とし、これは、２つの異なる検出システムからの２つの信号の同期等の不必要な複雑な状態を生み出す。２）ＲＢＣからのヘモグロビン吸収を避けるために、光源の波長が十分長くなければならず、これは、マルチパラメータ血液細胞分析用の光源の選択を限定する。３）二次元マトリクスは、異常な形状のＲＢＣに関するいずれの情報を提供せず、したがって、Ｖ＆ＨＣに関する不正確な臨床データを生成する。４）二次元マトリクスは、システム標準化におけるシフトに関するいずれの情報を提供せず、これは上記に説明されたように、電子工学または流体素子工学における不安定性のため、いずれも警告無しで発生する可能性のある現象である。
【０００６】
Ｆａｎらへ付与された米国特許第５，２８４，７７１号には、試薬組成物および細胞球形化におけるその使用が開示されている。試薬組成物は、向きによるノイズを排除するために赤血球を球形づけるための両性イオン界面活性剤と、網状赤血球を染色するためのＯｚｘａｚｉｎｅ７５０とを含む。光学式検出システムの光源は６３３ｎｍヘリウムネオンレーザであり、染色された網状赤血球は、光散乱／吸収技術によって識別される。網状赤血球の蛍光測定は、この特許では例示されていないか、または請求されていなかった。この開示の発明者らは、網状赤血球のＶ＆ＨＣの測定に関しては請求していなかったが、テクニコンＨ＊１システムを使用して細胞１つずつに基づいて、赤血球の容積およびヘモグロビンを同時に測定する上述のＴｙｃｋｏの方法の使用を記載した。Ｆａｎらの教示において、網状赤血球の染色手順は、手動調製、手動供給、および２分以上の染色時間を必要とする。発明者らは、ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣは、Ｔｙｃｋｏの方法によって測定されるが、ＲＢＣおよび網状赤血球に使用される試薬は、組成が完全に異なると記載した。テクニコンＨ＊１のＲＢＣに関するＴｙｃｋｏの二次元マトリクスを作るために使用される試薬は、Ｔｙｃｋｏの開示に記載されるように、ＲＢＣを球形にして固定し、一方、網状赤血球に関して使用される試薬は、いずれの固定剤を含まない緩衝液内でＲＢＣを球形にする。その上、網状赤血球を染色するのに使用される青染料による吸収は、染色された細胞のＶ＆ＨＣの測定における散乱信号の大きさに干渉する。上述の問題は、Ｆａｎらの教示による網状赤血球のＶ＆ＨＣに関する誤った臨床データへ導く可能性がある。上述のように、Ｖ＆ＨＣ測定に関するＴｙｃｋｏの方法は、ヘモグロビンが非常に透明である領域では単色光を発する光源を必要とする。これは、光源の利用可能性を制限する（λｍａｘは、６００ｎｍより大きくなければならない、赤ヘリウムネオンレーザ等）。別の制限は、吸収のためにまたは蛍光放射のために染料を励起するために、同一波長を使用しなければならないため、利用可能な染料の選択である。この条件下で、染料は、赤光を強力に吸収する青染料でなければならない。この特許では、網状赤血球のＶ＆ＨＣの測定に関しては、何の請求もされなかった。
【０００７】
Ｃｏｌｌｅｌａらに付与された米国特許第５，３５０，６９５号には、疑似吸収に関して測定された吸収信号を調整する方法が加えられていることを除いて、米国特許第５，２８４，７７１号で先に開示されたものと同一の網状赤血球を特徴づけるための方法および試薬が開示されている。この開示の第１２欄、第１段落の記載によると、米国特許第５，２８４，７７１号に開示された方法の主要な問題は、テクニコンＨ＊１機器の吸収信号が、吸収プリアンプのノイズと同一レベルであるということである。したがって、染色された網状赤血球からの吸収信号の信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比を改良するために、数学的モデルを展開しなければならなかった。この特許に開示された数学的訂正を備えてさえ、染色された網状赤血球から吸収信号の満足のいくＳ／Ｎ比を生成することは、この方法の主要な問題であると思われる。その上、光吸収も、粒子の光散乱の大きさに干渉する。
【０００８】
Ｆａｎらへ付与された米国特許第５，３６０，７３９号には、青の励起可能な蛍光染料、すなわちアクリジンオレンジが含まれることを除き、先の４つの特許に開示されたような方法および試薬が開示されている。この方法の教示を実行するために、２つの光源を必要とする。一方の光源は、青の励起可能な蛍光測定用（アルゴン／イオンレーザ）であり、他方の光源は、細胞の容積およびヘモグロビンの測定用（ヘリウムネオンレーザ）である。この方法の欠点は、同期および標準化のために検出システムが不必要に複雑になることであり、機器製造コストが非常に上昇する。
【０００９】
Ｃｏｌｌｅｌａらに付与された米国特許第５，４３８，００３号には、全血における網状赤血球の識別および特徴づけに使用するために、先の４つの特許に示されたものと同一の試薬組成物が開示されている。この特許のすべての請求項は試薬組成物に関しており、網状赤血球のＶ＆ＨＣの測定の方法に関する請求はなされていない。しかし、ヘリウムネオン（６３３ｎｍ）光源を使用する光散乱／吸収によって、成熟ＲＢＣから網状赤血球を分離するにあたり、開示された方法では「疑似吸収」およびヘモグロビン干渉をどのように訂正しているかを、本文内で新規に非常に長く説明している。結果として、米国特許第５，４３８，００３号に示されたサイトグラムは、成熟ＲＢＣ信号から不十分に分離された網状赤血球信号を明らかにしている。開示された光散乱／吸収方法によって、成熟ＲＢＣから母集団がよく分離されない限り、網状赤血球のＶ＆ＨＣを正確に測定することは非常に困難である。さらに、この開示の例は、開示された方法が、Ｖ＆ＨＣの測定に関する二次元マップを作るのに使用される試薬とは、ｐＨ、浸透圧、球形剤、および緩衝液がまったく異なる、２つの試薬を必要とすることを明らかにしている。加えて、Ｈ＊１ＲＢＣ方法は、非常に短いインキュベーション時間を有し、一方、開示された試薬における網状赤血球の染色時間は２分である（３０秒対１２０秒）。ＲＢＣ球形づけプロセスは、非常に敏感な可逆的なプロセスであり、２つの選択された光散乱信号に基づいて、一貫して再現可能なＶ＆ＨＣデータを得るために、正確なタイミングを必要とする。Ｃｏｌｌｅｌａらは、Ｖ＆ＨＣに関するいずれの時間検査データを開示していないし、この特許ではいずれの網状赤血球のＶ＆ＨＣデータも開示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
先行技術のこれらの態様を考慮すると、完全なＲＢＣ弁別分析、およびより正確な網状赤血球計数、およびＶ＆ＨＣ測定のための、改良された方法および装置を提供することが望ましい。本発明の目的は、単一の光源および光学式検出システムを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣの両方の弁別分析を行うことができる装置を提供することである。本発明の別の目的は、細胞１つずつに基づいた臨床的に有用なＭＣＨＣ測定、および異常な形状のＲＢＣの検出および定量化を含む、より完全なＲＢＣ弁別分析を提供することである。本発明のさらに別の目的は、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣ測定のために使用することができる、単一の網状赤血球試薬を提供することである。本発明のさらなる目的は、非常に狭い範囲内に光源の選択を限定しない方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、システムの安定を継続してモニタするためのＲＢＣ／弁別方法を提供することである。本発明のこれらの目的およびさらなる目的は、下記の説明および図面から当業者には明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（１）多角光散乱および蛍光ヘマトロジーアナライザーまたはフローサイトメータでＲＢＣ弁別を自動分析し、システム標準化を同時にモニタするための方法および装置に関し、（２）同一の光源および同一の光学式検出システムを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣの両方の弁別分析を行うことができる装置に関し、（３）特に、全血または体液における、容積、ヘモグロビン含有量、細胞形状、および成熟度に関してＲＢＣを分析するための方法に関し、（４）幼児および血液透析患者における鉄欠乏性貧血の診断に有用な、網状赤血球（未熟ＲＢＣ）のＶ＆ＨＣを決定するための正確な方法に関し、（５）血液試料が分析されている間に、システム標準化を継続してモニタすることができるＲＢＣ方法に関し、特徴は、システムドリフトによって生じる誤った臨床データを報告する可能性を排除する。上記目的は、内蔵測定装置として明確な予め較正された三次元（３Ｄ）表面を使用して達成され、三次元表面は、理論的データ、および多角光散乱および／または光損失測定によって生成される実際のデータ（事象）の両方を使用して形成される。正常なＲＢＣの各事象は、したがって、このごく薄い三次元表面に入らなければならない。細胞特徴の大半が、表面より下または上にあり、別の層を形成する場合には、電子工学的または流体素子工学的なシフトのいずれかのため、対象のチャネルが標準外であることが指摘される。３つまたはそれ以上の光散乱および／または光損失信号の多次元分析は、ある程度の内部一貫性を提供する。異常な形状のＲＢＣは、表面からもっとも近い各事象の距離によって規定されるが、それは、すべての正常なＲＢＣ信号（ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００希釈剤シースで球形づけられる）が、表面に近接するからである。網状赤血球は、ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００網状赤血球試薬における核酸ステインで処理された各事象の蛍光強度によって規定される。細胞のＶ＆ＨＣは、ＡＬＬ／ＩＡＳ’／ＰＳＳ、またはＩＡＳ／ＩＡＳ’／ＰＳＳによって形成された、三次元マトリクスにおける各事象の場所に基づいて決定される。上記目的を達成するために、ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００デテクタは、３つのゾーンを形成するように修正された。中心矩形ゾーン（ゾーン１）は、軸方向光損失（０度、ＡＬＬ）用であり、２．２４度から７．４５度（ＩＡＳ）である現在のＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００中間角度（ゾーン２）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５度から５．５度（ＩＡＳ’）である。修正されたデテクタは、本開示では３リングデテクタと称される。三次元表面は、前述の３リングデテクタによって生成された２つの角度（ＡＬＬおよびＩＡＳ’、またはＩＡＳおよびＩＡＳ’）、および９０度偏光側方散乱（ＰＳＳ）信号を使用して作られる。三次元の原則は、広い範囲の光源波長（たとえば、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、または６３３ｎｍ）を備えた光学式検出システムに適用可能である。
【００１２】
本発明およびその利点をより完全に理解するために、添付の図面とともに取られた下記の説明が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
Ａ）装置
開示された装置の１つの実施態様は、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＦＯＲ ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ ＡＵＯＭＡＴＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ）」に開示された、修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ヘマトロジーアナライザーである。本発明の開示された方法を行うために、ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００システムデテクタおよびプリアンプボードは修正された。修正されたデテクタを示す図が、図１Ａに表される。３つのゾーン（３リング）が形成される。中心矩形ゾーン（ゾーン１）は軸方向光損失（０度、ＡＬＬ）用であり、中間ゾーン（ゾーン２、２．２４から７．４５度、ＩＡＳ）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５から５．５度（ＩＡＳ’）である。ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００プリアンプボードも、図１Ｂに例示されるように修正された。修正されたプリアンプボードは、すべての３つのリングから信号を電気的に加算することによってＩＡＳ出力を形成する。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ＡＬＬおよびＩＡＳであるか、またはＩＡＳ’およびＩＡＳである（または配線し直すならば、ＡＬＬおよびＩＡＳ’である）。ＡＬＬチャネルのゲインが４に設定されるのであれば、ＩＡＳ’は、ＡＬＬの代わりに、出力へルートづけられる。ＩＡＳ’ゲインは、オンボードデュアルインラインパッケージ（ＤＩＰ）スイッチによって設定される。ＡＬＬおよびＩＡＳは、ＷＢＣ／弁別のために使用され、ＡＬＬおよびＩＡＳ’の組み合わせ、またはＩＡＳ’およびＩＡＳの組み合わせのいずれかが、ＲＢＣ／弁別のために使用される。三次元ＲＢＣ／弁別分析ために使用される第３の角度が、側方散乱信号であり、これは、１２５度円錐から構成される。これは、本質的にレーザ光の垂直偏光を保存するため、側方偏光散乱（ＰＳＳ）と呼ばれる。１２５度全角度円錐の同一側方収集システムも、米国特許第５，６９１，２０４号に開示された試薬のＲＮＡステインによって染色された網状赤血球の蛍光信号を収集する。この特徴は、単一の試薬および単一の光源から、網状赤血球の識別を可能にし、且つ成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣ測定を可能にするものであり、これは、本発明の独特な特徴である。
【００１４】
Ｂ）方法および試薬
ＷＢＣ／弁別試薬
ＷＢＣ弁別分析およびＮＲＢＣ定量化に使用されるＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＷＢＣ試薬の組成物は、米国特許第５，５１６，６９５号に開示されており、ＮＲＢＣ分析の方法は、米国特許第５，５５９，０３７号に開示されている。
【００１５】
ＲＢＣ／弁別試薬
ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００希釈剤シースの組成物は、米国特許第５，６５６，４９９号に開示されており、ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００網状赤血球試薬組成物および方法は、米国特許第５，６９１，２０４号に開示されている。希釈剤シースおよび網状赤血球試薬の両方は、システムに予め存在する流体素子工学構成のため、開示された方法をＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００システムで行うためのものであるが、２つの試薬を１つの試薬に化合して、開示された方法を行うことができる。
【００１６】
方法
開示されたＲＢＣ弁別分析を修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００で行うために、３６．１μｌの全血試料が、試料吸引プローブによって、約１０．５１３μｌの希釈剤シースを含んでいるＲＢＣカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、シース状インピーダンス開口部へ運ばれ、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置」に記載されるように、試料の絶対ＲＢＣ計数を電気的に決定する。次いで、約４５０μｌの希釈された試料が、４５０μｌの網状赤血球試薬を含んでいる網状赤血球カップ内に移され、ここで混合され、網状赤血球は染色される。次いで、準備された試料は、検出のために、シース状光学式フローセルへ運ばれる。細胞のストリームは、シースによって囲まれた層流の流体力学的に集束された試料ストリーム内で、本質的に一度に１細胞ずつ、フローセルを通って流れる。フロー軸に垂直な光のビームが、ストリームを照射する。照射された容積における細胞からの光散乱信号は、開示された３リングデテクタ（ＩＡＳおよびＩＡＳ’）によって、および偏光側方散乱（ＰＳＳ）および緑蛍光（ＦＬ１）を検出する２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出される。これらのパルスの振幅は、デジタル化され、リストモードデータとして保管される。本実施態様において、約２０，０００細胞が８秒間に計数される。
【００１７】
ＲＢＣ分析
第１に、図６Ａに示されるＦＬ１対ＩＡＳサイトグラムにおいてＲＢＣの左側に表れる信号は、血小板として識別される。第２のステップは、ＷＢＣおよびＮＲＢＣ（もしあれば）を識別しラベルづけることであり、それらの信号は、ＦＬ１対ＩＡＳサイトグラムにおいてＲＢＣより上に表れる。ＦＬ１ヒストグラム（図６Ｂ）をスキャンして、サイトグラムにおけるＲＢＣゲートの上部縁を決定する。ゲート内の事象は、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球である。
【００１８】
網状赤血球検出
本発明の方法は、十分に高いＳ／Ｎ比（染色された網状赤血球対染色されていない成熟ＲＢＣ）を有するため、信号を分離するために数学的訂正は必要ない。先の開示（米国特許第５，６９１，２０４号）に記載されるように、ゲート内のＲＢＣ母集団のＦＬ１ヒストグラムは、成熟ＲＢＣのピークに関してスキャンされ、このピークと第２のピーク（網状赤血球ピーク）との間の谷か、または傾斜の減少（網状赤血球「先端」）か、のいずれかに関してより高いＦＬ１値でスキャンされ、そこで、網状赤血球を成熟赤血球から分離するために線が引かれる。この線より上の細胞は、網状赤血球とラベルづけられ、網状赤血球のパーセント（％Ｒ）は、合計ＲＢＣ母集団の一部として決定され、ＲＢＣインピーダンス測定から決定されるように、この％Ｒに試料中のＲＢＣの絶対濃度を掛けて、網状赤血球の絶対濃度を得る。
【００１９】
ＲＢＣ／弁別分析
ゲートされたＲＢＣの３つの散乱信号が分析され、標準化三次元表面に表示される。三次元表面構造の詳細は、下記に説明される。
【００２０】
ＲＢＣ／弁別分析に関するシステムゲイン確立
最初に、ＭＣＶおよびＭＣＨＣに関する知られている参照値を備えた１セットの正常血液を、二重に流す。全読取値のＭＣＶおよびＭＣＨＣの総平均が計算される。次いで、９０ｆＬ（正規化された）のＭＣＶおよび３４（正規化された）のＭＣＨＣ’を備えたＲＢＣ母集団の平均散乱信号が、チャネル１２５＋／−３、すなわち各スケールの中心（ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００は、全散乱チャネルに関する２５６チャネルリニアスケールを有する）になるように、各散乱チャネル（ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＩＡＳ’またはＡＬＬ）に関するゲインが調整される。あるいは、適切な屈折率を有する安定したビーズか、または安定したヒトＲＢＣが、標準化されたシステムの各散乱チャネル数の平均でラベル値割り当てされ、標準粒子として使用されることが可能である。
【００２１】
三次元表面構造
第１のステップとして、三次元マップの理論的モデルが、ミー散乱理論に基づいて構成される。知られているＭＣＶおよびＭＣＨＣを備えた赤血球の散乱信号を、完全に表面に適合させるために微調整が行われる（これは、吸収のため、４８８ｎｍでヘモグロビン溶液の屈折率を正確に測定することが困難であるため、誤りが発生する可能性があるからである）。ミー散乱理論は、垂直に照射された均質な球形に関するマクスウェルの方程式の解法に基づいている。理論は、一定の屈折率を有する球形によって散乱される強度の計算方法を提供する（Ｋｅｒｋｅｒ、Ｂｏｈｒｅｎ、およびＨｕｆｆｍａｎ）。理論は、下記の入力パラメータを必要とする。
ａ）球形の屈折率。これは、球形が吸収するときに、複素数である。
ｂ）媒体の屈折率（媒体は、光を吸収してはならない）。
ｃ）照射に使用される光の波長および偏光。
ｄ）容積から計算することができる球形の直径。
【００２２】
モデルの仮定の１つは、球形は、固定された強度で照射されるということである。この近似は、球形を照射するビームの直径が、球形の直径よりも大きい（およそ１０倍）場合に有効である。ＲＢＣのために行われる基本的な仮定は、ＲＢＣが球形であり、均質であるということである。これは、細胞の屈折率が、細胞のいずれの場所でも同一であることを意味する。ミー散乱理論アルゴリズムは、均一電磁場におけるマクスウェルの方程式の数値解法に基づいている。
【００２３】
ミー理論アルゴリズムは、強度分布に角度シータを与えるだけである。これは、ビームが伝播する方向と観察の方向との間の角度である。これは、散乱強度プロファイルが前方方向で対称的であることを意味する。入射直線偏光に関する異なる角度によって収集される強度を計算するために使用される式は、式１によって与えられる。
【数１】
ここで、ｉ１＝｜Ｓ１（θ）｜２
ｉ２＝｜Ｓ２（θ）｜２
Ｉ＝強度（相対数）
λ＝波長（真空）
θ＝レーザ方向と観察の方向との間の角度
φ＝レーザ偏光と観察の方向との間の角度
ｉ１、ｉ２＝２つの異なる偏光方向の強度
である。
【００２４】
関数Ｓｉ（θ）は、プログラムによって計算される。プログラムは、すべてに、０．３度で分離された角度で、０度から１８０度の間でこの関数の値を与える。各角度で、この角度の値は、絶対値の平方によって得られる。角度φは、偏光ベクトルと観察の方向との間の角度である。ＣＤ４０００において、偏光方向は垂直軸である。したがって、関数Ｉ（θ，φ）は、細胞のまわりのすべての場所に散乱光の強度を提供する。前方ＩＡＳデテクタによって収集される光の量を得るために、強度プロファイルは、収集された角度に対して積分することができる。プログラムに使用される積分の数値方法は、トラペジウム方法である。φは２πに対して積分されるため、前方角度における散乱に関する式は下記のようになる。
【数２】
ＡＬＬデテクタからの信号は、細胞がレーザビームを通過するときの最大強度低下に等しい。ＡＬＬ信号は、合計光損失である。これは、散乱吸光係数とも呼ばれ、ＢｏｈｒｅｎおよびＨｕｆｆｍａｎによって開発されたアルゴリズムによって計算することができる。
【００２５】
デテクタが、各水平角度シータに関して異なる垂直角度ファイを収集する以外は、ＰＳＳ信号の計算は簡単ではある。各水平角度φに関して、垂直角度φに関する積分が行われなければならない。この積分は正確であり、そのため近似を行う必要はない。各角度θは、円錐の形状に関連する自己の最小および最大φを有し、これは、ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００の場合には円である。ｓｉｎ２（φ）の積分の解法は、式３によって与えられる。
【数３】
この式の中で角度φは半径方向に与えられ、上記公式の角度φよりも小さいπ／４である。これは、ファイが、９０度プラスマイナスφｍａｘ（垂直収集角度）だからである。ｃｏｓ２（φ）の解法も同様であり、第２項の符号のみが異なる。各角度θに関して、垂直方向に収集される強度を計算することができる。水平最小および最大角度θに対する積分後に、ＰＳＳの値が得られる。
【００２６】
前方散乱角度の選択
ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００前方散乱角度デテクタ（空中でＩＡＳ３度から１０度）は、容積に対して不感受性である。理論は、収集角度が懸濁媒体内で規定されなければならないことを必要とする。媒体（ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００希釈剤シース）の屈折率は、λ２５℃ｍａｘ４８８ｎｍで１．３３９である。したがって、スネルの法則によって、希釈剤の収集角度は２．２４から７．４５である。図２Ａおよび図２Ｂは、希釈剤における相対弁別クロス散乱対角度を表示する。弁別クロス散乱は、式２の積分より下の部分未満のものはない。
【００２７】
曲線より下の区域は、容積（Ｖ）およびヘモグロビン濃度（ＨＣ）の相対強度を表す。３３（ｇ／ｄＬ）のＨＣで異なるＶに関する曲線より下の区域は、２．２４度から７．４５度の間であまり変化しないが、これは、曲線が、４度より下では容積が高くなるにつれて下がり、４度より上では容積とともに上がるからである。最小ヘモグロビン干渉を有する容積を測定することができるために、４．５度から５．５度の間の角度が選択される。上記図２Ａおよび図２Ｂ参照。
【００２８】
異なる角度における測定は、修正された３リングデテクタを使用して達成される。デテクタは、２．２４度から４．５度の角度をカバーする１つの内側リングと、４．５度から５．５度（ＩＡＳ’）の角度をカバーする第２のリングと、５．５度から７．４５度の角度をカバーする第３のリングとを有するように構成される。３つのリングは一緒に、ＷＢＣ弁別分析に使用される現在のＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＩＡＳデテクタによって収集される角度を依然として与える。第２のリングのみから信号を収集することが可能であり、これは、４．５度から５．５度の間である。新しい角度と古い角度とを同時に使用することも可能である。この解決方法は、ＷＢＣ／弁別およびＲＢＣ／弁別分析用に、２つの別個の光学式検出システムが使用される先行技術に対して利点を有する。本発明は、ＷＢＣ／弁別およびＲＢＣ／弁別分析の両方に同時に同一の光学式検出システムを使用することを可能にする。この解決方法は、角度の異なるセットで散乱光を収集する様々な可能性を生み出す。
【００２９】
三次元（３Ｄ）細胞分析
ＲＢＣが完全な球形であると仮定すると、３つの散乱信号、ＩＡＳ、ＩＡＳ’、およびＰＰＳ（またはＡＬＬ、ＩＡＳ’、およびＰＰＳ）は、主に、２つのＲＢＣパラメータすなわちＶおよびＨＣに応じる。すべての可能なＶおよびＨＣの組み合わせが一緒に、空間に表面を形成する。空間におけるＩＡＳ’、ＡＬＬ、およびＰＰＳの表面の簡略にされた説明が、図３に示される。単一細胞のＶおよびＨＣがどのように得られるかという原則を説明するために、三次元における表面の小さな部分のみが表示される。表面は実際には湾曲しているが、表面は平面であると仮定する。しかし、単一のＲＢＣのＶおよびＨＣを見出すために、同一の原則を表面に適用することができる。システムが完全に標準化されるときには、すべての球形ＲＢＣは、表面のまわりに非常に近接して分布される。鎌状細胞等の異常な形状のＲＢＣは、表面からより離れている信号を生成する。このようにして、異常な細胞形状を識別するのに、ＲＢＣ信号の表面からの距離を使用することができる。
【００３０】
正確には表面上にない細胞のＶおよびＨＣ情報を見出す方法は、図３の細胞Ｍを使用して、下記に説明される。この細胞のＶおよびＨＣをもっとも表す可能性がある表面上の点は、表面上のもっとも近接した点である。実際には現実の表面はないが、三次元における所与のＶおよびＨＣ値を備えた知られている点のセットの位置がある。図３の等Ｖ線および等ＨＣ線の交差は、これらの点を表す。正確にはこの表面にはない点のＶおよびＨＣ値を得るために、この表面上のもっとも近接した３点が見出される。この場合、３つのもっとも近接した点は、１、２、および３である。１から２へのベクトルおよび１から３へのベクトルは、法線を計算することができる表面の小さな部分を規定する。点Ｍを通って法線に平行なベクトルの表面との交差を計算して、点Ｉが見出される。点Ｉは、表面上の細胞の投影を表す。交差が見出されると、ベクトルａおよびｂを計算することができる。ａおよびｂの長さを使用して、３点の値の間を補間し、細胞（点Ｍ）のＶおよびＨＣを得ることができる。ＩＡＳ方向のみにおける表面への距離のすべての細胞のヒストグラムを作ることによって、表面がＩＡＳ信号に関して正しい場所にあるか否かを見ることができる。表面がＩＡＳ信号に関して正しく設定される場合には、ヒストグラムのピークはチャネルゼロである。これは、同一数の細胞が表面の両側にあることを意味する。同一のことがＡＬＬおよびＰＰＳ信号に当てはまる。下記に示されるように、３つの信号方向における表面への距離に関する３つのヒストグラムが、正しい表面を見出すために有用なツールであることが判明した。
【００３１】
三次元表面を見出す
ミー散乱理論は、知られている屈折率を有する完全球形からの信号を予測する。屈折率およびＶの範囲に関する信号を計算することによって、表面上の点を見出すことができる。ミー理論は、信号強度の相対数のみを提供する。したがって、信号の三次元の正確なチャネル数は、これらを表面に正確に配置するために、ゲイン係数を掛けることによって計算されなければならない。これらの係数を見出すのを可能にするために、屈折率がヒト赤血球ＭＣＨＣの臨床範囲内に入る３つの異なる炭化水素（ヘプタン、ノナン、およびドデカン）が使用された。３つの炭化水素の各々は、懸濁媒体内で強く混合されるときには、同一の屈折率を有する様々なサイズの滴を生成する。これらの３つのオイルの各々は、屈折率が異なるため（炭化水素は吸収がない）、互いに異なる、明確なＶ信号分布トラックを作る。次に、ミー理論によって作られる表面の正確度は、表面上のもっとも近接した点への実際の信号の距離を測定することによってチェックされる。たとえば、表面が３つの炭化水素によって生成される信号へ完全に適合するのであれば、３つのヒストグラムのピークの表面への距離はゼロである。
【００３２】
血液試料に関する表面を作ることは、４８８ｎｍでのヘモグロビンによる光吸収のため、より複雑である。吸収を訂正するために、炭化水素に関する三次元表面を形成するために使用されるシミュレーションに吸光度が加えられなければならない。理論値をチャネル数へ転換するために３つの炭化水素に関して使用されるすべてのゲイン設定は、一定に保たれる。このようにして、すべての可能なＲＢＣ事象を規定する完全な表面が形成される。正常な試料のＲＢＣは、表面のまわりに正常に分布されなければならない。この表面は、機器の較正および標準化のための日常ＱＣチェックに関してさらに努力することなく、試料が分析されている間にシステム標準化をモニタするツールも提供する。各試料に関して、表面のまわりのＲＢＣの三次元ヒストグラムは、信号処理中に作られる。表面のまわりの正常なＲＢＣ分布が対称的ではない場合には、機器は標準化から外れる（たとえば、流体素子工学的なまたは電子工学的な問題）。
【００３３】
例示のために、ここに検討された好適な実施態様の多数の使用が示される。下記の検討は、例示的な目的のためのみに提供され、この検討は網羅的ではない。具体的に下記に検討されるのは、統合された血液細胞分析、ＷＢＣ弁別分析に使用されるのと同一の光学式検出システムを使用して、多角光散乱および蛍光ヘマトロジーアナライザーにおいて、容積、ヘモグロビン含有量、正常および異常な細胞形状、網状赤血球の容積、およびヘモグロビン含有量用のＲＢＣ弁別分析を行い、かつシステム標準化を同時にモニタするために開示された実施態様を使用する方法である。これは、請求される発明の範囲をいずれにも限定しない。
【００３４】
例１．
開示された装置は、修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００（ＣＤ４０００）システムである。ＣＤ４０００デテクタおよびプリアンプボードは、白血球弁別（ＷＢＣ／弁別）分析と赤血球弁別（ＲＢＣ／弁別）分析との両方に同一のデテクタを使用するために、修正される。修正されたデテクタを示す図は、図１Ａに見られる。３つのゾーンが形成される。中心矩形ゾーン（ゾーン１）は軸方向光損失（０度、ＡＬＬ）用である。中間ゾーン（ゾーン２、２．２４から７．４５度、ＩＡＳ）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５から５．５度（ＩＡＳ’）である。プリアンプボードは、図１Ｂに描かれるように修正された。修正されたプリアンプボードは、すべての３つのリングから信号を電気的に加算することによってＩＡＳ出力を形成する。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ＡＬＬおよびＩＡＳであるか、またはＩＡＳ’およびＩＡＳである（または配線し直すならば、ＡＬＬおよびＩＡＳ’である）。ＩＡＳ’ゲインは、オンボードデュアルインラインパッケージ（ＤＩＰ）スイッチによって設定される。ＡＬＬおよびＩＡＳは、ＷＢＣ弁別のために使用され、ＡＬＬおよびＩＡＳ’か、またはＩＡＳ’およびＩＡＳかの組み合わせのいずれかが、ＲＢＣ弁別分析のために使用される。三次元ＲＢＣ弁別分析ために使用される第３の角度は、９０度側方散乱である。
【００３５】
例２．
この実験のために、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置」に記載されたＣＤ４０００システムが、例１に記載されたように、３リングデテクタおよび新しいプリアンプボードを備えて修正された。約１１２．５μｌの正常全血試料が、試料吸引プローブによって、約１０．５１３μｌのＣＤ４０００希釈剤シースを含んでいるＲＢＣカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、シース状インピーダンス開口部へ運ばれ、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号に記載されるように、絶対ＲＢＣ計数を電気的に決定する。約４５０μｌの希釈された試料は、ＣＤ４０００網状赤血球カップ内に移され、このカップは約４５０μｌの網状赤血球試薬を含んでおり（米国特許第５，６９１，２０４号、１９９７年１１月２５日。「網状赤血球の迅速分析用の組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ）」）、混合される。次いで、準備された試料は、検出のために、シース状光学式フローセルへ運ばれる。ＷＢＣおよびＮＲＢＣは、ＲＢＣゲートによって排除され、網状赤血球は、米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号に記載されるように、識別され定量化される。同時に、３つの散乱信号は、各事象に関しても測定され、標準三次元表面に表示される。図４Ａおよび図４Ｂは、三次元表面にきっちりと重なり合う正常血液の正面図および側面図を示す。完全に標準化され較正されたシステムで、図４Ｂに示されるように、約５０％の信号が表面より上になり、５０％が表面より下になる。
【００３６】
例３．
鎌状細胞を含む臨床血液試料が、例２に記載された開示された装置を流れた。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、試料の正面図および側面図を表示する。見ることができるように、異常な形状の鎌状細胞のため、細胞母集団はかなり分散しており、側面図は、信号が三次元表面から外れることを示す。各事象の表面からの距離に基づいて、本発明の方法は、異常な形状のＲＢＣのパーセントを概算することができる。同一試料のＴｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１）による先行技術の二次元分布は、図５Ｃに表示される。図５Ｃから見ることができるように、二次元分布は、異常な細胞形状を球形の正赤血球から区別しない。その上、異常な形状を有するＲＢＣの有意な数は、二次元マップから外れ、それによって容積測定から除外される。
【００３７】
例４．
高ＷＢＣ試料およびＷＢＣのＲＢＣゲートからの分離および除外のＣＤ４０００サイトグラム（ＦＬ１対ＩＡＳ）は、染色された網状赤血球および成熟ＲＢＣを含み、図６Ａに示される。図４Ａに示されるように、本発明の方法は、ＲＢＣ／弁別分析の前に、ＷＢＣをＲＢＣ母集団からはっきりと識別し排除する。ゲートされた母集団のＦＬ１ヒストグラムは、図６Ｂに示される。逆に、Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１）によって開示された先行技術は、ＷＢＣをＲＢＣ母集団からはっきりと区別しないかまたは分離しない（図６Ｃ参照、先行技術による同一試料のＲＢＣ分布）。したがって、先行技術の方法は、様々な白血病の患者、特に、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の患者からの上昇ＷＢＣ試料では、誤った赤血球ＭＣＶおよびＭＣＨＣ結果を生成する可能性があるが、それは、ＣＬＬのリンパ球が、ＲＢＣと同じほど小さいだけではなく、ＲＢＣと同じほど小さい光散乱を生成するには壊れ易いからである。
【００３８】
例５．
小赤血球（図７Ａ）、正赤血球（図７Ｂ）、および大赤血球（図７Ｃ）のＲＢＣ試料の細胞ヘモグロビン含有量（ＨＣ）対容積（Ｖ）の二変数分布が、本発明の方法によって分析された。２本の固定線が、正常範囲のまわりに垂直に且つ水平に引かれ、各試料におけるサイズおよびヘモグロビン含有量のＲＢＣ異常性の異なる組み合わせを識別し計数する。下記の表１ａ、１ｂ、および１ｃは、各カテゴリーの細胞の概算されたパーセンテージを示す。提供された情報に基づいて、患者の状態の赤血球不同症、小赤血球症、大赤血球症、血色素減少症、および血色素増加症の重大度レベルを決定することができる。
【表１ａ】
【表１ｂ】
【表１ｃ】
【００３９】
例６．
平均細胞容積（ＭＣＶ）の回帰統計およびプロット。図８Ａは、本発明対Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１）による先行技術の結果を表し、図８Ｂは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＶ結果（流体力学的に集束された細胞を使用した電気インピーダンス測定）の結果を表す。
【００４０】
例７．
ＭＣＨＣの回帰統計およびプロット。図９Ａは、本発明対Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１ＣＨＣＭ）による先行技術の結果を表示し、図９Ｂは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００ＭＣＨＣ（インピーダンスＭＣＶおよびヘモグロビンのＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００比色分析測定から計算された結果）の結果を表示する。
【００４１】
例８．
ＭＣＨの回帰統計およびプロット。図１０Ａは、本発明対Ｔｙｃｋｏ（バイエルＨ＊１ＭＣＨ）による先行技術の結果であり、図１０Ｂは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＨ（インピーダンスＲＢＣ計数およびヘモグロビンの比色分析測定から計算された）の結果である。
【００４２】
例９．
開示された方法による正常および臨床試料のセットにおける平均網状赤血球容積（ＲＥＴＶ）と合計ＲＢＣＭＣＶとの比較が、図１１Ａに示され、開示された方法による正常および臨床試料の同一のセットにおける網状赤血球ＭＣＨＣ（ＲＥＴＨＣ）と合計ＲＢＣＭＣＨＣとの比較が、図１１Ｂに示される。
【００４３】
例１０．
約１．６７μＬの全血試料が、試料吸引プローブによって、約２８００μｌの上記例２に使用されたものと同一の希釈剤を含んでいるＲＢＣカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、アボットＣＥＬＬ ＤＹＮ３２００シース状光学式フローセルへ運ばれ、細胞１つずつの容積およびヘモグロビン測定に関する信号を収集する。アボットＣＥＬＬ ＤＹＮ３２００の光源は、５ｍワットヘリウムネオンレーザであり、そのデテクタは、１度から３度、および３度から１０度２つの前方光散乱信号、および９０度＋／−３０度の側方散乱信号を収集するように構成される。試料のＦＳＣファイルは較正された三次元表面で分析され、本発明の開示された方法を使用して、ヘリウムネオンシステムに関して作られる。１５７個の正常および臨床試料、および、浸透圧検査からの６６個の試料がシステムに流され、結果の比較は図１２Ａおよび図１２Ｂに示される。浸透圧実験は、血液を希釈するために使用される両方の試薬（ＣＥＬＬ ＤＹＮ３２００およびＨ＊１）の塩濃度を変えることによって行われた。検査された浸透圧範囲は、１７５ｍＯｓｍ／Ｌから５００ｍＯｓｍ／Ｌであった。
【００４４】
上記を考慮して、前述の記載から、先行技術に対して本発明の多くの利点が明らかである。一定の代表的な実施態様および詳細が、発明を例示する目的のために示されているが、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱せずに、様々な変更および修正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】白血球弁別（ＷＢＣ／弁別）分析と赤血球弁別（ＲＢＣ／弁別）との両方の分析に同一のデテクタを使用するために、修正されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００デテクタを示す図である。３つのゾーンが形成される。中心矩形ゾーン（ゾーン１：ＡＬＬ用に０度）は軸方向光損失用であり、中間ゾーン（ゾーン２：ＩＡＳ用に２．２４から７．４５度）は、３つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン（ゾーン３）は４．５から５．５度（ＩＡＳ’）である。
【図１Ｂ】ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００プリアンプボードの修正を示す。ＩＡＳ出力は、すべての３つのリングからの信号を電気的に加算することによって形成される。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ＡＬＬおよびＩＡＳであるか、またはＩＡＳ’およびＩＡＳである（または配線し直すならば、ＡＬＬおよびＩＡＳ’である）。ＷＢＣ弁別および三次元ＲＢＣ弁別の両方分析ために使用される第３の角度は、９０度偏光側方散乱である。
【図２Ａ】４８８ｎｍの波長での容積およびヘモグロビン濃度の異なる値に関する前方角度における弁別クロス散乱を例示する。
【図２Ｂ】４８８ｎｍの波長での容積およびヘモグロビン濃度の異なる値に関する前進角度における弁別クロス散乱を例示する。
【図３】細胞のＶ＆ＨＣデータがどのように三次元表面から得られるかの原則を説明するための三次元表面の小さな部分の例である。
【図４Ａ】開示された三次元表面における正常血液の正面図である。米国特許第５，６５６，４９９号および第５，６３１，１６５号に開示されたＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００システムが、例１に記載されたように、開示された３リングデテクタおよびプリアンプボードを備えて修正され、示されたデータを収集するために使用された。
【図４Ｂ】上記図４Ａに示されたものと同一の正常な血液の側面図であり、三次元表面を囲む非常に密接な対称分布を示す。完全に標準化され較正されたシステムでは、示されるように、約５０％の信号が表面より上になり、５０％が表面より下になる。シンボル：Ｏは球形の成熟赤血球であり、Ｒは染色された網状赤血球であり、Ｘは非球形の異常形状の赤血球であり、Ｗは白血球であり、Ｐは血小板である。
【図５Ａ】図４Ａに示されたものと同一の三次元表面における鎌状細胞試料の正面図である。図示のように、細胞母集団は、異常な形状の鎌状細胞のためにかなり分散している。
【図５Ｂ】三次元表面における同一の鎌状細胞試料の側面図である。異常な形状の鎌状細胞からの散乱信号は、三次元表面から外れ、それによって、非対称分布になり、正常な赤血球よりも三次元表面からかなり離れる。シンボル：Ｏは球形の成熟赤血球であり、Ｒは染色された網状赤血球であり、Ｘは非球形の異常形状の赤血球であり、Ｗは白血球であり、Ｐは血小板である。
【図５Ｃ】Ｔｙｃｋｏによって開示された先行技術（バイエルＨ＊１）による、同一試料の二次元分布である。
【図６Ａ】高いＷＢＣ試料のＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＲＢＣ／網状赤血球サイトグラム（ＦＬ１対ＩＡＳ）を表示する。これは、染色された網状赤血球および成熟ＲＢＣを含むＲＢＣゲートから、ＷＢＣのはっきりとした分離および除外を明らかにする。ゲートされたＲＢＣ母集団は、網状赤血球計数、および、成熟ＲＢＣおよび網状赤血球の両方のＶ＆ＨＣの測定のために使用される。
【図６Ｂ】成熟ＲＢＣに関するおよび網状赤血球に関する領域を示すゲートされたＲＢＣ母集団のＦＬ１ヒストグラムである。
【図６Ｃ】Ｔｙｃｋｏによって開示された先行技術によって分析された同一試料の二次元分布である。ＷＢＣはＲＢＣからはっきりと分離されていない。
【図７Ａ】小赤血球ＲＢＣ試料のＶ＆ＨＣの二変数分布を表示する。
【図７Ｂ】正常なＲＢＣ試料のＶ＆ＨＣの二変数分布を示す。
【図７Ｃ】大赤血球ＲＢＣ試料のＶ＆ＨＣの二変数分布を表示する。
【図８Ａ】正常および臨床試料のセットにおける、本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１）の平均血球容積（ＭＣＶ）の結果の回帰プロットを示す。
【図８Ｂ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＶ結果（流体力学的に集束されたインピーダンス開口部を使用する電気抵抗測定）のＭＣＶ結果の回帰プロットを示す。
【図９Ａ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１ＣＨＣＭ）のＭＣＨＣ結果を表示する。
【図９Ｂ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＨＣ（インピーダンスＭＣＶおよびヘモグロビンのＣＥＬＬ ＤＹＮ４０００比色分析測定から計算された結果）のＭＣＨＣ結果を表示する。
【図１０Ａ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１ＭＣＨ）のＭＣＨ結果を表示する。
【図１０Ｂ】図８Ａと同一の正常および臨床試料のセットにおける、本発明対ＣＥＬＬ ＤＹＮ（登録商標）４０００ＭＣＨ（インピーダンスＲＢＣ計数およびヘモグロビンの比色分析測定から計算される）のＭＣＨ結果を表示する。
【図１１Ａ】本発明の方法による正常および臨床試料のセットにおける、平均網状赤血球容積（ＲＥＴＶ）と合計ＲＢＣＭＣＶとの比較を示す。
【図１１Ｂ】本発明の方法による同一の正常および臨床試料のセットにおける、網状赤血球ＭＣＨＣ（ＲＥＴＨＣ）と合計ＲＢＣＭＣＨＣとの比較を示す。
【図１２Ａ】１５７個の正常および臨床試料および６６個の浸透圧試料（詳細は例１０参照）を含むセットにおける、６３３ｎｍ（ヘリウムネオンレーザ）光源を使用する本発明対Ｔｙｃｋｏによる先行技術（バイエルＨ＊１）のＭＣＶデータの回帰プロットを示す。
【図１２Ｂ】同一のヘリウムネオンシステムからの本発明対先行技術（バイエルＨ＊１ＣＨＣＭ）のＭＣＨＣ結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個別の赤血球の容積Ｖおよびヘモグロビン含有量ＨＣを決定するための三次元光学式方法であって、
ａ）抗凝固全血試料を、球形剤および中性緩衝等張塩水を含む試薬溶液で処理するステップと、
ｂ）前記試料から分離された赤血球を、選択された波長で光路に沿って方向づけられた光ビームを通過させるステップと、
ｃ）各赤血球からの第１の前方角度光散乱信号、第２の中間角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさを測定するステップと、
ｄ）ＶおよびＨＣのグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、各赤血球からの前記光散乱信号の三次元座標を投影するステップと、
ｅ）前記三次元グリッド表面に各投影された交差の場所によって、ＶおよびＨＣの値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記散乱信号が、各赤血球の容積およびヘモグロビン濃度によって決定され、前記ヘモグロビン濃度が、前記光のビームの波長におけるヘモグロビンの屈折率に応じて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された波長が、４００ｎｍから８００ｎｍの範囲の可視光に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記三次元表面が、ミー散乱理論に基づいて計算され、前記光ビームの角度に対する前記第３の側方角度光散乱信号の角度、前記光ビームの波長、および前記波長におけるヘモグロビンの屈折率に応じる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬溶液が、核酸ステインをさらに含み、核酸ステインが、第４の蛍光信号によって、前記血液試料の成熟赤血球から網状赤血球を分離することを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
白血球、血小板、および有核赤血球を含む他の細胞状粒子を除外するための赤血球ゲートをさらに含み、前記ゲートが、前方散乱および蛍光の二次元サイトグラムを作ることによって確立される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
白血球、血小板、および有核赤血球を含む他の細胞状粒子を除外するための赤血球ゲートをさらに含み、前記ゲートが、光損失および蛍光の二次元サイトグラムを作ることによって確立される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
三次元表面グリッド方法が、前記網状赤血球の容積およびヘモグロビン濃度を決定するために適用される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記グリッド表面の法線方向で測定された、前記三次元グリッド表面から赤血球点のもっとも近い距離を決定することによって、異常な形状の赤血球を識別することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料の個別の赤血球の容積およびヘモグロビン濃度の二変数分布から、前記血液試料における大赤血球、小赤血球、血色素減少細胞、血色素増加細胞、またはそれらの組み合わせのパーセントを定量化することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記三次元グリッド表面から細胞母集団の距離の対称性程度を決定することによって、システム標準化を継続してモニタすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
個別の赤血球の容積Ｖおよびヘモグロビン含有量ＨＣを決定するための三次元光学式方法であって、
ａ）抗凝固全血試料を、球形剤および中性緩衝等張塩水を含む試薬溶液で処理するステップと、
ｂ）前記試料から分離された赤血球を、選択された波長で光路に沿って方向づけられた光ビームを通過させるステップと、
ｃ）各赤血球からの１つの前方角度光散乱信号、１つの光損失信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさを測定するステップと、
ｄ）ＶおよびＨＣのグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、各細胞からの前記光散乱信号の三次元座標を投影するステップと、
ｅ）前記三次元グリッド表面に各投影された交差の場所によって、ＶおよびＨＣの値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項１３】
白血球および赤血球の弁別を同時に決定するための装置であって、
ａ）光路に沿って光のビームを方向づける手段と、
ｂ）細胞を前記光ビームに通過させて、所望の角度間隔の光散乱パターンを作る手段と、
ｃ）所定の角度間隔に対応する、多数の別々の領域を備えた光学式デテクタと、
ｄ）それぞれ前記白血球および赤血球の弁別分析に関して、所望の角度間隔を選択的に分離するための電子プリアンプ手段と、
ｅ）それぞれ前記角度間隔内の散乱した光の強度に対応する、各角度間隔からの信号を同時に生成する手段と、
ｆ）前記赤血球の細胞１つずつに基づいて容積およびヘモグロビン濃度を決定し、かつ前記白血球のサイズおよび複雑度を決定するための手段とを具備する、装置。
【請求項１４】
決定ステップが、複数の前記赤血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記赤血球の各々が、少なくとも第１の前方角度光散乱信号、第２の中間角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号を展開して、容積、ヘモグロビン濃度、および赤血球形状異常度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
決定ステップが、複数の前記赤血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記赤血球の各々が、少なくとも１つ光損失信号、第２の中間角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号とを展開して、容積、ヘモグロビン濃度、および赤血球形状異常度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
さらなる決定ステップが、各赤血球の成熟度を決定するために、前記赤血球の第４の同時蛍光信号を展開するための手段を含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
決定ステップが、複数の白血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記白血球の各々が、少なくとも第１の前方角度光散乱信号、第２の中間角度光散乱信号、第３の側方角度偏光散乱信号、および第４の側方角度偏光解消散乱信号を展開して、各白血球のサイズ、白血球内部複雑度、および粒度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
決定ステップが、複数の白血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記白血球の各々が、少なくとも１つの光損失信号、第２の中間角度光散乱信号、第３の側方角度偏光散乱信号、および第４の側方角度偏光解消散乱信号を展開して、各白血球のサイズ、白血球内部複雑度、および粒度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１９】
前記光ビームが、４００ｎｍから８００ｎｍの範囲の可視スペクトルから選択される、請求項１３に記載の装置。
【請求項２０】
前記光源が、
ａ）４８８ｎｍでのアルゴンイオンガスレーザと、
ｂ）５３２ｎｍでの固定レーザと、
ｂ）６３２ｎｍでのヘリウムネオンガスレーザと、
ｃ）赤色ダイオードレーザと、
ｄ）緑色ダイオードレーザと、
ｅ）青色ダイオードレーザと
からなる群から選択される、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記球形剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１または１２に記載の方法。
【請求項１】
個別の赤血球の容積Ｖおよびヘモグロビン含有量ＨＣを決定するための三次元光学式方法であって、
ａ）抗凝固全血試料を、球形剤および中性緩衝等張塩水を含む試薬溶液で処理するステップと、
ｂ）前記試料から分離された赤血球を、選択された波長で光路に沿って方向づけられた光ビームを通過させるステップと、
ｃ）各赤血球からの第１の前方角度光散乱信号、第２の中間角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさを測定するステップと、
ｄ）ＶおよびＨＣのグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、各赤血球からの前記光散乱信号の三次元座標を投影するステップと、
ｅ）前記三次元グリッド表面に各投影された交差の場所によって、ＶおよびＨＣの値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記散乱信号が、各赤血球の容積およびヘモグロビン濃度によって決定され、前記ヘモグロビン濃度が、前記光のビームの波長におけるヘモグロビンの屈折率に応じて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された波長が、４００ｎｍから８００ｎｍの範囲の可視光に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記三次元表面が、ミー散乱理論に基づいて計算され、前記光ビームの角度に対する前記第３の側方角度光散乱信号の角度、前記光ビームの波長、および前記波長におけるヘモグロビンの屈折率に応じる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬溶液が、核酸ステインをさらに含み、核酸ステインが、第４の蛍光信号によって、前記血液試料の成熟赤血球から網状赤血球を分離することを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
白血球、血小板、および有核赤血球を含む他の細胞状粒子を除外するための赤血球ゲートをさらに含み、前記ゲートが、前方散乱および蛍光の二次元サイトグラムを作ることによって確立される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
白血球、血小板、および有核赤血球を含む他の細胞状粒子を除外するための赤血球ゲートをさらに含み、前記ゲートが、光損失および蛍光の二次元サイトグラムを作ることによって確立される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
三次元表面グリッド方法が、前記網状赤血球の容積およびヘモグロビン濃度を決定するために適用される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記グリッド表面の法線方向で測定された、前記三次元グリッド表面から赤血球点のもっとも近い距離を決定することによって、異常な形状の赤血球を識別することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料の個別の赤血球の容積およびヘモグロビン濃度の二変数分布から、前記血液試料における大赤血球、小赤血球、血色素減少細胞、血色素増加細胞、またはそれらの組み合わせのパーセントを定量化することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記三次元グリッド表面から細胞母集団の距離の対称性程度を決定することによって、システム標準化を継続してモニタすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
個別の赤血球の容積Ｖおよびヘモグロビン含有量ＨＣを決定するための三次元光学式方法であって、
ａ）抗凝固全血試料を、球形剤および中性緩衝等張塩水を含む試薬溶液で処理するステップと、
ｂ）前記試料から分離された赤血球を、選択された波長で光路に沿って方向づけられた光ビームを通過させるステップと、
ｃ）各赤血球からの１つの前方角度光散乱信号、１つの光損失信号、および第３の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさを測定するステップと、
ｄ）ＶおよびＨＣのグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、各細胞からの前記光散乱信号の三次元座標を投影するステップと、
ｅ）前記三次元グリッド表面に各投影された交差の場所によって、ＶおよびＨＣの値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項１３】
白血球および赤血球の弁別を同時に決定するための装置であって、
ａ）光路に沿って光のビームを方向づける手段と、
ｂ）細胞を前記光ビームに通過させて、所望の角度間隔の光散乱パターンを作る手段と、
ｃ）所定の角度間隔に対応する、多数の別々の領域を備えた光学式デテクタと、
ｄ）それぞれ前記白血球および赤血球の弁別分析に関して、所望の角度間隔を選択的に分離するための電子プリアンプ手段と、
ｅ）それぞれ前記角度間隔内の散乱した光の強度に対応する、各角度間隔からの信号を同時に生成する手段と、
ｆ）前記赤血球の細胞１つずつに基づいて容積およびヘモグロビン濃度を決定し、かつ前記白血球のサイズおよび複雑度を決定するための手段とを具備する、装置。
【請求項１４】
決定ステップが、複数の前記赤血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記赤血球の各々が、少なくとも第１の前方角度光散乱信号、第２の中間角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号を展開して、容積、ヘモグロビン濃度、および赤血球形状異常度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
決定ステップが、複数の前記赤血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記赤血球の各々が、少なくとも１つ光損失信号、第２の中間角度光散乱信号、および第３の側方角度光散乱信号とを展開して、容積、ヘモグロビン濃度、および赤血球形状異常度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
さらなる決定ステップが、各赤血球の成熟度を決定するために、前記赤血球の第４の同時蛍光信号を展開するための手段を含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
決定ステップが、複数の白血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記白血球の各々が、少なくとも第１の前方角度光散乱信号、第２の中間角度光散乱信号、第３の側方角度偏光散乱信号、および第４の側方角度偏光解消散乱信号を展開して、各白血球のサイズ、白血球内部複雑度、および粒度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
決定ステップが、複数の白血球を１度に１つずつ前記光のビームを通過させて、前記白血球の各々が、少なくとも１つの光損失信号、第２の中間角度光散乱信号、第３の側方角度偏光散乱信号、および第４の側方角度偏光解消散乱信号を展開して、各白血球のサイズ、白血球内部複雑度、および粒度を決定することを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１９】
前記光ビームが、４００ｎｍから８００ｎｍの範囲の可視スペクトルから選択される、請求項１３に記載の装置。
【請求項２０】
前記光源が、
ａ）４８８ｎｍでのアルゴンイオンガスレーザと、
ｂ）５３２ｎｍでの固定レーザと、
ｂ）６３２ｎｍでのヘリウムネオンガスレーザと、
ｃ）赤色ダイオードレーザと、
ｄ）緑色ダイオードレーザと、
ｅ）青色ダイオードレーザと
からなる群から選択される、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記球形剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１または１２に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【公開番号】特開２００８−２６８２３０（Ｐ２００８−２６８２３０Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−１５９８７５（Ｐ２００８−１５９８７５）
【出願日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【分割の表示】特願２００３−５０２４５５（Ｐ２００３−５０２４５５）の分割
【原出願日】平成１４年５月３１日（２００２．５．３１）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５９８７５（Ｐ２００８−１５９８７５）
【出願日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【分割の表示】特願２００３−５０２４５５（Ｐ２００３−５０２４５５）の分割
【原出願日】平成１４年５月３１日（２００２．５．３１）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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