光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法
【課題】 ２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル及びラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを提供する。
【解決手段】 ２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステル（１）の一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル（２）の製造方法。
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
【解決手段】 ２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステル（１）の一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル（２）の製造方法。
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、抗菌剤等の医薬品を製造する際の中間体化合物として有用である光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法、及び、光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル、及びその製造方法は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述したとおり、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法は知られていない。一方、上記抗菌剤等の医薬品を製造する際の中間体化合物として、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル等の提供が望まれていた。
本発明者は、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを提供すべく鋭意検討した結果、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステルを特定の酵素により不斉加水分解すると、上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、本発明の（イ）は、下式（２）で示される光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法であって、下式（１）で示される２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステルの一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法を提供するものである。
【０００５】
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
【０００６】
また、本発明の（ロ）は、下式（２’）で示される光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを提供するものである。
［式中、Ｒは上記と同じ定義である。］
【発明の効果】
【０００７】
本発明の（イ）によれば、酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いることによって、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを製造することができる。
また、本発明（ロ）の光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルは、抗菌剤の合成用中間体化合物等として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の（イ）において、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステル（１）［以下、基質ということもある］は、例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（６９），１４５１，（１９８７）に記載の方法に準じて、ナトリウムエチラートの存在下、マロン酸ジエステルとｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステルから製造することができる。
【０００９】
上記の基質は、上記方法以外の方法により製造されたものを使用してもよい。
【００１０】
基質（１）におけるＲは炭素数１〜４のアルキル基を表す。該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
基質（１）におけるＲとしては、エチル基が好ましい。
【００１１】
基質（１）としては、例えば、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジメチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｎ−プロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジイソプロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｎ−ブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジイソブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｓｅｃ−ブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｔｅｒｔ−ブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸エチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−プロピル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソプロピル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−プロピル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソプロピル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソプロピル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−ｎ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−ｎ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−ｎ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−イソブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−イソブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルや２−ｓｅｃ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００１２】
基質（１）の一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えばアルスロバクター属、キャンディダ属、クロモバクテリウム属及びストレプトマイセス属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素が挙げられる。
上記加水分解酵素としては、例えば、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）又はクロモバクテリウム・ビスコサム（Chromobacterium viscosum）等の微生物を起源とする加水分解酵素を挙げることができる。
【００１３】
上記微生物を起源とする加水分解酵素としては、例えばアルスロバクター・グロビフォルミス ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素（エステラーゼ又はリパーゼ）や、次の市販酵素が挙げられる。
キラザイムＬ−２［Candida antarctica由来；ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製］、IndiAge Super L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル(Genencor International)社製］、IndiAge Max L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル社製］及びTransglucosidase L-50［ゼネンコール・インターナショナル社製］等を挙げることができる。
【００１４】
上記のアルスロバクター・グロビフォルミス ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）又はクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素等は、前記微生物から突然変異剤又は紫外線等の処理により産生された突然変異体由来の酵素であってもよく、該微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入されて形質転換された組換え微生物により産生された酵素であってもよい。
また、遺伝子工学的手法により、酵素のアミノ酸配列中における特定のアミノ酸が１個〜数個欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素であってもよい。
【００１５】
酵素をコードする遺伝子が導入されて形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばJ.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)や、１９８９年発行のコールドスプリングハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。より具体的には、特開平７−１６３３６４号公報に記載の方法を挙げることができる。
【００１６】
遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、例えばOlfert Landt（Gene 96 125-128 1990）らの方法を挙げることができる。より具体的には、特開２０００−７８９８８号公報や特開平７−２１３２８０号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼから作製される変異型のエステラーゼ又は変異型のリパーゼ等を挙げることができる。
【００１７】
酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源や無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。
例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸や糖蜜等を挙げることができる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムや尿素等を挙げることができる。
無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルトや亜鉛等の金属の塩酸塩、上記金属の硫酸塩及び前記金属のリン酸塩等が挙げられる。具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウムやリン酸ナトリウム等を使用することができる。また、上記微生物の不斉水解能を高めるために、適宜、オリーブ油若しくはトリブチリン等のトリグリセリド又は上述した基質を培地に添加してもよい。
【００１８】
培養は、通常は、好気的雰囲気で行うのがよく、振とう培養又は通気撹拌培養が好ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３５℃程度であり、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。また、上記基質の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば、固体培養法も採用することができる。
【００１９】
上述した酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、酵素の精製において一般に使用されている方法に従えばよい。
例えば、先ず、超音波処理、ダイノミル処理又はフレンチプレス処理等の方法により、微生物培養物中の菌体を破砕する。次に、得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィー等の一つ又は二つ以上を適宜組合せることによって、目的とする酵素を精製することができる。これらのカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例としては、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）や、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）等を挙げることができる。
【００２０】
酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、及びこれらを処理したもの等の種々の形態で用いることができる。上記の処理したものとは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物又は菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度又は形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、カラギーナンゲル法のような含硫多糖ゲル法、アルギン酸ゲル法、及び寒天ゲル法等の公知の方法により固定化して用いてもよい。
【００２１】
酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択される。
例えば精製酵素や粗酵素を用いる場合、その使用量は上記の基質に対して、通常は０．００１〜２重量倍程度、好ましくは０．００２〜０．５重量倍程度である。
また、微生物培養物、菌体及びそれらの処理物を用いる場合の使用量は、前記基質に対して、通常は０．０１〜２００重量倍程度であり、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００２２】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液等といったリン酸アルカリ金属塩水溶液等の無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等といった酢酸アルカリ金属塩等の有機酸塩の緩衝水溶液等が挙げられる。
水の使用量は、通常は基質に対して０．５モル倍〜２００重量倍の範囲である。
【００２３】
本発明の（イ）における不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒等の有機溶媒の存在下に行ってもよい。
疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテル等の脂肪族エーテル類や、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンやイソオクタン等の炭化水素類等が用いられる。
また、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノールやｎ−ブタノール等のアルコール類、テトラヒドロフラン等の脂環式エーテル類、ジメチルスルホキサイド等のスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類や、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類等が挙げられる。
これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒は、それぞれ単独で、又は２種以上を混合して用いられる。また、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを混合して用いてもよい。
【００２４】
上記の有機溶媒を用いる場合の使用量は、基質に対して、通常は２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍の範囲である。
【００２５】
不斉加水分解反応は、例えば、水、基質及び酵素を混合する方法により行われる。また、有機溶媒を用いる場合には、該有機溶媒、水、基質及び酵素を混合すればよい。
【００２６】
反応系のｐＨは、酵素による不斉加水分解反応が選択性よく進行する値が適宜選択される。反応系のｐＨは、通常４〜１０程度、好ましくは６〜８程度の範囲である。反応中、塩基を加えることにより、ｐＨを上記範囲内に調整してもよい。
上記の塩基としては、例えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウムや炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸カルシウム等のアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウム等のアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウムやリン酸水素２カリウム等のリン酸塩、トリエチルアミンやピリジン等の有機塩基、及びアンモニア等が使用される。
前記の塩基は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。塩基は通常は水溶液として添加されるが、有機溶媒と水の混合物の溶液として添加してもよい。上記の有機溶媒は反応で使用する溶媒と同じものを使用することもできる。さらに、塩基は固体として添加してもよいし、懸濁液として添加してもよい。
【００２７】
不斉加水分解の反応温度は、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、低すぎると反応速度が低下する傾向にある。反応温度は、通常は５〜６５℃程度の範囲であり、好ましくは２０〜５０℃程度の範囲である。
【００２８】
かくして、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル（２）［以下、不斉加水分解モノエステルということもある］を含む反応液が得られるが、反応で使用した酵素や緩衝剤、又は反応が完結しなかったときに残存する基質［以下、残存ジエステルということもある］等と分離するために、さらに後処理操作を行ってもよい。後処理操作としては、例えば、反応液中の溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製する方法や、分液操作により分離精製する方法等が挙げられる。
【００２９】
分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合は、この水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する溶媒を留去により除去した後、分液操作を行ってもよい。
また、不斉加水分解モノエステルを含む液に不溶の酵素や固定化担体等が存在する場合は、これらの酵素や固定化担体を濾過により除去してもよい。
【００３０】
不斉加水分解反応液中に含まれる残存ジエステルの分離は、該残存ジエステルを疎水性有機溶媒によって抽出後、水層と分液すればよい。
上記の抽出に用いる疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルやイソプロピルエーテル等の脂肪族エーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンやイソオクタン等の炭化水素類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼンやオルトジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチルや酢酸ブチル等のエステル類が挙げられる。
不斉加水分解反応時に上記例示の疎水性有機溶媒を使用した場合は、そのまま分液操作を行うこともできる。また、不斉加水分解反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、疎水性有機溶媒又は水の使用量が少ないために容易に分液できない場合には、疎水性有機溶媒及び／又は水を適宜添加した後、静置して分液すればよい。
上記の疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、基質に対して、通常は０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
上述した抽出や分液操作時のｐＨは、通常６〜１２程度の範囲、好ましくは７〜１０程度の範囲である。
【００３１】
不斉加水分解モノエステルと残存ジエステルを分離する際には、液のｐＨを上記範囲に調整するために、適宜、酸や塩基を使用することもできる。上記の酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸やリン酸等の無機酸、該無機酸と金属との酸性塩、酢酸、クエン酸やメタンスルホン酸等の有機酸、及び該有機酸と金属との酸性塩等が挙げられる。また、上記の塩基としては反応時のｐＨ調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。
不斉加水分解モノエステルと残存ジエステルとの分離が不十分な場合は、上述した抽出や分液の操作を複数回繰り返してもよい。
【００３２】
不斉加水分解モノエステルは、上記の抽出操作において水層に存在する。水層に存在する不斉加水分解モノエステルを酵素や緩衝剤等の水溶性成分と分離するには、疎水性有機溶媒を用いて有機層に抽出後、水層と分液すればよい。上記の抽出時に使用する疎水性有機溶媒としては、前述した残存ジエステルを抽出する際に用いた溶媒と同じ溶媒を用いることができる。該疎水性有機溶媒の使用量は、基質に対して、通常は０．１〜２００重量倍程度の範囲であり、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
不斉加水分解モノエステルの抽出時のｐＨは、通常は１〜７程度の範囲、好ましくは２〜５程度の範囲である。抽出時の液性を上記ｐＨ範囲に調整するため、酸及び塩基を適宜使用することもできる。かかる酸及び塩基としては、上述した残存ジエステルと分離する際の分液操作時に用いた酸及び塩基と同じものを用いることができる。
不斉加水分解モノエステルの水層からの抽出量が少ない場合は、抽出操作と分液操作とを、複数回繰り返してもよい。
【００３３】
不斉加水分解モノエステルは、上述の方法で得た油層中の疎水性有機溶媒を留去することにより、単離することができる。不斉加水分解モノエステルは、さらにカラムクロマトグラフィーや再結晶等によって精製されてもよい。
【００３４】
本発明の（イ）によって得られる不斉加水分解モノエステル（２）としては、次の化合物が挙げられる。
（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸メチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−プロピル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソプロピル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−ブチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソブチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｓｅｃ−ブチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｔｅｒｔ−ブチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸メチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−プロピル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソプロピル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−ブチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソブチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｓｅｃ−ブチルや（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｔｅｒｔ−ブチル等。
また、本発明（ロ）の２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エステル（２’）としては、上記例示の光学活性な化合物の他、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸メチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−プロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソプロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−ブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｓｅｃ−ブチルや２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｔｅｒｔ−ブチル等のラセミの化合物が挙げられる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００３６】
参考例１
ｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステルの製造例
【００３７】
シクロペンチルメチルアルコール６５．０ｇ（０．６４９ｍｏｌ）、トルエン３２５ｇ、塩化ｐ−トルエンスルホニル１２３．６ｇ（０．６４９ｍｏｌ）及びトリメチルアミン塩酸塩６．２ｇ（０．０６５ｍｏｌ）を含む混合物を０℃に冷却し、攪拌下に、トリエチルアミン６５．６ｇ（０．６４９ｍｏｌ）を、０〜１０℃で２時間かけて滴下した。２０℃まで昇温後、１５〜２５℃で５時間攪拌した。攪拌終了後、反応マスに水１３０ｇ及び５％塩酸５．１ｇを０〜１０℃で加えてｐＨを１．５〜２．５に調整後、分液した。得られた油層を、水６５ｇ、５％炭酸水素ナトリウム水１９５ｇ及び水６５ｇの順で洗浄し、分液後、減圧下に溶媒を留去してｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステル１６３．２ｇ（含量８９．９％、純分１４６．７ｇ；収率８８．９％）を得た。
【００３８】
参考例２
２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチルの製造例
【００３９】
２１％ナトリウムエトキシドのエタノール溶液３６９．５ｇ（１．１４０ｍｏｌ）及びマロン酸ジエチル１８２．６ｇ（１．１４０ｍｏｌ）を含む混合物中に、参考例１で得たｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステル１６１．４ｇ（純分１４５．０ｇ、０．５７０ｍｏｌ）及びトルエン２１８ｇからなる溶液を、攪拌下に１０〜３０℃で２０分かけて滴下した。２５℃で１５時間攪拌後、８０℃で８時間攪拌した。反応終了後、１０〜３０℃まで冷却し、トルエン２１８ｇ及び水４３５ｇを加えて抽出後、分液した。得られた油層に水１４５ｇ及びトルエン１５０ｇを加えて洗浄後、分液して油層を得た。該油層を水１４５ｇで洗浄後、分液した。次いで、減圧下に溶媒を留去した。濃縮残分を１２０〜１２５℃で減圧下（１Ｔｏｒｒ）に蒸留して、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル１０１．５ｇ（含量９９．８％、純分１０１．４ｇ；収率７３．４％）を得た。
【００４０】
実施例１〜９
光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルの製造例
【００４１】
リン酸水素２カリウム１７．３ｇを水９００ｇに溶解させ、リン酸を加えてｐＨ７．０に調整し、水を加えて１０００ｍｌとしたバッファー水溶液を作製した。別途、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル８．０ｇ（純分８．０ｇ、０．０３３ｍｏｌ）を含むｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル溶液２００ｍｌを作製した。
【００４２】
下記の表１に示した種々の酵素を、それぞれ秤取り（秤取量は下記の表２参照）、これにバッファー水溶液５ｍｌと、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチルのＭＴＢＥ（ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル）溶液１ｍｌを加えた。次に、２５℃で２４時間攪拌後、３．９％リン酸水溶液１ｍｌ、塩化ナトリウム２．０ｇ及びＭＴＢＥ１０ｍｌを加えて混合した。分液後に得た油層を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）を２本連結］にて分析して、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルの転化率と鏡像体過剰率とを求めた。結果を表２に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例１０
（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルの製造例
【００４６】
リン酸水素２カリウム１７．３ｇを水９００ｇに溶解させ、リン酸を加えてｐＨ７．０に調整し、水を加えて１０００ｍｌとしたバッファー水溶液を作製した。
別途、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル８．０ｇ（純分８．０ｇ、０．０３３ｍｏｌ）を含むＭＴＢＥ溶液２００ｍｌを作製した。
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ（特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準じて作製）を含む培養物２．０ｇを秤取り、これにバッファー水溶液５０ｍｌ、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチルのＭＴＢＥ溶液１０ｍｌを加えた。これを２５℃で２４時間攪拌後、３．９％リン酸水溶液１０ｍｌ、塩化ナトリウム２０ｇ及びＭＴＢＥ１００ｍｌを加えて混合した。混合後、分液して得た油層を減圧下に濃縮して溶媒を留去した。濃縮残分（０．３１ｇ）の含量を定量したところ、８９．９％であった（収率７８．８％）。また、ＨＰＬＣ［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）を２本連結］にて鏡像体過剰率を分析したところ、４９．４％ｅｅ（Ｓ）であった。上記の濃縮残分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルを得た。
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）データ
δ：０．９７〜１．１９（ｍ，２Ｈ），１．２６（ｔ，３Ｈ），１．４０〜１．７０（ｍ，４Ｈ），１．７０〜１．８５（ｍ，３Ｈ），１．９２（ｄｄ，２Ｈ），３．４０（ｔ，１Ｈ），４．１９（ｑ，２Ｈ），８．９９（ｂｒ，１Ｈ）
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル、特に光学活性体は、抗菌剤等の合成用中間体化合物として有用である（例えば、ＷＯ２００００６１１３４号公報やＷＯ２００１０１０８３５号公報を参照）。
また、本発明の製造方法によれば、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルが得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、抗菌剤等の医薬品を製造する際の中間体化合物として有用である光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法、及び、光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル、及びその製造方法は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述したとおり、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法は知られていない。一方、上記抗菌剤等の医薬品を製造する際の中間体化合物として、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル等の提供が望まれていた。
本発明者は、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを提供すべく鋭意検討した結果、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステルを特定の酵素により不斉加水分解すると、上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、本発明の（イ）は、下式（２）で示される光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法であって、下式（１）で示される２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステルの一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法を提供するものである。
【０００５】
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
【０００６】
また、本発明の（ロ）は、下式（２’）で示される光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを提供するものである。
［式中、Ｒは上記と同じ定義である。］
【発明の効果】
【０００７】
本発明の（イ）によれば、酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いることによって、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルを製造することができる。
また、本発明（ロ）の光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルは、抗菌剤の合成用中間体化合物等として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の（イ）において、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステル（１）［以下、基質ということもある］は、例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（６９），１４５１，（１９８７）に記載の方法に準じて、ナトリウムエチラートの存在下、マロン酸ジエステルとｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステルから製造することができる。
【０００９】
上記の基質は、上記方法以外の方法により製造されたものを使用してもよい。
【００１０】
基質（１）におけるＲは炭素数１〜４のアルキル基を表す。該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
基質（１）におけるＲとしては、エチル基が好ましい。
【００１１】
基質（１）としては、例えば、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジメチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｎ−プロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジイソプロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｎ−ブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジイソブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｓｅｃ−ブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジｔｅｒｔ−ブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸エチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−プロピル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソプロピル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−メトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−プロピル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソプロピル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−エトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソプロピル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−ｎ−プロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｎ−ブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−イソプロポキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−ｎ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸イソブチル、２−ｎ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−ｎ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−イソブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｓｅｃ−ブチル、２−イソブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルや２−ｓｅｃ−ブトキシカルボニル−３−シクロペンチルプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００１２】
基質（１）の一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えばアルスロバクター属、キャンディダ属、クロモバクテリウム属及びストレプトマイセス属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素が挙げられる。
上記加水分解酵素としては、例えば、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）又はクロモバクテリウム・ビスコサム（Chromobacterium viscosum）等の微生物を起源とする加水分解酵素を挙げることができる。
【００１３】
上記微生物を起源とする加水分解酵素としては、例えばアルスロバクター・グロビフォルミス ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素（エステラーゼ又はリパーゼ）や、次の市販酵素が挙げられる。
キラザイムＬ−２［Candida antarctica由来；ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製］、IndiAge Super L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル(Genencor International)社製］、IndiAge Max L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル社製］及びTransglucosidase L-50［ゼネンコール・インターナショナル社製］等を挙げることができる。
【００１４】
上記のアルスロバクター・グロビフォルミス ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）又はクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素等は、前記微生物から突然変異剤又は紫外線等の処理により産生された突然変異体由来の酵素であってもよく、該微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入されて形質転換された組換え微生物により産生された酵素であってもよい。
また、遺伝子工学的手法により、酵素のアミノ酸配列中における特定のアミノ酸が１個〜数個欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素であってもよい。
【００１５】
酵素をコードする遺伝子が導入されて形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばJ.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)や、１９８９年発行のコールドスプリングハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。より具体的には、特開平７−１６３３６４号公報に記載の方法を挙げることができる。
【００１６】
遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、例えばOlfert Landt（Gene 96 125-128 1990）らの方法を挙げることができる。より具体的には、特開２０００−７８９８８号公報や特開平７−２１３２８０号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼから作製される変異型のエステラーゼ又は変異型のリパーゼ等を挙げることができる。
【００１７】
酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源や無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。
例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸や糖蜜等を挙げることができる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムや尿素等を挙げることができる。
無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルトや亜鉛等の金属の塩酸塩、上記金属の硫酸塩及び前記金属のリン酸塩等が挙げられる。具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウムやリン酸ナトリウム等を使用することができる。また、上記微生物の不斉水解能を高めるために、適宜、オリーブ油若しくはトリブチリン等のトリグリセリド又は上述した基質を培地に添加してもよい。
【００１８】
培養は、通常は、好気的雰囲気で行うのがよく、振とう培養又は通気撹拌培養が好ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３５℃程度であり、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。また、上記基質の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば、固体培養法も採用することができる。
【００１９】
上述した酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、酵素の精製において一般に使用されている方法に従えばよい。
例えば、先ず、超音波処理、ダイノミル処理又はフレンチプレス処理等の方法により、微生物培養物中の菌体を破砕する。次に、得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィー等の一つ又は二つ以上を適宜組合せることによって、目的とする酵素を精製することができる。これらのカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例としては、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）や、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）等を挙げることができる。
【００２０】
酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、及びこれらを処理したもの等の種々の形態で用いることができる。上記の処理したものとは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物又は菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度又は形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、カラギーナンゲル法のような含硫多糖ゲル法、アルギン酸ゲル法、及び寒天ゲル法等の公知の方法により固定化して用いてもよい。
【００２１】
酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択される。
例えば精製酵素や粗酵素を用いる場合、その使用量は上記の基質に対して、通常は０．００１〜２重量倍程度、好ましくは０．００２〜０．５重量倍程度である。
また、微生物培養物、菌体及びそれらの処理物を用いる場合の使用量は、前記基質に対して、通常は０．０１〜２００重量倍程度であり、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００２２】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液等といったリン酸アルカリ金属塩水溶液等の無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等といった酢酸アルカリ金属塩等の有機酸塩の緩衝水溶液等が挙げられる。
水の使用量は、通常は基質に対して０．５モル倍〜２００重量倍の範囲である。
【００２３】
本発明の（イ）における不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒等の有機溶媒の存在下に行ってもよい。
疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテル等の脂肪族エーテル類や、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンやイソオクタン等の炭化水素類等が用いられる。
また、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノールやｎ−ブタノール等のアルコール類、テトラヒドロフラン等の脂環式エーテル類、ジメチルスルホキサイド等のスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類や、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類等が挙げられる。
これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒は、それぞれ単独で、又は２種以上を混合して用いられる。また、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを混合して用いてもよい。
【００２４】
上記の有機溶媒を用いる場合の使用量は、基質に対して、通常は２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍の範囲である。
【００２５】
不斉加水分解反応は、例えば、水、基質及び酵素を混合する方法により行われる。また、有機溶媒を用いる場合には、該有機溶媒、水、基質及び酵素を混合すればよい。
【００２６】
反応系のｐＨは、酵素による不斉加水分解反応が選択性よく進行する値が適宜選択される。反応系のｐＨは、通常４〜１０程度、好ましくは６〜８程度の範囲である。反応中、塩基を加えることにより、ｐＨを上記範囲内に調整してもよい。
上記の塩基としては、例えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウムや炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸カルシウム等のアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウム等のアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウムやリン酸水素２カリウム等のリン酸塩、トリエチルアミンやピリジン等の有機塩基、及びアンモニア等が使用される。
前記の塩基は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。塩基は通常は水溶液として添加されるが、有機溶媒と水の混合物の溶液として添加してもよい。上記の有機溶媒は反応で使用する溶媒と同じものを使用することもできる。さらに、塩基は固体として添加してもよいし、懸濁液として添加してもよい。
【００２７】
不斉加水分解の反応温度は、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、低すぎると反応速度が低下する傾向にある。反応温度は、通常は５〜６５℃程度の範囲であり、好ましくは２０〜５０℃程度の範囲である。
【００２８】
かくして、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル（２）［以下、不斉加水分解モノエステルということもある］を含む反応液が得られるが、反応で使用した酵素や緩衝剤、又は反応が完結しなかったときに残存する基質［以下、残存ジエステルということもある］等と分離するために、さらに後処理操作を行ってもよい。後処理操作としては、例えば、反応液中の溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製する方法や、分液操作により分離精製する方法等が挙げられる。
【００２９】
分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合は、この水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する溶媒を留去により除去した後、分液操作を行ってもよい。
また、不斉加水分解モノエステルを含む液に不溶の酵素や固定化担体等が存在する場合は、これらの酵素や固定化担体を濾過により除去してもよい。
【００３０】
不斉加水分解反応液中に含まれる残存ジエステルの分離は、該残存ジエステルを疎水性有機溶媒によって抽出後、水層と分液すればよい。
上記の抽出に用いる疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルやイソプロピルエーテル等の脂肪族エーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンやイソオクタン等の炭化水素類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼンやオルトジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチルや酢酸ブチル等のエステル類が挙げられる。
不斉加水分解反応時に上記例示の疎水性有機溶媒を使用した場合は、そのまま分液操作を行うこともできる。また、不斉加水分解反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、疎水性有機溶媒又は水の使用量が少ないために容易に分液できない場合には、疎水性有機溶媒及び／又は水を適宜添加した後、静置して分液すればよい。
上記の疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、基質に対して、通常は０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
上述した抽出や分液操作時のｐＨは、通常６〜１２程度の範囲、好ましくは７〜１０程度の範囲である。
【００３１】
不斉加水分解モノエステルと残存ジエステルを分離する際には、液のｐＨを上記範囲に調整するために、適宜、酸や塩基を使用することもできる。上記の酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸やリン酸等の無機酸、該無機酸と金属との酸性塩、酢酸、クエン酸やメタンスルホン酸等の有機酸、及び該有機酸と金属との酸性塩等が挙げられる。また、上記の塩基としては反応時のｐＨ調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。
不斉加水分解モノエステルと残存ジエステルとの分離が不十分な場合は、上述した抽出や分液の操作を複数回繰り返してもよい。
【００３２】
不斉加水分解モノエステルは、上記の抽出操作において水層に存在する。水層に存在する不斉加水分解モノエステルを酵素や緩衝剤等の水溶性成分と分離するには、疎水性有機溶媒を用いて有機層に抽出後、水層と分液すればよい。上記の抽出時に使用する疎水性有機溶媒としては、前述した残存ジエステルを抽出する際に用いた溶媒と同じ溶媒を用いることができる。該疎水性有機溶媒の使用量は、基質に対して、通常は０．１〜２００重量倍程度の範囲であり、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
不斉加水分解モノエステルの抽出時のｐＨは、通常は１〜７程度の範囲、好ましくは２〜５程度の範囲である。抽出時の液性を上記ｐＨ範囲に調整するため、酸及び塩基を適宜使用することもできる。かかる酸及び塩基としては、上述した残存ジエステルと分離する際の分液操作時に用いた酸及び塩基と同じものを用いることができる。
不斉加水分解モノエステルの水層からの抽出量が少ない場合は、抽出操作と分液操作とを、複数回繰り返してもよい。
【００３３】
不斉加水分解モノエステルは、上述の方法で得た油層中の疎水性有機溶媒を留去することにより、単離することができる。不斉加水分解モノエステルは、さらにカラムクロマトグラフィーや再結晶等によって精製されてもよい。
【００３４】
本発明の（イ）によって得られる不斉加水分解モノエステル（２）としては、次の化合物が挙げられる。
（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸メチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−プロピル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソプロピル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−ブチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソブチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｓｅｃ−ブチル、（Ｒ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｔｅｒｔ−ブチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸メチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−プロピル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソプロピル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−ブチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソブチル、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｓｅｃ−ブチルや（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｔｅｒｔ−ブチル等。
また、本発明（ロ）の２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エステル（２’）としては、上記例示の光学活性な化合物の他、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸メチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−プロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソプロピル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｎ−ブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸イソブチル、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｓｅｃ−ブチルや２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ｔｅｒｔ−ブチル等のラセミの化合物が挙げられる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００３６】
参考例１
ｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステルの製造例
【００３７】
シクロペンチルメチルアルコール６５．０ｇ（０．６４９ｍｏｌ）、トルエン３２５ｇ、塩化ｐ−トルエンスルホニル１２３．６ｇ（０．６４９ｍｏｌ）及びトリメチルアミン塩酸塩６．２ｇ（０．０６５ｍｏｌ）を含む混合物を０℃に冷却し、攪拌下に、トリエチルアミン６５．６ｇ（０．６４９ｍｏｌ）を、０〜１０℃で２時間かけて滴下した。２０℃まで昇温後、１５〜２５℃で５時間攪拌した。攪拌終了後、反応マスに水１３０ｇ及び５％塩酸５．１ｇを０〜１０℃で加えてｐＨを１．５〜２．５に調整後、分液した。得られた油層を、水６５ｇ、５％炭酸水素ナトリウム水１９５ｇ及び水６５ｇの順で洗浄し、分液後、減圧下に溶媒を留去してｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステル１６３．２ｇ（含量８９．９％、純分１４６．７ｇ；収率８８．９％）を得た。
【００３８】
参考例２
２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチルの製造例
【００３９】
２１％ナトリウムエトキシドのエタノール溶液３６９．５ｇ（１．１４０ｍｏｌ）及びマロン酸ジエチル１８２．６ｇ（１．１４０ｍｏｌ）を含む混合物中に、参考例１で得たｐ−トルエンスルホン酸シクロペンチルメチルエステル１６１．４ｇ（純分１４５．０ｇ、０．５７０ｍｏｌ）及びトルエン２１８ｇからなる溶液を、攪拌下に１０〜３０℃で２０分かけて滴下した。２５℃で１５時間攪拌後、８０℃で８時間攪拌した。反応終了後、１０〜３０℃まで冷却し、トルエン２１８ｇ及び水４３５ｇを加えて抽出後、分液した。得られた油層に水１４５ｇ及びトルエン１５０ｇを加えて洗浄後、分液して油層を得た。該油層を水１４５ｇで洗浄後、分液した。次いで、減圧下に溶媒を留去した。濃縮残分を１２０〜１２５℃で減圧下（１Ｔｏｒｒ）に蒸留して、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル１０１．５ｇ（含量９９．８％、純分１０１．４ｇ；収率７３．４％）を得た。
【００４０】
実施例１〜９
光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルの製造例
【００４１】
リン酸水素２カリウム１７．３ｇを水９００ｇに溶解させ、リン酸を加えてｐＨ７．０に調整し、水を加えて１０００ｍｌとしたバッファー水溶液を作製した。別途、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル８．０ｇ（純分８．０ｇ、０．０３３ｍｏｌ）を含むｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル溶液２００ｍｌを作製した。
【００４２】
下記の表１に示した種々の酵素を、それぞれ秤取り（秤取量は下記の表２参照）、これにバッファー水溶液５ｍｌと、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチルのＭＴＢＥ（ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル）溶液１ｍｌを加えた。次に、２５℃で２４時間攪拌後、３．９％リン酸水溶液１ｍｌ、塩化ナトリウム２．０ｇ及びＭＴＢＥ１０ｍｌを加えて混合した。分液後に得た油層を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）を２本連結］にて分析して、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルの転化率と鏡像体過剰率とを求めた。結果を表２に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例１０
（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルの製造例
【００４６】
リン酸水素２カリウム１７．３ｇを水９００ｇに溶解させ、リン酸を加えてｐＨ７．０に調整し、水を加えて１０００ｍｌとしたバッファー水溶液を作製した。
別途、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチル８．０ｇ（純分８．０ｇ、０．０３３ｍｏｌ）を含むＭＴＢＥ溶液２００ｍｌを作製した。
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ（特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準じて作製）を含む培養物２．０ｇを秤取り、これにバッファー水溶液５０ｍｌ、２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエチルのＭＴＢＥ溶液１０ｍｌを加えた。これを２５℃で２４時間攪拌後、３．９％リン酸水溶液１０ｍｌ、塩化ナトリウム２０ｇ及びＭＴＢＥ１００ｍｌを加えて混合した。混合後、分液して得た油層を減圧下に濃縮して溶媒を留去した。濃縮残分（０．３１ｇ）の含量を定量したところ、８９．９％であった（収率７８．８％）。また、ＨＰＬＣ［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）を２本連結］にて鏡像体過剰率を分析したところ、４９．４％ｅｅ（Ｓ）であった。上記の濃縮残分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）−２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸エチルを得た。
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）データ
δ：０．９７〜１．１９（ｍ，２Ｈ），１．２６（ｔ，３Ｈ），１．４０〜１．７０（ｍ，４Ｈ），１．７０〜１．８５（ｍ，３Ｈ），１．９２（ｄｄ，２Ｈ），３．４０（ｔ，１Ｈ），４．１９（ｑ，２Ｈ），８．９９（ｂｒ，１Ｈ）
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル、特に光学活性体は、抗菌剤等の合成用中間体化合物として有用である（例えば、ＷＯ２００００６１１３４号公報やＷＯ２００１０１０８３５号公報を参照）。
また、本発明の製造方法によれば、光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルが得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（２）で示される光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法であって、下式（１）で示される２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステルの一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
【請求項２】
式（１）におけるＲが、エチル基である請求項１に記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項３】
酵素が、アルスロバクター（Arthrobacter）属、キャンディダ（Candida）属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属及びストレプトマイセス(Streptomyces)属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項１又は２に記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項４】
酵素が、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）及びクロモバクテリウム・ビスコサム(Chromobacterium viscosum)からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項１〜３のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項５】
酵素が、アルスロバクター・グロビフォルミス ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）及びクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）からなる群より選ばれる株由来のエステラーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項６】
酵素が、キラザイムＬ−２［Candida antarctica由来；ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製］、IndiAge Super L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル(Genencor International)社製］、IndiAge Max L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル社製］及びTransglucosidase L-50［ゼネンコール・インターナショナル社製］からなる群より選ばれる市販の酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項７】
酵素が、請求項３〜６のいずれかに記載の酵素における特定のアミノ酸が１個以上欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項８】
下式（２’）で示される光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル。
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。］
【請求項９】
式（２’）におけるＲが、エチル基である請求項８に記載の光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル。
【請求項１】
下式（２）で示される光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法であって、下式（１）で示される２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸ジエステルの一方のエステル部位を優先的に加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
【請求項２】
式（１）におけるＲが、エチル基である請求項１に記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項３】
酵素が、アルスロバクター（Arthrobacter）属、キャンディダ（Candida）属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属及びストレプトマイセス(Streptomyces)属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項１又は２に記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項４】
酵素が、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）及びクロモバクテリウム・ビスコサム(Chromobacterium viscosum)からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項１〜３のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項５】
酵素が、アルスロバクター・グロビフォルミス ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８）及びクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）からなる群より選ばれる株由来のエステラーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項６】
酵素が、キラザイムＬ−２［Candida antarctica由来；ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製］、IndiAge Super L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル(Genencor International)社製］、IndiAge Max L［Streptomyces sp.由来；ゼネンコール・インターナショナル社製］及びTransglucosidase L-50［ゼネンコール・インターナショナル社製］からなる群より選ばれる市販の酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項７】
酵素が、請求項３〜６のいずれかに記載の酵素における特定のアミノ酸が１個以上欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の光学活性な２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項８】
下式（２’）で示される光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル。
［式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を表す。］
【請求項９】
式（２’）におけるＲが、エチル基である請求項８に記載の光学活性な又はラセミの２−（シクロペンチルメチル）−マロン酸モノエステル。
【公開番号】特開２００６−６１１１２（Ｐ２００６−６１１１２Ａ）
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２４９６４８（Ｐ２００４−２４９６４８）
【出願日】平成１６年８月３０日（２００４．８．３０）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３０日（２００４．８．３０）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
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