光学活性シアンヒドリンの製造方法及び光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法
【課題】高濃度蓄積可能な光学活性シアンヒドリンの効率的な製造方法及び安全かつ高収率である光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供する。
【解決手段】芳香族アルデヒド及びＨＣＮを基質とし、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下、酵素反応により光学活性シアンヒドリンを製造する方法において、
酵素として遺伝子組換え生物を用いて調製したヒドロキシニトリルリアーゼを使用し、反応溶液中の芳香族アルデヒドのモル濃度が０．４ｍｏｌ/ｋｇ以下であり、且つＨＣＮのモル濃度以下となる状態を反応温度−１０〜４０℃、ｐＨ４．０〜７．０で２時間以上維持することにより、光学純度９０％ｅ．ｅ．以上の光学活性シアンヒドリンを反応系内に３５重量％以上蓄積することを特徴とする光学活性シアンヒドリンの製造方法。
【解決手段】芳香族アルデヒド及びＨＣＮを基質とし、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下、酵素反応により光学活性シアンヒドリンを製造する方法において、
酵素として遺伝子組換え生物を用いて調製したヒドロキシニトリルリアーゼを使用し、反応溶液中の芳香族アルデヒドのモル濃度が０．４ｍｏｌ/ｋｇ以下であり、且つＨＣＮのモル濃度以下となる状態を反応温度−１０〜４０℃、ｐＨ４．０〜７．０で２時間以上維持することにより、光学純度９０％ｅ．ｅ．以上の光学活性シアンヒドリンを反応系内に３５重量％以上蓄積することを特徴とする光学活性シアンヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬中間体等として有用な光学活性シアンヒドリン及び光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性シアンヒドリンは、ピレスロイド系農薬製造や医薬合成の光学活性有機合成中間体として有用である。光学活性シアンヒドリンをＨＣＮとカルボニル化合物から直接合成する手段の一つとして、ヒドロキシニトリルリアーゼと呼ばれる酵素を使う合成方法が種々提唱されている。
通常、当該酵素を使う光学活性シアンヒドリンの合成は、酵素と基質のＨＣＮ及びカルボニル化合物を必須要素として含む水系、水―有機溶媒二相系、有機溶媒―微水系又は有機溶媒系で実施されている。反応に用いる有機溶媒としては、水に難溶又は不溶な有機溶媒が使用されている例が多い。特にエーテル系溶媒を使う例が多く知られている。例えば、水−有機溶媒二相系において水と有機溶媒の容量比が５：１〜１：５の間で反応を行うこと（特許文献１）、水−有機溶媒二相系においてエマルジョンが生成するまで攪拌して反応を行うこと（特許文献２）が知られている。
また、カルボニル化合物の存在下、ＨＣＮを滴下しながら反応を行うこと（特許文献３）又はＨＣＮの存在下、温度を維持しながらカルボニル化合物を滴下して反応を行うこと（特許文献４）が知られている。しかし、特許文献１〜４に記載の方法では、いずれも生成したシアンヒドリンの反応系内の蓄積濃度は、３０％未満に過ぎなかった。また、カルボニル化合物１ｍｍｏｌあたりの酵素量も３０〜３００単位と多量に必要であり、工業生産に適した効率の良い方法とは言えなかった。
さらには、高化学純度及び高光学純度光学活性シアンヒドリンは、室温付近で固結する場合があり、固結した場合、光学活性シアンヒドリンの取り扱いが困難になるという問題があった。そのため、高化学純度及び高光学純度光学活性シアンヒドリンの高濃度蓄積可能な製造方法が望まれていた。
一方、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸は、上記光学活性シアンヒドリンを加水分解することにより製造される（非特許文献１〜２、特許文献５、特許文献７〜８）。上記文献の方法は、光学活性シアンヒドリンの製造後、固液分離、溶剤抽出又は相分離により光学活性シアンヒドリンと酵素を分離後、加水分解している。上記方法を含む光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、残存するＨＣＮの存在下、光学活性シアンヒドリン溶液から酵素を分離する工程が必要なため、危険性が高く、収率も低いという問題があった。そのため、安全でかつ収率が高い光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が望まれていた。
【特許文献１】特開平５−３１７０６５号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９８３号公報
【特許文献３】特開２００２−３３０７９１号公報
【特許文献４】特開２００４−５７００５号公報
【特許文献５】特開昭６３−２１９３８８号公報
【特許文献６】国際公開第９８／３０７１１号パンフレット
【特許文献７】特開２００１−３４８３５６号公報
【特許文献８】特開２００２−１４２７９２号公報
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ Ｚｉｅｇｌｅｒ 等，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９０， ５７５−５７８（１９９０）
【非特許文献２】Ｆｒａｎｚ Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ 等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３２， ２６０５−２６０８ （１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、高濃度蓄積した光学活性シアンヒドリンの効率的な製造方法及び安全かつ高収率である光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下の通りである。
（１）カルボニル化合物及びＨＣＮを基質とし、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在
下、酵素反応により光学活性シアンヒドリンを製造する方法において、反応溶液中のカル
ボニル化合物のモル濃度が０．４ｍｏｌ/ｋｇ以下であり、且つＨＣＮのモル濃度以下と
なる状態を維持することを特徴とする光学活性シアンヒドリンの製造方法。（２）最終的
なカルボニル化合物の使用量の１ミリモルあたり１〜２０単位のヒドロキシニトリルリア
ーゼを使用する（１）の方法。（３）（１）又は（２）の方法で得られた光学活性シアン
ヒドリンを加水分解することを含む光学活性α-ヒドロキシカルボン酸の製造方法。（４
）次いで、光学活性α-ヒドロキシカルボン酸を含む溶液を活性炭と接触させた後、濃縮
及び／又は冷却晶析することを含む（３）の方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、高濃度蓄積した光学活性シアンヒドリンを効率的に得られる。また、
安全かつ高収率に光学活性α−ヒドロキシカルボン酸が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明の光学活性シアンヒドリンの製造方法を以下、単に「本シアンヒドリン製造方法」と呼ぶ。
光学活性シアンヒドリンとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれているシアンヒドリン又はいずれか一方の鏡像異性体のみからなるシアンヒドリンをいう。なお、シアンヒドリンがいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合は、光学純度が１００％である。
【０００７】
本シアンヒドリン製造方法の基質であるカルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）で示される化合物である。
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を示す。）炭化水素基中、−ＣＨ２−並びに−ＣＨ３のＣＨ２はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてもよく、＝ＣＨ２は＝Ｏ又は＝Ｓで置換されていて良い。また、−ＣＨ２−のＣ−Ｈ、−ＣＨ３のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ２のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置換されていても良い。さらには、Ｒ１及びＲ２は、共同して２価の基を示してもよい。
【００１０】
上記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。
【００１１】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基等を併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００１２】
上記炭化水素基中、−ＣＨ２−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ３の−ＣＨ２−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ２が＝Ｏ又は＝Ｓに置換すると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ２−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ３のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ２が導入され、＝ＣＨ２のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ３、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置換されると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ２並びにＣ−Ｈにおける置換は、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置換を行った後、なお当該炭素上にＣＨ２又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置換がなされてもよい。更には、前記の置換により、−ＣＨ２−ＣＨ３の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換等もなされる。
ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００１３】
従って、上記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基等環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルケニル基、直鎖状又は分岐状のアルキニル基、直鎖状又は分岐状のアルカジエニル基等、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基等、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基等が挙げられる。
【００１４】
更に詳しくいえば、直鎖状又は分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基等、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基等が挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）等が挙げられる。シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基等が挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基等が挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基等が挙げられる。
【００１５】
上記炭化水素基中のＣＨ２がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置換された基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）等の構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置換するものを意味し、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。上記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；エステル構造のアセトキシ基、プロピオキシ基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基等が挙げられる。 Ｒ１及びＲ２で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。
【００１６】
上記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール、２−ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、２−ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒドが好ましく使用されるが、特に好ましく使用されるのはベンズアルデヒドである。
【００１７】
本シアンヒドリン製造方法に使用する酵素は、ＨＣＮの存在下、カルボニル化合物から
光学活性シアンヒドリンを合成する活性を有する酵素を意味する。そのような酵素として
は、ヒドロキシニトリルリアーゼが挙げられる。Ｒ体のシアンヒドリンを合成するヒドロ
キシニトリルリアーゼ（（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）等のバラ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、アマ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを例示できる。Ｓ体のシアンヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）等のイネ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のトウダイグサ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア（Ｘｉｍｅｎｉａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）等のボロボロノキ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを例示できる。キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列は公知であり、文献等に公開されている（Ｊａｎｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ， Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３１（１９９４）４９６−５０２及びＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｚ２９０９１）。該遺伝子の塩基配列を配列番号２に表す。また、該遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号１に表す。
【００１８】
前記ヒドロキシニトリルリアーゼは、生物組織からの抽出によって調製することができる。また、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換え生物によっても生産し、調整することができる。さらには、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したヒドロキシニトリルリアーゼも、光学活性シアンヒドリンの合成活性を有するものであれば調整することができる。
ヒドロキシニトリルリアーゼの抽出は常法によって行うことができる。抽出した調整物は、反応に悪影響を与えなければ本製造方法の酵素として使用することができる。例えば、調製が容易であることから、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いて調整するヒドロキシニトリルリアーゼが好ましい。
ヒドロキシニトリルリアーゼの形態は、粉末状酵素、緩衝液等に溶解させた酵素水溶液、適当な担体に固定化してなる固定化酵素等のいずれのものでも使用することができる。調製が容易であることから、緩衝液等に溶解させた酵素水溶液とすることが好ましい。酵素水溶液は、夾雑物を含む懸濁液でも良く、例えば、遺伝子組換え大腸菌を破砕して得られる懸濁液が挙げられる。
【００１９】
本シアンヒドリンの製造方法は、生産性を高めるために、酵素反応を水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下で行う。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、有機溶媒を２５℃で水と重量比１：１に混合した場合に二層に分離する有機溶媒を意味する。有機溶媒は、水と実質的に混和せず、基質及び生成物を充分に溶解し、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限されない。このような有機溶媒は、基質のアルデヒド又はケトンの物性、生成物である光学活性シアンヒドリンの物性に応じて適宜選択する。
【００２０】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていても良い炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム等；ハロゲン化されていても良いアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコール等；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタン等；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられる。これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いても良い。特に、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテルを用いるのが好ましい。
有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和していることが好ましい。水性緩衝液のｐＨは、酵素活性の最適ｐＨとすることが好ましい。ｐＨは、ｐＨ４．０〜７．０で緩衝能を発揮する緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸、酢酸等の塩によって構成される緩衝液等とすることが好ましい。
有機溶媒は、ＨＣＮを予め含んでいてもよく、そのＨＣＮ濃度は、特に制限されない。ＨＣＮを２０質量％以下とすることが好ましく、１０質量％以下とすることが特に好ましい。有機溶媒中のＨＣＮの濃度は、有機溶媒で希釈するか又はＨＣＮを有機溶媒に加えることにより所望の濃度に調整することが好ましい。
【００２１】
酵素反応溶液は、有機溶媒が共存していれば、特に制限されない。酵素反応が進行する溶液、例えば、有機溶媒、有機溶媒及び微水又は水及び有機溶媒の二相溶液等いずれでも良い。水及び有機溶媒の二相溶液とすることが好ましい。
【００２２】
ヒドロキシニトリルリアーゼの使用量は、目的反応が進行する量、例えば、最終的なカルボニル化合物の使用量の１ｍｍｏｌあたり、１〜１０００単位使用するが、ヒドロキシニトリルリアーゼの使用量が少なく経済的であること、また、有機溶剤及び／又は水を留去した後の光学活性シアンヒドリンを含む混合物を鉱酸による加水分解工程に供する場合に生じる着色が少ないことから、最終的なカルボニル化合物の使用量の１ｍｍｏｌあたり１〜２０単位を使用することが好ましく、１〜１０単位を使用することが特に好ましい。
ここで、「最終的なカルボニル化合物の使用量」とは反応開始から反応終了までに使用するカルボニル化合物の全量のことを意味する。１単位（Ｕ； ｕｎｉｔ）とは、ＤＬ−マンデロニトリルを基質として１分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義する。その活性は特表平１１−５０８７７５ 号公報に記載の方法により測定することができる。
【００２３】
反応温度は、−１０〜４０℃とすることが好ましい。この範囲内であると反応系を冷却するためのエネルギー消費量が削減される。また、カルボニル化合物への非酵素的反応でのＨＣＮ付加による光学純度の低下が防止できる。温度は、０〜３０℃とすることがより好ましく、４〜２０℃とすることが特に好ましい。
【００２４】
酵素反応溶液は、水と混和しない有機溶媒及びヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液に対して、ＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物を添加して調製する。酵素反応溶液中のカルボニル化合物の濃度は、０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下に維持する。０．４ｍｏｌ／ｋｇを超えると酵素反応溶液中にカルボニル化合物が高濃度に存在し、ヒドロキシニトリルリアーゼの活性が著しく低下するため、酵素反応溶液中に高い光学純度、例えば９０％ｅ．ｅ．以上で３０重量％以上の光学活性シアンヒドリンを蓄積することが困難となる。また、酵素反応溶液中に滞留するカルボニル化合物の影響による、ヒドロキシニトリルリアーゼの活性低下を防止する点から、酵素反応溶液中のカルボニル化合物のモル濃度がＨＣＮのモル濃度以下である状態を維持することが好ましく、０．２ｍｏｌ／ｋｇ以下とすることが特に好ましい。下限は、１μｍｏｌ／ｋｇ以上に維持することが好ましく、１ｍｍｏｌ／ｋｇ以上とすることが特に好ましい。
【００２５】
酵素反応溶液中のＨＣＮ濃度は特に制限されないが、２０重量％以下とすることが好ましい。酵素反応溶液中のＨＣＮ濃度は、１０重量％以下に維持することがより好ましく、４．５重量％以下とすることが特に好ましい。下限は、酵素反応溶液中のカルボニル化合物のモル濃度を以上であれば良い。酵素反応溶液中のＨＣＮ濃度は、０．０１重量％以上に維持することが好ましい。
例えば、水と混和しない有機溶剤及びヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液中に対して、好ましくはＨＣＮ濃度が１０質量％を超えないように溶液中にＨＣＮを添加する。その後、カルボニル化合物を０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下かつＨＣＮの濃度を下回る濃度に維持しながら添加する。酵素反応溶液中にＨＣＮ及びカルボニル化合物を添加すると、酵素反応によりＨＣＮ及びカルボニル化合物は光学活性シアンヒドリンに変換し、消費される。消費されるＨＣＮ及びカルボニル化合物を補うため、ＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物を逐次添加する。添加方法は、複数回に分けて添加する方法又は連続的に滴下する方法等が挙げられる。カルボニル化合物が０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下かつＨＣＮのモル濃度を下回る状態を維持する。
上述の方法により、光学活性シアンヒドリンは高い光学純度、例えば９０％ｅ．ｅ．以上で、反応系内に３０質量％以上蓄積することができる。この蓄積濃度以上であると、該光学活性シアンヒドリンに対するヒドロキシニトリルリアーゼ及び有機溶剤の使用量が相対的に抑えられ、経済的に有利となる。
【００２６】
反応系内のカルボニル化合物のモル濃度を０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下に維持するために、ＨＰＬＣ分析によって反応系内のカルボニル化合物のモル濃度を測定してカルボニル化合物を添加しても良く、または、反応条件におけるカルボニル化合物の消費速度を予め測定し、その消費速度以下の速度で連続的にカルボニル化合物を添加しても良い。あるいは、予めＨＣＮが好ましくは１０質量％を超えないように反応系内に添加した後、カルボニル化合物及びＨＣＮをそのモル比が１：１又はＨＣＮが小過剰となるよう同時に添加しても良い。あるいは、反応系内のＨＣＮ濃度を滴定し、ＨＣＮ濃度が１０質量％を超えないようにＨＣＮを添加しても良い。
【００２７】
また、ＨＣＮの使用量は、最終的なカルボニル化合物の使用量に対して、１〜４倍モル使用するが、反応後に大量のＨＣＮが酵素反応溶液中に残留せず、安全であることから、ＨＣＮの使用量は、１〜１．５倍モルとすることが好ましい。
【００２８】
反応時間は、酵素反応溶液中の光学活性シアンヒドリンの濃度が３０重量％以上に達するまでの時間以上であれば良い。酵素反応溶液中へのＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物を含む溶液を添加し始めてから添加終了となるまでの時間は、反応熱による急激な温度上昇を防ぐために２時間以上とすることが好ましい。
【００２９】
本シアンヒドリン製造は、ＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物の添加の最中及び／又は添加の終了後、撹拌等により酵素が反応系内に分散するようにする。酵素反応溶液の混合を止め酵素反応を終了する。光学活性シアンヒドリンを含む有機相とヒドロキシニトリルリアーゼを常法により分離するか又はヒドロキシニトリルリアーゼを分離せずに、有機溶剤及び／又は水を留去して光学活性シアンヒドリンを回収する。ヒドロキシニトリルリアーゼを分離することなく、有機溶剤及び／又は水を留去して光学活性シアンヒドリンを回収することが好ましい。この方法で回収すると有機相と酵素との分離工程が省略でき、効率的に光学活性シアンヒドリンを回収できる。また、光学活性シアンヒドリンの固結を防ぐことができる。
【００３０】
ここで、反応溶液から有機溶剤及び／又は水を留去する工程は、光学活性シアンヒドリンが高温で不安定であるため、常圧高温下で実施するよりも、減圧下に比較的低い温度で実施することが好ましい。また、留去工程で、シアンヒドリンの公知の安定化剤を添加しても良い。安定化剤としては濃縮残渣を酸性に維持できるものであれば良い。濃縮残渣とは、有機溶剤、水、酵素及び光学活性シアンヒドリンからなる反応溶液から、有機溶剤及び／又は水を留去した光学活性シアンヒドリン及び酵素の残骸を主成分としたものである。
安定化剤は、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸等の有機酸、硫酸等の無機酸等が挙げられる。光学活性シアンヒドリンに対して安定化剤を１／２００〜１／１０モル添加することが好ましい。
上述の留去工程により、光学活性シアンヒドリンを含む溶液中の光学活性シアンヒドリンの含有率が５０質量％以上とすることが好ましい。含有率が８０重量％以上とすることがより好ましく、９０重量％以上とすることが特に好ましい。
留去工程の減圧度及び温度は、有機溶媒の種類に応じて適宜選択する。通常、ｔ−ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテル等の沸点が約３０〜１００℃付近の溶媒を用いる場合には、蒸留温度を０〜１００℃とすることが好ましい。蒸留温度は、２０〜７０℃とすることがより好ましく、２０〜６０℃とすることが特に好ましい。減圧度は、１〜６００Ｔｏｒｒとすることが好ましく、５〜４００Ｔｏｒｒとすることが特に好ましい。また、留出した溶媒は、溶媒を捕集するのに十分な温度、例えば、１０℃以下に冷却した冷却管を使い捕集する。この方法で行うと効率が良い。
【００３１】
次に、第二の発明について説明する。本カルボン酸製造方法は、有機溶剤及び／又は水を留去した光学活性シアンヒドリンを加水分解することにより行う。加水分解の方法は、例えば、鉱酸を使用する加水分解等が挙げられる。ここで使用する鉱酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸又は過塩素酸等が挙げられる。塩酸を使用することが好ましい。鉱酸の使用量は、光学活性シアンヒドリンに対して０．５〜２０当量とすることが好ましい。使用量は、０．９〜１０当量とすることがより好ましく、１〜５当量とすることが特に好ましい。
【００３２】
加水分解は、反応溶媒を必要に応じて使用しても良い。反応溶媒を使用する場合は、水が好ましい。ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の極性溶媒、トルエン、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素系溶媒又はジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等が共存しても良い。これらの溶媒は混合して用いても良い。
【００３３】
光学活性シアンヒドリンの濃度は、１〜７０質量％とすることが好ましい。この範囲内であると反応速度が速い。濃度は、５〜６０質量％とすることがより好ましく、１０〜５０質量％とすることが特に好ましい。
【００３４】
光学活性シアンヒドリン溶液、鉱酸又は溶媒の添加方法は特に制限されない。光学活性シアンヒドリン溶液を鉱酸中に添加した後、次いで該反応液に溶媒を添加する方法が反応効率が高い点で好ましい。加水分解の反応温度は−５℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、１０〜９０℃とすることがより好ましい。この範囲内であると反応速度が速く、不純物を低減できる。また、光学活性シアンヒドリン溶液を鉱酸中に添加する時の温度と、次いで該反応液に溶媒を添加する時の温度が異なっていても良い。例えば、酵素反応によりシアンヒドリン類を製造し、溶媒を留去した濃縮残渣を含む光学活性シアンヒドリン溶液を、鉱酸中に添加する時の温度は−５℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、１０〜４０℃とすることが特に好ましい。次いで、該反応液に溶媒を添加する時の反応温度は１０℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、３０〜９０℃とすることが特に好ましい。
【００３５】
加水分解により、加水分解の対象である光学活性シアンヒドリン及び中間体であるα−ヒドロキシアミドが高速液体クロマトグラフィーの測定において分析ピークの割合で光学活性α−ヒドロキシカルボン酸に対して１０％以下の状態になった後、反応溶液から光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を単離する。この時の反応溶液は、結晶が析出し、不均一な状態、いわゆるスラリーとなっている場合もある。
次いで、有機溶媒によって光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を抽出し、必要に応じて水洗する。その後、溶媒を蒸発・乾固するか、あるいは反応溶液を必要に応じて濃縮及び／又は冷却して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の結晶を析出させる。析出した結晶を濾別回収する。加水分解終了後は、反応溶液内にＨＣＮが実質的に残存しないため、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶の回収は安全に実施できる。
【００３６】
本カルボン酸製造方法は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶が着色している場合
に、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を溶剤で再溶解した後、活性炭と接触処理して脱色する。また、加水分解溶液を活性炭と接触処理した後、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を単離することで、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶の着色を防ぐこともできる。接触処理の方法としては、特に制限されない。例えば、回分式で実施する場合は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸溶液に活性炭を加えて攪拌することにより接触処理する。連続式で実施する場合は、活性炭を充填したカラム内に光学活性α−ヒドロキシカルボン酸溶液を通して接触処理する。
着色の度合いは、比色管によりＡＰＨＡ標準色と比較することで数値化（ハーゼン色数）
する。接触処理に使用する活性炭の量、処理温度及び処理時間は着色の度合いによって適宜選択する。
【００３７】
接触処理を回分式で実施する場合は、接触処理後、活性炭を濾別する。濾別後、濾液を蒸発・乾固又は濃縮し、冷却晶析することにより光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を回収する。連続式で実施する場合は、活性炭を濾別する必要がないので、接触処理後の光学活性α−ヒドロキシカルボン酸溶液を上述のように回収する。
【００３８】
本カルボン酸製造方法によれば、得られた光学活性シアンヒドリンから煩雑で危険な酵素分離工程を経ずに、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を回収できる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに詳しく説明する。
なお、マンデロニトリル、マンデルアミド、マンデル酸の化学純度及び光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、下記の分析条件で決定した。
＜化学純度＞
試料調製方法： 試料２０ｍｇをキャリヤー２５ｍＬに溶解
装置： カラムオーブン 日本分光社製 ８６５−ＣＯ
ＵＶ 日本分光社製 ８７０−ＵＶ
ポンプ 日本分光社製 ８８０−ＰＵ
インテグレーター 島津製作所社製 Ｃ−Ｒ３Ａ
カラム： ＯＤＳ−２ ＧＬサイエンス社製
キャリヤー： アセトニトリル：水＝３／７（リン酸にてｐＨ３．０に調整）
カラム温度： ４０℃
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
波長： ２２０ｎｍ
＜光学純度＞
試料調製方法： 試料２０ｍｇをキャリヤー２５ｍＬに溶解
装置： カラムオーブン 日本分光社製 ８６５−ＣＯ
ＵＶ 日本分光社製 ８７０−ＵＶ
ポンプ 日本分光社製 ８８０−ＰＵ
インテグレーター 島津製作所社製 Ｃ−Ｒ３Ａ
カラム： ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｈ ダイセル化学工業社製
キャリヤー：ｎ−ヘキサン：２−プロパノール：トリフルオロ酢酸 ＝ ９０：１０：０．１
カラム温度： ３５℃
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
波長： ２２０ｎｍ
検出限界値： ９９．９％ｅｅ
【００４０】
［調整例１］
［ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体の調製］
（１）ＰＣＲによるヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
Ｊａｎｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ， Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３１（１９９４）４９６−５０２及びＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｚ２９０９１記載の塩基配列を元に、配列番号２によって表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈ
ｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）を設計及び合成した。オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した。図１に２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）の位置関係を模式的に表した。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、１００ ｐｍｏｌ／μｌとした。２０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をＰＣＲ−ｍｉｘ（Ｐｗｏ １０×緩衝液、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）に加えた。表１にＰＣＲ反応液の組成を示した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５５サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子をＰＣＲ合成した。この操作を１ｓｔ ＰＣＲとした。
次に、上述の方法で作製した合成遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。この操作を２ｎｄ ＰＣＲとした。上記のＡ、Ｂ、Ｃの反応産物１．３μｌに、５μｌのＰｗｏ １０×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水及び１μｌの外側プライマ−を添加した。外側プライマ−として、Ｆ０１（配列番号３）及びＲ０１（配列番号１３）のプライマ−を用いた。２ｎｄ ＰＣＲは、９４度で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。１．５％アガロ−スゲル電気泳動に該増幅産物を供し、約１ｋｂの増幅産物を確認した。
【００４３】
（２）ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のベクターへの連結
工程（１）で得られた２ｎｄ ＰＣＲの増幅産物のバンド（約１ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）を制限酵素ＢａｍＨＩ（１μｌ）（オリゴヌクレオチドＦ０１中に消化認識部位が含まれる）及びＫｐｎＩ（１μｌ）（オリゴヌクレオチドＲ０１中に消化認識部位が含まれる）で３７℃、１時間消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））］により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで予め消化しておいたベクタ−ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）及びｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を混合してライゲ−ション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることで増幅産物とベクタ−を結合した。
【００４４】
（３）大腸菌 ＪＭ１０９株のコンピテントセルの作製
大腸菌 ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ ＮａＣｌ） １ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養した。該前培養液 ０．４ｍｌを ＳＯＢ培地 ４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。該培養物を遠心分離により集菌（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）し、上澄を除いた。沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液 ３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。
【００４５】
（４）ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のクロ−ニング
作製したコンピテントセル ２００μｌ を工程（２）で作製した該ライゲーション産物１０μｌに加え、０℃で３０分放置した。該コンピテントセルに４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、該コンピテントセルにＳＯＣ 培地（２０ｍＭ グルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ 、２．５ｍＭ ＫＣｌ 、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）１ｍｌを添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。該培養液を ２００μｌ ずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ 、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）にまき、３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ−複数個を １．５ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。該培養液を各々集菌後、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて組換えベクターを回収した。得られた組換えベクターの塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及び蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて解析した。プライマ−は、オリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０を用いた。 配列番号２で表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の塩基配列と同一の配列を有する組換えベクターのひとつをｐＵＭＥと命名した。
【００４６】
（５）発現ベクター組み込み用ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ） 由来ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドを、以下の方法で作製した。まず、ヒドロキシニトリルリア−ゼをコ−ドするＤＮＡ断片が、発現ベクタ−に容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるよう、ＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ １０×バッファ−、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスプライマー（配列番号２３、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位及びヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）及びアンチセンスプライマ−（配列番号２４、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位及びヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の終止コドンを含む）、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクルいった。
【００４７】
センスプライマ−：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２３；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位
を示す）
アンチセンスプライマ−：
ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＡＣＴＴＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＣ（配列番号２４；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８
７Ｉ認識部位を示す）
【００４８】
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化後、ＮｃｏＩによって部分消化した。アガロ−スゲル電気泳動で分離し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）のゲルを切り出した。該ゲル中の増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。
【００４９】
（６） 発現ベクターの調製
次いで、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現用ベクタ−を以下のように調製した。発現用ベクタ−としては、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）を用いた。ｐＫＫ２３３−２（５μｌ）をＨｉｎｄＩＩＩ（１μｌ）で消化後、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ（株））を用いて末端を平滑処理を行った。該処理液を再度フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製した発現ベクタ−（５μｌ）をＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行った。該処理液を再度エタノ−ル沈殿により精製した。精製したベクタ−ＤＮＡ（５μｌ）、アニ−リング済みＳｓｅ８３８７Ｉリン酸化リンカ−ｐＳｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ社製）（５μｌ）及びｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を混合してライゲ−ション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることでリンカ−とベクタ−を結合した。工程（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニ−より組換えベクターを回収した。回収した組換えベクターに対してＳｓｅ８３８７Ｉ消化反応を行い、直鎖状に消化されることが確認されたものをｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）とした。ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）を制限酵素ＮｃｏＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化後、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。
【００５０】
（７）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、及び該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体の作製
工程（５）の方法で得られたヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子ＤＮＡ断片（５μｌ）と工程（６）の方法で作成した発現ベクタ−ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ） （５μｌ）を混合した。該混合液にｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を添加してライゲ−ション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることでリンカ−とベクタ−を結合した。工程（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニ−より組換えベクターを回収した。ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子ＤＮＡ断片が正しく発現ベクタ−に連結された組換えベクターを確認し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現組換えベクターｐＯＸＮ１０３と命名した。同時に、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３を得た。
【００５１】
［調整例２］
［（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液の調製］
培地（２％ 日本製薬社製ポリペプトンＮ、０．５％ オリエンタル酵母社製酵母エキス、０．１５％ リン酸水素２カリウム、０．１ｇ／Ｌ アンピシリンナトリウム、１ｍＭ ＩＰＴＧ）を１００ｍｌ入れた三角フラスコを２０本準備した。調整例１で得られた形質転換（導入）体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３を接種し、３７℃で一晩培養した。培養液の酵素活性は、特表平１１−５０８７７５ 号公報に記載の方法により測定し、４．７７ｕｎｉｔ／ｍＬであった。この培養液２Ｌを遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）して菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸及び７０ｍＭリン酸水素２ナトリウムを含むｐＨ６．０の緩衝液を加えて８０ｍＬの菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所社製 フレンチ・プレス ５５０２ ５６１５Ｌ、１０００ｋｇ／ｃｍ２）で２回処理して菌体を破砕した。その後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間、４℃）により上清を回収し、１３０ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素活性を持つ（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液６０ｍＬを得た。
【００５２】
［実施例１］
（１）（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液２５．４ｍＬ（３３０２単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合し、ＨＣＮ３．５ｇ（０．１２９５ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を１６〜１８℃で充分攪拌しながら、ベンズアルデヒド４ｇ（０．０３７７ｍｏｌ）を添加した。添加して１０分後、ＨＰＬＣによって反応系内のベンズアルデヒド濃度を測定したところ、０．０６３ｍｏｌ／ｋｇ（１０分あたり３．１８ｇのベンズアルデヒドを消費）であった。さらに、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌しながら、１０分あたりＨＣＮ０．８ｇ（０．０２９６ｍｏｌ）及びベンズアルデヒド３ｇ（０．０２８３ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを３時間２０分間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表２に示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
反応終了後、ＨＰＬＣにより反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は３９．５重量％、その光学純度は９８．５％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００５５】
［実施例２］
（１）（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液４４．６ｍＬ（５７９８単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合し、ＨＣＮ５．０ｇ（０．１８５ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を６〜８℃で充分攪拌しながら、ＨＣＮ１．４５ｇ（０．０５３７ｍｏｌ） 及びベンズアルデヒド５．５５ｇ（０．０５２３ｍｏｌ）を添加した。添加して１０分後、ＨＰＬＣによって反応系内のベンズアルデヒド濃度を測定したところ、０．０６０ｍｏｌ／ｋｇ（１０分あたり４．６５ｇのベンズアルデヒドが消費）であった。さらに、反応系内を６〜８℃に維持して充分攪拌しながら、１０分あたりＨＣＮ１．５ｇ（０．０５５６ｍｏｌ） 及びベンズアルデヒド４．５ｇ（０．０４２４ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを３時間２０分間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を６〜８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表３に示した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は４５．０重量％、その光学純度は９８．０％ｅ．ｅ． のＳ体過剰であった。
【００５８】
（２）（Ｓ）−マンデロニトリルの濃縮
実施例２の（１）で得られた反応溶液２６１ｇに、９８％硫酸を０．４ｇ添加した後、エバポレーターで濃縮を行った。９０重量％のマンデロニトリルを含む溶液１３０．５ｇ（ベンズアルデヒドからの収率９８％）が得られた。濃縮後のマンデロニトリル溶液は、水及び有機溶剤に不溶な沈澱を含んでいた。
【００５９】
［実施例３］
（１） （Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液２５．４ｍＬ（３３０２単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合し、ＨＣＮ２４．３ｇ（０．９ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を１６〜１８℃で充分攪拌しながら、ベンズアルデヒド６４ｇ（０．６０３ｍｏｌ）を３時間３０分間かけて滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表４に示した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
反応終了後、ＨＰＬＣにより反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は３７．５重量％、その光学純度は９７．７％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００６２】
［実施例４］
（１）（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成
アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアー
ゼ（シグマ社製ＭＯ６４６（登録商標））２４．３ｍｇ（１３２００単位） を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍＬに溶解させた。次いで、これにｔ−ブチルメチルエーテル１４０ｍＬを混合し、ＨＣＮ３ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を添加した。この混合物を２６〜２８℃で充分攪拌しながら、ＨＣＮ１．３ｇ（０．０４８ｍｏｌ） 及び２−クロロベンズアルデヒド５．３ｇ（０．０３７７ｍｏｌ）を添加した。添加して１０分後、ＨＰＬＣによって反応系内の２−クロロベンズアルデヒド濃度を測定したところ、０．０５７ｍｏｌ／ｋｇ（１０分あたり４．２ｇの２−クロロベンズアルデヒドが消費された）であった。さらに、反応系内を２６〜２８℃に維持して充分攪拌しながら、１０分あたりＨＣＮ１ｇ（０．０３７ｍｏｌ） 及び２−クロロベンズアルデヒド４ｇ（０．０２８４ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及び２−クロロベンズアルデヒドを３時間２０分間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を２６〜２８℃に維持して充分攪拌した。反応系内の２−クロロベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表５に示した。
【００６３】
【表５】
【００６４】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、２−クロロマンデロニトリルの
濃度は４１．４重量％、その光学純度は９１．５％ｅ．ｅ． のＲ体過剰であった。
【００６５】
（２）（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの加水分解
実施例４の（１）で得られた反応溶液２３８ｇに、９８％硫酸を０．４ｇ添加した後、エバポレーターで濃縮を行った。９０重量％の２−クロロマンデロニトリルを含む溶液１０９．５ｇ（２−クロロベンズアルデヒドからの収率８７％）が得られた。濃縮後の２−クロロマンデロニトリル溶液は水及び有機溶剤に不溶な沈澱を含んでいた。次いで、３０〜３５℃で１７時間攪拌しながら３５％塩酸９７ｇに濃縮後の２−クロロマンデロニトリル溶液１０９．５ｇを滴下した。この反応溶液はスラリーであった。１７時間攪拌後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、２−クロロマンデロニトリルは検出されず、２−クロロマンデルアミドと２−クロロマンデル酸が混在していた。１７時間攪拌後の反応溶液の全量に、水を２１３ｇ添加し、７５℃で２時間攪拌して加水分解した。この反応溶液は均一であった。７５℃で２時間攪拌した後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、２−クロロマンデロニトリル、及び２−クロロマンデルアミドは検出されなかった。２−クロロマンデル酸の濃度は２６．８％（２−クロロマンデロニトリルからの収率９３％）、光学純度は９１．５％ｅ．ｅ．のＲ体過剰であった。この反応溶液はわずかに褐色に着色しており、ハーゼン色数は２５０〜３００番であった。
【００６６】
（３）加水分解反応溶液の活性炭による脱色
実施例４の（２）で得られた４１９．５ｇの加水分解反応溶液に、活性炭８ｇ（クラレ製Ｐ−６０Ｗ５； 含水率５０％）を加え、６０℃で２時間攪拌した。その後、活性炭を濾別し、その着色度を比色管で測定した。ハーゼン色数は１５０〜２００番であった。
【００６７】
［実施例５］
（Ｓ）−マンデロニトリルの加水分解
３０〜３５℃で１７時間攪拌しながら、実施例２の（１）で得られたマンデロニトリル溶液１３０．５ｇを３５％塩酸１４６ｇに滴下した。この反応溶液はスラリーであった。１７時間攪拌後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、マンデロニトリルは検出されず、マンデルアミドとマンデル酸が混在していた。１７時間攪拌後の反応溶液の全量に、水を３１９ｇ添加し、７５℃で２時間攪拌し加水分解した。この反応溶液は均一であった。７５℃で２時間攪拌した後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、マンデロニトリル、及びマンデルアミドは検出されず、マンデル酸の濃度は２１．３％（マンデロニトリルからの収率９４．５％）、光学純度は９８．０％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。この反応溶液はわずかに褐色に着色しており、その着色度を比色管で測定した。ハーゼン色数は２００〜２５０番であった。
【００６８】
［実施例６］ 加水分解反応溶液の活性炭による脱色
加水分解反応溶液を実施例５で得られたマンデル酸を含む加水分解反応溶液５９５ｇ、活性炭を１２ｇに変えた以外は実施例４の（３）と同様に行った。ハーゼン色数は８０〜１００番であった。
【００６９】
［実施例７］ 加水分解反応溶液から（Ｓ）−マンデル酸結晶の回収
実施例６で得られた脱色後の加水分解反応溶液のうち５９０ｇを、６０℃から５℃／時間の冷却速度で１５℃まで冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾別し、１０℃の水で洗浄した後、乾燥した。白色のマンデル酸結晶１１４．５ｇが得られ、その化学純度は９７．０％（Ｒ体を含む）、光学純度は９９．５％ ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００７０】
［比較例１］
（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液２５．４ｍＬ（３３０２単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合したものに、ベンズアルデヒド６４ｇ（０．６０３ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を１６〜１８℃で充分攪拌しながら、ＨＣＮ２４．３ｇ （０．９ｍｏｌ）を３時間３０分間かけて滴下した。滴下終了後、
１時間、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定） 及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表６
に示した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は２７．７重量％、その光学純度は７７．５％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００７３】
［比較例２］
（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
１０分あたりＨＣＮ２ｇ（０．０７４ｍｏｌ） 及びベンズアルデヒド６ｇ（０．０５６５ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを１時間４５分間かけて連続的に滴下した以外は実施例１と同様に行った。ＨＣＮ及びベンズアルデヒドの滴下終了後、２時間４５分間充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定） 及びＨＣＮ濃度（
滴定により測定）をモニタリングした結果を表７に示した。
【００７４】
【表７】
【００７５】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は２９．６重量％、その光学純度は８３．１％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００７６】
［比較例３］
（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成
１０分あたりＨＣＮ２ｇ（０．０７４ｍｏｌ） 及び２−クロロベンズアルデヒド８ｇ（０．０５６９ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを１時間４５分間かけて連続的に滴下した以外は実施例４の（１）と同様に行った。ＨＣＮ及び２−クロロベンズアルデヒドの滴下終了後、２時間４５分間充分攪拌した。反応系内の２−クロロベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定） 及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表８に示した。
【００７７】
【表８】
【００７８】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、２−クロロマンデロニトリルの濃度は２７．９重量％、その光学純度は８１．４％ｅ．ｅ． のＲ体過剰であった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＰＣＲによる野生型ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製に用いた２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）の位置関係を模式的に表した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号３〜２４：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬中間体等として有用な光学活性シアンヒドリン及び光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性シアンヒドリンは、ピレスロイド系農薬製造や医薬合成の光学活性有機合成中間体として有用である。光学活性シアンヒドリンをＨＣＮとカルボニル化合物から直接合成する手段の一つとして、ヒドロキシニトリルリアーゼと呼ばれる酵素を使う合成方法が種々提唱されている。
通常、当該酵素を使う光学活性シアンヒドリンの合成は、酵素と基質のＨＣＮ及びカルボニル化合物を必須要素として含む水系、水―有機溶媒二相系、有機溶媒―微水系又は有機溶媒系で実施されている。反応に用いる有機溶媒としては、水に難溶又は不溶な有機溶媒が使用されている例が多い。特にエーテル系溶媒を使う例が多く知られている。例えば、水−有機溶媒二相系において水と有機溶媒の容量比が５：１〜１：５の間で反応を行うこと（特許文献１）、水−有機溶媒二相系においてエマルジョンが生成するまで攪拌して反応を行うこと（特許文献２）が知られている。
また、カルボニル化合物の存在下、ＨＣＮを滴下しながら反応を行うこと（特許文献３）又はＨＣＮの存在下、温度を維持しながらカルボニル化合物を滴下して反応を行うこと（特許文献４）が知られている。しかし、特許文献１〜４に記載の方法では、いずれも生成したシアンヒドリンの反応系内の蓄積濃度は、３０％未満に過ぎなかった。また、カルボニル化合物１ｍｍｏｌあたりの酵素量も３０〜３００単位と多量に必要であり、工業生産に適した効率の良い方法とは言えなかった。
さらには、高化学純度及び高光学純度光学活性シアンヒドリンは、室温付近で固結する場合があり、固結した場合、光学活性シアンヒドリンの取り扱いが困難になるという問題があった。そのため、高化学純度及び高光学純度光学活性シアンヒドリンの高濃度蓄積可能な製造方法が望まれていた。
一方、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸は、上記光学活性シアンヒドリンを加水分解することにより製造される（非特許文献１〜２、特許文献５、特許文献７〜８）。上記文献の方法は、光学活性シアンヒドリンの製造後、固液分離、溶剤抽出又は相分離により光学活性シアンヒドリンと酵素を分離後、加水分解している。上記方法を含む光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、残存するＨＣＮの存在下、光学活性シアンヒドリン溶液から酵素を分離する工程が必要なため、危険性が高く、収率も低いという問題があった。そのため、安全でかつ収率が高い光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が望まれていた。
【特許文献１】特開平５−３１７０６５号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９８３号公報
【特許文献３】特開２００２−３３０７９１号公報
【特許文献４】特開２００４−５７００５号公報
【特許文献５】特開昭６３−２１９３８８号公報
【特許文献６】国際公開第９８／３０７１１号パンフレット
【特許文献７】特開２００１−３４８３５６号公報
【特許文献８】特開２００２−１４２７９２号公報
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ Ｚｉｅｇｌｅｒ 等，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９０， ５７５−５７８（１９９０）
【非特許文献２】Ｆｒａｎｚ Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ 等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３２， ２６０５−２６０８ （１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、高濃度蓄積した光学活性シアンヒドリンの効率的な製造方法及び安全かつ高収率である光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下の通りである。
（１）カルボニル化合物及びＨＣＮを基質とし、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在
下、酵素反応により光学活性シアンヒドリンを製造する方法において、反応溶液中のカル
ボニル化合物のモル濃度が０．４ｍｏｌ/ｋｇ以下であり、且つＨＣＮのモル濃度以下と
なる状態を維持することを特徴とする光学活性シアンヒドリンの製造方法。（２）最終的
なカルボニル化合物の使用量の１ミリモルあたり１〜２０単位のヒドロキシニトリルリア
ーゼを使用する（１）の方法。（３）（１）又は（２）の方法で得られた光学活性シアン
ヒドリンを加水分解することを含む光学活性α-ヒドロキシカルボン酸の製造方法。（４
）次いで、光学活性α-ヒドロキシカルボン酸を含む溶液を活性炭と接触させた後、濃縮
及び／又は冷却晶析することを含む（３）の方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、高濃度蓄積した光学活性シアンヒドリンを効率的に得られる。また、
安全かつ高収率に光学活性α−ヒドロキシカルボン酸が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明の光学活性シアンヒドリンの製造方法を以下、単に「本シアンヒドリン製造方法」と呼ぶ。
光学活性シアンヒドリンとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれているシアンヒドリン又はいずれか一方の鏡像異性体のみからなるシアンヒドリンをいう。なお、シアンヒドリンがいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合は、光学純度が１００％である。
【０００７】
本シアンヒドリン製造方法の基質であるカルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）で示される化合物である。
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を示す。）炭化水素基中、−ＣＨ２−並びに−ＣＨ３のＣＨ２はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてもよく、＝ＣＨ２は＝Ｏ又は＝Ｓで置換されていて良い。また、−ＣＨ２−のＣ−Ｈ、−ＣＨ３のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ２のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置換されていても良い。さらには、Ｒ１及びＲ２は、共同して２価の基を示してもよい。
【００１０】
上記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。
【００１１】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基等を併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００１２】
上記炭化水素基中、−ＣＨ２−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ３の−ＣＨ２−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ２が＝Ｏ又は＝Ｓに置換すると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ２−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ３のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ２が導入され、＝ＣＨ２のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ３、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置換されると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ２並びにＣ−Ｈにおける置換は、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置換を行った後、なお当該炭素上にＣＨ２又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置換がなされてもよい。更には、前記の置換により、−ＣＨ２−ＣＨ３の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換等もなされる。
ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００１３】
従って、上記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基等環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルケニル基、直鎖状又は分岐状のアルキニル基、直鎖状又は分岐状のアルカジエニル基等、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基等、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基等が挙げられる。
【００１４】
更に詳しくいえば、直鎖状又は分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基等、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基等が挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）等が挙げられる。シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基等が挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基等が挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基等が挙げられる。
【００１５】
上記炭化水素基中のＣＨ２がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置換された基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）等の構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置換するものを意味し、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。上記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；エステル構造のアセトキシ基、プロピオキシ基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基等が挙げられる。 Ｒ１及びＲ２で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。
【００１６】
上記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール、２−ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、２−ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒドが好ましく使用されるが、特に好ましく使用されるのはベンズアルデヒドである。
【００１７】
本シアンヒドリン製造方法に使用する酵素は、ＨＣＮの存在下、カルボニル化合物から
光学活性シアンヒドリンを合成する活性を有する酵素を意味する。そのような酵素として
は、ヒドロキシニトリルリアーゼが挙げられる。Ｒ体のシアンヒドリンを合成するヒドロ
キシニトリルリアーゼ（（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）等のバラ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、アマ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを例示できる。Ｓ体のシアンヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）等のイネ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のトウダイグサ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア（Ｘｉｍｅｎｉａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）等のボロボロノキ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを例示できる。キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列は公知であり、文献等に公開されている（Ｊａｎｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ， Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３１（１９９４）４９６−５０２及びＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｚ２９０９１）。該遺伝子の塩基配列を配列番号２に表す。また、該遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号１に表す。
【００１８】
前記ヒドロキシニトリルリアーゼは、生物組織からの抽出によって調製することができる。また、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換え生物によっても生産し、調整することができる。さらには、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したヒドロキシニトリルリアーゼも、光学活性シアンヒドリンの合成活性を有するものであれば調整することができる。
ヒドロキシニトリルリアーゼの抽出は常法によって行うことができる。抽出した調整物は、反応に悪影響を与えなければ本製造方法の酵素として使用することができる。例えば、調製が容易であることから、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いて調整するヒドロキシニトリルリアーゼが好ましい。
ヒドロキシニトリルリアーゼの形態は、粉末状酵素、緩衝液等に溶解させた酵素水溶液、適当な担体に固定化してなる固定化酵素等のいずれのものでも使用することができる。調製が容易であることから、緩衝液等に溶解させた酵素水溶液とすることが好ましい。酵素水溶液は、夾雑物を含む懸濁液でも良く、例えば、遺伝子組換え大腸菌を破砕して得られる懸濁液が挙げられる。
【００１９】
本シアンヒドリンの製造方法は、生産性を高めるために、酵素反応を水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下で行う。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、有機溶媒を２５℃で水と重量比１：１に混合した場合に二層に分離する有機溶媒を意味する。有機溶媒は、水と実質的に混和せず、基質及び生成物を充分に溶解し、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限されない。このような有機溶媒は、基質のアルデヒド又はケトンの物性、生成物である光学活性シアンヒドリンの物性に応じて適宜選択する。
【００２０】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていても良い炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム等；ハロゲン化されていても良いアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコール等；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタン等；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられる。これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いても良い。特に、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテルを用いるのが好ましい。
有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和していることが好ましい。水性緩衝液のｐＨは、酵素活性の最適ｐＨとすることが好ましい。ｐＨは、ｐＨ４．０〜７．０で緩衝能を発揮する緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸、酢酸等の塩によって構成される緩衝液等とすることが好ましい。
有機溶媒は、ＨＣＮを予め含んでいてもよく、そのＨＣＮ濃度は、特に制限されない。ＨＣＮを２０質量％以下とすることが好ましく、１０質量％以下とすることが特に好ましい。有機溶媒中のＨＣＮの濃度は、有機溶媒で希釈するか又はＨＣＮを有機溶媒に加えることにより所望の濃度に調整することが好ましい。
【００２１】
酵素反応溶液は、有機溶媒が共存していれば、特に制限されない。酵素反応が進行する溶液、例えば、有機溶媒、有機溶媒及び微水又は水及び有機溶媒の二相溶液等いずれでも良い。水及び有機溶媒の二相溶液とすることが好ましい。
【００２２】
ヒドロキシニトリルリアーゼの使用量は、目的反応が進行する量、例えば、最終的なカルボニル化合物の使用量の１ｍｍｏｌあたり、１〜１０００単位使用するが、ヒドロキシニトリルリアーゼの使用量が少なく経済的であること、また、有機溶剤及び／又は水を留去した後の光学活性シアンヒドリンを含む混合物を鉱酸による加水分解工程に供する場合に生じる着色が少ないことから、最終的なカルボニル化合物の使用量の１ｍｍｏｌあたり１〜２０単位を使用することが好ましく、１〜１０単位を使用することが特に好ましい。
ここで、「最終的なカルボニル化合物の使用量」とは反応開始から反応終了までに使用するカルボニル化合物の全量のことを意味する。１単位（Ｕ； ｕｎｉｔ）とは、ＤＬ−マンデロニトリルを基質として１分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義する。その活性は特表平１１−５０８７７５ 号公報に記載の方法により測定することができる。
【００２３】
反応温度は、−１０〜４０℃とすることが好ましい。この範囲内であると反応系を冷却するためのエネルギー消費量が削減される。また、カルボニル化合物への非酵素的反応でのＨＣＮ付加による光学純度の低下が防止できる。温度は、０〜３０℃とすることがより好ましく、４〜２０℃とすることが特に好ましい。
【００２４】
酵素反応溶液は、水と混和しない有機溶媒及びヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液に対して、ＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物を添加して調製する。酵素反応溶液中のカルボニル化合物の濃度は、０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下に維持する。０．４ｍｏｌ／ｋｇを超えると酵素反応溶液中にカルボニル化合物が高濃度に存在し、ヒドロキシニトリルリアーゼの活性が著しく低下するため、酵素反応溶液中に高い光学純度、例えば９０％ｅ．ｅ．以上で３０重量％以上の光学活性シアンヒドリンを蓄積することが困難となる。また、酵素反応溶液中に滞留するカルボニル化合物の影響による、ヒドロキシニトリルリアーゼの活性低下を防止する点から、酵素反応溶液中のカルボニル化合物のモル濃度がＨＣＮのモル濃度以下である状態を維持することが好ましく、０．２ｍｏｌ／ｋｇ以下とすることが特に好ましい。下限は、１μｍｏｌ／ｋｇ以上に維持することが好ましく、１ｍｍｏｌ／ｋｇ以上とすることが特に好ましい。
【００２５】
酵素反応溶液中のＨＣＮ濃度は特に制限されないが、２０重量％以下とすることが好ましい。酵素反応溶液中のＨＣＮ濃度は、１０重量％以下に維持することがより好ましく、４．５重量％以下とすることが特に好ましい。下限は、酵素反応溶液中のカルボニル化合物のモル濃度を以上であれば良い。酵素反応溶液中のＨＣＮ濃度は、０．０１重量％以上に維持することが好ましい。
例えば、水と混和しない有機溶剤及びヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液中に対して、好ましくはＨＣＮ濃度が１０質量％を超えないように溶液中にＨＣＮを添加する。その後、カルボニル化合物を０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下かつＨＣＮの濃度を下回る濃度に維持しながら添加する。酵素反応溶液中にＨＣＮ及びカルボニル化合物を添加すると、酵素反応によりＨＣＮ及びカルボニル化合物は光学活性シアンヒドリンに変換し、消費される。消費されるＨＣＮ及びカルボニル化合物を補うため、ＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物を逐次添加する。添加方法は、複数回に分けて添加する方法又は連続的に滴下する方法等が挙げられる。カルボニル化合物が０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下かつＨＣＮのモル濃度を下回る状態を維持する。
上述の方法により、光学活性シアンヒドリンは高い光学純度、例えば９０％ｅ．ｅ．以上で、反応系内に３０質量％以上蓄積することができる。この蓄積濃度以上であると、該光学活性シアンヒドリンに対するヒドロキシニトリルリアーゼ及び有機溶剤の使用量が相対的に抑えられ、経済的に有利となる。
【００２６】
反応系内のカルボニル化合物のモル濃度を０．４ｍｏｌ／ｋｇ以下に維持するために、ＨＰＬＣ分析によって反応系内のカルボニル化合物のモル濃度を測定してカルボニル化合物を添加しても良く、または、反応条件におけるカルボニル化合物の消費速度を予め測定し、その消費速度以下の速度で連続的にカルボニル化合物を添加しても良い。あるいは、予めＨＣＮが好ましくは１０質量％を超えないように反応系内に添加した後、カルボニル化合物及びＨＣＮをそのモル比が１：１又はＨＣＮが小過剰となるよう同時に添加しても良い。あるいは、反応系内のＨＣＮ濃度を滴定し、ＨＣＮ濃度が１０質量％を超えないようにＨＣＮを添加しても良い。
【００２７】
また、ＨＣＮの使用量は、最終的なカルボニル化合物の使用量に対して、１〜４倍モル使用するが、反応後に大量のＨＣＮが酵素反応溶液中に残留せず、安全であることから、ＨＣＮの使用量は、１〜１．５倍モルとすることが好ましい。
【００２８】
反応時間は、酵素反応溶液中の光学活性シアンヒドリンの濃度が３０重量％以上に達するまでの時間以上であれば良い。酵素反応溶液中へのＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物を含む溶液を添加し始めてから添加終了となるまでの時間は、反応熱による急激な温度上昇を防ぐために２時間以上とすることが好ましい。
【００２９】
本シアンヒドリン製造は、ＨＣＮ及び／又はカルボニル化合物の添加の最中及び／又は添加の終了後、撹拌等により酵素が反応系内に分散するようにする。酵素反応溶液の混合を止め酵素反応を終了する。光学活性シアンヒドリンを含む有機相とヒドロキシニトリルリアーゼを常法により分離するか又はヒドロキシニトリルリアーゼを分離せずに、有機溶剤及び／又は水を留去して光学活性シアンヒドリンを回収する。ヒドロキシニトリルリアーゼを分離することなく、有機溶剤及び／又は水を留去して光学活性シアンヒドリンを回収することが好ましい。この方法で回収すると有機相と酵素との分離工程が省略でき、効率的に光学活性シアンヒドリンを回収できる。また、光学活性シアンヒドリンの固結を防ぐことができる。
【００３０】
ここで、反応溶液から有機溶剤及び／又は水を留去する工程は、光学活性シアンヒドリンが高温で不安定であるため、常圧高温下で実施するよりも、減圧下に比較的低い温度で実施することが好ましい。また、留去工程で、シアンヒドリンの公知の安定化剤を添加しても良い。安定化剤としては濃縮残渣を酸性に維持できるものであれば良い。濃縮残渣とは、有機溶剤、水、酵素及び光学活性シアンヒドリンからなる反応溶液から、有機溶剤及び／又は水を留去した光学活性シアンヒドリン及び酵素の残骸を主成分としたものである。
安定化剤は、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸等の有機酸、硫酸等の無機酸等が挙げられる。光学活性シアンヒドリンに対して安定化剤を１／２００〜１／１０モル添加することが好ましい。
上述の留去工程により、光学活性シアンヒドリンを含む溶液中の光学活性シアンヒドリンの含有率が５０質量％以上とすることが好ましい。含有率が８０重量％以上とすることがより好ましく、９０重量％以上とすることが特に好ましい。
留去工程の減圧度及び温度は、有機溶媒の種類に応じて適宜選択する。通常、ｔ−ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテル等の沸点が約３０〜１００℃付近の溶媒を用いる場合には、蒸留温度を０〜１００℃とすることが好ましい。蒸留温度は、２０〜７０℃とすることがより好ましく、２０〜６０℃とすることが特に好ましい。減圧度は、１〜６００Ｔｏｒｒとすることが好ましく、５〜４００Ｔｏｒｒとすることが特に好ましい。また、留出した溶媒は、溶媒を捕集するのに十分な温度、例えば、１０℃以下に冷却した冷却管を使い捕集する。この方法で行うと効率が良い。
【００３１】
次に、第二の発明について説明する。本カルボン酸製造方法は、有機溶剤及び／又は水を留去した光学活性シアンヒドリンを加水分解することにより行う。加水分解の方法は、例えば、鉱酸を使用する加水分解等が挙げられる。ここで使用する鉱酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸又は過塩素酸等が挙げられる。塩酸を使用することが好ましい。鉱酸の使用量は、光学活性シアンヒドリンに対して０．５〜２０当量とすることが好ましい。使用量は、０．９〜１０当量とすることがより好ましく、１〜５当量とすることが特に好ましい。
【００３２】
加水分解は、反応溶媒を必要に応じて使用しても良い。反応溶媒を使用する場合は、水が好ましい。ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の極性溶媒、トルエン、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素系溶媒又はジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等が共存しても良い。これらの溶媒は混合して用いても良い。
【００３３】
光学活性シアンヒドリンの濃度は、１〜７０質量％とすることが好ましい。この範囲内であると反応速度が速い。濃度は、５〜６０質量％とすることがより好ましく、１０〜５０質量％とすることが特に好ましい。
【００３４】
光学活性シアンヒドリン溶液、鉱酸又は溶媒の添加方法は特に制限されない。光学活性シアンヒドリン溶液を鉱酸中に添加した後、次いで該反応液に溶媒を添加する方法が反応効率が高い点で好ましい。加水分解の反応温度は−５℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、１０〜９０℃とすることがより好ましい。この範囲内であると反応速度が速く、不純物を低減できる。また、光学活性シアンヒドリン溶液を鉱酸中に添加する時の温度と、次いで該反応液に溶媒を添加する時の温度が異なっていても良い。例えば、酵素反応によりシアンヒドリン類を製造し、溶媒を留去した濃縮残渣を含む光学活性シアンヒドリン溶液を、鉱酸中に添加する時の温度は−５℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、１０〜４０℃とすることが特に好ましい。次いで、該反応液に溶媒を添加する時の反応温度は１０℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、３０〜９０℃とすることが特に好ましい。
【００３５】
加水分解により、加水分解の対象である光学活性シアンヒドリン及び中間体であるα−ヒドロキシアミドが高速液体クロマトグラフィーの測定において分析ピークの割合で光学活性α−ヒドロキシカルボン酸に対して１０％以下の状態になった後、反応溶液から光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を単離する。この時の反応溶液は、結晶が析出し、不均一な状態、いわゆるスラリーとなっている場合もある。
次いで、有機溶媒によって光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を抽出し、必要に応じて水洗する。その後、溶媒を蒸発・乾固するか、あるいは反応溶液を必要に応じて濃縮及び／又は冷却して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の結晶を析出させる。析出した結晶を濾別回収する。加水分解終了後は、反応溶液内にＨＣＮが実質的に残存しないため、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶の回収は安全に実施できる。
【００３６】
本カルボン酸製造方法は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶が着色している場合
に、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を溶剤で再溶解した後、活性炭と接触処理して脱色する。また、加水分解溶液を活性炭と接触処理した後、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を単離することで、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶の着色を防ぐこともできる。接触処理の方法としては、特に制限されない。例えば、回分式で実施する場合は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸溶液に活性炭を加えて攪拌することにより接触処理する。連続式で実施する場合は、活性炭を充填したカラム内に光学活性α−ヒドロキシカルボン酸溶液を通して接触処理する。
着色の度合いは、比色管によりＡＰＨＡ標準色と比較することで数値化（ハーゼン色数）
する。接触処理に使用する活性炭の量、処理温度及び処理時間は着色の度合いによって適宜選択する。
【００３７】
接触処理を回分式で実施する場合は、接触処理後、活性炭を濾別する。濾別後、濾液を蒸発・乾固又は濃縮し、冷却晶析することにより光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を回収する。連続式で実施する場合は、活性炭を濾別する必要がないので、接触処理後の光学活性α−ヒドロキシカルボン酸溶液を上述のように回収する。
【００３８】
本カルボン酸製造方法によれば、得られた光学活性シアンヒドリンから煩雑で危険な酵素分離工程を経ずに、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸結晶を回収できる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに詳しく説明する。
なお、マンデロニトリル、マンデルアミド、マンデル酸の化学純度及び光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、下記の分析条件で決定した。
＜化学純度＞
試料調製方法： 試料２０ｍｇをキャリヤー２５ｍＬに溶解
装置： カラムオーブン 日本分光社製 ８６５−ＣＯ
ＵＶ 日本分光社製 ８７０−ＵＶ
ポンプ 日本分光社製 ８８０−ＰＵ
インテグレーター 島津製作所社製 Ｃ−Ｒ３Ａ
カラム： ＯＤＳ−２ ＧＬサイエンス社製
キャリヤー： アセトニトリル：水＝３／７（リン酸にてｐＨ３．０に調整）
カラム温度： ４０℃
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
波長： ２２０ｎｍ
＜光学純度＞
試料調製方法： 試料２０ｍｇをキャリヤー２５ｍＬに溶解
装置： カラムオーブン 日本分光社製 ８６５−ＣＯ
ＵＶ 日本分光社製 ８７０−ＵＶ
ポンプ 日本分光社製 ８８０−ＰＵ
インテグレーター 島津製作所社製 Ｃ−Ｒ３Ａ
カラム： ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｈ ダイセル化学工業社製
キャリヤー：ｎ−ヘキサン：２−プロパノール：トリフルオロ酢酸 ＝ ９０：１０：０．１
カラム温度： ３５℃
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
波長： ２２０ｎｍ
検出限界値： ９９．９％ｅｅ
【００４０】
［調整例１］
［ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体の調製］
（１）ＰＣＲによるヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
Ｊａｎｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ， Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３１（１９９４）４９６−５０２及びＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｚ２９０９１記載の塩基配列を元に、配列番号２によって表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈ
ｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）を設計及び合成した。オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した。図１に２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）の位置関係を模式的に表した。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、１００ ｐｍｏｌ／μｌとした。２０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をＰＣＲ−ｍｉｘ（Ｐｗｏ １０×緩衝液、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）に加えた。表１にＰＣＲ反応液の組成を示した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５５サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子をＰＣＲ合成した。この操作を１ｓｔ ＰＣＲとした。
次に、上述の方法で作製した合成遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。この操作を２ｎｄ ＰＣＲとした。上記のＡ、Ｂ、Ｃの反応産物１．３μｌに、５μｌのＰｗｏ １０×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水及び１μｌの外側プライマ−を添加した。外側プライマ−として、Ｆ０１（配列番号３）及びＲ０１（配列番号１３）のプライマ−を用いた。２ｎｄ ＰＣＲは、９４度で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。１．５％アガロ−スゲル電気泳動に該増幅産物を供し、約１ｋｂの増幅産物を確認した。
【００４３】
（２）ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のベクターへの連結
工程（１）で得られた２ｎｄ ＰＣＲの増幅産物のバンド（約１ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）を制限酵素ＢａｍＨＩ（１μｌ）（オリゴヌクレオチドＦ０１中に消化認識部位が含まれる）及びＫｐｎＩ（１μｌ）（オリゴヌクレオチドＲ０１中に消化認識部位が含まれる）で３７℃、１時間消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））］により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで予め消化しておいたベクタ−ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）及びｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を混合してライゲ−ション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることで増幅産物とベクタ−を結合した。
【００４４】
（３）大腸菌 ＪＭ１０９株のコンピテントセルの作製
大腸菌 ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ ＮａＣｌ） １ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養した。該前培養液 ０．４ｍｌを ＳＯＢ培地 ４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。該培養物を遠心分離により集菌（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）し、上澄を除いた。沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液 ３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。
【００４５】
（４）ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のクロ−ニング
作製したコンピテントセル ２００μｌ を工程（２）で作製した該ライゲーション産物１０μｌに加え、０℃で３０分放置した。該コンピテントセルに４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、該コンピテントセルにＳＯＣ 培地（２０ｍＭ グルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ 、２．５ｍＭ ＫＣｌ 、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）１ｍｌを添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。該培養液を ２００μｌ ずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ 、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）にまき、３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ−複数個を １．５ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。該培養液を各々集菌後、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて組換えベクターを回収した。得られた組換えベクターの塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及び蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて解析した。プライマ−は、オリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０を用いた。 配列番号２で表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の塩基配列と同一の配列を有する組換えベクターのひとつをｐＵＭＥと命名した。
【００４６】
（５）発現ベクター組み込み用ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ） 由来ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドを、以下の方法で作製した。まず、ヒドロキシニトリルリア−ゼをコ−ドするＤＮＡ断片が、発現ベクタ−に容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるよう、ＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ １０×バッファ−、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスプライマー（配列番号２３、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位及びヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）及びアンチセンスプライマ−（配列番号２４、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位及びヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の終止コドンを含む）、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクルいった。
【００４７】
センスプライマ−：
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２３；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位
を示す）
アンチセンスプライマ−：
ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＡＣＴＴＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＣ（配列番号２４；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８
７Ｉ認識部位を示す）
【００４８】
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化後、ＮｃｏＩによって部分消化した。アガロ−スゲル電気泳動で分離し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）のゲルを切り出した。該ゲル中の増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。
【００４９】
（６） 発現ベクターの調製
次いで、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現用ベクタ−を以下のように調製した。発現用ベクタ−としては、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）を用いた。ｐＫＫ２３３−２（５μｌ）をＨｉｎｄＩＩＩ（１μｌ）で消化後、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ（株））を用いて末端を平滑処理を行った。該処理液を再度フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製した発現ベクタ−（５μｌ）をＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行った。該処理液を再度エタノ−ル沈殿により精製した。精製したベクタ−ＤＮＡ（５μｌ）、アニ−リング済みＳｓｅ８３８７Ｉリン酸化リンカ−ｐＳｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ社製）（５μｌ）及びｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を混合してライゲ−ション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることでリンカ−とベクタ−を結合した。工程（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニ−より組換えベクターを回収した。回収した組換えベクターに対してＳｓｅ８３８７Ｉ消化反応を行い、直鎖状に消化されることが確認されたものをｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）とした。ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）を制限酵素ＮｃｏＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化後、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。
【００５０】
（７）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、及び該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体の作製
工程（５）の方法で得られたヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子ＤＮＡ断片（５μｌ）と工程（６）の方法で作成した発現ベクタ−ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ） （５μｌ）を混合した。該混合液にｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を添加してライゲ−ション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることでリンカ−とベクタ−を結合した。工程（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニ−より組換えベクターを回収した。ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子ＤＮＡ断片が正しく発現ベクタ−に連結された組換えベクターを確認し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現組換えベクターｐＯＸＮ１０３と命名した。同時に、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３を得た。
【００５１】
［調整例２］
［（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液の調製］
培地（２％ 日本製薬社製ポリペプトンＮ、０．５％ オリエンタル酵母社製酵母エキス、０．１５％ リン酸水素２カリウム、０．１ｇ／Ｌ アンピシリンナトリウム、１ｍＭ ＩＰＴＧ）を１００ｍｌ入れた三角フラスコを２０本準備した。調整例１で得られた形質転換（導入）体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３を接種し、３７℃で一晩培養した。培養液の酵素活性は、特表平１１−５０８７７５ 号公報に記載の方法により測定し、４．７７ｕｎｉｔ／ｍＬであった。この培養液２Ｌを遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）して菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸及び７０ｍＭリン酸水素２ナトリウムを含むｐＨ６．０の緩衝液を加えて８０ｍＬの菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所社製 フレンチ・プレス ５５０２ ５６１５Ｌ、１０００ｋｇ／ｃｍ２）で２回処理して菌体を破砕した。その後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間、４℃）により上清を回収し、１３０ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素活性を持つ（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液６０ｍＬを得た。
【００５２】
［実施例１］
（１）（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液２５．４ｍＬ（３３０２単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合し、ＨＣＮ３．５ｇ（０．１２９５ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を１６〜１８℃で充分攪拌しながら、ベンズアルデヒド４ｇ（０．０３７７ｍｏｌ）を添加した。添加して１０分後、ＨＰＬＣによって反応系内のベンズアルデヒド濃度を測定したところ、０．０６３ｍｏｌ／ｋｇ（１０分あたり３．１８ｇのベンズアルデヒドを消費）であった。さらに、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌しながら、１０分あたりＨＣＮ０．８ｇ（０．０２９６ｍｏｌ）及びベンズアルデヒド３ｇ（０．０２８３ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを３時間２０分間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表２に示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
反応終了後、ＨＰＬＣにより反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は３９．５重量％、その光学純度は９８．５％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００５５】
［実施例２］
（１）（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液４４．６ｍＬ（５７９８単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合し、ＨＣＮ５．０ｇ（０．１８５ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を６〜８℃で充分攪拌しながら、ＨＣＮ１．４５ｇ（０．０５３７ｍｏｌ） 及びベンズアルデヒド５．５５ｇ（０．０５２３ｍｏｌ）を添加した。添加して１０分後、ＨＰＬＣによって反応系内のベンズアルデヒド濃度を測定したところ、０．０６０ｍｏｌ／ｋｇ（１０分あたり４．６５ｇのベンズアルデヒドが消費）であった。さらに、反応系内を６〜８℃に維持して充分攪拌しながら、１０分あたりＨＣＮ１．５ｇ（０．０５５６ｍｏｌ） 及びベンズアルデヒド４．５ｇ（０．０４２４ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを３時間２０分間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を６〜８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表３に示した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は４５．０重量％、その光学純度は９８．０％ｅ．ｅ． のＳ体過剰であった。
【００５８】
（２）（Ｓ）−マンデロニトリルの濃縮
実施例２の（１）で得られた反応溶液２６１ｇに、９８％硫酸を０．４ｇ添加した後、エバポレーターで濃縮を行った。９０重量％のマンデロニトリルを含む溶液１３０．５ｇ（ベンズアルデヒドからの収率９８％）が得られた。濃縮後のマンデロニトリル溶液は、水及び有機溶剤に不溶な沈澱を含んでいた。
【００５９】
［実施例３］
（１） （Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液２５．４ｍＬ（３３０２単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合し、ＨＣＮ２４．３ｇ（０．９ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を１６〜１８℃で充分攪拌しながら、ベンズアルデヒド６４ｇ（０．６０３ｍｏｌ）を３時間３０分間かけて滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表４に示した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
反応終了後、ＨＰＬＣにより反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は３７．５重量％、その光学純度は９７．７％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００６２】
［実施例４］
（１）（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成
アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアー
ゼ（シグマ社製ＭＯ６４６（登録商標））２４．３ｍｇ（１３２００単位） を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍＬに溶解させた。次いで、これにｔ−ブチルメチルエーテル１４０ｍＬを混合し、ＨＣＮ３ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を添加した。この混合物を２６〜２８℃で充分攪拌しながら、ＨＣＮ１．３ｇ（０．０４８ｍｏｌ） 及び２−クロロベンズアルデヒド５．３ｇ（０．０３７７ｍｏｌ）を添加した。添加して１０分後、ＨＰＬＣによって反応系内の２−クロロベンズアルデヒド濃度を測定したところ、０．０５７ｍｏｌ／ｋｇ（１０分あたり４．２ｇの２−クロロベンズアルデヒドが消費された）であった。さらに、反応系内を２６〜２８℃に維持して充分攪拌しながら、１０分あたりＨＣＮ１ｇ（０．０３７ｍｏｌ） 及び２−クロロベンズアルデヒド４ｇ（０．０２８４ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及び２−クロロベンズアルデヒドを３時間２０分間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を２６〜２８℃に維持して充分攪拌した。反応系内の２−クロロベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定）及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表５に示した。
【００６３】
【表５】
【００６４】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、２−クロロマンデロニトリルの
濃度は４１．４重量％、その光学純度は９１．５％ｅ．ｅ． のＲ体過剰であった。
【００６５】
（２）（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの加水分解
実施例４の（１）で得られた反応溶液２３８ｇに、９８％硫酸を０．４ｇ添加した後、エバポレーターで濃縮を行った。９０重量％の２−クロロマンデロニトリルを含む溶液１０９．５ｇ（２−クロロベンズアルデヒドからの収率８７％）が得られた。濃縮後の２−クロロマンデロニトリル溶液は水及び有機溶剤に不溶な沈澱を含んでいた。次いで、３０〜３５℃で１７時間攪拌しながら３５％塩酸９７ｇに濃縮後の２−クロロマンデロニトリル溶液１０９．５ｇを滴下した。この反応溶液はスラリーであった。１７時間攪拌後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、２−クロロマンデロニトリルは検出されず、２−クロロマンデルアミドと２−クロロマンデル酸が混在していた。１７時間攪拌後の反応溶液の全量に、水を２１３ｇ添加し、７５℃で２時間攪拌して加水分解した。この反応溶液は均一であった。７５℃で２時間攪拌した後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、２−クロロマンデロニトリル、及び２−クロロマンデルアミドは検出されなかった。２−クロロマンデル酸の濃度は２６．８％（２−クロロマンデロニトリルからの収率９３％）、光学純度は９１．５％ｅ．ｅ．のＲ体過剰であった。この反応溶液はわずかに褐色に着色しており、ハーゼン色数は２５０〜３００番であった。
【００６６】
（３）加水分解反応溶液の活性炭による脱色
実施例４の（２）で得られた４１９．５ｇの加水分解反応溶液に、活性炭８ｇ（クラレ製Ｐ−６０Ｗ５； 含水率５０％）を加え、６０℃で２時間攪拌した。その後、活性炭を濾別し、その着色度を比色管で測定した。ハーゼン色数は１５０〜２００番であった。
【００６７】
［実施例５］
（Ｓ）−マンデロニトリルの加水分解
３０〜３５℃で１７時間攪拌しながら、実施例２の（１）で得られたマンデロニトリル溶液１３０．５ｇを３５％塩酸１４６ｇに滴下した。この反応溶液はスラリーであった。１７時間攪拌後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、マンデロニトリルは検出されず、マンデルアミドとマンデル酸が混在していた。１７時間攪拌後の反応溶液の全量に、水を３１９ｇ添加し、７５℃で２時間攪拌し加水分解した。この反応溶液は均一であった。７５℃で２時間攪拌した後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、マンデロニトリル、及びマンデルアミドは検出されず、マンデル酸の濃度は２１．３％（マンデロニトリルからの収率９４．５％）、光学純度は９８．０％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。この反応溶液はわずかに褐色に着色しており、その着色度を比色管で測定した。ハーゼン色数は２００〜２５０番であった。
【００６８】
［実施例６］ 加水分解反応溶液の活性炭による脱色
加水分解反応溶液を実施例５で得られたマンデル酸を含む加水分解反応溶液５９５ｇ、活性炭を１２ｇに変えた以外は実施例４の（３）と同様に行った。ハーゼン色数は８０〜１００番であった。
【００６９】
［実施例７］ 加水分解反応溶液から（Ｓ）−マンデル酸結晶の回収
実施例６で得られた脱色後の加水分解反応溶液のうち５９０ｇを、６０℃から５℃／時間の冷却速度で１５℃まで冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾別し、１０℃の水で洗浄した後、乾燥した。白色のマンデル酸結晶１１４．５ｇが得られ、その化学純度は９７．０％（Ｒ体を含む）、光学純度は９９．５％ ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００７０】
［比較例１］
（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液２５．４ｍＬ（３３０２単位）とｔ−ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合したものに、ベンズアルデヒド６４ｇ（０．６０３ｍｏｌ）を添加した。次いで、この混合物を１６〜１８℃で充分攪拌しながら、ＨＣＮ２４．３ｇ （０．９ｍｏｌ）を３時間３０分間かけて滴下した。滴下終了後、
１時間、反応系内を１６〜１８℃に維持して充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定） 及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表６
に示した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は２７．７重量％、その光学純度は７７．５％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００７３】
［比較例２］
（Ｓ）−マンデロニトリルの合成
１０分あたりＨＣＮ２ｇ（０．０７４ｍｏｌ） 及びベンズアルデヒド６ｇ（０．０５６５ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを１時間４５分間かけて連続的に滴下した以外は実施例１と同様に行った。ＨＣＮ及びベンズアルデヒドの滴下終了後、２時間４５分間充分攪拌した。反応系内のベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定） 及びＨＣＮ濃度（
滴定により測定）をモニタリングした結果を表７に示した。
【００７４】
【表７】
【００７５】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は２９．６重量％、その光学純度は８３．１％ｅ．ｅ．のＳ体過剰であった。
【００７６】
［比較例３］
（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成
１０分あたりＨＣＮ２ｇ（０．０７４ｍｏｌ） 及び２−クロロベンズアルデヒド８ｇ（０．０５６９ｍｏｌ）の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを１時間４５分間かけて連続的に滴下した以外は実施例４の（１）と同様に行った。ＨＣＮ及び２−クロロベンズアルデヒドの滴下終了後、２時間４５分間充分攪拌した。反応系内の２−クロロベンズアルデヒド濃度（ＨＰＬＣで測定） 及びＨＣＮ濃度（滴定により測定）をモニタリングした結果を表８に示した。
【００７７】
【表８】
【００７８】
反応終了後、ＨＰＬＣにより 反応溶液を分析した結果、２−クロロマンデロニトリルの濃度は２７．９重量％、その光学純度は８１．４％ｅ．ｅ． のＲ体過剰であった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＰＣＲによる野生型ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製に用いた２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）の位置関係を模式的に表した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号３〜２４：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族アルデヒド及びＨＣＮを基質とし、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下、酵素反応により光学活性シアンヒドリンを製造する方法において、
酵素として遺伝子組換え生物を用いて調製したヒドロキシニトリルリアーゼを使用し、反応溶液中の芳香族アルデヒドのモル濃度が０．４ｍｏｌ/ｋｇ以下であり、且つＨＣＮのモル濃度以下となる状態を反応温度−１０〜４０℃、ｐＨ４．０〜７．０で２時間以上維持することにより、光学純度９０％ｅ．ｅ．以上の光学活性シアンヒドリンを反応系内に３５重量％以上蓄積することを特徴とする光学活性シアンヒドリンの製造方法。
【請求項２】
芳香族アルデヒドが、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、２-ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド又は４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法で得られた光学活性シアンヒドリンを加水分解することを含む光学活性α-ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項１】
芳香族アルデヒド及びＨＣＮを基質とし、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下、酵素反応により光学活性シアンヒドリンを製造する方法において、
酵素として遺伝子組換え生物を用いて調製したヒドロキシニトリルリアーゼを使用し、反応溶液中の芳香族アルデヒドのモル濃度が０．４ｍｏｌ/ｋｇ以下であり、且つＨＣＮのモル濃度以下となる状態を反応温度−１０〜４０℃、ｐＨ４．０〜７．０で２時間以上維持することにより、光学純度９０％ｅ．ｅ．以上の光学活性シアンヒドリンを反応系内に３５重量％以上蓄積することを特徴とする光学活性シアンヒドリンの製造方法。
【請求項２】
芳香族アルデヒドが、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、２-ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド又は４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法で得られた光学活性シアンヒドリンを加水分解することを含む光学活性α-ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１０５６７１（Ｐ２０１２−１０５６７１Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−４２００３（Ｐ２０１２−４２００３）
【出願日】平成２４年２月２８日（２０１２．２．２８）
【分割の表示】特願２００５−１３０１６６（Ｐ２００５−１３０１６６）の分割
【原出願日】平成１７年４月２７日（２００５．４．２７）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２８日（２０１２．２．２８）
【分割の表示】特願２００５−１３０１６６（Ｐ２００５−１３０１６６）の分割
【原出願日】平成１７年４月２７日（２００５．４．２７）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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