光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
【課題】高濃度かつ光学純度の高い４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを得る製造方法を提供すること。
【解決手段】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法であって、酵素反応の開始後、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、該方法。
なし
【解決手段】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法であって、酵素反応の開始後、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、該方法。
なし
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法に関する。詳しくは、酵素反応の開始後、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造するに際し、使用される酵素として、ハロヒドリンエポキシダーゼが例示できる。ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物が産生する酵素が知られている。
【０００３】
本出願人らは、先にコリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オウレオバクテリウム属の脱ハロゲン化酵素の作用により、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献１、特許文献２参照）、及びエピハロヒドリンから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献３参照）を提案している。さらに遺伝子組換技術を利用し、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺伝子ＤＮＡを有する組換ベクターを得、この組換ベクターを導入した形質転換体を使用し３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することに成功している（特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献１参照）。
【０００４】
また本出願人らは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼにおいて、ランダム変異導入により改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを有する組換ベクターを得、この組換ベクターを導入した形質転換体を使用し４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することに成功している（特許文献７）。
【０００５】
また、Ｊａｎｓｅｎらはアグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ） ＡＤ１株、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＧＰ１、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＡＤ２が産生するハロヒドリンエポキシダーゼを見出している。アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ） ＡＤ１株においては、その酵素の立体構造を明らかにしている（非特許文献２，３）。
【０００６】
しかしながら、上述の酵素を用いた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法においては、得られる該ニトリルの蓄積濃度は０．１ｍｏｌ／ｋｇ程度と生産性が低い、あるいは得られる該ニトリルの光学純度は９４％ｅ．ｅ．程度と不十分であり、工業的に好適な方法ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２８４０７２２号公報
【特許文献２】特開第２００１−２５３９７号公報
【特許文献３】特許第２８４０７２３号公報
【特許文献４】特許第３０７３０３７号公報
【特許文献５】特許第３０２６３６７号公報
【特許文献６】特開２００８−１７８３８号公報
【特許文献７】ＷＯ２００８／１０８４６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４
【非特許文献２】Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．，２２（１９），４９３３−４９４４，２００３
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、生産性が高く、工業的に好適な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法において、酵素反応の開始後、反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することにより、高濃度かつ高光学純度の光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法であって、酵素反応の開始後、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、該方法。
（２）酵素がハロヒドリンエポキシダーゼである、上記（１）に記載の方法。
（３）ハロヒドリンエポキシダーゼがコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ）に由来するものである、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）ハロヒドリンエポキシダーゼが配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、反応系内に４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを高濃度かつ高光学純度で蓄積させることができる。よって、本発明は、生産性が高く、工業的に好適な光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＴＴ００２の構成図である。
【図２】図２は、表４に記載の反応プロファイルから計算される、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を示すグラフである。
【図３】図３は、表６に記載の反応プロファイルから計算される、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を示すグラフである。
【図４】図４は、表８に記載の反応プロファイルから計算される、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に関して詳細に説明する。
本発明に係る光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法（以下、単に「本製造方法」と称す）とは、水及びハロヒドリンエポキシダーゼを含む反応溶媒中で、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法である。
【００１５】
（１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質であり、特にＬ−カルニチンの合成原料として有用である。４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、下記一般式（１）で表される化合物のことをいう。
【００１６】
【化１】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示す。具体的にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が最も好ましい。＊は不斉炭素を示し、その立体配置は（Ｒ）体、（Ｓ）体のいずれでも構わないが、（Ｒ）体が好ましい。）
【００１７】
具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリルが挙げられ、好ましくは４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
【００１８】
また、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれている４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのこと、または、いずれか一方の鏡像異性体のみからなる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのことをいう。なお、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルがいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合、光学純度１００％という。
【００１９】
ここで、本発明において「光学活性」とは、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている物質の状態、またはいずれか一方の鏡像異性体のみから成っている物質の状態を言う。また、「光学純度」とは、「鏡像異性体過剰率（％ｅ．ｅ．）」にほぼ等しいものであるとし、次式で定義する。
【００２０】
光学純度≒鏡像異性体過剰率=１００×（｜［Ｒ］−［Ｓ］｜）／（［Ｒ］＋［Ｓ］）（％ｅ．ｅ．）
【００２１】
ここで、［Ｒ］及び［Ｓ］は試料中の鏡像異性体のそれぞれの濃度を示す。また、本発明において、「立体選択性」とは、ハロヒドリンエポキシダーゼが、基質から生成物を生成する際に、いずれか一方の鏡像異性体が生成する反応を優先的に触媒する性質を言う。
【００２２】
（２）ハロヒドリンエポキシダーゼ
本製造方法において使用される酵素としては、ハロヒドリンエポキシダーゼが挙げられる。ハロヒドリンエポキシダーゼとは、下記一般式（２）で表される１，３−ジハロ−２−プロパノールを脱ハロゲン化水素し、下記一般式（３）で表されるエピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：４．５．１．−）を意味する。
【００２３】
【化２】
（式中、Ｘ１、Ｘ２はハロゲン原子を示す。フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。）
【００２４】
【化３】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示し、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。）
【００２５】
この酵素を産生する微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｎ-４７０１（ＦＥＲＭ ＢＰ-２６４４）、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.ＧＰ１、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ.ＡＤ２等が挙げられる。
【００２６】
特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｎ-１０７４（ＦＥＲＭ ＢＰ-２６４３）である。
【００２７】
ハロヒドリンエポキシダーゼは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに公表されており、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｎ-１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ）のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＤ９０３５０である。
【００２８】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４株由来のハロヒドリンエポキシダーゼＨｈｅＢについては、その遺伝子（ＨＨＥＢ）が２つの開始コドンを有するため、結果的に、Ｎ末端近傍の８アミノ酸残基の有無のみが異なる２種のハロヒドリンエポキシダーゼが存在することが報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４）。本明細書において、両者（上記２種のハロヒドリンエポキシダーゼ）を区別して称するときは、最初の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号３）からなるＨｈｅＢを「ＨｈｅＢ（１ｓｔ）」と称し、２番目の開始コドン（次に登場するメチオニン）から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１）からなるＨｈｅＢを「ＨｈｅＢ（２ｎｄ）」と称することとし、これらはいずれも野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるものとする。
【００２９】
ＨｈｅＢ（１ｓｔ）をコードする遺伝子（ＨＨＥＢ（１ｓｔ））としては、例えば配列番号７記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。ＨｈｅＢ（２ｎｄ）をコードする遺伝子（ＨＨＥＢ（２ｎｄ））としては、例えば配列番号５記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。
【００３０】
ここで、「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ」とは、自然界の生物より分離され得るハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有する酵素を指し、由来は限定されるものではない。また、当該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失または他のアミノ酸による置換もしくは挿入がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。
【００３１】
本発明の方法においては、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ（ＨｈｅＢ（１ｓｔ）およびＨｈｅＢ（２ｎｄ））だけでなく、配列番号３又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつＨｈｅＢ（１ｓｔ）又はＨｈｅＢ（２ｎｄ）と同等以上の生物学的活性を有するもの、或いは配列番号３又は配列番号１に示すアミノ酸配列と実質的に同一の配列相同性を有し、かつＨｈｅＢ（１ｓｔ）又はＨｈｅＢ（２ｎｄ）と同等以上の生物学的活性を有するもの（以下、「変異型ＨｈｅＢ（１ｓｔ）または変異型ＨｈｅＢ（２ｎｄ）」ともいう）も使用することができる。
【００３２】
本明細書において、「同等の生物学的活性」とは、１，３−ジハロ−２−プロパノールを脱ハロゲン化水素し、エピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性の強さが実質的に同一であることを指す。また、上記「１個若しくは数個」とは、１０以下の整数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度である。
【００３３】
また「実質的に同一の配列相同性」とは、配列番号３又は配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有することをいう。
【００３４】
また、ＨＨＥＢ遺伝子としては、配列番号７又は配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号７又は配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＨｈｅＢ（１ｓｔ）又はＨｈｅＢ（２ｎｄ）と同等以上の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、それぞれ「変異型ＨＨＥＢ（１ｓｔ）」および「変異型ＨＨＥＢ（２ｎｄ）」ともいう）を含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、例えば配列番号７又は配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００３５】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記微生物からの抽出によって調製することができる。また、ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換微生物によっても生産することができる。
【００３６】
酵素の抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはハロヒドリンエポキシダーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換微生物を培養して得られるハロヒドリンエポキシダーゼが、調製が容易なことから好ましく使用される。
【００３７】
また、形質転換に用いる宿主微生物としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）あるいはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に属する微生物が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、他の宿主微生物を用いることも出来る。
【００３８】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、またはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸などの無機酸あるいはその塩、用いられる微生物が利用可能なナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムなどを含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンＢ１、Ｂ２、Ｃ、Ｋ等のビタミン等が必要に応じて適宜添加される。本発明の微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことができる。
【００３９】
培養は１０〜５０℃の温度で、ｐＨ２〜１１の範囲で行われる。微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよい。培養により得られた微生物は、培養液そのまま若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体、若しくは菌体処理物（例えば、菌体破砕物、粗酵素、精製酵素）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物の形で、ハロヒドリンエポキシダーゼとして利用することができる。
【００４０】
（３）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」は、主として遺伝子組換技術を利用し、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して第２番目、７１番目、１２５番目及び１９９番目（ＨｈｅＢ（２ｎｄ））並びに第２番目、７９番目、１３３番目及び２０７番目（ＨｈｅＢ（１ｓｔ））の４つのアミノ酸について置換変異が導入されたアミノ酸配列からなるものであり、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能等が向上したハロヒドリンエポキシダーゼである。
【００４１】
本発明において使用される改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、具体的には、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００４２】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ,７１番目のＰｈｅ，１２５番目のＧｌｎ，および１９９番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ,Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号２）
【００４３】
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ,７１番目のＰｈｅ，１２５番目のＧｌｎ，および１９９番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ,Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列であって、前記第２番目、７１番目、１２５番目、および１９９番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００４４】
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ，第７９番目のＰｈｅ，１３３番目のＧｌｎ，および２０７番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ，Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号４）
【００４５】
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ，７９番目のＰｈｅ，１３３番目のＧｌｎ，および２０７番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ，Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列であって、前記第２番目、７９番目及び１３３番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００４６】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改良型ＨｈｅＢ（２ｎｄ）をコードする遺伝子としては、例えば配列番号６記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。配列番号４記載のアミノ酸配列からなる改良型ＨｈｅＢ（１ｓｔ）をコードする遺伝子としては、例えば配列番号８記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。
【００４７】
本発明において使用する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記（１）〜（４）より選択されるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるものであればよい。
【００４８】
なお、上記（２）および（４）において「１個若しくは数個」とは、１０以下の整数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度を指す。
【００４９】
なお、本発明において、アミノ酸の種類を３文字または１文字のアルファベット表記で表すことがある。さらに、数字の前または前後に、３文字または１文字のアルファベットを配して表記することがあり、この場合は、アミノ酸残基の箇所及び置換前後のアミノ酸の種類を表す。すなわち、数字は、特に断りがない限り、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基（通常はメチオニン）を１番目と定義した場合に、何番目のアミノ酸残基であるかを示すものである。また、数字の前に表示した３文字または１文字のアルファベットは、アミノ酸置換前のアミノ酸の３文字または１文字表記を表し、数字の後に表示した３文字または１文字のアルファベットは、アミノ酸置換が生じた場合の置換後のアミノ酸の３文字または１文字表記を表すものとする。例えば、１２５番目のグルタミン残基は「Ｇｌｎ１２５」または「Ｑ１２５」と表記し、７１番目のフェニルアラニン残基がトリプトファンに置換された場合は「Ｐｈｅ７１Ｔｒｐ」または「Ｆ７１Ｗ」と表記することがある。
【００５０】
（４）シアニドドナー
シアニドドナーとは、反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物を意味し、特に制限されないが、シアン化水素（ＨＣＮ）、シアン化カリウム（ＫＣＮ）、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）、アセトンシアンヒドリン（ＡＣＨ）が例示される。シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムが好ましく使用される。
【００５１】
（５）酵素反応
本製造方法の酵素反応は、水または緩衝液へ、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール及びハロヒドリンエポキシダーゼを反応系に添加することにより開始する。緩衝液としては、例えば、青酸、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示される。その内、青酸とその塩によって構成される緩衝液、トリス緩衝液が好ましい。緩衝剤由来の不純物が混入しない点で、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液が特に好ましい。
【００５２】
上記緩衝液への、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール、ハロヒドリンエポキシダーゼの投入順序については、特に制限されないが、１，３−ジハロ−２−プロパノールとハロヒドリンエポキシダーゼが接触する前に、反応系内にシアニドドナーを存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点、及びエピハロヒドリンの副生を抑えることができる点で好ましい。存在させておくシアニドドナーの濃度は、反応開始時において、０．０１〜１．５ｍｏｌ／ｋｇが好ましく、０．８〜１．５ｍｏｌ／ｋｇがより好ましい。シアニドドナーの濃度は１．５ｍｏｌ／ｋｇを超えると酵素の安定性の観点から好ましくない。
【００５３】
また、シアニドドナーは反応進行により消費されるため、追添加することが好ましい。その場合、反応系内に０．０５ｍｏｌ／ｋｇ以上存在させておくよう、追添加することが好ましいが、酵素の安定性の観点から１．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにすることが好ましい。
【００５４】
シアニドドナーの使用量は、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの１〜２当量とすることが、反応速度の向上、及びシアニドドナーの効率的な利用の観点から好ましい。
【００５５】
ここで、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの量とは、反応開始から反応終了までに使用した１，３−ジハロ−２−プロパノールの全量のことを意味する。
【００５６】
酵素反応時の温度は、０〜３０℃とすることが酵素の安定性が良く、円滑に反応が進行する点から好ましい。
【００５７】
反応が進行するに従い、反応液中にハロゲン化水素が生成するためｐＨが低下していく。よって、反応系内にアルカリを追添加することにより、系内のｐＨを酵素の活性が発揮される領域に調整、維持することが好ましい。そのｐＨは７．０以上とすることが反応の円滑な進行の点から好ましく、８．５以下とすることが副反応の抑制の点から好ましい。
【００５８】
使用するアルカリとしては、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩の水溶液が酵素の活性が発揮されるｐＨ領域にあるものであれば特に制限されず、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニアの、水酸化物あるいは弱酸との塩が例示される。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、シアン化ナトリウム、シアン化カリウムが好ましい。アルカリの使用形態としては、特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液が好ましい。
【００５９】
１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応開始時において０．０１ｍｏｌ／ｋｇ以上となるように予め反応系内に存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点で好ましい。また、１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応開始時において１．５ｍｏｌ／ｋｇ以下、好ましくは１．０ｍｏｌ／ｋｇ以下、より好ましくは０．５ｍｏｌ／ｋｇ以下となるように予め反応系内に存在させておくことが、酵素の安定性の観点で好ましい。
【００６０】
１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応の進行に従って追添加することが高生産性の観点から好ましく、具体的には、酵素反応の開始以降、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持するように間欠的に追添加することが好ましい。
【００６１】
ハロヒドリンエポキシダーゼの使用量は特に制限されず、反応が円滑に進行する量を使用すればよい。例えば、反応開始時において反応液１ｇあたり１Ｕ〜１０００Ｕ使用することができる。ここで、１Ｕ（ユニット）とは、２０℃，ｐＨ８．０の緩衝液中において、１，３−ジクロロ−２−プロパノールから１分間に１μｍｏｌのエピクロロヒドリンを生成することができる酵素量のことを意味する。
【００６２】
反応系内の１，３−ジハロ−２−プロパノール、及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって定量することができる。また、反応系内のシアニドドナーの濃度は、例えば滴定によって定量することができる。これらの定量結果を反応進行の指標として、追添加する１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーの量を決定することができるが、以下に示す方法で１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーの濃度をより容易に管理できる。
【００６３】
つまり、反応開始以降、ｐＨコントローラを用いてｐＨを一定に維持すると、生成したハロゲン化水素と理論上、等ｍｏｌ、すなわち反応により消費された１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーと理論上等ｍｏｌのアルカリが投入される。このアルカリの投入量が反応進行の指標となるので、反応系に１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーを追添加する際の目安とすることができる。
【００６４】
反応時間は、基質等の濃度、酵素濃度、又はその他の反応条件等によって適時選択するが、１〜１２０時間、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは５〜２４時間で反応が終了するように条件を設定する。
【００６５】
上述の方法により、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを反応系内に０．３ｍｏｌ／ｋｇを超えて蓄積させることができる。反応液中に生成、蓄積した光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下で溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）、及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）の定量は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて表１に示す分析条件で行った。
【００６７】
【表１】
【００６８】
反応終了液１００μｌを、上表記載の移動相５ｍｌにより希釈混合した後、上表記載の分析条件により分析を行った。予め、濃度既知のＤＣＰ,ＥＣＨ及びＣＨＢＮ溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ,ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度を求めた。
【００６９】
＜生成ＣＨＢＮの光学純度分析＞
生成ＣＨＢＮの光学純度分析は、ＣＨＢＮをエステル化後、順相系ＨＰＬＣにより行った。順相系ＨＰＬＣ分析条件を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
反応終了液約４００μｌに等量の酢酸エチルを加えて抽出を行った。酢酸エチル相を分取し、少量の無水硫酸マグネシウムを加えて攪拌した。酢酸エチル相を全量なすフラスコに分取してロータリーエバポレータ（東京理化機械）にセットし、５０℃，２５０ｔｏｒｒ，６０分間濃縮した。残存物に２０μｌのジクロロメタンと２０μｌのピリジン、及び２０μｌの（＋）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（以下、（＋）−ＭＴＰＡと称することがある）を添加した。室温で一晩反応させた後、４００μｌのジイソプロピルエーテル（以下、ＩＰＥと称することがある）を添加し、１規定の塩酸を加えて抽出を行った。ＩＰＥ相を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を４００μｌ加えて抽出を行った。ＩＰＥ相を１．５ｍｌチューブに分取し、アスピレータによりＩＰＥ相を揮発させた。残存物をｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝４：１の混合液に懸濁した後、表５に記載の分析条件により分析を行った。（Ｒ）−ＣＨＢＮ−（＋）−ＭＴＰＡエステル及び（Ｓ）−ＣＨＢＮ−（＋）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積比から各濃度を算出し、本明細書において説明した要領（前述）でＣＨＢＮの光学純度を算出した。
【実施例１】
【００７２】
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する組換菌の作製
（１）鋳型プラスミドの作製
鋳型とするプラスミドの作製を以下の通り行った。
まず、配列番号５に示されるハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨＨＥＢ（２ｎｄ）を、配列番号９及び配列番号１０に示されるプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。
【００７３】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（プラスミドｐＳＴ１１１） １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−０９（配列番号９） １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−０７（配列番号１０） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
総量 ５０μｌ
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：４秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＤＨ−０９：ＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＧＣＧ（配列番号９）
ＤＨ−０７：ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＣＴＧ（配列番号１０）
【００７４】
ＤＨ−０９は３３ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の翻訳開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＡでリジンをコードする。
【００７５】
ＤＨ−０７は３２ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ兼ＰｓｔＩ認識部位（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨＨＥＢ（２ｎｄ）終止コドン下流領域を有する。
【００７６】
また、鋳型として用いたｐＳＴ１１１は、特公平５−３１７０６６号公報に記載されており、ｐＳＴ１１１を含む組換えベクターによる大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２２」として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成３（１９９１）年３月１日付けで寄託されている。
【００７７】
熱サイクル処理を行ったＰＣＲ反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により精製した後、ＰＣＲ増幅産物について制限酵素ＢｓｐＨＩとＰｓｔＩで二重消化を行った。消化産物を０．７％アガロースゲル電気泳動で分離後、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。一方、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）））により精製した。これを、上述のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むＰＣＲ増幅産物と混合した後、該混合液にＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでＰＣＲ増幅産物と発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを結合した。
【００７８】
尚、ｐＴｒｃ９９ＡはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ）から購入できる。
【００７９】
次に、後述の方法で作製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル２００μｌに対して上記ライゲーション反応液の全量を添加し、０℃で３０分放置した。
【００８０】
続いて、前記コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液２００μｌを、ＬＢ Ａｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ，２％寒天を含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１％ＮａＣｌ）に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、１．５ｍｌのＬＢ Ａｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて組換プラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解析し、ＰＣＲにおけるエラー変異が生じていないことを確認した。ＰＣＲ増幅由来ＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドをｐＳＴＴ００２と命名し、当該プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９株形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２と命名した。
【００８１】
図１にｐＳＴＴ００２の構造を示す。ｐＳＴＴ００２はベクターｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ（２ｎｄ））を挿入したものである。
【００８２】
なお、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルは以下の方法で作製した。
【００８３】
大腸菌 ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃，５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００８４】
（２）Ｑ１２５Ｔ変異導入
下記の条件でＰＣＲを行ってＱ１２５Ｔ変異を導入した。
【００８５】
反応液組成：
ｐＳＴＴ００２ １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−５１（配列番号１１） １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−５２（配列番号１２） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ２５μｌ
総量 ５０μｌ
反応サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：３０秒を３０サイクル
プライマー：
ＤＨ−５１：ｇｃａｇｃｇａｔｇｃｇｇｔａｃＡＣＣｇａａｇｇｔｇｃｇｃｔｇｇｃｃ（配列番号１１）
ＤＨ−５２：ｇｇｃｃａｇｃｇｃａｃｃｔｔｃＧＧＴｇｔａｃｃｇｃａｔｃｇｃｔｇｃ（配列番号１２）
【００８６】
各反応液にＤｐｎＩを１μｌ添加して３７℃で１時間インキュベートし、ＤｐｎＩ処理液２μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行った。得られた形質転換体からプラスミドを抽出してＤＮＡ配列を確認し、Ｑ１２５Ｔの変異が導入されたプラスミドを得た。得られた変異導入プラスミドをｐＳＴＴ１１８と命名した。
【００８７】
（３）Ｄ１９９Ｈの導入
テンプレートとしてｐＳＴＴ１１８，プライマーとしてＤＨ−１２５およびＤＨ−１２６を使用した以外は実施例１（２）と同様にしてＰＣＲ，形質転換およびプラスミド抽出を行い、Ｑ１２５Ｔ＋Ｄ１９９Ｈ変異を導入したプラスミドを作製した。
【００８８】
プライマー：
ＤＨ−１２５：ｃｇａｇａｇｃａｃｇｃｇｃｔｇｃｔｃｇｃｇｔｔｇｔｔｃｃｔｇ（配列番号１３）
ＤＨ−１２６：ｃａｇｃｇｃｇｔｇｃｔｃｔｃｇｇｇｃａｇｔｃｇｃｇａｇｃｃｇ（配列番号１４）
【００８９】
得られた変異導入プラスミドをｐＳＴＴ２０１と命名した。
【００９０】
（４）Ｆ７１Ｗの導入
テンプレートとしてｐＳＴＴ２０１，プライマーとしてＤＨ−４９およびＤＨ−５０を使用した以外は実施例１（２）と同様にしてＰＣＲ，形質転換およびプラスミド抽出を行い、Ｑ１２５Ｔ＋Ｄ１９９Ｈ＋Ｆ７１Ｗ変異を導入したプラスミドを作製した。
【００９１】
プライマー：
ＤＨ−４９：ｇｃｃｃａｃＴＧＧｇｇｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｇ（配列番号１５）
ＤＨ−５０：ｃａｃｃｃｃＣＣＡｇｔｇｇｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｇａａ（配列番号１６）
【００９２】
得られた変異導入プラスミドをｐＳＴＴ２０６と命名し、当該プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＴＴ２０６と命名した。
【実施例２】
【００９３】
ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
実施例１にて作製した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する組換菌ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ２０６を、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍＬ×２０本植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。
【００９４】
培養菌体を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）を２０ｇになるように加え、懸濁した。この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。
【００９５】
ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１３．５ｍＭであった。すなわち、１０分当たり１３５０μｍｏｌのエピクロロヒドリンが生成したことになり、この菌体懸濁液の活性は菌体懸濁液１ｇあたり５４０Ｕであることがわかった。
【００９６】
この菌体懸濁液を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で菌体懸濁液１ｇあたり４００Ｕになるように希釈した。
【実施例３】
【００９７】
以下の表３に示す条件を初期量として、反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【００９８】
次いで、実施例２の菌体懸濁液７５ｇ（３０．０ｋＵ）を加え、２０℃，ｐＨ８．０で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【００９９】
ｐＨコントロールで使用したＮａＯＨが０．１９ｍｏｌ添加された時点からＤＣＰの追添加を開始し、ｐＨコントロールで使用したＮａＯＨが０．２４３ｍｏｌ添加された時点からＨＣＮの追添加を開始した。ＤＣＰは投入されるＮａＯＨとほぼ等ｍｏｌの割合で、総計０．３９５ｍｏｌ添加した。
【０１００】
なお、収率は以下の方法により算出した。
収率（％）＝ＤＣＰ転化率×ＣＨＢＮ選択率
・ＤＣＰ転化率（％）＝１００−｛（系内全量×ＤＣＰ濃度）／（ＤＣＰ仕込量＋ＤＣＰ累計追加量）｝
・ＣＨＢＮ選択率（％）＝｛（系内全量×ＣＨＢＮ濃度）／（ＤＣＰ仕込量＋ＤＣＰ累計追加量）｝×ＤＣＰ転化率
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
反応プロファイルを表４に示し、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を図２に示す。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
反応１２９０分後のＤＣＰ転化率９５．８％，ＣＨＢＮ選択率９６．７％，Ｒ−ＣＨＢＮ光学純度９７．２％ｅ．ｅ．であった。
【実施例４】
【０１０５】
以下の表５に示す条件を初期量として、反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【０１０６】
次いで、実施例２の菌体懸濁液７９．３ｇ（３１．７ｋＵ）を加え、２０℃，ｐＨ８．０で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【０１０７】
ｐＨコントロール用のＮａＯＨが添加されはじめた時点からＤＣＰの追添加を開始し、ｐＨコントロール用のＮａＯＨが０．０９ｍｏｌ添加された時点からＨＣＮの追添加を開始した。ＤＣＰは投入されるＮａＯＨのｍｏｌ数に対して約０．５〜１当量となるように添加した。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
反応プロファイルを表６に示し、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を図３に示す。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
反応１２９０分後のＤＣＰ転化率９５．２％，ＣＨＢＮ選択率９６．７％，Ｒ−ＣＨＢＮ光学純度９７．２％ｅ．ｅ．であった。
【０１１２】
＜比較例１＞
以下の表７に示す条件を初期量として、反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【０１１３】
次いで、実施例２の菌体懸濁液７７．３ｇ（３０．９ｋＵ）を加え、２０℃，ｐＨ８．０で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【０１１４】
ｐＨコントロール用のＮａＯＨが添加されはじめた時点からＤＣＰ及びＨＣＮの追添加を開始した。ＤＣＰ及びＨＣＮは、投入されるＮａＯＨとほぼ等ｍｏｌの割合で添加した。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
反応プロファイルを表８に示し、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を図４に示す。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
ｐＨコントロール用のＮａＯＨが０．１６２ｍｏｌ添加された時点（反応開始３０分後）で反応の進行が停止した。
【０１１９】
反応１３８０分後のＤＣＰ転化率３４．６％，ＣＨＢＮ選択率９６．４％，Ｒ−ＣＨＢＮ光学純度７８．８％ｅ．ｅ．であった。
【０１２０】
比較例１の結果より、反応液中のＤＣＰ濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超える範囲に保持した場合には、酵素反応が早く終結し、得られる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは少なく、光学純度も低くなることがわかる。一方、実施例３および４の結果より、反応液中のＤＣＰ濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲または０．２ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持した場合には、多くの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが得られ、かつ光学純度も高くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、生産性が高く、工業的に好適な光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号１：ＨｈｅＢ（２ｎｄ）のアミノ酸配列
配列番号２：改良型ＨｈｅＢ（２ｎｄ）のアミノ酸配列
配列番号３：ＨｈｅＢ（１ｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号４：改良型ＨｈｅＢ（１ｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号５：ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の塩基配列
配列番号６：改良型ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の塩基配列
配列番号７：ＨＨＥＢ（１ｓｔ）の塩基配列
配列番号８：改良型ＨＨＥＢ（１ｓｔ）の塩基配列
配列番号９：プライマーＤＨ−０９
配列番号１０：プライマーＤＨ−０７
配列番号１１：プライマーＤＨ−５１
配列番号１２：プライマーＤＨ−５２
配列番号１３：プライマーＤＨ−１２５
配列番号１４：プライマーＤＨ−１２６
配列番号１５：プライマーＤＨ−４９
配列番号１６：プライマーＤＨ−５０
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法に関する。詳しくは、酵素反応の開始後、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造するに際し、使用される酵素として、ハロヒドリンエポキシダーゼが例示できる。ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物が産生する酵素が知られている。
【０００３】
本出願人らは、先にコリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オウレオバクテリウム属の脱ハロゲン化酵素の作用により、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献１、特許文献２参照）、及びエピハロヒドリンから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献３参照）を提案している。さらに遺伝子組換技術を利用し、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のハロヒドリンエポキシダーゼ酵素遺伝子ＤＮＡを有する組換ベクターを得、この組換ベクターを導入した形質転換体を使用し３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することに成功している（特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献１参照）。
【０００４】
また本出願人らは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼにおいて、ランダム変異導入により改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを有する組換ベクターを得、この組換ベクターを導入した形質転換体を使用し４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することに成功している（特許文献７）。
【０００５】
また、Ｊａｎｓｅｎらはアグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ） ＡＤ１株、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＧＰ１、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＡＤ２が産生するハロヒドリンエポキシダーゼを見出している。アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ） ＡＤ１株においては、その酵素の立体構造を明らかにしている（非特許文献２，３）。
【０００６】
しかしながら、上述の酵素を用いた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法においては、得られる該ニトリルの蓄積濃度は０．１ｍｏｌ／ｋｇ程度と生産性が低い、あるいは得られる該ニトリルの光学純度は９４％ｅ．ｅ．程度と不十分であり、工業的に好適な方法ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２８４０７２２号公報
【特許文献２】特開第２００１−２５３９７号公報
【特許文献３】特許第２８４０７２３号公報
【特許文献４】特許第３０７３０３７号公報
【特許文献５】特許第３０２６３６７号公報
【特許文献６】特開２００８−１７８３８号公報
【特許文献７】ＷＯ２００８／１０８４６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４
【非特許文献２】Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．，２２（１９），４９３３−４９４４，２００３
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、生産性が高く、工業的に好適な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法において、酵素反応の開始後、反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することにより、高濃度かつ高光学純度の光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法であって、酵素反応の開始後、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、該方法。
（２）酵素がハロヒドリンエポキシダーゼである、上記（１）に記載の方法。
（３）ハロヒドリンエポキシダーゼがコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ）に由来するものである、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）ハロヒドリンエポキシダーゼが配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、反応系内に４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを高濃度かつ高光学純度で蓄積させることができる。よって、本発明は、生産性が高く、工業的に好適な光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＴＴ００２の構成図である。
【図２】図２は、表４に記載の反応プロファイルから計算される、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を示すグラフである。
【図３】図３は、表６に記載の反応プロファイルから計算される、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を示すグラフである。
【図４】図４は、表８に記載の反応プロファイルから計算される、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に関して詳細に説明する。
本発明に係る光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法（以下、単に「本製造方法」と称す）とは、水及びハロヒドリンエポキシダーゼを含む反応溶媒中で、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応により光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法である。
【００１５】
（１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質であり、特にＬ−カルニチンの合成原料として有用である。４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、下記一般式（１）で表される化合物のことをいう。
【００１６】
【化１】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示す。具体的にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が最も好ましい。＊は不斉炭素を示し、その立体配置は（Ｒ）体、（Ｓ）体のいずれでも構わないが、（Ｒ）体が好ましい。）
【００１７】
具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリルが挙げられ、好ましくは４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
【００１８】
また、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれている４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのこと、または、いずれか一方の鏡像異性体のみからなる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのことをいう。なお、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルがいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合、光学純度１００％という。
【００１９】
ここで、本発明において「光学活性」とは、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている物質の状態、またはいずれか一方の鏡像異性体のみから成っている物質の状態を言う。また、「光学純度」とは、「鏡像異性体過剰率（％ｅ．ｅ．）」にほぼ等しいものであるとし、次式で定義する。
【００２０】
光学純度≒鏡像異性体過剰率=１００×（｜［Ｒ］−［Ｓ］｜）／（［Ｒ］＋［Ｓ］）（％ｅ．ｅ．）
【００２１】
ここで、［Ｒ］及び［Ｓ］は試料中の鏡像異性体のそれぞれの濃度を示す。また、本発明において、「立体選択性」とは、ハロヒドリンエポキシダーゼが、基質から生成物を生成する際に、いずれか一方の鏡像異性体が生成する反応を優先的に触媒する性質を言う。
【００２２】
（２）ハロヒドリンエポキシダーゼ
本製造方法において使用される酵素としては、ハロヒドリンエポキシダーゼが挙げられる。ハロヒドリンエポキシダーゼとは、下記一般式（２）で表される１，３−ジハロ−２−プロパノールを脱ハロゲン化水素し、下記一般式（３）で表されるエピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：４．５．１．−）を意味する。
【００２３】
【化２】
（式中、Ｘ１、Ｘ２はハロゲン原子を示す。フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。）
【００２４】
【化３】
（式中、Ｘはハロゲン原子を示し、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。）
【００２５】
この酵素を産生する微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｎ-４７０１（ＦＥＲＭ ＢＰ-２６４４）、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.ＧＰ１、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ.ＡＤ２等が挙げられる。
【００２６】
特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｎ-１０７４（ＦＥＲＭ ＢＰ-２６４３）である。
【００２７】
ハロヒドリンエポキシダーゼは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに公表されており、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｎ-１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ）のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＤ９０３５０である。
【００２８】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４株由来のハロヒドリンエポキシダーゼＨｈｅＢについては、その遺伝子（ＨＨＥＢ）が２つの開始コドンを有するため、結果的に、Ｎ末端近傍の８アミノ酸残基の有無のみが異なる２種のハロヒドリンエポキシダーゼが存在することが報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４）。本明細書において、両者（上記２種のハロヒドリンエポキシダーゼ）を区別して称するときは、最初の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号３）からなるＨｈｅＢを「ＨｈｅＢ（１ｓｔ）」と称し、２番目の開始コドン（次に登場するメチオニン）から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１）からなるＨｈｅＢを「ＨｈｅＢ（２ｎｄ）」と称することとし、これらはいずれも野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるものとする。
【００２９】
ＨｈｅＢ（１ｓｔ）をコードする遺伝子（ＨＨＥＢ（１ｓｔ））としては、例えば配列番号７記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。ＨｈｅＢ（２ｎｄ）をコードする遺伝子（ＨＨＥＢ（２ｎｄ））としては、例えば配列番号５記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。
【００３０】
ここで、「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ」とは、自然界の生物より分離され得るハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有する酵素を指し、由来は限定されるものではない。また、当該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失または他のアミノ酸による置換もしくは挿入がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。
【００３１】
本発明の方法においては、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ（ＨｈｅＢ（１ｓｔ）およびＨｈｅＢ（２ｎｄ））だけでなく、配列番号３又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつＨｈｅＢ（１ｓｔ）又はＨｈｅＢ（２ｎｄ）と同等以上の生物学的活性を有するもの、或いは配列番号３又は配列番号１に示すアミノ酸配列と実質的に同一の配列相同性を有し、かつＨｈｅＢ（１ｓｔ）又はＨｈｅＢ（２ｎｄ）と同等以上の生物学的活性を有するもの（以下、「変異型ＨｈｅＢ（１ｓｔ）または変異型ＨｈｅＢ（２ｎｄ）」ともいう）も使用することができる。
【００３２】
本明細書において、「同等の生物学的活性」とは、１，３−ジハロ−２−プロパノールを脱ハロゲン化水素し、エピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性の強さが実質的に同一であることを指す。また、上記「１個若しくは数個」とは、１０以下の整数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度である。
【００３３】
また「実質的に同一の配列相同性」とは、配列番号３又は配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有することをいう。
【００３４】
また、ＨＨＥＢ遺伝子としては、配列番号７又は配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号７又は配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＨｈｅＢ（１ｓｔ）又はＨｈｅＢ（２ｎｄ）と同等以上の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、それぞれ「変異型ＨＨＥＢ（１ｓｔ）」および「変異型ＨＨＥＢ（２ｎｄ）」ともいう）を含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、例えば配列番号７又は配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００３５】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記微生物からの抽出によって調製することができる。また、ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換微生物によっても生産することができる。
【００３６】
酵素の抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはハロヒドリンエポキシダーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換微生物を培養して得られるハロヒドリンエポキシダーゼが、調製が容易なことから好ましく使用される。
【００３７】
また、形質転換に用いる宿主微生物としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）あるいはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に属する微生物が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、他の宿主微生物を用いることも出来る。
【００３８】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、またはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸などの無機酸あるいはその塩、用いられる微生物が利用可能なナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムなどを含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンＢ１、Ｂ２、Ｃ、Ｋ等のビタミン等が必要に応じて適宜添加される。本発明の微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことができる。
【００３９】
培養は１０〜５０℃の温度で、ｐＨ２〜１１の範囲で行われる。微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよい。培養により得られた微生物は、培養液そのまま若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体、若しくは菌体処理物（例えば、菌体破砕物、粗酵素、精製酵素）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物の形で、ハロヒドリンエポキシダーゼとして利用することができる。
【００４０】
（３）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」は、主として遺伝子組換技術を利用し、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して第２番目、７１番目、１２５番目及び１９９番目（ＨｈｅＢ（２ｎｄ））並びに第２番目、７９番目、１３３番目及び２０７番目（ＨｈｅＢ（１ｓｔ））の４つのアミノ酸について置換変異が導入されたアミノ酸配列からなるものであり、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能等が向上したハロヒドリンエポキシダーゼである。
【００４１】
本発明において使用される改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、具体的には、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００４２】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ,７１番目のＰｈｅ，１２５番目のＧｌｎ，および１９９番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ,Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号２）
【００４３】
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ,７１番目のＰｈｅ，１２５番目のＧｌｎ，および１９９番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ,Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列であって、前記第２番目、７１番目、１２５番目、および１９９番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００４４】
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ，第７９番目のＰｈｅ，１３３番目のＧｌｎ，および２０７番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ，Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号４）
【００４５】
（４）配列番号３で表されるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａ，７９番目のＰｈｅ，１３３番目のＧｌｎ，および２０７番目のＡｓｐが、それぞれＬｙｓ，Ｔｒｐ，Ｔｈｒ，およびＨｉｓに置換されたアミノ酸配列であって、前記第２番目、７９番目及び１３３番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００４６】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改良型ＨｈｅＢ（２ｎｄ）をコードする遺伝子としては、例えば配列番号６記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。配列番号４記載のアミノ酸配列からなる改良型ＨｈｅＢ（１ｓｔ）をコードする遺伝子としては、例えば配列番号８記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。
【００４７】
本発明において使用する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記（１）〜（４）より選択されるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるものであればよい。
【００４８】
なお、上記（２）および（４）において「１個若しくは数個」とは、１０以下の整数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度を指す。
【００４９】
なお、本発明において、アミノ酸の種類を３文字または１文字のアルファベット表記で表すことがある。さらに、数字の前または前後に、３文字または１文字のアルファベットを配して表記することがあり、この場合は、アミノ酸残基の箇所及び置換前後のアミノ酸の種類を表す。すなわち、数字は、特に断りがない限り、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基（通常はメチオニン）を１番目と定義した場合に、何番目のアミノ酸残基であるかを示すものである。また、数字の前に表示した３文字または１文字のアルファベットは、アミノ酸置換前のアミノ酸の３文字または１文字表記を表し、数字の後に表示した３文字または１文字のアルファベットは、アミノ酸置換が生じた場合の置換後のアミノ酸の３文字または１文字表記を表すものとする。例えば、１２５番目のグルタミン残基は「Ｇｌｎ１２５」または「Ｑ１２５」と表記し、７１番目のフェニルアラニン残基がトリプトファンに置換された場合は「Ｐｈｅ７１Ｔｒｐ」または「Ｆ７１Ｗ」と表記することがある。
【００５０】
（４）シアニドドナー
シアニドドナーとは、反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物を意味し、特に制限されないが、シアン化水素（ＨＣＮ）、シアン化カリウム（ＫＣＮ）、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）、アセトンシアンヒドリン（ＡＣＨ）が例示される。シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムが好ましく使用される。
【００５１】
（５）酵素反応
本製造方法の酵素反応は、水または緩衝液へ、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール及びハロヒドリンエポキシダーゼを反応系に添加することにより開始する。緩衝液としては、例えば、青酸、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示される。その内、青酸とその塩によって構成される緩衝液、トリス緩衝液が好ましい。緩衝剤由来の不純物が混入しない点で、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液が特に好ましい。
【００５２】
上記緩衝液への、シアニドドナー、１，３−ジハロ−２−プロパノール、ハロヒドリンエポキシダーゼの投入順序については、特に制限されないが、１，３−ジハロ−２−プロパノールとハロヒドリンエポキシダーゼが接触する前に、反応系内にシアニドドナーを存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点、及びエピハロヒドリンの副生を抑えることができる点で好ましい。存在させておくシアニドドナーの濃度は、反応開始時において、０．０１〜１．５ｍｏｌ／ｋｇが好ましく、０．８〜１．５ｍｏｌ／ｋｇがより好ましい。シアニドドナーの濃度は１．５ｍｏｌ／ｋｇを超えると酵素の安定性の観点から好ましくない。
【００５３】
また、シアニドドナーは反応進行により消費されるため、追添加することが好ましい。その場合、反応系内に０．０５ｍｏｌ／ｋｇ以上存在させておくよう、追添加することが好ましいが、酵素の安定性の観点から１．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにすることが好ましい。
【００５４】
シアニドドナーの使用量は、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの１〜２当量とすることが、反応速度の向上、及びシアニドドナーの効率的な利用の観点から好ましい。
【００５５】
ここで、最終的に使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールの量とは、反応開始から反応終了までに使用した１，３−ジハロ−２−プロパノールの全量のことを意味する。
【００５６】
酵素反応時の温度は、０〜３０℃とすることが酵素の安定性が良く、円滑に反応が進行する点から好ましい。
【００５７】
反応が進行するに従い、反応液中にハロゲン化水素が生成するためｐＨが低下していく。よって、反応系内にアルカリを追添加することにより、系内のｐＨを酵素の活性が発揮される領域に調整、維持することが好ましい。そのｐＨは７．０以上とすることが反応の円滑な進行の点から好ましく、８．５以下とすることが副反応の抑制の点から好ましい。
【００５８】
使用するアルカリとしては、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩の水溶液が酵素の活性が発揮されるｐＨ領域にあるものであれば特に制限されず、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニアの、水酸化物あるいは弱酸との塩が例示される。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、シアン化ナトリウム、シアン化カリウムが好ましい。アルカリの使用形態としては、特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液が好ましい。
【００５９】
１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応開始時において０．０１ｍｏｌ／ｋｇ以上となるように予め反応系内に存在させておくことが、反応開始時に高い反応速度を得られる点で好ましい。また、１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応開始時において１．５ｍｏｌ／ｋｇ以下、好ましくは１．０ｍｏｌ／ｋｇ以下、より好ましくは０．５ｍｏｌ／ｋｇ以下となるように予め反応系内に存在させておくことが、酵素の安定性の観点で好ましい。
【００６０】
１，３−ジハロ−２−プロパノールは、反応の進行に従って追添加することが高生産性の観点から好ましく、具体的には、酵素反応の開始以降、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持するように間欠的に追添加することが好ましい。
【００６１】
ハロヒドリンエポキシダーゼの使用量は特に制限されず、反応が円滑に進行する量を使用すればよい。例えば、反応開始時において反応液１ｇあたり１Ｕ〜１０００Ｕ使用することができる。ここで、１Ｕ（ユニット）とは、２０℃，ｐＨ８．０の緩衝液中において、１，３−ジクロロ−２−プロパノールから１分間に１μｍｏｌのエピクロロヒドリンを生成することができる酵素量のことを意味する。
【００６２】
反応系内の１，３−ジハロ−２−プロパノール、及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって定量することができる。また、反応系内のシアニドドナーの濃度は、例えば滴定によって定量することができる。これらの定量結果を反応進行の指標として、追添加する１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーの量を決定することができるが、以下に示す方法で１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーの濃度をより容易に管理できる。
【００６３】
つまり、反応開始以降、ｐＨコントローラを用いてｐＨを一定に維持すると、生成したハロゲン化水素と理論上、等ｍｏｌ、すなわち反応により消費された１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーと理論上等ｍｏｌのアルカリが投入される。このアルカリの投入量が反応進行の指標となるので、反応系に１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーを追添加する際の目安とすることができる。
【００６４】
反応時間は、基質等の濃度、酵素濃度、又はその他の反応条件等によって適時選択するが、１〜１２０時間、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは５〜２４時間で反応が終了するように条件を設定する。
【００６５】
上述の方法により、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを反応系内に０．３ｍｏｌ／ｋｇを超えて蓄積させることができる。反応液中に生成、蓄積した光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下で溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）、及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）の定量は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて表１に示す分析条件で行った。
【００６７】
【表１】
【００６８】
反応終了液１００μｌを、上表記載の移動相５ｍｌにより希釈混合した後、上表記載の分析条件により分析を行った。予め、濃度既知のＤＣＰ,ＥＣＨ及びＣＨＢＮ溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ,ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度を求めた。
【００６９】
＜生成ＣＨＢＮの光学純度分析＞
生成ＣＨＢＮの光学純度分析は、ＣＨＢＮをエステル化後、順相系ＨＰＬＣにより行った。順相系ＨＰＬＣ分析条件を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
反応終了液約４００μｌに等量の酢酸エチルを加えて抽出を行った。酢酸エチル相を分取し、少量の無水硫酸マグネシウムを加えて攪拌した。酢酸エチル相を全量なすフラスコに分取してロータリーエバポレータ（東京理化機械）にセットし、５０℃，２５０ｔｏｒｒ，６０分間濃縮した。残存物に２０μｌのジクロロメタンと２０μｌのピリジン、及び２０μｌの（＋）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（以下、（＋）−ＭＴＰＡと称することがある）を添加した。室温で一晩反応させた後、４００μｌのジイソプロピルエーテル（以下、ＩＰＥと称することがある）を添加し、１規定の塩酸を加えて抽出を行った。ＩＰＥ相を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を４００μｌ加えて抽出を行った。ＩＰＥ相を１．５ｍｌチューブに分取し、アスピレータによりＩＰＥ相を揮発させた。残存物をｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝４：１の混合液に懸濁した後、表５に記載の分析条件により分析を行った。（Ｒ）−ＣＨＢＮ−（＋）−ＭＴＰＡエステル及び（Ｓ）−ＣＨＢＮ−（＋）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積比から各濃度を算出し、本明細書において説明した要領（前述）でＣＨＢＮの光学純度を算出した。
【実施例１】
【００７２】
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する組換菌の作製
（１）鋳型プラスミドの作製
鋳型とするプラスミドの作製を以下の通り行った。
まず、配列番号５に示されるハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨＨＥＢ（２ｎｄ）を、配列番号９及び配列番号１０に示されるプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。
【００７３】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（プラスミドｐＳＴ１１１） １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−０９（配列番号９） １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−０７（配列番号１０） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
総量 ５０μｌ
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：４秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＤＨ−０９：ＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＧＣＧ（配列番号９）
ＤＨ−０７：ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＣＴＧ（配列番号１０）
【００７４】
ＤＨ−０９は３３ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の翻訳開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＡでリジンをコードする。
【００７５】
ＤＨ−０７は３２ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ兼ＰｓｔＩ認識部位（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨＨＥＢ（２ｎｄ）終止コドン下流領域を有する。
【００７６】
また、鋳型として用いたｐＳＴ１１１は、特公平５−３１７０６６号公報に記載されており、ｐＳＴ１１１を含む組換えベクターによる大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２２」として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成３（１９９１）年３月１日付けで寄託されている。
【００７７】
熱サイクル処理を行ったＰＣＲ反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により精製した後、ＰＣＲ増幅産物について制限酵素ＢｓｐＨＩとＰｓｔＩで二重消化を行った。消化産物を０．７％アガロースゲル電気泳動で分離後、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。一方、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）））により精製した。これを、上述のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むＰＣＲ増幅産物と混合した後、該混合液にＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでＰＣＲ増幅産物と発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを結合した。
【００７８】
尚、ｐＴｒｃ９９ＡはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ）から購入できる。
【００７９】
次に、後述の方法で作製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル２００μｌに対して上記ライゲーション反応液の全量を添加し、０℃で３０分放置した。
【００８０】
続いて、前記コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液２００μｌを、ＬＢ Ａｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ，２％寒天を含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１％ＮａＣｌ）に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、１．５ｍｌのＬＢ Ａｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて組換プラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解析し、ＰＣＲにおけるエラー変異が生じていないことを確認した。ＰＣＲ増幅由来ＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドをｐＳＴＴ００２と命名し、当該プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９株形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２と命名した。
【００８１】
図１にｐＳＴＴ００２の構造を示す。ｐＳＴＴ００２はベクターｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に配列番号５記載のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ（２ｎｄ））を挿入したものである。
【００８２】
なお、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルは以下の方法で作製した。
【００８３】
大腸菌 ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃，５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００８４】
（２）Ｑ１２５Ｔ変異導入
下記の条件でＰＣＲを行ってＱ１２５Ｔ変異を導入した。
【００８５】
反応液組成：
ｐＳＴＴ００２ １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−５１（配列番号１１） １μｌ
１０μＭ プライマーＤＨ−５２（配列番号１２） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ２５μｌ
総量 ５０μｌ
反応サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：３０秒を３０サイクル
プライマー：
ＤＨ−５１：ｇｃａｇｃｇａｔｇｃｇｇｔａｃＡＣＣｇａａｇｇｔｇｃｇｃｔｇｇｃｃ（配列番号１１）
ＤＨ−５２：ｇｇｃｃａｇｃｇｃａｃｃｔｔｃＧＧＴｇｔａｃｃｇｃａｔｃｇｃｔｇｃ（配列番号１２）
【００８６】
各反応液にＤｐｎＩを１μｌ添加して３７℃で１時間インキュベートし、ＤｐｎＩ処理液２μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行った。得られた形質転換体からプラスミドを抽出してＤＮＡ配列を確認し、Ｑ１２５Ｔの変異が導入されたプラスミドを得た。得られた変異導入プラスミドをｐＳＴＴ１１８と命名した。
【００８７】
（３）Ｄ１９９Ｈの導入
テンプレートとしてｐＳＴＴ１１８，プライマーとしてＤＨ−１２５およびＤＨ−１２６を使用した以外は実施例１（２）と同様にしてＰＣＲ，形質転換およびプラスミド抽出を行い、Ｑ１２５Ｔ＋Ｄ１９９Ｈ変異を導入したプラスミドを作製した。
【００８８】
プライマー：
ＤＨ−１２５：ｃｇａｇａｇｃａｃｇｃｇｃｔｇｃｔｃｇｃｇｔｔｇｔｔｃｃｔｇ（配列番号１３）
ＤＨ−１２６：ｃａｇｃｇｃｇｔｇｃｔｃｔｃｇｇｇｃａｇｔｃｇｃｇａｇｃｃｇ（配列番号１４）
【００８９】
得られた変異導入プラスミドをｐＳＴＴ２０１と命名した。
【００９０】
（４）Ｆ７１Ｗの導入
テンプレートとしてｐＳＴＴ２０１，プライマーとしてＤＨ−４９およびＤＨ−５０を使用した以外は実施例１（２）と同様にしてＰＣＲ，形質転換およびプラスミド抽出を行い、Ｑ１２５Ｔ＋Ｄ１９９Ｈ＋Ｆ７１Ｗ変異を導入したプラスミドを作製した。
【００９１】
プライマー：
ＤＨ−４９：ｇｃｃｃａｃＴＧＧｇｇｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｇ（配列番号１５）
ＤＨ−５０：ｃａｃｃｃｃＣＣＡｇｔｇｇｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｇａａ（配列番号１６）
【００９２】
得られた変異導入プラスミドをｐＳＴＴ２０６と命名し、当該プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＴＴ２０６と命名した。
【実施例２】
【００９３】
ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
実施例１にて作製した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する組換菌ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ２０６を、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍＬ×２０本植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。
【００９４】
培養菌体を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）を２０ｇになるように加え、懸濁した。この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。
【００９５】
ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１３．５ｍＭであった。すなわち、１０分当たり１３５０μｍｏｌのエピクロロヒドリンが生成したことになり、この菌体懸濁液の活性は菌体懸濁液１ｇあたり５４０Ｕであることがわかった。
【００９６】
この菌体懸濁液を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で菌体懸濁液１ｇあたり４００Ｕになるように希釈した。
【実施例３】
【００９７】
以下の表３に示す条件を初期量として、反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【００９８】
次いで、実施例２の菌体懸濁液７５ｇ（３０．０ｋＵ）を加え、２０℃，ｐＨ８．０で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【００９９】
ｐＨコントロールで使用したＮａＯＨが０．１９ｍｏｌ添加された時点からＤＣＰの追添加を開始し、ｐＨコントロールで使用したＮａＯＨが０．２４３ｍｏｌ添加された時点からＨＣＮの追添加を開始した。ＤＣＰは投入されるＮａＯＨとほぼ等ｍｏｌの割合で、総計０．３９５ｍｏｌ添加した。
【０１００】
なお、収率は以下の方法により算出した。
収率（％）＝ＤＣＰ転化率×ＣＨＢＮ選択率
・ＤＣＰ転化率（％）＝１００−｛（系内全量×ＤＣＰ濃度）／（ＤＣＰ仕込量＋ＤＣＰ累計追加量）｝
・ＣＨＢＮ選択率（％）＝｛（系内全量×ＣＨＢＮ濃度）／（ＤＣＰ仕込量＋ＤＣＰ累計追加量）｝×ＤＣＰ転化率
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
反応プロファイルを表４に示し、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を図２に示す。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
反応１２９０分後のＤＣＰ転化率９５．８％，ＣＨＢＮ選択率９６．７％，Ｒ−ＣＨＢＮ光学純度９７．２％ｅ．ｅ．であった。
【実施例４】
【０１０５】
以下の表５に示す条件を初期量として、反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【０１０６】
次いで、実施例２の菌体懸濁液７９．３ｇ（３１．７ｋＵ）を加え、２０℃，ｐＨ８．０で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【０１０７】
ｐＨコントロール用のＮａＯＨが添加されはじめた時点からＤＣＰの追添加を開始し、ｐＨコントロール用のＮａＯＨが０．０９ｍｏｌ添加された時点からＨＣＮの追添加を開始した。ＤＣＰは投入されるＮａＯＨのｍｏｌ数に対して約０．５〜１当量となるように添加した。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
反応プロファイルを表６に示し、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を図３に示す。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
反応１２９０分後のＤＣＰ転化率９５．２％，ＣＨＢＮ選択率９６．７％，Ｒ−ＣＨＢＮ光学純度９７．２％ｅ．ｅ．であった。
【０１１２】
＜比較例１＞
以下の表７に示す条件を初期量として、反応を行った。反応は、ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０００ｍＬ容４つ口フラスコに、所定量の水、ＨＣＮを投入し、３０％ ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を加え、均一に溶解するまで攪拌した。
【０１１３】
次いで、実施例２の菌体懸濁液７７．３ｇ（３０．９ｋＵ）を加え、２０℃，ｐＨ８．０で反応を開始した。反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨのコントロールを行った。
【０１１４】
ｐＨコントロール用のＮａＯＨが添加されはじめた時点からＤＣＰ及びＨＣＮの追添加を開始した。ＤＣＰ及びＨＣＮは、投入されるＮａＯＨとほぼ等ｍｏｌの割合で添加した。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
反応プロファイルを表８に示し、ＤＣＰ濃度の理論値の推移を図４に示す。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
ｐＨコントロール用のＮａＯＨが０．１６２ｍｏｌ添加された時点（反応開始３０分後）で反応の進行が停止した。
【０１１９】
反応１３８０分後のＤＣＰ転化率３４．６％，ＣＨＢＮ選択率９６．４％，Ｒ−ＣＨＢＮ光学純度７８．８％ｅ．ｅ．であった。
【０１２０】
比較例１の結果より、反応液中のＤＣＰ濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超える範囲に保持した場合には、酵素反応が早く終結し、得られる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは少なく、光学純度も低くなることがわかる。一方、実施例３および４の結果より、反応液中のＤＣＰ濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲または０．２ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持した場合には、多くの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが得られ、かつ光学純度も高くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、生産性が高く、工業的に好適な光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号１：ＨｈｅＢ（２ｎｄ）のアミノ酸配列
配列番号２：改良型ＨｈｅＢ（２ｎｄ）のアミノ酸配列
配列番号３：ＨｈｅＢ（１ｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号４：改良型ＨｈｅＢ（１ｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号５：ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の塩基配列
配列番号６：改良型ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の塩基配列
配列番号７：ＨＨＥＢ（１ｓｔ）の塩基配列
配列番号８：改良型ＨＨＥＢ（１ｓｔ）の塩基配列
配列番号９：プライマーＤＨ−０９
配列番号１０：プライマーＤＨ−０７
配列番号１１：プライマーＤＨ−５１
配列番号１２：プライマーＤＨ−５２
配列番号１３：プライマーＤＨ−１２５
配列番号１４：プライマーＤＨ−１２６
配列番号１５：プライマーＤＨ−４９
配列番号１６：プライマーＤＨ−５０
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法であって、酵素反応の開始後、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、該方法。
【請求項２】
酵素がハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハロヒドリンエポキシダーゼがコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ）に由来するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ハロヒドリンエポキシダーゼが配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、酵素反応によって光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法であって、酵素反応の開始後、反応液へ１，３−ジハロ−２−プロパノールを供給し、該反応液中の１，３−ジハロ−２−プロパノール濃度を０．４３ｍｏｌ／ｋｇを超えない範囲に保持することを特徴とする、該方法。
【請求項２】
酵素がハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハロヒドリンエポキシダーゼがコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨＨＥＢ）に由来するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ハロヒドリンエポキシダーゼが配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−９６２１（Ｐ２０１３−９６２１Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４３８９５（Ｐ２０１１−１４３８９５）
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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