光学測定装置及び微粒子解析装置
【課題】測定精度が高く、高効率な光学測定装置とすること。
【解決手段】微小粒子Ｓを導入可能な流路Ｘが配設された基板１１と、前記微小粒子Ｓに対して測定光Ｌ１２を照射する光源１２と、前記測定光Ｌ１２の照射により生じる検出対象光Ｌを検出する検出部１３と、を少なくとも備え、前記検出対象光を流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかにより所定方向に出射させるよう前記基板１１の流路表面を処理した光学測定装置１とすること。
【解決手段】微小粒子Ｓを導入可能な流路Ｘが配設された基板１１と、前記微小粒子Ｓに対して測定光Ｌ１２を照射する光源１２と、前記測定光Ｌ１２の照射により生じる検出対象光Ｌを検出する検出部１３と、を少なくとも備え、前記検出対象光を流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかにより所定方向に出射させるよう前記基板１１の流路表面を処理した光学測定装置１とすること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学測定装置及び微粒子解析装置に関する。より詳しくは、微小粒子が導入可能な流路を有する基板において光学測定を行う技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザー等の指向性光は、波長が同じで位相が揃っているため、これをレンズなどで集束させた場合、光を小さい点に集めることができ、その照射点のエネルギー密度が高いという特性を有している。そのため、レーザー等の指向性光は分光測定等に幅広く使用されている。
【０００３】
レーザー分光に関しては、線型レーザー分光や非線形レーザー分光等に分類できる。吸収スペクトルや励起スペクトルを測定する線型レーザー分光も在来の光源を用いる分光に比して高感度かつ高分解能である。非線型レーザー分光は、更に高感度かつ高分解能の分光が可能となる。このようなものとして、例えば、レーザー誘起蛍光分光、レーザー・ラマン分光法、ＣＡＲＳ（Coherent anti-Stokes Raman Scattering）、偏光分光、共鳴イオン化分光、光音響分光等が挙げられる。特に、時間分解能が高いものは、ピコ秒分光やフェムト秒分光とも呼ばれている。
【０００４】
例えば、レーザー照射技術はフローサイトメトリーにも用いられている（非特許文献１）。フローサイトメトリーとは、測定対象である細胞を生きたまま分取（ソーティング）して細胞の機能等を解析する測定手法である。細胞をラミナフロー中に流し込み、フローセルを通過する細胞にレーザーを照射する。これによって発生した蛍光や散乱光を測定する。また、パルス検出系では、細胞がレーザーを横切るときに生じた蛍光や散乱光を電気パルスとして検出し、パルス高やパルス幅やパルス面積等を分析することで解析を行う。これによって、細胞１個１個から発せられる散乱光や蛍光を検出することで、各細胞の特性を生きたまま分析することができる。
【０００５】
このような分光測定は、例えば、流路を備えた基板上で行われている。図６は、従来の光学測定装置の一例を説明するための概略図である。図６の符号Ａは光学測定装置を示している。該光学測定装置Ａは、基板Ａ１に流路Ｘが設けられている。そして、流路Ｘ内には試料として微小粒子Ｓが存在している。例えば、流路Ｘには微小粒子Ｓと共に媒体として液体等を流しながら測定を行う。この微小粒子Ｓに対して、光源Ａ２から測定光Ｌ２を照射する。これにより生じる蛍光や散乱光等を検出対象光Ｌ３，Ｌ４として検出器Ａ３，Ａ４で夫々検出する。
【０００６】
【非特許文献１】中内啓光著、「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」、秀潤社、ｐ１２〜ｐ１３、第２版、２００６年８月３１日発行。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、平面状の流路で測定を行う場合には検出対象光は前方や側方に散乱するため、集光効率が低くなるといった問題がある。そこで、本発明は、測定精度が高く、高効率な光学測定装置を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
まず、本発明は、微小粒子を導入可能な流路が配設された基板と、前記微小粒子に対して測定光を照射する光源と、前記測定光の照射により生じる検出対象光を検出する検出部と、を少なくとも備え、前記検出対象光を流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかにより所定方向に出射させるように前記基板の流路表面を処理した光学測定装置を提供する。散乱が起こりうる検出対象光を所定方向に出射させることで、検出部において効率よく受光できる。その結果、簡易な装置構造でありながら、集光効率を向上でき、更には光学測定の測定精度を向上できる。
次に、本発明は、前記所定方向は、前記測定光の照射の入射方向と同軸方向である光学測定装置を提供する。測定光の入射方向と同軸方向に前記検出対象光を出射させることで、前方散乱光のみならず側方散乱光も効率よく集光できる。
続いて、本発明は、前記流路に、所定波長の光を透過する波長選択膜が少なくとも形成した光学測定装置を提供する。所定波長の光を透過する波長選択膜を設けることで、検出すべき検出対象光を効率よく集光できる。
そして、本発明は、前記流路の断面視、前記測定光の入射方向に対する前記流路表面の角度が略４５度である領域を少なくとも備えた光学測定装置を提供する。これにより、微小粒子の側方に散乱する光を効率よく反射させて所定方向に出射させることができる。
更に、前記基板を、流路層を支持層に積層させた構造とすることで、基板の反り返りや変形等を防止できる。
また、本発明は、流路を前記支持層にも配設した光学測定装置を提供する。支持層にも流路を設けることで、基板の両面で光学測定を行うことができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、測定精度が高く、高効率の光学測定を基板上で行うことができる光学測定装置とできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、添付図面に基づいて、本発明に係る光学測定装置及び微粒子解析装置の好適な実施形態について説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の例示であり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１１】
図１は、本発明に係る光学測定装置の第１実施形態の側面概略図である。
【００１２】
図１の符号１は、光学測定装置１を示している。該光学測定装置１は、基板１１と光源１２と検出部１３とを備えている。以下、符号Ｓは照射対象である微小粒子を示している。
【００１３】
微小粒子Ｓに対して、光源１２から測定光Ｌ１２を照射し、得られる検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を検出部１３（符号１３１，１３２，１３３参照）にて検出することで、光学測定を行うものである。
【００１４】
検出対象光の種類は限定されず、微小粒子Ｓの種類や測定条件等を考慮して必要とする光を適宜選択できる。検出対象光としては、微小粒子Ｓから発せられる蛍光や散乱光が挙げられる。検出対象光の検出は、例えば、あらかじめ微小粒子Ｓを特定の蛍光物質でラベリングしておき、光源１２から測定光Ｌ１２として励起光を照射する。これにより発する蛍光を検出対象光として検出することが挙げられる。
【００１５】
蛍光色素を用いる場合は、例えば、測定光Ｌ１２を指向性光とし、この波長（例えば、レーザーの波長）に対応した蛍光色素を用いることができる。
【００１６】
例えば、Ａｒイオンレーザー（４８８ｎｍ）の場合には、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）やＰｅｒＣＰ（peridinin chlorophyll protein）等の蛍光色素を用いることができる。また、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）の場合には、ＡＰＣ（allophycocyanin）やＡＰＣ−Ｃｙ７等の蛍光色素を用いることができる。ダイレーザー（５９８ｎｍ）の場合には、ＴＲ（Texas Red）等の蛍光色素を用いることができる。Ｃｒレーザー（４０７ｎｍ）レーザーや半導体レーザーの場合には、Cascade Blue等の蛍光色素を用いることができる。
【００１７】
検出対象光の検出は、ラベリング等を行わずに微小粒子Ｓからの散乱光を検出してもよい。例えば、微小粒子Ｓに測定光Ｌ２２を照射することで発生する散乱光を検出してもよい。この場合にも、例えば、光Ｌ２２を指向性光とすることで、より高精度の位置情報の検出ができる。散乱光としては、前方散乱光（符号Ｌ１３１参照）や側方散乱光（符号Ｌ１３２，Ｌ１３３参照）が挙げられる。
【００１８】
本発明は、流路層１１の流路表面に設けられた反射膜１１１１，１１１１，１１１１によって検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を反射あるいは干渉させること等により、所定方向に出射させるものである。このように、所定方向に出射させることで、効率よく検出対象光を集光し、これを検出部１３で検出できる。特に、検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を、夫々対応する検出器１３１，１３２，１３３の設置方向に向かって出射させることで、前記検出器１３１，１３２，１３３の検出精度を向上させることができる。
【００１９】
そして、基板１１の構造に関し、より好適には、流路Ｘの断面視、前記測定光Ｌ１２の入射方向に対する前記流路表面の角度が略４５度である領域を有することが望ましい（図１参照）。これにより、微小粒子Ｓの側方から出る側方散乱光や蛍光等を効率よく反射させて所定方向に出射させることができる（例えば、検出対象光Ｌ１３２，Ｌ１３３等参照）。従って、優れた光集光効率とすることができる。
【００２０】
従って、本発明によれば、簡易な装置構造でありながら、測定精度を向上できる。前記所定方向は、装置構造等を考慮して適宜好適な方向となるように調整することができるが、好適には、前記測定光Ｌ１２と同軸方向であることが望ましい。更には、測定光Ｌ１２の入射方向が流路表面に対して略垂直に面する方向であることが望ましい。これにより、四周に散乱する側方散乱光等を効率よく集光できる。
【００２１】
以下、光学測定装置１の各構成についてより詳細に説明する。
【００２２】
基板１１は、微小粒子Ｓを導入可能な流路Ｘを備えた構造である。この流路Ｘは、流路層１１１と流路保護層１１２を積層することで形成されている。流路層１１１の流路表面は反射膜１１１１によって形成されている。なお、図１では流路Ｘ内の構造は簡略化して表しているが、流路Ｘ内に媒体を流すことで微小粒子Ｓが流路Ｘ内を移動することができる。なお、図１では、微小粒子Ｓは紙面の垂直方向に移動している状態を示しており、流路Ｘの流路幅を正面視した状態である。
【００２３】
本発明において流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓの種類は限定されない。例えば、微小粒子Ｓは種々の生体細胞やビーズ等の微小構造体であってもよい。また、流路Ｘ内の媒体は流体であればよく、種々の溶液や気体等を用いることができる。微小粒子Ｓや照射条件等を考慮して好適な媒体を選択することができる。
【００２４】
流路層１１１の流路表面は、検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３が流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかを行い得るように処理されていればよく、その処理手法について限定するものではない。処理手法としては、例えば、流路表面の所定の一面若しくは複数面に、反射膜１１１１を設けることが挙げられる。
【００２５】
また、流路表面に、反射光強度を強めることができる干渉膜を設けてもよい。これにより検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３の光強度を増幅できるため、測定精度をより向上できる点で望ましい。このような干渉膜として用いるものは限定されないが、例えば、多層膜干渉を利用した誘電体多層膜フィルタ（干渉膜フィルタ）等が挙げられる。また、流路表面に薄膜干渉を利用した表面処理を行うことで、任意の透過率や反射率となるように流路表面を設計できる。
【００２６】
更に好適には、所定波長の光を透過させる波長選択膜を設けることが望ましい。特に、流路表面への測定光Ｌ１２の入射方向に対して、略垂直に面するように波長選択膜を形成することが望ましい。これに関する形態例については後述する。
【００２７】
光源１２の種類は特に限定されないが、好適には、レーザーやＬＥＤ（Light Emission Diode；発光ダイオード）等の指向性光の光源であることが望ましい。測定光Ｌ１２としてレーザーを用いる場合、その媒体としては、例えば、半導体レーザーや液体レーザーや気体レーザーや固体レーザー等が挙げられる。
【００２８】
半導体レーザーとしては、ＧａＡｓレーザーやＩｎＧａＡｓＰレーザー等が挙げられる。ガスレーザーとしては、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（赤色）、Ａｒレーザー（可視、青色又は緑色）、ＣＯ２レーザー（赤外線）、エキシマーレーザー（紫色等）等が挙げられる。液体レーザーとしては、色素レーザー等が挙げられる。固体レーザーとしては、ルビーレーザーやＹＡＧレーザーやガラスレーザー等が挙げられる。また、レーザーダイオード（ＬＤ）でＮｄ：ＹＡＧ等の固体媒体を励起して発振させるＤＰＳＳ（ダイオード励起固体レーザー）等も用いることができる。
【００２９】
また、図示はしないが、測定光Ｌ１２の走査手段を別途設けることができる。本発明に係る光学測定装置１としては、流路Ｘの流路幅よりも小さい照射スポットである測定光Ｌ１２を照射する光源１２と、前記測定光Ｌ１２を流路幅方向に走査させる走査手段を更に備えた光学測定装置とすることが望ましい。これにより、微小粒子Ｓに対して十分かつ正確な光照射を行うことができる。従って、照射後の光集光効率だけでなく、照射時の照射効率も優れた光学測定装置とできる。これにより更に高精度の測定結果を得ることができる。特に、測定光Ｌ１２がレーザー等の指向性光である場合に好適である。
【００３０】
測定光Ｌ１２を流路幅方向に走査させながら照射することで、複数の照射スポットを流路Ｘの幅方向に渡って作り出すことができる。その結果、流路Ｘ内を移動する微小粒子Ｓに対して確実かつ十分に光照射ができる。流路Ｘ内を微小粒子Ｓが移動する場合、流路Ｘ内の微小粒子Ｓの位置が変化する。特に、微小粒子Ｓの大きさが流路Ｘの流路幅に比してかなり小さい場合には、流路Ｘ内で微小粒子Ｓが一定の自由度を有して移動する。そのため、大きな照射むらや照射位置ずれやフォーカス位置ずれ等が生じることがある。このようなことが測定光Ｌ１２の照射効率の低下の一因となっていた。
【００３１】
これに関して、ビームスポット径を大きくしたり、照射時間を長くしたりすることが行われている。しかし、ビームスポットのエネルギー密度を強くするために光源の出力パワーを上げなければならなかったり、照射時間の制限を受ける等といった光源に関する制約が生じる。一方、本発明では、ビームスポット径が小さい測定光Ｌ１２を、流路幅方向に走査しながら照射する。これにより、ビームスポット径を大きくしたり、無駄に長時間照射することもなく、確実かつ十分に微小粒子Ｓに光照射できる。
【００３２】
なお、この場合、測定光Ｌ１２の走査角度や走査速度等を考慮して基板１１の流路表面の表面処理を行うことが望ましい。例えば、測定光Ｌ１２の入射角の範囲等を考慮して、検出対象光Ｌ１３１，１３２，１３３等が所定の出射方向に出射するように反射膜や干渉膜を設けること等が挙げられる。
【００３３】
走査条件は特に限定されないが、下記式（１）を満たす条件で光照射することが望ましい。このような条件で走査することで、走査スポットが流路Ｘの流路幅を通過する時間内に、微小粒子Ｓがこの走査スポットを１回以上横切ることになる。その結果、流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓを必ず走査スポットで検出できる。
【００３４】
【数１】
【００３５】
走査手段は特に限定されないが、好適にはガルバノミラーや、電気光学素子や、ポリゴンミラーや、ＭＥＭＳ素子等によって測定光Ｌ１２を走査させることが望ましい。特に、電気光学素子は可動部がないため、安定性や信頼性が高い点で好適である。また、これらの走査手段を複数用いてもよい。
【００３６】
また、図示はしないが、微小粒子Ｓの流路Ｘ内の位置情報に基づいて測定光Ｌ１２の照射制御を行なう照射制御手段等を更に設けてもよい。具体的には、別途の光源と、この光源から微小粒子Ｓの位置情報を得るための光を照射することで、流路Ｘ内における微小粒子Ｓの位置情報を得て、この位置情報に基づいて光源１２の照射を制御する照射制御手段とを、更に設けた光学測定装置とすることが望ましい。
【００３７】
別途、微小粒子Ｓの流路Ｘ内における位置情報（例えば、移動速度、流路Ｘ内の存在位置等）を得ておき、これに基づいて光照射を制御することで、より正確に測定光Ｌ１２を微小粒子Ｓに照射できる。この位置情報とは、流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓの移動速度や、３次元の存在位置等に関する情報等をいい、流路Ｘ内における微小粒子Ｓのベクトルに関連するあらゆる情報を包含する。
【００３８】
例えば、測定光Ｌ１２の照射スポットとは別の位置に、位置情報を得るための光の照射スポットを流路Ｘ内に設ける。そして、この光を微小粒子Ｓに照射することで得られる蛍光や散乱光等を検出する。この検出結果を、微小粒子Ｓの位置情報として得ることができる。
【００３９】
そして、この位置情報を、光源１２の光照射のトリガタイミング等として光源１２の光学系にフィードバックさせる。これによって、適切な照射タイミングで所望の照射位置に、測定光Ｌ１２を照射できる。なお、光源１２から照射する測定光Ｌ１２も、微小粒子Ｓの位置情報等を得ることに用いてもよいことは勿論である。
【００４０】
検出部１３では、検出した検出対象光の測定データをアナログデジタルコンバーター（ＡＤＣ）等によってデジタル信号に変換し、この信号をコンピューターにより演算処理することで、微小粒子Ｓの測定を行うことができる。
【００４１】
検出部１３としては、検出対象光の出射方向に対応した検出器１３１，１３２，１３３を設けることができる。集光する光の数は３本である必要はなく、検出器の数も３に限定するものではない。また、本発明では、検出対象光が所定方向に揃って出射させるため、この検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を集光レンズ等により１本に集光することができる。これにより検出器の数を減らすこともできる。また、前方散乱光を検出する検出器と、側方散乱光を検出する検出器と、蛍光を検出する検出器を、夫々設けることもできる。
【００４２】
本発明に係る光学測定装置は、流路が配設された基板上で微小粒子の測定等を行なうことができ、更には基板が装置本体から脱着可能であるため基板の使い捨てが可能である。このため、基板の繰り返しの使用における被測定物のコンタミネーションを抑制でき、生体細胞等を扱う場合は細胞の純度を上げたり、コンタミネーションを抑制することが可能となる。
【００４３】
図２は、本発明に係る光学測定装置の第２実施形態の側面概略図である。
【００４４】
図２の符号２は、光学測定装置を示している。該光学測定装置２は、流路表面に特定波長の光を透過する波長選択膜が少なくとも形成されていることを特徴の一としている。以下、第１実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。
【００４５】
前記光学測定装置２は、基板２１の流路Ｘ中に存在する微小粒子Ｓに対して、光源２２から測定光Ｌ２２を照射する。これにより得られる検出対象光Ｌ２３１，Ｌ２３２，Ｌ２３３を、検出部２３の検出器２３１，２３２，２３３で夫々検出するものである。基板２１の流路表面には、反射膜２１１１，２１１１と、波長選択膜２１１２とが形成されている。
【００４６】
基板２１は流路層２１１と流路保護層２１２とから構成されている。そして、流路表面に、所定波長の光を透過させる波長選択膜２１１２を設けることで、検出する必要がない測定光Ｌ２２をそのまま透過させることができる。その結果、検出対象光Ｌ２３１，Ｌ２３２，Ｌ２３３に測定光Ｌ２２がさしこむことを防止できる。特に、前方散乱光（符号Ｌ２３１参照）を検出する際にはより測定精度を向上できるため好適である。従って、波長選択膜２１１２は、測定光Ｌ２２が流路表面に入射する方向に対して、略垂直に面するように形成することが望ましい（図２参照）。
【００４７】
波長選択膜の種類は限定されないが、例えば、窒化シリコン、窒化アルミニウム、酸化シリコン等の光学干渉膜を用いることができる。より好適には、流体による光学干渉膜の腐食防止等の観点から、これら光学干渉膜の多層構造や、腐食防止膜を積層した多層構造等を用いることが望ましい。
【００４８】
図３は、本発明に係る光学測定装置の第３実施形態の側面概略図である。
【００４９】
図３の符号３は、光学測定装置を示している。該光学測定装置３は、流路表面の形状を曲面に形成した点を特徴の一としている。以下、先に述べた各実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。なお、図３は、流路構造についてのみ示しており、装置全体の構成は省略している。
【００５０】
前記光学測定装置３は、基板３１の流路Ｘ中に存在する微小粒子Ｓに対して、測定光Ｌ３２を照射する。これにより得られる検出対象光Ｌ３３１，Ｌ３３２，Ｌ３３３，Ｌ３３４，Ｌ３３５を検出するものである。基板３１は、流路層３１１と流路保護層３１２とから構成されている。そして、流路層３１１の流路表面には、反射膜３１１１が形成されているが、その形状は曲面である。
【００５１】
流路Ｘの流路表面の形状については限定されないことは前述したが、より好ましくは、曲面形状とすることが望ましい。少なくとも、微小粒子Ｓから発する側方散乱光や蛍光等の検出対象光について、より多くの光を所定方向に集光・出射させることができる点で好適である。曲面の形状は、曲面構造により集光される光が、検出用光学レンズ等を用いて検出部（図示せず）に効率的に入射できるようにパラボリック形状等であることが好ましい。
【００５２】
なお、図示はしないが、検出対象光Ｌ３３１,Ｌ３３２，Ｌ３３３，Ｌ３３４，Ｌ３３５を集光レンズ等を用いて集光した後に検出部（図示せず）で検出する装置構成としてもよい。
【００５３】
図４は、本発明に係る光学測定装置の第４実施形態の側面概略図である。
【００５４】
図４の符号４は、光学測定装置を示している。該光学測定装置４は、２枚の流路層を貼り合わせた基板を用いている点を特徴の一としている。以下、先に述べた各実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。
【００５５】
前記光学測定装置４は、基板４１を備えており、該基板４１では、流路層４１１と流路保護層４１２が積層されることで流路Ｘを形成している。そして、夫々の流路層４１１，４１１は貼り合わせ層４１３を介して貼り合わされている。これにより、基板４１の両面（表裏面）で夫々測定を行うことができる。
【００５６】
夫々の流路層４１１の流路Ｘで行なう光学測定について説明する。流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓに対して光源４２から測定光Ｌ４２を照射する。これにより得られる検出対象光Ｌ４３１，Ｌ４３２，Ｌ４３３を検出部４３で検出する。検出部４３は、各検出対象光に対応する検出器４３１，４３２，４３３を有している。
【００５７】
流路層４１１単独からなる基板等であれば、温度や湿度等の影響によって変形する場合がある。その結果、光照射の焦点位置が変化してしまう場合がある。このような場合には、光学的なアライメントが別途必要となる。あるいは、測定に使用できる回数が限られてしまう場合もある。
【００５８】
これに対して、少なくとも本発明によれば、少なくともいずれか一方の流路層４１１についてみれば、貼り合わせ層４１３を介して一方の流路層４１１により支持することができる。即ち、流路層４１１，４１１が互いを支持しあうことができる。その結果、前述のような反り返り現象を防止できる。
【００５９】
そして、本発明では、２枚の流路層４１１，４１１を貼り合わせる基板構造に限定するものではない。例えば、少なくとも１枚の流路層４１１を単なる支持層に積層させる基板構造としてもよい。即ち、図４に示す１枚の流路層４１１をダミー層として用いることができる。この場合の支持層（ダミー層）には、基板４１で行う処理条件や微小粒子情報（例えば、細胞名や化合物名等）等を記入しておくこともできる。
【００６０】
また、従来の透過方式による散乱光検出や蛍光検出の場合には、基板の一方向からしか測定光を照射できない。これに対して、本発明によれば、検出対象光Ｌ４３１，Ｌ４３２，Ｌ４３３を流路表面で反射又は屈折させることで、所定方向（好適には、測定光Ｌ４２と同軸方向）に出射させることができる。これにより、基板４１の両面での測定が可能となる。その結果、流路Ｘ中に存在する微小粒子Ｓの解析処理スピードを改善することができ、かつ温度や湿度等による変形や反り返りも防止できる。
【００６１】
流路層４１１の材料については限定されず、例えば、ポリカーボネートや各種プラスチック等を用いることができる。特に、支持層として用いる場合には、前記の反り返り防止の効果が高い材料として、シリコン基板やガラス基板等を用いることができる。また、流路層４１１，４１１の接合は圧着や加熱圧着によって行うことができ、貼り合わせ層４１３には、例えば、熱硬化性樹脂やＵＶ硬化性樹脂等を用いることができる。
【００６２】
流路保護層４１２の材料については限定されず、例えば、ポリカーボネートや各種プラスチック等を用いることができる。また、流路保護層４１２は、貼着可能なシーリング層として用いることもできる。このような流路保護層４１２を設けることで、流路Ｘに微小粒子Ｓを効率よく導入することもできる。
【００６３】
そして、前記流路層４１１や、流路保護層４１２や、貼り合わせ層４１３の厚さについても限定されないが、好適には、略同じ厚さであることが望ましく、これにより温度や湿度による変形を相殺させることができる点で好適である。
【００６４】
図５は、本発明に係る光学測定装置の第５実施形態の概念図である。
【００６５】
図５の符号５は、光学測定装置を示している。該光学測定装置５は、基板５１と、光源５２と、検出部５３と、反射ミラー５４，５５，５６と、集光レンズ５７を備えている。以下、先の述べた各実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。なお、図５では、基板５１の構造や流路内の微小粒子等は簡略化して示しており、今まで述べた基板の種々の構造を備えるように設計できることは勿論である。
【００６６】
光源５２から測定光Ｌ５２が照射され、反射ミラー５４を経て対物レンズ５７で集光されて、基板５１の流路内の微小粒子に照射される。そして、これにより生じる検出対象光Ｌ５３１，Ｌ５３２は、前記測定光Ｌ５２と同軸方向に出射して、反射ミラー５５，５６を経由して、検出部５３で検出される。検出部５３では、検出器５３１で検出対象光Ｌ５３１を、検出器５３２で検出対象光Ｌ５３２を検出する。
【００６７】
このように、本発明では、検出する検出対象光を透過させるのではなく、所定方向に反射させるため、検出部５３の検出器５３１，５３２をまとめて設置することができる。これにより、装置構成の簡略化が可能となる点で望ましい。そして、入射光路と出射光路を同一光路とすることが望ましい。
【００６８】
本発明に係る光学測定装置は、種々の技術分野に応用することができ、例えば、粒子径分布測定や流体画像解析や三次元測定やレーザー顕微鏡等をはじめとする指向性光を利用した計測装置・解析装置に応用できる。そのなかでも、流路中に存在する微小粒子に対して照射を行う微粒子解析装置等に好適に用いることができる。
【００６９】
微粒子解析装置としては、フローサイトメーターやビーズアッセイ（フロービーズアッセイ）等の解析装置が挙げられる。即ち、微小粒子に対して光照射を行い、得られる蛍光や散乱光等の検出対象光を検出することで、微小粒子の分取等を行うものである。
【００７０】
フローサイトメトリーには、微小粒子の大きさや構造等を測定することのみを目的とするものや、さらに測定された大きさや構造等に基づいて所望の微小粒子を分取できるように構成として用いるものがある。このうち、特に細胞の分取を行なうものをセルソータとして用いることができる。
【００７１】
微小粒子をソーティングする際に、本発明の光学測定装置を光学的検出機構に用いることができる。即ち、流路中に存在する微小粒子（生体細胞等）に対して正確な位置に光照射できるため、生体細胞中にごくわずかに存在する幹細胞等であっても正確かつ効率よくソーティングすることができる。
【００７２】
あるいは、流路Ｘ内で所定の化学反応を行なうマイクロリアクターとして用いる場合にも、本発明の光学測定装置を光学的検出機構として用いることができる。流路Ｘにおいて何らかの反応が進行し、その後の反応物（微小粒子Ｓ）に対して指向性光を照射して分光検出を行い、かつその結果に応じて分取（ソーティング）するといった用途に用いることができる。
【００７３】
従って、今まで説明した光学測定装置を備えた微粒子解析装置とすることもでき、更に前記流路に存在する微小粒子Ｓを加工する加工部や、所定の処理を行う処理部や、所定の基準に従って分別する分別部等を別途設けることができる。
【００７４】
具体的には、加工部は、微小粒子Ｓに対して何らかの手を加える操作を行うものを包含し、例えば、レーザー加工や表面加工等を行うものが挙げられる。処理部は、微小粒子Ｓに対して何らかの処理を行うものを包含し、例えば、化学的処理、物理的処理、活性化処理、加熱処理、洗浄処理等を行うものが挙げられる。分別部は、微小粒子Ｓを何らかの基準に基づいて分別・分離したり、更には分取（ソーティング）したりするものが挙げられる。
【００７５】
このように光照射によって得られた微小粒子Ｓの反応結果や位置情報に基づいて、加工や処理や分別等を別途行うことができる。本発明の光照射により生じる検出対象光等の集光効率が優れているため、より高精度の光検出（分光測定等）が可能である。即ち、本発明では、光学測定装置にこれら加工部や処理部や分別部を単に組み合わせるだけでなく、光照射による検出結果をこれらの操作にフィードバックさせることができる。これにより、別途行う微小粒子Ｓへの加工や処理や分別等についても正確かつ効率よく行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係る光学測定装置及び微粒子解析装置によれば、測定精度が高い光学測定が可能であるため、バイオテクノロジー分野のみならず、各種光学測定機器や分析機器をはじめとする幅広い分野に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明に係る光学測定装置の第１実施形態の側面概略図である。
【図２】本発明に係る光学測定装置の第２実施形態の側面概略図である。
【図３】本発明に係る光学測定装置の第３実施形態の側面概略図である。
【図４】本発明に係る光学測定装置の第４実施形態の側面概略図である。
【図５】本発明に係る光学測定装置の第５実施形態の概略図である。
【図６】従来の光学測定装置の一例を説明するための概略図である。
【符号の説明】
【００７８】
１，２，３，４，５ 光学測定装置
１１，２１，３１，４１，５１ 基板
１２，２２，４２，５２ 光源
１３，２３，４３，５３ 検出部
Ｘ 流路
Ｓ 微小粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学測定装置及び微粒子解析装置に関する。より詳しくは、微小粒子が導入可能な流路を有する基板において光学測定を行う技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザー等の指向性光は、波長が同じで位相が揃っているため、これをレンズなどで集束させた場合、光を小さい点に集めることができ、その照射点のエネルギー密度が高いという特性を有している。そのため、レーザー等の指向性光は分光測定等に幅広く使用されている。
【０００３】
レーザー分光に関しては、線型レーザー分光や非線形レーザー分光等に分類できる。吸収スペクトルや励起スペクトルを測定する線型レーザー分光も在来の光源を用いる分光に比して高感度かつ高分解能である。非線型レーザー分光は、更に高感度かつ高分解能の分光が可能となる。このようなものとして、例えば、レーザー誘起蛍光分光、レーザー・ラマン分光法、ＣＡＲＳ（Coherent anti-Stokes Raman Scattering）、偏光分光、共鳴イオン化分光、光音響分光等が挙げられる。特に、時間分解能が高いものは、ピコ秒分光やフェムト秒分光とも呼ばれている。
【０００４】
例えば、レーザー照射技術はフローサイトメトリーにも用いられている（非特許文献１）。フローサイトメトリーとは、測定対象である細胞を生きたまま分取（ソーティング）して細胞の機能等を解析する測定手法である。細胞をラミナフロー中に流し込み、フローセルを通過する細胞にレーザーを照射する。これによって発生した蛍光や散乱光を測定する。また、パルス検出系では、細胞がレーザーを横切るときに生じた蛍光や散乱光を電気パルスとして検出し、パルス高やパルス幅やパルス面積等を分析することで解析を行う。これによって、細胞１個１個から発せられる散乱光や蛍光を検出することで、各細胞の特性を生きたまま分析することができる。
【０００５】
このような分光測定は、例えば、流路を備えた基板上で行われている。図６は、従来の光学測定装置の一例を説明するための概略図である。図６の符号Ａは光学測定装置を示している。該光学測定装置Ａは、基板Ａ１に流路Ｘが設けられている。そして、流路Ｘ内には試料として微小粒子Ｓが存在している。例えば、流路Ｘには微小粒子Ｓと共に媒体として液体等を流しながら測定を行う。この微小粒子Ｓに対して、光源Ａ２から測定光Ｌ２を照射する。これにより生じる蛍光や散乱光等を検出対象光Ｌ３，Ｌ４として検出器Ａ３，Ａ４で夫々検出する。
【０００６】
【非特許文献１】中内啓光著、「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」、秀潤社、ｐ１２〜ｐ１３、第２版、２００６年８月３１日発行。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、平面状の流路で測定を行う場合には検出対象光は前方や側方に散乱するため、集光効率が低くなるといった問題がある。そこで、本発明は、測定精度が高く、高効率な光学測定装置を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
まず、本発明は、微小粒子を導入可能な流路が配設された基板と、前記微小粒子に対して測定光を照射する光源と、前記測定光の照射により生じる検出対象光を検出する検出部と、を少なくとも備え、前記検出対象光を流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかにより所定方向に出射させるように前記基板の流路表面を処理した光学測定装置を提供する。散乱が起こりうる検出対象光を所定方向に出射させることで、検出部において効率よく受光できる。その結果、簡易な装置構造でありながら、集光効率を向上でき、更には光学測定の測定精度を向上できる。
次に、本発明は、前記所定方向は、前記測定光の照射の入射方向と同軸方向である光学測定装置を提供する。測定光の入射方向と同軸方向に前記検出対象光を出射させることで、前方散乱光のみならず側方散乱光も効率よく集光できる。
続いて、本発明は、前記流路に、所定波長の光を透過する波長選択膜が少なくとも形成した光学測定装置を提供する。所定波長の光を透過する波長選択膜を設けることで、検出すべき検出対象光を効率よく集光できる。
そして、本発明は、前記流路の断面視、前記測定光の入射方向に対する前記流路表面の角度が略４５度である領域を少なくとも備えた光学測定装置を提供する。これにより、微小粒子の側方に散乱する光を効率よく反射させて所定方向に出射させることができる。
更に、前記基板を、流路層を支持層に積層させた構造とすることで、基板の反り返りや変形等を防止できる。
また、本発明は、流路を前記支持層にも配設した光学測定装置を提供する。支持層にも流路を設けることで、基板の両面で光学測定を行うことができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、測定精度が高く、高効率の光学測定を基板上で行うことができる光学測定装置とできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、添付図面に基づいて、本発明に係る光学測定装置及び微粒子解析装置の好適な実施形態について説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の例示であり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１１】
図１は、本発明に係る光学測定装置の第１実施形態の側面概略図である。
【００１２】
図１の符号１は、光学測定装置１を示している。該光学測定装置１は、基板１１と光源１２と検出部１３とを備えている。以下、符号Ｓは照射対象である微小粒子を示している。
【００１３】
微小粒子Ｓに対して、光源１２から測定光Ｌ１２を照射し、得られる検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を検出部１３（符号１３１，１３２，１３３参照）にて検出することで、光学測定を行うものである。
【００１４】
検出対象光の種類は限定されず、微小粒子Ｓの種類や測定条件等を考慮して必要とする光を適宜選択できる。検出対象光としては、微小粒子Ｓから発せられる蛍光や散乱光が挙げられる。検出対象光の検出は、例えば、あらかじめ微小粒子Ｓを特定の蛍光物質でラベリングしておき、光源１２から測定光Ｌ１２として励起光を照射する。これにより発する蛍光を検出対象光として検出することが挙げられる。
【００１５】
蛍光色素を用いる場合は、例えば、測定光Ｌ１２を指向性光とし、この波長（例えば、レーザーの波長）に対応した蛍光色素を用いることができる。
【００１６】
例えば、Ａｒイオンレーザー（４８８ｎｍ）の場合には、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）やＰｅｒＣＰ（peridinin chlorophyll protein）等の蛍光色素を用いることができる。また、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）の場合には、ＡＰＣ（allophycocyanin）やＡＰＣ−Ｃｙ７等の蛍光色素を用いることができる。ダイレーザー（５９８ｎｍ）の場合には、ＴＲ（Texas Red）等の蛍光色素を用いることができる。Ｃｒレーザー（４０７ｎｍ）レーザーや半導体レーザーの場合には、Cascade Blue等の蛍光色素を用いることができる。
【００１７】
検出対象光の検出は、ラベリング等を行わずに微小粒子Ｓからの散乱光を検出してもよい。例えば、微小粒子Ｓに測定光Ｌ２２を照射することで発生する散乱光を検出してもよい。この場合にも、例えば、光Ｌ２２を指向性光とすることで、より高精度の位置情報の検出ができる。散乱光としては、前方散乱光（符号Ｌ１３１参照）や側方散乱光（符号Ｌ１３２，Ｌ１３３参照）が挙げられる。
【００１８】
本発明は、流路層１１の流路表面に設けられた反射膜１１１１，１１１１，１１１１によって検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を反射あるいは干渉させること等により、所定方向に出射させるものである。このように、所定方向に出射させることで、効率よく検出対象光を集光し、これを検出部１３で検出できる。特に、検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を、夫々対応する検出器１３１，１３２，１３３の設置方向に向かって出射させることで、前記検出器１３１，１３２，１３３の検出精度を向上させることができる。
【００１９】
そして、基板１１の構造に関し、より好適には、流路Ｘの断面視、前記測定光Ｌ１２の入射方向に対する前記流路表面の角度が略４５度である領域を有することが望ましい（図１参照）。これにより、微小粒子Ｓの側方から出る側方散乱光や蛍光等を効率よく反射させて所定方向に出射させることができる（例えば、検出対象光Ｌ１３２，Ｌ１３３等参照）。従って、優れた光集光効率とすることができる。
【００２０】
従って、本発明によれば、簡易な装置構造でありながら、測定精度を向上できる。前記所定方向は、装置構造等を考慮して適宜好適な方向となるように調整することができるが、好適には、前記測定光Ｌ１２と同軸方向であることが望ましい。更には、測定光Ｌ１２の入射方向が流路表面に対して略垂直に面する方向であることが望ましい。これにより、四周に散乱する側方散乱光等を効率よく集光できる。
【００２１】
以下、光学測定装置１の各構成についてより詳細に説明する。
【００２２】
基板１１は、微小粒子Ｓを導入可能な流路Ｘを備えた構造である。この流路Ｘは、流路層１１１と流路保護層１１２を積層することで形成されている。流路層１１１の流路表面は反射膜１１１１によって形成されている。なお、図１では流路Ｘ内の構造は簡略化して表しているが、流路Ｘ内に媒体を流すことで微小粒子Ｓが流路Ｘ内を移動することができる。なお、図１では、微小粒子Ｓは紙面の垂直方向に移動している状態を示しており、流路Ｘの流路幅を正面視した状態である。
【００２３】
本発明において流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓの種類は限定されない。例えば、微小粒子Ｓは種々の生体細胞やビーズ等の微小構造体であってもよい。また、流路Ｘ内の媒体は流体であればよく、種々の溶液や気体等を用いることができる。微小粒子Ｓや照射条件等を考慮して好適な媒体を選択することができる。
【００２４】
流路層１１１の流路表面は、検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３が流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかを行い得るように処理されていればよく、その処理手法について限定するものではない。処理手法としては、例えば、流路表面の所定の一面若しくは複数面に、反射膜１１１１を設けることが挙げられる。
【００２５】
また、流路表面に、反射光強度を強めることができる干渉膜を設けてもよい。これにより検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３の光強度を増幅できるため、測定精度をより向上できる点で望ましい。このような干渉膜として用いるものは限定されないが、例えば、多層膜干渉を利用した誘電体多層膜フィルタ（干渉膜フィルタ）等が挙げられる。また、流路表面に薄膜干渉を利用した表面処理を行うことで、任意の透過率や反射率となるように流路表面を設計できる。
【００２６】
更に好適には、所定波長の光を透過させる波長選択膜を設けることが望ましい。特に、流路表面への測定光Ｌ１２の入射方向に対して、略垂直に面するように波長選択膜を形成することが望ましい。これに関する形態例については後述する。
【００２７】
光源１２の種類は特に限定されないが、好適には、レーザーやＬＥＤ（Light Emission Diode；発光ダイオード）等の指向性光の光源であることが望ましい。測定光Ｌ１２としてレーザーを用いる場合、その媒体としては、例えば、半導体レーザーや液体レーザーや気体レーザーや固体レーザー等が挙げられる。
【００２８】
半導体レーザーとしては、ＧａＡｓレーザーやＩｎＧａＡｓＰレーザー等が挙げられる。ガスレーザーとしては、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（赤色）、Ａｒレーザー（可視、青色又は緑色）、ＣＯ２レーザー（赤外線）、エキシマーレーザー（紫色等）等が挙げられる。液体レーザーとしては、色素レーザー等が挙げられる。固体レーザーとしては、ルビーレーザーやＹＡＧレーザーやガラスレーザー等が挙げられる。また、レーザーダイオード（ＬＤ）でＮｄ：ＹＡＧ等の固体媒体を励起して発振させるＤＰＳＳ（ダイオード励起固体レーザー）等も用いることができる。
【００２９】
また、図示はしないが、測定光Ｌ１２の走査手段を別途設けることができる。本発明に係る光学測定装置１としては、流路Ｘの流路幅よりも小さい照射スポットである測定光Ｌ１２を照射する光源１２と、前記測定光Ｌ１２を流路幅方向に走査させる走査手段を更に備えた光学測定装置とすることが望ましい。これにより、微小粒子Ｓに対して十分かつ正確な光照射を行うことができる。従って、照射後の光集光効率だけでなく、照射時の照射効率も優れた光学測定装置とできる。これにより更に高精度の測定結果を得ることができる。特に、測定光Ｌ１２がレーザー等の指向性光である場合に好適である。
【００３０】
測定光Ｌ１２を流路幅方向に走査させながら照射することで、複数の照射スポットを流路Ｘの幅方向に渡って作り出すことができる。その結果、流路Ｘ内を移動する微小粒子Ｓに対して確実かつ十分に光照射ができる。流路Ｘ内を微小粒子Ｓが移動する場合、流路Ｘ内の微小粒子Ｓの位置が変化する。特に、微小粒子Ｓの大きさが流路Ｘの流路幅に比してかなり小さい場合には、流路Ｘ内で微小粒子Ｓが一定の自由度を有して移動する。そのため、大きな照射むらや照射位置ずれやフォーカス位置ずれ等が生じることがある。このようなことが測定光Ｌ１２の照射効率の低下の一因となっていた。
【００３１】
これに関して、ビームスポット径を大きくしたり、照射時間を長くしたりすることが行われている。しかし、ビームスポットのエネルギー密度を強くするために光源の出力パワーを上げなければならなかったり、照射時間の制限を受ける等といった光源に関する制約が生じる。一方、本発明では、ビームスポット径が小さい測定光Ｌ１２を、流路幅方向に走査しながら照射する。これにより、ビームスポット径を大きくしたり、無駄に長時間照射することもなく、確実かつ十分に微小粒子Ｓに光照射できる。
【００３２】
なお、この場合、測定光Ｌ１２の走査角度や走査速度等を考慮して基板１１の流路表面の表面処理を行うことが望ましい。例えば、測定光Ｌ１２の入射角の範囲等を考慮して、検出対象光Ｌ１３１，１３２，１３３等が所定の出射方向に出射するように反射膜や干渉膜を設けること等が挙げられる。
【００３３】
走査条件は特に限定されないが、下記式（１）を満たす条件で光照射することが望ましい。このような条件で走査することで、走査スポットが流路Ｘの流路幅を通過する時間内に、微小粒子Ｓがこの走査スポットを１回以上横切ることになる。その結果、流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓを必ず走査スポットで検出できる。
【００３４】
【数１】
【００３５】
走査手段は特に限定されないが、好適にはガルバノミラーや、電気光学素子や、ポリゴンミラーや、ＭＥＭＳ素子等によって測定光Ｌ１２を走査させることが望ましい。特に、電気光学素子は可動部がないため、安定性や信頼性が高い点で好適である。また、これらの走査手段を複数用いてもよい。
【００３６】
また、図示はしないが、微小粒子Ｓの流路Ｘ内の位置情報に基づいて測定光Ｌ１２の照射制御を行なう照射制御手段等を更に設けてもよい。具体的には、別途の光源と、この光源から微小粒子Ｓの位置情報を得るための光を照射することで、流路Ｘ内における微小粒子Ｓの位置情報を得て、この位置情報に基づいて光源１２の照射を制御する照射制御手段とを、更に設けた光学測定装置とすることが望ましい。
【００３７】
別途、微小粒子Ｓの流路Ｘ内における位置情報（例えば、移動速度、流路Ｘ内の存在位置等）を得ておき、これに基づいて光照射を制御することで、より正確に測定光Ｌ１２を微小粒子Ｓに照射できる。この位置情報とは、流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓの移動速度や、３次元の存在位置等に関する情報等をいい、流路Ｘ内における微小粒子Ｓのベクトルに関連するあらゆる情報を包含する。
【００３８】
例えば、測定光Ｌ１２の照射スポットとは別の位置に、位置情報を得るための光の照射スポットを流路Ｘ内に設ける。そして、この光を微小粒子Ｓに照射することで得られる蛍光や散乱光等を検出する。この検出結果を、微小粒子Ｓの位置情報として得ることができる。
【００３９】
そして、この位置情報を、光源１２の光照射のトリガタイミング等として光源１２の光学系にフィードバックさせる。これによって、適切な照射タイミングで所望の照射位置に、測定光Ｌ１２を照射できる。なお、光源１２から照射する測定光Ｌ１２も、微小粒子Ｓの位置情報等を得ることに用いてもよいことは勿論である。
【００４０】
検出部１３では、検出した検出対象光の測定データをアナログデジタルコンバーター（ＡＤＣ）等によってデジタル信号に変換し、この信号をコンピューターにより演算処理することで、微小粒子Ｓの測定を行うことができる。
【００４１】
検出部１３としては、検出対象光の出射方向に対応した検出器１３１，１３２，１３３を設けることができる。集光する光の数は３本である必要はなく、検出器の数も３に限定するものではない。また、本発明では、検出対象光が所定方向に揃って出射させるため、この検出対象光Ｌ１３１，Ｌ１３２，Ｌ１３３を集光レンズ等により１本に集光することができる。これにより検出器の数を減らすこともできる。また、前方散乱光を検出する検出器と、側方散乱光を検出する検出器と、蛍光を検出する検出器を、夫々設けることもできる。
【００４２】
本発明に係る光学測定装置は、流路が配設された基板上で微小粒子の測定等を行なうことができ、更には基板が装置本体から脱着可能であるため基板の使い捨てが可能である。このため、基板の繰り返しの使用における被測定物のコンタミネーションを抑制でき、生体細胞等を扱う場合は細胞の純度を上げたり、コンタミネーションを抑制することが可能となる。
【００４３】
図２は、本発明に係る光学測定装置の第２実施形態の側面概略図である。
【００４４】
図２の符号２は、光学測定装置を示している。該光学測定装置２は、流路表面に特定波長の光を透過する波長選択膜が少なくとも形成されていることを特徴の一としている。以下、第１実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。
【００４５】
前記光学測定装置２は、基板２１の流路Ｘ中に存在する微小粒子Ｓに対して、光源２２から測定光Ｌ２２を照射する。これにより得られる検出対象光Ｌ２３１，Ｌ２３２，Ｌ２３３を、検出部２３の検出器２３１，２３２，２３３で夫々検出するものである。基板２１の流路表面には、反射膜２１１１，２１１１と、波長選択膜２１１２とが形成されている。
【００４６】
基板２１は流路層２１１と流路保護層２１２とから構成されている。そして、流路表面に、所定波長の光を透過させる波長選択膜２１１２を設けることで、検出する必要がない測定光Ｌ２２をそのまま透過させることができる。その結果、検出対象光Ｌ２３１，Ｌ２３２，Ｌ２３３に測定光Ｌ２２がさしこむことを防止できる。特に、前方散乱光（符号Ｌ２３１参照）を検出する際にはより測定精度を向上できるため好適である。従って、波長選択膜２１１２は、測定光Ｌ２２が流路表面に入射する方向に対して、略垂直に面するように形成することが望ましい（図２参照）。
【００４７】
波長選択膜の種類は限定されないが、例えば、窒化シリコン、窒化アルミニウム、酸化シリコン等の光学干渉膜を用いることができる。より好適には、流体による光学干渉膜の腐食防止等の観点から、これら光学干渉膜の多層構造や、腐食防止膜を積層した多層構造等を用いることが望ましい。
【００４８】
図３は、本発明に係る光学測定装置の第３実施形態の側面概略図である。
【００４９】
図３の符号３は、光学測定装置を示している。該光学測定装置３は、流路表面の形状を曲面に形成した点を特徴の一としている。以下、先に述べた各実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。なお、図３は、流路構造についてのみ示しており、装置全体の構成は省略している。
【００５０】
前記光学測定装置３は、基板３１の流路Ｘ中に存在する微小粒子Ｓに対して、測定光Ｌ３２を照射する。これにより得られる検出対象光Ｌ３３１，Ｌ３３２，Ｌ３３３，Ｌ３３４，Ｌ３３５を検出するものである。基板３１は、流路層３１１と流路保護層３１２とから構成されている。そして、流路層３１１の流路表面には、反射膜３１１１が形成されているが、その形状は曲面である。
【００５１】
流路Ｘの流路表面の形状については限定されないことは前述したが、より好ましくは、曲面形状とすることが望ましい。少なくとも、微小粒子Ｓから発する側方散乱光や蛍光等の検出対象光について、より多くの光を所定方向に集光・出射させることができる点で好適である。曲面の形状は、曲面構造により集光される光が、検出用光学レンズ等を用いて検出部（図示せず）に効率的に入射できるようにパラボリック形状等であることが好ましい。
【００５２】
なお、図示はしないが、検出対象光Ｌ３３１,Ｌ３３２，Ｌ３３３，Ｌ３３４，Ｌ３３５を集光レンズ等を用いて集光した後に検出部（図示せず）で検出する装置構成としてもよい。
【００５３】
図４は、本発明に係る光学測定装置の第４実施形態の側面概略図である。
【００５４】
図４の符号４は、光学測定装置を示している。該光学測定装置４は、２枚の流路層を貼り合わせた基板を用いている点を特徴の一としている。以下、先に述べた各実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。
【００５５】
前記光学測定装置４は、基板４１を備えており、該基板４１では、流路層４１１と流路保護層４１２が積層されることで流路Ｘを形成している。そして、夫々の流路層４１１，４１１は貼り合わせ層４１３を介して貼り合わされている。これにより、基板４１の両面（表裏面）で夫々測定を行うことができる。
【００５６】
夫々の流路層４１１の流路Ｘで行なう光学測定について説明する。流路Ｘ内に存在する微小粒子Ｓに対して光源４２から測定光Ｌ４２を照射する。これにより得られる検出対象光Ｌ４３１，Ｌ４３２，Ｌ４３３を検出部４３で検出する。検出部４３は、各検出対象光に対応する検出器４３１，４３２，４３３を有している。
【００５７】
流路層４１１単独からなる基板等であれば、温度や湿度等の影響によって変形する場合がある。その結果、光照射の焦点位置が変化してしまう場合がある。このような場合には、光学的なアライメントが別途必要となる。あるいは、測定に使用できる回数が限られてしまう場合もある。
【００５８】
これに対して、少なくとも本発明によれば、少なくともいずれか一方の流路層４１１についてみれば、貼り合わせ層４１３を介して一方の流路層４１１により支持することができる。即ち、流路層４１１，４１１が互いを支持しあうことができる。その結果、前述のような反り返り現象を防止できる。
【００５９】
そして、本発明では、２枚の流路層４１１，４１１を貼り合わせる基板構造に限定するものではない。例えば、少なくとも１枚の流路層４１１を単なる支持層に積層させる基板構造としてもよい。即ち、図４に示す１枚の流路層４１１をダミー層として用いることができる。この場合の支持層（ダミー層）には、基板４１で行う処理条件や微小粒子情報（例えば、細胞名や化合物名等）等を記入しておくこともできる。
【００６０】
また、従来の透過方式による散乱光検出や蛍光検出の場合には、基板の一方向からしか測定光を照射できない。これに対して、本発明によれば、検出対象光Ｌ４３１，Ｌ４３２，Ｌ４３３を流路表面で反射又は屈折させることで、所定方向（好適には、測定光Ｌ４２と同軸方向）に出射させることができる。これにより、基板４１の両面での測定が可能となる。その結果、流路Ｘ中に存在する微小粒子Ｓの解析処理スピードを改善することができ、かつ温度や湿度等による変形や反り返りも防止できる。
【００６１】
流路層４１１の材料については限定されず、例えば、ポリカーボネートや各種プラスチック等を用いることができる。特に、支持層として用いる場合には、前記の反り返り防止の効果が高い材料として、シリコン基板やガラス基板等を用いることができる。また、流路層４１１，４１１の接合は圧着や加熱圧着によって行うことができ、貼り合わせ層４１３には、例えば、熱硬化性樹脂やＵＶ硬化性樹脂等を用いることができる。
【００６２】
流路保護層４１２の材料については限定されず、例えば、ポリカーボネートや各種プラスチック等を用いることができる。また、流路保護層４１２は、貼着可能なシーリング層として用いることもできる。このような流路保護層４１２を設けることで、流路Ｘに微小粒子Ｓを効率よく導入することもできる。
【００６３】
そして、前記流路層４１１や、流路保護層４１２や、貼り合わせ層４１３の厚さについても限定されないが、好適には、略同じ厚さであることが望ましく、これにより温度や湿度による変形を相殺させることができる点で好適である。
【００６４】
図５は、本発明に係る光学測定装置の第５実施形態の概念図である。
【００６５】
図５の符号５は、光学測定装置を示している。該光学測定装置５は、基板５１と、光源５２と、検出部５３と、反射ミラー５４，５５，５６と、集光レンズ５７を備えている。以下、先の述べた各実施形態との共通点は説明を割愛し、相違点を中心に説明する。なお、図５では、基板５１の構造や流路内の微小粒子等は簡略化して示しており、今まで述べた基板の種々の構造を備えるように設計できることは勿論である。
【００６６】
光源５２から測定光Ｌ５２が照射され、反射ミラー５４を経て対物レンズ５７で集光されて、基板５１の流路内の微小粒子に照射される。そして、これにより生じる検出対象光Ｌ５３１，Ｌ５３２は、前記測定光Ｌ５２と同軸方向に出射して、反射ミラー５５，５６を経由して、検出部５３で検出される。検出部５３では、検出器５３１で検出対象光Ｌ５３１を、検出器５３２で検出対象光Ｌ５３２を検出する。
【００６７】
このように、本発明では、検出する検出対象光を透過させるのではなく、所定方向に反射させるため、検出部５３の検出器５３１，５３２をまとめて設置することができる。これにより、装置構成の簡略化が可能となる点で望ましい。そして、入射光路と出射光路を同一光路とすることが望ましい。
【００６８】
本発明に係る光学測定装置は、種々の技術分野に応用することができ、例えば、粒子径分布測定や流体画像解析や三次元測定やレーザー顕微鏡等をはじめとする指向性光を利用した計測装置・解析装置に応用できる。そのなかでも、流路中に存在する微小粒子に対して照射を行う微粒子解析装置等に好適に用いることができる。
【００６９】
微粒子解析装置としては、フローサイトメーターやビーズアッセイ（フロービーズアッセイ）等の解析装置が挙げられる。即ち、微小粒子に対して光照射を行い、得られる蛍光や散乱光等の検出対象光を検出することで、微小粒子の分取等を行うものである。
【００７０】
フローサイトメトリーには、微小粒子の大きさや構造等を測定することのみを目的とするものや、さらに測定された大きさや構造等に基づいて所望の微小粒子を分取できるように構成として用いるものがある。このうち、特に細胞の分取を行なうものをセルソータとして用いることができる。
【００７１】
微小粒子をソーティングする際に、本発明の光学測定装置を光学的検出機構に用いることができる。即ち、流路中に存在する微小粒子（生体細胞等）に対して正確な位置に光照射できるため、生体細胞中にごくわずかに存在する幹細胞等であっても正確かつ効率よくソーティングすることができる。
【００７２】
あるいは、流路Ｘ内で所定の化学反応を行なうマイクロリアクターとして用いる場合にも、本発明の光学測定装置を光学的検出機構として用いることができる。流路Ｘにおいて何らかの反応が進行し、その後の反応物（微小粒子Ｓ）に対して指向性光を照射して分光検出を行い、かつその結果に応じて分取（ソーティング）するといった用途に用いることができる。
【００７３】
従って、今まで説明した光学測定装置を備えた微粒子解析装置とすることもでき、更に前記流路に存在する微小粒子Ｓを加工する加工部や、所定の処理を行う処理部や、所定の基準に従って分別する分別部等を別途設けることができる。
【００７４】
具体的には、加工部は、微小粒子Ｓに対して何らかの手を加える操作を行うものを包含し、例えば、レーザー加工や表面加工等を行うものが挙げられる。処理部は、微小粒子Ｓに対して何らかの処理を行うものを包含し、例えば、化学的処理、物理的処理、活性化処理、加熱処理、洗浄処理等を行うものが挙げられる。分別部は、微小粒子Ｓを何らかの基準に基づいて分別・分離したり、更には分取（ソーティング）したりするものが挙げられる。
【００７５】
このように光照射によって得られた微小粒子Ｓの反応結果や位置情報に基づいて、加工や処理や分別等を別途行うことができる。本発明の光照射により生じる検出対象光等の集光効率が優れているため、より高精度の光検出（分光測定等）が可能である。即ち、本発明では、光学測定装置にこれら加工部や処理部や分別部を単に組み合わせるだけでなく、光照射による検出結果をこれらの操作にフィードバックさせることができる。これにより、別途行う微小粒子Ｓへの加工や処理や分別等についても正確かつ効率よく行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係る光学測定装置及び微粒子解析装置によれば、測定精度が高い光学測定が可能であるため、バイオテクノロジー分野のみならず、各種光学測定機器や分析機器をはじめとする幅広い分野に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明に係る光学測定装置の第１実施形態の側面概略図である。
【図２】本発明に係る光学測定装置の第２実施形態の側面概略図である。
【図３】本発明に係る光学測定装置の第３実施形態の側面概略図である。
【図４】本発明に係る光学測定装置の第４実施形態の側面概略図である。
【図５】本発明に係る光学測定装置の第５実施形態の概略図である。
【図６】従来の光学測定装置の一例を説明するための概略図である。
【符号の説明】
【００７８】
１，２，３，４，５ 光学測定装置
１１，２１，３１，４１，５１ 基板
１２，２２，４２，５２ 光源
１３，２３，４３，５３ 検出部
Ｘ 流路
Ｓ 微小粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子を導入可能な流路が配設された基板と、
前記微小粒子に対して測定光を照射する光源と、
前記測定光の照射により生じる検出対象光を検出する検出部と、
を少なくとも備え、
前記検出対象光を流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかにより所定方向に出射させるように前記基板の流路表面が処理された光学測定装置。
【請求項２】
前記所定方向は、前記測定光の照射の入射方向と同軸方向であることを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項３】
前記流路に、所定波長の光を透過する波長選択膜が少なくとも形成されたことを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項４】
前記流路の断面視、前記測定光の入射方向に対する前記流路表面の角度が略４５度である領域を少なくとも備えることを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項５】
前記基板は、流路層が支持層に積層された構造であることを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項６】
流路が前記支持層にも配設されていることを特徴とする請求項５記載に光学測定装置。
【請求項７】
請求項１に記載の光学測定装置を備えた微粒子解析装置。
【請求項１】
微小粒子を導入可能な流路が配設された基板と、
前記微小粒子に対して測定光を照射する光源と、
前記測定光の照射により生じる検出対象光を検出する検出部と、
を少なくとも備え、
前記検出対象光を流路表面で反射又は屈折の少なくともいずれかにより所定方向に出射させるように前記基板の流路表面が処理された光学測定装置。
【請求項２】
前記所定方向は、前記測定光の照射の入射方向と同軸方向であることを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項３】
前記流路に、所定波長の光を透過する波長選択膜が少なくとも形成されたことを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項４】
前記流路の断面視、前記測定光の入射方向に対する前記流路表面の角度が略４５度である領域を少なくとも備えることを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項５】
前記基板は、流路層が支持層に積層された構造であることを特徴とする請求項１記載の光学測定装置。
【請求項６】
流路が前記支持層にも配設されていることを特徴とする請求項５記載に光学測定装置。
【請求項７】
請求項１に記載の光学測定装置を備えた微粒子解析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−６３４６２（Ｐ２００９−６３４６２Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３２１７６（Ｐ２００７−２３２１７６）
【出願日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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