光学異性体の異なる乳酸混合物の製造法
【構成】 生産する乳酸の光学特性が異なる、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、乳酸発酵せしめることから成る、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【効果】 生産すべき乳酸の光学特性の異なる、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、特に、糖の資化性や、発酵温度などのような発酵条件の差異を利用して、所定の光学異性体比率を持った乳酸混合物を、効率よく、生産することが出来る。したがって、本発明の方法は、従来型の乳酸発酵プロセスに比し、製造費上、特に不利な面は無く、光学異性体の異なる乳酸混合物の、経済的な製造法と位置付けることが出来よう。
【効果】 生産すべき乳酸の光学特性の異なる、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、特に、糖の資化性や、発酵温度などのような発酵条件の差異を利用して、所定の光学異性体比率を持った乳酸混合物を、効率よく、生産することが出来る。したがって、本発明の方法は、従来型の乳酸発酵プロセスに比し、製造費上、特に不利な面は無く、光学異性体の異なる乳酸混合物の、経済的な製造法と位置付けることが出来よう。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規にして有用なる、光学異性体の異なる乳酸混合物の製造法に関する。さらに詳細には、光学特性の異なる乳酸を生産する、２種以上の微生物を用いる混合培養により、乳酸発酵せしめて、乳酸発酵せしめることから成る、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法に関する。
【０００２】つまり、所定の光学異性体比率を有する乳酸を、効率的に、生産する方法に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】乳酸は、化学合成法ならびに発酵法で以て生産されており、前者方法にあっては、専ら、ラセミ体が、後者方法にあっては、用いる微生物によって、Ｌ体、Ｄ体および／またはラセミ体なる種々の異性体が得られるというように、生産方法によって、生産物が異なっている。
【０００４】かかる乳酸の用途としては、醸造用、漬物用または清涼飲料用の酸味料などのような食品添加物用として、医薬品用として、あるいは工業用としてなど、広範ではあるが、特に、光学活性乳酸については、Ｌ体の外科縫合糸ならびに骨折箇所接合ピンなどの生体適合医用高分子材料の原料への利用が知られているし、また、Ｄ体の光学活性農薬の中間体への利用が知られている。
【０００５】近年、地球環境保全の観点から、分解性プラスチックが注目されており、乳酸を原料とする乳酸ポリマーもまた、その高い加水分解性の故に、有望な素材として期待されている。分解性プラスチックは、分解性のほかに、いわゆるプラスチックとして要求される物性をも、併せ持たなければならないが、乳酸ポリマーの場合には、構成する乳酸の光学異性体の比率が、両者に影響を及ぼすことが知られている。
【０００６】従来において、生産されていた乳酸は、ラセミ体あるいは光学純度の高いＬ体またはＤ体のみである処から、所定の光学異性体比率を有する乳酸を得るためには、異なった光学特性を有する乳酸を、別々に、製造し、あるいは購入して、混合せしめるという方法を採っていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】かかる乳酸ポリマーを、汎用性のプラスチック素材とするためには、原料たる乳酸を、安価に、製造することが必要であるが、別系列の発酵設備で生産したり、精製後に混合調整することは、経済的に得策では無く、乳酸ポリマーの低廉化ならびに汎用化を妨げる一因ともなっていた。
【０００８】しかるに、本発明者らは、従来技術における種々の欠点の存在に鑑みて、所定の光学異性体比率を有する乳酸を得るために、異なった光学特性を有する乳酸を、別々に、製造し、あるいは購入して、混合せしめるという、いわゆる煩雑なる方法を採らずに、連続した操作で以て、簡単に、調製することの出来る、斬新なる方法で以て、目的とする、光学異性体の異なる乳酸混合物を提供するべく、鋭意、研究を開始した。
【０００９】したがって、本発明が解決しようとする課題は、一にかかって、生産すべき乳酸の光学特性の異なる、２種類以上の微生物を併用することによって、所定の光学異性体比率（Ｄ／Ｌ）を持った乳酸を、一層、効率的に、生産する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、前述したような現状に鑑み、そして、上述した如き発明が解決しようとする課題に照準を合わせて、鋭意、検討を重ねた結果、生産する乳酸の光学特性が異なり、しかも、発酵条件および／または糖の資化性の異なる、２種類以上の微生物を併用することによって、所定の光学異性体比率を持った乳酸を、一層、効率的に、生産し得ることを見い出して、ここに、本発明を完成させるに到った。
【００１１】すなわち、本発明は、光学特性の異なる乳酸を生産する、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、乳酸発酵せしめることから成る、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法を提供しようとするものである。
【００１２】前述した如く、発酵乳酸は、その旋行性により、左旋性のＤ（＋）乳酸、右旋性のＬ（−）乳酸、そして、ラセミ体である、不旋性のＤＬ乳酸という乳酸類に大別され、その光学特性は、主として、用いられる微生物に依存する。
【００１３】より詳細には、たとえば、ラクトバチルス属の同定における判定基準となっているように〔微生物、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．３（１９９０）〕、生産に用いる微生物によって、Ｌ（＋）乳酸とＤ（−）乳酸との比率が異なり（以下、この比率をＤ／Ｌ比と略記する。）、総乳酸量中に占めるＬ（＋）乳酸の割合（％）が０〜２０％のものをＤ（−）と呼び、２０〜４０％のものをＤ＋ＤＬと呼び、４０〜６０％のものをＤＬと呼び、６０〜８０％のものをＬ＋ＤＬと呼び、そして、８０〜１００％のものをＬ（＋）乳酸と呼ぶこともある。
【００１４】すなわち、適当なる微生物を用いれば、特定のＤ／Ｌ比を持った乳酸を発酵生産することは、理論的には、可能である。しかし、商業生産の場合には、生産速度、収率ならびに扱い易さなどの面から、使用し得る微生物は限定されるし、ましてや、任意のＤ／Ｌ比を持った乳酸を、適宜、生産することは、実用上は、極めて、困難である。
【００１５】しかるに、本発明者らは、鋭意、研究した結果、光学特性の異なる乳酸を生産する、２種類以上の微生物の混合培養によって、任意のＤ／Ｌ比を持った乳酸を、効率よく、生産する方法を開発した。
【００１６】ここにおいて、右旋性のＬ（−）乳酸を生産する微生物を（Ｌ）と称し、左旋性のＤ（−）乳酸を生産する微生物を（Ｄ）と称し、不旋光性のＤＬ乳酸を生産する微生物を（Ｒ）と称することにする。
【００１７】種々の（Ｌ）、（Ｄ）、（Ｒ）の特性、たとえば、温度、ｐＨ、基質濃度、乳酸濃度ならびに培地組成などの、いわゆる環境条件と、増殖活性、基質消費速度、乳酸生産速度ならびに収率などとを、詳細に調査し、研究して、（Ｌ）と（Ｄ）；（Ｌ）と（Ｒ）；（Ｄ）と（Ｒ）；あるいは（Ｌ）と（Ｄ）と（Ｒ）とを、適宜、選定して組み合わせ、或る適当なる発酵条件にて、同一発酵槽内で、混合培養せしめることによって、それぞれに特有の光学特性を有する乳酸を作らせることにすれば、所定の光学異性体比率を持った乳酸を、安価に、生産することが可能である。
【００１８】さらに、本発明者らは、生産すべき乳酸の光学特性のみならず、発酵条件が、著しく、異なった２種類以上の微生物を用い、これらの差異を利用して混合培養せしめることによって、任意の光学異性体比率を持った乳酸を、一層、確実に得るということにも成功した。
【００１９】たとえば、乳酸生産微生物は、前述した如き生産乳酸の光学特性による分類のほかにも、その生育し得る温度範囲によって、低温適性菌、中温適性菌および高温適性菌に大別することが出来るが、低温適性の（Ｌ）と、高温適性の（Ｄ）とを同時に用いて、まず、低温条件にて所定量のＬ−乳酸を生産せしめたのち、温度を、高温にシフトして、残った糖で以て、あるいは必要量の糖を追加して、発酵を継続することにすれば、（Ｌ）は、もはや、乳酸を活発に生産することは出来なくなるし、その一方で、（Ｄ）のみが活発に発酵して、残糖量に相当する、あるいはそれに追加した糖量に相当するＤ−乳酸を生産することが出来るので、任意の光学特性比率を持った乳酸混合物を、確実に、製造することが出来る。
【００２０】上記の発酵条件の差異の一つに、糖の資化性がある。すなわち、微生物は、その種類によって、乳酸に転化できる糖の種類が異なることが知られており、たとえば、シュクロースを基質とすることは出来るが、ラクトースの方は利用することが出来ない（Ｌ）と、ラクトースを基質とすることは出来るが、シュクロースの方は利用することが出来ない（Ｄ）とを、同時に用いて混合培養せしめることとし、このさいに、培地中の糖として、シュクロースとラクトースとの量を、所定の比率に設定しておけば、その比率に応じたＬとＤとの比率を持った乳酸混合物を、一層、容易に、生産することが出来る。
【００２１】
【実施例】次に、本発明を実施例により、一層、具体的に説明するが、本発明の方法に用いられる微生物や糖は、これらの実施例のみに限定されるものでは無い。たとえば、前述したように、微生物として特に代表的なもののみを例示するにとどめれば、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属またはビフィドバクテリウム属などの、いわゆる乳酸菌のほかにも、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、バチルス属、クロストリヂウム属またはスポロラクトバチルス属などと言った細菌や、リゾプス属などと言ったカビなどのように、乳酸を生産し得る微生物でさえあるならば、すべてが包含される。
【００２２】また、糖として特に代表的なもののみを例示するにとどめれば、グルコース、フルクトース、ガラクトースの如き、各種の単糖類；シュクロース、ラクトースの如き、各種の少糖類およびその加水分解物；デンプン、イヌリンの如き、各種の多糖類およびその加水分解物などをはじめ、さらには、これらの混合物とか、これらを含有せる農産物、畜産物、酪農製品、廃棄物およびその加水分解物の如き、各種の糖類のほかに、１，２−プロパンジオールの如き、各種の炭水化物以外の基質をも使用することが出来る。
【００２３】さらに、たとえば、Ｌ−乳酸生産に当たって用いられる微生物の種類も、１種類である必要は無く、（Ｌ）、（Ｄ）、（Ｒ）の発酵させる順序や、組み合わせについても、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】さらにまた、利用する発酵条件の差異とは、発酵温度範囲や、糖の資化性の差異に留まらず、ｐＨ、微量必須栄養素、溶存酸素濃度、酸化還元電位、通気・攪拌条件、培地組成、塩濃度、発酵促進物質ならびに発酵阻害物などもような、それぞれの微生物の発酵に特有の条件の差異でさえあれば、その一つ、あるいは２つ以上を、適宜、組み合わせて利用することが出来ることは言う迄も無い。
【００２５】実施例 １Ｌ−乳酸生産菌（Ｌ）としては、「ラクトバチルス・カゼイ ＩＦＯ ３４２５」を、Ｄ−乳酸生産菌（Ｒ）としては、「ラクトバチルス・デルブリュッキＩＦＯ ３５３４」を用いた。前者は、ラクトースをＬ−乳酸に転換することは出来るが、シュクロースは、実質的に資化できない。
【００２６】一方、後者は、シュクロースをＤ−乳酸に転化できるが、ラクトースを資化することは出来ない。まず、「ＩＦＯ ８０４」培地を用い、（Ｌ）および（Ｒ）を、３７℃に１日間、静置培養し、種菌と為した。次いで、全糖濃度は同一だが、構成する２種類の糖（シュクロースとラクトースと）の比率を、第１表の如く、変えた殺菌培地を、それぞれ、３００ミリ・リットル（ｍｌ）ずつ準備し、それぞれに、（Ｌ）および（Ｒ）の種菌培養液の２ｍｌを接種して、５００ｍｌ容の三角フラスコ中で、９０ｒｐｍなる回転振とう培養機にて、３７℃で培養せしめた。
【００２７】培養を開始して、３８時間後における、各発酵液中のグルコース、シュクロース、ラクトース、Ｌ−乳酸濃度およびＤ−乳酸濃度を、液体クロマトグラフィーによって分析した処、同表に示されるような結果が得られたが、生産した乳酸の光学異性体比率（Ｌ／Ｄ）は、ほぼ、培地のシュクロースとラクトースとの比率に等しいことが確認・証明された。
【００２８】
【表１】
【００２９】《第１表の脚注》「ｇ／ｌ」は、「グラム／リットル」の略記である。
【００３０】
【表２】
【００３１】実施例 ２Ｌ−乳酸：Ｄ−乳酸＝９：１なる乳酸の生産を目的とし、実施例１と同様の微生物を用いて行った。
【００３２】まず、「ＩＦＯ ８０４」培地を用い、３７℃に１日間、静置培養しておいた（Ｌ）および（Ｒ）の培養液の各２ｍｌを、５００ｍｌ容の三角フラスコ中に入った、第１表に示されるような培地（糖源として、シュクロースが４．５％で、かつ、ラクトースが０．５％である。）の３００ｍｌに加え、９０ｒｐｍなる回転振とう培養機にて、３７℃で培養せしめた。
【００３３】培養を開始して４８時間後における、発酵液中のグルコース、シュクロース、ラクトース、Ｌ−乳酸濃度およびＤ−乳酸濃度を、液体クロマトグラフィーによって分析した処、それぞれ、０．４ｇ／ｌ、０．４ｇ／ｌ、０．３ｇ／ｌ、４２．７ｇ／ｌおよび４．６ｇ／ｌであって、目標のＬ−乳酸：Ｄ−乳酸＝９：１に、ほぼ、匹敵する比率を持った乳酸を、高収率で以て、得ることが出来た。
【００３４】
【表３】
【００３５】実施例 ３Ｌ−乳酸：Ｄ−乳酸＝９：１の乳酸の生産を目的とし、Ｌ−乳酸生産菌（Ｌ）としては、「ラクトバチルス・カゼイ ＡＴＣＣ １１４４３」を、Ｄ−乳酸生産菌（Ｒ）としては、「スポロラクトバチルス・イヌリナス ＩＦＯ １３５９５」を用いた。予備検討の結果、前者の増殖至適温度は３２〜４５℃、 後者のそれは３０〜３５℃であり、後者は、特に、４３℃以上では、増殖も、乳酸発酵も出来ないことが明きらかとなっている。
【００３６】まず、この（Ｌ）を、「ＩＦＯ ８０４」改変培地（炭酸カルシウムを、糖と等量で以て添加したもの）を用い、５００ｍｌ容の三角フラスコ中で、４４℃、９０ｒｐｍなる条件で、また、（Ｒ）を「ＩＦＯ８０３」改変培地（糖源として、ラクトースの代わりに、グルコースを使用し、炭酸カルシウムを、糖と等量で以て添加したもの）を用い、５００ｍｌ容の三角フラスコ中で、３３℃、９０ｒｐｍなる条件で、それぞれ、１日間、振とう培養せしめて種菌と為した。
【００３７】発酵槽に、グルコースの５％、酵母エキスの０．５％、Ｋ2ＨＰＯ4の０．１％、ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏの０．０２％、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏの０．００１％およびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏの０．００１％からなる殺菌培地を、３．５ｌ仕込んで、（Ｌ）および（Ｒ）を、それぞれ、３００ｍｌづつ植菌せしめ、まず、（Ｒ）の発酵至適条件である、温度が３３℃で、かつ、ｐＨが６．５（アンモニア水で調節）で以て、気相中にのみ通気をし、攪拌回転数を１００ｒｐｍにして、回分培養を行った。
【００３８】発酵液を定期的に採取し、糖濃度を、酵素電極法によって分析して、グルコース濃度が４％になった時点から、発酵条件を、（Ｌ）の発酵至適条件である、温度が４４℃で、ｐＨが５．５で、無通気で、かつ、攪拌回転数が１００ｒｐｍなる条件にシフトして、引き続いて、発酵を行った。
【００３９】発酵開始後、２９時間にして、中和用アルカリの消費が止まったので、発酵を終了して、発酵液中のグルコース、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の濃度を、液体クロマトグラフィーで以て分析した処、それぞれ、０．１ｇ／ｌ、３７．９ｇ／ｌおよび１０．２ｇ／ｌであって、目標のＬ−乳酸：Ｄ−乳酸＝８：２に、ほぼ、匹敵する比率を持った乳酸を、高収率で以て、得ることが出来た。
【００４０】
【発明の効果】以上の各実施例からも明らかなように、生産すべき乳酸の光学特性の異なる、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、特に、糖の資化性や、発酵温度などのような発酵条件の差異を利用して、所定の光学異性体比率を持った乳酸混合物を、効率よく、生産することが出来ることが知れよう。
【００４１】本発明の方法は、従来型の乳酸発酵プロセスに比し、製造費上、特に不利な面は無く、光学異性体の異なる乳酸混合物の、経済的な製造法と位置付けることが出来よう。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規にして有用なる、光学異性体の異なる乳酸混合物の製造法に関する。さらに詳細には、光学特性の異なる乳酸を生産する、２種以上の微生物を用いる混合培養により、乳酸発酵せしめて、乳酸発酵せしめることから成る、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法に関する。
【０００２】つまり、所定の光学異性体比率を有する乳酸を、効率的に、生産する方法に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】乳酸は、化学合成法ならびに発酵法で以て生産されており、前者方法にあっては、専ら、ラセミ体が、後者方法にあっては、用いる微生物によって、Ｌ体、Ｄ体および／またはラセミ体なる種々の異性体が得られるというように、生産方法によって、生産物が異なっている。
【０００４】かかる乳酸の用途としては、醸造用、漬物用または清涼飲料用の酸味料などのような食品添加物用として、医薬品用として、あるいは工業用としてなど、広範ではあるが、特に、光学活性乳酸については、Ｌ体の外科縫合糸ならびに骨折箇所接合ピンなどの生体適合医用高分子材料の原料への利用が知られているし、また、Ｄ体の光学活性農薬の中間体への利用が知られている。
【０００５】近年、地球環境保全の観点から、分解性プラスチックが注目されており、乳酸を原料とする乳酸ポリマーもまた、その高い加水分解性の故に、有望な素材として期待されている。分解性プラスチックは、分解性のほかに、いわゆるプラスチックとして要求される物性をも、併せ持たなければならないが、乳酸ポリマーの場合には、構成する乳酸の光学異性体の比率が、両者に影響を及ぼすことが知られている。
【０００６】従来において、生産されていた乳酸は、ラセミ体あるいは光学純度の高いＬ体またはＤ体のみである処から、所定の光学異性体比率を有する乳酸を得るためには、異なった光学特性を有する乳酸を、別々に、製造し、あるいは購入して、混合せしめるという方法を採っていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】かかる乳酸ポリマーを、汎用性のプラスチック素材とするためには、原料たる乳酸を、安価に、製造することが必要であるが、別系列の発酵設備で生産したり、精製後に混合調整することは、経済的に得策では無く、乳酸ポリマーの低廉化ならびに汎用化を妨げる一因ともなっていた。
【０００８】しかるに、本発明者らは、従来技術における種々の欠点の存在に鑑みて、所定の光学異性体比率を有する乳酸を得るために、異なった光学特性を有する乳酸を、別々に、製造し、あるいは購入して、混合せしめるという、いわゆる煩雑なる方法を採らずに、連続した操作で以て、簡単に、調製することの出来る、斬新なる方法で以て、目的とする、光学異性体の異なる乳酸混合物を提供するべく、鋭意、研究を開始した。
【０００９】したがって、本発明が解決しようとする課題は、一にかかって、生産すべき乳酸の光学特性の異なる、２種類以上の微生物を併用することによって、所定の光学異性体比率（Ｄ／Ｌ）を持った乳酸を、一層、効率的に、生産する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、前述したような現状に鑑み、そして、上述した如き発明が解決しようとする課題に照準を合わせて、鋭意、検討を重ねた結果、生産する乳酸の光学特性が異なり、しかも、発酵条件および／または糖の資化性の異なる、２種類以上の微生物を併用することによって、所定の光学異性体比率を持った乳酸を、一層、効率的に、生産し得ることを見い出して、ここに、本発明を完成させるに到った。
【００１１】すなわち、本発明は、光学特性の異なる乳酸を生産する、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、乳酸発酵せしめることから成る、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法を提供しようとするものである。
【００１２】前述した如く、発酵乳酸は、その旋行性により、左旋性のＤ（＋）乳酸、右旋性のＬ（−）乳酸、そして、ラセミ体である、不旋性のＤＬ乳酸という乳酸類に大別され、その光学特性は、主として、用いられる微生物に依存する。
【００１３】より詳細には、たとえば、ラクトバチルス属の同定における判定基準となっているように〔微生物、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．３（１９９０）〕、生産に用いる微生物によって、Ｌ（＋）乳酸とＤ（−）乳酸との比率が異なり（以下、この比率をＤ／Ｌ比と略記する。）、総乳酸量中に占めるＬ（＋）乳酸の割合（％）が０〜２０％のものをＤ（−）と呼び、２０〜４０％のものをＤ＋ＤＬと呼び、４０〜６０％のものをＤＬと呼び、６０〜８０％のものをＬ＋ＤＬと呼び、そして、８０〜１００％のものをＬ（＋）乳酸と呼ぶこともある。
【００１４】すなわち、適当なる微生物を用いれば、特定のＤ／Ｌ比を持った乳酸を発酵生産することは、理論的には、可能である。しかし、商業生産の場合には、生産速度、収率ならびに扱い易さなどの面から、使用し得る微生物は限定されるし、ましてや、任意のＤ／Ｌ比を持った乳酸を、適宜、生産することは、実用上は、極めて、困難である。
【００１５】しかるに、本発明者らは、鋭意、研究した結果、光学特性の異なる乳酸を生産する、２種類以上の微生物の混合培養によって、任意のＤ／Ｌ比を持った乳酸を、効率よく、生産する方法を開発した。
【００１６】ここにおいて、右旋性のＬ（−）乳酸を生産する微生物を（Ｌ）と称し、左旋性のＤ（−）乳酸を生産する微生物を（Ｄ）と称し、不旋光性のＤＬ乳酸を生産する微生物を（Ｒ）と称することにする。
【００１７】種々の（Ｌ）、（Ｄ）、（Ｒ）の特性、たとえば、温度、ｐＨ、基質濃度、乳酸濃度ならびに培地組成などの、いわゆる環境条件と、増殖活性、基質消費速度、乳酸生産速度ならびに収率などとを、詳細に調査し、研究して、（Ｌ）と（Ｄ）；（Ｌ）と（Ｒ）；（Ｄ）と（Ｒ）；あるいは（Ｌ）と（Ｄ）と（Ｒ）とを、適宜、選定して組み合わせ、或る適当なる発酵条件にて、同一発酵槽内で、混合培養せしめることによって、それぞれに特有の光学特性を有する乳酸を作らせることにすれば、所定の光学異性体比率を持った乳酸を、安価に、生産することが可能である。
【００１８】さらに、本発明者らは、生産すべき乳酸の光学特性のみならず、発酵条件が、著しく、異なった２種類以上の微生物を用い、これらの差異を利用して混合培養せしめることによって、任意の光学異性体比率を持った乳酸を、一層、確実に得るということにも成功した。
【００１９】たとえば、乳酸生産微生物は、前述した如き生産乳酸の光学特性による分類のほかにも、その生育し得る温度範囲によって、低温適性菌、中温適性菌および高温適性菌に大別することが出来るが、低温適性の（Ｌ）と、高温適性の（Ｄ）とを同時に用いて、まず、低温条件にて所定量のＬ−乳酸を生産せしめたのち、温度を、高温にシフトして、残った糖で以て、あるいは必要量の糖を追加して、発酵を継続することにすれば、（Ｌ）は、もはや、乳酸を活発に生産することは出来なくなるし、その一方で、（Ｄ）のみが活発に発酵して、残糖量に相当する、あるいはそれに追加した糖量に相当するＤ−乳酸を生産することが出来るので、任意の光学特性比率を持った乳酸混合物を、確実に、製造することが出来る。
【００２０】上記の発酵条件の差異の一つに、糖の資化性がある。すなわち、微生物は、その種類によって、乳酸に転化できる糖の種類が異なることが知られており、たとえば、シュクロースを基質とすることは出来るが、ラクトースの方は利用することが出来ない（Ｌ）と、ラクトースを基質とすることは出来るが、シュクロースの方は利用することが出来ない（Ｄ）とを、同時に用いて混合培養せしめることとし、このさいに、培地中の糖として、シュクロースとラクトースとの量を、所定の比率に設定しておけば、その比率に応じたＬとＤとの比率を持った乳酸混合物を、一層、容易に、生産することが出来る。
【００２１】
【実施例】次に、本発明を実施例により、一層、具体的に説明するが、本発明の方法に用いられる微生物や糖は、これらの実施例のみに限定されるものでは無い。たとえば、前述したように、微生物として特に代表的なもののみを例示するにとどめれば、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属またはビフィドバクテリウム属などの、いわゆる乳酸菌のほかにも、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、バチルス属、クロストリヂウム属またはスポロラクトバチルス属などと言った細菌や、リゾプス属などと言ったカビなどのように、乳酸を生産し得る微生物でさえあるならば、すべてが包含される。
【００２２】また、糖として特に代表的なもののみを例示するにとどめれば、グルコース、フルクトース、ガラクトースの如き、各種の単糖類；シュクロース、ラクトースの如き、各種の少糖類およびその加水分解物；デンプン、イヌリンの如き、各種の多糖類およびその加水分解物などをはじめ、さらには、これらの混合物とか、これらを含有せる農産物、畜産物、酪農製品、廃棄物およびその加水分解物の如き、各種の糖類のほかに、１，２−プロパンジオールの如き、各種の炭水化物以外の基質をも使用することが出来る。
【００２３】さらに、たとえば、Ｌ−乳酸生産に当たって用いられる微生物の種類も、１種類である必要は無く、（Ｌ）、（Ｄ）、（Ｒ）の発酵させる順序や、組み合わせについても、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】さらにまた、利用する発酵条件の差異とは、発酵温度範囲や、糖の資化性の差異に留まらず、ｐＨ、微量必須栄養素、溶存酸素濃度、酸化還元電位、通気・攪拌条件、培地組成、塩濃度、発酵促進物質ならびに発酵阻害物などもような、それぞれの微生物の発酵に特有の条件の差異でさえあれば、その一つ、あるいは２つ以上を、適宜、組み合わせて利用することが出来ることは言う迄も無い。
【００２５】実施例 １Ｌ−乳酸生産菌（Ｌ）としては、「ラクトバチルス・カゼイ ＩＦＯ ３４２５」を、Ｄ−乳酸生産菌（Ｒ）としては、「ラクトバチルス・デルブリュッキＩＦＯ ３５３４」を用いた。前者は、ラクトースをＬ−乳酸に転換することは出来るが、シュクロースは、実質的に資化できない。
【００２６】一方、後者は、シュクロースをＤ−乳酸に転化できるが、ラクトースを資化することは出来ない。まず、「ＩＦＯ ８０４」培地を用い、（Ｌ）および（Ｒ）を、３７℃に１日間、静置培養し、種菌と為した。次いで、全糖濃度は同一だが、構成する２種類の糖（シュクロースとラクトースと）の比率を、第１表の如く、変えた殺菌培地を、それぞれ、３００ミリ・リットル（ｍｌ）ずつ準備し、それぞれに、（Ｌ）および（Ｒ）の種菌培養液の２ｍｌを接種して、５００ｍｌ容の三角フラスコ中で、９０ｒｐｍなる回転振とう培養機にて、３７℃で培養せしめた。
【００２７】培養を開始して、３８時間後における、各発酵液中のグルコース、シュクロース、ラクトース、Ｌ−乳酸濃度およびＤ−乳酸濃度を、液体クロマトグラフィーによって分析した処、同表に示されるような結果が得られたが、生産した乳酸の光学異性体比率（Ｌ／Ｄ）は、ほぼ、培地のシュクロースとラクトースとの比率に等しいことが確認・証明された。
【００２８】
【表１】
【００２９】《第１表の脚注》「ｇ／ｌ」は、「グラム／リットル」の略記である。
【００３０】
【表２】
【００３１】実施例 ２Ｌ−乳酸：Ｄ−乳酸＝９：１なる乳酸の生産を目的とし、実施例１と同様の微生物を用いて行った。
【００３２】まず、「ＩＦＯ ８０４」培地を用い、３７℃に１日間、静置培養しておいた（Ｌ）および（Ｒ）の培養液の各２ｍｌを、５００ｍｌ容の三角フラスコ中に入った、第１表に示されるような培地（糖源として、シュクロースが４．５％で、かつ、ラクトースが０．５％である。）の３００ｍｌに加え、９０ｒｐｍなる回転振とう培養機にて、３７℃で培養せしめた。
【００３３】培養を開始して４８時間後における、発酵液中のグルコース、シュクロース、ラクトース、Ｌ−乳酸濃度およびＤ−乳酸濃度を、液体クロマトグラフィーによって分析した処、それぞれ、０．４ｇ／ｌ、０．４ｇ／ｌ、０．３ｇ／ｌ、４２．７ｇ／ｌおよび４．６ｇ／ｌであって、目標のＬ−乳酸：Ｄ−乳酸＝９：１に、ほぼ、匹敵する比率を持った乳酸を、高収率で以て、得ることが出来た。
【００３４】
【表３】
【００３５】実施例 ３Ｌ−乳酸：Ｄ−乳酸＝９：１の乳酸の生産を目的とし、Ｌ−乳酸生産菌（Ｌ）としては、「ラクトバチルス・カゼイ ＡＴＣＣ １１４４３」を、Ｄ−乳酸生産菌（Ｒ）としては、「スポロラクトバチルス・イヌリナス ＩＦＯ １３５９５」を用いた。予備検討の結果、前者の増殖至適温度は３２〜４５℃、 後者のそれは３０〜３５℃であり、後者は、特に、４３℃以上では、増殖も、乳酸発酵も出来ないことが明きらかとなっている。
【００３６】まず、この（Ｌ）を、「ＩＦＯ ８０４」改変培地（炭酸カルシウムを、糖と等量で以て添加したもの）を用い、５００ｍｌ容の三角フラスコ中で、４４℃、９０ｒｐｍなる条件で、また、（Ｒ）を「ＩＦＯ８０３」改変培地（糖源として、ラクトースの代わりに、グルコースを使用し、炭酸カルシウムを、糖と等量で以て添加したもの）を用い、５００ｍｌ容の三角フラスコ中で、３３℃、９０ｒｐｍなる条件で、それぞれ、１日間、振とう培養せしめて種菌と為した。
【００３７】発酵槽に、グルコースの５％、酵母エキスの０．５％、Ｋ2ＨＰＯ4の０．１％、ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏの０．０２％、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏの０．００１％およびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏの０．００１％からなる殺菌培地を、３．５ｌ仕込んで、（Ｌ）および（Ｒ）を、それぞれ、３００ｍｌづつ植菌せしめ、まず、（Ｒ）の発酵至適条件である、温度が３３℃で、かつ、ｐＨが６．５（アンモニア水で調節）で以て、気相中にのみ通気をし、攪拌回転数を１００ｒｐｍにして、回分培養を行った。
【００３８】発酵液を定期的に採取し、糖濃度を、酵素電極法によって分析して、グルコース濃度が４％になった時点から、発酵条件を、（Ｌ）の発酵至適条件である、温度が４４℃で、ｐＨが５．５で、無通気で、かつ、攪拌回転数が１００ｒｐｍなる条件にシフトして、引き続いて、発酵を行った。
【００３９】発酵開始後、２９時間にして、中和用アルカリの消費が止まったので、発酵を終了して、発酵液中のグルコース、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の濃度を、液体クロマトグラフィーで以て分析した処、それぞれ、０．１ｇ／ｌ、３７．９ｇ／ｌおよび１０．２ｇ／ｌであって、目標のＬ−乳酸：Ｄ−乳酸＝８：２に、ほぼ、匹敵する比率を持った乳酸を、高収率で以て、得ることが出来た。
【００４０】
【発明の効果】以上の各実施例からも明らかなように、生産すべき乳酸の光学特性の異なる、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、特に、糖の資化性や、発酵温度などのような発酵条件の差異を利用して、所定の光学異性体比率を持った乳酸混合物を、効率よく、生産することが出来ることが知れよう。
【００４１】本発明の方法は、従来型の乳酸発酵プロセスに比し、製造費上、特に不利な面は無く、光学異性体の異なる乳酸混合物の、経済的な製造法と位置付けることが出来よう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 光学特性の異なる乳酸を生産する、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、乳酸発酵せしめることを特徴とする、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【請求項２】 光学特性の異なる乳酸を生産し、かつ、乳酸発酵条件の異なる、２種類以上の微生物を用い、それぞれに適した条件で、順次、乳酸発酵せしめることを特徴とする、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【請求項３】 光学特性の異なる乳酸を生産し、かつ、糖の資化性の異なる、２種以上の微生物を用い、それぞれに適した糖を資化せしめることを特徴とする、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【請求項１】 光学特性の異なる乳酸を生産する、２種類以上の微生物を用いる混合培養によって、乳酸発酵せしめることを特徴とする、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【請求項２】 光学特性の異なる乳酸を生産し、かつ、乳酸発酵条件の異なる、２種類以上の微生物を用い、それぞれに適した条件で、順次、乳酸発酵せしめることを特徴とする、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【請求項３】 光学特性の異なる乳酸を生産し、かつ、糖の資化性の異なる、２種以上の微生物を用い、それぞれに適した糖を資化せしめることを特徴とする、光学特性の異なる乳酸混合物の製造法。
【公開番号】特開平５−３２８９９３
【公開日】平成５年（１９９３）１２月１４日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−１４４２５８
【出願日】平成４年（１９９２）６月４日
【出願人】（０００００２８８６）大日本インキ化学工業株式会社 (2,597)
【公開日】平成５年（１９９３）１２月１４日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）６月４日
【出願人】（０００００２８８６）大日本インキ化学工業株式会社 (2,597)
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