【課題】 所望の活性を有する遺伝子生成物をコードする1つ以上の遺伝子エレメントを単離する方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、所望の活性を有する遺伝子生成物をコードする1つ以上の遺伝子エレメントを単離する方法であって、(a) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化し; (b) マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれらの各遺伝子産物を産生させ; (c) 遺伝子エレメントの光学特性の変化を利用して所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップを含む、前記方法を記載する。本発明は、反復的な突然変異誘発と本発明の方法の反復的な適用により、核酸およびタンパク質のin vitroにおける進化を可能とする。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子エレメントを単離する方法であって、その発現により該遺伝子エレメントの光学特性が直接または間接的に改変されるものであり、
(a) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル内に区画化するステップ;
(b) マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ;
(c) 遺伝子エレメントの光学特性の変化により、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ；
を含む上記方法。
【請求項２】
ステップ(b)において、マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性により、直接または間接的に遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントが修飾され、遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロカプセル内の遺伝子エレメントの修飾が該遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子エレメントの修飾により、マイクロカプセルの外部で該遺伝子エレメントがさらに修飾され、その光学特性の変化を誘導することが可能となる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子エレメントの一部がリガンドであり、マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物が直接または間接的に該リガンドに結合することにより、遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
リガンドもまた遺伝子エレメントによりコードされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子エレメントの一部が基質であり、マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性により該基質が、遺伝子エレメントの一部として保持されることにより該遺伝子エレメントの単離を可能にする生成物に、直接または間接的に変換される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性による生成物が、遺伝子エレメントと複合体を形成することにより遺伝子エレメントの単離を可能にする生成物の産生を直接または間接的にもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性により、直接または間接的に区画内で第２の遺伝子の発現の変化をもたらし、該第２の遺伝子の産物の活性により、遺伝子エレメントの光学特性の変化を用いる遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(b)が；
マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させ、そのそれぞれの遺伝子産物を産生させ、該遺伝子産物をそれらをコードする遺伝子エレメントに連結させ、その結果形成される複合体を単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(c)において、前記複合体の変化した光学特性に基づいて該複合体を直接分取し、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(c)において、前記複合体がさらに反応して、遺伝子エレメントの光学特性の、複合体中の所望の活性を有する遺伝子産物の存在に依存する条件的変化を誘導する、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離するために前記複合体をさらなる区画化ステップに供する、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子エレメントの光学特性の変化が特有の光学特性を有する遺伝子産物が遺伝子エレメントに結合することに起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子エレメントの光学特性の変化が特有の光学特性を有するリガンドが遺伝子産物と結合することに起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子エレメントの光学特性の変化がリガンドに結合した際の遺伝子産物の光学特性の変化に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子エレメントの光学特性の変化が、遺伝子産物が結合した際のリガンドの光学特性の変化に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子エレメントの光学特性の変化が、結合した際のリガンドおよび遺伝子産物の双方の光学特性の変化に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子エレメントの光学特性の変化が、選択された反応の基質および生成物の異なる光学特性に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
基質および生成物の双方が同様の光学特性を有するが、選択された反応の生成物だけが遺伝子エレメントと結合または反応するが、基質はそれと結合または反応せず、そのことにより遺伝子エレメントの光学特性が変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
さらに別の試薬が、遺伝子エレメントに結合した生成物と特異的に結合または特異的に反応するが、基質とは結合または反応せず、そのことにより遺伝子エレメントの光学特性を変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子産物の所望ではない活性により遺伝子エレメントの所望の活性により生じるものとは異なる光学特性の変化が起こる、請求項１〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
所望ではない活性により起こる光学的変化を、遺伝子エレメントのネガティブな選択に用いる、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
ネガティブな選択をポジティブな選択と組合せて反応特異性を改善する、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
改善される反応特異性が結合特異性の改善である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
改善される反応特異性が、基質ならびに/または生成物に対する部位および/もしくは立体選択性の改善である、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライブラリーから遺伝子エレメントが単離される、請求項１〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
各遺伝子エレメントが２以上の遺伝子をコードし、各遺伝子産物が、遺伝子エレメントの光学特性が改変されることにより遺伝子エレメントの分取を可能とするような所望の活性を有している、請求項１〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
各遺伝子エレメントが２以上の遺伝子をコードし、該遺伝子産物がマイクロカプセル内で互いに結合し、遺伝子エレメントの光学特性を改変することにより遺伝子エレメントの分取が可能となる、請求項１〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
付加的ステップ
(d) ステップ(c)において単離された遺伝子エレメント中に1つ以上の変異を導入すること、
をさらに含む、請求項１〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ(a)〜(d)の1つ以上を反復することをさらに含む、請求項１〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子エレメントを増幅することをさらに含む、請求項１〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
油をベースとする媒体中で水性溶液の油中水型エマルジョンを形成することによりマイクロカプセル化が達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子エレメントがマイクロビーズに結合する遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
マイクロビーズが非磁性、磁性、または常磁性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
遺伝子エレメントの蛍光の変化を検出することにより遺伝子エレメントを分取する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光活性化セルソーター(FACS)、またはこれに類似した装置を用いて、遺伝子エレメントを分取する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
基質および生成物の異なる蛍光特性が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものである、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
1種以上の試薬を油相に添加することによりマイクロカプセル内の環境を調整する、請求項１〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
所望の遺伝子産物の活性により直接または間接的に修飾された遺伝子エレメントを、チラミドシグナル増幅(TSA(商標)； NEN)によりさらに修飾して該遺伝子エレメントの光学特性を直接または間接的に変化させることにより、遺伝子エレメントの分離が可能となる、請求項１〜39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜40のいずれか1項に記載の方法により単離される産物。
【請求項４２】
遺伝子産物を調製する方法であって、
(a) 遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップ;
(b) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル中へ区画化するステップ;
(c) マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ；
(d)光学特性の変化を用いて、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ;および
(e) 該所望の活性を有する遺伝子産物を発現させるステップ；
を含む、上記方法。
【請求項４３】
遺伝子産物の活性を調節することができる1つ以上の化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製するステップ;
(b) 該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中へ区画化するステップ;
(c) マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ；
(d)光学特性の変化を用いて、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ;および
(e) 所望の活性を有する遺伝子産物を化合物と接触させ、化合物による遺伝子産物の活性の調節をモニターするステップ；
を含む、上記方法。
【請求項４４】
化合物を調製する方法であって、
(a) 少なくとも1つのステップがポリペプチドにより促進される合成方法を提供するステップ；
(b) 該ステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレメントを調製するステップ；
(c) マイクロカプセル内に該遺伝子エレメントを区画化するステップ；
(d) マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させ、それぞれの遺伝子産物を産生させるステップ；
(e)光学特性の変化を用いて、所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ；および
(f) ステップ(e)で関連する合成ステップを促進すると同定されたポリペプチド遺伝子産物を用いて化合物を調製するステップ；
を含む、上記方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【公開番号】特開２０１１−９２２１８（Ｐ２０１１−９２２１８Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３３２１８（Ｐ２０１１−３３２１８）
【出願日】平成２３年２月１８日（２０１１．２．１８）
【分割の表示】特願２０００−５９２４０９（Ｐ２０００−５９２４０９）の分割
【原出願日】平成１２年１月６日（２０００．１．６）
【出願人】（５０３２７６９９７）メディカル　リサーチ　カウンシル (10)
【Ｆターム（参考）】