光学顕微鏡、及びスペクトル測定方法
【課題】短時間にスペクトル測定を行うことができる光学顕微鏡、及びスペクトル測定方法を提供すること。
【解決手段】本発明の第１の態様にかかる光学顕微鏡は、対物レンズ２３を介してレーザ光を試料２４に照射するステップと、対物レンズ２３を介して、試料で反射した反射光を検出するステップと、レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、レーザ光の焦点位置を変化させたときの反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、抽出された焦点位置になるように調整するステップと、焦点位置を調整した状態で、レーザ光の照射により試料から出射される出射光をレーザ光から分岐するステップと、レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器３１で測定するステップと、を備えるものである。
【解決手段】本発明の第１の態様にかかる光学顕微鏡は、対物レンズ２３を介してレーザ光を試料２４に照射するステップと、対物レンズ２３を介して、試料で反射した反射光を検出するステップと、レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、レーザ光の焦点位置を変化させたときの反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、抽出された焦点位置になるように調整するステップと、焦点位置を調整した状態で、レーザ光の照射により試料から出射される出射光をレーザ光から分岐するステップと、レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器３１で測定するステップと、を備えるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡及びスペクトル測定方法に関し、特に詳しくは、スペクトルを測定するための分光器を用いた光学顕微鏡及びスペクトル測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光測定は、試料が気体、液体、結晶、無定形固体であることを問わず、温度は高温でも低温でも可能であり、測定において、真空などの特殊な測定雰囲気を必要としないという利点を持つ。さらに、試料の前処理を特に必要とせず、試料をそのままの状態で測定可能であるなどの長所があり、これらの長所を生かした測定が多くなされている。ラマン分光測定を利用することによって、分子を非染色で観測すること、及び半導体中の不純物を観測することができる。
【０００３】
このようなラマン分光測定を行うため、分光器を用いたラマン顕微鏡が開示されている（特許文献１、特許文献２）。このラマン顕微鏡では、試料にレーザ光を集光して照射している。そして、試料からのラマン散乱光を分光器で分光することにより、ラマンスペクトルを測定することができる。さらに、これらのラマン顕微鏡では、試料を移動させて測定することにより、特定の波長におけるラマン散乱光強度の空間分布を測定することができる。また、測定時間を短縮するため、シリンドリカルレンズにより試料をライン状に照明して、ＣＣＤカメラにより検出するラマン顕微鏡も開示されている（非特許文献１）。このラマン顕微鏡では、ライン状に照明しているため一度に広い領域を照射することができ、測定時間を短縮することができる。しかしながら、シリンドリカルレンズを用いて光をライン状にした場合、均一に光を照射することが困難であり、周辺領域が暗くなってしまう。
【０００４】
さらに、レーザ光を偏向させて、走査する光学顕微鏡が開示されている（特許文献３）。この文献では、Ｘ方向の走査装置、及びＹ方向の走査装置を設けている。そして、分光器に設けられたカメラの露光時間よりもＹ走査装置の走査周期を短くしている（段落００４２）。これにより、カメラの１フレームでライン状の領域におけるラマンスペクトルを測定することができる。
【特許文献１】特開２００２−１４０４３号公報
【特許文献２】特開２００３−３４４７７６号公報
【特許文献３】特開２００７−１７９００２号公報
【非特許文献１】ＣＨＡＲＬＥＮＥ Ａ．ＤＲＵＭＭ、他１名「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｒａｍａｎ Ｌｉｎｅ−Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 ＡＰＰＬＩＥＤ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ、１９９５年、４９巻、第９号、ｐ．１３３１−１３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、特許文献３や非特許文献１では、ラマンスペクトルを測定するために、分光器を用いている。しかしながら、上記のラマン顕微鏡では、分光器を通して反射光を分光器用カメラで撮像することになるため、以下に示す問題点がある。分光器用のカメラは、低雑音であることが要求されるため、読み出し速度が遅くなってしまう。すなわち、分光器用カメラでは、高速で撮像することが困難になってしまう。すなわち、通常の反射光で撮像を行うカメラに比べて、撮像時間が長くなってしまう。さらに、試料の表面に凹凸がある場合、試料の存在しない空間にフォーカスを合わせて測定することになってしまう。すなわち、表面が平坦でない試料では、焦点位置が試料表面以外の位置になってしまうことがある。従って、試料の任意の点に対して、試料表面からのラマンスペクトルを測定しようとする場合、各点において試料をＺ方向に動かして、複数回スペクトル測定を行う必要がある。よって、ラマンスペクトルの測定が長時間になってしまうという問題点がある。
【０００６】
このように従来の光学顕微鏡では、スペクトルを測定するための分光器を用いた場合、測定時間が長くなってしまうという問題点があった。
本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであり、スペクトルを測定するための分光器を用いた構成であっても、短時間でスペクトルを測定することができる光学顕微鏡、及びスペクトル測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様にかかるスペクトル測定方法は、対物レンズを介してレーザ光を試料に照射するステップと、前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出するステップと、前記レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、前記レーザ光の焦点位置を変化させたときの前記反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、前記抽出された焦点位置になるように調整するステップと、前記焦点位置を調整した状態で、前記レーザ光の照射により前記試料から出射される出射光を前記レーザ光から分岐するステップと、前記レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器で測定するステップと、を備えるものである。これにより、スペクトルを測定する回数を減らすことができる。よって、測定時間を短縮することができる。
【０００８】
本発明の第２の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出するステップと、前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定するステップと、前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するステップをさらに有するものである。これにより、試料表面において出射した出射光のスペクトルを測定することができる。よって、短い測定時間で精度の高い測定を行うことができる。
【０００９】
本発明の第３の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように３次元走査して、前記スペクトルを測定するものである。これにより、より短時間での測定が可能になる。
【００１０】
本発明の第４の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記出射光を前記レーザ光から分岐するステップでは、波長に応じて光を分岐する第１の光分岐手段によって前記レーザ光の波長と異なる波長の前記出射光を前記レーザ光から分岐して、前記第１の光分岐手段によって出射光を前記レーザ光と分岐した後、第２の光分岐手段によって前記試料で反射した反射光を分岐して、共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射像を撮像するものである。これにより、反射像の撮像とスペクトルの測定を同時に行うことができるようになる。
【００１１】
本発明の第５の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記レーザ光を第１の方向に走査する第１の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査する第２の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、をさらに備え、前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とするものである。これにより、分光器の同じ位置に出射光が入射するため、測定精度を向上することができる。
本発明の第６の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことを特徴とするものである。これにより、簡便な構成で反射像の撮像とスペクトルの測定を行うことができる。
【００１２】
本発明の第７の態様にかかる光学顕微鏡は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光と前記レーザ光源から前記試料に入射する入射光とを分離する第１の光分岐手段と、前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出する光検出器と、前記レーザ光の焦点位置を光軸に沿って変化させる焦点位置変化手段と、前記焦点位置を変化させたときの前記光検出器の検出結果から、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出する抽出手段と、前記抽出手段によって抽出された焦点位置で、前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、を備えるものである。これにより、スペクトルを測定する回数を減らすことができる。よって、測定時間を短縮することができる。
【００１３】
本発明の第８の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出して、前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定し、前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するものである。これにより、試料表面において出射した出射光のスペクトルを測定することができる。よって、短い測定時間で精度の高い測定を行うことができる。
【００１４】
本発明の第９の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように走査するオートフォーカス機構をさらに備え、前記オートフォーカス機構によって、前記試料の表面に追従させて前記スペクトル測定を行うものである。れにより、試料表面において出射した出射光のスペクトルを測定することができる。よって、短い測定時間で精度の高い測定を行うことができる。
【００１５】
本発明の第１０の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第１の光分岐手段によって分岐した後、前記試料で反射した反射光と前記試料に入射するレーザ光とを分岐する第２の光分岐手段をさらに備え、前記第１の光分岐手段が波長に応じて前記レーザ光と異なる波長の出射光を取り出し、共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射光画像を撮像するものである。これにより、反射像の撮像とスペクトルの測定を同時に行うことができるようになる。
【００１６】
本発明の第１１の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記レーザ光を第１の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第１の走査手段と、前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第２の走査手段と、をさらに備え、前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とするものである。これにより、分光器の同じ位置に出射光が入射するため、測定精度を向上することができる。
本発明の第１２の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことと特徴とするものである。これにより、簡便な構成で反射像の撮像とスペクトルの測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の第１３の態様にかかる光学顕微鏡は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、波長に応じて光を分岐して、前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光からレーザ光の波長と異なる波長の出射光を取り出す第１の光分岐手段と、前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、前記試料で反射した反射光を前記レーザ光から分岐する第２の光分岐手段と、共焦点光学系を介して、前記試料で反射した反射光を検出する光検出器と、を備えるものである。これにより、反射像の撮像とスペクトルの測定を同時に行うことができるようになる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、スペクトルを測定するための分光器を用いた構成であっても、短時間でスペクトルを測定することができる光学顕微鏡、及びスペクトル測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。
【００２０】
発明の実施の形態１．
本発明の実施の形態にかかる光学顕微鏡について図１を用いて説明する。図１は本実施の形態にかかる光学顕微鏡１００の光学系の構成を模式的に示す図である。光学顕微鏡１００は、試料２４を観察するための構成として、レーザ光源１０と、ビームエキスパンダ１１と、レーザラインフィルタ１２、Ｙ走査装置４０、リレーレンズ１７、リレーレンズ１８、エッジフィルタ１９、Ｘ走査装置２０、リレーレンズ２１、チューブレンズ２２、対物レンズ２３、ハーフミラー２５、結像レンズ２６、切換えミラー２７、分光器３１、ラインＣＣＤカメラ５０、ステージ６０と、を有している。
【００２１】
光学顕微鏡１００はラマン顕微鏡であり、レーザ光源１０からの光ビームを試料２４に入射させ、試料２４からのラマン散乱光を分光器３１で検出する。ラマン散乱光を分光器３１で分光するため、ラマンスペクトルを測定することができる。さらに、光学顕微鏡１００では、ＸＹ方向（水平方向）及びＺ方向（鉛直方向）に走査することができるため、３次元のラマンスペクトルイメージを測定することができる。さらに、光学顕微鏡１００は、コンフォーカル光学系を介して反射像を撮像するために、ラインＣＣＤカメラ５０が設けられている。すなわち、試料２４を反射した反射光は、ラインコンフォーカル光学系を介して検出される。ラマン散乱光のスペクトル測定を行うための光学系と、反射像を撮像するための光学系とを切換えることができる。ラマン散乱光のスペクトル測定を行うための光学系と、反射像を撮像するための光学系とは、一部の光路が共通しており、切換えミラー２７によって、切換が行われる。
【００２２】
光学顕微鏡１００の全体構成について説明する。まず、ラマンスペクトルを測定するときの照明光学系について説明する。照明光学系では、レーザ光源１０は、励起光となるレーザ光を出射する。レーザ光源１０は、所定のレーザ波長の光を出射する。レーザ光源１０は、例えば、赤色や緑色の単色光を出射する。レーザ光源１０には、例えば、スペクトラフィジックス社製Ｍｉｌｌｅｎｎｉａを用いることができる。このレーザ光源１０はレーザ波長５３２ｎｍ、線幅０．２４ｎｍ、最大出力が１０ＷのＮｄ／ＹＶＯ４レーザである。レーザ光源１０はこのレーザ波長を有するレーザ光を出射する。
【００２３】
レーザ光は、ビームエキスパンダ１１で拡大される。すなわち、ビームエキスパンダ１１は、レーザ光のスポットが所定の大きさとなるように、ビーム径を拡大する。この後、レーザ光は、レーザラインフィルタ１２に入射する。レーザラインフィルタ１２は、レーザ波長以外の光を遮光する。これにより、ノイズとなる迷光を低減することができる。そして、レーザ光は、レーザラインフィルタ１２を通過して、高速スキャナ１３に入射する。
【００２４】
高速スキャナ１３は、エッジフィルタ１９の後段側に配置されている低速スキャナ１６とともに、Ｙ走査装置４０を構成する。すなわち、Ｙ走査装置４０は、高速スキャナ１３と低速スキャナ１６とを含んでいる。Ｙ走査装置４０は、レーザ光をＹ方向に偏向して、走査する。Ｙ走査装置４０は、入射した光ビームの出射角を変化させて、光ビームを偏向させる。これにより、試料２４上で光ビームの入射位置がＹ方向に沿って変化する。例えば、高速スキャナ１３は、共振型ガルバノミラーであり、約８ｋＨｚでレーザ光を走査する。具体的には、ガルバノミラーの反射面の角度が変化することで、レーザ光の方向が変わる。低速スキャナ１６は、サーボガルバノミラーであり、高速スキャナ１３よりも低速で動作する。これにより、レーザ光が走査される。なお、高速スキャナ１３、及び低速スキャナ１６はレーザ光をＹ方向に走査する。なお、Ｙ走査装置４０の動作については後述する。
【００２５】
高速スキャナ１３と低速スキャナ１６の間には、リレーレンズ１７、１８とエッジフィルタ１９が設けられている。リレーレンズ１７、１８は、レーザ光を屈折して、像をリレーする。なお、リレーレンズ１７とリレーレンズ１８との間には、絞りが設けられていてもよい。そして、リレーレンズ１８からのレーザ光は、エッジフィルタ１９に入射する。
【００２６】
エッジフィルタ１９は、波長に応じて光を反射又は透過する。すなわち、エッジフィルタ１９は、波長に応じた透過率、及び反射率を有している。具体的には、エッジフィルタ１９は、レーザ波長の光を反射して、レーザ波長よりも波長の長い光を透過する。これにより、効率よく、ラマン散乱光を測定することができる。すなわち、励起光となるレーザ光のほとんどは、エッジフィルタ１９で反射して、試料２４の方向に向かう。一方、レーザ光よりも長い波長を有するラマン散乱光のほとんどは、エッジフィルタ１９を透過して、分光器３１の方向に向かう。ここでは、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製のエッジフィルタ１９を用いている。
【００２７】
エッジフィルタ１９で反射されたレーザ光は、低速スキャナ１６に入射する。低速スキャナ１６は、上記のように、ガルバノミラーであり、Ｙ方向にレーザ光を走査する。そして、低速スキャナ１６で反射されたレーザ光は、Ｘ走査装置２０に入射する。Ｘ走査装置２０は、例えばサーボガルバノミラーであり、反射面の角度が変化することによって、光ビームを偏向させる。すなわち、光軸に対するＸ走査装置２０の反射面の傾斜角度が変化するため、光ビームの出射角を変化させることができる。これにより、試料２４上で光ビームの入射位置がＸ方向に沿って変化する。試料２４上で、光ビームをＸ方向に走査することができる。なお、Ｘ走査装置２０での偏向角は、電気信号によって制御される。また、Ｘ方向とＹ方向とは互いに直交する方向であるため、Ｘ走査装置２０及びＹ走査装置４０によってＸＹ方向に走査することにより、試料２４上において２次元領域を走査することができる。
【００２８】
そして、Ｘ走査装置２０で反射されたレーザ光は、リレーレンズ２１、チューブレンズ２２で屈折され、対物レンズ２３に入射する。対物レンズ２３は、光ビームを集光して、試料２４上に入射させる。すなわち、対物レンズ２３は、試料２４上に光ビームを集光して、試料２４を照明する。これにより、試料２４のスポット状の領域が照明される。対物レンズ２３には、例えば、ニコン製アポクロマート ＮＡ １．２ ｘ６０を用いることができる。
【００２９】
対物レンズ２３は、レーザ光を集光して、試料２４に入射させる。このとき、Ｘ走査装置２０、及びＹ走査装置４０によって、レーザ光がＸＹ方向に走査されている。すなわち、試料２４上におけるレーザ光の入射位置が、Ｘ走査装置２０、及びＹ走査装置４０の動作に応じて変化している。これにより、試料２４上において２次元領域を走査することができる。
【００３０】
対物レンズ２３から試料２４に入射した入射光は、試料２４で反射される。また、試料２４に入射した入射光の一部はラマン散乱される。試料２４に入射した入射光のうち、対物レンズ２３側に出射した光を出射光とする。すなわち、試料２４から対物レンズ２３側に向かう光を出射光と称する。この出射光には、レーザ波長と同じ波長のレイリー散乱光、及びレーザ波長と異なる波長のラマン散乱光が含まれている。さらに、試料２４が蛍光物質を含む場合、出射光に蛍光が含まれている。
【００３１】
ラマン散乱された出射光は、入射光と異なる波長となっている。すなわち、ラマンシフトによって出射光は入射光の振動数からずれて散乱される。この出射光のスペクトルがラマンスペクトルとなる。したがって、出射光のスペクトルを測定することにより、試料２４中に含まれる物質の化学構造及び物理的状態を特定することができる。すなわち、ラマンスペクトルには、試料２４を構成する物質の振動数の情報が含まれるため、出射光を分光器３１で分光して検出することにより、試料２４中の物質を特定することができる。測定したラマンスペクトルのうち、特定の波長に注目することにより、特定物質の空間分布の測定も可能となる。具体的には、試料２４を生体細胞とした場合、核酸や脂質の空間分布あるいはスクロースやポリスチレン球の空間分布を測定することができる。
【００３２】
なお、試料２４はステージ６０の上に載置されている。ステージ６０は、例えば、ＸＹＺステージである。このステージ６０は可動ステージであり、試料２４の任意の位置を照明することができる。また、ステージ６０をＺ方向に駆動することによって、対物レンズ２３と試料２４との距離を変化させることができる。従って、対物レンズ２３の焦点位置を光軸方向に沿って変化させることができる。光学顕微鏡１００は、後述するようにレーザコンフォーカル顕微鏡を構成しているため、焦点位置を変化させることによって、Ｚ方向の走査が可能となる。すなわち、Ｚ方向にステージを移動させることによって、試料２４の断層画像を撮像することができる。試料２４の任意の高さからのラマン散乱光の検出することができる。
【００３３】
次に、試料２４からの出射光を検出するための光学系について説明する。ステージ６０上に載置された試料２４からの出射光は、入射光と同じ光路上を伝播していく。すなわち、対物レンズ２３により屈折され、チューブレンズ２２及びリレーレンズ２１で屈折されて、Ｘ走査装置２０に入射する。Ｘ走査装置２０は、入射した出射光をエッジフィルタ１９の方向に反射する。このとき、出射光は、Ｘ走査装置２０によってデスキャンされる。すなわち、Ｘ走査装置２０で反射されることによって、出射光は、レーザ光源１０からＸ走査装置２０に入射した入射光の進行方向と反対方向に伝播する。また、試料２４からのレイリー散乱光もラマン散乱光と同じ光路で伝播していく。
【００３４】
Ｘ走査装置２０によって、反射された出射光は、低速スキャナ１６を介して、エッジフィルタ１９に入射する。エッジフィルタ１９は、試料２４からの出射光と、レーザ光源１０から試料２４に入射する入射光とを波長に基づいて分岐する。すなわち、エッジフィルタ１９は、その反射面が入射光の光軸に対して傾いて設けられている。試料２４からの出射光がエッジフィルタ１９を透過することによって、試料２４からの出射光の光軸が、レーザ光源１０から試料２４に入射する入射光の光軸と異なるものとなる。よって、試料２４からの出射光を、レーザ光源１０から試料２４に入射する入射光から分離することができる。このように、エッジフィルタ１９は、入射光と出射光とを分岐する第１の光分岐手段として機能する。
【００３５】
光分岐手段として用いるエッジフィルタ１９は、波長に応じて光を透過又は反射する。エッジフィルタ１９に対する光ビームの入射角度を小さくすることが好ましい。ここで、光ビームの入射角度は、光ビームの主光線とエッジフィルタ１９の反射面の垂線との間の角度である。エッジフィルタ１９の反射面に対するリレーレンズ１８からの光ビームの入射角度を、例えば１２°以下とすることが好ましく、さらに、入射角度を１０°とすることがより好ましい。このように、エッジフィルタ１９に対して垂直方向に近い方向から光ビームを入射させる。また、リレーレンズ１８と光路が重ならないように入射角度を８°以上とすることが好ましいが、設計によっては、８°以下とすることも可能である。これにより、エッジフィルタ１９の特性を向上させることができ、レイリー散乱光とラマン散乱光と確実に分離することができる。すなわち、エッジフィルタ１９のレイリー散乱光に対する反射率及び、エッジフィルタ１９のラマン散乱光に対する透過率を向上することができる。したがって、レイリー散乱光とラマン散乱光との波長の差に基づいて、レイリー散乱光とラマン散乱光とを確実に分離することができる。もちろん、本発明にかかる光学顕微鏡において、光ビームのエッジフィルタ１９に対する入射角度は、上記の値に限定されるものではない。
【００３６】
さらに、エッジフィルタ１９は、レーザ波長の光を反射して、ラマン散乱光を透過するような、特性を有している。従って、試料２４からのレイリー散乱光は、エッジフィルタ１９で反射され、ラマン散乱光は、エッジフィルタ１９を透過する。すなわち、エッジフィルタ１９を用いることによって、レイリー散乱光とラマン散乱光との波長に差に基づいてレイリー散乱光を除去することができる。さらに、レーザ光源１０からのレーザ光のほとんどはエッジフィルタ１９で反射され、試料２４に向かう。これにより、レーザ光のロスを低減することができ、効率よくラマン散乱光のみを検出することができる。なお、エッジフィルタ１９の反射特性は、測定するスペクトルの範囲に応じて決定すればよい。
ここで、エッジフィルタ１９は、低速スキャナ１６と高速スキャナ１３との間に配置されている。ラマンスペクトルを測定する場合、高速スキャナ１３を固定して、低速スキャナ１６のみでスキャンする。すなわち、高速スキャナ１３を動作させない状態として、低速スキャナ１６のみを動作させる。従って、エッジフィルタ１９は、低速スキャナ１６によってデスキャンされた後の出射光と、レーザ光源１０からのレーザ光とを分離する。
【００３７】
エッジフィルタ１９を透過した出射光は、結像レンズ２６に入射する。結像レンズ２６は、試料２４の像を入射スリット３０またはラインＣＣＤカメラ５０上に結像する。さらに、結像レンズ２６で屈折された出射光は、切換えミラー２７で反射して、分光器３１の入射側に設けられた入射スリット３０に入射する。このとき、結像レンズ２６は入射スリット３０上に出射光を集光している。すなわち、結像レンズ２６は、入射スリット３０上に、試料２４が照明された領域の拡大像を結像している。入射スリット３０には、ライン状の開口部が設けられている。この開口部は、Ｙ方向に対応する方向に沿って設けられている。すなわち、入射スリット３０の開口部は試料２４上におけるＹ走査装置４０の走査方向（Ｙ方向）に対応する方向に沿って設けられている。
【００３８】
結像レンズ２６は出射光を屈折させて、入射スリット３０上に結像する。ここで、試料２４面上において入射光はスポット状に結像されているため、入射スリット３０上において出射光はスポット状に集光される。入射スリット３０の開口部の方向とＹ走査装置４０の走査方向とを一致させる。出射光は、Ｙ走査装置４０の低速スキャナ１６によってデスキャンされて、エッジフィルタ１９に入射している。このため、低速スキャナ１６で走査しても、入射スリット３０上で光ビームのスポット位置が入射スリット３０の同じ位置に入射する。試料２４上でＹ方向に走査された光が入射スリット３０の開口部に結像するように配置する。換言すると入射スリット３０と試料２４とは互いに共役な関係となるよう配置される。
【００３９】
したがって、ラマン顕微鏡はコンフォーカル光学系として構成される。例えば、絞り（不図示）と試料２４面上とが互いに共役な関係となるように配置され、試料２４面上と入射スリット３０とが互いに共役な関係となるように配置されている。絞りが設けられたＸＹ平面及び試料２４面上において、入射光がスポット状に集光される。そして、試料２４から散乱して出射した出射光は入射スリット３０上でスポット状に集光される。入射スリット３０はＹ方向に沿った開口部を有しており、この開口部に入射した出射光のみを分光器３１の２次元アレイ光検出器に透過させる。レーザ光源１０から試料２４までの照明光学系及び試料２４からアレイ光検出器まで観察光学系をこのような結像光学系とすることにより、共焦点ラマン顕微鏡とすることができる。これにより、Ｚ方向の分解能の高い測定を行うことができる。そして、ステージ６０をＺ方向に移動することにより、試料２４の任意の高さからのラマン散乱光を他の高さからのラマン散乱光から分離して検出することができる。
【００４０】
この入射スリット３０を通過した出射光は、分光器３１の本体に入射する。この分光器３１について、図２を用いて説明する。図２は、分光器３１の構成に示す図である。ここでは、ツェルニターナ型の分光器３１を示している。分光器３１には、入射スリット３０、ミラー３２、凹面鏡３３、グレーティング３４、凹面鏡３５、及びアレイ光検出器３６が設けられている。
【００４１】
入射スリット３０は、分光器３１の入射側に配置されている。また、入射スリット３０は、Ｙ方向に沿って配置されている。入射スリット３０を通過して出射光は、ミラー３２、凹面鏡３３で反射され、グレーティング３４に入射する。グレーティング３４は、入射スリット３０から入射した光をその波長に応じて空間的に分散させる。ここでは、グレーティング３４として、反射型回折格子を用いている。そして、グレーティング３４は、入射スリット３０の方向と垂直な方向に、出射光を分散させる。そして、グレーティング３４で分散した光は、凹面鏡３５で反射されて、アレイ光検出器３６に入射する。
【００４２】
もちろん、上記以外の構成を有する分光器３１を用いてもよい。出射光は分光器３１によって入射スリット３０の方向と垂直な方向に分散される。すなわち、分光器３１は、入射スリット３０のライン状の開口部と垂直な方向に出射光を波長分散する。分光器３１により分光された出射光はアレイ光検出器３６に入射する。アレイ光検出器３６は受光素子がマトリクス状に配列されたエリアセンサである。具体的には、アレイ光検出器３６は画素がアレイ状に配置されたＣＣＤカメラなどの２次元アレイ光検出器である。
【００４３】
アレイ光検出器３６には、例えば、冷却ＣＣＤを用いることができる。具体的には、アレイ光検出器３６として、プリンストン・インスツルメンツ社製１０２４×２５６画素の電子冷却ＣＣＤを用いることができる。また、アレイ光検出器３６にイメージインテンシファイアを取り付けることも可能である。アレイ光検出器３６の画素は、入射スリット３０に対応する方向に沿って配置されている。したがって、アレイ光検出器３６の画素の一方の配列方向は入射スリット３０の方向と一致し、他方の配列方向は、分光器３１の分散方向と一致する。アレイ光検出器３６の入射スリット３０の方向に対応する方向がＹ方向となり、入射スリット３０と垂直な方向、すなわち、分光器３１によって出射光が分散される方向がＸ方向となる。
【００４４】
アレイ光検出器３６は各画素で受光した出射光の光強度に応じた検出信号を処理装置７１に出力する。処理装置７１は、例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）などの情報処理装置であり、アレイ光検出器３６からの検出信号をメモリなどに記憶していく。そして、検出結果に所定の処理を行い、モニターに表示する。さらに、処理装置７１は、Ｙ走査装置４０及びＸ走査装置２０の走査や、ステージ６０の駆動を制御している。ここで、アレイ光検出器３６のＸ方向は出射光の波長（振動数）に対応している。すなわち、Ｘ方向に配列されている画素列において、一端の画素は長波長（低振動数）の出射光を検出し、他端の画素は短波長（高振動数）の出射光を検出する。このように、アレイ光検出器３６のＸ方向における光強度の分布はラマンスペクトルの分布を示すことになる。
【００４５】
次に、反射光による反射像を撮像するための光学系について、図１を用いて説明する。反射像を撮像する場合、エッジフィルタ１９を光路上から取り除く。そして、エッジフィルタ１９が挿入されていた位置に、ハーフミラー２５を挿入する。すなわち、エッジフィルタ１９、及びハーフミラー２５を挿脱可能に設けて、いずれか一方のみを光路中に挿入するようにする。エッジフィルタ１９、及びハーフミラー２５は排他的に使用される。レーザ波長と同じ波長の反射光を検出する場合、ハーフミラー２５が使用され、ラマン散乱光を検出する場合、エッジフィルタ１９が使用される。さらに、レーザ波長と同じ波長の反射光を検出する場合、切換えミラー２７が光路上から取り除かれる。また、高速スキャナ１３をスキャンして、低速スキャナ１６を固定する。すなわち、低速スキャナ１６を動作させない状態として、高速スキャナ１３のみを動作させる。なお、これら以外の構成については、ラマン散乱光を検出する場合と同じであるため、説明を省略する。
【００４６】
レーザラインフィルタ１２からのレーザ光は、高速スキャナ１３で走査される。そして、上記と同様に、リレーレンズ１７、リレーレンズ１８に入射する。リレーレンズ１８からのレーザ光は、ハーフミラー２５に入射する。ハーフミラー２５は、入射した光の一部を反射し、一部を透過する。ここでは、ハーフミラー２５に入射したレーザ光の半分が低速スキャナ１６の方向に反射される。ハーフミラー２５で反射したレーザ光は、固定された低速スキャナ１６を介して、Ｘ走査装置２０に入射する。そして、ラマン散乱光を検出する場合と同様に、レーザ光が試料２４に入射する。試料２４からの出射光が同様に、Ｘ走査装置２０でデスキャンされる。Ｘ走査装置２０からの出射光は、固定された低速スキャナ１６を介して、ハーフミラー２５に入射する。ハーフミラー２５は、出射光の半分を結像レンズ２６の方向に透過する。なお、ハーフミラー２５は、波長によらず、透過率及び反射率が一定である。このため、ラマン散乱光の一部もハーフミラー２５を透過するが、ラマン散乱光は、反射光（レイリー散乱光）に比べて十分に弱いため、反射像の撮像には、問題ない。
【００４７】
そして、ハーフミラー２５を透過した出射光は、結像レンズ２６で屈折される。ラインＣＣＤカメラ５０の方向に向かう。このとき、切換えミラー２７が光路上から離脱している。このため、出射光が、分光器３１の方向に反射されずに、ラインＣＣＤカメラ５０の方向に向かう。結像レンズ２６が出射光をラインＣＣＤカメラ５０の受光面に結像している。ラインＣＣＤカメラ５０は、Ｙ方向に対応する方向に沿って配列された受光画素を有している。
【００４８】
さらに、Ｙ走査装置４０は、１フレーム撮像する間に、光ビームをＹ方向に１回以上走査する。すなわち、Ｙ走査装置４０の走査周期を露光時間よりも短くして、ラインＣＣＤカメラ５０の１フレームの露光時間内で、Ｙ方向に１回以上走査する。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０の１フレームで、走査範囲に応じたライン状の領域の反射光を検出することができる。すなわち、露光時間内に、Ｙ走査装置４０の走査領域の全体を走査する。したがって、反射光はラインコンフォーカル（スリットコンフォーカル）光学系を介して検出される。上記の１フレームの撮像が終了したら、Ｘ走査装置２０によってＸ方向に１照明領域分、照明位置をずらす。そして、同様に１フレームの撮像を行い、ライン状の領域の反射光を検出する。これを繰り返し行なうことによって、試料２４上の２次元領域の反射像を撮像することができる。なお、ラインＣＣＤカメラ５０での検出信号は、処理装置７１に出力される。そして、処理装置７１で処理が行われて、反射光画像（反射像）となる。
【００４９】
ラインＣＣＤカメラ５０は、アレイ光検出器３６よりも読み出し速度が速くなっている。よって、高速に反射像を撮像することができる。すなわち、撮像時間を短縮することができる。さらに、分光器３１を介さずに、出射光がラインＣＣＤカメラ５０に入射する。よって、画像が分光器の収差の影響を受けることがなくなり、高分解能での撮像が可能になる。よって、ラマンスペクトルを測定可能な光学顕微鏡１００でも、高速、かつ高分解能で、反射像を撮像することができる。また、Ｙ方向に高速に走査することで、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間内では、光がライン状となる。すなわち、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間を考慮すると、試料２４がライン状に照明されていることになる。
【００５０】
本実施の形態では、出射光の光路を切換える切換え手段として、切換えミラー２７が設けられている。切換えミラー２７は、出射光の光路中に挿脱可能に設けられている。切換えミラー２７が光路中に挿入されることで、出射光が反射されて、分光器３１の方向に向かう。一方、切換えミラー２７が光路中から取り除かれると、出射光が切換えミラー２７の挿入位置を直進して、ラインＣＣＤカメラ５０の方向に向かう。このように、切換えミラー２７を挿脱することで、ラマンスペクトル測定か、反射像の撮像かを切換えることができる。もちろん、切換えミラー２７を挿入時に、反射像を撮像してもよい。この場合、スペクトル測定時には、切換えミラー２７が光路から取り除かれる。切換えミラー２７を動作させることで、分光器３１による測定か、ラインＣＣＤカメラ５０による測定かを選択することができる。入射光から分離された出射光が分光器３１に向かう光路５１又はラインＣＣＤカメラ５０に向かう光路５２を伝播するように、切換えミラー２７が光路を切換える。なお、光路を切換える切換え手段は、切換えミラー２７に限られるものではない。例えば、光を屈折するプリズムなどであってもよい。
【００５１】
次に、Ｙ走査装置４０について説明する。本実施の形態では、Ｙ方向に走査するＹ走査装置４０として、高速スキャナ１３、及び低速スキャナ１６の２つが設けられている。そして、用途に応じて、一方のスキャナを駆動する。高速スキャナ１３は、例えば、共振型ガルバノミラーであり、例えば、８ｋＨｚの周波数で動作する。
【００５２】
低速スキャナ１６は、サーボ型ガルバノミラーであり、高速スキャナ１３よりも低い周波数で動作する。高速スキャナ１３は低速スキャナ１６よりも高速にレーザ光を走査する。なお、いずれか一方のスキャナで十分な場合は、一方のスキャナのみでＹ走査装置４０を構成してもよい。
【００５３】
例えば、ラマン散乱光を検出するラマンモードの場合、高速スキャナ１３を固定して、低速スキャナ１６を動作させる。このとき、アレイ光検出器３６と低速スキャナ１６を同期させる。ラマンモードの場合、Ｘ走査装置２０も同期して動作させる。すなわち、ある測定位置でのスペクトル測定が終了したら、次の測定位置に、レーザ光が入射するよう、レーザ光を走査する。このとき、光路上からは、ハーフミラー２５が取り除かれ、光路中にはエッジフィルタ１９が挿入されている。また、切換えミラー２７も光路中に挿入されている。これにより、分光器３１で分光測定が可能になる。
ラマンモードの場合、光は、Ｘ走査装置２０、及び低速スキャナ１６でデスキャンされて、分光器３１に入射する。従って、ＸＹ方向に走査しても、分光器３１の入射スリット３０の同じ位置上に光が入射する。すなわち、試料上における測定位置によらず、光は入射スリット３０の同じ点を通過する。これにより、スペクトルの測定精度を向上することができる。
【００５４】
一方、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間は、アレイ光検出器３６の露光時間よりも短い。よって、レーザ光と同じ波長の反射光を検出する反射モードでは、高速スキャナ１３を動作させて、低速スキャナ１６を固定する。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間で、Ｙ方向に、レーザ光が１回以上走査される。反射モードの場合、Ｘ走査装置２０も動作させる。このとき、光路上からは、エッジフィルタ１９が取り除かれ、光路中にはハーフミラー２５が挿入されている。また、切換えミラー２７が光路上から取り除かれている。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０で反射光検出が可能になる。ラインＣＣＤカメラ５０は、アレイ光検出器３６よりも露光時間が短いため、高速スキャナ１３で走査することが好ましい。
【００５５】
また、試料２４の特定位置を観察する場合、位置制御可能な低速スキャナ１６でレーザ光をその特定位置に照射する。そして、レーザ光の走査を停止して、照射位置をその位置で固定する。このとき、高速スキャナ１３の動作は停止している。これにより、特定の位置での像の変化を観察することができる。このように、位置決め精度が必要な場合、低速スキャナ１６のみを用いてレーザ光の照射位置を移動させる。すなわち、特定の位置を照明するため、低速スキャナ１６で位置決めする。これにより、レーザ光の照射位置が特定の位置で固定される。一方、高速スキャナ１３は、反射光の検出時に用いる。もちろん、１つのスキャナで十分な場合は、１つのスキャナのみでＹ方向に走査してもよい。このように、Ｙ方向に走査する走査手段として、低速スキャナ１６と高速スキャナ１３を設ける。そして、２つのスキャナを用途に応じて使い分ける。
【００５６】
本実施の形態では、Y走査機構に高速スキャナ１３と低速スキャナ１６の２個のスキャナを組み合わせて使用している。このような構成とすることで、例えば、共振ガルバノミラーのように、特定の角度で停止させることができないスキャナを高速スキャナ１３に採用する場合においても、もう一方の低速スキャナを用いることで、試料上の特定の位置を測定することができる。このように、Ｘ走査装置２０とＹ走査装置４０が合わせて三つのスキャナー（Ｙ方向の高速スキャナ１３、Ｙ方向の低速スキャナ１６、Ｘ方向のスキャナ）を有している。そして、そのうちの２つにおいてデスキャンし、１つにおいてデスキャンしない構成とする。これにより、簡便な構成で反射像の撮像とスペクトルの測定を行うことができる。
【００５７】
試料上の特定の位置を測定する場合には、測定の高速性よりも、測定精度が重要となる場合が多い。本実施の形態では、低速スキャナ１６をエッジフィルタ１９（またはハーフミラー）よりも試料側に設置することで、低速スキャナ１６によって走査される場合、試料からの光は、デスキャンされた後にラインＣＣＤカメラ５０またはアレイ光検出器３６によって検出される。よって、試料上における測定位置によらず、光は入射スリット３０の同じ点を通過するため、スペクトルの測定精度が向上する。
【００５８】
一方、高速スキャナ１３をエッジフィルタ１９（またはハーフミラー）よりもレーザー光源１０側に配置される。高速スキャナ１３によって走査される場合には、試料からの光は、デスキャンされずにラインＣＣＤカメラ５０またはアレイ光検出器３６に入射する。このため、ライン状の領域における複数の点を同時に測定することができ、高速に測定が行える。
【００５９】
このように、Ｙ走査機構に高速スキャナ１３と低速スキャナ１６の２個のスキャナを組み合わせて使用し、一方のみをデスキャンする。このようにすることで、必要に応じて、スペクトルの測定精度を向上するか、測定を高速に行うかを選択することができる。
【００６０】
さらに、この構成では、蛍光を検出することができる。蛍光を検出する蛍光モードの場合、高速スキャナ１３を動作させて、低速スキャナ１６を固定する。蛍光モードの場合、Ｘ走査装置２０も動作させる。このとき、光路上からは、ハーフミラー２５が取り除かれ、光路中にはエッジフィルタ１９が挿入されている。これにより、蛍光から励起光を分岐することができる。すなわち、レーザ波長と異なる波長の蛍光がエッジフィルタ１９を通過し、レーザ光がエッジフィルタ１９で反射される。また、切換えミラー２７が光路上から取り除かれている。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０で蛍光像を取得することができる。このように、蛍光モード、反射モード、ラマンモードの切り替えを簡便に行うことができる。さらに、エッジフィルタ１９とハーフミラー２５を排他的に使用することで、別途、帯域フィルタ等を設ける必要がなくなる。よって、装置構成を簡便にすることができる。
【００６１】
本実施の形態では、試料の表面に沿って、レーザ光を走査している。これにより、ラマンスペクトルの測定時間を短縮することができる、すなわち、Ｚ方向における測定点数を１点として、ラマンスペクトル測定を行う測定点数を減らしている。よって、測定時間を短くすることができる。そのための制御と処理について、図３を用いて説明する。図３は、本実施の形態にかかる光学顕微鏡に用いられる処理装置７１の構成を模式的に示すブロック図である。図３に示すように、処理装置７１には、ステージ制御部７２、Ｘ走査制御部７３、Ｙ走査制御部７４、焦点位置抽出部７５、反射光データ記憶部７６、表面形状記憶部７７、スペクトルデータ記憶部７８が設けられている。
【００６２】
ステージ制御部７２は、ステージ６０の動作を制御する。なお、ステージ６０はＸＹＺステージであり、試料２４を３次元的に移動させる。これにより、所望の位置に試料２４を移動させることができる。ステージ制御部７２は、ステージ６０の３次元座標を認識している。ステージ制御部７２が、ステージ６０をＺ方向に移動させることで、対物レンズ２３と試料２４の距離が変化する。すなわち、試料２４に対するレーザ光の焦点位置が光軸に沿って変化する。このように、ステージ６０のＺ座標がレーザ光の焦点位置を示すことになる。
【００６３】
Ｘ走査制御部７３は、Ｘ走査装置２０による走査を制御する。すなわち、Ｘ方向におけるレーザ光の偏向角度は、Ｘ走査制御部７３によって制御される。Ｘ走査制御部７３は、Ｘ走査装置２０を駆動して、ステージ６０上の試料２４におけるレーザ光の入射位置をＸ方向に移動させる。従って、Ｘ走査制御部７３、及びステージ制御部７２によって、測定位置のＸ座標を認識することができる。すなわち、試料２４の任意の点におけるＸ座標を求めることができる。
【００６４】
Ｙ走査制御部７４は、Ｙ走査装置４０による走査を制御する。すなわち、Ｙ走査制御部７４は、高速スキャナ１３、及び低速スキャナ１６の動作をそれぞれ制御する。Ｙ方向におけるレーザ光の偏向角度は、Ｙ走査制御部７４によって制御される。Ｙ走査制御部７４は、Ｙ走査装置４０を駆動して、ステージ６０上の試料２４におけるレーザ光の入射位置をＹ方向に移動させる。Ｙ走査制御部７４、及びステージ制御部７２によって、測定位置のＹ座標を認識することができる。すなわち、試料２４の任意の点におけるＹ座標を求めることができる。従って、ＸＹ平面において試料２４の異なる点は、異なるＸＹ座標で示される。
【００６５】
ステージ制御部７２、Ｘ走査制御部７３、Ｙ走査制御部７４を用いて、試料２４を３次元的に走査する。そして、反射光による反射像を撮像する。ここで、試料２４の測定位置はＸＹ座標で示され、試料２４に対する焦点位置はＺ座標で示される。従って、各測定位置において、焦点位置をＺ方向に変化させて、複数回の測定を行う。すなわち、焦点位置を変化させたときの各焦点位置において、それぞれ、反射光をラインＣＣＤカメラ５０で検出する。
【００６６】
たとえば、ステージ６０、Ｘ走査装置２０、および低速スキャナ１６を固定した状態で、高速スキャナ１３を動作させる。そして、１ライン分の反射光をラインＣＣＤカメラ５０で検出する。そして、Ｚ方向に焦点位置を順次変化させ、それぞれの焦点位置で反射光の検出を行う。すなわち、ある焦点位置での反射光の検出が終了したら、焦点位置をＺ方向にずらして、反射光を検出する。そして、Ｚ方向の走査が終了したら、Ｘ走査装置２０によって１ライン分、測定位置をずらす。次のラインも同様に、反射光をラインＣＣＤカメラ５０で検出する。Ｘ方向の走査が終了したら、ステージ６０を動作させる。そして、試料２４をＹ方向に移動させて、同様に反射光を検出する。このように、試料全面を走査して、同様に反射光を検出する。このようにして、３次元的な走査を行う。もちろん、走査する順番は上記の順番に限られるものはない。
【００６７】
ラインＣＣＤカメラ５０で検出された反射光の強度が反射光データとして反射光データ記憶部７６に記憶される。ここで、各ＸＹＺ座標における反射光強度が、その座標と対応付けられて記憶される。すなわち、異なる高さで反射光強度を測定することで、座標毎に反射光データが取得される。このようにして、各断層における反射像が撮像される。
【００６８】
焦点位置抽出部７５は、反射光データに基づいて、ラマンスペクトルを測定する焦点位置を抽出する。すなわち、各測定位置において反射光を検出して、反射光を検出した複数のＺ座標の中からラマンスペクトルを測定するＺ座標を選択する。本実施の形態では、共焦点光学系を介して、反射光を検出している。従って、試料表面以外では反射光強度が低下する。レーザ光の焦点位置が試料２４の表面にある時に、反射光強度が最大となる。レーザ光の焦点位置が試料表面から外れると、ラインＣＣＤカメラ５０の受光面において像がぼやける。よって、反射光強度が最大となるＺ座標を求める。そして、このＺ座標を、ラマンスペクトルを測定する焦点位置とする。すなわち、反射光強度が最大となる焦点位置を抽出して、抽出した焦点位置をラマンスペクトル測定用焦点位置とする。換言すると、各測定位置において、ラマンスペクトルを測定しないＺ座標を決定することになる。
【００６９】
このように、焦点位置抽出部７５は、各ＸＹ座標において、反射光強度が最大となる焦点位置を順次求めていく。たとえば、図４に示すように、各ＸＹ座標において、反射光強度の測定を複数回行う。なお、図４は、試料の表面形状を模式的に示す図である。Ｚ方向に焦点位置を変えて、反射光を検出する。すなわち、異なる高さで反射強度の測定を行う。これにより、各断層における２次元の反射像が撮像される。焦点位置抽出部７５は、複数の焦点位置の中から、反射光強度が最大となる焦点位置を抽出する。そして、抽出された焦点位置の座標が、表面形状として、表面形状記憶部７７に記憶される。表面形状記憶部７７には、各ＸＹ座標に対して、反射光が最大となる焦点位置のＺ座標が対応付けて記憶される。図４に示すように、試料２４の表面に凹凸がある場合、測定位置ごとにＺ座標が異なることになる。
【００７０】
なお、試料２４が屈折率の異なる材料から構成される場合、それらの界面で反射光強度が高くなることがある。すなわち、屈折率の異なる材料同士の界面で反射光強度にピークが現れることになる。この場合、Ｚ方向における反射光強度分布に、複数のピークが現れることになる。このような場合、試料表面を示すＺ座標は、隣の測定位置におけるＺ座標に応じて決めることができる。すなわち、隣の測定位置との間で、試料の表面形状が滑らかになる焦点位置のＺ座標を抽出する。そして、抽出した焦点位置をつなぎ合わせて、試料２４の表面形状を形成する。
【００７１】
このように表面形状の測定が終了したら、図５に示すように試料２４の表面に沿ってラマンスペクトル測定を行う。すなわち、ＸＹ方向に測定位置を移動するときに、記憶されている表面形状にしたがってステージをＺ方向に駆動させる。隣の測定位置でラマンスペクトルを測定しようとするときに、試料２４と対物レンズ２３との距離が変わることになる。このように、表面形状記憶部７７に記憶されている表面形状を参照して、ラマンスペクトルの測定点を３次元的に移動させていく。具体的には、試料２４の表面に焦点位置があうように、ステージ６０を調整する。そして、焦点位置を調整した状態で、スペクトルを測定する。これにより、ラマンスペクトルの測定回数を減らすことができるため、測定時間を短縮することができる。
【００７２】
なお、試料表面に沿ってラマンスペクトルを測定する場合、図６に示すように、Ｘ方向、及びＹ方向にレーザ光を走査するとともに、ステージ６０をＺ方向に駆動する。すなわち、低速スキャナ１６、Ｘ走査装置２０、及びステージ６０を制御することで、３次元走査が可能になる。これにより、各測定位置において、対物レンズ２３と試料２４との距離を調整することができる。あるいは、図７に示すように、ステージ６０の駆動のみで３次元走査することも可能である。すなわち、ステージ６０をＸＹＺ方向に駆動して、これにより、測定点が試料表面に沿って移動する。試料表面に沿って、ラマンスペクトルを測定することができる。よって、測定時間を短縮することができる。なお、対物レンズ２３と試料２４との距離を、ステージ６０ではなくて、対物レンズ２３を移動させることによって、調整してもよい。
【００７３】
本実施の形態では、入射光を３次元的に走査して、試料２４の表面形状に沿ってラマンスペクトルを測定している。このため、スペクトルの測定時間を短縮化することができる。すなわち、試料２４の広い領域におけるラマンスペクトルの測定を短時間で行うことができる。試料２４の観察領域を広くした場合でも、各測定位置における測定回数を低減することができる。よって、長い測定時間が必要とならない。ラマンスペクトルの波長分解能を向上した場合や、より広い範囲のスペクトルを測定した場合でも、測定時間が長時間とならず、実用的な観察を行なうことができる。例えば、任意の波長（振動数）のラマン散乱光に着目した２次元像の観察や試料２４の特定の点におけるラマンスペクトルの測定を高い分解能で行なうことができる。
【００７４】
さらに、本実施の形態では、ラマン散乱光を集光するコンフォーカル光学系として構成している。これにより、Ｚ方向の分解能を向上することができる。試料表面のスペクトルを測定することで、様々なスペクトル解析を行なうことができる。そして、解析結果を処理装置のディスプレイに表示させることにより、より高度な分析が可能になる。
【００７５】
さらに、反射光や蛍光を検出するための光学系をスリットコンフォーカル光学系としている。よって、ステージ６０をＺ方向に移動させることで、任意の高さにおける反射像や蛍光像を取得することができる。これにより、断層画像を高速かつ高分解能で取得することができる。よって、３次元観察を容易に行うことができる。
【００７６】
なお、上記の説明では、アレイ光検出器３６、及びラインＣＣＤカメラ５０をＣＣＤカメラとして説明したが、これらはＣＣＤカメラに限られるものではない。すなわち、受光画素がマトリクス状に配列されている２次元光検出器を分光測定用に用いることができる。また、受光画素が１列に配列された１次元光検出器を反射光検出用に用いることができる。
【００７７】
さらに、ラマン散乱光とレーザ光を分岐するビームスプリッタは、エッジフィルタ１９に限られるものではない。例えば、波長に応じて光を分岐するダイクロイックミラーをビームスプリッタとして用いてもよい。また、Ｘ走査装置２０はビームを偏向させるものに限られるものではなく、ステージ６０を駆動するものでもよい。なお、Ｙ走査装置４０の代わりにシリンドリカルレンズなどを用いてスリットコンフォーカル光学系を構成してもよい。すなわち、光をライン状にする光変換手段をＹ走査装置４０の代わりに用いる。そして、ライン状の光のスポットを試料２４上に形成すれば、スリットコンフォーカル光学系を構成することができる。さらに、光分岐手段として、ハーフミラー２５とエッジフィルタ１９を排他的に用いることが好ましい。
【００７８】
本実施形態にかかるスペクトル測定方法では、対物レンズ２３を介してレーザ光を試料２４に照射するステップと、対物レンズ２３を介して、前記試料で反射した反射光を検出するステップと、レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、レーザ光の焦点位置を変化させたときの反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、抽出された焦点位置になるように調整するステップと、焦点位置を調整した状態で、レーザ光の照射により前記試料から出射される出射光を前記レーザ光から分岐するステップと、レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器で測定するステップと、を備えている。さらに、試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出するステップと、複数の測定位置における焦点位置をそれぞれ抽出し、試料の表面形状を測定するステップと、試料の表面に沿って焦点位置が移動するようにレーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するステップをさらに有していてもよい。
【００７９】
発明の実施の形態２．
本実施の形態にかかる光学顕微鏡１００について、図８を用いて説明する。図８は、本実施形態にかかる光学顕微鏡の光学系を示す図である。本実施の形態では、高速スキャナ１３とレーザラインフィルタ１２との間に、ビームスプリッタ５６が設けられている。そして、ビームスプリッタ５６で分岐された光はＡＦ（オートフォーカス）機構５３に入射する。これ以外の構成については、実施の形態１と同様であるため、重複する部分については説明を省略する。このような構成によって、実施の形態１と同様の効果を得ることができる。
【００８０】
本実施の形態では、ＡＦ機構５３によって試料表面にトラッキングしながらラマンスペクトル測定を行う。すなわち、ラマンスペクトル測定中にＡＦ機構５３を用いて自動焦点合わせ（ＡＦ）を行う。ＡＦ機構５３は、４分割フォトダイオードや、レンズ、シリンドリカルレンズ等を有している。そして、４分割フォトダイオードに対する反射光の入射位置に応じて、オートフォーカス（ＡＦ）を行う。具体的には、シリンドリカルレンズなどで反射光を非対称のスポット形状にする。そして、４分割フォトダイオードにおける反射光強度の分布によって、焦点位置を合わせる。ＡＦ機構５３の出力に応じて、ステージ６０をＺ方向に駆動する。
【００８１】
具体的には、ラマンモードにする場合、実施の形態１と同様に、エッジフィルタ１９、及び切換えミラー２７を光路上に配置する。図８に示すように、レーザラインフィルタ１２と高速スキャナ１３の間にビームスプリッタ５６が配置されている。ビームスプリッタ５６は、入射した一部の光を透過して、一部を反射する。すなわち、ビームスプリッタ５６は、所定の割合で、光を透過、又は反射する。従って、レーザラインフィルタ１２からのレーザ光は、ビームスプリッタ５６を介して、高速スキャナ１３に入射する。そして、実施の形態１におけるラマンモードと同様に、レーザ光は、エッジフィルタ１９で反射され、試料２４に入射する。試料２４で発生したラマン散乱光は、実施の形態１と同様にエッジフィルタ１９を透過して、入射スリット３０で検出される。これにより、ラマンスペクトルを測定する。
【００８２】
一方、試料２４で反射した反射光は、エッジフィルタ１９によって、反射される。そして、リレーレンズ１８、リレーレンズ１７、及び高速スキャナ１３を介してビームスプリッタ５６に入射する。ビームスプリッタ５６は、入射した反射光の一部をＡＦ機構５３の方向に反射する。そして、ビームスプリッタ５６で反射されて、ＡＦ機構５３に入射する。すなわち、ビームスプリッタ５６はレーザ光と、反射光とを分岐する光分岐手段として機能する。ＡＦ機構５３は、上記のように、４分割フォトダイオードを有しており、反射光を検出する。そして、ＡＦ機構５３での検出結果に基づいて、ステージ６０を駆動する。これにより、ＸＹ方向に測定位置を移動する際に、試料表面に沿って焦点位置が移動する。すなわち、試料２４の表面形状に追従して、焦点位置がＺ方向に動く。このように、ＡＦ機構５３を用いて、焦点位置が試料２４の表面に沿って追従するように、３次元的に走査する。
【００８３】
本実施の形態でも、処理装置７１がレーザ光の焦点位置を変化させたときの反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出する。そして、試料２４の表面に沿って、焦点位置を３次元的に移動させる。すなわち、測定位置をＸＹ方向に移動させる際、ＡＦ機構５３での検出結果に応じて、焦点位置の高さを調整する。焦点位置が試料２４の表面になるように、対物レンズ２３と試料２４との間隔を調整する。このように、試料表面に焦点合わせしながら、ラマンスペクトルを測定する。すなわち、試料表面に焦点位置が合うようにトラッキングしながら、ラマンスペクトルの測定を行う。これにより、ラマンスペクトルの測定回数を減らすことができる。よって、測定時間を短くすることができる。このように、本実施の形態にかかるスペクトル測定方法では、反射光の検出結果に基づいて、焦点位置が試料２４の表面に追従するように３次元的に走査して、スペクトルを測定している。よって、より短時間で、試料表面からのラマン散乱光のスペクトルを測定することができる。
【００８４】
発明の実施の形態３．
本実施の形態では、反射像の撮像と、ラマンスペクトルの測定を同時に行うことが可能な光学系を採用している。そのため、本実施の形態では、実施の形態１に比べて、ラインＣＣＤカメラ５０の配置が異なっている。さらに、エッジフィルタ１９とリレーレンズ１８の間にビームスプリッタ５５が設けられている。そして、ビームスプリッタ５５で分岐された反射光が結像レンズ５４を介してラインＣＣＤカメラ５０に入射する。なお、これら以外の構成については、実施の形態１と同様であるため、説明を省略する。
【００８５】
本実施の形態では、反射像の撮像と、ラマンスペクトル測定が同時に行われる。そのため、反射像の撮像時でも、エッジフィルタ１９と切換えミラー２７が光路上に配置される。さらに、光路上にはレーザ光と反射光とを分岐するビームスプリッタ５５が配置されている。ビームスプリッタ５５は、入射した光の一部を反射して、一部を透過する。すなわち、ビームスプリッタ５５は、所定の割合で、光を透過、又は反射する。従って、リレーレンズ１８からのレーザ光の一部はビームスプリッタ５５を通過して、エッジフィルタ１９に入射する。また、エッジフィルタ１９からの反射光の一部は、ビームスプリッタ５５で反射されて、結像レンズ５４に入射する。すなわち、ビームスプリッタ５５は、レーザ光と反射光とを分岐する光分岐手段として機能する。なお、Ｙ方向の走査は低速スキャナ１６によって行う。
【００８６】
結像レンズ５４は、入射した反射光を屈折する。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０の受光面に反射光が結像する。実施の形態１と同様に、ラインＣＣＤカメラ５０は、コンフォーカル光学系を介して、反射光を検出する。これにより、共焦点反射像を撮像することができる。また、エッジフィルタ１９を通過した出射光を分光器３１で検出する。これにより、ラマンスペクトルを測定することができる。このようにすることで、ラマンスペクトル測定と、反射像の撮像とを同時に行うことができる光学顕微鏡を実現することができる。
【００８７】
さらに、反射像の撮像と、ラマンスペクトルの測定とを切り換える際に、光学系の構成を変更する必要がなくなる。すなわち、エッジフィルタ１９、及び切換えミラー２７を光路上から取り除かなくてもよくなる。これにより、光学系を固定することができる。光学系の切り換え時において発生する、微小な焦点位置のずれを防ぐことができる。よって、精度の高い観察、測定を行うことができる。
【００８８】
なお、図９では、エッジフィルタ１９でラマン散乱光を取り出した後、ビームスプリッタ５５で反射光と入射光とを分岐している。これにより、ラマン散乱光のロスを低減することができるため、測定時間を短くすることができる。もちろん、光を分岐する順番はこれに限られるものではない。たとえば、出射光を入射光からビームスプリッタ５６で分岐した後、出射光のうちの反射光とラマン散乱光とをエッジフィルタで分岐する配置としてもよい。この場合、ビームスプリッタ５６で取り出された出射光の光路中にエッジフィルタ１９を配置する。そして、エッジフィルタ１９で出射光を波長に応じて分岐する。なお、図９において、ハーフミラー２５を設けなくてもよい。これにより、光学系を簡素化することができる。もちろん、本実施の形態においても、反射像の撮像と、スペクトル測定を同時に行わなくてもよい。
【００８９】
このように、本実施の形態では、出射光を前記レーザ光から分岐するステップにおいて、波長に応じて光を分岐する第１の光分岐手段（エッジフィルタ１９）によって出射光をレーザ光から分岐して、第１の光分岐手段によってレーザ光の波長と異なる波長の出射光をレーザ光と分岐した後、第２の光分岐手段（ビームスプリッタ５５）によって前記試料で反射した反射光を分岐して、共焦点光学系を介して反射光を光検出器で検出して、試料の反射光による反射像を撮像している。
【００９０】
上記の実施の形態１〜３にかかる光学顕微鏡によれば、試料表面で発生するラマン散乱光のスペクトル測定を短時間に行うことができる。すなわち、試料２４の表面形状に沿ってスペクトル測定を行うため、必要な測定だけを行うことができる。さらに、試料の表面に焦点位置が合わせられている。コンフォーカル光学系を介してスペクトルを測定する構成であっても、画像のコントラストが低下することなく、精度の高い測定を行うことができる。入射スリット３０の幅を狭くすることができ、Ｚ方向の分解能を向上することができる。
【００９１】
なお、上記の実施形態１〜３では、ラインコンフォーカル光学系を用いて反射像を撮像したが、反射像の撮像に用いられる光学系はこれに限られるものではない。例えば、ピンホールを用いたコンフォーカル光学系を用いて、反射像の撮像を行ってもよい。すなわち、コンフォーカル光学系を介して反射像の撮像を行う構成であればよい。また、分光器３１の入射側に入射スリット３０を設けた構成について説明したが、入射側にピンホールを設けた構成としてもよい。これにより、空間分解能を向上することができる。また、各実施の形態を適宜組み合わせてもよい。たとえば、実施の形態３の光学顕微鏡に対してＡＦ機構５３などを追加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。
【図２】光学顕微鏡に用いられる分光器の構成を模式的に示す斜視図である。
【図３】光学顕微鏡に用いられる処理装置の構成を示すブロック図である。
【図４】試料の表面形状を模式的に示す図である。
【図５】試料の表面に沿って走査する様子を示す図である。
【図６】試料の表面に沿って走査する走査方法の一例を説明するための図である。
【図７】試料の表面に沿って走査する走査方法の他の例を説明するための図である。
【図８】実施の形態２にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。
【図９】実施の形態３にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。
【符号の説明】
【００９３】
１０ レーザ光源
１１ ビームエキスパンダ
１２ レーザラインフィルタ
１３ 高速スキャナ
１４ リレーレンズ
１５ リレーレンズ
１６ 低速スキャナ
１７ リレーレンズ
１８ リレーレンズ
１９ エッジフィルタ
２０ Ｘ走査装置
２１ リレーレンズ
２２ チューブレンズ
２３ 対物レンズ
２４ 試料
２５ ハーフミラー
２６ 結像レンズ
２７ 切換えミラー
３０ 入射スリット
３１ 分光器
３２ ミラー
３３ 凹面鏡
３４ グレーティング
３５ 凹面鏡
３６ アレイ光検出器
３７ 受光画素
４０ Ｙ走査装置
５０ ラインＣＣＤカメラ
５３ ＡＦ機構
５４ レンズ
５５ ビームスプリッタ
５６ ビームスプリッタ
６０ ステージ
７１ 処理装置
７２ ステージ制御部
７３ Ｘ走査制御部
７４ Ｙ走査制御部
７５ 焦点位置抽出部
７６ 反射光データ記憶部
７７ 表面形状記憶部
７８ スペクトルデータ記憶部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡及びスペクトル測定方法に関し、特に詳しくは、スペクトルを測定するための分光器を用いた光学顕微鏡及びスペクトル測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光測定は、試料が気体、液体、結晶、無定形固体であることを問わず、温度は高温でも低温でも可能であり、測定において、真空などの特殊な測定雰囲気を必要としないという利点を持つ。さらに、試料の前処理を特に必要とせず、試料をそのままの状態で測定可能であるなどの長所があり、これらの長所を生かした測定が多くなされている。ラマン分光測定を利用することによって、分子を非染色で観測すること、及び半導体中の不純物を観測することができる。
【０００３】
このようなラマン分光測定を行うため、分光器を用いたラマン顕微鏡が開示されている（特許文献１、特許文献２）。このラマン顕微鏡では、試料にレーザ光を集光して照射している。そして、試料からのラマン散乱光を分光器で分光することにより、ラマンスペクトルを測定することができる。さらに、これらのラマン顕微鏡では、試料を移動させて測定することにより、特定の波長におけるラマン散乱光強度の空間分布を測定することができる。また、測定時間を短縮するため、シリンドリカルレンズにより試料をライン状に照明して、ＣＣＤカメラにより検出するラマン顕微鏡も開示されている（非特許文献１）。このラマン顕微鏡では、ライン状に照明しているため一度に広い領域を照射することができ、測定時間を短縮することができる。しかしながら、シリンドリカルレンズを用いて光をライン状にした場合、均一に光を照射することが困難であり、周辺領域が暗くなってしまう。
【０００４】
さらに、レーザ光を偏向させて、走査する光学顕微鏡が開示されている（特許文献３）。この文献では、Ｘ方向の走査装置、及びＹ方向の走査装置を設けている。そして、分光器に設けられたカメラの露光時間よりもＹ走査装置の走査周期を短くしている（段落００４２）。これにより、カメラの１フレームでライン状の領域におけるラマンスペクトルを測定することができる。
【特許文献１】特開２００２−１４０４３号公報
【特許文献２】特開２００３−３４４７７６号公報
【特許文献３】特開２００７−１７９００２号公報
【非特許文献１】ＣＨＡＲＬＥＮＥ Ａ．ＤＲＵＭＭ、他１名「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｒａｍａｎ Ｌｉｎｅ−Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 ＡＰＰＬＩＥＤ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ、１９９５年、４９巻、第９号、ｐ．１３３１−１３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、特許文献３や非特許文献１では、ラマンスペクトルを測定するために、分光器を用いている。しかしながら、上記のラマン顕微鏡では、分光器を通して反射光を分光器用カメラで撮像することになるため、以下に示す問題点がある。分光器用のカメラは、低雑音であることが要求されるため、読み出し速度が遅くなってしまう。すなわち、分光器用カメラでは、高速で撮像することが困難になってしまう。すなわち、通常の反射光で撮像を行うカメラに比べて、撮像時間が長くなってしまう。さらに、試料の表面に凹凸がある場合、試料の存在しない空間にフォーカスを合わせて測定することになってしまう。すなわち、表面が平坦でない試料では、焦点位置が試料表面以外の位置になってしまうことがある。従って、試料の任意の点に対して、試料表面からのラマンスペクトルを測定しようとする場合、各点において試料をＺ方向に動かして、複数回スペクトル測定を行う必要がある。よって、ラマンスペクトルの測定が長時間になってしまうという問題点がある。
【０００６】
このように従来の光学顕微鏡では、スペクトルを測定するための分光器を用いた場合、測定時間が長くなってしまうという問題点があった。
本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであり、スペクトルを測定するための分光器を用いた構成であっても、短時間でスペクトルを測定することができる光学顕微鏡、及びスペクトル測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様にかかるスペクトル測定方法は、対物レンズを介してレーザ光を試料に照射するステップと、前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出するステップと、前記レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、前記レーザ光の焦点位置を変化させたときの前記反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、前記抽出された焦点位置になるように調整するステップと、前記焦点位置を調整した状態で、前記レーザ光の照射により前記試料から出射される出射光を前記レーザ光から分岐するステップと、前記レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器で測定するステップと、を備えるものである。これにより、スペクトルを測定する回数を減らすことができる。よって、測定時間を短縮することができる。
【０００８】
本発明の第２の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出するステップと、前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定するステップと、前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するステップをさらに有するものである。これにより、試料表面において出射した出射光のスペクトルを測定することができる。よって、短い測定時間で精度の高い測定を行うことができる。
【０００９】
本発明の第３の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように３次元走査して、前記スペクトルを測定するものである。これにより、より短時間での測定が可能になる。
【００１０】
本発明の第４の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記出射光を前記レーザ光から分岐するステップでは、波長に応じて光を分岐する第１の光分岐手段によって前記レーザ光の波長と異なる波長の前記出射光を前記レーザ光から分岐して、前記第１の光分岐手段によって出射光を前記レーザ光と分岐した後、第２の光分岐手段によって前記試料で反射した反射光を分岐して、共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射像を撮像するものである。これにより、反射像の撮像とスペクトルの測定を同時に行うことができるようになる。
【００１１】
本発明の第５の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記レーザ光を第１の方向に走査する第１の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査する第２の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、をさらに備え、前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とするものである。これにより、分光器の同じ位置に出射光が入射するため、測定精度を向上することができる。
本発明の第６の態様にかかるスペクトル測定方法は、上記のスペクトル測定方法であって、前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことを特徴とするものである。これにより、簡便な構成で反射像の撮像とスペクトルの測定を行うことができる。
【００１２】
本発明の第７の態様にかかる光学顕微鏡は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光と前記レーザ光源から前記試料に入射する入射光とを分離する第１の光分岐手段と、前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出する光検出器と、前記レーザ光の焦点位置を光軸に沿って変化させる焦点位置変化手段と、前記焦点位置を変化させたときの前記光検出器の検出結果から、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出する抽出手段と、前記抽出手段によって抽出された焦点位置で、前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、を備えるものである。これにより、スペクトルを測定する回数を減らすことができる。よって、測定時間を短縮することができる。
【００１３】
本発明の第８の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出して、前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定し、前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するものである。これにより、試料表面において出射した出射光のスペクトルを測定することができる。よって、短い測定時間で精度の高い測定を行うことができる。
【００１４】
本発明の第９の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように走査するオートフォーカス機構をさらに備え、前記オートフォーカス機構によって、前記試料の表面に追従させて前記スペクトル測定を行うものである。れにより、試料表面において出射した出射光のスペクトルを測定することができる。よって、短い測定時間で精度の高い測定を行うことができる。
【００１５】
本発明の第１０の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第１の光分岐手段によって分岐した後、前記試料で反射した反射光と前記試料に入射するレーザ光とを分岐する第２の光分岐手段をさらに備え、前記第１の光分岐手段が波長に応じて前記レーザ光と異なる波長の出射光を取り出し、共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射光画像を撮像するものである。これにより、反射像の撮像とスペクトルの測定を同時に行うことができるようになる。
【００１６】
本発明の第１１の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記レーザ光を第１の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第１の走査手段と、前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第２の走査手段と、をさらに備え、前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とするものである。これにより、分光器の同じ位置に出射光が入射するため、測定精度を向上することができる。
本発明の第１２の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことと特徴とするものである。これにより、簡便な構成で反射像の撮像とスペクトルの測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の第１３の態様にかかる光学顕微鏡は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、波長に応じて光を分岐して、前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光からレーザ光の波長と異なる波長の出射光を取り出す第１の光分岐手段と、前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、前記試料で反射した反射光を前記レーザ光から分岐する第２の光分岐手段と、共焦点光学系を介して、前記試料で反射した反射光を検出する光検出器と、を備えるものである。これにより、反射像の撮像とスペクトルの測定を同時に行うことができるようになる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、スペクトルを測定するための分光器を用いた構成であっても、短時間でスペクトルを測定することができる光学顕微鏡、及びスペクトル測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。
【００２０】
発明の実施の形態１．
本発明の実施の形態にかかる光学顕微鏡について図１を用いて説明する。図１は本実施の形態にかかる光学顕微鏡１００の光学系の構成を模式的に示す図である。光学顕微鏡１００は、試料２４を観察するための構成として、レーザ光源１０と、ビームエキスパンダ１１と、レーザラインフィルタ１２、Ｙ走査装置４０、リレーレンズ１７、リレーレンズ１８、エッジフィルタ１９、Ｘ走査装置２０、リレーレンズ２１、チューブレンズ２２、対物レンズ２３、ハーフミラー２５、結像レンズ２６、切換えミラー２７、分光器３１、ラインＣＣＤカメラ５０、ステージ６０と、を有している。
【００２１】
光学顕微鏡１００はラマン顕微鏡であり、レーザ光源１０からの光ビームを試料２４に入射させ、試料２４からのラマン散乱光を分光器３１で検出する。ラマン散乱光を分光器３１で分光するため、ラマンスペクトルを測定することができる。さらに、光学顕微鏡１００では、ＸＹ方向（水平方向）及びＺ方向（鉛直方向）に走査することができるため、３次元のラマンスペクトルイメージを測定することができる。さらに、光学顕微鏡１００は、コンフォーカル光学系を介して反射像を撮像するために、ラインＣＣＤカメラ５０が設けられている。すなわち、試料２４を反射した反射光は、ラインコンフォーカル光学系を介して検出される。ラマン散乱光のスペクトル測定を行うための光学系と、反射像を撮像するための光学系とを切換えることができる。ラマン散乱光のスペクトル測定を行うための光学系と、反射像を撮像するための光学系とは、一部の光路が共通しており、切換えミラー２７によって、切換が行われる。
【００２２】
光学顕微鏡１００の全体構成について説明する。まず、ラマンスペクトルを測定するときの照明光学系について説明する。照明光学系では、レーザ光源１０は、励起光となるレーザ光を出射する。レーザ光源１０は、所定のレーザ波長の光を出射する。レーザ光源１０は、例えば、赤色や緑色の単色光を出射する。レーザ光源１０には、例えば、スペクトラフィジックス社製Ｍｉｌｌｅｎｎｉａを用いることができる。このレーザ光源１０はレーザ波長５３２ｎｍ、線幅０．２４ｎｍ、最大出力が１０ＷのＮｄ／ＹＶＯ４レーザである。レーザ光源１０はこのレーザ波長を有するレーザ光を出射する。
【００２３】
レーザ光は、ビームエキスパンダ１１で拡大される。すなわち、ビームエキスパンダ１１は、レーザ光のスポットが所定の大きさとなるように、ビーム径を拡大する。この後、レーザ光は、レーザラインフィルタ１２に入射する。レーザラインフィルタ１２は、レーザ波長以外の光を遮光する。これにより、ノイズとなる迷光を低減することができる。そして、レーザ光は、レーザラインフィルタ１２を通過して、高速スキャナ１３に入射する。
【００２４】
高速スキャナ１３は、エッジフィルタ１９の後段側に配置されている低速スキャナ１６とともに、Ｙ走査装置４０を構成する。すなわち、Ｙ走査装置４０は、高速スキャナ１３と低速スキャナ１６とを含んでいる。Ｙ走査装置４０は、レーザ光をＹ方向に偏向して、走査する。Ｙ走査装置４０は、入射した光ビームの出射角を変化させて、光ビームを偏向させる。これにより、試料２４上で光ビームの入射位置がＹ方向に沿って変化する。例えば、高速スキャナ１３は、共振型ガルバノミラーであり、約８ｋＨｚでレーザ光を走査する。具体的には、ガルバノミラーの反射面の角度が変化することで、レーザ光の方向が変わる。低速スキャナ１６は、サーボガルバノミラーであり、高速スキャナ１３よりも低速で動作する。これにより、レーザ光が走査される。なお、高速スキャナ１３、及び低速スキャナ１６はレーザ光をＹ方向に走査する。なお、Ｙ走査装置４０の動作については後述する。
【００２５】
高速スキャナ１３と低速スキャナ１６の間には、リレーレンズ１７、１８とエッジフィルタ１９が設けられている。リレーレンズ１７、１８は、レーザ光を屈折して、像をリレーする。なお、リレーレンズ１７とリレーレンズ１８との間には、絞りが設けられていてもよい。そして、リレーレンズ１８からのレーザ光は、エッジフィルタ１９に入射する。
【００２６】
エッジフィルタ１９は、波長に応じて光を反射又は透過する。すなわち、エッジフィルタ１９は、波長に応じた透過率、及び反射率を有している。具体的には、エッジフィルタ１９は、レーザ波長の光を反射して、レーザ波長よりも波長の長い光を透過する。これにより、効率よく、ラマン散乱光を測定することができる。すなわち、励起光となるレーザ光のほとんどは、エッジフィルタ１９で反射して、試料２４の方向に向かう。一方、レーザ光よりも長い波長を有するラマン散乱光のほとんどは、エッジフィルタ１９を透過して、分光器３１の方向に向かう。ここでは、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製のエッジフィルタ１９を用いている。
【００２７】
エッジフィルタ１９で反射されたレーザ光は、低速スキャナ１６に入射する。低速スキャナ１６は、上記のように、ガルバノミラーであり、Ｙ方向にレーザ光を走査する。そして、低速スキャナ１６で反射されたレーザ光は、Ｘ走査装置２０に入射する。Ｘ走査装置２０は、例えばサーボガルバノミラーであり、反射面の角度が変化することによって、光ビームを偏向させる。すなわち、光軸に対するＸ走査装置２０の反射面の傾斜角度が変化するため、光ビームの出射角を変化させることができる。これにより、試料２４上で光ビームの入射位置がＸ方向に沿って変化する。試料２４上で、光ビームをＸ方向に走査することができる。なお、Ｘ走査装置２０での偏向角は、電気信号によって制御される。また、Ｘ方向とＹ方向とは互いに直交する方向であるため、Ｘ走査装置２０及びＹ走査装置４０によってＸＹ方向に走査することにより、試料２４上において２次元領域を走査することができる。
【００２８】
そして、Ｘ走査装置２０で反射されたレーザ光は、リレーレンズ２１、チューブレンズ２２で屈折され、対物レンズ２３に入射する。対物レンズ２３は、光ビームを集光して、試料２４上に入射させる。すなわち、対物レンズ２３は、試料２４上に光ビームを集光して、試料２４を照明する。これにより、試料２４のスポット状の領域が照明される。対物レンズ２３には、例えば、ニコン製アポクロマート ＮＡ １．２ ｘ６０を用いることができる。
【００２９】
対物レンズ２３は、レーザ光を集光して、試料２４に入射させる。このとき、Ｘ走査装置２０、及びＹ走査装置４０によって、レーザ光がＸＹ方向に走査されている。すなわち、試料２４上におけるレーザ光の入射位置が、Ｘ走査装置２０、及びＹ走査装置４０の動作に応じて変化している。これにより、試料２４上において２次元領域を走査することができる。
【００３０】
対物レンズ２３から試料２４に入射した入射光は、試料２４で反射される。また、試料２４に入射した入射光の一部はラマン散乱される。試料２４に入射した入射光のうち、対物レンズ２３側に出射した光を出射光とする。すなわち、試料２４から対物レンズ２３側に向かう光を出射光と称する。この出射光には、レーザ波長と同じ波長のレイリー散乱光、及びレーザ波長と異なる波長のラマン散乱光が含まれている。さらに、試料２４が蛍光物質を含む場合、出射光に蛍光が含まれている。
【００３１】
ラマン散乱された出射光は、入射光と異なる波長となっている。すなわち、ラマンシフトによって出射光は入射光の振動数からずれて散乱される。この出射光のスペクトルがラマンスペクトルとなる。したがって、出射光のスペクトルを測定することにより、試料２４中に含まれる物質の化学構造及び物理的状態を特定することができる。すなわち、ラマンスペクトルには、試料２４を構成する物質の振動数の情報が含まれるため、出射光を分光器３１で分光して検出することにより、試料２４中の物質を特定することができる。測定したラマンスペクトルのうち、特定の波長に注目することにより、特定物質の空間分布の測定も可能となる。具体的には、試料２４を生体細胞とした場合、核酸や脂質の空間分布あるいはスクロースやポリスチレン球の空間分布を測定することができる。
【００３２】
なお、試料２４はステージ６０の上に載置されている。ステージ６０は、例えば、ＸＹＺステージである。このステージ６０は可動ステージであり、試料２４の任意の位置を照明することができる。また、ステージ６０をＺ方向に駆動することによって、対物レンズ２３と試料２４との距離を変化させることができる。従って、対物レンズ２３の焦点位置を光軸方向に沿って変化させることができる。光学顕微鏡１００は、後述するようにレーザコンフォーカル顕微鏡を構成しているため、焦点位置を変化させることによって、Ｚ方向の走査が可能となる。すなわち、Ｚ方向にステージを移動させることによって、試料２４の断層画像を撮像することができる。試料２４の任意の高さからのラマン散乱光の検出することができる。
【００３３】
次に、試料２４からの出射光を検出するための光学系について説明する。ステージ６０上に載置された試料２４からの出射光は、入射光と同じ光路上を伝播していく。すなわち、対物レンズ２３により屈折され、チューブレンズ２２及びリレーレンズ２１で屈折されて、Ｘ走査装置２０に入射する。Ｘ走査装置２０は、入射した出射光をエッジフィルタ１９の方向に反射する。このとき、出射光は、Ｘ走査装置２０によってデスキャンされる。すなわち、Ｘ走査装置２０で反射されることによって、出射光は、レーザ光源１０からＸ走査装置２０に入射した入射光の進行方向と反対方向に伝播する。また、試料２４からのレイリー散乱光もラマン散乱光と同じ光路で伝播していく。
【００３４】
Ｘ走査装置２０によって、反射された出射光は、低速スキャナ１６を介して、エッジフィルタ１９に入射する。エッジフィルタ１９は、試料２４からの出射光と、レーザ光源１０から試料２４に入射する入射光とを波長に基づいて分岐する。すなわち、エッジフィルタ１９は、その反射面が入射光の光軸に対して傾いて設けられている。試料２４からの出射光がエッジフィルタ１９を透過することによって、試料２４からの出射光の光軸が、レーザ光源１０から試料２４に入射する入射光の光軸と異なるものとなる。よって、試料２４からの出射光を、レーザ光源１０から試料２４に入射する入射光から分離することができる。このように、エッジフィルタ１９は、入射光と出射光とを分岐する第１の光分岐手段として機能する。
【００３５】
光分岐手段として用いるエッジフィルタ１９は、波長に応じて光を透過又は反射する。エッジフィルタ１９に対する光ビームの入射角度を小さくすることが好ましい。ここで、光ビームの入射角度は、光ビームの主光線とエッジフィルタ１９の反射面の垂線との間の角度である。エッジフィルタ１９の反射面に対するリレーレンズ１８からの光ビームの入射角度を、例えば１２°以下とすることが好ましく、さらに、入射角度を１０°とすることがより好ましい。このように、エッジフィルタ１９に対して垂直方向に近い方向から光ビームを入射させる。また、リレーレンズ１８と光路が重ならないように入射角度を８°以上とすることが好ましいが、設計によっては、８°以下とすることも可能である。これにより、エッジフィルタ１９の特性を向上させることができ、レイリー散乱光とラマン散乱光と確実に分離することができる。すなわち、エッジフィルタ１９のレイリー散乱光に対する反射率及び、エッジフィルタ１９のラマン散乱光に対する透過率を向上することができる。したがって、レイリー散乱光とラマン散乱光との波長の差に基づいて、レイリー散乱光とラマン散乱光とを確実に分離することができる。もちろん、本発明にかかる光学顕微鏡において、光ビームのエッジフィルタ１９に対する入射角度は、上記の値に限定されるものではない。
【００３６】
さらに、エッジフィルタ１９は、レーザ波長の光を反射して、ラマン散乱光を透過するような、特性を有している。従って、試料２４からのレイリー散乱光は、エッジフィルタ１９で反射され、ラマン散乱光は、エッジフィルタ１９を透過する。すなわち、エッジフィルタ１９を用いることによって、レイリー散乱光とラマン散乱光との波長に差に基づいてレイリー散乱光を除去することができる。さらに、レーザ光源１０からのレーザ光のほとんどはエッジフィルタ１９で反射され、試料２４に向かう。これにより、レーザ光のロスを低減することができ、効率よくラマン散乱光のみを検出することができる。なお、エッジフィルタ１９の反射特性は、測定するスペクトルの範囲に応じて決定すればよい。
ここで、エッジフィルタ１９は、低速スキャナ１６と高速スキャナ１３との間に配置されている。ラマンスペクトルを測定する場合、高速スキャナ１３を固定して、低速スキャナ１６のみでスキャンする。すなわち、高速スキャナ１３を動作させない状態として、低速スキャナ１６のみを動作させる。従って、エッジフィルタ１９は、低速スキャナ１６によってデスキャンされた後の出射光と、レーザ光源１０からのレーザ光とを分離する。
【００３７】
エッジフィルタ１９を透過した出射光は、結像レンズ２６に入射する。結像レンズ２６は、試料２４の像を入射スリット３０またはラインＣＣＤカメラ５０上に結像する。さらに、結像レンズ２６で屈折された出射光は、切換えミラー２７で反射して、分光器３１の入射側に設けられた入射スリット３０に入射する。このとき、結像レンズ２６は入射スリット３０上に出射光を集光している。すなわち、結像レンズ２６は、入射スリット３０上に、試料２４が照明された領域の拡大像を結像している。入射スリット３０には、ライン状の開口部が設けられている。この開口部は、Ｙ方向に対応する方向に沿って設けられている。すなわち、入射スリット３０の開口部は試料２４上におけるＹ走査装置４０の走査方向（Ｙ方向）に対応する方向に沿って設けられている。
【００３８】
結像レンズ２６は出射光を屈折させて、入射スリット３０上に結像する。ここで、試料２４面上において入射光はスポット状に結像されているため、入射スリット３０上において出射光はスポット状に集光される。入射スリット３０の開口部の方向とＹ走査装置４０の走査方向とを一致させる。出射光は、Ｙ走査装置４０の低速スキャナ１６によってデスキャンされて、エッジフィルタ１９に入射している。このため、低速スキャナ１６で走査しても、入射スリット３０上で光ビームのスポット位置が入射スリット３０の同じ位置に入射する。試料２４上でＹ方向に走査された光が入射スリット３０の開口部に結像するように配置する。換言すると入射スリット３０と試料２４とは互いに共役な関係となるよう配置される。
【００３９】
したがって、ラマン顕微鏡はコンフォーカル光学系として構成される。例えば、絞り（不図示）と試料２４面上とが互いに共役な関係となるように配置され、試料２４面上と入射スリット３０とが互いに共役な関係となるように配置されている。絞りが設けられたＸＹ平面及び試料２４面上において、入射光がスポット状に集光される。そして、試料２４から散乱して出射した出射光は入射スリット３０上でスポット状に集光される。入射スリット３０はＹ方向に沿った開口部を有しており、この開口部に入射した出射光のみを分光器３１の２次元アレイ光検出器に透過させる。レーザ光源１０から試料２４までの照明光学系及び試料２４からアレイ光検出器まで観察光学系をこのような結像光学系とすることにより、共焦点ラマン顕微鏡とすることができる。これにより、Ｚ方向の分解能の高い測定を行うことができる。そして、ステージ６０をＺ方向に移動することにより、試料２４の任意の高さからのラマン散乱光を他の高さからのラマン散乱光から分離して検出することができる。
【００４０】
この入射スリット３０を通過した出射光は、分光器３１の本体に入射する。この分光器３１について、図２を用いて説明する。図２は、分光器３１の構成に示す図である。ここでは、ツェルニターナ型の分光器３１を示している。分光器３１には、入射スリット３０、ミラー３２、凹面鏡３３、グレーティング３４、凹面鏡３５、及びアレイ光検出器３６が設けられている。
【００４１】
入射スリット３０は、分光器３１の入射側に配置されている。また、入射スリット３０は、Ｙ方向に沿って配置されている。入射スリット３０を通過して出射光は、ミラー３２、凹面鏡３３で反射され、グレーティング３４に入射する。グレーティング３４は、入射スリット３０から入射した光をその波長に応じて空間的に分散させる。ここでは、グレーティング３４として、反射型回折格子を用いている。そして、グレーティング３４は、入射スリット３０の方向と垂直な方向に、出射光を分散させる。そして、グレーティング３４で分散した光は、凹面鏡３５で反射されて、アレイ光検出器３６に入射する。
【００４２】
もちろん、上記以外の構成を有する分光器３１を用いてもよい。出射光は分光器３１によって入射スリット３０の方向と垂直な方向に分散される。すなわち、分光器３１は、入射スリット３０のライン状の開口部と垂直な方向に出射光を波長分散する。分光器３１により分光された出射光はアレイ光検出器３６に入射する。アレイ光検出器３６は受光素子がマトリクス状に配列されたエリアセンサである。具体的には、アレイ光検出器３６は画素がアレイ状に配置されたＣＣＤカメラなどの２次元アレイ光検出器である。
【００４３】
アレイ光検出器３６には、例えば、冷却ＣＣＤを用いることができる。具体的には、アレイ光検出器３６として、プリンストン・インスツルメンツ社製１０２４×２５６画素の電子冷却ＣＣＤを用いることができる。また、アレイ光検出器３６にイメージインテンシファイアを取り付けることも可能である。アレイ光検出器３６の画素は、入射スリット３０に対応する方向に沿って配置されている。したがって、アレイ光検出器３６の画素の一方の配列方向は入射スリット３０の方向と一致し、他方の配列方向は、分光器３１の分散方向と一致する。アレイ光検出器３６の入射スリット３０の方向に対応する方向がＹ方向となり、入射スリット３０と垂直な方向、すなわち、分光器３１によって出射光が分散される方向がＸ方向となる。
【００４４】
アレイ光検出器３６は各画素で受光した出射光の光強度に応じた検出信号を処理装置７１に出力する。処理装置７１は、例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）などの情報処理装置であり、アレイ光検出器３６からの検出信号をメモリなどに記憶していく。そして、検出結果に所定の処理を行い、モニターに表示する。さらに、処理装置７１は、Ｙ走査装置４０及びＸ走査装置２０の走査や、ステージ６０の駆動を制御している。ここで、アレイ光検出器３６のＸ方向は出射光の波長（振動数）に対応している。すなわち、Ｘ方向に配列されている画素列において、一端の画素は長波長（低振動数）の出射光を検出し、他端の画素は短波長（高振動数）の出射光を検出する。このように、アレイ光検出器３６のＸ方向における光強度の分布はラマンスペクトルの分布を示すことになる。
【００４５】
次に、反射光による反射像を撮像するための光学系について、図１を用いて説明する。反射像を撮像する場合、エッジフィルタ１９を光路上から取り除く。そして、エッジフィルタ１９が挿入されていた位置に、ハーフミラー２５を挿入する。すなわち、エッジフィルタ１９、及びハーフミラー２５を挿脱可能に設けて、いずれか一方のみを光路中に挿入するようにする。エッジフィルタ１９、及びハーフミラー２５は排他的に使用される。レーザ波長と同じ波長の反射光を検出する場合、ハーフミラー２５が使用され、ラマン散乱光を検出する場合、エッジフィルタ１９が使用される。さらに、レーザ波長と同じ波長の反射光を検出する場合、切換えミラー２７が光路上から取り除かれる。また、高速スキャナ１３をスキャンして、低速スキャナ１６を固定する。すなわち、低速スキャナ１６を動作させない状態として、高速スキャナ１３のみを動作させる。なお、これら以外の構成については、ラマン散乱光を検出する場合と同じであるため、説明を省略する。
【００４６】
レーザラインフィルタ１２からのレーザ光は、高速スキャナ１３で走査される。そして、上記と同様に、リレーレンズ１７、リレーレンズ１８に入射する。リレーレンズ１８からのレーザ光は、ハーフミラー２５に入射する。ハーフミラー２５は、入射した光の一部を反射し、一部を透過する。ここでは、ハーフミラー２５に入射したレーザ光の半分が低速スキャナ１６の方向に反射される。ハーフミラー２５で反射したレーザ光は、固定された低速スキャナ１６を介して、Ｘ走査装置２０に入射する。そして、ラマン散乱光を検出する場合と同様に、レーザ光が試料２４に入射する。試料２４からの出射光が同様に、Ｘ走査装置２０でデスキャンされる。Ｘ走査装置２０からの出射光は、固定された低速スキャナ１６を介して、ハーフミラー２５に入射する。ハーフミラー２５は、出射光の半分を結像レンズ２６の方向に透過する。なお、ハーフミラー２５は、波長によらず、透過率及び反射率が一定である。このため、ラマン散乱光の一部もハーフミラー２５を透過するが、ラマン散乱光は、反射光（レイリー散乱光）に比べて十分に弱いため、反射像の撮像には、問題ない。
【００４７】
そして、ハーフミラー２５を透過した出射光は、結像レンズ２６で屈折される。ラインＣＣＤカメラ５０の方向に向かう。このとき、切換えミラー２７が光路上から離脱している。このため、出射光が、分光器３１の方向に反射されずに、ラインＣＣＤカメラ５０の方向に向かう。結像レンズ２６が出射光をラインＣＣＤカメラ５０の受光面に結像している。ラインＣＣＤカメラ５０は、Ｙ方向に対応する方向に沿って配列された受光画素を有している。
【００４８】
さらに、Ｙ走査装置４０は、１フレーム撮像する間に、光ビームをＹ方向に１回以上走査する。すなわち、Ｙ走査装置４０の走査周期を露光時間よりも短くして、ラインＣＣＤカメラ５０の１フレームの露光時間内で、Ｙ方向に１回以上走査する。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０の１フレームで、走査範囲に応じたライン状の領域の反射光を検出することができる。すなわち、露光時間内に、Ｙ走査装置４０の走査領域の全体を走査する。したがって、反射光はラインコンフォーカル（スリットコンフォーカル）光学系を介して検出される。上記の１フレームの撮像が終了したら、Ｘ走査装置２０によってＸ方向に１照明領域分、照明位置をずらす。そして、同様に１フレームの撮像を行い、ライン状の領域の反射光を検出する。これを繰り返し行なうことによって、試料２４上の２次元領域の反射像を撮像することができる。なお、ラインＣＣＤカメラ５０での検出信号は、処理装置７１に出力される。そして、処理装置７１で処理が行われて、反射光画像（反射像）となる。
【００４９】
ラインＣＣＤカメラ５０は、アレイ光検出器３６よりも読み出し速度が速くなっている。よって、高速に反射像を撮像することができる。すなわち、撮像時間を短縮することができる。さらに、分光器３１を介さずに、出射光がラインＣＣＤカメラ５０に入射する。よって、画像が分光器の収差の影響を受けることがなくなり、高分解能での撮像が可能になる。よって、ラマンスペクトルを測定可能な光学顕微鏡１００でも、高速、かつ高分解能で、反射像を撮像することができる。また、Ｙ方向に高速に走査することで、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間内では、光がライン状となる。すなわち、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間を考慮すると、試料２４がライン状に照明されていることになる。
【００５０】
本実施の形態では、出射光の光路を切換える切換え手段として、切換えミラー２７が設けられている。切換えミラー２７は、出射光の光路中に挿脱可能に設けられている。切換えミラー２７が光路中に挿入されることで、出射光が反射されて、分光器３１の方向に向かう。一方、切換えミラー２７が光路中から取り除かれると、出射光が切換えミラー２７の挿入位置を直進して、ラインＣＣＤカメラ５０の方向に向かう。このように、切換えミラー２７を挿脱することで、ラマンスペクトル測定か、反射像の撮像かを切換えることができる。もちろん、切換えミラー２７を挿入時に、反射像を撮像してもよい。この場合、スペクトル測定時には、切換えミラー２７が光路から取り除かれる。切換えミラー２７を動作させることで、分光器３１による測定か、ラインＣＣＤカメラ５０による測定かを選択することができる。入射光から分離された出射光が分光器３１に向かう光路５１又はラインＣＣＤカメラ５０に向かう光路５２を伝播するように、切換えミラー２７が光路を切換える。なお、光路を切換える切換え手段は、切換えミラー２７に限られるものではない。例えば、光を屈折するプリズムなどであってもよい。
【００５１】
次に、Ｙ走査装置４０について説明する。本実施の形態では、Ｙ方向に走査するＹ走査装置４０として、高速スキャナ１３、及び低速スキャナ１６の２つが設けられている。そして、用途に応じて、一方のスキャナを駆動する。高速スキャナ１３は、例えば、共振型ガルバノミラーであり、例えば、８ｋＨｚの周波数で動作する。
【００５２】
低速スキャナ１６は、サーボ型ガルバノミラーであり、高速スキャナ１３よりも低い周波数で動作する。高速スキャナ１３は低速スキャナ１６よりも高速にレーザ光を走査する。なお、いずれか一方のスキャナで十分な場合は、一方のスキャナのみでＹ走査装置４０を構成してもよい。
【００５３】
例えば、ラマン散乱光を検出するラマンモードの場合、高速スキャナ１３を固定して、低速スキャナ１６を動作させる。このとき、アレイ光検出器３６と低速スキャナ１６を同期させる。ラマンモードの場合、Ｘ走査装置２０も同期して動作させる。すなわち、ある測定位置でのスペクトル測定が終了したら、次の測定位置に、レーザ光が入射するよう、レーザ光を走査する。このとき、光路上からは、ハーフミラー２５が取り除かれ、光路中にはエッジフィルタ１９が挿入されている。また、切換えミラー２７も光路中に挿入されている。これにより、分光器３１で分光測定が可能になる。
ラマンモードの場合、光は、Ｘ走査装置２０、及び低速スキャナ１６でデスキャンされて、分光器３１に入射する。従って、ＸＹ方向に走査しても、分光器３１の入射スリット３０の同じ位置上に光が入射する。すなわち、試料上における測定位置によらず、光は入射スリット３０の同じ点を通過する。これにより、スペクトルの測定精度を向上することができる。
【００５４】
一方、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間は、アレイ光検出器３６の露光時間よりも短い。よって、レーザ光と同じ波長の反射光を検出する反射モードでは、高速スキャナ１３を動作させて、低速スキャナ１６を固定する。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０の露光時間で、Ｙ方向に、レーザ光が１回以上走査される。反射モードの場合、Ｘ走査装置２０も動作させる。このとき、光路上からは、エッジフィルタ１９が取り除かれ、光路中にはハーフミラー２５が挿入されている。また、切換えミラー２７が光路上から取り除かれている。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０で反射光検出が可能になる。ラインＣＣＤカメラ５０は、アレイ光検出器３６よりも露光時間が短いため、高速スキャナ１３で走査することが好ましい。
【００５５】
また、試料２４の特定位置を観察する場合、位置制御可能な低速スキャナ１６でレーザ光をその特定位置に照射する。そして、レーザ光の走査を停止して、照射位置をその位置で固定する。このとき、高速スキャナ１３の動作は停止している。これにより、特定の位置での像の変化を観察することができる。このように、位置決め精度が必要な場合、低速スキャナ１６のみを用いてレーザ光の照射位置を移動させる。すなわち、特定の位置を照明するため、低速スキャナ１６で位置決めする。これにより、レーザ光の照射位置が特定の位置で固定される。一方、高速スキャナ１３は、反射光の検出時に用いる。もちろん、１つのスキャナで十分な場合は、１つのスキャナのみでＹ方向に走査してもよい。このように、Ｙ方向に走査する走査手段として、低速スキャナ１６と高速スキャナ１３を設ける。そして、２つのスキャナを用途に応じて使い分ける。
【００５６】
本実施の形態では、Y走査機構に高速スキャナ１３と低速スキャナ１６の２個のスキャナを組み合わせて使用している。このような構成とすることで、例えば、共振ガルバノミラーのように、特定の角度で停止させることができないスキャナを高速スキャナ１３に採用する場合においても、もう一方の低速スキャナを用いることで、試料上の特定の位置を測定することができる。このように、Ｘ走査装置２０とＹ走査装置４０が合わせて三つのスキャナー（Ｙ方向の高速スキャナ１３、Ｙ方向の低速スキャナ１６、Ｘ方向のスキャナ）を有している。そして、そのうちの２つにおいてデスキャンし、１つにおいてデスキャンしない構成とする。これにより、簡便な構成で反射像の撮像とスペクトルの測定を行うことができる。
【００５７】
試料上の特定の位置を測定する場合には、測定の高速性よりも、測定精度が重要となる場合が多い。本実施の形態では、低速スキャナ１６をエッジフィルタ１９（またはハーフミラー）よりも試料側に設置することで、低速スキャナ１６によって走査される場合、試料からの光は、デスキャンされた後にラインＣＣＤカメラ５０またはアレイ光検出器３６によって検出される。よって、試料上における測定位置によらず、光は入射スリット３０の同じ点を通過するため、スペクトルの測定精度が向上する。
【００５８】
一方、高速スキャナ１３をエッジフィルタ１９（またはハーフミラー）よりもレーザー光源１０側に配置される。高速スキャナ１３によって走査される場合には、試料からの光は、デスキャンされずにラインＣＣＤカメラ５０またはアレイ光検出器３６に入射する。このため、ライン状の領域における複数の点を同時に測定することができ、高速に測定が行える。
【００５９】
このように、Ｙ走査機構に高速スキャナ１３と低速スキャナ１６の２個のスキャナを組み合わせて使用し、一方のみをデスキャンする。このようにすることで、必要に応じて、スペクトルの測定精度を向上するか、測定を高速に行うかを選択することができる。
【００６０】
さらに、この構成では、蛍光を検出することができる。蛍光を検出する蛍光モードの場合、高速スキャナ１３を動作させて、低速スキャナ１６を固定する。蛍光モードの場合、Ｘ走査装置２０も動作させる。このとき、光路上からは、ハーフミラー２５が取り除かれ、光路中にはエッジフィルタ１９が挿入されている。これにより、蛍光から励起光を分岐することができる。すなわち、レーザ波長と異なる波長の蛍光がエッジフィルタ１９を通過し、レーザ光がエッジフィルタ１９で反射される。また、切換えミラー２７が光路上から取り除かれている。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０で蛍光像を取得することができる。このように、蛍光モード、反射モード、ラマンモードの切り替えを簡便に行うことができる。さらに、エッジフィルタ１９とハーフミラー２５を排他的に使用することで、別途、帯域フィルタ等を設ける必要がなくなる。よって、装置構成を簡便にすることができる。
【００６１】
本実施の形態では、試料の表面に沿って、レーザ光を走査している。これにより、ラマンスペクトルの測定時間を短縮することができる、すなわち、Ｚ方向における測定点数を１点として、ラマンスペクトル測定を行う測定点数を減らしている。よって、測定時間を短くすることができる。そのための制御と処理について、図３を用いて説明する。図３は、本実施の形態にかかる光学顕微鏡に用いられる処理装置７１の構成を模式的に示すブロック図である。図３に示すように、処理装置７１には、ステージ制御部７２、Ｘ走査制御部７３、Ｙ走査制御部７４、焦点位置抽出部７５、反射光データ記憶部７６、表面形状記憶部７７、スペクトルデータ記憶部７８が設けられている。
【００６２】
ステージ制御部７２は、ステージ６０の動作を制御する。なお、ステージ６０はＸＹＺステージであり、試料２４を３次元的に移動させる。これにより、所望の位置に試料２４を移動させることができる。ステージ制御部７２は、ステージ６０の３次元座標を認識している。ステージ制御部７２が、ステージ６０をＺ方向に移動させることで、対物レンズ２３と試料２４の距離が変化する。すなわち、試料２４に対するレーザ光の焦点位置が光軸に沿って変化する。このように、ステージ６０のＺ座標がレーザ光の焦点位置を示すことになる。
【００６３】
Ｘ走査制御部７３は、Ｘ走査装置２０による走査を制御する。すなわち、Ｘ方向におけるレーザ光の偏向角度は、Ｘ走査制御部７３によって制御される。Ｘ走査制御部７３は、Ｘ走査装置２０を駆動して、ステージ６０上の試料２４におけるレーザ光の入射位置をＸ方向に移動させる。従って、Ｘ走査制御部７３、及びステージ制御部７２によって、測定位置のＸ座標を認識することができる。すなわち、試料２４の任意の点におけるＸ座標を求めることができる。
【００６４】
Ｙ走査制御部７４は、Ｙ走査装置４０による走査を制御する。すなわち、Ｙ走査制御部７４は、高速スキャナ１３、及び低速スキャナ１６の動作をそれぞれ制御する。Ｙ方向におけるレーザ光の偏向角度は、Ｙ走査制御部７４によって制御される。Ｙ走査制御部７４は、Ｙ走査装置４０を駆動して、ステージ６０上の試料２４におけるレーザ光の入射位置をＹ方向に移動させる。Ｙ走査制御部７４、及びステージ制御部７２によって、測定位置のＹ座標を認識することができる。すなわち、試料２４の任意の点におけるＹ座標を求めることができる。従って、ＸＹ平面において試料２４の異なる点は、異なるＸＹ座標で示される。
【００６５】
ステージ制御部７２、Ｘ走査制御部７３、Ｙ走査制御部７４を用いて、試料２４を３次元的に走査する。そして、反射光による反射像を撮像する。ここで、試料２４の測定位置はＸＹ座標で示され、試料２４に対する焦点位置はＺ座標で示される。従って、各測定位置において、焦点位置をＺ方向に変化させて、複数回の測定を行う。すなわち、焦点位置を変化させたときの各焦点位置において、それぞれ、反射光をラインＣＣＤカメラ５０で検出する。
【００６６】
たとえば、ステージ６０、Ｘ走査装置２０、および低速スキャナ１６を固定した状態で、高速スキャナ１３を動作させる。そして、１ライン分の反射光をラインＣＣＤカメラ５０で検出する。そして、Ｚ方向に焦点位置を順次変化させ、それぞれの焦点位置で反射光の検出を行う。すなわち、ある焦点位置での反射光の検出が終了したら、焦点位置をＺ方向にずらして、反射光を検出する。そして、Ｚ方向の走査が終了したら、Ｘ走査装置２０によって１ライン分、測定位置をずらす。次のラインも同様に、反射光をラインＣＣＤカメラ５０で検出する。Ｘ方向の走査が終了したら、ステージ６０を動作させる。そして、試料２４をＹ方向に移動させて、同様に反射光を検出する。このように、試料全面を走査して、同様に反射光を検出する。このようにして、３次元的な走査を行う。もちろん、走査する順番は上記の順番に限られるものはない。
【００６７】
ラインＣＣＤカメラ５０で検出された反射光の強度が反射光データとして反射光データ記憶部７６に記憶される。ここで、各ＸＹＺ座標における反射光強度が、その座標と対応付けられて記憶される。すなわち、異なる高さで反射光強度を測定することで、座標毎に反射光データが取得される。このようにして、各断層における反射像が撮像される。
【００６８】
焦点位置抽出部７５は、反射光データに基づいて、ラマンスペクトルを測定する焦点位置を抽出する。すなわち、各測定位置において反射光を検出して、反射光を検出した複数のＺ座標の中からラマンスペクトルを測定するＺ座標を選択する。本実施の形態では、共焦点光学系を介して、反射光を検出している。従って、試料表面以外では反射光強度が低下する。レーザ光の焦点位置が試料２４の表面にある時に、反射光強度が最大となる。レーザ光の焦点位置が試料表面から外れると、ラインＣＣＤカメラ５０の受光面において像がぼやける。よって、反射光強度が最大となるＺ座標を求める。そして、このＺ座標を、ラマンスペクトルを測定する焦点位置とする。すなわち、反射光強度が最大となる焦点位置を抽出して、抽出した焦点位置をラマンスペクトル測定用焦点位置とする。換言すると、各測定位置において、ラマンスペクトルを測定しないＺ座標を決定することになる。
【００６９】
このように、焦点位置抽出部７５は、各ＸＹ座標において、反射光強度が最大となる焦点位置を順次求めていく。たとえば、図４に示すように、各ＸＹ座標において、反射光強度の測定を複数回行う。なお、図４は、試料の表面形状を模式的に示す図である。Ｚ方向に焦点位置を変えて、反射光を検出する。すなわち、異なる高さで反射強度の測定を行う。これにより、各断層における２次元の反射像が撮像される。焦点位置抽出部７５は、複数の焦点位置の中から、反射光強度が最大となる焦点位置を抽出する。そして、抽出された焦点位置の座標が、表面形状として、表面形状記憶部７７に記憶される。表面形状記憶部７７には、各ＸＹ座標に対して、反射光が最大となる焦点位置のＺ座標が対応付けて記憶される。図４に示すように、試料２４の表面に凹凸がある場合、測定位置ごとにＺ座標が異なることになる。
【００７０】
なお、試料２４が屈折率の異なる材料から構成される場合、それらの界面で反射光強度が高くなることがある。すなわち、屈折率の異なる材料同士の界面で反射光強度にピークが現れることになる。この場合、Ｚ方向における反射光強度分布に、複数のピークが現れることになる。このような場合、試料表面を示すＺ座標は、隣の測定位置におけるＺ座標に応じて決めることができる。すなわち、隣の測定位置との間で、試料の表面形状が滑らかになる焦点位置のＺ座標を抽出する。そして、抽出した焦点位置をつなぎ合わせて、試料２４の表面形状を形成する。
【００７１】
このように表面形状の測定が終了したら、図５に示すように試料２４の表面に沿ってラマンスペクトル測定を行う。すなわち、ＸＹ方向に測定位置を移動するときに、記憶されている表面形状にしたがってステージをＺ方向に駆動させる。隣の測定位置でラマンスペクトルを測定しようとするときに、試料２４と対物レンズ２３との距離が変わることになる。このように、表面形状記憶部７７に記憶されている表面形状を参照して、ラマンスペクトルの測定点を３次元的に移動させていく。具体的には、試料２４の表面に焦点位置があうように、ステージ６０を調整する。そして、焦点位置を調整した状態で、スペクトルを測定する。これにより、ラマンスペクトルの測定回数を減らすことができるため、測定時間を短縮することができる。
【００７２】
なお、試料表面に沿ってラマンスペクトルを測定する場合、図６に示すように、Ｘ方向、及びＹ方向にレーザ光を走査するとともに、ステージ６０をＺ方向に駆動する。すなわち、低速スキャナ１６、Ｘ走査装置２０、及びステージ６０を制御することで、３次元走査が可能になる。これにより、各測定位置において、対物レンズ２３と試料２４との距離を調整することができる。あるいは、図７に示すように、ステージ６０の駆動のみで３次元走査することも可能である。すなわち、ステージ６０をＸＹＺ方向に駆動して、これにより、測定点が試料表面に沿って移動する。試料表面に沿って、ラマンスペクトルを測定することができる。よって、測定時間を短縮することができる。なお、対物レンズ２３と試料２４との距離を、ステージ６０ではなくて、対物レンズ２３を移動させることによって、調整してもよい。
【００７３】
本実施の形態では、入射光を３次元的に走査して、試料２４の表面形状に沿ってラマンスペクトルを測定している。このため、スペクトルの測定時間を短縮化することができる。すなわち、試料２４の広い領域におけるラマンスペクトルの測定を短時間で行うことができる。試料２４の観察領域を広くした場合でも、各測定位置における測定回数を低減することができる。よって、長い測定時間が必要とならない。ラマンスペクトルの波長分解能を向上した場合や、より広い範囲のスペクトルを測定した場合でも、測定時間が長時間とならず、実用的な観察を行なうことができる。例えば、任意の波長（振動数）のラマン散乱光に着目した２次元像の観察や試料２４の特定の点におけるラマンスペクトルの測定を高い分解能で行なうことができる。
【００７４】
さらに、本実施の形態では、ラマン散乱光を集光するコンフォーカル光学系として構成している。これにより、Ｚ方向の分解能を向上することができる。試料表面のスペクトルを測定することで、様々なスペクトル解析を行なうことができる。そして、解析結果を処理装置のディスプレイに表示させることにより、より高度な分析が可能になる。
【００７５】
さらに、反射光や蛍光を検出するための光学系をスリットコンフォーカル光学系としている。よって、ステージ６０をＺ方向に移動させることで、任意の高さにおける反射像や蛍光像を取得することができる。これにより、断層画像を高速かつ高分解能で取得することができる。よって、３次元観察を容易に行うことができる。
【００７６】
なお、上記の説明では、アレイ光検出器３６、及びラインＣＣＤカメラ５０をＣＣＤカメラとして説明したが、これらはＣＣＤカメラに限られるものではない。すなわち、受光画素がマトリクス状に配列されている２次元光検出器を分光測定用に用いることができる。また、受光画素が１列に配列された１次元光検出器を反射光検出用に用いることができる。
【００７７】
さらに、ラマン散乱光とレーザ光を分岐するビームスプリッタは、エッジフィルタ１９に限られるものではない。例えば、波長に応じて光を分岐するダイクロイックミラーをビームスプリッタとして用いてもよい。また、Ｘ走査装置２０はビームを偏向させるものに限られるものではなく、ステージ６０を駆動するものでもよい。なお、Ｙ走査装置４０の代わりにシリンドリカルレンズなどを用いてスリットコンフォーカル光学系を構成してもよい。すなわち、光をライン状にする光変換手段をＹ走査装置４０の代わりに用いる。そして、ライン状の光のスポットを試料２４上に形成すれば、スリットコンフォーカル光学系を構成することができる。さらに、光分岐手段として、ハーフミラー２５とエッジフィルタ１９を排他的に用いることが好ましい。
【００７８】
本実施形態にかかるスペクトル測定方法では、対物レンズ２３を介してレーザ光を試料２４に照射するステップと、対物レンズ２３を介して、前記試料で反射した反射光を検出するステップと、レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、レーザ光の焦点位置を変化させたときの反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、抽出された焦点位置になるように調整するステップと、焦点位置を調整した状態で、レーザ光の照射により前記試料から出射される出射光を前記レーザ光から分岐するステップと、レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器で測定するステップと、を備えている。さらに、試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出するステップと、複数の測定位置における焦点位置をそれぞれ抽出し、試料の表面形状を測定するステップと、試料の表面に沿って焦点位置が移動するようにレーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するステップをさらに有していてもよい。
【００７９】
発明の実施の形態２．
本実施の形態にかかる光学顕微鏡１００について、図８を用いて説明する。図８は、本実施形態にかかる光学顕微鏡の光学系を示す図である。本実施の形態では、高速スキャナ１３とレーザラインフィルタ１２との間に、ビームスプリッタ５６が設けられている。そして、ビームスプリッタ５６で分岐された光はＡＦ（オートフォーカス）機構５３に入射する。これ以外の構成については、実施の形態１と同様であるため、重複する部分については説明を省略する。このような構成によって、実施の形態１と同様の効果を得ることができる。
【００８０】
本実施の形態では、ＡＦ機構５３によって試料表面にトラッキングしながらラマンスペクトル測定を行う。すなわち、ラマンスペクトル測定中にＡＦ機構５３を用いて自動焦点合わせ（ＡＦ）を行う。ＡＦ機構５３は、４分割フォトダイオードや、レンズ、シリンドリカルレンズ等を有している。そして、４分割フォトダイオードに対する反射光の入射位置に応じて、オートフォーカス（ＡＦ）を行う。具体的には、シリンドリカルレンズなどで反射光を非対称のスポット形状にする。そして、４分割フォトダイオードにおける反射光強度の分布によって、焦点位置を合わせる。ＡＦ機構５３の出力に応じて、ステージ６０をＺ方向に駆動する。
【００８１】
具体的には、ラマンモードにする場合、実施の形態１と同様に、エッジフィルタ１９、及び切換えミラー２７を光路上に配置する。図８に示すように、レーザラインフィルタ１２と高速スキャナ１３の間にビームスプリッタ５６が配置されている。ビームスプリッタ５６は、入射した一部の光を透過して、一部を反射する。すなわち、ビームスプリッタ５６は、所定の割合で、光を透過、又は反射する。従って、レーザラインフィルタ１２からのレーザ光は、ビームスプリッタ５６を介して、高速スキャナ１３に入射する。そして、実施の形態１におけるラマンモードと同様に、レーザ光は、エッジフィルタ１９で反射され、試料２４に入射する。試料２４で発生したラマン散乱光は、実施の形態１と同様にエッジフィルタ１９を透過して、入射スリット３０で検出される。これにより、ラマンスペクトルを測定する。
【００８２】
一方、試料２４で反射した反射光は、エッジフィルタ１９によって、反射される。そして、リレーレンズ１８、リレーレンズ１７、及び高速スキャナ１３を介してビームスプリッタ５６に入射する。ビームスプリッタ５６は、入射した反射光の一部をＡＦ機構５３の方向に反射する。そして、ビームスプリッタ５６で反射されて、ＡＦ機構５３に入射する。すなわち、ビームスプリッタ５６はレーザ光と、反射光とを分岐する光分岐手段として機能する。ＡＦ機構５３は、上記のように、４分割フォトダイオードを有しており、反射光を検出する。そして、ＡＦ機構５３での検出結果に基づいて、ステージ６０を駆動する。これにより、ＸＹ方向に測定位置を移動する際に、試料表面に沿って焦点位置が移動する。すなわち、試料２４の表面形状に追従して、焦点位置がＺ方向に動く。このように、ＡＦ機構５３を用いて、焦点位置が試料２４の表面に沿って追従するように、３次元的に走査する。
【００８３】
本実施の形態でも、処理装置７１がレーザ光の焦点位置を変化させたときの反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出する。そして、試料２４の表面に沿って、焦点位置を３次元的に移動させる。すなわち、測定位置をＸＹ方向に移動させる際、ＡＦ機構５３での検出結果に応じて、焦点位置の高さを調整する。焦点位置が試料２４の表面になるように、対物レンズ２３と試料２４との間隔を調整する。このように、試料表面に焦点合わせしながら、ラマンスペクトルを測定する。すなわち、試料表面に焦点位置が合うようにトラッキングしながら、ラマンスペクトルの測定を行う。これにより、ラマンスペクトルの測定回数を減らすことができる。よって、測定時間を短くすることができる。このように、本実施の形態にかかるスペクトル測定方法では、反射光の検出結果に基づいて、焦点位置が試料２４の表面に追従するように３次元的に走査して、スペクトルを測定している。よって、より短時間で、試料表面からのラマン散乱光のスペクトルを測定することができる。
【００８４】
発明の実施の形態３．
本実施の形態では、反射像の撮像と、ラマンスペクトルの測定を同時に行うことが可能な光学系を採用している。そのため、本実施の形態では、実施の形態１に比べて、ラインＣＣＤカメラ５０の配置が異なっている。さらに、エッジフィルタ１９とリレーレンズ１８の間にビームスプリッタ５５が設けられている。そして、ビームスプリッタ５５で分岐された反射光が結像レンズ５４を介してラインＣＣＤカメラ５０に入射する。なお、これら以外の構成については、実施の形態１と同様であるため、説明を省略する。
【００８５】
本実施の形態では、反射像の撮像と、ラマンスペクトル測定が同時に行われる。そのため、反射像の撮像時でも、エッジフィルタ１９と切換えミラー２７が光路上に配置される。さらに、光路上にはレーザ光と反射光とを分岐するビームスプリッタ５５が配置されている。ビームスプリッタ５５は、入射した光の一部を反射して、一部を透過する。すなわち、ビームスプリッタ５５は、所定の割合で、光を透過、又は反射する。従って、リレーレンズ１８からのレーザ光の一部はビームスプリッタ５５を通過して、エッジフィルタ１９に入射する。また、エッジフィルタ１９からの反射光の一部は、ビームスプリッタ５５で反射されて、結像レンズ５４に入射する。すなわち、ビームスプリッタ５５は、レーザ光と反射光とを分岐する光分岐手段として機能する。なお、Ｙ方向の走査は低速スキャナ１６によって行う。
【００８６】
結像レンズ５４は、入射した反射光を屈折する。これにより、ラインＣＣＤカメラ５０の受光面に反射光が結像する。実施の形態１と同様に、ラインＣＣＤカメラ５０は、コンフォーカル光学系を介して、反射光を検出する。これにより、共焦点反射像を撮像することができる。また、エッジフィルタ１９を通過した出射光を分光器３１で検出する。これにより、ラマンスペクトルを測定することができる。このようにすることで、ラマンスペクトル測定と、反射像の撮像とを同時に行うことができる光学顕微鏡を実現することができる。
【００８７】
さらに、反射像の撮像と、ラマンスペクトルの測定とを切り換える際に、光学系の構成を変更する必要がなくなる。すなわち、エッジフィルタ１９、及び切換えミラー２７を光路上から取り除かなくてもよくなる。これにより、光学系を固定することができる。光学系の切り換え時において発生する、微小な焦点位置のずれを防ぐことができる。よって、精度の高い観察、測定を行うことができる。
【００８８】
なお、図９では、エッジフィルタ１９でラマン散乱光を取り出した後、ビームスプリッタ５５で反射光と入射光とを分岐している。これにより、ラマン散乱光のロスを低減することができるため、測定時間を短くすることができる。もちろん、光を分岐する順番はこれに限られるものではない。たとえば、出射光を入射光からビームスプリッタ５６で分岐した後、出射光のうちの反射光とラマン散乱光とをエッジフィルタで分岐する配置としてもよい。この場合、ビームスプリッタ５６で取り出された出射光の光路中にエッジフィルタ１９を配置する。そして、エッジフィルタ１９で出射光を波長に応じて分岐する。なお、図９において、ハーフミラー２５を設けなくてもよい。これにより、光学系を簡素化することができる。もちろん、本実施の形態においても、反射像の撮像と、スペクトル測定を同時に行わなくてもよい。
【００８９】
このように、本実施の形態では、出射光を前記レーザ光から分岐するステップにおいて、波長に応じて光を分岐する第１の光分岐手段（エッジフィルタ１９）によって出射光をレーザ光から分岐して、第１の光分岐手段によってレーザ光の波長と異なる波長の出射光をレーザ光と分岐した後、第２の光分岐手段（ビームスプリッタ５５）によって前記試料で反射した反射光を分岐して、共焦点光学系を介して反射光を光検出器で検出して、試料の反射光による反射像を撮像している。
【００９０】
上記の実施の形態１〜３にかかる光学顕微鏡によれば、試料表面で発生するラマン散乱光のスペクトル測定を短時間に行うことができる。すなわち、試料２４の表面形状に沿ってスペクトル測定を行うため、必要な測定だけを行うことができる。さらに、試料の表面に焦点位置が合わせられている。コンフォーカル光学系を介してスペクトルを測定する構成であっても、画像のコントラストが低下することなく、精度の高い測定を行うことができる。入射スリット３０の幅を狭くすることができ、Ｚ方向の分解能を向上することができる。
【００９１】
なお、上記の実施形態１〜３では、ラインコンフォーカル光学系を用いて反射像を撮像したが、反射像の撮像に用いられる光学系はこれに限られるものではない。例えば、ピンホールを用いたコンフォーカル光学系を用いて、反射像の撮像を行ってもよい。すなわち、コンフォーカル光学系を介して反射像の撮像を行う構成であればよい。また、分光器３１の入射側に入射スリット３０を設けた構成について説明したが、入射側にピンホールを設けた構成としてもよい。これにより、空間分解能を向上することができる。また、各実施の形態を適宜組み合わせてもよい。たとえば、実施の形態３の光学顕微鏡に対してＡＦ機構５３などを追加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。
【図２】光学顕微鏡に用いられる分光器の構成を模式的に示す斜視図である。
【図３】光学顕微鏡に用いられる処理装置の構成を示すブロック図である。
【図４】試料の表面形状を模式的に示す図である。
【図５】試料の表面に沿って走査する様子を示す図である。
【図６】試料の表面に沿って走査する走査方法の一例を説明するための図である。
【図７】試料の表面に沿って走査する走査方法の他の例を説明するための図である。
【図８】実施の形態２にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。
【図９】実施の形態３にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。
【符号の説明】
【００９３】
１０ レーザ光源
１１ ビームエキスパンダ
１２ レーザラインフィルタ
１３ 高速スキャナ
１４ リレーレンズ
１５ リレーレンズ
１６ 低速スキャナ
１７ リレーレンズ
１８ リレーレンズ
１９ エッジフィルタ
２０ Ｘ走査装置
２１ リレーレンズ
２２ チューブレンズ
２３ 対物レンズ
２４ 試料
２５ ハーフミラー
２６ 結像レンズ
２７ 切換えミラー
３０ 入射スリット
３１ 分光器
３２ ミラー
３３ 凹面鏡
３４ グレーティング
３５ 凹面鏡
３６ アレイ光検出器
３７ 受光画素
４０ Ｙ走査装置
５０ ラインＣＣＤカメラ
５３ ＡＦ機構
５４ レンズ
５５ ビームスプリッタ
５６ ビームスプリッタ
６０ ステージ
７１ 処理装置
７２ ステージ制御部
７３ Ｘ走査制御部
７４ Ｙ走査制御部
７５ 焦点位置抽出部
７６ 反射光データ記憶部
７７ 表面形状記憶部
７８ スペクトルデータ記憶部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを介してレーザ光を試料に照射するステップと、
前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出するステップと、
前記レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、
前記レーザ光の焦点位置を変化させたときの前記反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、
前記抽出された焦点位置になるように調整するステップと、
前記焦点位置を調整した状態で、前記レーザ光の照射により前記試料から出射される出射光を前記レーザ光から分岐するステップと、
前記レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器で測定するステップと、を備えるスペクトル測定方法。
【請求項２】
前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出するステップと、
前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定するステップと、
前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するステップをさらに有する請求項１に記載のスペクトル測定方法。
【請求項３】
前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように３次元走査して、前記スペクトルを測定する請求項１に記載のスペクトル測定方法。
【請求項４】
前記出射光を前記レーザ光から分岐するステップでは、波長に応じて光を分岐する第１の光分岐手段によって前記レーザ光の波長と異なる波長の前記出射光を前記レーザ光から分岐して、
前記第１の光分岐手段によって出射光を前記レーザ光と分岐した後、第２の光分岐手段によって前記試料で反射した反射光を分岐して、
共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射像を撮像する請求項１乃至３のいずれか１項に記載のスペクトル測定方法。
【請求項５】
前記レーザ光を第１の方向に走査する第１の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、
前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査する第２の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、をさらに備え、
前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のスペクトル測定方法。
【請求項６】
前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、
前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことと特徴とする請求項５に記載のスペクトル測定方法。
【請求項７】
レーザ光源と、
前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、
前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光と前記レーザ光源から前記試料に入射する入射光とを分離する第１の光分岐手段と、
前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出する光検出器と、
前記レーザ光の焦点位置を光軸に沿って変化させる焦点位置変化手段と、
前記焦点位置を変化させたときの前記光検出器の検出結果から、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出する抽出手段と、
前記抽出手段によって抽出された焦点位置で、前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、を備える光学顕微鏡。
【請求項８】
前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出して、
前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定し、
前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定する請求項７に記載の光学顕微鏡。
【請求項９】
前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように走査するオートフォーカス機構をさらに備え、
前記オートフォーカス機構によって、前記試料の表面に追従させて前記スペクトル測定を行う請求項７に記載の光学顕微鏡。
【請求項１０】
前記第１の光分岐手段によって分岐した後、前記試料で反射した反射光と前記試料に入射するレーザ光とを分岐する第２の光分岐手段をさらに備え、
前記第１の光分岐手段が波長に応じて前記レーザ光と異なる波長の出射光を取り出し、
共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射光画像を撮像する請求項７乃至９のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
【請求項１１】
前記レーザ光を第１の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第１の走査手段と、
前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第２の走査手段と、をさらに備え、
前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
【請求項１２】
前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、
前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことを特徴とする請求項１１に記載の光学顕微鏡。
【請求項１３】
レーザ光源と、
前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、
波長に応じて光を分岐して、前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光からレーザ光の波長と異なる波長の出射光を取り出す第１の光分岐手段と、
前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、
前記試料で反射した反射光を前記レーザ光から分岐する第２の光分岐手段と、
共焦点光学系を介して、前記試料で反射した反射光を検出する光検出器と、を備える光学顕微鏡。
【請求項１】
対物レンズを介してレーザ光を試料に照射するステップと、
前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出するステップと、
前記レーザ光の焦点位置を光軸方向に変化させるステップと、
前記レーザ光の焦点位置を変化させたときの前記反射光の検出結果に基づいて、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出するステップと、
前記抽出された焦点位置になるように調整するステップと、
前記焦点位置を調整した状態で、前記レーザ光の照射により前記試料から出射される出射光を前記レーザ光から分岐するステップと、
前記レーザ光から分岐された出射光のスペクトルを分光器で測定するステップと、を備えるスペクトル測定方法。
【請求項２】
前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出するステップと、
前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定するステップと、
前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定するステップをさらに有する請求項１に記載のスペクトル測定方法。
【請求項３】
前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように３次元走査して、前記スペクトルを測定する請求項１に記載のスペクトル測定方法。
【請求項４】
前記出射光を前記レーザ光から分岐するステップでは、波長に応じて光を分岐する第１の光分岐手段によって前記レーザ光の波長と異なる波長の前記出射光を前記レーザ光から分岐して、
前記第１の光分岐手段によって出射光を前記レーザ光と分岐した後、第２の光分岐手段によって前記試料で反射した反射光を分岐して、
共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射像を撮像する請求項１乃至３のいずれか１項に記載のスペクトル測定方法。
【請求項５】
前記レーザ光を第１の方向に走査する第１の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、
前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査する第２の走査手段によって、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させるステップと、をさらに備え、
前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のスペクトル測定方法。
【請求項６】
前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、
前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことと特徴とする請求項５に記載のスペクトル測定方法。
【請求項７】
レーザ光源と、
前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、
前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光と前記レーザ光源から前記試料に入射する入射光とを分離する第１の光分岐手段と、
前記試料で反射した反射光を、前記対物レンズを介して検出する光検出器と、
前記レーザ光の焦点位置を光軸に沿って変化させる焦点位置変化手段と、
前記焦点位置を変化させたときの前記光検出器の検出結果から、スペクトル測定を行う焦点位置を抽出する抽出手段と、
前記抽出手段によって抽出された焦点位置で、前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、を備える光学顕微鏡。
【請求項８】
前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させて試料上の複数の測定位置からの反射光を順次検出して、
前記複数の測定位置における前記焦点位置をそれぞれ抽出し、前記試料の表面形状を測定し、
前記試料の表面に沿って前記焦点位置が移動するように前記レーザ光を３次元走査して、前記スペクトルを測定する請求項７に記載の光学顕微鏡。
【請求項９】
前記反射光の検出結果に基づいて、前記焦点位置が前記試料の表面に追従するように走査するオートフォーカス機構をさらに備え、
前記オートフォーカス機構によって、前記試料の表面に追従させて前記スペクトル測定を行う請求項７に記載の光学顕微鏡。
【請求項１０】
前記第１の光分岐手段によって分岐した後、前記試料で反射した反射光と前記試料に入射するレーザ光とを分岐する第２の光分岐手段をさらに備え、
前記第１の光分岐手段が波長に応じて前記レーザ光と異なる波長の出射光を取り出し、
共焦点光学系を介して前記反射光を光検出器で検出して、前記試料の反射光による反射光画像を撮像する請求項７乃至９のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
【請求項１１】
前記レーザ光を第１の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第１の走査手段と、
前記レーザ光を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査して、前記試料に対する前記レーザ光の入射位置を変化させる第２の走査手段と、をさらに備え、
前記試料からの出射光が前記第１の走査手段、及び前記第２の走査手段によってデスキャンされて分光器に入射することを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
【請求項１２】
前記第１の走査手段と前記第２の走査手段とが合わせて３つのスキャナーを備え、
前記３つのスキャナーのうち、２つでデスキャンされ、１つでデスキャンされないことを特徴とする請求項１１に記載の光学顕微鏡。
【請求項１３】
レーザ光源と、
前記レーザ光源からの光を集光する対物レンズと、
波長に応じて光を分岐して、前記対物レンズを介して試料に入射した光ビームのうち前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光からレーザ光の波長と異なる波長の出射光を取り出す第１の光分岐手段と、
前記第１の光分岐手段により分岐された出射光のスペクトルを測定する分光器と、
前記試料で反射した反射光を前記レーザ光から分岐する第２の光分岐手段と、
共焦点光学系を介して、前記試料で反射した反射光を検出する光検出器と、を備える光学顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−１２７７２６（Ｐ２０１０−１２７７２６Ａ）
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０１８２０（Ｐ２００８−３０１８２０）
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０３１３８１３４）ナノフォトン株式会社 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０３１３８１３４）ナノフォトン株式会社 (19)
【Ｆターム（参考）】
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