光導波型バイオケミカルセンサチップ、光導波型バイオセンサ及び物質測定用キット
【課題】測定対象物質の検出感度を向上させることが可能な光導波型バイオケミカルセンサチップを提供する。
【解決手段】本実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と、を備える。
【解決手段】本実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、光導波型バイオケミカルセンサチップ、光導波型バイオセンサ及び物質測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗原抗体反応を利用した免疫測定は、通常、測定対象とする検体中の測定対象物質（例えば、タンパク質等）に対応する一次抗体をウエル状の基材表面に固定化する。ウエル内に各々所定量の検体溶液、二次抗体液、発色試薬を順次滴下する。各溶液の滴下毎に、所定の洗浄液により洗浄を行う。このような免疫測定は、各溶液及び洗浄液を測定者が秤量しつつ加え、かつ排出するという複雑な手順で行われる。更に、100μLの規模の溶液を用いることから、各反応に数十分から数時間という時間を要するのが一般的である。
【０００３】
そこで、酵素反応により発色した際に沈殿する酵素反応産物を生成する発色試薬を用い、沈殿したその酵素反応産物に起因する光の物理量の変化を光導波路のエバネッセント波で測定することで、検体溶液の容量が不正確でも測定が可能な方法が提案されている。
【０００４】
これらの方法においては，発色反応を触媒する酵素で標識された抗体等を用い、通常、１つの抗体に標識される酵素（発色触媒酵素）は１つである。つまり、一対の抗原抗体反応により、発色触媒酵素１つ分の発色が生じる。従って、発色量（すなわち、測定対象物質を検出する感度）は抗体の数に規定され、より高感度化を図ることは難しい。
【０００５】
一方、微粒子を光導波型バイオケミカルセンサチップの光導波路上に分散させることで、微粒子が光を吸収及び散乱し、余剰の検体溶液や二次抗体を洗浄する手順を含まずに測定対象物質を定量することが可能な技術が提案されている。この技術においては、微粒子が光導波路表面に一層分最密配列された場合に、測定対象物質を検出する感度が最大になると考えられる。
【０００６】
いずれの方式においても、より高感度な検出が必要とされる検査項目を想定すると、測定対象物質の検出感度を向上させる技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第4231051号公報
【特許文献２】特開2009-133842号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、測定対象物質の検出感度を向上させることが可能な光導波型バイオケミカルセンサチップ、光導波型バイオセンサ及び物質測定用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と、を備える。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】第１の実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップの断面図
【図２】同実施形態に係る微粒子の形態を示す模式図
【図３】同実施形態に係る微粒子の別の形態を示す模式図
【図４】同実施形態に係る光導波路型バイオセンサの模式図
【図５】同実施形態に係る被測定検体中の測定対象物質を測定する工程を示す図
【図６】同実施形態に係る検出信号強度の経時変化の例を示す図
【図７】第２の実施形態に係る物質測定用キットの断面図
【図８】第３の実施形態に係る物質測定用キットの断面図
【図９】第４の実施形態に係る測定方法の手順を説明する図
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態を図面を参照しながら説明する。
【００１２】
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップの断面図である。
【００１３】
第１実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１が表面に固定化された光導波路３と、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２及び発色反応を触媒する酵素１４が固定化された微粒子１３と、を備える。
【００１４】
ここで測定対象物質は、例えば血液、血清、血漿、生体試料、食品等の中に含まれる蛋白質、ペプチド、遺伝子等が挙げられる。具体的には、インスリン、カゼイン、β−ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子、コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン、ジゴキシン、テオフィリン等の薬物、細菌、ウイルス等の感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥの他、そばの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２を含む可溶性タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
光導波路３は、例えば平面光導波路を用いることができる。この光導波路３は、例えばフェノール樹脂、エポキシ樹脂のような熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。詳細には、ここで用いる材料とは、所定の光の透過性を有する材料であって、特に、ポリスチレンを主たる構造とするエポキシ樹脂等であることが好ましい。光導波路３への被測定検体中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１の固定化は、例えば光導波路３の表面との疎水性相互作用や化学結合により固定化する。
【００１６】
第１物質１１は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体（一次抗体）を用いることができる。
【００１７】
微粒子１３は、光導波路３上に分散している。ここで「光導波路上に微粒子が分散する」とは、微粒子１３が光導波路３の上方（基板１に接する面と反対側の面）に直接的または間接的に分散されることを意味する。「微粒子が光導波路上方に間接的に分散する」形態は、例えば微粒子１３が光導波路３の表面にブロッキング層を介して分散される形態が挙げられる。ブロッキング層は、例えばポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン、カゼイン，糖類（例えばスクロース、トレハロース）のような水溶性物質を含む。ブロッキング層は、さらにプロテアーゼインヒビターを含んでも良い。あるいは、図１では微粒子１３が光導波路に近接して配置されている例を示しているが、別の例として、微粒子１３が光導波路３の上方に空間を空けて配置される形態が挙げられる。例えば、光導波路３に対向して支持板（図示せず）が配置され、その支持板の光導波路３と対向する面に、微粒子１３が分散していてもよい。
【００１８】
微粒子１３は、金属、金属酸化物、金属と金属酸化物の複合体のうちいずれかのコロイド、又は球状樹脂である。例えば、微粒子１３として、ポリスチレン製のラテックスビーズ（商品名）のような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子を用いることができる。微粒子１３は、アルブミンのようなタンパク質、アガロースのような多糖類、シリカ粒子、カーボン粒子のような非金属粒子も用いることができる。特に、ラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。ラテックスビーズの中で、後述する光導波路を伝播させる光が赤色レーザの場合、青色ラテックスビーズが好ましい。微粒子１３は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。
【００１９】
図２は、微粒子１３の形態を示す模式図である。微粒子１３の表面には、第２物質１２と酵素１４とが固定化される。第２物質１２は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体（二次抗体）を用いることができる。酵素１４は、発色反応を触媒する発色触媒酵素である。例えば、酵素１４としてペルオキシダーゼが用いられる。本実施形態では、１つの微粒子１３に対して、複数の酵素１４を固定化することができる。
【００２０】
図３は、微粒子１３の別の形態を示す模式図である。図３に示すように、微粒子１３の表面に、酵素１４によって酵素標識された第２物質を固定化してもよい。発色酵素によって酵素標識された第２物質とは、例えば、ペルオキシダーゼ標識二次抗体である。
【００２１】
次に、第１の実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップを図１を参照して具体的に説明する。
【００２２】
基板１の主面の両端部には、入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂが設けられている。基板１は例えば、無アルカリガラスである。グレーティング２ａ，２ｂは、基板よりも高い屈折率を有する材料で形成される。例えば、グレーティング２ａ，２ｂは、酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化錫（ＳｎＯ2）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等から形成される。例えば熱硬化性樹脂からなる平面光導波路３は、グレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆されている。低屈折率樹脂は、例えば、市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）等を用いることができる。低屈折率樹脂膜４には、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状のセンシングエリア５を形成している。枠状のセル壁６は、平面光導波路３を露出させるセンシングエリア５を囲むように低屈折率樹脂膜４上に形成されている。
【００２３】
被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１は、センシングエリア５から露出する平面光導波路３表面に、例えばシランカップリング剤による疎水化処理により固定化されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２は、微粒子１３に、例えば物理吸着、あるいはカルボキシル基やアミノ基等を介した化学結合により固定化されている。さらに、発色反応を触媒する酵素１４が、微粒子１３に固定化されている。第２物質１２および酵素１４が固定化された微粒子１３は、前記物質１１が固定化された平面光導波路３表面に分散されている。この微粒子１３の分散は、例えば微粒子１３および水溶性物質を含むスラリを平面光導波路３に塗布、凍結乾燥することにより形成される。あるいは、微粒子１３は液体に溶解させて光導波路３上に塗布あるいは滴下してもよいし、固体として光導波路３上に分散させてもよい。
【００２４】
図４は、第１の実施形態に係る光導波路型バイオセンサの模式図である。第１の実施形態に係る光導波路型バイオセンサは、前述した光導波路型バイオケミカルセンサチップの入射側グレーティング２ａから光導波路３に光を入射させるための光源（例えば赤色レーザダイオード）２１と、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する受光素子（例えばフォトダイオード）２２をさらに備える。光源２１から前述の光導波路型バイオケミカルセンサチップに光を照射し、入射側グレーティング２ａにより光が回折される。入射側グレーティング２ａから入射された光は、光導波路３内を伝播し、出射側グレーティング２ｂにより回折されて出射される。出射された光は受光素子２２により受光され、光の強度が測定される。入射した光と出射された光との強度を比較し、光の吸収率を測定することで、被測定物の濃度が測定される。
【００２５】
次に、前述した光導波路型バイオセンサを用いて測定対象物質を測定する測定方法を図５の（a）〜（c）を参照して説明する。
【００２６】
まず、図４に示す光導波路型バイオセンサを用意する。次いで、図５（a）に示すように、センシングエリア５内の微粒子１３の分散領域を含む光導波路３表面に、被測定検体溶液と、第２物質（二次抗体）１２および酵素１４が固定化された微粒子１３の分散液との混合液を導入する。導入の方法は、例えば滴下や流入が考えられる。導入した被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する測定対象物質（抗原）が存在すると、図５（a）に示すように抗原１５は光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２は抗原と抗原抗体反応を生じて結合する。つまり、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で抗原を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に対して固定化される。
【００２７】
さらに、図５（b）に示すように、余剰の検体液及び微粒子１３を洗浄除去した後、センシングエリア５内の微粒子１３の分散領域を含む光導波路３表面に、発色試薬を導入する。導入の方法は、例えば滴下や流入が考えられる。被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する測定対象物質（抗原）が存在する場合、発色試薬の導入により酵素１４が発色を触媒し、色素が発色する。ところで上述のように、１つの測定対象物質（抗原）は１つの第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３のいずれか１つの第２物質（二次抗体）１２は１つの測定対象物質（抗原）と抗原抗体反応を生じて結合する。本実施形態では、微粒子１３には複数の酵素が固定化されているため、１対の抗原抗体反応に対して、複数の酵素が発色反応を触媒し、複数の酵素分の発色反応が生じる。
【００２８】
この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その光導波路３を伝播させて表面（センシングエリア５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させる。すると、微粒子１３が光導波路３表面に対して固定化されているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度が減衰する。さらに、酵素と発色試薬により色素が発色しているので、エバネッセント光が色素により吸光される。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光すると、出射されるレーザ光強度は、固定化された微粒子１３及び発色色素の影響によって時間の経過に伴って低下する。
【００２９】
フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、および、発色する色素濃度に依存する。つまり、抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。
【００３０】
一方、導入した被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する抗原が存在しない場合、微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２は光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と結合することなく被測定検体溶液中に分散する。さらに、余剰の検体液及び微粒子１３を洗浄除去した後、センシングエリア５内の微粒子１３の分散領域を含む光導波路３表面に、発色試薬を導入しても、導入した被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する抗原が存在しない場合、抗原抗体反応が生じないため、酵素が存在せず発色反応が生じない。
【００３１】
この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その光導波路３を伝播させて表面（センシングエリア５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させても、センシングエリア５内の被測定検体溶液中の微粒子１３がエバネッセント光領域に殆ど存在しなくなる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に殆ど関与しないため、エバネッセント光の強度の減衰が殆ど起きない。さらに、発色の色素によって赤色レーザ光が吸光されないので、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が殆ど変化しない。その結果、受光したレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させると、被測定検体溶液中に測定対象物質（抗原）が存在しないことがわかる。
【００３２】
本実施形態では、検体溶液と、第２物質（二次抗体）１２および酵素１４が固定化された微粒子１３の分散液とを混合後、センシングエリア５の内部に導入した。この際、例えば微粒子分散液を導入後、検体溶液を導入して混合するといったように、微粒子分散液と検体溶液を別々にセンシングエリア５に導入してもよい。
【００３３】
図６に本実施形態に係る検出の信号強度比の経時変化の例を示す。図６において、信号強度比[%]が低下するほど、入射したレーザ光が吸収されて減衰し、測定対象物質を検出する感度が高いことを表す。図６における実線は本発明方式を、長二点鎖線は比較方式を示している。ここで、比較方式とは、酵素を標識していない微粒子を用いた抗原抗体反応のみの場合である。また、実験では、酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた。
【００３４】
本発明方式において、まずビーズ液と検体溶液とを混合、検出面に導入すると、抗原抗体反応によってビーズが光導波路表面に結合する量に応じて検出信号強度が低下し、およそ６００秒間で約３５％の信号低下率が得られた。その後、余剰のビーズ及び検体混合液を洗浄した後、発色試薬溶液を滴下すると、抗原抗体反応によりチップ表面に捕捉された微粒子に結合してある酵素による発色反応が始まる。この発色反応により、大きな信号低下が確認され、測定開始から１５００秒後で約７２％の信号低下率が得られた。
【００３５】
一方、酵素を標識していない微粒子を用いた抗原抗体反応のみの比較方式では、１５００秒後の信号低下率が４７%程度であることがわかる。
【００３６】
つまり、図６の結果例より、酵素を標識していない微粒子を用いた抗原抗体反応のみの比較方式（長二点鎖線）と比べて、本発明方式（実線）は酵素の発色増幅を併せることにより、実質２５%程度、測定感度が向上することが可能となった。
【００３７】
以上、第１の実施形態によれば、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、従来の微粒子のみによる測定方法、あるいは酵素の発色のみによる測定方法よりも対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、色素反応の前に第２物質（二次抗体）と複数の酵素が固定された微粒子を導入することにより、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させることができる。これにより、一対の抗原抗体反応によって生じる発色量が大きくなるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００３８】
（第２の実施形態）
第２の実施形態に係る物質測定用キットを以下に説明する。図７に本実施形態に係る物質測定用キットの断面図を示す。
【００３９】
図７に示すように、本実施形態の物質測定用キットは、第１の実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップとキャップ３１とを備える。よって、図７における基板１、グレーティング２a、２ｂ、光導波路３、低屈折率樹脂膜４、センシングエリア５は第１の実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップと同様である。
【００４０】
キャップ３１は、前記光導波路型バイオケミカルセンサチップにおける光導波路３の主面および側面を覆うように配置され、光導波路３表面との間でセンシングエリア５を形成するための凹部を有する。
【００４１】
微粒子１３も第１の実施形態における図２または図３と同様に、第２物質（二次抗体）１２と酵素１４とが固定化された構成とする。ただし、本実施形態では、微粒子１３は光導波路３の上方に空間を空けて配置される。すなわち、光導波路３に対向するキャップ３１の面に、微粒子１３が付着あるいは収容されている。微粒子１３は乾燥した固体の状態でキャップ３１の面に付着していてもよいし、微粒子１３を含む分散液を包装体（図示せず）が収容していてもよい。
【００４２】
微粒子１３を含む分散液は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤やＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。
【００４３】
包装体は、例えばポリエチレン膜またはポリエチレンとポリエチレンテレフタレートの
積層膜から作ることができる。また、包装体はマイクロチューブ、プラスチックボトル、
ガラス瓶を用いることができる。
【００４４】
キャップ３１は、光導波路３表面との間で例えば矩形状のセンシングエリア５を形成するための矩形凹部を有する。また、キャップ３１には、センシングエリア５と連通する導入孔３０が開口されている。この導入孔から、例えばポンプなどを用いて検体溶液や発色試薬などをセンシングエリア５に導入する。キャップ３１は、導入孔３０とは別に、各種溶液を排出する排出孔を有していてもよい。キャップ３１は、例えばアクリル樹脂のような樹脂から作られる。キャップ３１の材料として、所定の低屈折率を有する他の樹脂等を代用することも可能である。
【００４５】
次に、本実施形態に係る物質測定用キットを用いた測定方法を説明する。
【００４６】
まず、図７に示す物質測定用キットを用意する。次いで、センシングエリア５内に被測定検体溶液を導入孔３０を通して導入する。導入の方法は、例えば滴下や流入が考えられる。このとき、導入した被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）は、光導波路３
表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合する。
【００４７】
次いで、例えばポンプにより導入孔３０を介して被測定検体溶液を吸引及び押し出し導入することにより、キャップに付着した微粒子１３と被測定検体溶液とを混合する。あるいは、包装体に保持された微粒子３を含む分散液と被測定検体溶液とを混合する。これにより、センシングエリア５に微粒子１３が導入され、微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２が光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応した測定対象物質（抗原）と抗原抗体反応して結合される。すなわち、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で測定対象物質（抗原）を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に固定化される。
【００４８】
この後、例えばポンプにより導入孔３０を介して発色試薬をセンシングエリア５に導入する。微粒子１３に固定化された酵素１４により、発色反応が触媒され、色素が発色する。
【００４９】
発色試薬を導入する前に、微粒子３と被測定検体溶液との余剰な混合液を、ポンプなどで吸引して排出してもよい。あるいは、排出孔から外部に排出してもよい。
【００５０】
この状態で、第１の実施形態と同様に、光源２１からレーザ光を入射側グレーティング２ａを介して光導波路３に入射させる。レーザ光は光導波路３内を伝播し、出射側グレーティング２ｂから受光素子２２へと出射される。出射されたレーザ光の強度の低下率より、被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）の濃度を測定することができる。
【００５１】
以上、第２の実施形態に係る物質測定用キットによれば、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。すなわち、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００５２】
（第３の実施形態）
第３の実施形態に係る物質測定用キットを以下に説明する。図８に本実施形態に係る物質測定用キットの断面図を示す。
【００５３】
図８に示すように、本実施形態の物質測定用キットは、第１の実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップを、キャップ４４上に逆様に設置した形態である。
【００５４】
微粒子１３も第１の実施形態における図２または図３と同様に、第２物質（二次抗体）１２と酵素１４とが固定化された構成とする。ただし、本実施形態では、微粒子１３はセンシングエリア５に配置されているのではなく、キャップ４４に設けられた空隙４８に収容されている。微粒子１３は乾燥した固体の状態で空隙４８の内面に付着していてもよいし、微粒子１３を含む分散液が空隙４８に収容されていてもよい。
【００５５】
微粒子１３を含む分散液は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤やＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。
【００５６】
キャップ４４は、光導波路３表面との間で例えば矩形状のセンシングエリア５を形成するための空隙４３を有する。また、キャップ４４には、センシングエリア５と連通する導入孔４５が開口されている。この導入孔から、例えばポンプ４０などを用いて被測定検体溶液や発色試薬などをセンシングエリア５に導入する。キャップ４４は、各種溶液を排出する排出孔４１を有していてもよい。排出孔４１は逆止弁４２を備え、溶液の排出を制御する。
【００５７】
キャップ４４は、例えばアクリル樹脂のような樹脂から作られる。キャップ４４の材料として、所定の低屈折率を有する他の樹脂等を代用することも可能である。
【００５８】
また、キャップ４４は、被測定検体溶液を導入する空隙４６を有する。
【００５９】
次に、本実施形態に係る物質測定用キットを用いた測定方法を説明する。
【００６０】
まず、図８に示す物質測定用キットを用意する。次いで、被測定検体溶液を空隙４６を通して導入する。ポンプ４０を用いて空気を吸引することにより、被測定検体溶液を空隙４６から空隙４８に導入する。空隙４８において、被測定検体溶液と微粒子１３が混合される。このとき、ポンプ４０を用いて空気を吸引及び押し出しすることにより、混合を促進してもよい。
【００６１】
次いで、ポンプ４０から空気を押し出すことにより、被測定検体溶液と微粒子１３の混合液を空隙４３に導入する。導入した混合液中の測定対象物質（抗原）は、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合する。また、センシングエリア５に微粒子１３が導入されるので、微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２が光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応した測定対象物質（抗原）と抗原抗体反応して結合される。すなわち、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で測定対象物質（抗原）を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に固定化される。
【００６２】
この後、ポンプで空気を押し出すことにより、排出孔４１から、微粒子３と被測定検体溶液との余剰な混合液を外に排出する。これにより、抗体と反応しなかった余剰な測定対象物質（抗原）は洗い流される。
【００６３】
この後、同様にポンプを吸引及び押し出しすることで、空隙４６を介して発色試薬を空隙４３に導入し、センシングエリア５に発色試薬を提供する。あるいは、光導波路型バイオケミカルセンサチップをキャップ４４から取り外し、センシングエリア５に発色試薬を滴下してもよい。センシングエリア５に発色試薬が提供されることにより、微粒子１３に固定化された酵素１４により発色反応が触媒され、色素が発色する。
【００６４】
この状態で、第１の実施形態および第２の実施形態と同様に、光源２１からレーザ光を入射側グレーティング２ａを介して光導波路３に入射させる。レーザ光は光導波路３内を伝播し、出射側グレーティング２ｂから受光素子２２へと出射される。出射されたレーザ光の強度の低下率より、被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）の濃度を測定することができる。
【００６５】
以上、第３の実施形態に係る物質測定用キットによれば、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。すなわち、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００６６】
（第４の実施形態）
第４の実施形態に係る測定対象物質の測定方法を以下に説明する。図９に本実施形態に係る測定方法を説明する図を示す。
【００６７】
図９に示すように、本実施形態で用いる光導波路型バイオケミカルセンサチップは実施形態１と同様の構成である。微粒子１３も第１の実施形態における図２または図３と同様に、第２物質（二次抗体）１２と酵素１４とが固定化された構成とする。ただし、本実施形態では、微粒子１３はセンシングエリア５に配置されているのではなく、別の容器あるいは包装に収容されている。微粒子１３は乾燥した固体の状態でもよいし、微粒子１３を含む分散液でもよい。ここでは、別の容器あるいは包装に収容された微粒子１３を、微粒子試薬という。
【００６８】
まず、図９に示す光導波路型バイオケミカルセンサチップと微粒子試薬を用意する。次いで、被測定検体溶液を光導波路型バイオケミカルセンサチップのセンシングエリア５に滴下する。続いて、微粒子試薬を光導波路型バイオケミカルセンサチップのセンシングエリア５に滴下する。これにより、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で測定対象物質（抗原）を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に固定化される。
【００６９】
その後、第１の実施形態と同様に、余剰の検体液及び微粒子１３を洗浄除去した後、発色試薬をセンシングエリア５に滴下し、微粒子１３に固定化された酵素１４により発色反応が触媒され、色素が発色する。光源２１からレーザ光を入射させ、受光素子２２に出射されたレーザ光の強度の低下率より、被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）の濃度を測定する。
【００７０】
なお、被測定検体溶液と微粒子試薬をセンシングエリア５に滴下する順番は、上述の順番と逆であってもよい。すなわち、最初に微粒子試薬をセンシングエリア５に滴下し、次に被測定検体溶液をセンシングエリア５に滴下してもよい。
【００７１】
さらには、被測定検体溶液と微粒子試薬を別々にセンシングエリア５に滴下するのではなく、被測定検体溶液と微粒子試薬を混合した混合液を作成し、この混合液をセンシングエリア５に滴下してもよい。
【００７２】
以上、第４の実施形態に係る測定方法によれば、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。すなわち、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【符号の説明】
【００７４】
１・・・基板
２a、２b・・・グレーティング
３・・・光導波路
４・・・低屈折率樹脂膜
５・・・センシングエリア
６・・・セル壁
１０・・・酵素標識（二次）抗体
１１・・・第１物質（一次抗体）
１２・・・第２物質（二次抗体）
１３・・・微粒子
１４・・・酵素
２１・・・光源
２２・・・受光素子
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、光導波型バイオケミカルセンサチップ、光導波型バイオセンサ及び物質測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗原抗体反応を利用した免疫測定は、通常、測定対象とする検体中の測定対象物質（例えば、タンパク質等）に対応する一次抗体をウエル状の基材表面に固定化する。ウエル内に各々所定量の検体溶液、二次抗体液、発色試薬を順次滴下する。各溶液の滴下毎に、所定の洗浄液により洗浄を行う。このような免疫測定は、各溶液及び洗浄液を測定者が秤量しつつ加え、かつ排出するという複雑な手順で行われる。更に、100μLの規模の溶液を用いることから、各反応に数十分から数時間という時間を要するのが一般的である。
【０００３】
そこで、酵素反応により発色した際に沈殿する酵素反応産物を生成する発色試薬を用い、沈殿したその酵素反応産物に起因する光の物理量の変化を光導波路のエバネッセント波で測定することで、検体溶液の容量が不正確でも測定が可能な方法が提案されている。
【０００４】
これらの方法においては，発色反応を触媒する酵素で標識された抗体等を用い、通常、１つの抗体に標識される酵素（発色触媒酵素）は１つである。つまり、一対の抗原抗体反応により、発色触媒酵素１つ分の発色が生じる。従って、発色量（すなわち、測定対象物質を検出する感度）は抗体の数に規定され、より高感度化を図ることは難しい。
【０００５】
一方、微粒子を光導波型バイオケミカルセンサチップの光導波路上に分散させることで、微粒子が光を吸収及び散乱し、余剰の検体溶液や二次抗体を洗浄する手順を含まずに測定対象物質を定量することが可能な技術が提案されている。この技術においては、微粒子が光導波路表面に一層分最密配列された場合に、測定対象物質を検出する感度が最大になると考えられる。
【０００６】
いずれの方式においても、より高感度な検出が必要とされる検査項目を想定すると、測定対象物質の検出感度を向上させる技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第4231051号公報
【特許文献２】特開2009-133842号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、測定対象物質の検出感度を向上させることが可能な光導波型バイオケミカルセンサチップ、光導波型バイオセンサ及び物質測定用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と、を備える。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】第１の実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップの断面図
【図２】同実施形態に係る微粒子の形態を示す模式図
【図３】同実施形態に係る微粒子の別の形態を示す模式図
【図４】同実施形態に係る光導波路型バイオセンサの模式図
【図５】同実施形態に係る被測定検体中の測定対象物質を測定する工程を示す図
【図６】同実施形態に係る検出信号強度の経時変化の例を示す図
【図７】第２の実施形態に係る物質測定用キットの断面図
【図８】第３の実施形態に係る物質測定用キットの断面図
【図９】第４の実施形態に係る測定方法の手順を説明する図
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態を図面を参照しながら説明する。
【００１２】
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップの断面図である。
【００１３】
第１実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１が表面に固定化された光導波路３と、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２及び発色反応を触媒する酵素１４が固定化された微粒子１３と、を備える。
【００１４】
ここで測定対象物質は、例えば血液、血清、血漿、生体試料、食品等の中に含まれる蛋白質、ペプチド、遺伝子等が挙げられる。具体的には、インスリン、カゼイン、β−ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子、コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン、ジゴキシン、テオフィリン等の薬物、細菌、ウイルス等の感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥの他、そばの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２を含む可溶性タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
光導波路３は、例えば平面光導波路を用いることができる。この光導波路３は、例えばフェノール樹脂、エポキシ樹脂のような熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。詳細には、ここで用いる材料とは、所定の光の透過性を有する材料であって、特に、ポリスチレンを主たる構造とするエポキシ樹脂等であることが好ましい。光導波路３への被測定検体中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１の固定化は、例えば光導波路３の表面との疎水性相互作用や化学結合により固定化する。
【００１６】
第１物質１１は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体（一次抗体）を用いることができる。
【００１７】
微粒子１３は、光導波路３上に分散している。ここで「光導波路上に微粒子が分散する」とは、微粒子１３が光導波路３の上方（基板１に接する面と反対側の面）に直接的または間接的に分散されることを意味する。「微粒子が光導波路上方に間接的に分散する」形態は、例えば微粒子１３が光導波路３の表面にブロッキング層を介して分散される形態が挙げられる。ブロッキング層は、例えばポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン、カゼイン，糖類（例えばスクロース、トレハロース）のような水溶性物質を含む。ブロッキング層は、さらにプロテアーゼインヒビターを含んでも良い。あるいは、図１では微粒子１３が光導波路に近接して配置されている例を示しているが、別の例として、微粒子１３が光導波路３の上方に空間を空けて配置される形態が挙げられる。例えば、光導波路３に対向して支持板（図示せず）が配置され、その支持板の光導波路３と対向する面に、微粒子１３が分散していてもよい。
【００１８】
微粒子１３は、金属、金属酸化物、金属と金属酸化物の複合体のうちいずれかのコロイド、又は球状樹脂である。例えば、微粒子１３として、ポリスチレン製のラテックスビーズ（商品名）のような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子を用いることができる。微粒子１３は、アルブミンのようなタンパク質、アガロースのような多糖類、シリカ粒子、カーボン粒子のような非金属粒子も用いることができる。特に、ラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。ラテックスビーズの中で、後述する光導波路を伝播させる光が赤色レーザの場合、青色ラテックスビーズが好ましい。微粒子１３は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。
【００１９】
図２は、微粒子１３の形態を示す模式図である。微粒子１３の表面には、第２物質１２と酵素１４とが固定化される。第２物質１２は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体（二次抗体）を用いることができる。酵素１４は、発色反応を触媒する発色触媒酵素である。例えば、酵素１４としてペルオキシダーゼが用いられる。本実施形態では、１つの微粒子１３に対して、複数の酵素１４を固定化することができる。
【００２０】
図３は、微粒子１３の別の形態を示す模式図である。図３に示すように、微粒子１３の表面に、酵素１４によって酵素標識された第２物質を固定化してもよい。発色酵素によって酵素標識された第２物質とは、例えば、ペルオキシダーゼ標識二次抗体である。
【００２１】
次に、第１の実施形態に係る光導波路型バイオケミカルセンサチップを図１を参照して具体的に説明する。
【００２２】
基板１の主面の両端部には、入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂが設けられている。基板１は例えば、無アルカリガラスである。グレーティング２ａ，２ｂは、基板よりも高い屈折率を有する材料で形成される。例えば、グレーティング２ａ，２ｂは、酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化錫（ＳｎＯ2）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等から形成される。例えば熱硬化性樹脂からなる平面光導波路３は、グレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆されている。低屈折率樹脂は、例えば、市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）等を用いることができる。低屈折率樹脂膜４には、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状のセンシングエリア５を形成している。枠状のセル壁６は、平面光導波路３を露出させるセンシングエリア５を囲むように低屈折率樹脂膜４上に形成されている。
【００２３】
被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１は、センシングエリア５から露出する平面光導波路３表面に、例えばシランカップリング剤による疎水化処理により固定化されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２は、微粒子１３に、例えば物理吸着、あるいはカルボキシル基やアミノ基等を介した化学結合により固定化されている。さらに、発色反応を触媒する酵素１４が、微粒子１３に固定化されている。第２物質１２および酵素１４が固定化された微粒子１３は、前記物質１１が固定化された平面光導波路３表面に分散されている。この微粒子１３の分散は、例えば微粒子１３および水溶性物質を含むスラリを平面光導波路３に塗布、凍結乾燥することにより形成される。あるいは、微粒子１３は液体に溶解させて光導波路３上に塗布あるいは滴下してもよいし、固体として光導波路３上に分散させてもよい。
【００２４】
図４は、第１の実施形態に係る光導波路型バイオセンサの模式図である。第１の実施形態に係る光導波路型バイオセンサは、前述した光導波路型バイオケミカルセンサチップの入射側グレーティング２ａから光導波路３に光を入射させるための光源（例えば赤色レーザダイオード）２１と、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する受光素子（例えばフォトダイオード）２２をさらに備える。光源２１から前述の光導波路型バイオケミカルセンサチップに光を照射し、入射側グレーティング２ａにより光が回折される。入射側グレーティング２ａから入射された光は、光導波路３内を伝播し、出射側グレーティング２ｂにより回折されて出射される。出射された光は受光素子２２により受光され、光の強度が測定される。入射した光と出射された光との強度を比較し、光の吸収率を測定することで、被測定物の濃度が測定される。
【００２５】
次に、前述した光導波路型バイオセンサを用いて測定対象物質を測定する測定方法を図５の（a）〜（c）を参照して説明する。
【００２６】
まず、図４に示す光導波路型バイオセンサを用意する。次いで、図５（a）に示すように、センシングエリア５内の微粒子１３の分散領域を含む光導波路３表面に、被測定検体溶液と、第２物質（二次抗体）１２および酵素１４が固定化された微粒子１３の分散液との混合液を導入する。導入の方法は、例えば滴下や流入が考えられる。導入した被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する測定対象物質（抗原）が存在すると、図５（a）に示すように抗原１５は光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２は抗原と抗原抗体反応を生じて結合する。つまり、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で抗原を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に対して固定化される。
【００２７】
さらに、図５（b）に示すように、余剰の検体液及び微粒子１３を洗浄除去した後、センシングエリア５内の微粒子１３の分散領域を含む光導波路３表面に、発色試薬を導入する。導入の方法は、例えば滴下や流入が考えられる。被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する測定対象物質（抗原）が存在する場合、発色試薬の導入により酵素１４が発色を触媒し、色素が発色する。ところで上述のように、１つの測定対象物質（抗原）は１つの第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３のいずれか１つの第２物質（二次抗体）１２は１つの測定対象物質（抗原）と抗原抗体反応を生じて結合する。本実施形態では、微粒子１３には複数の酵素が固定化されているため、１対の抗原抗体反応に対して、複数の酵素が発色反応を触媒し、複数の酵素分の発色反応が生じる。
【００２８】
この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その光導波路３を伝播させて表面（センシングエリア５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させる。すると、微粒子１３が光導波路３表面に対して固定化されているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度が減衰する。さらに、酵素と発色試薬により色素が発色しているので、エバネッセント光が色素により吸光される。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光すると、出射されるレーザ光強度は、固定化された微粒子１３及び発色色素の影響によって時間の経過に伴って低下する。
【００２９】
フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、および、発色する色素濃度に依存する。つまり、抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。
【００３０】
一方、導入した被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する抗原が存在しない場合、微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２は光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と結合することなく被測定検体溶液中に分散する。さらに、余剰の検体液及び微粒子１３を洗浄除去した後、センシングエリア５内の微粒子１３の分散領域を含む光導波路３表面に、発色試薬を導入しても、導入した被測定検体溶液中に光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２と特異的に反応する抗原が存在しない場合、抗原抗体反応が生じないため、酵素が存在せず発色反応が生じない。
【００３１】
この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その光導波路３を伝播させて表面（センシングエリア５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させても、センシングエリア５内の被測定検体溶液中の微粒子１３がエバネッセント光領域に殆ど存在しなくなる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に殆ど関与しないため、エバネッセント光の強度の減衰が殆ど起きない。さらに、発色の色素によって赤色レーザ光が吸光されないので、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が殆ど変化しない。その結果、受光したレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させると、被測定検体溶液中に測定対象物質（抗原）が存在しないことがわかる。
【００３２】
本実施形態では、検体溶液と、第２物質（二次抗体）１２および酵素１４が固定化された微粒子１３の分散液とを混合後、センシングエリア５の内部に導入した。この際、例えば微粒子分散液を導入後、検体溶液を導入して混合するといったように、微粒子分散液と検体溶液を別々にセンシングエリア５に導入してもよい。
【００３３】
図６に本実施形態に係る検出の信号強度比の経時変化の例を示す。図６において、信号強度比[%]が低下するほど、入射したレーザ光が吸収されて減衰し、測定対象物質を検出する感度が高いことを表す。図６における実線は本発明方式を、長二点鎖線は比較方式を示している。ここで、比較方式とは、酵素を標識していない微粒子を用いた抗原抗体反応のみの場合である。また、実験では、酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた。
【００３４】
本発明方式において、まずビーズ液と検体溶液とを混合、検出面に導入すると、抗原抗体反応によってビーズが光導波路表面に結合する量に応じて検出信号強度が低下し、およそ６００秒間で約３５％の信号低下率が得られた。その後、余剰のビーズ及び検体混合液を洗浄した後、発色試薬溶液を滴下すると、抗原抗体反応によりチップ表面に捕捉された微粒子に結合してある酵素による発色反応が始まる。この発色反応により、大きな信号低下が確認され、測定開始から１５００秒後で約７２％の信号低下率が得られた。
【００３５】
一方、酵素を標識していない微粒子を用いた抗原抗体反応のみの比較方式では、１５００秒後の信号低下率が４７%程度であることがわかる。
【００３６】
つまり、図６の結果例より、酵素を標識していない微粒子を用いた抗原抗体反応のみの比較方式（長二点鎖線）と比べて、本発明方式（実線）は酵素の発色増幅を併せることにより、実質２５%程度、測定感度が向上することが可能となった。
【００３７】
以上、第１の実施形態によれば、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、従来の微粒子のみによる測定方法、あるいは酵素の発色のみによる測定方法よりも対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、色素反応の前に第２物質（二次抗体）と複数の酵素が固定された微粒子を導入することにより、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させることができる。これにより、一対の抗原抗体反応によって生じる発色量が大きくなるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００３８】
（第２の実施形態）
第２の実施形態に係る物質測定用キットを以下に説明する。図７に本実施形態に係る物質測定用キットの断面図を示す。
【００３９】
図７に示すように、本実施形態の物質測定用キットは、第１の実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップとキャップ３１とを備える。よって、図７における基板１、グレーティング２a、２ｂ、光導波路３、低屈折率樹脂膜４、センシングエリア５は第１の実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップと同様である。
【００４０】
キャップ３１は、前記光導波路型バイオケミカルセンサチップにおける光導波路３の主面および側面を覆うように配置され、光導波路３表面との間でセンシングエリア５を形成するための凹部を有する。
【００４１】
微粒子１３も第１の実施形態における図２または図３と同様に、第２物質（二次抗体）１２と酵素１４とが固定化された構成とする。ただし、本実施形態では、微粒子１３は光導波路３の上方に空間を空けて配置される。すなわち、光導波路３に対向するキャップ３１の面に、微粒子１３が付着あるいは収容されている。微粒子１３は乾燥した固体の状態でキャップ３１の面に付着していてもよいし、微粒子１３を含む分散液を包装体（図示せず）が収容していてもよい。
【００４２】
微粒子１３を含む分散液は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤やＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。
【００４３】
包装体は、例えばポリエチレン膜またはポリエチレンとポリエチレンテレフタレートの
積層膜から作ることができる。また、包装体はマイクロチューブ、プラスチックボトル、
ガラス瓶を用いることができる。
【００４４】
キャップ３１は、光導波路３表面との間で例えば矩形状のセンシングエリア５を形成するための矩形凹部を有する。また、キャップ３１には、センシングエリア５と連通する導入孔３０が開口されている。この導入孔から、例えばポンプなどを用いて検体溶液や発色試薬などをセンシングエリア５に導入する。キャップ３１は、導入孔３０とは別に、各種溶液を排出する排出孔を有していてもよい。キャップ３１は、例えばアクリル樹脂のような樹脂から作られる。キャップ３１の材料として、所定の低屈折率を有する他の樹脂等を代用することも可能である。
【００４５】
次に、本実施形態に係る物質測定用キットを用いた測定方法を説明する。
【００４６】
まず、図７に示す物質測定用キットを用意する。次いで、センシングエリア５内に被測定検体溶液を導入孔３０を通して導入する。導入の方法は、例えば滴下や流入が考えられる。このとき、導入した被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）は、光導波路３
表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合する。
【００４７】
次いで、例えばポンプにより導入孔３０を介して被測定検体溶液を吸引及び押し出し導入することにより、キャップに付着した微粒子１３と被測定検体溶液とを混合する。あるいは、包装体に保持された微粒子３を含む分散液と被測定検体溶液とを混合する。これにより、センシングエリア５に微粒子１３が導入され、微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２が光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応した測定対象物質（抗原）と抗原抗体反応して結合される。すなわち、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で測定対象物質（抗原）を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に固定化される。
【００４８】
この後、例えばポンプにより導入孔３０を介して発色試薬をセンシングエリア５に導入する。微粒子１３に固定化された酵素１４により、発色反応が触媒され、色素が発色する。
【００４９】
発色試薬を導入する前に、微粒子３と被測定検体溶液との余剰な混合液を、ポンプなどで吸引して排出してもよい。あるいは、排出孔から外部に排出してもよい。
【００５０】
この状態で、第１の実施形態と同様に、光源２１からレーザ光を入射側グレーティング２ａを介して光導波路３に入射させる。レーザ光は光導波路３内を伝播し、出射側グレーティング２ｂから受光素子２２へと出射される。出射されたレーザ光の強度の低下率より、被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）の濃度を測定することができる。
【００５１】
以上、第２の実施形態に係る物質測定用キットによれば、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。すなわち、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００５２】
（第３の実施形態）
第３の実施形態に係る物質測定用キットを以下に説明する。図８に本実施形態に係る物質測定用キットの断面図を示す。
【００５３】
図８に示すように、本実施形態の物質測定用キットは、第１の実施形態の光導波路型バイオケミカルセンサチップを、キャップ４４上に逆様に設置した形態である。
【００５４】
微粒子１３も第１の実施形態における図２または図３と同様に、第２物質（二次抗体）１２と酵素１４とが固定化された構成とする。ただし、本実施形態では、微粒子１３はセンシングエリア５に配置されているのではなく、キャップ４４に設けられた空隙４８に収容されている。微粒子１３は乾燥した固体の状態で空隙４８の内面に付着していてもよいし、微粒子１３を含む分散液が空隙４８に収容されていてもよい。
【００５５】
微粒子１３を含む分散液は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤やＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。
【００５６】
キャップ４４は、光導波路３表面との間で例えば矩形状のセンシングエリア５を形成するための空隙４３を有する。また、キャップ４４には、センシングエリア５と連通する導入孔４５が開口されている。この導入孔から、例えばポンプ４０などを用いて被測定検体溶液や発色試薬などをセンシングエリア５に導入する。キャップ４４は、各種溶液を排出する排出孔４１を有していてもよい。排出孔４１は逆止弁４２を備え、溶液の排出を制御する。
【００５７】
キャップ４４は、例えばアクリル樹脂のような樹脂から作られる。キャップ４４の材料として、所定の低屈折率を有する他の樹脂等を代用することも可能である。
【００５８】
また、キャップ４４は、被測定検体溶液を導入する空隙４６を有する。
【００５９】
次に、本実施形態に係る物質測定用キットを用いた測定方法を説明する。
【００６０】
まず、図８に示す物質測定用キットを用意する。次いで、被測定検体溶液を空隙４６を通して導入する。ポンプ４０を用いて空気を吸引することにより、被測定検体溶液を空隙４６から空隙４８に導入する。空隙４８において、被測定検体溶液と微粒子１３が混合される。このとき、ポンプ４０を用いて空気を吸引及び押し出しすることにより、混合を促進してもよい。
【００６１】
次いで、ポンプ４０から空気を押し出すことにより、被測定検体溶液と微粒子１３の混合液を空隙４３に導入する。導入した混合液中の測定対象物質（抗原）は、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応を生じて結合する。また、センシングエリア５に微粒子１３が導入されるので、微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２が光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と抗原抗体反応した測定対象物質（抗原）と抗原抗体反応して結合される。すなわち、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で測定対象物質（抗原）を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に固定化される。
【００６２】
この後、ポンプで空気を押し出すことにより、排出孔４１から、微粒子３と被測定検体溶液との余剰な混合液を外に排出する。これにより、抗体と反応しなかった余剰な測定対象物質（抗原）は洗い流される。
【００６３】
この後、同様にポンプを吸引及び押し出しすることで、空隙４６を介して発色試薬を空隙４３に導入し、センシングエリア５に発色試薬を提供する。あるいは、光導波路型バイオケミカルセンサチップをキャップ４４から取り外し、センシングエリア５に発色試薬を滴下してもよい。センシングエリア５に発色試薬が提供されることにより、微粒子１３に固定化された酵素１４により発色反応が触媒され、色素が発色する。
【００６４】
この状態で、第１の実施形態および第２の実施形態と同様に、光源２１からレーザ光を入射側グレーティング２ａを介して光導波路３に入射させる。レーザ光は光導波路３内を伝播し、出射側グレーティング２ｂから受光素子２２へと出射される。出射されたレーザ光の強度の低下率より、被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）の濃度を測定することができる。
【００６５】
以上、第３の実施形態に係る物質測定用キットによれば、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。すなわち、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００６６】
（第４の実施形態）
第４の実施形態に係る測定対象物質の測定方法を以下に説明する。図９に本実施形態に係る測定方法を説明する図を示す。
【００６７】
図９に示すように、本実施形態で用いる光導波路型バイオケミカルセンサチップは実施形態１と同様の構成である。微粒子１３も第１の実施形態における図２または図３と同様に、第２物質（二次抗体）１２と酵素１４とが固定化された構成とする。ただし、本実施形態では、微粒子１３はセンシングエリア５に配置されているのではなく、別の容器あるいは包装に収容されている。微粒子１３は乾燥した固体の状態でもよいし、微粒子１３を含む分散液でもよい。ここでは、別の容器あるいは包装に収容された微粒子１３を、微粒子試薬という。
【００６８】
まず、図９に示す光導波路型バイオケミカルセンサチップと微粒子試薬を用意する。次いで、被測定検体溶液を光導波路型バイオケミカルセンサチップのセンシングエリア５に滴下する。続いて、微粒子試薬を光導波路型バイオケミカルセンサチップのセンシングエリア５に滴下する。これにより、光導波路３表面の第１物質（一次抗体）１１と微粒子１３の第２物質（二次抗体）１２の間で測定対象物質（抗原）を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が光導波路３表面に固定化される。
【００６９】
その後、第１の実施形態と同様に、余剰の検体液及び微粒子１３を洗浄除去した後、発色試薬をセンシングエリア５に滴下し、微粒子１３に固定化された酵素１４により発色反応が触媒され、色素が発色する。光源２１からレーザ光を入射させ、受光素子２２に出射されたレーザ光の強度の低下率より、被測定検体溶液中の測定対象物質（抗原）の濃度を測定する。
【００７０】
なお、被測定検体溶液と微粒子試薬をセンシングエリア５に滴下する順番は、上述の順番と逆であってもよい。すなわち、最初に微粒子試薬をセンシングエリア５に滴下し、次に被測定検体溶液をセンシングエリア５に滴下してもよい。
【００７１】
さらには、被測定検体溶液と微粒子試薬を別々にセンシングエリア５に滴下するのではなく、被測定検体溶液と微粒子試薬を混合した混合液を作成し、この混合液をセンシングエリア５に滴下してもよい。
【００７２】
以上、第４の実施形態に係る測定方法によれば、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。すなわち、微粒子による光の吸収および散乱に加え、酵素に触媒された発色による吸光が生じるので、対象物質を検出する感度を向上させることができる。さらに、一対の抗原抗体反応に対して複数の発色触媒酵素を作用させるので、極低濃度の測定対象物質であっても発色しやすく、高感度で定量することが可能になる。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【符号の説明】
【００７４】
１・・・基板
２a、２b・・・グレーティング
３・・・光導波路
４・・・低屈折率樹脂膜
５・・・センシングエリア
６・・・セル壁
１０・・・酵素標識（二次）抗体
１１・・・第１物質（一次抗体）
１２・・・第２物質（二次抗体）
１３・・・微粒子
１４・・・酵素
２１・・・光源
２２・・・受光素子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、
前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と
を備えることを特徴とする光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項２】
１つの前記微粒子に対して複数個の前記酵素が固定化されている
ことを特徴とする請求項１に記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項３】
前記酵素は、前記第２物質に標識している
ことを特徴とする請求項１に記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項４】
前記微粒子は、前記光導波路上に分散している
ことを特徴とする請求項１乃至請求項３いずれか一項記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項５】
前記光導波路と対向して配置された支持板をさらに備え、
前記微粒子は、前記支持板の前記光導波路と対向する表面に分散している
ことを特徴とする請求項１乃至請求項３いずれか一項記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５いずれか一項記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップと、
前記光導波路に光を入射させる光源と、
前記光導波路から出射される光を受光する受光素子と
を備えることを特徴とする光導波路型バイオセンサ。
【請求項７】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、
前記光導波路の主面および側面を覆うように配置され、前記光導波路表面との間でセンシングエリアを形成するための凹部を有するキャップと、
前記キャップにおける前記凹部の内側に分散され、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と
を備えることを特徴とする物質測定用キット。
【請求項８】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、
前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と、
前記光導波路表面との間で矩形状のセンシングエリアを形成するための第１の空隙と、前記測定対象物質を含む検体溶液を導入するための第２の空隙と、前記微粒子を内部に収容する第３の空隙とを有するキャップと
を備えることを特徴とする物質測定用キット。
【請求項９】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路を有する光導波路型バイオケミカルセンサチップと、
前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子とを備え、
前記光導波路型バイオケミカルセンサチップ及び前記微粒子がそれぞれ個別に収容されて組み合わされた測定対象物質の物質測定用キット。
【請求項１】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、
前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と
を備えることを特徴とする光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項２】
１つの前記微粒子に対して複数個の前記酵素が固定化されている
ことを特徴とする請求項１に記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項３】
前記酵素は、前記第２物質に標識している
ことを特徴とする請求項１に記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項４】
前記微粒子は、前記光導波路上に分散している
ことを特徴とする請求項１乃至請求項３いずれか一項記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項５】
前記光導波路と対向して配置された支持板をさらに備え、
前記微粒子は、前記支持板の前記光導波路と対向する表面に分散している
ことを特徴とする請求項１乃至請求項３いずれか一項記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップ。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５いずれか一項記載の光導波路型バイオケミカルセンサチップと、
前記光導波路に光を入射させる光源と、
前記光導波路から出射される光を受光する受光素子と
を備えることを特徴とする光導波路型バイオセンサ。
【請求項７】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、
前記光導波路の主面および側面を覆うように配置され、前記光導波路表面との間でセンシングエリアを形成するための凹部を有するキャップと、
前記キャップにおける前記凹部の内側に分散され、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と
を備えることを特徴とする物質測定用キット。
【請求項８】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、
前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子と、
前記光導波路表面との間で矩形状のセンシングエリアを形成するための第１の空隙と、前記測定対象物質を含む検体溶液を導入するための第２の空隙と、前記微粒子を内部に収容する第３の空隙とを有するキャップと
を備えることを特徴とする物質測定用キット。
【請求項９】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路を有する光導波路型バイオケミカルセンサチップと、
前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質及び発色反応を触媒する酵素が固定化された微粒子とを備え、
前記光導波路型バイオケミカルセンサチップ及び前記微粒子がそれぞれ個別に収容されて組み合わされた測定対象物質の物質測定用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１７３２２０（Ｐ２０１２−１７３２２０Ａ）
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３７５９０（Ｐ２０１１−３７５９０）
【出願日】平成２３年２月２３日（２０１１．２．２３）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２３日（２０１１．２．２３）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
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