光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法
【課題】少量のＤＮＡ検体であっても正確にＤＮＡ検出が可能な光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法を提供すること。
【解決手段】本発明の一実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサは、光導波路３２と、金コロイド溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与されるセンシング領域３８とを備えている。導波光Ｓは、少なくともセンシング領域３８を横切るように光導波路３２を導波し、センシング領域３８には、プラスの電荷が導入されている。
【解決手段】本発明の一実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサは、光導波路３２と、金コロイド溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与されるセンシング領域３８とを備えている。導波光Ｓは、少なくともセンシング領域３８を横切るように光導波路３２を導波し、センシング領域３８には、プラスの電荷が導入されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法に関し、より詳細には、光を用いてＤＮＡセンシングを行う光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法
【背景技術】
【０００２】
高齢化に伴い医療費の増大が深刻になっており、医療費を抑えるために微量なＤＮＡを迅速、常温で検出できるセンサの開発が求められている。近年、金微粒子を利用して、ＤＮＡ検体を迅速、また常温で検出できる方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
また、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法が報告されている。図１は、従来の、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法を説明するための図である。
図１において、光３を透過する材料からなる容器１中に、金コロイド溶液２が入れられている。この金コロイド溶液２は、金コロイド溶液に一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を滴下して金微粒子にプローブＤＮＡを固定し、次いで、ターゲットとする一本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を金コロイド溶液に滴下して生成される。
【０００４】
このとき、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが相補的である場合、ハイブリダイゼーション反応が起こり、金微粒子の凝集が起こる。金微粒子が分散した金コロイドは赤色であるが、上記凝集が起こると吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色が赤色から紫色へと変化する。
【０００５】
従来では、この色の変化を利用してＤＮＡセンシングを行っている。すなわち、図１において、容器１において、光３の入射側と対向する側にフォトダイオード等の受光素子４を配置し、金コロイド溶液２に対して光３を照射し、その透過光５を受光素子４にて受光している。受光素子４にて受光した透過光５の吸収スペクトルを調べることにより、ＤＮＡセンシングを行っている。
【０００６】
【非特許文献１】三浦佳子、米澤徹、“金ナノ粒子の調整とそれを利用したバイオセンシング”Ｄｏｊｉｎ Ｎｅｗｓ Ｎｏ．１１３（２００５）、ｐ．１−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように従来では、金コロイド溶液に光を入射し、その透過光のスペクトルを解析することによってＤＮＡ検出を行っているが、金コロイド溶液では、マイナスの電荷を持つＣＯＯ−基が金微粒子を取り囲んでおり、金微粒子間に電気的な反発力が働き、金微粒子同士が凝集せずに分散している。従って、少量のＤＮＡ検体（プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡ）では正確な測定が行えず、光の通過する領域に金微粒子を多く存在させるために、多量の金コロイド溶液が必要であった。
【０００８】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、少量のＤＮＡ検体であっても正確にＤＮＡ検出が可能な光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、このような目的を達成するために、請求項１記載の発明は、光導波路と、前記光導波路に光を結合するための光結合手段と、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される、前記光導波路上の領域とを備え、前記結合した光は、少なくとも前記領域を横切るように前記光導波路を導波し、前記領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されていることを特徴とする。
【００１０】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記領域上に付与された前記材料をさらに備え、前記領域の表面では、該表面と前記材料とが静電的に吸着していることを特徴とする。
【００１１】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記材料には、前記プローブＤＮＡが固定されていることを特徴とする。
【００１２】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする。
【００１３】
請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【００１４】
請求項６記載の発明は、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される領域を有する光導波路であって、該領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されている光導波路を用意する工程と、前記領域に前記溶液、前記プローブＤＮＡ、および前記ターゲットＤＮＡを付与する工程と、前記光導波路に光を結合して、該結合した光を前記領域を横切るように導波させる工程と、前記領域を横切った光を受光する工程とを有することを特徴とする。
【００１５】
請求項７記載の発明は、請求項６記載の発明において、前記プローブＤＮＡと前記ターゲットＤＮＡとがミスマッチの場合は、前記材料は、前記領域の表面に静電的に吸着していることを特徴とする。
【００１６】
請求項８記載の発明は、請求項６または７記載の発明において、前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする。
【００１７】
請求項９記載の発明は、請求項６乃至８のいずれかに記載の発明において、前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＤＮＡを固定可能であり、一方の電荷で帯電した材料、プローブＤＮＡ、およびターゲットＤＮＡが付与される光導波路の所定の領域に対して、上記電荷の符号と反対の電荷を導入しているので、上記材料を光導波路に静電的に吸着することができる。よって、少量のＤＮＡ検体であっても正確にＤＮＡ検出が可能な光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
粒子径１５ｎｍ程度の金微粒子が分散した金コロイド溶液は、赤色である。この金コロイド溶液において、金微粒子が凝集すると、吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色は赤色から青に変化する。この金微粒子の凝集は、金微粒子に固定されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイゼーション反応することによって起こるものである。
【００２０】
本発明の一実施形態に係るＤＮＡセンシングは、上記色の変化、あるいは凝集を利用して、すなわち、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を利用して、吸収スペクトル、透過スペクトル、あるいは蛍光等の光の特性、または屈折率変化を測定することによって行っている。
【００２１】
さて、光を用いたＤＮＡセンシングに金コロイド溶液等のコロイド溶液を用いると、金微粒子が分散しているので上述のように、大量のＤＮＡ検体や金コロイド溶液が必要である。そこで、本発明の一実施形態では、センシング領域に金微粒子を、コロイド溶液中の金粒子密度よりも高密度に配置している。
【００２２】
このような配置を実現するために、本発明の一実施形態では、光導波路のセンシング領域上に、金微粒子を取り囲む官能基であるＣＯＯ−基と反対の電荷であるプラスの電荷を持つ官能基（例えば、ＮＨ２＋基）を配置する。すなわち、上記領域にプラス電荷を導入する。こうすることで、センシング領域上に金コロイド溶液を付与すると、溶液中の金微粒子は、該金微粒子を取り囲むＣＯＯ−基とセンシング領域上に導入されたプラス電荷（例えば、ＮＨ２＋基）との間のクーロン力によって静電的にセンシング領域に吸着する。この様子を図２（ａ）に示す。
【００２３】
図２（ａ）において、光導波路２１上に、金コロイド溶液２２が付与されており、さらに金微粒子２３がプラス電荷の導入が施された光導波路２１に静電的に吸着されている。この光導波路２１には、シランカップリング処理を行ってＮＨ２＋基（不図示）が配置されており、該ＮＨ２＋基と金微粒子２３の周囲にあるＣＯＯ−基との間に働くクーロン力により、金微粒子２３は光導波路２１に静電的に吸着している。
【００２４】
これに対して、上述のプラス電荷の導入が施されていないと、図２（ｂ）に示すように、光導波路２１上に金コロイド溶液２２を付与しても、通常通り、金微粒子２３は溶液中で分散している。
【００２５】
図２（ａ）および図２（ｂ）から分るように、光導波路の表面にプラス電荷を導入すると、光導波路の界面に金微粒子が吸着しているので、図２（ａ）の矢印方向Ｐに光を導波させると、導波路中を導波する光の進行方向における導波路の長さ（単に、「導波路の長さ」とも呼ぶ）分だけ、導波路を導波する光を金微粒子に作用させることができる。従って、ＤＮＡ検体や金コロイド溶液を少量にしても、上記導波路の長さ分だけ、測定光である導波路を導波する光と金微粒子とが作用する領域をかせぐことができる。
【００２６】
すなわち、図２（ｂ）や、図１に示す従来の方法のように、金微粒子が分散したコロイド溶液を用いる場合、検体の量が少量だと測定に用いる光が作用する金微粒子の数は、金微粒子が溶液中で分散しているのでわずかとなってしまい、より高精度な測定を行うために、検体や金コロイド溶液の量を大量にしなければならない。しかしながら、図２（ａ）のようにすることで、所定量の金コロイド溶液において、分散により３次元的に分布している金微粒子を、２次元的に配置することができ、この２次元的に配置された面と平行に光を導波させることによって、２次元的に配置された金微粒子の全てに対して、上記導波光を作用させることができる。よって、従来のように、コロイド溶液のままで測定する際の、分散によって測定光と作用しない金微粒子をも上記測定光と作用させることができるので、コロイド溶液中の金微粒子を効率よく利用することができ、検体等の微量化を実現できる。
【００２７】
なお、光導波路に付与された金コロイド溶液に含まれる金微粒子の全てを、光導波路に静電的に吸着させることが好ましいが、吸着されずに溶液に金微粒子が残っていても良い。本発明の一実施形態で重要なことの一つは、付与される金コロイド溶液に含まれる金微粒子を効率良く導波路を導波する光と作用させることであり、上記金コロイド溶液の少なくとも一部を光導波路に静電的に吸着させれば、付与される金コロイド溶液に含まれる金微粒子において、導波路を導波する光と作用する金微粒子を増加することができる。
【００２８】
本発明の一実施形態で重要なことは上述のように、測定光である導波路を導波する光と作用する金微粒子の数を増やすことであり、そのために、導波光によるエバネッセント波の染み出す領域に、より多くの金微粒子を存在させることが重要である。そのために、マイナス電荷によって分散している金微粒子を光導波路のセンシング領域上に静電的に吸着させている。
【００２９】
なお、本発明の一実施形態では、プローブＤＮＡを固定するために用いる材料として金微粒子を用いているが、これに限らず、例えば、酸化シリコン（ＳｉＯ２）等、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷を有する官能基に取り囲まれる等して、上記符号の電荷で帯電して溶液中で分散される材料であればいずれの材料であっても良い。このような材料としては、コロイド溶液の際の色と、凝集した時の色とが異なる材料であることが好ましい。
【００３０】
（第１の実施形態）
図３（ａ）は、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの側面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示した光導波路型ＤＮＡセンサの上面図である。
図３において、ガラス基板３１の一方の面には、カリウムイオン交換ガラス光導波路(硝酸カリウム溶融塩中４００℃、１ｈイオン交換)３２が、厚さ約２ミクロンで形成されている。光導波路３２は、シングルモード導波路である。ガラス基板３１の、光導波路３２が形成された面と対向する面には、光吸収層３３が形成されている。光導波路３２の所定の領域には、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３ ３４が形成されている。Ａｌｑ３ ３４を覆うようにしてＣｙｔｏｐ３５が形成されており、該Ｃｙｔｏｐ３５上にはカバーガラス３６が配置されている。
【００３１】
光導波路３２上の、図３（ｂ）の矢印方向Ｄに向かって、Ｃｙｔｏｐ３５やカバーガラス３６から所定の距離だけ離間して、プリズム３７が配置されている。このプリズム３７と光導波路３２との間には、インデックスマッチングオイル（不図示）が配置されており、光導波路３２を導波する光はプリズム３７へと入射される。光導波路３２上の、Ｃｙｔｏｐ３５やカバーガラス３６とプリズム３７との間の領域であって、導波光Ｓが導波する領域上に、金コロイド溶液を付与するための領域であるセンシング領域３８が形成されている。このセンシング領域３８は、テフロン（登録商標）シートなどから形成することができ、上記センシング領域３８上に、金コロイド溶液が付与され、また、ＤＮＡ検体も付与される。すなわち、導波光Ｓが横切るようにセンシング領域３８が形成されている。
【００３２】
また、Ａｌｑ３ ３４に光を入射するように、紫外線照射用のＬＥＤ３９が配置されている。このＬＥＤ３９からは、波長３６５ｎｍの紫外線が照射される。
【００３３】
プリズム３７からの出射光を受光するようにフィルタ４０および光センサ４１が配置されている。また、ガラス基板３１の、光吸収層３３が形成されていない領域から出射される光を受光するように、フィルタ４２および光センサ４３が形成されている。
【００３４】
ところで、本実施形態において、金微粒子の吸収スペクトルに対応するために、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３を用いている。Ａｌｑ３の発光波長領域は、５００〜６００ｎｍの幅広い波長領域である。よって、金微粒子の吸収スペクトルとＡｌｑ３の発光スペクトルとがほぼ重なっている、すなわち、Ａｌｑ３の発光波長領域が金微粒子の吸収ピークの波長に対応しているため、感度の高い検出が可能となる。
【００３５】
よって、本実施形態のように構成し、ＬＥＤ３９から紫外線（波長＝３６５ｎｍ）をＡｌｑ３ ３４に照射して、Ａｌｑ３ ３４にてフォトルミネッセンス光を生成する。この生成されたフォトルミネッセンス光のうち、所定の光が光導波路３２に結合し、導波光Ｓとなる。このようにして、シングルモード導波路である光導波路３２中を、スペクトル幅の広い導波光Ｓが導波することになる。この導波光Ｓは、プリズム３７から出射され、該プリズムから出射された出射光Ｕは、フィルタ４０を介して光センサ４１に入射する。また、上記生成されたフォトルミネッセンス光のうち光Ｔは、ガラス基板３１の、光吸収層３３が形成されていない領域から外に出射され、後述する、フィルタ４２を介して、光センサ４３に入射する。
【００３６】
次に、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの作製方法を説明する。
市販のスライドガラスを超音波洗浄により洗浄し、十分にリンスした後、４００℃の硝酸カリウム溶液塩中に４０分間浸す。このようにして、ガラス基板３１上に形成されたカリウムイオン交換光導波路３２を作製する。次いで、光導波路３２の所定の領域に真空蒸着法によりＡｌｑ３ ３４の薄膜を作製し、該作製されたＡｌｑ３ ３４を覆うようにＣｙｔｏｐ３５を形成し、カバーグラス３６を配置する。次いで、センシングエリア３８をテフロン（登録商標）シートにより形成し、光導波路３２の所定の領域にインデックスマッチングオイルを塗布して、該インデックスマッチングオイル上にプリズム３７を配置する。
【００３７】
さて、金コロイド溶液では、マイナスの電荷を持つＣＯＯ−基が金微粒子を取り囲むことによって微粒子間に電気的な反発力が働く。よって、金コロイド溶液は、粒子同士が凝集せずに分散している。そのため、基板表面にプラスの電荷を持ちえるＮＨ２＋基を導入すれば、静電的に基板上に金微粒子を吸着することができる。
【００３８】
よって、本実施形態では、光導波路のセンシング領域３８にシランカップリング処理を行うことで、光導波路基板にＮＨ２＋基を導入している。すなわち、図３に示した構成のセンサを用意し、金コロイド溶液中の金微粒子を取り囲む官能基の有する電荷と反対の電荷を、センシング領域３８に導入する処理を行う。
【００３９】
次いで、金コロイド溶液（濃度７４ｐｐｍ、粒子径１６．５ｎｍ）をセンシング領域３８に滴下する。センシング領域３８表面にはシランカップリング処理により、ＮＨ２＋基が導入されているので、上記滴下された金コロイド溶液中の金微粒子は、センシング領域３８の表面に電気的に吸着することによって固定化される。
【００４０】
次いで、Ａｕ−プローブＤＮＡ、および０．５ＭのＮａＣｌ溶液とターゲットＤＮＡとを金微粒子が静電的に吸着しているセンシング領域３８に滴下する。このようにして、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサが作製される。なお、本実施形態では、金微粒子とＤＮＡの結合には、Ａｕ−Ｓ結合を利用している。
【００４１】
上記滴下されたターゲットＤＮＡが、プローブＤＮＡとフルマッチのときは、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとはハイブリダイゼーション反応するはずである。つまり、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡとフルマッチなのか、ミスマッチなのかに応じて、金微粒子に固定されたＤＮＡの電荷の状態が異なり、光導波路への固定化に差が生じると考えられる。
【００４２】
よって、本実施形態では、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡとフルマッチなのか、ミスマッチなのかに応じて、ＤＮＡが固定された金微粒子の光導波路のセンシング領域への固定を制御するために、センシング領域にシランカップリング処理を行う等して、プラス電荷の導入を行っている。
【００４３】
次に、本実施形態に係るＤＮＡ検出方法について説明する。
まず、図３において、プラス電荷が導入されたセンシング領域３８に、金コロイド溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとをそれぞれ付与する。次いで、Ａｌｑ３ ３４に対して、ＬＥＤ３９から紫外線を照射して、フォトルミネッセンス光を発生させる。このフォトルミネッセンス光の発光スペクトルは、波長帯域５００ｎｍ〜６００ｎｍにピークがあり、金微粒子の吸収ピークとほぼ重なっている。発生したフォトルミネッセンス光の一部は導波光Ｓとして、光導波路３２に結合し、また、他の一部は、光Ｔとしてセンサから出射して、フィルタ４２を介して光センサ４３に入射する。
【００４４】
上記導波光Ｓは、全反射しながら光導波路３２を導波するので、エバネッセント波が発生する。このとき、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがミスマッチのときは、センシング領域の表面に１本鎖のＤＮＡが固定された（プローブＤＮＡが固定された）金微粒子が静電的に吸着している（固定されている）ので、上記エバネッセント波がその範囲内に存在する金微粒子に作用して、およそ波長５３０ｎｍの光が吸収される。よって、プリズム３７から出射し、フィルタ４０を介して光センサ４１にて受光された光を解析すると、吸収ピークであるおよそ波長５３０ｎｍの光強度が時間と共に弱まる。この様子を図４に示す。
【００４５】
図４において、スペクトル（ａ）は、固定化（吸着）が起こる前の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトル、すなわち、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、およびターゲットＤＮＡをセンシング領域３８に付与する前の透過スペクトルである。スペクトル（ｂ）は、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、およびターゲットＤＮＡをセンシング領域３８に付与（固定後（吸着後）とも呼ぶ）してから１０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｃ）は、固定後（吸着後）から２０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｄ）は、固定後（吸着後）から３０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルである。図４から分るように、時間の経過と共に、透過スペクトルの、およそ５３０ｎｍ付近の光強度が弱まっているので、該波長帯域の光が吸収されていることが分かる。すなわち、センシング領域３８の表面に金微粒子が固定されていることが分る。
【００４６】
一方、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがフルマッチのときは、金微粒子には２本鎖のＤＮＡが固定されることになり、金微粒子はセンシング領域３８に固定（吸着）されない。よって、固定後の経過時間に依らず、光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルはほとんど変化しない。この様子を図５に示す。
【００４７】
図５において、スペクトル（ａ）は、固定化（吸着）が起こる前の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルである。スペクトル（ｂ）は、固定後（吸着後）から１０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｃ）は、固定後（吸着後）から２０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｄ）は、固定後（吸着後）から３０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルである。図５から分るように、時間が経過しても、透過スペクトルの、およそ５３０ｎｍ付近の光強度にほとんど変化は見られないので、該波長帯域の光がほとんど吸収されていないことが分る。すなわち、センシング領域３８の表面に金微粒子が固定されてないことが分る。
【００４８】
本実施形態の構成において、フルマッチ時には金微粒子がプラス電荷を導入した光導波路表面に固定されず、ミスマッチ時に金微粒子が上記光導波路表面に固定されることを確認するため、以下のようにして吸収スペクトルを測定した。
【００４９】
上述した方法により、同一の作製条件で３枚の光導波路基板を用意した。そのうちの第１の光導波路基板を２つに切断し、切断された一方の光導波路基板には、フルマッチになるように金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、ターゲットＤＮＡを付与し、他方の光導波路基板には、ミスマッチになるように金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、ターゲットＤＮＡを付与し、フルマッチの光導波路基板およびミスマッチの光導波路基板のそれぞれについて、該付与後（固定後）１０分後に上記付与が行われた領域を通過させた光の吸収スペクトルを測定した。この吸収スペクトルを、図６および７に示す。
【００５０】
これと同様にして、第２の光導波路基板についても２つに切断し、一方をフルマッチの基板、他方をミスマッチの基板として、固定後２０分後の吸収スペクトルを測定した。第３の光導波路基板についても上述と同様にして２つに切断し、一方をフルマッチの基板、他方をミスマッチの基板として、固定後３０分後の吸収スペクトルを測定した。これらの吸収スペクトルも図６および７に示す。
【００５１】
図６から分るように、フルマッチの場合は、固定後からの経過時間に依らず、およそ５３０ｎｍにある金微粒子の吸収ピークは見られなかった。よって、金微粒子による光の吸収はほとんど起こっていないことが分る。従って、光導波路基板を導波する光によるエバネッセント波の範囲内にはほとんど金微粒子が存在していない、すなわち、金微粒子はほとんど固定されていないことが分る。
【００５２】
また、図７から分るように、ミスマッチの場合は、いずれの経過時間においても、金微粒子の吸収ピークと一致する、およそ５３０ｎｍに吸収ピークが見られた。よって、金微粒子による光の吸収が起こっていることが分かる。従って、光導波路基板を導波する光によるエバネッセント波の範囲内に金微粒子が多数存在している、すなわち、金微粒子は光導波路基板表面に固定されていることが分かる。
【００５３】
さて、検出方法の説明に戻ると、導波光Ｓは、光導波路３２を通過してセンシング領域３８において金微粒子が固定（静電的に吸着）されている場合は該金微粒子に作用して、プリズム３７から出射されて出射光Ｕとなる。該出射光Ｕは、フィルタ４０を介して光センサ４１に入射する。
【００５４】
光センサ４３にて受光した光から得られる透過スペクトルはリファレンスとして機能するので、光センサ４１にて受光した光から得られる透過スペクトルとの比を取ることによって、計算された透過スペクトルを取得する。この透過スペクトルを見て、およそ５３０ｎｍのピークが時間の経過と共に減少する場合は、ミスマッチと判断し、減少せずにほとんど変化しない場合はフルマッチと判断する。このようにして、ＤＮＡの検出を行う。
【００５５】
なお、本実施形態では、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射するためにＡｌｑ３ ３４やＬＥＤ３９を用いているが、これに限定されず、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射できればいずれの手段を用いても良い。例えば、光導波路３２の所定の領域にプリズム３７と対向するように第２のプリズムを配置し、該プリズムを介して光を光導波路３２に入射するようにしても良い。また、所定の波長帯域の光が導波している光ファイバや光導波路の一方端を、光導波路３２のプリズム３７と対向する側の端面にバットジョイント法などにより接続して、上記光を光導波路３２に入射するようにしても良い。
【００５６】
また、本実施形態では、ミスマッチ時の、光導波路に吸着した金微粒子に固定されたＤＮＡによるにエバネッセント波の吸収の影響を、測定する光に反映して、透過スペクトルや吸収スペクトルを変化できれば良い。よって、本実施形態では、金微粒子の吸収波長帯域と一致するような波長帯域を有する光を生成するためにＡｌｑ３を用いているが、上記一致が起こらなくても、上述のエバネッセント波の吸収の影響を測定光に反映できれば良い。導波光Ｓの波長帯域が金微粒子の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていれば、上述のエバネッセント波の吸収の影響を測定光に反映できるので、本実施形態では、このような波長帯域の光を光導波路に導波できれば良い。
【００５７】
（第２の実施形態）
第１の実施形態では、出射光Ｕから得られる透過スペクトルを測定してＤＮＡセンシングを行っているが、本実施形態では、出射光Ｕから屈折率変化を測定してＤＮＡセンシングを行う。この場合は、光センサ４１を屈折率測定用のセンサとする。また、屈折率は温度によって変動するので、図３に示した光導波路型ＤＮＡセンサをホットプレート等の温調の上に配置し、センシング領域３８の温度を一定に保つことが好ましい。
【００５８】
（第３の実施形態）
第１および第２の実施形態では、金コロイド溶液を用いているので、光導波路の表面にプラスの電荷を導入している。しかしながら、本発明では、光導波路の表面にプラスの電荷を導入することが本質ではない。本発明では、金コロイド溶液などの、ＤＮＡを固定するための材料が分散された溶液において、上記材料を光導波路の表面に静電的に吸着させることが本質である。よって、上記材料に帯電した電荷の符号と反対の符号の電荷を光導波路に導入することが重要である。例えば、上記材料が一方の符号の電荷を有する官能基によって取り囲まれている場合は、他方の符号の電荷を光導波路に導入するのである。よって、上記材料がプラスの電荷を有する官能基によって囲まれている場合は、光導波路の表面にマイナスの電荷を導入すれば良い。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】従来の、金コロイド溶液を用いたＤＡＮ検出法を説明するための図である。
【図２】（ａ）は、本発明の一実施形態に係る金微粒子が静電的に光導波路に吸着する様子を示す図であり、（ｂ）は、金微粒子が静電的に光導波路に吸着せずに、コロイド溶液中を分散している様子を示す図である。
【図３】（ａ）は、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの側面図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した光導波路型ＤＮＡセンサの上面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがミスマッチした際の、透過スペクトルの経時変化を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがフルマッチした際の、透過スペクトルの経時変化を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る、フルマッチ時の、吸収スペクトルの経時変化を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る、ミスマッチ時の、吸収スペクトルの経時変化を示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
２１ 光導波路
２２ 金コロイド溶液
２３ 金微粒子
３１ ガラス基板
３２ カリウムイオン交換ガラス光導波路
３３ 光吸収層
３４ Ａｌｑ３
３５ Ｃｙｔｏｐ
３６ カバーガラス
３７ プリズム
３８ センシング領域
３９ ＬＥＤ
４０，４２ フィルタ
４１、４３ 光センサ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法に関し、より詳細には、光を用いてＤＮＡセンシングを行う光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法
【背景技術】
【０００２】
高齢化に伴い医療費の増大が深刻になっており、医療費を抑えるために微量なＤＮＡを迅速、常温で検出できるセンサの開発が求められている。近年、金微粒子を利用して、ＤＮＡ検体を迅速、また常温で検出できる方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
また、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法が報告されている。図１は、従来の、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法を説明するための図である。
図１において、光３を透過する材料からなる容器１中に、金コロイド溶液２が入れられている。この金コロイド溶液２は、金コロイド溶液に一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を滴下して金微粒子にプローブＤＮＡを固定し、次いで、ターゲットとする一本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を金コロイド溶液に滴下して生成される。
【０００４】
このとき、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが相補的である場合、ハイブリダイゼーション反応が起こり、金微粒子の凝集が起こる。金微粒子が分散した金コロイドは赤色であるが、上記凝集が起こると吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色が赤色から紫色へと変化する。
【０００５】
従来では、この色の変化を利用してＤＮＡセンシングを行っている。すなわち、図１において、容器１において、光３の入射側と対向する側にフォトダイオード等の受光素子４を配置し、金コロイド溶液２に対して光３を照射し、その透過光５を受光素子４にて受光している。受光素子４にて受光した透過光５の吸収スペクトルを調べることにより、ＤＮＡセンシングを行っている。
【０００６】
【非特許文献１】三浦佳子、米澤徹、“金ナノ粒子の調整とそれを利用したバイオセンシング”Ｄｏｊｉｎ Ｎｅｗｓ Ｎｏ．１１３（２００５）、ｐ．１−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように従来では、金コロイド溶液に光を入射し、その透過光のスペクトルを解析することによってＤＮＡ検出を行っているが、金コロイド溶液では、マイナスの電荷を持つＣＯＯ−基が金微粒子を取り囲んでおり、金微粒子間に電気的な反発力が働き、金微粒子同士が凝集せずに分散している。従って、少量のＤＮＡ検体（プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡ）では正確な測定が行えず、光の通過する領域に金微粒子を多く存在させるために、多量の金コロイド溶液が必要であった。
【０００８】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、少量のＤＮＡ検体であっても正確にＤＮＡ検出が可能な光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、このような目的を達成するために、請求項１記載の発明は、光導波路と、前記光導波路に光を結合するための光結合手段と、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される、前記光導波路上の領域とを備え、前記結合した光は、少なくとも前記領域を横切るように前記光導波路を導波し、前記領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されていることを特徴とする。
【００１０】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記領域上に付与された前記材料をさらに備え、前記領域の表面では、該表面と前記材料とが静電的に吸着していることを特徴とする。
【００１１】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記材料には、前記プローブＤＮＡが固定されていることを特徴とする。
【００１２】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする。
【００１３】
請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【００１４】
請求項６記載の発明は、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される領域を有する光導波路であって、該領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されている光導波路を用意する工程と、前記領域に前記溶液、前記プローブＤＮＡ、および前記ターゲットＤＮＡを付与する工程と、前記光導波路に光を結合して、該結合した光を前記領域を横切るように導波させる工程と、前記領域を横切った光を受光する工程とを有することを特徴とする。
【００１５】
請求項７記載の発明は、請求項６記載の発明において、前記プローブＤＮＡと前記ターゲットＤＮＡとがミスマッチの場合は、前記材料は、前記領域の表面に静電的に吸着していることを特徴とする。
【００１６】
請求項８記載の発明は、請求項６または７記載の発明において、前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする。
【００１７】
請求項９記載の発明は、請求項６乃至８のいずれかに記載の発明において、前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＤＮＡを固定可能であり、一方の電荷で帯電した材料、プローブＤＮＡ、およびターゲットＤＮＡが付与される光導波路の所定の領域に対して、上記電荷の符号と反対の電荷を導入しているので、上記材料を光導波路に静電的に吸着することができる。よって、少量のＤＮＡ検体であっても正確にＤＮＡ検出が可能な光導波路型ＤＮＡセンサおよびＤＮＡ検出方法を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
粒子径１５ｎｍ程度の金微粒子が分散した金コロイド溶液は、赤色である。この金コロイド溶液において、金微粒子が凝集すると、吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色は赤色から青に変化する。この金微粒子の凝集は、金微粒子に固定されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイゼーション反応することによって起こるものである。
【００２０】
本発明の一実施形態に係るＤＮＡセンシングは、上記色の変化、あるいは凝集を利用して、すなわち、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を利用して、吸収スペクトル、透過スペクトル、あるいは蛍光等の光の特性、または屈折率変化を測定することによって行っている。
【００２１】
さて、光を用いたＤＮＡセンシングに金コロイド溶液等のコロイド溶液を用いると、金微粒子が分散しているので上述のように、大量のＤＮＡ検体や金コロイド溶液が必要である。そこで、本発明の一実施形態では、センシング領域に金微粒子を、コロイド溶液中の金粒子密度よりも高密度に配置している。
【００２２】
このような配置を実現するために、本発明の一実施形態では、光導波路のセンシング領域上に、金微粒子を取り囲む官能基であるＣＯＯ−基と反対の電荷であるプラスの電荷を持つ官能基（例えば、ＮＨ２＋基）を配置する。すなわち、上記領域にプラス電荷を導入する。こうすることで、センシング領域上に金コロイド溶液を付与すると、溶液中の金微粒子は、該金微粒子を取り囲むＣＯＯ−基とセンシング領域上に導入されたプラス電荷（例えば、ＮＨ２＋基）との間のクーロン力によって静電的にセンシング領域に吸着する。この様子を図２（ａ）に示す。
【００２３】
図２（ａ）において、光導波路２１上に、金コロイド溶液２２が付与されており、さらに金微粒子２３がプラス電荷の導入が施された光導波路２１に静電的に吸着されている。この光導波路２１には、シランカップリング処理を行ってＮＨ２＋基（不図示）が配置されており、該ＮＨ２＋基と金微粒子２３の周囲にあるＣＯＯ−基との間に働くクーロン力により、金微粒子２３は光導波路２１に静電的に吸着している。
【００２４】
これに対して、上述のプラス電荷の導入が施されていないと、図２（ｂ）に示すように、光導波路２１上に金コロイド溶液２２を付与しても、通常通り、金微粒子２３は溶液中で分散している。
【００２５】
図２（ａ）および図２（ｂ）から分るように、光導波路の表面にプラス電荷を導入すると、光導波路の界面に金微粒子が吸着しているので、図２（ａ）の矢印方向Ｐに光を導波させると、導波路中を導波する光の進行方向における導波路の長さ（単に、「導波路の長さ」とも呼ぶ）分だけ、導波路を導波する光を金微粒子に作用させることができる。従って、ＤＮＡ検体や金コロイド溶液を少量にしても、上記導波路の長さ分だけ、測定光である導波路を導波する光と金微粒子とが作用する領域をかせぐことができる。
【００２６】
すなわち、図２（ｂ）や、図１に示す従来の方法のように、金微粒子が分散したコロイド溶液を用いる場合、検体の量が少量だと測定に用いる光が作用する金微粒子の数は、金微粒子が溶液中で分散しているのでわずかとなってしまい、より高精度な測定を行うために、検体や金コロイド溶液の量を大量にしなければならない。しかしながら、図２（ａ）のようにすることで、所定量の金コロイド溶液において、分散により３次元的に分布している金微粒子を、２次元的に配置することができ、この２次元的に配置された面と平行に光を導波させることによって、２次元的に配置された金微粒子の全てに対して、上記導波光を作用させることができる。よって、従来のように、コロイド溶液のままで測定する際の、分散によって測定光と作用しない金微粒子をも上記測定光と作用させることができるので、コロイド溶液中の金微粒子を効率よく利用することができ、検体等の微量化を実現できる。
【００２７】
なお、光導波路に付与された金コロイド溶液に含まれる金微粒子の全てを、光導波路に静電的に吸着させることが好ましいが、吸着されずに溶液に金微粒子が残っていても良い。本発明の一実施形態で重要なことの一つは、付与される金コロイド溶液に含まれる金微粒子を効率良く導波路を導波する光と作用させることであり、上記金コロイド溶液の少なくとも一部を光導波路に静電的に吸着させれば、付与される金コロイド溶液に含まれる金微粒子において、導波路を導波する光と作用する金微粒子を増加することができる。
【００２８】
本発明の一実施形態で重要なことは上述のように、測定光である導波路を導波する光と作用する金微粒子の数を増やすことであり、そのために、導波光によるエバネッセント波の染み出す領域に、より多くの金微粒子を存在させることが重要である。そのために、マイナス電荷によって分散している金微粒子を光導波路のセンシング領域上に静電的に吸着させている。
【００２９】
なお、本発明の一実施形態では、プローブＤＮＡを固定するために用いる材料として金微粒子を用いているが、これに限らず、例えば、酸化シリコン（ＳｉＯ２）等、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷を有する官能基に取り囲まれる等して、上記符号の電荷で帯電して溶液中で分散される材料であればいずれの材料であっても良い。このような材料としては、コロイド溶液の際の色と、凝集した時の色とが異なる材料であることが好ましい。
【００３０】
（第１の実施形態）
図３（ａ）は、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの側面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示した光導波路型ＤＮＡセンサの上面図である。
図３において、ガラス基板３１の一方の面には、カリウムイオン交換ガラス光導波路(硝酸カリウム溶融塩中４００℃、１ｈイオン交換)３２が、厚さ約２ミクロンで形成されている。光導波路３２は、シングルモード導波路である。ガラス基板３１の、光導波路３２が形成された面と対向する面には、光吸収層３３が形成されている。光導波路３２の所定の領域には、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３ ３４が形成されている。Ａｌｑ３ ３４を覆うようにしてＣｙｔｏｐ３５が形成されており、該Ｃｙｔｏｐ３５上にはカバーガラス３６が配置されている。
【００３１】
光導波路３２上の、図３（ｂ）の矢印方向Ｄに向かって、Ｃｙｔｏｐ３５やカバーガラス３６から所定の距離だけ離間して、プリズム３７が配置されている。このプリズム３７と光導波路３２との間には、インデックスマッチングオイル（不図示）が配置されており、光導波路３２を導波する光はプリズム３７へと入射される。光導波路３２上の、Ｃｙｔｏｐ３５やカバーガラス３６とプリズム３７との間の領域であって、導波光Ｓが導波する領域上に、金コロイド溶液を付与するための領域であるセンシング領域３８が形成されている。このセンシング領域３８は、テフロン（登録商標）シートなどから形成することができ、上記センシング領域３８上に、金コロイド溶液が付与され、また、ＤＮＡ検体も付与される。すなわち、導波光Ｓが横切るようにセンシング領域３８が形成されている。
【００３２】
また、Ａｌｑ３ ３４に光を入射するように、紫外線照射用のＬＥＤ３９が配置されている。このＬＥＤ３９からは、波長３６５ｎｍの紫外線が照射される。
【００３３】
プリズム３７からの出射光を受光するようにフィルタ４０および光センサ４１が配置されている。また、ガラス基板３１の、光吸収層３３が形成されていない領域から出射される光を受光するように、フィルタ４２および光センサ４３が形成されている。
【００３４】
ところで、本実施形態において、金微粒子の吸収スペクトルに対応するために、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３を用いている。Ａｌｑ３の発光波長領域は、５００〜６００ｎｍの幅広い波長領域である。よって、金微粒子の吸収スペクトルとＡｌｑ３の発光スペクトルとがほぼ重なっている、すなわち、Ａｌｑ３の発光波長領域が金微粒子の吸収ピークの波長に対応しているため、感度の高い検出が可能となる。
【００３５】
よって、本実施形態のように構成し、ＬＥＤ３９から紫外線（波長＝３６５ｎｍ）をＡｌｑ３ ３４に照射して、Ａｌｑ３ ３４にてフォトルミネッセンス光を生成する。この生成されたフォトルミネッセンス光のうち、所定の光が光導波路３２に結合し、導波光Ｓとなる。このようにして、シングルモード導波路である光導波路３２中を、スペクトル幅の広い導波光Ｓが導波することになる。この導波光Ｓは、プリズム３７から出射され、該プリズムから出射された出射光Ｕは、フィルタ４０を介して光センサ４１に入射する。また、上記生成されたフォトルミネッセンス光のうち光Ｔは、ガラス基板３１の、光吸収層３３が形成されていない領域から外に出射され、後述する、フィルタ４２を介して、光センサ４３に入射する。
【００３６】
次に、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの作製方法を説明する。
市販のスライドガラスを超音波洗浄により洗浄し、十分にリンスした後、４００℃の硝酸カリウム溶液塩中に４０分間浸す。このようにして、ガラス基板３１上に形成されたカリウムイオン交換光導波路３２を作製する。次いで、光導波路３２の所定の領域に真空蒸着法によりＡｌｑ３ ３４の薄膜を作製し、該作製されたＡｌｑ３ ３４を覆うようにＣｙｔｏｐ３５を形成し、カバーグラス３６を配置する。次いで、センシングエリア３８をテフロン（登録商標）シートにより形成し、光導波路３２の所定の領域にインデックスマッチングオイルを塗布して、該インデックスマッチングオイル上にプリズム３７を配置する。
【００３７】
さて、金コロイド溶液では、マイナスの電荷を持つＣＯＯ−基が金微粒子を取り囲むことによって微粒子間に電気的な反発力が働く。よって、金コロイド溶液は、粒子同士が凝集せずに分散している。そのため、基板表面にプラスの電荷を持ちえるＮＨ２＋基を導入すれば、静電的に基板上に金微粒子を吸着することができる。
【００３８】
よって、本実施形態では、光導波路のセンシング領域３８にシランカップリング処理を行うことで、光導波路基板にＮＨ２＋基を導入している。すなわち、図３に示した構成のセンサを用意し、金コロイド溶液中の金微粒子を取り囲む官能基の有する電荷と反対の電荷を、センシング領域３８に導入する処理を行う。
【００３９】
次いで、金コロイド溶液（濃度７４ｐｐｍ、粒子径１６．５ｎｍ）をセンシング領域３８に滴下する。センシング領域３８表面にはシランカップリング処理により、ＮＨ２＋基が導入されているので、上記滴下された金コロイド溶液中の金微粒子は、センシング領域３８の表面に電気的に吸着することによって固定化される。
【００４０】
次いで、Ａｕ−プローブＤＮＡ、および０．５ＭのＮａＣｌ溶液とターゲットＤＮＡとを金微粒子が静電的に吸着しているセンシング領域３８に滴下する。このようにして、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサが作製される。なお、本実施形態では、金微粒子とＤＮＡの結合には、Ａｕ−Ｓ結合を利用している。
【００４１】
上記滴下されたターゲットＤＮＡが、プローブＤＮＡとフルマッチのときは、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとはハイブリダイゼーション反応するはずである。つまり、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡとフルマッチなのか、ミスマッチなのかに応じて、金微粒子に固定されたＤＮＡの電荷の状態が異なり、光導波路への固定化に差が生じると考えられる。
【００４２】
よって、本実施形態では、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡとフルマッチなのか、ミスマッチなのかに応じて、ＤＮＡが固定された金微粒子の光導波路のセンシング領域への固定を制御するために、センシング領域にシランカップリング処理を行う等して、プラス電荷の導入を行っている。
【００４３】
次に、本実施形態に係るＤＮＡ検出方法について説明する。
まず、図３において、プラス電荷が導入されたセンシング領域３８に、金コロイド溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとをそれぞれ付与する。次いで、Ａｌｑ３ ３４に対して、ＬＥＤ３９から紫外線を照射して、フォトルミネッセンス光を発生させる。このフォトルミネッセンス光の発光スペクトルは、波長帯域５００ｎｍ〜６００ｎｍにピークがあり、金微粒子の吸収ピークとほぼ重なっている。発生したフォトルミネッセンス光の一部は導波光Ｓとして、光導波路３２に結合し、また、他の一部は、光Ｔとしてセンサから出射して、フィルタ４２を介して光センサ４３に入射する。
【００４４】
上記導波光Ｓは、全反射しながら光導波路３２を導波するので、エバネッセント波が発生する。このとき、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがミスマッチのときは、センシング領域の表面に１本鎖のＤＮＡが固定された（プローブＤＮＡが固定された）金微粒子が静電的に吸着している（固定されている）ので、上記エバネッセント波がその範囲内に存在する金微粒子に作用して、およそ波長５３０ｎｍの光が吸収される。よって、プリズム３７から出射し、フィルタ４０を介して光センサ４１にて受光された光を解析すると、吸収ピークであるおよそ波長５３０ｎｍの光強度が時間と共に弱まる。この様子を図４に示す。
【００４５】
図４において、スペクトル（ａ）は、固定化（吸着）が起こる前の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトル、すなわち、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、およびターゲットＤＮＡをセンシング領域３８に付与する前の透過スペクトルである。スペクトル（ｂ）は、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、およびターゲットＤＮＡをセンシング領域３８に付与（固定後（吸着後）とも呼ぶ）してから１０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｃ）は、固定後（吸着後）から２０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｄ）は、固定後（吸着後）から３０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルである。図４から分るように、時間の経過と共に、透過スペクトルの、およそ５３０ｎｍ付近の光強度が弱まっているので、該波長帯域の光が吸収されていることが分かる。すなわち、センシング領域３８の表面に金微粒子が固定されていることが分る。
【００４６】
一方、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがフルマッチのときは、金微粒子には２本鎖のＤＮＡが固定されることになり、金微粒子はセンシング領域３８に固定（吸着）されない。よって、固定後の経過時間に依らず、光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルはほとんど変化しない。この様子を図５に示す。
【００４７】
図５において、スペクトル（ａ）は、固定化（吸着）が起こる前の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルである。スペクトル（ｂ）は、固定後（吸着後）から１０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｃ）は、固定後（吸着後）から２０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルであり、スペクトル（ｄ）は、固定後（吸着後）から３０分後の光センサ４１にて受光した光の透過スペクトルである。図５から分るように、時間が経過しても、透過スペクトルの、およそ５３０ｎｍ付近の光強度にほとんど変化は見られないので、該波長帯域の光がほとんど吸収されていないことが分る。すなわち、センシング領域３８の表面に金微粒子が固定されてないことが分る。
【００４８】
本実施形態の構成において、フルマッチ時には金微粒子がプラス電荷を導入した光導波路表面に固定されず、ミスマッチ時に金微粒子が上記光導波路表面に固定されることを確認するため、以下のようにして吸収スペクトルを測定した。
【００４９】
上述した方法により、同一の作製条件で３枚の光導波路基板を用意した。そのうちの第１の光導波路基板を２つに切断し、切断された一方の光導波路基板には、フルマッチになるように金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、ターゲットＤＮＡを付与し、他方の光導波路基板には、ミスマッチになるように金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、ターゲットＤＮＡを付与し、フルマッチの光導波路基板およびミスマッチの光導波路基板のそれぞれについて、該付与後（固定後）１０分後に上記付与が行われた領域を通過させた光の吸収スペクトルを測定した。この吸収スペクトルを、図６および７に示す。
【００５０】
これと同様にして、第２の光導波路基板についても２つに切断し、一方をフルマッチの基板、他方をミスマッチの基板として、固定後２０分後の吸収スペクトルを測定した。第３の光導波路基板についても上述と同様にして２つに切断し、一方をフルマッチの基板、他方をミスマッチの基板として、固定後３０分後の吸収スペクトルを測定した。これらの吸収スペクトルも図６および７に示す。
【００５１】
図６から分るように、フルマッチの場合は、固定後からの経過時間に依らず、およそ５３０ｎｍにある金微粒子の吸収ピークは見られなかった。よって、金微粒子による光の吸収はほとんど起こっていないことが分る。従って、光導波路基板を導波する光によるエバネッセント波の範囲内にはほとんど金微粒子が存在していない、すなわち、金微粒子はほとんど固定されていないことが分る。
【００５２】
また、図７から分るように、ミスマッチの場合は、いずれの経過時間においても、金微粒子の吸収ピークと一致する、およそ５３０ｎｍに吸収ピークが見られた。よって、金微粒子による光の吸収が起こっていることが分かる。従って、光導波路基板を導波する光によるエバネッセント波の範囲内に金微粒子が多数存在している、すなわち、金微粒子は光導波路基板表面に固定されていることが分かる。
【００５３】
さて、検出方法の説明に戻ると、導波光Ｓは、光導波路３２を通過してセンシング領域３８において金微粒子が固定（静電的に吸着）されている場合は該金微粒子に作用して、プリズム３７から出射されて出射光Ｕとなる。該出射光Ｕは、フィルタ４０を介して光センサ４１に入射する。
【００５４】
光センサ４３にて受光した光から得られる透過スペクトルはリファレンスとして機能するので、光センサ４１にて受光した光から得られる透過スペクトルとの比を取ることによって、計算された透過スペクトルを取得する。この透過スペクトルを見て、およそ５３０ｎｍのピークが時間の経過と共に減少する場合は、ミスマッチと判断し、減少せずにほとんど変化しない場合はフルマッチと判断する。このようにして、ＤＮＡの検出を行う。
【００５５】
なお、本実施形態では、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射するためにＡｌｑ３ ３４やＬＥＤ３９を用いているが、これに限定されず、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射できればいずれの手段を用いても良い。例えば、光導波路３２の所定の領域にプリズム３７と対向するように第２のプリズムを配置し、該プリズムを介して光を光導波路３２に入射するようにしても良い。また、所定の波長帯域の光が導波している光ファイバや光導波路の一方端を、光導波路３２のプリズム３７と対向する側の端面にバットジョイント法などにより接続して、上記光を光導波路３２に入射するようにしても良い。
【００５６】
また、本実施形態では、ミスマッチ時の、光導波路に吸着した金微粒子に固定されたＤＮＡによるにエバネッセント波の吸収の影響を、測定する光に反映して、透過スペクトルや吸収スペクトルを変化できれば良い。よって、本実施形態では、金微粒子の吸収波長帯域と一致するような波長帯域を有する光を生成するためにＡｌｑ３を用いているが、上記一致が起こらなくても、上述のエバネッセント波の吸収の影響を測定光に反映できれば良い。導波光Ｓの波長帯域が金微粒子の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていれば、上述のエバネッセント波の吸収の影響を測定光に反映できるので、本実施形態では、このような波長帯域の光を光導波路に導波できれば良い。
【００５７】
（第２の実施形態）
第１の実施形態では、出射光Ｕから得られる透過スペクトルを測定してＤＮＡセンシングを行っているが、本実施形態では、出射光Ｕから屈折率変化を測定してＤＮＡセンシングを行う。この場合は、光センサ４１を屈折率測定用のセンサとする。また、屈折率は温度によって変動するので、図３に示した光導波路型ＤＮＡセンサをホットプレート等の温調の上に配置し、センシング領域３８の温度を一定に保つことが好ましい。
【００５８】
（第３の実施形態）
第１および第２の実施形態では、金コロイド溶液を用いているので、光導波路の表面にプラスの電荷を導入している。しかしながら、本発明では、光導波路の表面にプラスの電荷を導入することが本質ではない。本発明では、金コロイド溶液などの、ＤＮＡを固定するための材料が分散された溶液において、上記材料を光導波路の表面に静電的に吸着させることが本質である。よって、上記材料に帯電した電荷の符号と反対の符号の電荷を光導波路に導入することが重要である。例えば、上記材料が一方の符号の電荷を有する官能基によって取り囲まれている場合は、他方の符号の電荷を光導波路に導入するのである。よって、上記材料がプラスの電荷を有する官能基によって囲まれている場合は、光導波路の表面にマイナスの電荷を導入すれば良い。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】従来の、金コロイド溶液を用いたＤＡＮ検出法を説明するための図である。
【図２】（ａ）は、本発明の一実施形態に係る金微粒子が静電的に光導波路に吸着する様子を示す図であり、（ｂ）は、金微粒子が静電的に光導波路に吸着せずに、コロイド溶液中を分散している様子を示す図である。
【図３】（ａ）は、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの側面図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した光導波路型ＤＮＡセンサの上面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがミスマッチした際の、透過スペクトルの経時変化を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがフルマッチした際の、透過スペクトルの経時変化を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る、フルマッチ時の、吸収スペクトルの経時変化を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る、ミスマッチ時の、吸収スペクトルの経時変化を示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
２１ 光導波路
２２ 金コロイド溶液
２３ 金微粒子
３１ ガラス基板
３２ カリウムイオン交換ガラス光導波路
３３ 光吸収層
３４ Ａｌｑ３
３５ Ｃｙｔｏｐ
３６ カバーガラス
３７ プリズム
３８ センシング領域
３９ ＬＥＤ
４０，４２ フィルタ
４１、４３ 光センサ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路と、
前記光導波路に光を結合するための光結合手段と、
ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される、前記光導波路上の領域とを備え、
前記結合した光は、少なくとも前記領域を横切るように前記光導波路を導波し、
前記領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されていることを特徴とする光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項２】
前記領域上に付与された前記材料をさらに備え、
前記領域の表面では、該表面と前記材料とが静電的に吸着していることを特徴とする請求項１記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項３】
前記材料には、前記プローブＤＮＡが固定されていることを特徴とする請求項２記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項４】
前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項５】
前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項６】
ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される領域を有する光導波路であって、該領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されている光導波路を用意する工程と、
前記領域に前記溶液、前記プローブＤＮＡ、および前記ターゲットＤＮＡを付与する工程と、
前記光導波路に光を結合して、該結合した光を前記領域を横切るように導波させる工程と、
前記領域を横切った光を受光する工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
前記プローブＤＮＡと前記ターゲットＤＮＡとがミスマッチの場合は、前記材料は、前記領域の表面に静電的に吸着していることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする請求項６または７記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項６乃至８のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１】
光導波路と、
前記光導波路に光を結合するための光結合手段と、
ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される、前記光導波路上の領域とを備え、
前記結合した光は、少なくとも前記領域を横切るように前記光導波路を導波し、
前記領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されていることを特徴とする光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項２】
前記領域上に付与された前記材料をさらに備え、
前記領域の表面では、該表面と前記材料とが静電的に吸着していることを特徴とする請求項１記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項３】
前記材料には、前記プローブＤＮＡが固定されていることを特徴とする請求項２記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項４】
前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項５】
前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の光導波路型ＤＮＡセンサ。
【請求項６】
ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷が帯電した材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与される領域を有する光導波路であって、該領域には、前記電荷と反対の符号の電荷が導入されている光導波路を用意する工程と、
前記領域に前記溶液、前記プローブＤＮＡ、および前記ターゲットＤＮＡを付与する工程と、
前記光導波路に光を結合して、該結合した光を前記領域を横切るように導波させる工程と、
前記領域を横切った光を受光する工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
前記プローブＤＮＡと前記ターゲットＤＮＡとがミスマッチの場合は、前記材料は、前記領域の表面に静電的に吸着していることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
前記結合した光の波長帯域は、前記材料の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっていることを特徴とする請求項６または７記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
前記材料は、金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項６乃至８のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−７０２１４（Ｐ２００８−７０２１４Ａ）
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４８６６５（Ｐ２００６−２４８６６５）
【出願日】平成１８年９月１３日（２００６．９．１３）
【出願人】（５０４１８２２５５）国立大学法人横浜国立大学 (429)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１３日（２００６．９．１３）
【出願人】（５０４１８２２５５）国立大学法人横浜国立大学 (429)
【Ｆターム（参考）】
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