光透過性磁性粒子を用いた免疫測定方法
【課題】 本発明の目的は、磁性担体粒子及び標識を用いて、測定すべき物質に特異的に結合する物質と測定すべき物質の特異的反応に基づく物質の測定方法において、標識からのシグナルを感度よく検出する方法および該方法に使用する試薬を提供すること
【解決手段】 （i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程、および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程を含み、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であることを特徴とする測定すべき物質の測定方法および試薬。
【解決手段】 （i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程、および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程を含み、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であることを特徴とする測定すべき物質の測定方法および試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定すべき物質に特異的に結合する物質を用いる物質の測定方法および測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を利用した免疫測定方法は、種々の疾病を示す診断マーカーや微量物質の検出に用いられ、その原理も広く知られている。このうち代表的な免疫測定方法としては、それぞれ放射性同位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などの標識物質を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）などが知られている。これらの方法は標識物質の特徴を生かして非常に高感度な測定方法として利用されてきたが、一方で担体粒子の反応面積を広げるために担体粒子に磁性粒子を利用し、その分散と集磁を特徴とした方法も開発されてきた。この方法では反応性や感度などの性能を大きく向上させた一方、該粒子を液体中に分散させた状態で試薬としての供給が可能であるため、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）プレートのように担体粒子と反応容器が一体となったものに比べ、その汎用性は非常に高いものとなった。特に磁性粒子と発光物質による標識の組み合わせは現在もなお高感度かつ実用的な方法として広く利用されている。
【０００３】
しかし、この方法には種々の問題がある。例えばこれまで免疫測定に用いられてきた磁性粒子は光の透過性がない酸化鉄を主成分としていたため、磁性粒子上に形成された免疫複合体中の蛍光物質または発光物質の標識を検出する場合、その光シグナルが弱められる遮蔽現象を常に伴う。このような遮蔽現象は微弱な光シグナルを遮蔽するばかりでなく、高濃度の磁性粒子の使用にあたってはその検量線の傾きを減少させ、精度を大幅に損なうものであった。従って磁性粒子の使用量は遮蔽現象の少ない範囲に限定して使用するのが一般的であった。
【０００４】
しかしかかる遮蔽効果を避けるため、その使用量を減らすことは有効な手段ではない。即ち、磁性粒子の使用量の減少は測定性能に大きな影響を与える。第一に固相の反応面積は担体粒子量に比例するため、該粒子量を減らすことは反応性や測定感度といった性能に影響を与える。第二に洗浄工程を含む測定系では、磁性粒子の集磁後、反応液を除去する工程で物理的衝撃による粒子の損失を伴うため、測定精度を悪化させる。この物理的衝撃による粒子の損失割合は磁性粒子量が少ないときに大きく、性能への影響は顕著となる。従って磁性粒子の遮蔽効果はこれら反応性と精度維持のための調整範囲を大きく制限する。
【０００５】
この問題の対応策として、特許文献１には、検出時に免疫複合体の特異的結合を解離させる方法が記載されている。この方法では、抗原抗体反応により磁性粒子上に形成された免疫複合体中の標識を検出するため、検出時に抗原抗体反応による特異的結合を解離させるべく解離液を加えて標識を解離させ、該解離した標識の強度を測定する。しかしこれらの方法では解離液の添加、再分離などの工程が必要となり煩雑であり、また標識の測定に乖離液が影響を及ぼすことがあり好ましくない。
【特許文献１】特開平８−４３３９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、磁性担体粒子及び標識を用いて、測定すべき物質に特異的に結合する物質と測定すべき物質の特異的反応に基づく物質の測定方法において、標識からのシグナルを感度よく検出する方法および該方法に使用する試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の［１］〜［１０］に関する。
（１） （i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程、および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程を含み、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であることを特徴とする測定すべき物質の測定方法。
【０００８】
（２） 標識を測定する工程が磁性担体粒子と複合体を形成した状態で行われる前記（１）記載の測定方法。
（３） 磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である前記（１）または（２）記載の方法。
【０００９】
（４） 標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質、および標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
【００１０】
（７） 磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質、および標識された測定すべき物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
（８） 磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である前記（６）または（７）記載の試薬。
【００１１】
（９） 標識が酵素、発光物質、蛍光物質または色原体である前記（６）〜（８）のいずれかに記載の試薬。
（１０） 測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である前記（６）〜（９）のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、測定精度の高い正確な免疫測定方法および試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用する磁性粒子は、標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能なもので有れば特に制限はない。例えば、特開平１０−２９７９３３号公報記載のモル％でＴｂ2 Ｏ3 が２５〜５０％、ＳｉＯ2 が５〜４０％、Ｂ2 Ｏ3 が５〜４５％、Ｇａ2 Ｏ3 が５〜３５％、さらにＰ2 Ｏ5 が０〜７％、ＧｅＯ2 が０〜２０％、またＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯおよびＢａＯがそれぞれ０〜６％で、ＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯおよびＢａＯの総和が０〜６％、Ｌａ2 Ｏ3 が０〜６％、Ｇｄ2 Ｏ3 が０〜６％、Ｙｂ2 Ｏ3 が０〜６％、Ｄｙ2 Ｏ3 が０〜１５％、Ｔｂ2 Ｏ3 、Ｌａ2 Ｏ3 、Ｇｄ2 Ｏ3 、Ｙｂ2 Ｏ3 およびＤｙ2 Ｏ3 の総和が２５〜６０％並びにＺｒＯ2 が０〜８％からなる組成のファラデー回転素子用ガラス、特開２００２−１４５６２２号公報記載の化学式：Ｔｉ1-x Ｃｏx Ｏ2 ；０＜ｘ≦０．３、で表され、Ｔｉ格子位置にＣｏが置換し、かつ、単結晶基板上にエピタキシャル成長した二酸化チタン・コバルト磁性膜、イットリウム・鉄・ガーネットから成る化合物（Proc. 12th Int. Symp. Plasma Chem., / Minneapolis, USA, 1995）、磁性ガラス（特開平０４−１７０３３８号公報）や光磁気記録材料（特開平０１−２６１２３５号公報）、窒化ガリウムなどがあげられる。
【００１４】
また、磁性担体粒子としては、上記透過性磁性微粒子をポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、またはそれぞれのモノマーの２〜４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームまたは、上記磁性微粒子をラテックス、ゼラチン、リポソームなどで内包した粒子などがあげられる。
【００１５】
磁性担体粒子としては、標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であればその透過率は特に制限はないが、例えば蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子が好ましく３５％である磁性粒子がより好ましく、５０％以上である磁性粒子が特に好ましい。
【００１６】
磁性粒子の粒径は、反応液中に懸濁できる粒径であれば特に制限はないが、例えば０．０５μｍ〜３００μｍが好ましく、０．１μｍ〜３０μｍがより好ましく、０．５〜１０μｍが特に好ましい。
本発明で使用される標識は、磁性粒子を透過するシグナルを用いて直接または補所試薬を用いて間接的に検出できるものであれば特に制限はなく、例えば酵素、発光物質、蛍光物質、色原体、酵素等があげられるが、補助試薬との反応によりその量を測定することができるものが好ましい。
【００１７】
シグナルとしては、標識を検出できれば特に制限はないが、例えば光学的なシグナルが好ましく、光、蛍光等があげられる。
発光物質としては、例えば4-(2- サクシニミジルオキシカルボニルエチル)フェニル-10-メチルアクリジウム-9- カルボン酸フルオロ硫酸（以下アクリジニウム−Ｉと略記する）等のアクリジウム誘導体、ジオキセタン類、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、クマリン誘導体、ピラゾロピリドピリダジン誘導体等があげられるがあげられる。
【００１８】
蛍光物質としては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸などがあげられる。
色原体としては、単独で色素を形成する化合物であっても、二つの化合物が結合して色素を形成する化合物であってもよい。
単独で色素を形成する化合物としては、例えば、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＣＣＡＰと略記する。）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＭＣＤＰと略記する。）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（以下、ＤＡ−６４と略記する。）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（以下、ＢＣＭＡと略記する。）等があげられる。
【００１９】
二つの化合物が結合して色素となるものとしては、例えば過酸化水素水とパーオキシダーゼとの共存下で、結合して色素を形成する化合物があげられる。
具体的には、４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡと略す。）や、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等のカプラ−と、アニリン化合物、例えばＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（以下ＥＭＳＥと略す。）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩２水和物（以下ＴＯＯＳと略記する。）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンプロピル−ｍ−アニジン等との組み合わせ等が挙げられる。その他、４−ＡＡとフェノールや３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨウド酢酸の組み合わせが挙げられる。
【００２０】
酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略記する。）などがあげられる。
補助試薬は、前述の標識を測定するために使用される試薬であり前述の標識の種類に応じて当業者であれば適宜選択できるが、例えば前述の発光物質、蛍光物質、色原体、酵素などがあげられる。また、アルカリ、過酸化水素等もあげられる。
【００２１】
発明において、測定すべき物質に特異的に結合する物質としては、例えば測定すべき物質に結合する抗体、核酸、糖蛋白質、アプタマー等があげられる。
抗体としては、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等およびこれら抗体を酵素処理等により処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２などのフラグメントが挙げられる。抗体としては、ＩｇＧが好ましい。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れも使用できる。モノクローナル抗体を用いる場合、認識するエピトープの異なるモノクローナル抗体を二種類以上組み合わせて使用するのが好ましいが、同一抗原上にエピトープを複数持つ抗原に対しては一種類のモノクローナル抗体を用いることもできる。
【００２２】
測定すべき物質としては、特定の物質と特異的に結合する物質であれば特に制限はなく、抗原抗体反応を用いて測定される成分、その他の特異的反応により測定される成分等があげられる。
抗原抗体反応により測定される成分としては例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、アポ蛋白ＡＩ、アポ蛋白ＡＩＩ、アポ蛋白Ｂ、アポ蛋白Ｅ、リウマチファクター、Ｄ−ダイマー、酸化ＬＤＬ、グリコアルブミン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、総サイロキシン（Ｔ４）、抗テンカン剤等の薬剤、Ｃ−反応性蛋白（以下ＣＲＰと略記する。）、サイトカイン類、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９（carbohydrate antigen 19-9）、ＣＡ１５−３（carbohydrate antigen 15-3）、ＣＡ−１２５（carbohydrate antigen 125）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Protein induced by vitamin K absence-II）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、Ｃ−ペプタイド、エストロゲン、抗抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（ＧＡＤ）抗体、ペプシノーゲン、ＨＢＶ抗原、抗B型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗体、C型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、抗ＨＣＶ抗体、成人T細胞性白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）抗原、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、結核抗体、結核菌抗原（ＴＢＧＬ）マイコプラズマ抗体、ヘモグロビンＡ１ｃ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチニンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、Ｈ−ＦＡＢＰ（ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白）、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、T-2トキシン（Ｔ２）等のカビ毒類、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール、フタル酸ジブチル、ポリ塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）類、ダイオキシン類、ｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン、トリブチルスズ等の内分泌撹乱物質類、大腸菌等の菌類、卵、乳、小麦、そば、落花生等の食物アレルギー物質やコナヒョウダニやトヤヒョウダニ等のダニ類等のアレルギー物質、抗アレルギー物質抗体等があげられる。
【００２３】
その他の特異的結合により測定される成分としては、核酸、レクチン等があげられ、例えばｒａｓ等のガン遺伝子、ｐ５３等のガン抑制遺伝子等をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマー、糖蛋白質等があげられる。
本発明において対象となる試料には前述の測定すべき物質を含有していると疑われる試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等の生体試料や、食品、土壌等があげられる。
【００２４】
磁性担体粒子または標識に、測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質を結合させる方法は、例えば、物理的吸着、化学的結合等により行うことができる。
物理的に結合させる方法としては、磁性担体粒子または標識に抗原または抗体などを疎水結合などで直接固定化する方法が挙げられる。またアルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させ、物理的に結合する方法があげられる。
【００２５】
化学的に結合させる方法としては、磁性担体粒子または標識に存在するアミノ基、カルボキシル基、チオール基などを化学的に修飾することにより、抗原または抗体分子上の同様の官能基と直接固定化する方法が挙げられる。スペーサー分子やアルブミンなどの他のタンパク質を介して抗原または抗体を化学結合させる方法もあげられる。
結合させる測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質の量は、用いる磁性担体粒子の表面積、官能基量等により異なるが、通常磁性担体粒子１ｍｇあたり１μｇ〜５００μｇ、好ましくは１０μｇ〜２００μｇである。また標識の場合、酵素もしくは発光物質を担持させる量は反応官能基の種類または標識によっても異なるが、測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質の１分子あたり１〜５０個、好ましくは５〜２０個となるように調製される。
【００２６】
磁性担体粒子に標識を固定化する場合は、磁性担体粒子表面の官能基を利用して化学的に結合させる方法、または表面に物理的に結合させる方法などがある。
また、本発明において磁性担体粒子または標識と測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質との結合は、ビオチン又はストレプトアビジン等の生理活性物質、糖鎖とレクチン、または化学的な相互作用を有する物質を介して行うこともできる。
【００２７】
さらに、固定化したい測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質と結合しうる物質、例えば抗体、プロテインＡ等を利用して、磁性担体粒子または標識と結合させる方法があげられる。
磁性担体粒子の分離に関しては、磁性担体粒子を約１〜３分程度で分離できるような磁場の強度及び容器の形状が好ましい。磁石には、永久磁石、電磁石等を使用することができる。分離は速やかに行われることが好ましく、このため反応容器の大きさは比較的小さい方が好ましい。反応容器の材質としては特に制限はないが、ポリスチレン、アクリルなどのプラスチックや、ガラスで作成したチューブ、キュベットなどがあげられる。
【００２８】
反応液としては、測定すべき物質と測定すべき物質に特異的に結合する物質とが反応できる溶媒で有れば特に制限はないが、標識を補助試薬を用いて測定する場合は、さらに標識と補助試薬とが反応できる溶媒が好ましく、例えば水性媒体があげられる。
水性媒体としては例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
【００２９】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸［（Ｈ）ＥＰＰＳ］、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等があげられる。
【００３０】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、例えば０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
本願発明の測定方法は、例えば以下の工程を含む。
（i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識に担持された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程。
【００３１】
磁性担体粒子は、前述の標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である。
磁性担体粒子と複合体を形成した標識の測定は、直接標識を光学的に測定してもよいが、補助試薬を用いて光学的シグナルを生成させ間接的に測定する方法が好ましい。標識の測定は、使用する磁性担体粒子を透過可能な光学的シグナルを用いて、光学的に行うのが好ましい。
【００３２】
予め既知濃度の測定対象物を用いて作成した測定対象物濃度と生成物量の関係を示す検量線と、該生成物量を比較することにより測定対象物濃度を求めることができる。
反応条件は、特異的結合が起こる条件であれば特に制限はないが、２℃〜５０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましく、２５℃〜３７℃が特に好ましい。反応時間は特に制限が無く、試薬の混合直後から一昼夜が好ましく、２〜６０分間がより好ましく、３〜３０分間が特に好ましい。また担体粒子は反応液に対して０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５〜０．２ｍｇ／ｍＬとなるように使用される。試薬添加時の混合は速やかに行う必要があるが、均一に混合された後は静置してもよい。反応液のpHは特に制限はなく、１〜１１が好ましく、２〜１０がより好ましく、３〜９が特に好ましく、前述の緩衝剤が用いうる。
【００３３】
反応液は非特異反応を避けるために、例えば塩化ナトリウム等の塩類及びウシ血清アルブミン等のタンパク質を含有してもよい。
磁性担体粒子と標識された抗体が添加されると、試料中の抗原が磁性担体粒子上の抗体及び標識された抗体と結合し、免疫複合体を形成する。次いで免疫複合体を含む磁性担体粒子を磁力により反応液中の容器側面に移動させ、反応液を除いた後、必要に応じて洗浄を数回繰り返すことができる。洗浄方法は特に制限はなく、例えば必要に応じて洗浄液を添加した後、吸引除去する方法があげられる。洗浄液としては、前述の反応液があげられ、必要に応じて、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を添加することができる。
【００３４】
ついで反応容器中に残った磁性担体粒子は適切な分散液、例えば前述の反応液に再分散させ、磁性担体粒子上の標識の量を標識に固有の方法で測定する。標識が蛍光物質のときは、蛍光色素に固有の励起光で照射し、同時に放出される蛍光強度を計測することができる。例えばフルオレッセン化合物を標識として用いた場合、４９０ｎｍで励起し５２０ｎｍの蛍光を測定することができる。
【００３５】
標識の強度を磁性担体粒子の分散した懸濁状態で光学的に行うことは、分散した磁性担体粒子による光学的な妨害を受けることになる。即ち、磁性担体粒子による遮蔽効果が高すぎると標識の光学的検出を極めて困難なものにするため、使用する磁性担体粒子濃度に制限が生じてしまう。本発明では、この点を改善するため従来の磁性担体粒子の代わりに光透過性磁性担体粒子を用いるものであり、これにより従来と全く変わらない測定手順でより正確な標識強度の計測を可能とさせるものである。
【００３６】
本発明の測定試薬は、例えば下記の試薬があげられる。
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質、標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有する測定すべき物質の測定用試薬。
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質および標識された測定すべき物質を含有する測定すべき物質の測定用試薬。
【００３７】
本発明の試薬は、下記のようなキットの形態でも良い
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質を含む試薬および標識に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含む試薬を含むキット。
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質を含む試薬および標識に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含むキット。
【００３８】
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含む試薬および標識に担持された測定すべき物質を含む試薬を含むキット。
これら試薬およびキットには、前記の緩衝剤、塩類、タンパク質等を含有していてもよい。
【００３９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
酸化鉄から成る磁性担体粒子と光透過性磁性担体粒子の遮蔽効果の比較
光透過性磁性担体粒子を調製するため、市販の厚さ１０．１ｍｍ、透過率が可視領域において８０％、比重６．０４および屈折率１．８３の粉末磁性ガラス（住田光学ガラス社製）を用い、メノー乳鉢で微粉化した。このとき分粒の目安として、水溶液中に分散させた状態で５分経っても沈降しない画分を採取し、免疫測定に利用可能な一定粒径以下の磁性担体粒子を得た。さらにこれら磁性担体粒子を磁石で集磁させ、３分経っても集磁できずに水溶液中に分散していた磁性担体粒子を除去することで、免疫測定用光透過性磁性担体粒子とした。これらの磁性担体粒子の粒径は顕微鏡による観察から平均粒径が１〜３μｍであることが確認された。
【００４１】
これら光透過性磁性担体粒子１ｇに２００μＬの０．０２Ｎ ＮａＯＨを加え、さらにシランカップリング剤であるＮ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン（信越シリコーン社製）２００μＬを添加し、１５０℃で２時間反応させた。得られたアミノ基含有光透過性磁性担体粒子は１％トリトンＸ−１００水溶液５０ｍＬで５回洗浄し、不要なシランカップリング剤を除去した後、水溶液中に保存した。
【００４２】
調製した光透過性磁性担体粒子および市販の平均粒径０．５〜１．０μｍの酸化鉄を主成分とするアミノ基付加磁性担体粒子（ＭａｇｎａＢｉｎｄ Ｂｅａｄｓ；ＰＩＥＲＣＥ社製：以下磁性担体粒子）をｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ＰＢ）にそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬで分散させ、この溶液の５ｍＬに発光物質である４−（２−サクシニミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジウム−９−カルボン酸フルオロ硫酸（以下アクリジニウム−Ｉと略記する：同人化学社製）の０．００１μｇ／μＬジメチルホルムアミド溶液を１０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、磁性担体粒子を１％トリトンＸ−１００水溶液５０ｍＬで５回洗浄し、不要なアクリジニウム−Ｉを除去した。また洗浄液は全て回収し、磁性担体粒子に結合しなかったアクリジニウム−Ｉの総量を以下と同様の手順で測定した。
【００４３】
得られたアクリジニウム−Ｉ結合光透過磁性担体粒子、及びアクリジニウム−Ｉ結合磁性担体粒子は、再び０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液中に分散させ、この１００μＬに０．１Ｎ水酸化ナトリウムと０．３％過酸化水素を含む水溶液２００μＬを添加し、結合したアクリジニウム−Ｉを発光させた。この検出は発光光度計（バイオルマットＬＢ９５００Ｔ；ベルトールド社製）を用い、発光光度計で捉えられた全発光カウントの積算値を標識強度として算出した。
【００４４】
アクリジニウム−Ｉ結合光透過性磁性担体粒子、及びアクリジニウム−Ｉ結合磁性担体粒子それぞれの発光カウント、及びアクリジニウム−Ｉ固定化時に結合せず洗浄液中に抽出された発光カウントを第１表に示す。なお、発光強度は、相対値（ＲＬＵ）を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
この結果、それぞれ一定量の磁性担体粒子上で観察された発光カウントはアクリジニウム−Ｉ結合光透過性磁性担体粒子の方が高い結果となった。ここで洗浄液中に抽出された未結合のアクリジニウム−Ｉは微少量であったことから、両磁性担体粒子上に固定化されたアクリジニウム−Ｉの量は一定と見なすことができる。従って得られた発光カウントの差は各磁性担体粒子の遮蔽効果に依存した違いと見なすことができ、光透過性磁性担体粒子を用いることにより正確な発光カウントが得られることが示唆された。
【００４７】
なお、本試験に使用した光透過性磁性粒子は、蒸留水に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた場合、１ｃｍの６００ｎｍの光の透過率は、５１．１％であった。一方磁性担体粒子は、蒸留水に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた場合、１ｃｍの６００ｎｍの光の透過率は、５．１％であった。
【実施例２】
【００４８】
光透過性磁性担体粒子を用いた免疫測定系
光透過性磁性担体粒子及び蛍光物質であるフルオレッセンで標識した抗体を用いてＣＲＰ測定系を構築した例を示す。
担体粒子含有試薬の調製
実施例１で調製した光透過性磁性担体粒子１００ｍｇをｐＨ５．５、１０ｍｍｏｌ／ｍＬの酢酸緩衝液５ｍＬ中に分散させ、グルタルアルデヒド（和光純薬社製）１ｍＬを添加し、３７℃で１時間振とうさせ、活性化させた。光透過性磁性担体粒子は酢酸緩衝液１００ｍＬで５回洗浄し、酢酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。固定化する抗ＣＲＰ抗体は酢酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬとなるよう調製し、この２０ｍＬを光透過性磁性担体粒子分散溶液中に添加した。同分散溶液を密閉溶液に入れ、３７℃恒温槽中で一晩反応させた。反応後、抗ＣＲＰ抗体固定化光透過性磁性担体粒子は酢酸緩衝液１００ｍＬで５回洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）に０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、担体粒子含有試薬とした。
【００４９】
標識試薬の調製
抗ＣＲＰモノクロナール抗体（以下、抗ＣＲＰ抗体）は１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させ、テキサスレッド（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＤＭＳＯ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。反応後、未反応の標識体を除くためにセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製）で精製し、テキサスレッド標識抗ＣＲＰ抗体を得た。これをＢＳＡ／ＰＢＳに０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、標識試薬とした。
【００５０】
標準抗原溶液の測定
標準のＣＲＰ抗原溶液は、ＣＲＰリコンビナント（ｒＣＲＰ；オリエンタル酵母工業社製）を２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム及び０．１％のＢＳＡを含むｐＨ７．２のリン酸緩衝液で希釈した溶液を用いた。
この標準抗原の測定は標準抗原溶液５０μＬに担体粒子含有試薬３００μＬ、及び標識試薬１００μＬを反応容器内で混合し、３７℃で５分間反応させた。反応後、反応容器の両側に磁石を配し、反応液中に分散している光透過性磁性担体粒子を集磁させ、反応液及び未反応の標識抗体を除去した。さらに蒸留水１ｍＬの添加と除去を２回繰り返し、反応液及び未反応の標識抗体を十分に除去した。次に磁性担体粒子上に形成された免疫複合体中の標識の量を測定するため、蒸留水１００μＬを添加し、該光透過性磁性担体粒子を分散させ、分光蛍光光度計（Ｆ−４０００；日立製作所製）を用いて、標識体に固有の励起光（Ｅｘ：５９６ｎｍ）及び蛍光（Ｅｍ：６１５ｎｍ）で測定した。この結果、測定可能なＣＲＰの濃度範囲は、少なくとも蛍光強度と抗原濃度の関係から０．００１〜５．０ｍｇ／ｄＬであった。結果を図１に示す。
【００５１】
またＣＲＰを添加した健常人血清３種（ＣＲＰ濃度：血清１は０．５０ｍｇ／ｄＬ、血清２は１．０ｍｇ／ｄＬ、血清３は２．０ｍｇ／ｄＬ）を測定し、上記蛍光強度と抗原濃度の関係からそれぞれの濃度を算出したところ、各濃度値は同等の数値を示した。結果を第２表に示す。
【００５２】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例２で得られたＣＲＰ濃度とフルオレッセン蛍光強度を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定すべき物質に特異的に結合する物質を用いる物質の測定方法および測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を利用した免疫測定方法は、種々の疾病を示す診断マーカーや微量物質の検出に用いられ、その原理も広く知られている。このうち代表的な免疫測定方法としては、それぞれ放射性同位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などの標識物質を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）などが知られている。これらの方法は標識物質の特徴を生かして非常に高感度な測定方法として利用されてきたが、一方で担体粒子の反応面積を広げるために担体粒子に磁性粒子を利用し、その分散と集磁を特徴とした方法も開発されてきた。この方法では反応性や感度などの性能を大きく向上させた一方、該粒子を液体中に分散させた状態で試薬としての供給が可能であるため、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）プレートのように担体粒子と反応容器が一体となったものに比べ、その汎用性は非常に高いものとなった。特に磁性粒子と発光物質による標識の組み合わせは現在もなお高感度かつ実用的な方法として広く利用されている。
【０００３】
しかし、この方法には種々の問題がある。例えばこれまで免疫測定に用いられてきた磁性粒子は光の透過性がない酸化鉄を主成分としていたため、磁性粒子上に形成された免疫複合体中の蛍光物質または発光物質の標識を検出する場合、その光シグナルが弱められる遮蔽現象を常に伴う。このような遮蔽現象は微弱な光シグナルを遮蔽するばかりでなく、高濃度の磁性粒子の使用にあたってはその検量線の傾きを減少させ、精度を大幅に損なうものであった。従って磁性粒子の使用量は遮蔽現象の少ない範囲に限定して使用するのが一般的であった。
【０００４】
しかしかかる遮蔽効果を避けるため、その使用量を減らすことは有効な手段ではない。即ち、磁性粒子の使用量の減少は測定性能に大きな影響を与える。第一に固相の反応面積は担体粒子量に比例するため、該粒子量を減らすことは反応性や測定感度といった性能に影響を与える。第二に洗浄工程を含む測定系では、磁性粒子の集磁後、反応液を除去する工程で物理的衝撃による粒子の損失を伴うため、測定精度を悪化させる。この物理的衝撃による粒子の損失割合は磁性粒子量が少ないときに大きく、性能への影響は顕著となる。従って磁性粒子の遮蔽効果はこれら反応性と精度維持のための調整範囲を大きく制限する。
【０００５】
この問題の対応策として、特許文献１には、検出時に免疫複合体の特異的結合を解離させる方法が記載されている。この方法では、抗原抗体反応により磁性粒子上に形成された免疫複合体中の標識を検出するため、検出時に抗原抗体反応による特異的結合を解離させるべく解離液を加えて標識を解離させ、該解離した標識の強度を測定する。しかしこれらの方法では解離液の添加、再分離などの工程が必要となり煩雑であり、また標識の測定に乖離液が影響を及ぼすことがあり好ましくない。
【特許文献１】特開平８−４３３９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、磁性担体粒子及び標識を用いて、測定すべき物質に特異的に結合する物質と測定すべき物質の特異的反応に基づく物質の測定方法において、標識からのシグナルを感度よく検出する方法および該方法に使用する試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の［１］〜［１０］に関する。
（１） （i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程、および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程を含み、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であることを特徴とする測定すべき物質の測定方法。
【０００８】
（２） 標識を測定する工程が磁性担体粒子と複合体を形成した状態で行われる前記（１）記載の測定方法。
（３） 磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である前記（１）または（２）記載の方法。
【０００９】
（４） 標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質、および標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
【００１０】
（７） 磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質、および標識された測定すべき物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
（８） 磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である前記（６）または（７）記載の試薬。
【００１１】
（９） 標識が酵素、発光物質、蛍光物質または色原体である前記（６）〜（８）のいずれかに記載の試薬。
（１０） 測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である前記（６）〜（９）のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、測定精度の高い正確な免疫測定方法および試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用する磁性粒子は、標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能なもので有れば特に制限はない。例えば、特開平１０−２９７９３３号公報記載のモル％でＴｂ2 Ｏ3 が２５〜５０％、ＳｉＯ2 が５〜４０％、Ｂ2 Ｏ3 が５〜４５％、Ｇａ2 Ｏ3 が５〜３５％、さらにＰ2 Ｏ5 が０〜７％、ＧｅＯ2 が０〜２０％、またＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯおよびＢａＯがそれぞれ０〜６％で、ＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯおよびＢａＯの総和が０〜６％、Ｌａ2 Ｏ3 が０〜６％、Ｇｄ2 Ｏ3 が０〜６％、Ｙｂ2 Ｏ3 が０〜６％、Ｄｙ2 Ｏ3 が０〜１５％、Ｔｂ2 Ｏ3 、Ｌａ2 Ｏ3 、Ｇｄ2 Ｏ3 、Ｙｂ2 Ｏ3 およびＤｙ2 Ｏ3 の総和が２５〜６０％並びにＺｒＯ2 が０〜８％からなる組成のファラデー回転素子用ガラス、特開２００２−１４５６２２号公報記載の化学式：Ｔｉ1-x Ｃｏx Ｏ2 ；０＜ｘ≦０．３、で表され、Ｔｉ格子位置にＣｏが置換し、かつ、単結晶基板上にエピタキシャル成長した二酸化チタン・コバルト磁性膜、イットリウム・鉄・ガーネットから成る化合物（Proc. 12th Int. Symp. Plasma Chem., / Minneapolis, USA, 1995）、磁性ガラス（特開平０４−１７０３３８号公報）や光磁気記録材料（特開平０１−２６１２３５号公報）、窒化ガリウムなどがあげられる。
【００１４】
また、磁性担体粒子としては、上記透過性磁性微粒子をポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、またはそれぞれのモノマーの２〜４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームまたは、上記磁性微粒子をラテックス、ゼラチン、リポソームなどで内包した粒子などがあげられる。
【００１５】
磁性担体粒子としては、標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であればその透過率は特に制限はないが、例えば蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子が好ましく３５％である磁性粒子がより好ましく、５０％以上である磁性粒子が特に好ましい。
【００１６】
磁性粒子の粒径は、反応液中に懸濁できる粒径であれば特に制限はないが、例えば０．０５μｍ〜３００μｍが好ましく、０．１μｍ〜３０μｍがより好ましく、０．５〜１０μｍが特に好ましい。
本発明で使用される標識は、磁性粒子を透過するシグナルを用いて直接または補所試薬を用いて間接的に検出できるものであれば特に制限はなく、例えば酵素、発光物質、蛍光物質、色原体、酵素等があげられるが、補助試薬との反応によりその量を測定することができるものが好ましい。
【００１７】
シグナルとしては、標識を検出できれば特に制限はないが、例えば光学的なシグナルが好ましく、光、蛍光等があげられる。
発光物質としては、例えば4-(2- サクシニミジルオキシカルボニルエチル)フェニル-10-メチルアクリジウム-9- カルボン酸フルオロ硫酸（以下アクリジニウム−Ｉと略記する）等のアクリジウム誘導体、ジオキセタン類、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、クマリン誘導体、ピラゾロピリドピリダジン誘導体等があげられるがあげられる。
【００１８】
蛍光物質としては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸などがあげられる。
色原体としては、単独で色素を形成する化合物であっても、二つの化合物が結合して色素を形成する化合物であってもよい。
単独で色素を形成する化合物としては、例えば、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＣＣＡＰと略記する。）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＭＣＤＰと略記する。）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（以下、ＤＡ−６４と略記する。）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（以下、ＢＣＭＡと略記する。）等があげられる。
【００１９】
二つの化合物が結合して色素となるものとしては、例えば過酸化水素水とパーオキシダーゼとの共存下で、結合して色素を形成する化合物があげられる。
具体的には、４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡと略す。）や、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等のカプラ−と、アニリン化合物、例えばＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（以下ＥＭＳＥと略す。）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩２水和物（以下ＴＯＯＳと略記する。）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンプロピル−ｍ−アニジン等との組み合わせ等が挙げられる。その他、４−ＡＡとフェノールや３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨウド酢酸の組み合わせが挙げられる。
【００２０】
酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略記する。）などがあげられる。
補助試薬は、前述の標識を測定するために使用される試薬であり前述の標識の種類に応じて当業者であれば適宜選択できるが、例えば前述の発光物質、蛍光物質、色原体、酵素などがあげられる。また、アルカリ、過酸化水素等もあげられる。
【００２１】
発明において、測定すべき物質に特異的に結合する物質としては、例えば測定すべき物質に結合する抗体、核酸、糖蛋白質、アプタマー等があげられる。
抗体としては、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等およびこれら抗体を酵素処理等により処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２などのフラグメントが挙げられる。抗体としては、ＩｇＧが好ましい。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れも使用できる。モノクローナル抗体を用いる場合、認識するエピトープの異なるモノクローナル抗体を二種類以上組み合わせて使用するのが好ましいが、同一抗原上にエピトープを複数持つ抗原に対しては一種類のモノクローナル抗体を用いることもできる。
【００２２】
測定すべき物質としては、特定の物質と特異的に結合する物質であれば特に制限はなく、抗原抗体反応を用いて測定される成分、その他の特異的反応により測定される成分等があげられる。
抗原抗体反応により測定される成分としては例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、アポ蛋白ＡＩ、アポ蛋白ＡＩＩ、アポ蛋白Ｂ、アポ蛋白Ｅ、リウマチファクター、Ｄ−ダイマー、酸化ＬＤＬ、グリコアルブミン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、総サイロキシン（Ｔ４）、抗テンカン剤等の薬剤、Ｃ−反応性蛋白（以下ＣＲＰと略記する。）、サイトカイン類、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９（carbohydrate antigen 19-9）、ＣＡ１５−３（carbohydrate antigen 15-3）、ＣＡ−１２５（carbohydrate antigen 125）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Protein induced by vitamin K absence-II）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、Ｃ−ペプタイド、エストロゲン、抗抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（ＧＡＤ）抗体、ペプシノーゲン、ＨＢＶ抗原、抗B型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗体、C型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、抗ＨＣＶ抗体、成人T細胞性白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）抗原、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、結核抗体、結核菌抗原（ＴＢＧＬ）マイコプラズマ抗体、ヘモグロビンＡ１ｃ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチニンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、Ｈ−ＦＡＢＰ（ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白）、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、T-2トキシン（Ｔ２）等のカビ毒類、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール、フタル酸ジブチル、ポリ塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）類、ダイオキシン類、ｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン、トリブチルスズ等の内分泌撹乱物質類、大腸菌等の菌類、卵、乳、小麦、そば、落花生等の食物アレルギー物質やコナヒョウダニやトヤヒョウダニ等のダニ類等のアレルギー物質、抗アレルギー物質抗体等があげられる。
【００２３】
その他の特異的結合により測定される成分としては、核酸、レクチン等があげられ、例えばｒａｓ等のガン遺伝子、ｐ５３等のガン抑制遺伝子等をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマー、糖蛋白質等があげられる。
本発明において対象となる試料には前述の測定すべき物質を含有していると疑われる試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等の生体試料や、食品、土壌等があげられる。
【００２４】
磁性担体粒子または標識に、測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質を結合させる方法は、例えば、物理的吸着、化学的結合等により行うことができる。
物理的に結合させる方法としては、磁性担体粒子または標識に抗原または抗体などを疎水結合などで直接固定化する方法が挙げられる。またアルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させ、物理的に結合する方法があげられる。
【００２５】
化学的に結合させる方法としては、磁性担体粒子または標識に存在するアミノ基、カルボキシル基、チオール基などを化学的に修飾することにより、抗原または抗体分子上の同様の官能基と直接固定化する方法が挙げられる。スペーサー分子やアルブミンなどの他のタンパク質を介して抗原または抗体を化学結合させる方法もあげられる。
結合させる測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質の量は、用いる磁性担体粒子の表面積、官能基量等により異なるが、通常磁性担体粒子１ｍｇあたり１μｇ〜５００μｇ、好ましくは１０μｇ〜２００μｇである。また標識の場合、酵素もしくは発光物質を担持させる量は反応官能基の種類または標識によっても異なるが、測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質の１分子あたり１〜５０個、好ましくは５〜２０個となるように調製される。
【００２６】
磁性担体粒子に標識を固定化する場合は、磁性担体粒子表面の官能基を利用して化学的に結合させる方法、または表面に物理的に結合させる方法などがある。
また、本発明において磁性担体粒子または標識と測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質との結合は、ビオチン又はストレプトアビジン等の生理活性物質、糖鎖とレクチン、または化学的な相互作用を有する物質を介して行うこともできる。
【００２７】
さらに、固定化したい測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質と結合しうる物質、例えば抗体、プロテインＡ等を利用して、磁性担体粒子または標識と結合させる方法があげられる。
磁性担体粒子の分離に関しては、磁性担体粒子を約１〜３分程度で分離できるような磁場の強度及び容器の形状が好ましい。磁石には、永久磁石、電磁石等を使用することができる。分離は速やかに行われることが好ましく、このため反応容器の大きさは比較的小さい方が好ましい。反応容器の材質としては特に制限はないが、ポリスチレン、アクリルなどのプラスチックや、ガラスで作成したチューブ、キュベットなどがあげられる。
【００２８】
反応液としては、測定すべき物質と測定すべき物質に特異的に結合する物質とが反応できる溶媒で有れば特に制限はないが、標識を補助試薬を用いて測定する場合は、さらに標識と補助試薬とが反応できる溶媒が好ましく、例えば水性媒体があげられる。
水性媒体としては例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
【００２９】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸［（Ｈ）ＥＰＰＳ］、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等があげられる。
【００３０】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、例えば０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
本願発明の測定方法は、例えば以下の工程を含む。
（i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識に担持された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程。
【００３１】
磁性担体粒子は、前述の標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である。
磁性担体粒子と複合体を形成した標識の測定は、直接標識を光学的に測定してもよいが、補助試薬を用いて光学的シグナルを生成させ間接的に測定する方法が好ましい。標識の測定は、使用する磁性担体粒子を透過可能な光学的シグナルを用いて、光学的に行うのが好ましい。
【００３２】
予め既知濃度の測定対象物を用いて作成した測定対象物濃度と生成物量の関係を示す検量線と、該生成物量を比較することにより測定対象物濃度を求めることができる。
反応条件は、特異的結合が起こる条件であれば特に制限はないが、２℃〜５０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましく、２５℃〜３７℃が特に好ましい。反応時間は特に制限が無く、試薬の混合直後から一昼夜が好ましく、２〜６０分間がより好ましく、３〜３０分間が特に好ましい。また担体粒子は反応液に対して０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５〜０．２ｍｇ／ｍＬとなるように使用される。試薬添加時の混合は速やかに行う必要があるが、均一に混合された後は静置してもよい。反応液のpHは特に制限はなく、１〜１１が好ましく、２〜１０がより好ましく、３〜９が特に好ましく、前述の緩衝剤が用いうる。
【００３３】
反応液は非特異反応を避けるために、例えば塩化ナトリウム等の塩類及びウシ血清アルブミン等のタンパク質を含有してもよい。
磁性担体粒子と標識された抗体が添加されると、試料中の抗原が磁性担体粒子上の抗体及び標識された抗体と結合し、免疫複合体を形成する。次いで免疫複合体を含む磁性担体粒子を磁力により反応液中の容器側面に移動させ、反応液を除いた後、必要に応じて洗浄を数回繰り返すことができる。洗浄方法は特に制限はなく、例えば必要に応じて洗浄液を添加した後、吸引除去する方法があげられる。洗浄液としては、前述の反応液があげられ、必要に応じて、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を添加することができる。
【００３４】
ついで反応容器中に残った磁性担体粒子は適切な分散液、例えば前述の反応液に再分散させ、磁性担体粒子上の標識の量を標識に固有の方法で測定する。標識が蛍光物質のときは、蛍光色素に固有の励起光で照射し、同時に放出される蛍光強度を計測することができる。例えばフルオレッセン化合物を標識として用いた場合、４９０ｎｍで励起し５２０ｎｍの蛍光を測定することができる。
【００３５】
標識の強度を磁性担体粒子の分散した懸濁状態で光学的に行うことは、分散した磁性担体粒子による光学的な妨害を受けることになる。即ち、磁性担体粒子による遮蔽効果が高すぎると標識の光学的検出を極めて困難なものにするため、使用する磁性担体粒子濃度に制限が生じてしまう。本発明では、この点を改善するため従来の磁性担体粒子の代わりに光透過性磁性担体粒子を用いるものであり、これにより従来と全く変わらない測定手順でより正確な標識強度の計測を可能とさせるものである。
【００３６】
本発明の測定試薬は、例えば下記の試薬があげられる。
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質、標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有する測定すべき物質の測定用試薬。
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質および標識された測定すべき物質を含有する測定すべき物質の測定用試薬。
【００３７】
本発明の試薬は、下記のようなキットの形態でも良い
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質を含む試薬および標識に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含む試薬を含むキット。
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質を含む試薬および標識に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含むキット。
【００３８】
標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含む試薬および標識に担持された測定すべき物質を含む試薬を含むキット。
これら試薬およびキットには、前記の緩衝剤、塩類、タンパク質等を含有していてもよい。
【００３９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
酸化鉄から成る磁性担体粒子と光透過性磁性担体粒子の遮蔽効果の比較
光透過性磁性担体粒子を調製するため、市販の厚さ１０．１ｍｍ、透過率が可視領域において８０％、比重６．０４および屈折率１．８３の粉末磁性ガラス（住田光学ガラス社製）を用い、メノー乳鉢で微粉化した。このとき分粒の目安として、水溶液中に分散させた状態で５分経っても沈降しない画分を採取し、免疫測定に利用可能な一定粒径以下の磁性担体粒子を得た。さらにこれら磁性担体粒子を磁石で集磁させ、３分経っても集磁できずに水溶液中に分散していた磁性担体粒子を除去することで、免疫測定用光透過性磁性担体粒子とした。これらの磁性担体粒子の粒径は顕微鏡による観察から平均粒径が１〜３μｍであることが確認された。
【００４１】
これら光透過性磁性担体粒子１ｇに２００μＬの０．０２Ｎ ＮａＯＨを加え、さらにシランカップリング剤であるＮ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン（信越シリコーン社製）２００μＬを添加し、１５０℃で２時間反応させた。得られたアミノ基含有光透過性磁性担体粒子は１％トリトンＸ−１００水溶液５０ｍＬで５回洗浄し、不要なシランカップリング剤を除去した後、水溶液中に保存した。
【００４２】
調製した光透過性磁性担体粒子および市販の平均粒径０．５〜１．０μｍの酸化鉄を主成分とするアミノ基付加磁性担体粒子（ＭａｇｎａＢｉｎｄ Ｂｅａｄｓ；ＰＩＥＲＣＥ社製：以下磁性担体粒子）をｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ＰＢ）にそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬで分散させ、この溶液の５ｍＬに発光物質である４−（２−サクシニミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジウム−９−カルボン酸フルオロ硫酸（以下アクリジニウム−Ｉと略記する：同人化学社製）の０．００１μｇ／μＬジメチルホルムアミド溶液を１０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、磁性担体粒子を１％トリトンＸ−１００水溶液５０ｍＬで５回洗浄し、不要なアクリジニウム−Ｉを除去した。また洗浄液は全て回収し、磁性担体粒子に結合しなかったアクリジニウム−Ｉの総量を以下と同様の手順で測定した。
【００４３】
得られたアクリジニウム−Ｉ結合光透過磁性担体粒子、及びアクリジニウム−Ｉ結合磁性担体粒子は、再び０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液中に分散させ、この１００μＬに０．１Ｎ水酸化ナトリウムと０．３％過酸化水素を含む水溶液２００μＬを添加し、結合したアクリジニウム−Ｉを発光させた。この検出は発光光度計（バイオルマットＬＢ９５００Ｔ；ベルトールド社製）を用い、発光光度計で捉えられた全発光カウントの積算値を標識強度として算出した。
【００４４】
アクリジニウム−Ｉ結合光透過性磁性担体粒子、及びアクリジニウム−Ｉ結合磁性担体粒子それぞれの発光カウント、及びアクリジニウム−Ｉ固定化時に結合せず洗浄液中に抽出された発光カウントを第１表に示す。なお、発光強度は、相対値（ＲＬＵ）を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
この結果、それぞれ一定量の磁性担体粒子上で観察された発光カウントはアクリジニウム−Ｉ結合光透過性磁性担体粒子の方が高い結果となった。ここで洗浄液中に抽出された未結合のアクリジニウム−Ｉは微少量であったことから、両磁性担体粒子上に固定化されたアクリジニウム−Ｉの量は一定と見なすことができる。従って得られた発光カウントの差は各磁性担体粒子の遮蔽効果に依存した違いと見なすことができ、光透過性磁性担体粒子を用いることにより正確な発光カウントが得られることが示唆された。
【００４７】
なお、本試験に使用した光透過性磁性粒子は、蒸留水に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた場合、１ｃｍの６００ｎｍの光の透過率は、５１．１％であった。一方磁性担体粒子は、蒸留水に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた場合、１ｃｍの６００ｎｍの光の透過率は、５．１％であった。
【実施例２】
【００４８】
光透過性磁性担体粒子を用いた免疫測定系
光透過性磁性担体粒子及び蛍光物質であるフルオレッセンで標識した抗体を用いてＣＲＰ測定系を構築した例を示す。
担体粒子含有試薬の調製
実施例１で調製した光透過性磁性担体粒子１００ｍｇをｐＨ５．５、１０ｍｍｏｌ／ｍＬの酢酸緩衝液５ｍＬ中に分散させ、グルタルアルデヒド（和光純薬社製）１ｍＬを添加し、３７℃で１時間振とうさせ、活性化させた。光透過性磁性担体粒子は酢酸緩衝液１００ｍＬで５回洗浄し、酢酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。固定化する抗ＣＲＰ抗体は酢酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬとなるよう調製し、この２０ｍＬを光透過性磁性担体粒子分散溶液中に添加した。同分散溶液を密閉溶液に入れ、３７℃恒温槽中で一晩反応させた。反応後、抗ＣＲＰ抗体固定化光透過性磁性担体粒子は酢酸緩衝液１００ｍＬで５回洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ３を含むｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）に０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、担体粒子含有試薬とした。
【００４９】
標識試薬の調製
抗ＣＲＰモノクロナール抗体（以下、抗ＣＲＰ抗体）は１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させ、テキサスレッド（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＤＭＳＯ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。反応後、未反応の標識体を除くためにセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製）で精製し、テキサスレッド標識抗ＣＲＰ抗体を得た。これをＢＳＡ／ＰＢＳに０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、標識試薬とした。
【００５０】
標準抗原溶液の測定
標準のＣＲＰ抗原溶液は、ＣＲＰリコンビナント（ｒＣＲＰ；オリエンタル酵母工業社製）を２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム及び０．１％のＢＳＡを含むｐＨ７．２のリン酸緩衝液で希釈した溶液を用いた。
この標準抗原の測定は標準抗原溶液５０μＬに担体粒子含有試薬３００μＬ、及び標識試薬１００μＬを反応容器内で混合し、３７℃で５分間反応させた。反応後、反応容器の両側に磁石を配し、反応液中に分散している光透過性磁性担体粒子を集磁させ、反応液及び未反応の標識抗体を除去した。さらに蒸留水１ｍＬの添加と除去を２回繰り返し、反応液及び未反応の標識抗体を十分に除去した。次に磁性担体粒子上に形成された免疫複合体中の標識の量を測定するため、蒸留水１００μＬを添加し、該光透過性磁性担体粒子を分散させ、分光蛍光光度計（Ｆ−４０００；日立製作所製）を用いて、標識体に固有の励起光（Ｅｘ：５９６ｎｍ）及び蛍光（Ｅｍ：６１５ｎｍ）で測定した。この結果、測定可能なＣＲＰの濃度範囲は、少なくとも蛍光強度と抗原濃度の関係から０．００１〜５．０ｍｇ／ｄＬであった。結果を図１に示す。
【００５１】
またＣＲＰを添加した健常人血清３種（ＣＲＰ濃度：血清１は０．５０ｍｇ／ｄＬ、血清２は１．０ｍｇ／ｄＬ、血清３は２．０ｍｇ／ｄＬ）を測定し、上記蛍光強度と抗原濃度の関係からそれぞれの濃度を算出したところ、各濃度値は同等の数値を示した。結果を第２表に示す。
【００５２】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例２で得られたＣＲＰ濃度とフルオレッセン蛍光強度を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程、および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程を含み、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であることを特徴とする測定すべき物質の測定方法。
【請求項２】
標識を測定する工程が磁性担体粒子と複合体を形成した状態で行われる請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質、および標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
【請求項７】
磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質、および標識された測定すべき物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
【請求項８】
磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である請求項６または７記載の試薬。
【請求項９】
標識が酵素、発光物質、蛍光物質または色原体である請求項６〜８のいずれかに記載の試薬。
【請求項１０】
測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である請求項６〜９のいずれかに記載の試薬。
【請求項１】
（i）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質と標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、または（ii）磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質と標識された測定すべき物質とを反応液中の測定すべき物質に反応させ、磁性担体粒子と複合体を形成した標識を生成させる工程、および磁性担体粒子と複合体を形成した標識を測定する工程を含み、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子であることを特徴とする測定すべき物質の測定方法。
【請求項２】
標識を測定する工程が磁性担体粒子と複合体を形成した状態で行われる請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質もしくは測定すべき物質、および標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
【請求項７】
磁性担体粒子に担持された測定すべき物質に特異的に結合する物質、および標識された測定すべき物質を含有し、磁性担体粒子が標識を検出するのに使用するシグナルが透過可能な磁性担体粒子である測定すべき物質の測定用試薬。
【請求項８】
磁性担体粒子が、蒸留水に０．１ｍｇ/ｍＬの濃度で懸濁した状態で、標識を検出するのに使用するシグナルの１ｃｍにおける透過率が２０％以上である磁性粒子である請求項６または７記載の試薬。
【請求項９】
標識が酵素、発光物質、蛍光物質または色原体である請求項６〜８のいずれかに記載の試薬。
【請求項１０】
測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である請求項６〜９のいずれかに記載の試薬。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１６２４６７（Ｐ２００６−１６２４６７Ａ）
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３５５３０４（Ｐ２００４−３５５３０４）
【出願日】平成１６年１２月８日（２００４．１２．８）
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月８日（２００４．１２．８）
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
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