光電流検出用電極及びその製造方法並びに作用電極基板
【課題】高い再現性で、被検物質を検出することができる電極及び作用電極基板並びに簡便な操作で前記電極を得ることができる製造方法を提供する。
【解決手段】光電流検出用電極において、励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体と、金属からなる金属層との間に、リンカー分子を含む密着層を設ける。
【解決手段】光電流検出用電極において、励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体と、金属からなる金属層との間に、リンカー分子を含む密着層を設ける。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光電流検出用電極及びその製造方法並びに作用電極基板に関する。本発明は、より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、光電流検出用電極及びその製造方法並びに作用電極基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査や診断を行なうための方法として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる光電流を、核酸、タンパク質等の被検物質の検出に利用する光化学的検出方法が提案されている。ここで、臨床検査や診断では、検体に含まれる微量な被検物質を検出する必要があるため、被検物質の検出感度の向上が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、半導体層と被検物質を捕捉する捕捉物質とを含む光電流検出用電極を備えた光電流検出チップにおいて、半導体層と捕捉物質との間に金属層を設けることにより、光電流検出チップによる被検物質の検出感度を向上させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１３３９３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の光電流検出チップを用いると、稀に検出感度や測定の再現性が低下する場合があった。本発明者等は、この検出感度や再現性の低下の原因を調査した結果、特許文献１の光電流検出チップは、金属層が半導体層から剥離する場合があり、これが検出感度や再現性の低下を引き起こすことを見出した。例えば、金属層への被検物質以外の物質の非特異的吸着を抑制して検出感度を向上させるために、金属層にブロッキング処理を施した場合には、金属層の剥離が生じることがある。また、被検物質がＤＮＡであり、かつ捕捉物質として核酸プローブを用いる場合には、捕捉物質による被検物質の捕捉や被検物質以外の物質の除去の際に、加熱条件下でのハイブリダイゼーション及び洗浄が行なわれる。ところが、半導体と金属との間の接着力は、加熱により弱くなりやすいため、ハイブリダイゼーション中に、金属層の剥離が生じることがある。このように、特許文献１に記載の光電流検出チップにおいて、前述のような、金属層の剥離が生じた場合には、この金属層上の捕捉物質がとれてしまい、検出感度や測定の再現性の低下を招くおそれがある。
【０００６】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、検出感度及び再現性の高い光電流検出用電極及び作用電極基板並びに、その製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、半導体層と金属層とを、リンカー分子を用いて接着することで、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極であって、
励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体と、
前記電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層と、
前記密着層上に形成された金属からなる金属層と
を含むことを特徴とする電極に関する。
【０００９】
また、本発明は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するのに用いられる作用電極基板であって、
基板本体と、
光電流検出用電極と
を含み、
光電流検出用電極は、前記基板本体上に形成され、励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体、この電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層、及びこの密着層上に形成された金属からなる金属層を有する作用電極基板に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極の製造方法であって、
光励起により生じた電子を受容する半導体からなる電極本体に、リンカー分子を含む密着層を形成する工程、及び
前記密着層上に、金属層を形成する工程
を含む、光電流検出用電極の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の光電流検出用電極及び作用電極基板によれば、高い検出感度及び再現性で、被検物質を検出することができる。また、本発明の製造方法によれば、前記光電流検出用電極を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を用いて、被検物質を検出するための検出装置を示す斜視図である。
【図２】図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップを示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は図３に示される光電流検出チップのＡＡ線での断面図である。（Ｂ）は図３に示される光電流検出チップの上基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）を下面側から見た斜視図である。（Ｃ）は図３に示される光電流検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ中の電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図７】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）の変形例の平面説明図である。
【図８】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）の変形例の平面説明図である。（Ｃ）は間隔保持部材の変形例の斜視図である。
【図９】本発明の一実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１０】本発明の他の実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１１】本発明の一実施の形態に係る電極を用いる被検物質の検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１２】試験例３において、光電流測定の際の作用電極を含む部分の状態を示す概略説明図である。
【図１３】試験例３において、被検物質濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１において、光電流を測定した結果を示すグラフである。
【図１５】試験例５において、実施例８及び９それぞれで得られた作用電極基板を用い、光電流を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［検出装置の構成］
本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を用いて、被検物質を検出するための検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を用いて、被検物質を検出するための検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用い、光電気化学的に被検物質を検出する方法に用いる検出装置である。
【００１４】
検出装置１は、光電流検出チップ２０が挿入されるチップ受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
【００１５】
図２は、図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源１３と、電流計１４と、電源１５と、Ａ／Ｄ変換部１６と、制御部１７と、ディスプレイ１２とを備えている。
光源１３は、光電流検出チップ２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザー又は太陽光が好ましい。前記光源のなかでは、レーザーがより好ましい。前記光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるものであってもよい。
電流計１４は、励起された検出物質から放出される電子に起因して光電流検出チップ２０内を流れる電流を測定する。
電源１５は、光電流検出チップ２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１６は、電流計１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１７は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成されている。この制御部１７は、ディスプレイ１２、光源１３、電流計１４及び電源１５の動作を制御する。また、制御部１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１２は、制御部１７で概算された検出物質の量等の情報を表示する。
【００１６】
［光電流検出チップ及び作用電極基板の構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ２０の構成を説明する。なお、本明細書において、「作用電極基板」とは、作用電極を備えた基板をいう。
【００１７】
図３は、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップを示す斜視図である。図４（Ａ）は図３に示される光電流検出チップのＡＡ線での断面図、図４（Ｂ）は図３に示される光電流検出チップの上基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）を下面側から見た斜視図、図４（Ｃ）は図３に示される光電流検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【００１８】
光電流検出チップ２０は、上基板３０と、上基板３０の下方に設けられた下基板４０と、上基板３０と下基板４０とに挟まれた間隔保持部材５０とを備えている。光電流検出チップ２０では、上基板３０と下基板４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板３０と下基板４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１９】
上基板３０は、図４（Ｂ）に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６１とを備えている。この基板本体３０ａには、検出物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口３０ｂが設けられている。また、基板本体３０ａの表面には、作用電極６１と、この作用電極６１に接続されている電極リード７１とが形成されている。上基板３０においては、作用電極６１は、基板本体３０ａの一側部〔図４（Ｂ）の左側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６１から基板本体３０ａの他側部〔図４（Ｂ）の右側〕に向けて延びている。試料注入口３０ｂは、基板本体３０ａにおいて、間隔保持部材５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００２０】
基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、かかる基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。
【００２１】
基板本体３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。また、基板本体３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の検出物質や被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００２２】
下基板４０は、図４（Ｃ）に示されるように、基板本体４０ａと、対極６６と、参照電極６９とを備えている。基板本体４０ａは、上基板３０の基板本体３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。基板本体４０ａ及び基板本体３０ａは、必ずしも、同寸法である必要はない。
【００２３】
基板本体４０ａを構成する材料は、光の透過性を有する材料であればよい。かかる材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、十分な光の透過性、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体４０ａの厚さ及び大きさは、前記上基板３０の基板本体３０ａを構成する材料、基板本体３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２４】
基板本体４０ａの表面には、対極６６と、この対極６６に接続された電極リード７２と、参照電極６９と、この参照電極６９に接続された電極リード７３とが形成されている。下基板４０においては、対極６６は、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕に配置されている。参照電極６９は、基板本体４０ａ上において、対極６６と対向する位置に配置されている。対極６６の電極リード７２と参照電極６９の電極リード７３とは、それぞれ、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕から他側部〔図４（Ｃ）の左側〕へ向けて延びている。対極６６及び参照電極６９の各電極リード７２，７３は、基板本体４０ａの他側部〔図４（Ｃ）の左側〕において互いに並列するように配置されている。また、電極リード７２，７３は、上基板３０と下基板４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している〔図３及び図４（Ａ）参照〕。
【００２５】
つぎに、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９について、詳細に説明する。
図５は、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。作用電極６１は、ほぼ四角形状に形成されている。作用電極６１は、図５に示されるように、基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体としての半導体層６２と、この半導体層６２上に形成された密着層６３と、この密着層６３上に形成された金属層６４と、この金属層６４上に固定化された捕捉物質９０とから構成されている。作用電極６１の電極リード７１は、半導体層６２に接続されている。
【００２６】
なお、本明細書において、「作用電極」の概念には、作用電極本体としての半導体層６２と、密着層６３と、金属層６４とからなる電極を含む場合もある。
【００２７】
半導体層６２は、励起光が照射されることにより検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる。この半導体層６２は、導電層及び電子受容層として機能する。前記半導体は、光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、半導体は、後述の標識物質の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。かかる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。これらのなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズが好ましい。半導体層６２の厚さは、通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜２００ｎｍ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
【００２８】
密着層６３は、リンカー分子を含む。リンカー分子は、半導体層６２と検出物質との間の電子の授受を阻害せず、光電流の検出の際に用いられる励起光によるバックグランド電流を生じさせない化合物であり、半導体層６２及び金属層６４の両方と結合する化合物であればよい。すなわち、リンカー分子は、半導体層６２と金属層６４の極性（親水性、疎水性）の違いを緩和する化合物であればよい。例えば、半導体層６２が金属層６４と比較して親水度が高い場合、金属層６４よりも親水度が高く、半導体層６２よりも疎水度が高いリンカー分子を用いることができる。また、半導体層６２を構成する半導体と結合する官能基と金属層６４を構成する金属と結合する官能基とを有する化合物を用いることができる。かかるリンカー分子としては、例えば、シランカップリング剤；チタンカップリング剤；式（１）：
Ｒ1−Ｘ−Ｒ2 （１）
〔式中、Ｒ1はシラノール基、リン酸基、チオール基又はカルボキシル基を示し、Ｒ2はアミノ基、チオール基、炭素数１〜４のアルキル基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、エポキシ基、メタクリロイル基、アクリロイル基又はビニル基を示し、Ｘは式（２）：
（ＣＨ2）m （２）
（式中、ｍは１〜２０の整数を示す）又は式（３）：
【００２９】
【化１】
【００３０】
（式中、ｎは１〜１００の整数を示す）
を示し、式（１）で示される分子中にアミド結合、エステル結合、エーテル結合又はジチオール結合を有していてもよい〕で表される化合物；アミノ酸；アミノ酸残基を含む化合物等が挙げられる。
【００３１】
シランカップリング剤及びチタンカップリング剤は、半導体層６２を構成する半導体と結合する官能基と金属層６４を構成する金属と結合する官能基とを有するため、半導体層６２及び金属層６４の両方とに結合するか、又は半導体層６２と金属層６４の極性（親水性、疎水性）の違いを緩和することにより、半導体層６２と金属層６４とを密着させることができる。
【００３２】
式（１）で表わされる化合物において、Ｒ1及びＲ2は、半導体層６２を構成する半導体及び金属層６４を構成する金属との結合に役割を果たすか、半導体層６２と金属層６４の極性（親水性、疎水性）の違いの緩和に役割を果たす性質を有する。かかるＲ1及びＲ2は、本発明の目的を妨げない範囲で、置換基を有していてもよい。ここで、炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。これらのなかでは、半導体層６２と金属層６４とを強固に密着させる観点から、メチル基が好ましい。
【００３３】
アミノ酸やアミノ酸残基は、末端にカルボキシル基及びアミノ基（若しくはイミノ基）を有しているため、半導体層６２及び金属層６４の双方に対し、良好な反応性を有する。したがって、かかるアミノ酸、又はアミノ酸残基を含む化合物をリンカー分子として用いた場合、かかるリンカー分子を含む密着層６３を介して半導体層６２と金属層６４とを強く密着させることができる。
【００３４】
アミノ酸は、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸のいずれであってもよい。また、アミノ酸は、本発明の目的を妨げないものであれば、Ｌ体のアミノ酸であってもよく、Ｒ体のアミノ酸であってもよい。アミノ酸としては、特に限定されないが、例えば、システイン、リジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアミノ酸は、本発明の目的を妨げない範囲で、例えば、水酸基、ホルミル基、ピロリニル基、リン酸基、セレノール基等の置換基を有していてもよい。かかるアミノ酸のなかでは、半導体層６２と金属層６４とを強く密着させ、かつノイズの発生を効果的に抑制する観点から、システイン及びリジンが好ましく、リジンがより好ましい。
【００３５】
アミノ酸残基を含む化合物としては、特に限定されないが、例えば、ポリアミノ酸；単量体としてのアミノ酸と当該アミノ酸以外の単量体とを重合させて得られる化合物等が挙げられる。アミノ酸残基は、本発明の目的を妨げないものであれば、Ｌ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基であってもよく、Ｒ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基であってもよい。アミノ酸残基を含む化合物は、Ｌ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基及びＲ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基の両方を有していてもよく、Ｌ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基及びＲ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基のいずれか一方のみを有していてもよい。アミノ酸残基としては、特に限定されないが、例えば、前述のアミノ酸に由来するアミノ酸残基等が挙げられる。かかるアミノ酸残基のなかでは、半導体層６２と金属層６４とを強く密着させ、かつノイズの発生を効果的に抑制する観点から、システイン残基及びリジン残基が好ましく、リジン残基がより好ましい。
【００３６】
ポリアミノ酸は、単量体としてのアミノ酸がペプチド結合を介して重合した化合物である。ポリアミノ酸は、１種類の単量体（アミノ酸）を重合させて得られた高分子化合物（単独重合体）であってもよく、２種類以上の単量体（アミノ酸）を重合させて得られた高分子化合物（共重合体）であってもよい。かかる単独重合体としては、特に限定されないが、例えば、ポリリジン等が挙げられる。また、共重合体としては、特に限定されないが、例えば、ペプチド、タンパク質等が挙げられる。なお、ポリアミノ酸を構成する単量体としてのアミノ酸がα位以外にもアミノ基又はカルボキシル基を有する場合、ポリアミノ酸は、本発明の目的を妨げない範囲で、α位のアミノ基（若しくはイミノ基）とα位以外の位置のカルボキシル基とのペプチド結合、又はα位のカルボキシル基とα位以外の位置のアミノ基（若しくはイミノ基）とのペプチド結合を有していてもよい。
【００３７】
これらのリンカー分子は、単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。本実施の形態では、作用電極６１が、かかる密着層６３を備えているため、かかる密着層６３を介して作用電極本体としての半導体層６２と後述の金属層６４との間をより強く密着させることができる。そのため、検出物質の検出の際に、捕捉物質によって検出物質の捕捉を行なう場合や、作用電極６１に対して、検出感度を向上させるためのブロッキング処理を施す場合においても、金属層６４が剥離しにくい。したがって、本実施の形態の作用電極基板を含む光電流検出チップによれば、高い再現性で、被検物質を検出することができる。なお、従来、半導体と金属とを密着させる手段としてチタンやクロムが用いられている。ところが、光電流検出用電極において、半導体層と金属層とを密着させるために、チタンやクロムを用いた場合、著しいノイズが発生することが本発明者らにより見出されている。しかしながら、本実施の形態のように、前記リンカー分子を含む密着層を用いた場合には、ノイズの発生を抑制することができる。したがって、本実施の形態の作用電極基板は、十分な検出感度を確保することができる点でも優れている。
【００３８】
金属層６４は、捕捉物質９０を固定化することができる金属から構成されている。かかる金属は、捕捉物質９０と共有結合することができる金属であることが好ましい。また、前記金属は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するに際して用いられる電解液によって溶解される金属であることが好ましい。前記金属としては、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ニッケル、水銀、ロジウム、ルテニウム、銅又はそれらの合金等が挙げられる。これらのなかでは、金及びパラジウムが好ましい。金属層６４の厚さは、捕捉物質を固定化するのに十分な厚さを確保する観点から、１ｎｍ以上、好ましくは２ｎｍ以上であり、金属から生じるバックグランド電流の発生を抑制する観点から、２０ｎｍ以下である。なお、金属層６４の厚さが２ｎｍ以下である場合、金属層６４は、密着層６３上でアイランド状に形成されることがある。しかしながら、この場合においても、捕捉物質を固定化するのに十分な表面積の金属層６４を確保することができればよい。一方、後述のブロッキング層は、ブロッキング剤が金属層６４の金属と反応することにより形成される。したがって、検出感度を向上させるために、金属層６４上にブロッキング層を設ける場合には、検出感度の向上の効果を十分に得る観点から、密着層６３の表面全体が金属層６４で覆われていることが好ましい。ただし、ブロッキング剤を固定することができる密着層６３を使用する場合は、この限りではない。
【００３９】
金属層６４の表面には、捕捉物質９０が固定化されている〔図５参照〕。かかる捕捉物質９０は、検出物質を捕捉する物質である。これにより、検出物質を作用電極６１の近傍に存在させることができるようになっている。捕捉物質９０は、検出物質の種類に応じて、適宜選択することができる。前記捕捉物質９０としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
【００４０】
本発明においては、より検出感度を向上させる観点から、図６に示されるように、金属層６４上における捕捉物質９０が固定化されていない部分（非固定部６４ａ）上に、ブロッキング剤からなるブロッキング層６５が形成されていてもよい。
【００４１】
対極６６は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この対極６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００４２】
参照電極６９は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この参照電極６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。なお、本実施の形態では、参照電極６９を設けているが、本発明においては、参照電極６９を設けなくてもよい。対極６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６６が参照電極６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６９を設けることが好ましい。
【００４３】
つぎに、間隔保持部材５０について、説明する。間隔保持部材５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材５０は、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９を取り囲むように配置されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。上基板３０と下基板４０との間には間隔保持部材５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極６１，６６，６９の間には試料や電解液を収容するための空間２０ａが形成されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。間隔保持部材５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム等のプラスチック製両面テープ等を用いることもできる。
【００４４】
さらに、本発明においては、作用電極本体は、半導体層と導電層とから構成されていてもよい。この場合、作用電極６１の電極リード７１は、導電層に接続される。ここで、用いることができる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。これらのなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズが好ましい。この場合の半導体層の厚さは、好ましくは０．１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
前記導電層は、導電性材料からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素系材料等が挙げられる。導電層の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１００ｎｍである。導電性が確保でき、かつ電極から生じる光電流（バックグランド電流）が最小となる膜厚が望ましい。なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドープした酸化インジウム（ＩＴＯ）、フッ素をドープした酸化スズ（ＦＴＯ）、アンチモンをドープした酸化スズ（ＡＴＯ）等が挙げられる。導電層は、例えば、当該導電層を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、前記半導体層６２の形成の際の膜形成方法と同様の方法が挙げられる。
【００４５】
また、本発明においては、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、同一の基板本体上に形成されていてもよい。すなわち、光電流検出チップは、基板本体３１ａに試料注入口３１ｂが形成された上基板３１〔図７（Ａ）参照〕と、基板本体４１ａに作用電極６１、対極６６及び参照電極６９が形成された下基板４１（この態様では、作用電極基板に対応）〔図７（Ｂ）参照〕とを有するものであってもよい。さらに、本発明においては、対極６６及び参照電極６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。すなわち、光電流検出チップは、基板本体３２ａに試料注入口３２ｂが形成された上基板３２〔図８（Ａ）参照〕と、基板本体４２ａに作用電極６１が形成された下基板４２（この態様では、作用電極基板に対応）〔図８（Ｂ）参照〕と、部材本体５１ａに対極６６及び参照電極６９が設けられた間隔保持部材５１〔図８（Ｃ）参照〕とを有するものであってもよい。この場合、対極６６及び参照電極６９の少なくともいずれかが間隔保持部材５１の部材本体５１ａに設けられていればよい。そして、上基板３２及び下基板４２のいずれかに、部材本体５１ａに設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００４６】
なお、本発明においては、作用電極を備えていない基板を構成する材料が、光透過性を有する材料であればよい。
【００４７】
［電極の製造方法］
本発明の電極の製造方法は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極の製造方法であって、
（Ａ） 光励起により生じた電子を受容する半導体からなる電極本体上に、リンカー分子を含む密着層を形成する工程、及び
（Ｂ） 前記密着層上に、金属層を形成する工程
を含む方法である。
【００４８】
図９は、本発明の一実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。本実施の形態に係る電極の製造方法では、まず、基板本体３０ａ上に、作用電極本体としての半導体層６２を形成する（工程Ｓ１−１）。工程Ｓ１−１では、半導体層６２は、半導体層６２を構成する半導体の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、蒸着法、スパッタリング法、インプリント法、スクリーン印刷法、めっき処理法、ゾルゲル法、スピンコート法、浸漬法、気相蒸着法等が挙げられる。
【００４９】
つぎに、作用電極本体としての半導体層６２上に、密着層６３を形成する（工程Ｓ１−２）。工程Ｓ１−２では、密着層６３は、作用電極本体としての半導体層を形成した基板本体を、前記リンカー分子を含む溶液中に浸漬させること、インプリント法、スクリーン印刷法、スピンコート法、気相蒸着法、スプレー法、ディップコート法等により形成することができる。本実施の形態に係る電極の製造方法では、半導体層６２上に密着層を形成するため、次工程で形成する金属層６４と、作用電極本体としての半導体層との間をより強く密着させることができる。したがって、本実施の形態に係る電極の製造方法により得られた電極を有する光電流検出チップによれば、前述したように、高い再現性で被検物質を検出することができる。
【００５０】
つぎに、本実施の形態に係る電極の製造方法では、密着層６３上に、金属層６４を形成する（工程Ｓ１−２）。工程Ｓ１−２では、金属層６４は、例えば、金属の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、例えば、蒸着法、スパッタリング法、インプリント法、スクリーン印刷法、めっき処理法、ゾルゲル法等が挙げられる。
【００５１】
図１０は、本発明の他の実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。本実施形態に係る電極の製造方法では、金属層６４の表面に捕捉物質９０が固定化され、かつ金属層６４における捕捉物質９０が固定化されていない部分（非固定部６４ａ）上にブロッキング層６５が形成された作用電極（図６参照）を得ることができる。本実施の形態に係る電極の製造方法において、工程Ｓ２−１〜工程Ｓ２−３は、前記工程Ｓ１−１〜工程Ｓ１−３と同様の操作によって行なうことができる。
【００５２】
本実施の形態に係る電極の製造方法では、工程Ｓ２−３の後、金属層６４上に、検出物質を捕捉する捕捉物質９０を固定化する（工程Ｓ２−４）。金属層６４上への捕捉物質９０の固定は、金属層６４に結合する結合基等を介して行なうことができる。前記結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基等が挙げられる。また、金属層６４の表面への捕捉物質９０の固定は、光硬化性樹脂や物理吸着により行なわれていてもよい。金属層６４上における捕捉物質９０の固定量は、特に限定されるものではなく、用途及び目的に応じて設定することができる。
【００５３】
その後、金属層６４上における捕捉物質９０が固定化されていない部分（非固定部６４ａ）を、ブロッキング剤によってブロッキングする（工程Ｓ２−５）。工程Ｓ２−５において、非固定部６４ａのブロッキングは、非固定部６４ａにブロッキング剤を接触させること、インプリント法、スクリーン印刷法、スピンコート法、気相蒸着法、スプレー法、ディップコート法等により行なうことができる。ブロッキング剤は、検出物質以外の物質が非固定部６４ａに非特異的に吸着するのを抑制するものであればよい。前記ブロッキング剤としては、例えば、トリエチレングリコールモノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル、１−メルカプトヘキサノール、２-メルカプトエタノール、メルカプトエタノール、ホスフィン〔ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン〕、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、脱脂粉乳（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、カゼイン（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、ゼラチン（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、被検物質又は検出物質と結合しないタンパク質、被検物質又は検出物質と結合しない核酸、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ等）等の化合物や物質が挙げられる。前記ブロッキング剤は、前記化合物や物質を、水、緩衝液等の溶媒に溶解させた溶液であってもよい。この場合、溶液中における前記化合物の濃度は、前記化合物の種類等に応じて適宜設定することができる。また、本発明においては、前記ブロッキング剤として、市販のブロッキング剤、例えば、ナノビオテック（株）社製、商品名：ＮａｎｏＢｉｏ ｂｌｏｃｋｅｒ等を用いることもできる。
【００５４】
つぎに、工程Ｓ２−５後の基板本体を洗浄する（工程Ｓ２−６）。これにより、作用電極を有する基板（作用電極基板）を得ることができる。工程Ｓ２−６において、基板本体の洗浄には、捕捉物質の種類等に応じた洗浄剤を用いることができる。例えば、捕捉物質が核酸である場合、洗浄剤として、緩衝液、核酸のハイブリダイゼーションに用いられるハイブリダイゼーション用溶液等を用いることができる。また、捕捉物質がタンパク質である場合、洗浄剤として、緩衝液等を用いることができる。基板本体の洗浄は、基板本体を洗浄剤中に浸漬させること、洗浄剤で基板本体の表面を洗い流すこと等により行なうことができる。必要によっては、工程Ｓ２−４後に洗浄工程を行なってもよい。
【００５５】
以上のように、本発明によれば、簡単な操作で、前述した電極（作用電極）を得ることができる。
【００５６】
［被検物質の検出方法］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る電極（作用電極６１）を用いる被検物質の検出方法を説明する。図１１は、本発明の一実施の形態に係る電極を用いる被検物質の検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００５７】
図１１において、工程Ｓ３−１では、ユーザーは、被検物質を含む液体試料を、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。これにより、液体試料中の被検物質が光電流検出チップ２０を構成する上基板３０の作用電極６１中の捕捉物質９０によって捕捉される。
【００５８】
ここで、捕捉物質９０は、被検物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質が核酸である場合、捕捉物質９０は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質がリガンドである場合、捕捉物質９０は、かかるリガンドに対するレセプターであればよい。被検物質がレセプターである場合、捕捉物質９０は、かかるレセプターに対するリガンドであればよい。
【００５９】
捕捉物質９０による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質９０と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質９０と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質９０が前記核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質９０が前記核酸に対する抗体、前記タンパク質に対する抗体又は前記ペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。さらに、被検物質がリガンドであり、捕捉物質９０が前記リガンドに対するレセプターである場合や、被検物質がレセプターであり、捕捉物質９０が前記レセプターに対するリガンドである場合、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプターとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
【００６０】
かかる被検物質の検出方法では、前記密着層６３を有する作用電極が用いられているため、本工程Ｓ３−１に際して、被検物質を捕捉する捕捉物質９０が固定化された金属層６４の剥離が抑制される。したがって、高い再現性での被検物質の検出が可能になる。
【００６１】
つぎに、工程Ｓ３−２において、ユーザーは、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、光電流検出チップ２０内を洗浄する。これにより、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制することができる。かかる工程Ｓ３−２では、光電流検出チップ２０内の洗浄に際して、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）、精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）、エタノール等の有機溶媒等が用いられる。
【００６２】
つぎに、工程Ｓ３−３において、ユーザーは、被検物質に結合する結合物質と標識物質とを有する標識結合物質（検出物質）を含む液体を、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。これにより、標識結合物質を作用電極６１上に捕捉された被検物質に結合させ、当該被検物質を標識する。
【００６３】
標識結合物質は、被検物質に結合する結合物質と標識物質とから構成されている。標識物質は、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質として、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報、特願２００８−１５４１７９号公報等を参照することができる。
【００６４】
結合物質は、被検物質中において、捕捉物質９０と結合する物質であればよく、被検物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質が核酸である場合、結合物質は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質がタンパク質又はペプチドである場合、結合物質は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体であればよい。また、被検物質がリガンドである場合、結合物質は、かかるリガンドに対するレセプターであればよい。被検物質がレセプターである場合、結合物質は、かかるレセプターに対するリガンドであればよい。
【００６５】
工程Ｓ３−３では、被検物質に結合していない残部の標識結合物質は、光電流検出チップ２０内の液体中において、遊離した状態で存在している。したがって、工程Ｓ３−４において、ユーザーは、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより、液体を排出し、光電流検出チップ２０内を洗浄する。これにより、検出結果の特性を向上させることができる。なお、かかる洗浄工程は、行なわなくてもよい。かかる工程Ｓ３−４では、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）、精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）、エタノール等の有機溶媒が用いられる。
【００６６】
つぎに、工程Ｓ３−５において、ユーザーは、電解液を、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。前記電解液として、標識物質に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。また、電解液は、ゲル状であってもよく、固体であってもよい。
【００６７】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。電解液中における電解質の濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００６８】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類；１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００６９】
ここで、電解質がヨウ化物である場合、電解液の注入により、金属層６４を構成する金属、好ましくは金が溶解される。このとき、捕捉物質９０と被検物質と標識結合物質（検出物質）とは、作用電極６１上に存在し、標識結合物質中の標識物質と作用電極６１の半導体層６２との間で電子の授受が行なわれる。
【００７０】
前記電解液のなかでは、ヨウ素又はヨウ化物を含有する電解液が好ましい。
【００７１】
工程Ｓ３−１〜Ｓ３−５をユーザーが行なった後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に光電流検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された光電流検出チップ２０の電極リード７１，７２、７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、参照電極６９を基準として任意の電位が作用電極６１に印加される（工程Ｓ３−６）。電極に印加される電位は、検出物質に対する励起光が照射されていない場合の電流値（定常電流、暗電流）が小さく、検出物質から生じる光電流が最大となる電位が好ましい。電位は、対極に印加してもよく、作用電極に印加してもよい。
【００７２】
つぎに、工程Ｓ３−７において、検出装置１の光源１３により、作用電極６１上の標識物質に励起光が照射される。これにより、標識物質が励起し、電子を発生する。そして、発生した電子は、半導体層６２に移動する。その結果、作用電極６１と対極６６との間に電流が流れる。なお、本工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみが標識物質に照射されてもよい。
【００７３】
工程Ｓ３−８では、検出装置１の電流計１４により、作用電極６１と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質を定量することができる。
【００７４】
工程Ｓ３−９では、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された電流値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、液体試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。
【００７５】
工程Ｓ３−１０では、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００７６】
以上説明したように、本発明の一実施の形態に係る電極（作用電極６１）を用いる被検物質の検出方法では、工程Ｓ３−１における捕捉物質９０による被検物質の捕捉の際における金属層６４の剥離が抑制される。したがって、作用電極６１における捕捉物質９０の量が金属層６４の剥離に伴って変動することが抑制されるので、高い再現性での被検物質の検出が可能になる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
（製造例１）
シランカップリング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ａを得た。
【００７９】
（製造例２）
シランカップリング剤である３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ｂを得た。
【００８０】
（製造例３）
２４ヌクレオチド長のＤＮＡにチオール基を導入して、チオール化ＤＮＡを得た。得られたチオール化ＤＮＡを、その濃度が１μＭとなるように滅菌精製水に添加し、ＤＮＡ水溶液を得た。
【００８１】
（製造例４〜６）
トリエチレングリコールモノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル（ＳＨ−ＴＥＧ）を、その濃度が１ｍＭとなるようにＴＢＳ緩衝液〔組成：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４〕に添加し、ＳＨ−ＴＥＧ水溶液を得た（製造例４）。また、メルカプトヘキサノール（ＭＣＨ）を、その濃度が１ｍＭとなるようにＴＢＳ緩衝液に添加し、ＭＣＨ水溶液を得た（製造例５）。さらに、市販のブロッキング剤〔ナノビオテック（株）社製、商品名：ＮａｎｏＢｉｏ ｂｌｏｃｋｅｒ〕を、製造例６のブロッキング剤として用いた。
【００８２】
（参考例１）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層（作用電極本体）を形成した。つぎに、前記半導体層に、電流計と接続するための作用電極リードを接続し、基板ａ１を得た。前記半導体層は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【００８３】
（２）金属層の形成
真空蒸着法により、前記（１）で形成した半導体層上に金薄膜（厚さ約２ｎｍ）からなる金属層を形成し、基板ａ２を得た。
【００８４】
（３）捕捉物質の固定
製造例３で得られたＤＮＡ水溶液７μＬを前記（２）で得られた基板ａ２の金属層上に滴下した。つぎに、基板ａ２の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、基板ａ２の上方から、カバーグラスをのせ、基板ａ２とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板ａ２を４℃で一晩静置して、金薄膜を構成する金と、捕捉物質としてのチオール化ＤＮＡとを共有結合させた。その後、基板ａ２の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板ａ３を得た。
【００８５】
（４）ブロッキング処理
基板ａ３の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例４で得られたブロッキング剤７μＬを滴下した。つぎに、前記基板ａ３の上方から、カバーグラスをのせ、基板ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板ａ３を４℃で一晩静置して、金属層における捕捉物質が固定化されていない部分をブロッキングした。その後、基板ａ３の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板ａ４を得た。
【００８６】
（５）洗浄
金属層上に固定化されていないチオール化ＤＮＡをさらに除去するため、以下のような操作で洗浄を行なった。基板ａ４の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置し、フッ素樹脂〔テフロン（登録商標）〕製のハイブリダイゼーション用のチャンバー（体積２０μＬ）を設置した。ハイブリダイゼーション用のチャンバーよって形成された空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液〔東洋紡績（株）製、商品名：ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕２０μＬを注入した。そして、基板ａ４を恒温槽（６５℃）中に２時間静置した。その後、前記空間より液体を排出した。さらに、前記空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを注入し、その後、前記空間から液体を排出した。これにより、ハイブリダイゼーション用のチャンバーが取り付けられた作用電極基板を得た。
【００８７】
（試験例１）
（１）ハイブリダイゼーション処理
ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを、参考例１で得られた作用電極基板に取り付けられたハイブリダイゼーション用のチャンバー内に注入した。その後、作用電極基板を恒温槽（６５℃）中に２．５時間静置した。つぎに、ハイブリダイゼーション用のチャンバーを電極上から取り外した。そして、作用電極基板を、洗浄溶液〔０．０１質量％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液〕０．５ｍＬで３回洗浄後、滅菌精製水０．５ｍＬで洗浄し、乾燥させた。
【００８８】
（２）金属層の安定性評価
前記（１）の後の作用電極基板の作用電極本体（半導体層）上の金属層の安定性を目視で評価した。その結果、金属層が完全に剥離していることがわかった。ハイブリダイゼーションによる被検物質の捕捉を行なう際に金属層の剥離が生じた場合、作用電極本体から金属層とともにこの金属層上の捕捉物質もなくなる。したがって、半導体層上に金属層を形成した作用電極基板（参考例１）を用いて被検物質の検出を行なった場合、検出感度及び測定の再現性が低くなると考えられる。
【００８９】
（実施例１）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層（作用電極本体）と、前記作用電極本体及び電流計を接続するための作用電極リードを形成し、基板Ａ１を得た。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【００９０】
（２）密着層の形成
製造例１で得られた溶液中で、前記（１）で得られた基板Ａ１を１時間浸漬させた。その後、基板Ａ１をトルエンで洗浄し、乾燥させた。これにより、半導体層上にＡＰＴＥＳの薄膜からなる密着層を形成した。
【００９１】
（３）金属層の形成
真空蒸着法により、前記（２）で形成した密着層上に金薄膜（厚さ約２ｎｍ）からなる金属層を形成し、基板Ａ２を得た。
【００９２】
（４）捕捉物質の固定
製造例３で得られたＤＮＡ水溶液７μＬを前記（３）で得られた基板Ａ２の金属層上に滴下した。つぎに、基板Ａ２の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、基板Ａ２の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ２とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ２を４℃で一晩静置して、金薄膜を構成する金と、捕捉物質としてのチオール化ＤＮＡとを共有結合させた。その後、基板Ａ２の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板Ａ３を得た。
【００９３】
（５）ブロッキング処理
基板Ａ３の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られたブロッキング剤７μＬを滴下した。つぎに、前記基板Ａ３の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ３を４℃で一晩静置して、金属層における捕捉物質が固定化されていない部分をブロッキングした。その後、基板Ａ３の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板Ａ４を得た。
【００９４】
（６）洗浄
金属層上に固定化されていないチオール化ＤＮＡをさらに除去するため、以下のような操作で洗浄を行なった。基板Ａ４の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。そして、前記シリコーンゴム上にハイブリダイゼーション用のチャンバー（体積２０μＬ）を設置した。ハイブリダイゼーション用のチャンバーによって形成された空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを注入した。そして、基板Ａ４を恒温槽（６５℃）中に２時間静置した。その後、前記空間より液体を排出した。さらに、前記空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを注入し、前記と同様に操作を行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【００９５】
（実施例２）
実施例１において、製造例５で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例６のブロッキング剤を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９６】
（実施例３）
実施例１において、ブロッキング処理を行なわなかったことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９７】
（実施例４）
実施例１において、製造例１で得られた溶液Ａの代わりに、製造例２で得られた溶液Ｂを用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９８】
（実施例５）
実施例４において、製造例５で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例６のブロッキング剤を用いたことを除き、実施例４と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９９】
（実施例６）
実施例４において、ブロッキング処理を行なわなかったことを除き、実施例４と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１００】
（比較例１）
参考例１において、製造例４で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例５のブロッキング剤を用いたことを除き、参考例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１０１】
（比較例２）
参考例１において、製造例４で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例６のブロッキング剤を用いたことを除き、参考例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１０２】
（比較例３）
参考例１において、ブロッキング処理を行なわなかったことを除き、参考例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１０３】
（試験例２）
試験例１と同様の操作を行ない、実施例１〜６並びに比較例１〜３それぞれで得られた作用電極基板の作用電極上の金属層の安定性を評価した。評価基準は、以下のとおりである。評価の結果を表１に示す。
【０１０４】
〔評価基準〕
○ 金属層が完全に残っている。
× 金属層の剥離が見られる。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
表１に示された結果から、半導体層と金属層との間に密着層を形成した場合（実施例１〜６）、核酸間のハイブリダイゼーションに用いる液相中においても、金属層の剥離が見られず、金属層は良好な状態で維持されていることがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１〜６それぞれで得られた作用電極基板を被検物質の検出に用いた場合、高い検出感度で、かつ高い再現性で被検物質を検出することができることが示唆される。実施例１〜６において、密着層に用いられたシランカップリング剤は、半導体層及び金属層の両方と結合する化合物である。したがって、半導体層及び金属層の両方と結合する化合物からなる密着層を半導体層と金属層との間に有する光電流検出用電極によれば、金属層の剥離が抑制されることから、高い検出感度で、かつ高い再現性で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１０７】
一方、表１に示された結果から半導体層と金属層との間に密着層を形成していない場合（比較例１〜３）、金属層の剥離が見られることがわかる。したがって、これらの結果から、比較例１〜３それぞれで得られた作用電極基板を被検物質の検出に用いた場合、検出感度及び再現性が低くなることが予想される。
【０１０８】
（製造例７）
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体溶液〔ダコ社製、商品名：Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、カタログ番号：Ｆ０４７９〕２０μＬを、還元剤であるトリス(２−クロロエチル)ホスフェート（ＴＣＥＰ）〔ピアス（ＰＩＥＲＣＥ）社製、カタログ番号：７７７１２〕２０μＬと混合した。得られた混合物を１８００ｒｐｍ（回転／分）で室温９０分間振とうさせ、抗マウスイムノグロブリン抗体をＦａｂ化し、Ｆａｂ化抗体（Ｆａｂ化抗マウスイムノグロブリン抗体）を得た。その後、前記混合物の上清６μＬとＴＢＳ緩衝液５９４μＬとを混合し、Ｆａｂ化抗体水溶液を得た。
【０１０９】
（実施例７）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体３０ａ上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層６２（図１２参照）（作用電極本体）と、前記作用電極本体と電流計とを接続するための作用電極リードを形成し、基板Ａ１を得た。前記半導体層６２は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【０１１０】
（２）密着層の形成
製造例１で得られた溶液中で、前記（１）で得られた基板Ａ１を１時間浸漬させた。その後、基板Ａをトルエンで洗浄し、乾燥させた。これにより、半導体層６２上にシランカップリング剤であるＡＰＴＥＳの薄膜からなる密着層６３（図１２参照）を形成した。
【０１１１】
（３）金属層の形成
真空蒸着法により、前記（２）で形成した密着層６３上に金薄膜（厚さ約２ｎｍ）からなる金属層６４（図１２参照）を形成し、基板Ａ２を得た。
【０１１２】
（４）捕捉物質の固定
基板Ａ２の金属層６４の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。そして、前記シリコーンゴム上に、チャンバー（体積２０μＬ）を設置した。チャンバーよって形成された空間に、製造例７で得られたＦａｂ化抗体水溶液２０μＬを注入した。その後、基板Ａ２を４℃で一晩静置した。これにより、捕捉物質９０（Ｆａｂ化抗体）と金属層６４を構成する金とを共有結合させた。その後、チャンバーを装着したまま、基板Ａ２の金属層６４をＴＢＳ緩衝液２０μＬで洗浄した。これにより、基板Ａ３を得た。
【０１１３】
（５）ブロッキング処理
基板Ａ３の金属層６４の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られたブロッキング剤７μＬを滴下した。つぎに、前記基板Ａ３の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ３を４℃で一晩静置して、金属層６４における捕捉物質９０（Ｆａｂ化抗体）が固定化されていない部分の表面にブロッキング層６５（図１２参照）を形成させた。その後、基板Ａ３の金属層６４をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、作用電極基板を得た。
【０１１４】
（製造例８〜１１）
被検物質Ｓとしてのマウスイムノグロブリンを、その濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ（製造例８）、１ｎｇ／ｍＬ（製造例９）、１０ｎｇ／ｍＬ（製造例１０）又は１００ｎｇ／ｍＬ（製造例１１）となるように、１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液〔トリス緩衝溶液（ＴＢＳ−Ｔ）：０．１体積％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有するトリス緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）〕に添加し、被検物質を含有する液体試料を得た。
【０１１５】
（製造例１２）
２４ヌクレオチド長のＤＮＡ９５に、ビオチン９４と光化学的に活性な標識物質９６（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０）を導入して、標識ビオチン化ＤＮＡ９７を得た。得られた標識ビオチン化ＤＮＡ９７を、その濃度が１００ｎＭとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加し、標識溶液を得た。
【０１１６】
（製造例１３）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、溶解誘引電解液を得た。なお、前記ヨウ素及びテトラプロピルアンモニウムヨーダイドは、金を溶解させることができる。
【０１１７】
（製造例１４）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜からなる対極と、厚さ２００ｎｍの白金薄膜からなる参照電極と、前記対極及び参照電極と電流計とを接続するための電極リードを形成した。これにより、対極基板を得た。
【０１１８】
（試験例３）
（１）被検物質の捕捉
製造例８〜１１それぞれで得られた液体試料２０μＬを、実施例７で得られた作用電極基板に取り付けられたチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で１．５時間静置し、捕捉物質９０（Ｆａｂ化抗体）により、被検物質Ｓを捕捉させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬで洗浄した。
【０１１９】
（２）標識
ビオチン標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ビオチン標識２次抗体）溶液〔シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｂ７１５１〕を、２０００倍の体積となるように、１質量％ウシ血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔで希釈し、希釈抗体溶液を得た。得られた希釈抗体溶液２０μＬを、前記（１）の後の作用電極基板のチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で３０分間静置して、ビオチン標識２次抗体９２と、作用電極上に捕捉された被検物質Ｓとを反応させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬで洗浄した。
【０１２０】
ストレプトアビジン含有液〔ベクター（ＶＥＣＴＯＲ）社製、製品番号：ＳＡ−５０００〕を、５００倍の体積となるようにＴＢＳ−Ｔで希釈し、ストレプトアビジン含有希釈液を得た。得られたストレプトアビジン含有希釈液２０μＬを、作用電極基板のチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で３０分間静置して、ストレプトアビジン９３と、作用電極上に存在するビオチン標識２次抗体９２とを反応させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬで洗浄した。
【０１２１】
製造例１２で得られた標識溶液２０μＬを、作用電極基板のチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で１．５時間静置して、作用電極上に固定されたストレプトアビジン９４に標識ビオチン化ＤＮＡ９７を結合させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬと滅菌精製水２０μＬとで洗浄して、未結合の標識物質を除去した。さらに、チャンバーを取り外し、滅菌精製水０．５ｍＬで、作用電極を３回洗浄後、乾燥させた。
【０１２２】
（３）光電流の測定
前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例１３で得られた電解液１２μＬを充填した。そして、作用電極基板の上方から、製造例１４で得られた対極基板をのせ、前記電解液が充填された空間を密封した。これにより、作用電極と対極と参照電極を電解液に接触させた。つぎに、電極リードを電流計に接続した。
【０１２３】
作用電極に対して、参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。これと同時に、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源〔コヒレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社製、商品名Ｃｕｂｅ７８５〕からレーザー光（波長７８５ｎｍ、出力１３ｍＷ）を照射した。このとき、レーザー光を所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。そして、レーザー光を２０回点滅させたときのレーザー光点灯時（ｏｎの時）に作用電極と対極との間を流れる光電流を測定した。試験例３において、被検物質濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフを図１３に示す。
【０１２４】
図１３に示された結果から、捕捉物質として抗体（Ｆａｂ化抗マウスイムノグロブリン抗体）を用い、被験物質としてその抗原を抗原抗体反応によって検出する際に、半導体層６２及び金属層６４の両方と結合する化合物であるシランカップリング剤からなる密着層６３を半導体層６２と金属層６４との間に有する作用電極基板を用いた場合であっても、ノイズは光電流の検出の妨げにはならない程度に抑制されており、しかも、被検物質濃度に依存的に光電流が増加することがわかる。
【０１２５】
（製造例１５）
Ｌ−システインを、その濃度が１ｍＭとなるようにＴＢＳ緩衝液に添加し、溶液Ｃを得た。
【０１２６】
（製造例１６）
ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩〔シグマアルドリッチ社製、カタログ番号：Ｐ２６５８−２５ＭＧ、α−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩、粘度平均分子量：１５０００−３００００Ｄａ〕を、その濃度が１００μＭとなるようにＰＢＳに添加し、溶液Ｄを得た。
【０１２７】
（実施例８）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層（作用電極本体）と、作用電極本体及び電流計を接続するための作用電極リードとを形成し、基板Ａ１を得た。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【０１２８】
（２）密着層の形成
（１）で得られた基板Ａ１の半導体層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．２ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ１とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例１５で得られた溶液Ｃ３０μＬを滴下した後、基板Ａ１を４℃で一晩静置した。その後、基板Ａ１をＴＢＳ緩衝液で洗浄し、風乾した。これにより、半導体層上に、Ｌ−システインの薄膜からなる密着層を形成した。
【０１２９】
（３）金属層の形成
真空蒸着法により、（２）で形成した密着層上に金薄膜（厚さ２ｎｍ）からなる金属層をさらに形成し、基板Ａ２を得た。
【０１３０】
（４）捕捉物質の固定
製造例３で得られたＤＮＡ水溶液１２μＬを、（３）で得られた基板Ａ２の金属層上に滴下した。つぎに、基板Ａ２の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、基板Ａ２の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ２とシリコーンゴムとで囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ２を４℃で一晩静置して、金薄膜を構成する金と、捕捉物質としてのチオール化ＤＮＡとを共有結合させた。その後、基板Ａ２の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。
【０１３１】
その後、金属膜および半導体層上に非特異的に吸着したプローブＤＮＡを取り除くため、ＤＮＡプローブが固定された基板の表面を以下のようにして洗浄した。まず、シリコーンゴム上にハイブリダイゼーション用のチャンバー（体積２０μＬ）を設置した。ハイブリダイゼーション用のチャンバーによって形成された空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液〔東洋紡績（株）製、商品名：ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕２０μＬを注入した。そして、基板Ａ２を恒温槽（４５℃）中に２時間静置した。その後、前記空間より液体を排出した。さらに、前記空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液１００μＬを注入し、前記と同様に操作を行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【０１３２】
（実施例９）
実施例８において、製造例１５で得られた溶液Ｃの代わりに、製造例１６で得られた溶液Ｄを用いたことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１３３】
（比較例４）
実施例８において、製造例１５で得られた溶液Ｃの代わりに、ＴＢＳ緩衝液を用いたことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１３４】
（比較例５）
実施例８において、製造例１５で得られた溶液Ｃを用いる代わりに何も用いなかったことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１３５】
（試験例４）
（１）ハイブリダイゼーション処理
ハイブリダイゼーション用水溶液又は１０ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション用水溶液１００μＬを、実施例８及び９並びに比較例４及び５それぞれで得られた作用電極基板に取り付けられたハイブリダイゼーション用のチャンバー内に注入した。
【０１３６】
その後、作用電極基板を恒温槽（４５℃）中に４時間静置した。つぎに、ハイブリダイゼーション用のチャンバーを電極上から取り外した。そして、作用電極基板を、洗浄溶液〔０．０１質量％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液〕及び滅菌精製水で洗浄し、乾燥させた。
【０１３７】
（２）金属層の安定性評価
試験例１と同様の操作を行ない、実施例８及び９並びに比較例４及び５それぞれで得られた作用電極基板の作用電極上の金属層の安定性を評価した。評価基準は、以下のとおりである。評価の結果を表２に示す。
【０１３８】
〔評価基準〕
○ 金属層が完全に残っている。
× 金属層の剥離が見られる。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
表２に示された結果から、リンカー分子としてのＬ−システイン又はポリ−Ｌ−リジンからなる密着層を半導体層と金属層との間に形成した場合（実施例８及び９）、金属層の剥離が見られず、金属層は良好な状態で維持されていることがわかる。したがって、これらの結果から、リンカー分子として半導体層及び金属層の両方と結合する化合物であるＬ-システイン等のアミノ酸又はポリ−Ｌ−リジン等のポリアミノ酸が用いられた作用電極基板によれば、高い検出感度で、かつ高い再現性で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１４１】
（試験例５）
（１）ハイブリダイゼーション処理
ハイブリダイゼーション用水溶液（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの濃度：０ｎＭ）又は１０ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション用水溶液１００μＬを、実施例８及び９並びに比較例４及び５それぞれで得られた作用電極基板に取り付けられたハイブリダイゼーション用のチャンバー内に注入した。
【０１４２】
その後、作用電極基板を恒温槽（４５℃）中に４時間静置した。つぎに、ハイブリダイゼーション用のチャンバーを電極上から取り外した。そして、作用電極基板を、洗浄溶液〔０．０１質量％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液〕及び滅菌精製水で洗浄し、乾燥させた。
【０１４３】
（２）被験物質の誘引
（１）を行なった後の作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとによって囲まれた空間に、製造例１３で得られた溶解誘引電解液１２．５μＬを注入した。つぎに、作用電極基板の上方から、製造例１４で得た対極基板をのせ、溶解誘引電解液が充填された空間を密封した。これにより、作用電極本体上の金薄膜と対極と参照電極とを溶解誘引電解液に接触させ、室温で５分間静置した。つぎに、電極リードを電流計に接続した。
【０１４４】
（３）光電流の測定
作用電極に対して、参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。これと同時に、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源からレーザー光（波長約７８５ｎｍ、出力約１３ｍＷ）を照射した。このとき、レーザー光を所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。そして、レーザー光を２０回点滅させたときのレーザー光点灯時（ｏｎの時）に作用電極と対極との間を流れる光電流を測定した。試験例５において、実施例８及び９それぞれで得られた作用電極基板を用い、光電流を測定した結果を図１５に示す。図中、黒色バーはハイブリダイゼーション用水溶液（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの濃度：０ｎＭ）を用いたときの光電流値、白色バーは１０ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション用水溶液を用いたときの光電流値を示す。また、図中、エラーバーは、同一の作用電極上の３点で得られた光電流値の標準偏差を示す。さらに、図中、「ＤＮＡ」は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを示す。
【０１４５】
図１５に示された結果から、リンカー分子としてポリ−Ｌ−リジンが用いられた作用電極基板（実施例８）及びリンカー分子としてＬ−システインが用いられた作用電極基板（実施例８）のいずれを用いた場合であっても、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０に基づく光電流を良好に検出することができることがわかる。したがって、これらの結果から、リンカー分子としてＬ-システイン等のアミノ酸又はポリ−Ｌ−リジン等のポリアミノ酸が用いられた作用電極基板によれば、被検物質を良好に検出することができることが示唆される。
【０１４６】
また、図１５に示された結果から、リンカー分子としてポリ−Ｌ−リジンが用いられた作用電極基板（実施例９）を用いたときのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０に基づく光電流は、リンカー分子としてＬ−システインが用いられた作用電極基板（実施例８）を用いたときのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０に基づく光電流と比べて大きいことがわかる。しかも、リンカー分子としてポリ−Ｌ−リジンが用いられた作用電極基板（実施例９）を用いたときのシグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、リンカー分子としてＬ−システインが用いられた作用電極基板（実施例８）を用いたときのＳ／Ｎと比べて大きいことがわかる。したがって、これらの結果から、被検物質を高い検出感度で検出する観点から、リンカー分子は、Ｌ−システインよりもポリ−Ｌ−リジンが好ましいことがわかる。
【０１４７】
（実験例１）
（１）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、ガラス（ＳｉＯ2）からなる基板本体の表面に、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の薄膜（厚さ約２００ｎｍ）を形成し、さらにその上にアンチモンドープ酸化スズ（ＡＴＯ）の薄膜（厚さ約１００ｎｍ）を形成し、作用電極１を得た。また、作用電極１上に、酸化チタン（ＴｉＯ2）の薄膜（厚さ約１０ｎｍ）を形成し、作用電極２を得た。酸化チタンは、従来、半導体と金属とを密着させるために用いられている。
【０１４８】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例１３で得られた電解液１２μＬを充填した。そして、作用電極基板の上方から、製造例１４で得られた対極基板をのせ、前記電解液が充填された空間を密封した。これにより、作用電極と対極と参照電極を電解液に接触させた。つぎに、電極リードを電流計に接続した。
【０１４９】
作用電極に対して、参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。これと同時に、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源から波長４７３ｎｍのレーザー光〔出力１３ｍＷ、使用光源：フォトップ・スーテック（Ｐｈｏｔｏｐ Ｓｕｗｔｅｃｈ）社製、商品名：ＤＰＢＬ−９０５０〕、波長６４０ｎｍのレーザー光〔出力１３ｍＷ、使用光源：コヘレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社製、商品名：Ｃｕｂｅ６４０〕又は波長７８５ｎｍのレーザー光〔出力１３ｍＷ、使用光源：コヘレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社製、商品名：Ｃｕｂｅ７８５〕を照射した。このとき、レーザー光を所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。そして、レーザー光を２０回点滅させたときのレーザー光点灯時（ｏｎの時）に作用電極と対極との間を流れる光電流を測定した。実験例１において、光電流を測定した結果を示すグラフを図１４に示す。実験番号１は作用電極２に対して、波長４７３ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号２は作用電極２に対して、波長６４０ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号３は作用電極２に対して、波長７８５ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号４は作用電極１に対して、波長４７３ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号５は作用電極１に対して、波長６４０ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流及び実験番号６は作用電極１に対して、波長７８５ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流を示す。
【０１５０】
図１４に示された結果から、酸化チタンからなる薄膜を有する作用電極２（実験番号１〜３）では、酸化チタンからなる薄膜を有しない作用電極１（実験番号４〜６）と比べて、作用電極由来の光電流値が１０倍以上に増大することがわかる。この結果より、光電流の検出に用いる作用電極基板において、半導体層と金属層とを密着させる密着層として酸化チタンからなる薄膜を用いた場合、作用電極由来の光電流値が増大してしまい、結果としてＳ／Ｎの著しい低下を招くことが示唆される。したがって、従来、半導体と金属とを密着させるために用いられているチタンは、光電流の検出に用いる作用電極基板においては、金属層を安定的に維持するための密着層として使用困難であることが示唆される。
【０１５１】
以上の結果から、本発明の電極は、半導体層と金属層との間にリンカー分子からなる密着層を有しているので、かかる密着層を介して半導体層と金属層との間をより強く密着させることができることがわかる。そのため、検出物質の検出の際に、捕捉物質によって検出物質の捕捉を行なう場合や、作用電極に対して、検出感度を向上させるためのブロッキング処理を施した場合であっても、金属層が剥離しにくくなる。したがって、光化学的検出方法において、本発明の電極を用いることで、高い再現性で被検物質を検出することができることがわかる。
【符号の説明】
【０１５２】
１ 検出装置
１１ チップ受入部
１２ ディスプレイ
１３ 光源
１４ 電流計
１５ 電源
１６ Ａ／Ｄ変換部
１７ 制御部
２０ 光電流検出チップ
２０ａ 空間
３０ 上基板
３０ａ 基板本体
３０ｂ 試料注入口
３１ 上基板
３１ａ 基板本体
３１ｂ 試料注入口
３２ 上基板
３２ａ 基板本体
３２ｂ 試料注入口
４０ 下基板
４１ 下基板
４２ 下基板
４０ａ 基板本体
４１ａ 基板本体
４２ａ 基板本体
５０ 間隔保持部材
５１ 間隔保持部材
５１ａ 部材本体
６１ 作用電極
６２ 半導体層（作用電極本体）
６３ 密着層
６４ 金属層
６４ａ 非固定部
６５ ブロッキング層
６６ 対極
６９ 参照電極
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
９０ 捕捉物質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光電流検出用電極及びその製造方法並びに作用電極基板に関する。本発明は、より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、光電流検出用電極及びその製造方法並びに作用電極基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査や診断を行なうための方法として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる光電流を、核酸、タンパク質等の被検物質の検出に利用する光化学的検出方法が提案されている。ここで、臨床検査や診断では、検体に含まれる微量な被検物質を検出する必要があるため、被検物質の検出感度の向上が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、半導体層と被検物質を捕捉する捕捉物質とを含む光電流検出用電極を備えた光電流検出チップにおいて、半導体層と捕捉物質との間に金属層を設けることにより、光電流検出チップによる被検物質の検出感度を向上させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１３３９３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の光電流検出チップを用いると、稀に検出感度や測定の再現性が低下する場合があった。本発明者等は、この検出感度や再現性の低下の原因を調査した結果、特許文献１の光電流検出チップは、金属層が半導体層から剥離する場合があり、これが検出感度や再現性の低下を引き起こすことを見出した。例えば、金属層への被検物質以外の物質の非特異的吸着を抑制して検出感度を向上させるために、金属層にブロッキング処理を施した場合には、金属層の剥離が生じることがある。また、被検物質がＤＮＡであり、かつ捕捉物質として核酸プローブを用いる場合には、捕捉物質による被検物質の捕捉や被検物質以外の物質の除去の際に、加熱条件下でのハイブリダイゼーション及び洗浄が行なわれる。ところが、半導体と金属との間の接着力は、加熱により弱くなりやすいため、ハイブリダイゼーション中に、金属層の剥離が生じることがある。このように、特許文献１に記載の光電流検出チップにおいて、前述のような、金属層の剥離が生じた場合には、この金属層上の捕捉物質がとれてしまい、検出感度や測定の再現性の低下を招くおそれがある。
【０００６】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、検出感度及び再現性の高い光電流検出用電極及び作用電極基板並びに、その製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、半導体層と金属層とを、リンカー分子を用いて接着することで、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極であって、
励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体と、
前記電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層と、
前記密着層上に形成された金属からなる金属層と
を含むことを特徴とする電極に関する。
【０００９】
また、本発明は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するのに用いられる作用電極基板であって、
基板本体と、
光電流検出用電極と
を含み、
光電流検出用電極は、前記基板本体上に形成され、励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体、この電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層、及びこの密着層上に形成された金属からなる金属層を有する作用電極基板に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極の製造方法であって、
光励起により生じた電子を受容する半導体からなる電極本体に、リンカー分子を含む密着層を形成する工程、及び
前記密着層上に、金属層を形成する工程
を含む、光電流検出用電極の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の光電流検出用電極及び作用電極基板によれば、高い検出感度及び再現性で、被検物質を検出することができる。また、本発明の製造方法によれば、前記光電流検出用電極を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を用いて、被検物質を検出するための検出装置を示す斜視図である。
【図２】図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップを示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は図３に示される光電流検出チップのＡＡ線での断面図である。（Ｂ）は図３に示される光電流検出チップの上基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）を下面側から見た斜視図である。（Ｃ）は図３に示される光電流検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ中の電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図７】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）の変形例の平面説明図である。
【図８】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）の変形例の平面説明図である。（Ｃ）は間隔保持部材の変形例の斜視図である。
【図９】本発明の一実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１０】本発明の他の実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１１】本発明の一実施の形態に係る電極を用いる被検物質の検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１２】試験例３において、光電流測定の際の作用電極を含む部分の状態を示す概略説明図である。
【図１３】試験例３において、被検物質濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１において、光電流を測定した結果を示すグラフである。
【図１５】試験例５において、実施例８及び９それぞれで得られた作用電極基板を用い、光電流を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［検出装置の構成］
本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を用いて、被検物質を検出するための検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を用いて、被検物質を検出するための検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用い、光電気化学的に被検物質を検出する方法に用いる検出装置である。
【００１４】
検出装置１は、光電流検出チップ２０が挿入されるチップ受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
【００１５】
図２は、図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源１３と、電流計１４と、電源１５と、Ａ／Ｄ変換部１６と、制御部１７と、ディスプレイ１２とを備えている。
光源１３は、光電流検出チップ２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザー又は太陽光が好ましい。前記光源のなかでは、レーザーがより好ましい。前記光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるものであってもよい。
電流計１４は、励起された検出物質から放出される電子に起因して光電流検出チップ２０内を流れる電流を測定する。
電源１５は、光電流検出チップ２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１６は、電流計１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１７は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成されている。この制御部１７は、ディスプレイ１２、光源１３、電流計１４及び電源１５の動作を制御する。また、制御部１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１２は、制御部１７で概算された検出物質の量等の情報を表示する。
【００１６】
［光電流検出チップ及び作用電極基板の構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ２０の構成を説明する。なお、本明細書において、「作用電極基板」とは、作用電極を備えた基板をいう。
【００１７】
図３は、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップを示す斜視図である。図４（Ａ）は図３に示される光電流検出チップのＡＡ線での断面図、図４（Ｂ）は図３に示される光電流検出チップの上基板（本発明の一実施の形態に係る作用電極基板に対応）を下面側から見た斜視図、図４（Ｃ）は図３に示される光電流検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【００１８】
光電流検出チップ２０は、上基板３０と、上基板３０の下方に設けられた下基板４０と、上基板３０と下基板４０とに挟まれた間隔保持部材５０とを備えている。光電流検出チップ２０では、上基板３０と下基板４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板３０と下基板４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１９】
上基板３０は、図４（Ｂ）に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６１とを備えている。この基板本体３０ａには、検出物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口３０ｂが設けられている。また、基板本体３０ａの表面には、作用電極６１と、この作用電極６１に接続されている電極リード７１とが形成されている。上基板３０においては、作用電極６１は、基板本体３０ａの一側部〔図４（Ｂ）の左側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６１から基板本体３０ａの他側部〔図４（Ｂ）の右側〕に向けて延びている。試料注入口３０ｂは、基板本体３０ａにおいて、間隔保持部材５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００２０】
基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、かかる基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。
【００２１】
基板本体３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。また、基板本体３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の検出物質や被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００２２】
下基板４０は、図４（Ｃ）に示されるように、基板本体４０ａと、対極６６と、参照電極６９とを備えている。基板本体４０ａは、上基板３０の基板本体３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。基板本体４０ａ及び基板本体３０ａは、必ずしも、同寸法である必要はない。
【００２３】
基板本体４０ａを構成する材料は、光の透過性を有する材料であればよい。かかる材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、十分な光の透過性、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体４０ａの厚さ及び大きさは、前記上基板３０の基板本体３０ａを構成する材料、基板本体３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２４】
基板本体４０ａの表面には、対極６６と、この対極６６に接続された電極リード７２と、参照電極６９と、この参照電極６９に接続された電極リード７３とが形成されている。下基板４０においては、対極６６は、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕に配置されている。参照電極６９は、基板本体４０ａ上において、対極６６と対向する位置に配置されている。対極６６の電極リード７２と参照電極６９の電極リード７３とは、それぞれ、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕から他側部〔図４（Ｃ）の左側〕へ向けて延びている。対極６６及び参照電極６９の各電極リード７２，７３は、基板本体４０ａの他側部〔図４（Ｃ）の左側〕において互いに並列するように配置されている。また、電極リード７２，７３は、上基板３０と下基板４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している〔図３及び図４（Ａ）参照〕。
【００２５】
つぎに、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９について、詳細に説明する。
図５は、本発明の一実施の形態に係る作用電極基板を含む光電流検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。作用電極６１は、ほぼ四角形状に形成されている。作用電極６１は、図５に示されるように、基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体としての半導体層６２と、この半導体層６２上に形成された密着層６３と、この密着層６３上に形成された金属層６４と、この金属層６４上に固定化された捕捉物質９０とから構成されている。作用電極６１の電極リード７１は、半導体層６２に接続されている。
【００２６】
なお、本明細書において、「作用電極」の概念には、作用電極本体としての半導体層６２と、密着層６３と、金属層６４とからなる電極を含む場合もある。
【００２７】
半導体層６２は、励起光が照射されることにより検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる。この半導体層６２は、導電層及び電子受容層として機能する。前記半導体は、光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、半導体は、後述の標識物質の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。かかる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。これらのなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズが好ましい。半導体層６２の厚さは、通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜２００ｎｍ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
【００２８】
密着層６３は、リンカー分子を含む。リンカー分子は、半導体層６２と検出物質との間の電子の授受を阻害せず、光電流の検出の際に用いられる励起光によるバックグランド電流を生じさせない化合物であり、半導体層６２及び金属層６４の両方と結合する化合物であればよい。すなわち、リンカー分子は、半導体層６２と金属層６４の極性（親水性、疎水性）の違いを緩和する化合物であればよい。例えば、半導体層６２が金属層６４と比較して親水度が高い場合、金属層６４よりも親水度が高く、半導体層６２よりも疎水度が高いリンカー分子を用いることができる。また、半導体層６２を構成する半導体と結合する官能基と金属層６４を構成する金属と結合する官能基とを有する化合物を用いることができる。かかるリンカー分子としては、例えば、シランカップリング剤；チタンカップリング剤；式（１）：
Ｒ1−Ｘ−Ｒ2 （１）
〔式中、Ｒ1はシラノール基、リン酸基、チオール基又はカルボキシル基を示し、Ｒ2はアミノ基、チオール基、炭素数１〜４のアルキル基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、エポキシ基、メタクリロイル基、アクリロイル基又はビニル基を示し、Ｘは式（２）：
（ＣＨ2）m （２）
（式中、ｍは１〜２０の整数を示す）又は式（３）：
【００２９】
【化１】
【００３０】
（式中、ｎは１〜１００の整数を示す）
を示し、式（１）で示される分子中にアミド結合、エステル結合、エーテル結合又はジチオール結合を有していてもよい〕で表される化合物；アミノ酸；アミノ酸残基を含む化合物等が挙げられる。
【００３１】
シランカップリング剤及びチタンカップリング剤は、半導体層６２を構成する半導体と結合する官能基と金属層６４を構成する金属と結合する官能基とを有するため、半導体層６２及び金属層６４の両方とに結合するか、又は半導体層６２と金属層６４の極性（親水性、疎水性）の違いを緩和することにより、半導体層６２と金属層６４とを密着させることができる。
【００３２】
式（１）で表わされる化合物において、Ｒ1及びＲ2は、半導体層６２を構成する半導体及び金属層６４を構成する金属との結合に役割を果たすか、半導体層６２と金属層６４の極性（親水性、疎水性）の違いの緩和に役割を果たす性質を有する。かかるＲ1及びＲ2は、本発明の目的を妨げない範囲で、置換基を有していてもよい。ここで、炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。これらのなかでは、半導体層６２と金属層６４とを強固に密着させる観点から、メチル基が好ましい。
【００３３】
アミノ酸やアミノ酸残基は、末端にカルボキシル基及びアミノ基（若しくはイミノ基）を有しているため、半導体層６２及び金属層６４の双方に対し、良好な反応性を有する。したがって、かかるアミノ酸、又はアミノ酸残基を含む化合物をリンカー分子として用いた場合、かかるリンカー分子を含む密着層６３を介して半導体層６２と金属層６４とを強く密着させることができる。
【００３４】
アミノ酸は、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸のいずれであってもよい。また、アミノ酸は、本発明の目的を妨げないものであれば、Ｌ体のアミノ酸であってもよく、Ｒ体のアミノ酸であってもよい。アミノ酸としては、特に限定されないが、例えば、システイン、リジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアミノ酸は、本発明の目的を妨げない範囲で、例えば、水酸基、ホルミル基、ピロリニル基、リン酸基、セレノール基等の置換基を有していてもよい。かかるアミノ酸のなかでは、半導体層６２と金属層６４とを強く密着させ、かつノイズの発生を効果的に抑制する観点から、システイン及びリジンが好ましく、リジンがより好ましい。
【００３５】
アミノ酸残基を含む化合物としては、特に限定されないが、例えば、ポリアミノ酸；単量体としてのアミノ酸と当該アミノ酸以外の単量体とを重合させて得られる化合物等が挙げられる。アミノ酸残基は、本発明の目的を妨げないものであれば、Ｌ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基であってもよく、Ｒ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基であってもよい。アミノ酸残基を含む化合物は、Ｌ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基及びＲ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基の両方を有していてもよく、Ｌ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基及びＲ体のアミノ酸由来のアミノ酸残基のいずれか一方のみを有していてもよい。アミノ酸残基としては、特に限定されないが、例えば、前述のアミノ酸に由来するアミノ酸残基等が挙げられる。かかるアミノ酸残基のなかでは、半導体層６２と金属層６４とを強く密着させ、かつノイズの発生を効果的に抑制する観点から、システイン残基及びリジン残基が好ましく、リジン残基がより好ましい。
【００３６】
ポリアミノ酸は、単量体としてのアミノ酸がペプチド結合を介して重合した化合物である。ポリアミノ酸は、１種類の単量体（アミノ酸）を重合させて得られた高分子化合物（単独重合体）であってもよく、２種類以上の単量体（アミノ酸）を重合させて得られた高分子化合物（共重合体）であってもよい。かかる単独重合体としては、特に限定されないが、例えば、ポリリジン等が挙げられる。また、共重合体としては、特に限定されないが、例えば、ペプチド、タンパク質等が挙げられる。なお、ポリアミノ酸を構成する単量体としてのアミノ酸がα位以外にもアミノ基又はカルボキシル基を有する場合、ポリアミノ酸は、本発明の目的を妨げない範囲で、α位のアミノ基（若しくはイミノ基）とα位以外の位置のカルボキシル基とのペプチド結合、又はα位のカルボキシル基とα位以外の位置のアミノ基（若しくはイミノ基）とのペプチド結合を有していてもよい。
【００３７】
これらのリンカー分子は、単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。本実施の形態では、作用電極６１が、かかる密着層６３を備えているため、かかる密着層６３を介して作用電極本体としての半導体層６２と後述の金属層６４との間をより強く密着させることができる。そのため、検出物質の検出の際に、捕捉物質によって検出物質の捕捉を行なう場合や、作用電極６１に対して、検出感度を向上させるためのブロッキング処理を施す場合においても、金属層６４が剥離しにくい。したがって、本実施の形態の作用電極基板を含む光電流検出チップによれば、高い再現性で、被検物質を検出することができる。なお、従来、半導体と金属とを密着させる手段としてチタンやクロムが用いられている。ところが、光電流検出用電極において、半導体層と金属層とを密着させるために、チタンやクロムを用いた場合、著しいノイズが発生することが本発明者らにより見出されている。しかしながら、本実施の形態のように、前記リンカー分子を含む密着層を用いた場合には、ノイズの発生を抑制することができる。したがって、本実施の形態の作用電極基板は、十分な検出感度を確保することができる点でも優れている。
【００３８】
金属層６４は、捕捉物質９０を固定化することができる金属から構成されている。かかる金属は、捕捉物質９０と共有結合することができる金属であることが好ましい。また、前記金属は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するに際して用いられる電解液によって溶解される金属であることが好ましい。前記金属としては、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ニッケル、水銀、ロジウム、ルテニウム、銅又はそれらの合金等が挙げられる。これらのなかでは、金及びパラジウムが好ましい。金属層６４の厚さは、捕捉物質を固定化するのに十分な厚さを確保する観点から、１ｎｍ以上、好ましくは２ｎｍ以上であり、金属から生じるバックグランド電流の発生を抑制する観点から、２０ｎｍ以下である。なお、金属層６４の厚さが２ｎｍ以下である場合、金属層６４は、密着層６３上でアイランド状に形成されることがある。しかしながら、この場合においても、捕捉物質を固定化するのに十分な表面積の金属層６４を確保することができればよい。一方、後述のブロッキング層は、ブロッキング剤が金属層６４の金属と反応することにより形成される。したがって、検出感度を向上させるために、金属層６４上にブロッキング層を設ける場合には、検出感度の向上の効果を十分に得る観点から、密着層６３の表面全体が金属層６４で覆われていることが好ましい。ただし、ブロッキング剤を固定することができる密着層６３を使用する場合は、この限りではない。
【００３９】
金属層６４の表面には、捕捉物質９０が固定化されている〔図５参照〕。かかる捕捉物質９０は、検出物質を捕捉する物質である。これにより、検出物質を作用電極６１の近傍に存在させることができるようになっている。捕捉物質９０は、検出物質の種類に応じて、適宜選択することができる。前記捕捉物質９０としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
【００４０】
本発明においては、より検出感度を向上させる観点から、図６に示されるように、金属層６４上における捕捉物質９０が固定化されていない部分（非固定部６４ａ）上に、ブロッキング剤からなるブロッキング層６５が形成されていてもよい。
【００４１】
対極６６は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この対極６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００４２】
参照電極６９は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この参照電極６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。なお、本実施の形態では、参照電極６９を設けているが、本発明においては、参照電極６９を設けなくてもよい。対極６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６６が参照電極６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６９を設けることが好ましい。
【００４３】
つぎに、間隔保持部材５０について、説明する。間隔保持部材５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材５０は、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９を取り囲むように配置されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。上基板３０と下基板４０との間には間隔保持部材５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極６１，６６，６９の間には試料や電解液を収容するための空間２０ａが形成されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。間隔保持部材５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム等のプラスチック製両面テープ等を用いることもできる。
【００４４】
さらに、本発明においては、作用電極本体は、半導体層と導電層とから構成されていてもよい。この場合、作用電極６１の電極リード７１は、導電層に接続される。ここで、用いることができる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。これらのなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズが好ましい。この場合の半導体層の厚さは、好ましくは０．１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
前記導電層は、導電性材料からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素系材料等が挙げられる。導電層の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１００ｎｍである。導電性が確保でき、かつ電極から生じる光電流（バックグランド電流）が最小となる膜厚が望ましい。なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドープした酸化インジウム（ＩＴＯ）、フッ素をドープした酸化スズ（ＦＴＯ）、アンチモンをドープした酸化スズ（ＡＴＯ）等が挙げられる。導電層は、例えば、当該導電層を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、前記半導体層６２の形成の際の膜形成方法と同様の方法が挙げられる。
【００４５】
また、本発明においては、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、同一の基板本体上に形成されていてもよい。すなわち、光電流検出チップは、基板本体３１ａに試料注入口３１ｂが形成された上基板３１〔図７（Ａ）参照〕と、基板本体４１ａに作用電極６１、対極６６及び参照電極６９が形成された下基板４１（この態様では、作用電極基板に対応）〔図７（Ｂ）参照〕とを有するものであってもよい。さらに、本発明においては、対極６６及び参照電極６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。すなわち、光電流検出チップは、基板本体３２ａに試料注入口３２ｂが形成された上基板３２〔図８（Ａ）参照〕と、基板本体４２ａに作用電極６１が形成された下基板４２（この態様では、作用電極基板に対応）〔図８（Ｂ）参照〕と、部材本体５１ａに対極６６及び参照電極６９が設けられた間隔保持部材５１〔図８（Ｃ）参照〕とを有するものであってもよい。この場合、対極６６及び参照電極６９の少なくともいずれかが間隔保持部材５１の部材本体５１ａに設けられていればよい。そして、上基板３２及び下基板４２のいずれかに、部材本体５１ａに設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００４６】
なお、本発明においては、作用電極を備えていない基板を構成する材料が、光透過性を有する材料であればよい。
【００４７】
［電極の製造方法］
本発明の電極の製造方法は、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極の製造方法であって、
（Ａ） 光励起により生じた電子を受容する半導体からなる電極本体上に、リンカー分子を含む密着層を形成する工程、及び
（Ｂ） 前記密着層上に、金属層を形成する工程
を含む方法である。
【００４８】
図９は、本発明の一実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。本実施の形態に係る電極の製造方法では、まず、基板本体３０ａ上に、作用電極本体としての半導体層６２を形成する（工程Ｓ１−１）。工程Ｓ１−１では、半導体層６２は、半導体層６２を構成する半導体の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、蒸着法、スパッタリング法、インプリント法、スクリーン印刷法、めっき処理法、ゾルゲル法、スピンコート法、浸漬法、気相蒸着法等が挙げられる。
【００４９】
つぎに、作用電極本体としての半導体層６２上に、密着層６３を形成する（工程Ｓ１−２）。工程Ｓ１−２では、密着層６３は、作用電極本体としての半導体層を形成した基板本体を、前記リンカー分子を含む溶液中に浸漬させること、インプリント法、スクリーン印刷法、スピンコート法、気相蒸着法、スプレー法、ディップコート法等により形成することができる。本実施の形態に係る電極の製造方法では、半導体層６２上に密着層を形成するため、次工程で形成する金属層６４と、作用電極本体としての半導体層との間をより強く密着させることができる。したがって、本実施の形態に係る電極の製造方法により得られた電極を有する光電流検出チップによれば、前述したように、高い再現性で被検物質を検出することができる。
【００５０】
つぎに、本実施の形態に係る電極の製造方法では、密着層６３上に、金属層６４を形成する（工程Ｓ１−２）。工程Ｓ１−２では、金属層６４は、例えば、金属の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、例えば、蒸着法、スパッタリング法、インプリント法、スクリーン印刷法、めっき処理法、ゾルゲル法等が挙げられる。
【００５１】
図１０は、本発明の他の実施の形態に係る電極の製造方法の処理手順を示す工程説明図である。本実施形態に係る電極の製造方法では、金属層６４の表面に捕捉物質９０が固定化され、かつ金属層６４における捕捉物質９０が固定化されていない部分（非固定部６４ａ）上にブロッキング層６５が形成された作用電極（図６参照）を得ることができる。本実施の形態に係る電極の製造方法において、工程Ｓ２−１〜工程Ｓ２−３は、前記工程Ｓ１−１〜工程Ｓ１−３と同様の操作によって行なうことができる。
【００５２】
本実施の形態に係る電極の製造方法では、工程Ｓ２−３の後、金属層６４上に、検出物質を捕捉する捕捉物質９０を固定化する（工程Ｓ２−４）。金属層６４上への捕捉物質９０の固定は、金属層６４に結合する結合基等を介して行なうことができる。前記結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基等が挙げられる。また、金属層６４の表面への捕捉物質９０の固定は、光硬化性樹脂や物理吸着により行なわれていてもよい。金属層６４上における捕捉物質９０の固定量は、特に限定されるものではなく、用途及び目的に応じて設定することができる。
【００５３】
その後、金属層６４上における捕捉物質９０が固定化されていない部分（非固定部６４ａ）を、ブロッキング剤によってブロッキングする（工程Ｓ２−５）。工程Ｓ２−５において、非固定部６４ａのブロッキングは、非固定部６４ａにブロッキング剤を接触させること、インプリント法、スクリーン印刷法、スピンコート法、気相蒸着法、スプレー法、ディップコート法等により行なうことができる。ブロッキング剤は、検出物質以外の物質が非固定部６４ａに非特異的に吸着するのを抑制するものであればよい。前記ブロッキング剤としては、例えば、トリエチレングリコールモノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル、１−メルカプトヘキサノール、２-メルカプトエタノール、メルカプトエタノール、ホスフィン〔ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン〕、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、脱脂粉乳（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、カゼイン（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、ゼラチン（例えば、使用濃度１〜１０質量％）、被検物質又は検出物質と結合しないタンパク質、被検物質又は検出物質と結合しない核酸、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ等）等の化合物や物質が挙げられる。前記ブロッキング剤は、前記化合物や物質を、水、緩衝液等の溶媒に溶解させた溶液であってもよい。この場合、溶液中における前記化合物の濃度は、前記化合物の種類等に応じて適宜設定することができる。また、本発明においては、前記ブロッキング剤として、市販のブロッキング剤、例えば、ナノビオテック（株）社製、商品名：ＮａｎｏＢｉｏ ｂｌｏｃｋｅｒ等を用いることもできる。
【００５４】
つぎに、工程Ｓ２−５後の基板本体を洗浄する（工程Ｓ２−６）。これにより、作用電極を有する基板（作用電極基板）を得ることができる。工程Ｓ２−６において、基板本体の洗浄には、捕捉物質の種類等に応じた洗浄剤を用いることができる。例えば、捕捉物質が核酸である場合、洗浄剤として、緩衝液、核酸のハイブリダイゼーションに用いられるハイブリダイゼーション用溶液等を用いることができる。また、捕捉物質がタンパク質である場合、洗浄剤として、緩衝液等を用いることができる。基板本体の洗浄は、基板本体を洗浄剤中に浸漬させること、洗浄剤で基板本体の表面を洗い流すこと等により行なうことができる。必要によっては、工程Ｓ２−４後に洗浄工程を行なってもよい。
【００５５】
以上のように、本発明によれば、簡単な操作で、前述した電極（作用電極）を得ることができる。
【００５６】
［被検物質の検出方法］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る電極（作用電極６１）を用いる被検物質の検出方法を説明する。図１１は、本発明の一実施の形態に係る電極を用いる被検物質の検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００５７】
図１１において、工程Ｓ３−１では、ユーザーは、被検物質を含む液体試料を、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。これにより、液体試料中の被検物質が光電流検出チップ２０を構成する上基板３０の作用電極６１中の捕捉物質９０によって捕捉される。
【００５８】
ここで、捕捉物質９０は、被検物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質が核酸である場合、捕捉物質９０は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質がリガンドである場合、捕捉物質９０は、かかるリガンドに対するレセプターであればよい。被検物質がレセプターである場合、捕捉物質９０は、かかるレセプターに対するリガンドであればよい。
【００５９】
捕捉物質９０による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質９０と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質９０と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質９０が前記核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質９０が前記核酸に対する抗体、前記タンパク質に対する抗体又は前記ペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。さらに、被検物質がリガンドであり、捕捉物質９０が前記リガンドに対するレセプターである場合や、被検物質がレセプターであり、捕捉物質９０が前記レセプターに対するリガンドである場合、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプターとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
【００６０】
かかる被検物質の検出方法では、前記密着層６３を有する作用電極が用いられているため、本工程Ｓ３−１に際して、被検物質を捕捉する捕捉物質９０が固定化された金属層６４の剥離が抑制される。したがって、高い再現性での被検物質の検出が可能になる。
【００６１】
つぎに、工程Ｓ３−２において、ユーザーは、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、光電流検出チップ２０内を洗浄する。これにより、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制することができる。かかる工程Ｓ３−２では、光電流検出チップ２０内の洗浄に際して、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）、精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）、エタノール等の有機溶媒等が用いられる。
【００６２】
つぎに、工程Ｓ３−３において、ユーザーは、被検物質に結合する結合物質と標識物質とを有する標識結合物質（検出物質）を含む液体を、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。これにより、標識結合物質を作用電極６１上に捕捉された被検物質に結合させ、当該被検物質を標識する。
【００６３】
標識結合物質は、被検物質に結合する結合物質と標識物質とから構成されている。標識物質は、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質として、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報、特願２００８−１５４１７９号公報等を参照することができる。
【００６４】
結合物質は、被検物質中において、捕捉物質９０と結合する物質であればよく、被検物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質が核酸である場合、結合物質は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質がタンパク質又はペプチドである場合、結合物質は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体であればよい。また、被検物質がリガンドである場合、結合物質は、かかるリガンドに対するレセプターであればよい。被検物質がレセプターである場合、結合物質は、かかるレセプターに対するリガンドであればよい。
【００６５】
工程Ｓ３−３では、被検物質に結合していない残部の標識結合物質は、光電流検出チップ２０内の液体中において、遊離した状態で存在している。したがって、工程Ｓ３−４において、ユーザーは、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより、液体を排出し、光電流検出チップ２０内を洗浄する。これにより、検出結果の特性を向上させることができる。なお、かかる洗浄工程は、行なわなくてもよい。かかる工程Ｓ３−４では、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）、精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）、エタノール等の有機溶媒が用いられる。
【００６６】
つぎに、工程Ｓ３−５において、ユーザーは、電解液を、光電流検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。前記電解液として、標識物質に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。また、電解液は、ゲル状であってもよく、固体であってもよい。
【００６７】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。電解液中における電解質の濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００６８】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類；１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００６９】
ここで、電解質がヨウ化物である場合、電解液の注入により、金属層６４を構成する金属、好ましくは金が溶解される。このとき、捕捉物質９０と被検物質と標識結合物質（検出物質）とは、作用電極６１上に存在し、標識結合物質中の標識物質と作用電極６１の半導体層６２との間で電子の授受が行なわれる。
【００７０】
前記電解液のなかでは、ヨウ素又はヨウ化物を含有する電解液が好ましい。
【００７１】
工程Ｓ３−１〜Ｓ３−５をユーザーが行なった後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に光電流検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された光電流検出チップ２０の電極リード７１，７２、７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、参照電極６９を基準として任意の電位が作用電極６１に印加される（工程Ｓ３−６）。電極に印加される電位は、検出物質に対する励起光が照射されていない場合の電流値（定常電流、暗電流）が小さく、検出物質から生じる光電流が最大となる電位が好ましい。電位は、対極に印加してもよく、作用電極に印加してもよい。
【００７２】
つぎに、工程Ｓ３−７において、検出装置１の光源１３により、作用電極６１上の標識物質に励起光が照射される。これにより、標識物質が励起し、電子を発生する。そして、発生した電子は、半導体層６２に移動する。その結果、作用電極６１と対極６６との間に電流が流れる。なお、本工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみが標識物質に照射されてもよい。
【００７３】
工程Ｓ３−８では、検出装置１の電流計１４により、作用電極６１と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質を定量することができる。
【００７４】
工程Ｓ３−９では、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された電流値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、液体試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。
【００７５】
工程Ｓ３−１０では、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００７６】
以上説明したように、本発明の一実施の形態に係る電極（作用電極６１）を用いる被検物質の検出方法では、工程Ｓ３−１における捕捉物質９０による被検物質の捕捉の際における金属層６４の剥離が抑制される。したがって、作用電極６１における捕捉物質９０の量が金属層６４の剥離に伴って変動することが抑制されるので、高い再現性での被検物質の検出が可能になる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
（製造例１）
シランカップリング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ａを得た。
【００７９】
（製造例２）
シランカップリング剤である３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ｂを得た。
【００８０】
（製造例３）
２４ヌクレオチド長のＤＮＡにチオール基を導入して、チオール化ＤＮＡを得た。得られたチオール化ＤＮＡを、その濃度が１μＭとなるように滅菌精製水に添加し、ＤＮＡ水溶液を得た。
【００８１】
（製造例４〜６）
トリエチレングリコールモノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル（ＳＨ−ＴＥＧ）を、その濃度が１ｍＭとなるようにＴＢＳ緩衝液〔組成：２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４〕に添加し、ＳＨ−ＴＥＧ水溶液を得た（製造例４）。また、メルカプトヘキサノール（ＭＣＨ）を、その濃度が１ｍＭとなるようにＴＢＳ緩衝液に添加し、ＭＣＨ水溶液を得た（製造例５）。さらに、市販のブロッキング剤〔ナノビオテック（株）社製、商品名：ＮａｎｏＢｉｏ ｂｌｏｃｋｅｒ〕を、製造例６のブロッキング剤として用いた。
【００８２】
（参考例１）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層（作用電極本体）を形成した。つぎに、前記半導体層に、電流計と接続するための作用電極リードを接続し、基板ａ１を得た。前記半導体層は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【００８３】
（２）金属層の形成
真空蒸着法により、前記（１）で形成した半導体層上に金薄膜（厚さ約２ｎｍ）からなる金属層を形成し、基板ａ２を得た。
【００８４】
（３）捕捉物質の固定
製造例３で得られたＤＮＡ水溶液７μＬを前記（２）で得られた基板ａ２の金属層上に滴下した。つぎに、基板ａ２の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、基板ａ２の上方から、カバーグラスをのせ、基板ａ２とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板ａ２を４℃で一晩静置して、金薄膜を構成する金と、捕捉物質としてのチオール化ＤＮＡとを共有結合させた。その後、基板ａ２の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板ａ３を得た。
【００８５】
（４）ブロッキング処理
基板ａ３の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例４で得られたブロッキング剤７μＬを滴下した。つぎに、前記基板ａ３の上方から、カバーグラスをのせ、基板ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板ａ３を４℃で一晩静置して、金属層における捕捉物質が固定化されていない部分をブロッキングした。その後、基板ａ３の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板ａ４を得た。
【００８６】
（５）洗浄
金属層上に固定化されていないチオール化ＤＮＡをさらに除去するため、以下のような操作で洗浄を行なった。基板ａ４の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置し、フッ素樹脂〔テフロン（登録商標）〕製のハイブリダイゼーション用のチャンバー（体積２０μＬ）を設置した。ハイブリダイゼーション用のチャンバーよって形成された空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液〔東洋紡績（株）製、商品名：ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕２０μＬを注入した。そして、基板ａ４を恒温槽（６５℃）中に２時間静置した。その後、前記空間より液体を排出した。さらに、前記空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを注入し、その後、前記空間から液体を排出した。これにより、ハイブリダイゼーション用のチャンバーが取り付けられた作用電極基板を得た。
【００８７】
（試験例１）
（１）ハイブリダイゼーション処理
ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを、参考例１で得られた作用電極基板に取り付けられたハイブリダイゼーション用のチャンバー内に注入した。その後、作用電極基板を恒温槽（６５℃）中に２．５時間静置した。つぎに、ハイブリダイゼーション用のチャンバーを電極上から取り外した。そして、作用電極基板を、洗浄溶液〔０．０１質量％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液〕０．５ｍＬで３回洗浄後、滅菌精製水０．５ｍＬで洗浄し、乾燥させた。
【００８８】
（２）金属層の安定性評価
前記（１）の後の作用電極基板の作用電極本体（半導体層）上の金属層の安定性を目視で評価した。その結果、金属層が完全に剥離していることがわかった。ハイブリダイゼーションによる被検物質の捕捉を行なう際に金属層の剥離が生じた場合、作用電極本体から金属層とともにこの金属層上の捕捉物質もなくなる。したがって、半導体層上に金属層を形成した作用電極基板（参考例１）を用いて被検物質の検出を行なった場合、検出感度及び測定の再現性が低くなると考えられる。
【００８９】
（実施例１）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層（作用電極本体）と、前記作用電極本体及び電流計を接続するための作用電極リードを形成し、基板Ａ１を得た。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【００９０】
（２）密着層の形成
製造例１で得られた溶液中で、前記（１）で得られた基板Ａ１を１時間浸漬させた。その後、基板Ａ１をトルエンで洗浄し、乾燥させた。これにより、半導体層上にＡＰＴＥＳの薄膜からなる密着層を形成した。
【００９１】
（３）金属層の形成
真空蒸着法により、前記（２）で形成した密着層上に金薄膜（厚さ約２ｎｍ）からなる金属層を形成し、基板Ａ２を得た。
【００９２】
（４）捕捉物質の固定
製造例３で得られたＤＮＡ水溶液７μＬを前記（３）で得られた基板Ａ２の金属層上に滴下した。つぎに、基板Ａ２の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、基板Ａ２の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ２とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ２を４℃で一晩静置して、金薄膜を構成する金と、捕捉物質としてのチオール化ＤＮＡとを共有結合させた。その後、基板Ａ２の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板Ａ３を得た。
【００９３】
（５）ブロッキング処理
基板Ａ３の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られたブロッキング剤７μＬを滴下した。つぎに、前記基板Ａ３の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ３を４℃で一晩静置して、金属層における捕捉物質が固定化されていない部分をブロッキングした。その後、基板Ａ３の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、基板Ａ４を得た。
【００９４】
（６）洗浄
金属層上に固定化されていないチオール化ＤＮＡをさらに除去するため、以下のような操作で洗浄を行なった。基板Ａ４の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。そして、前記シリコーンゴム上にハイブリダイゼーション用のチャンバー（体積２０μＬ）を設置した。ハイブリダイゼーション用のチャンバーによって形成された空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを注入した。そして、基板Ａ４を恒温槽（６５℃）中に２時間静置した。その後、前記空間より液体を排出した。さらに、前記空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液２０μＬを注入し、前記と同様に操作を行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【００９５】
（実施例２）
実施例１において、製造例５で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例６のブロッキング剤を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９６】
（実施例３）
実施例１において、ブロッキング処理を行なわなかったことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９７】
（実施例４）
実施例１において、製造例１で得られた溶液Ａの代わりに、製造例２で得られた溶液Ｂを用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９８】
（実施例５）
実施例４において、製造例５で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例６のブロッキング剤を用いたことを除き、実施例４と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【００９９】
（実施例６）
実施例４において、ブロッキング処理を行なわなかったことを除き、実施例４と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１００】
（比較例１）
参考例１において、製造例４で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例５のブロッキング剤を用いたことを除き、参考例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１０１】
（比較例２）
参考例１において、製造例４で得られたブロッキング剤の代わりに、製造例６のブロッキング剤を用いたことを除き、参考例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１０２】
（比較例３）
参考例１において、ブロッキング処理を行なわなかったことを除き、参考例１と同様に操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１０３】
（試験例２）
試験例１と同様の操作を行ない、実施例１〜６並びに比較例１〜３それぞれで得られた作用電極基板の作用電極上の金属層の安定性を評価した。評価基準は、以下のとおりである。評価の結果を表１に示す。
【０１０４】
〔評価基準〕
○ 金属層が完全に残っている。
× 金属層の剥離が見られる。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
表１に示された結果から、半導体層と金属層との間に密着層を形成した場合（実施例１〜６）、核酸間のハイブリダイゼーションに用いる液相中においても、金属層の剥離が見られず、金属層は良好な状態で維持されていることがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１〜６それぞれで得られた作用電極基板を被検物質の検出に用いた場合、高い検出感度で、かつ高い再現性で被検物質を検出することができることが示唆される。実施例１〜６において、密着層に用いられたシランカップリング剤は、半導体層及び金属層の両方と結合する化合物である。したがって、半導体層及び金属層の両方と結合する化合物からなる密着層を半導体層と金属層との間に有する光電流検出用電極によれば、金属層の剥離が抑制されることから、高い検出感度で、かつ高い再現性で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１０７】
一方、表１に示された結果から半導体層と金属層との間に密着層を形成していない場合（比較例１〜３）、金属層の剥離が見られることがわかる。したがって、これらの結果から、比較例１〜３それぞれで得られた作用電極基板を被検物質の検出に用いた場合、検出感度及び再現性が低くなることが予想される。
【０１０８】
（製造例７）
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体溶液〔ダコ社製、商品名：Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、カタログ番号：Ｆ０４７９〕２０μＬを、還元剤であるトリス(２−クロロエチル)ホスフェート（ＴＣＥＰ）〔ピアス（ＰＩＥＲＣＥ）社製、カタログ番号：７７７１２〕２０μＬと混合した。得られた混合物を１８００ｒｐｍ（回転／分）で室温９０分間振とうさせ、抗マウスイムノグロブリン抗体をＦａｂ化し、Ｆａｂ化抗体（Ｆａｂ化抗マウスイムノグロブリン抗体）を得た。その後、前記混合物の上清６μＬとＴＢＳ緩衝液５９４μＬとを混合し、Ｆａｂ化抗体水溶液を得た。
【０１０９】
（実施例７）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体３０ａ上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層６２（図１２参照）（作用電極本体）と、前記作用電極本体と電流計とを接続するための作用電極リードを形成し、基板Ａ１を得た。前記半導体層６２は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【０１１０】
（２）密着層の形成
製造例１で得られた溶液中で、前記（１）で得られた基板Ａ１を１時間浸漬させた。その後、基板Ａをトルエンで洗浄し、乾燥させた。これにより、半導体層６２上にシランカップリング剤であるＡＰＴＥＳの薄膜からなる密着層６３（図１２参照）を形成した。
【０１１１】
（３）金属層の形成
真空蒸着法により、前記（２）で形成した密着層６３上に金薄膜（厚さ約２ｎｍ）からなる金属層６４（図１２参照）を形成し、基板Ａ２を得た。
【０１１２】
（４）捕捉物質の固定
基板Ａ２の金属層６４の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。そして、前記シリコーンゴム上に、チャンバー（体積２０μＬ）を設置した。チャンバーよって形成された空間に、製造例７で得られたＦａｂ化抗体水溶液２０μＬを注入した。その後、基板Ａ２を４℃で一晩静置した。これにより、捕捉物質９０（Ｆａｂ化抗体）と金属層６４を構成する金とを共有結合させた。その後、チャンバーを装着したまま、基板Ａ２の金属層６４をＴＢＳ緩衝液２０μＬで洗浄した。これにより、基板Ａ３を得た。
【０１１３】
（５）ブロッキング処理
基板Ａ３の金属層６４の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られたブロッキング剤７μＬを滴下した。つぎに、前記基板Ａ３の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ３とシリコーンゴムとに囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ３を４℃で一晩静置して、金属層６４における捕捉物質９０（Ｆａｂ化抗体）が固定化されていない部分の表面にブロッキング層６５（図１２参照）を形成させた。その後、基板Ａ３の金属層６４をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。これにより、作用電極基板を得た。
【０１１４】
（製造例８〜１１）
被検物質Ｓとしてのマウスイムノグロブリンを、その濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ（製造例８）、１ｎｇ／ｍＬ（製造例９）、１０ｎｇ／ｍＬ（製造例１０）又は１００ｎｇ／ｍＬ（製造例１１）となるように、１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液〔トリス緩衝溶液（ＴＢＳ−Ｔ）：０．１体積％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有するトリス緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）〕に添加し、被検物質を含有する液体試料を得た。
【０１１５】
（製造例１２）
２４ヌクレオチド長のＤＮＡ９５に、ビオチン９４と光化学的に活性な標識物質９６（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０）を導入して、標識ビオチン化ＤＮＡ９７を得た。得られた標識ビオチン化ＤＮＡ９７を、その濃度が１００ｎＭとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加し、標識溶液を得た。
【０１１６】
（製造例１３）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、溶解誘引電解液を得た。なお、前記ヨウ素及びテトラプロピルアンモニウムヨーダイドは、金を溶解させることができる。
【０１１７】
（製造例１４）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜からなる対極と、厚さ２００ｎｍの白金薄膜からなる参照電極と、前記対極及び参照電極と電流計とを接続するための電極リードを形成した。これにより、対極基板を得た。
【０１１８】
（試験例３）
（１）被検物質の捕捉
製造例８〜１１それぞれで得られた液体試料２０μＬを、実施例７で得られた作用電極基板に取り付けられたチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で１．５時間静置し、捕捉物質９０（Ｆａｂ化抗体）により、被検物質Ｓを捕捉させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬで洗浄した。
【０１１９】
（２）標識
ビオチン標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ビオチン標識２次抗体）溶液〔シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｂ７１５１〕を、２０００倍の体積となるように、１質量％ウシ血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔで希釈し、希釈抗体溶液を得た。得られた希釈抗体溶液２０μＬを、前記（１）の後の作用電極基板のチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で３０分間静置して、ビオチン標識２次抗体９２と、作用電極上に捕捉された被検物質Ｓとを反応させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬで洗浄した。
【０１２０】
ストレプトアビジン含有液〔ベクター（ＶＥＣＴＯＲ）社製、製品番号：ＳＡ−５０００〕を、５００倍の体積となるようにＴＢＳ−Ｔで希釈し、ストレプトアビジン含有希釈液を得た。得られたストレプトアビジン含有希釈液２０μＬを、作用電極基板のチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で３０分間静置して、ストレプトアビジン９３と、作用電極上に存在するビオチン標識２次抗体９２とを反応させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬで洗浄した。
【０１２１】
製造例１２で得られた標識溶液２０μＬを、作用電極基板のチャンバー内に注入した。つぎに、作用電極基板を室温で１．５時間静置して、作用電極上に固定されたストレプトアビジン９４に標識ビオチン化ＤＮＡ９７を結合させた（図１２参照）。その後、チャンバーを装着したまま、作用電極をＴＢＳ−Ｔ２０μＬと滅菌精製水２０μＬとで洗浄して、未結合の標識物質を除去した。さらに、チャンバーを取り外し、滅菌精製水０．５ｍＬで、作用電極を３回洗浄後、乾燥させた。
【０１２２】
（３）光電流の測定
前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例１３で得られた電解液１２μＬを充填した。そして、作用電極基板の上方から、製造例１４で得られた対極基板をのせ、前記電解液が充填された空間を密封した。これにより、作用電極と対極と参照電極を電解液に接触させた。つぎに、電極リードを電流計に接続した。
【０１２３】
作用電極に対して、参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。これと同時に、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源〔コヒレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社製、商品名Ｃｕｂｅ７８５〕からレーザー光（波長７８５ｎｍ、出力１３ｍＷ）を照射した。このとき、レーザー光を所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。そして、レーザー光を２０回点滅させたときのレーザー光点灯時（ｏｎの時）に作用電極と対極との間を流れる光電流を測定した。試験例３において、被検物質濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフを図１３に示す。
【０１２４】
図１３に示された結果から、捕捉物質として抗体（Ｆａｂ化抗マウスイムノグロブリン抗体）を用い、被験物質としてその抗原を抗原抗体反応によって検出する際に、半導体層６２及び金属層６４の両方と結合する化合物であるシランカップリング剤からなる密着層６３を半導体層６２と金属層６４との間に有する作用電極基板を用いた場合であっても、ノイズは光電流の検出の妨げにはならない程度に抑制されており、しかも、被検物質濃度に依存的に光電流が増加することがわかる。
【０１２５】
（製造例１５）
Ｌ−システインを、その濃度が１ｍＭとなるようにＴＢＳ緩衝液に添加し、溶液Ｃを得た。
【０１２６】
（製造例１６）
ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩〔シグマアルドリッチ社製、カタログ番号：Ｐ２６５８−２５ＭＧ、α−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩、粘度平均分子量：１５０００−３００００Ｄａ〕を、その濃度が１００μＭとなるようにＰＢＳに添加し、溶液Ｄを得た。
【０１２７】
（実施例８）
（１）作用電極本体の形成
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ約２００ｎｍ）からなる半導体層（作用電極本体）と、作用電極本体及び電流計を接続するための作用電極リードとを形成し、基板Ａ１を得た。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。
【０１２８】
（２）密着層の形成
（１）で得られた基板Ａ１の半導体層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．２ｍｍ）を配置した。その後、この基板Ａ１とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例１５で得られた溶液Ｃ３０μＬを滴下した後、基板Ａ１を４℃で一晩静置した。その後、基板Ａ１をＴＢＳ緩衝液で洗浄し、風乾した。これにより、半導体層上に、Ｌ−システインの薄膜からなる密着層を形成した。
【０１２９】
（３）金属層の形成
真空蒸着法により、（２）で形成した密着層上に金薄膜（厚さ２ｎｍ）からなる金属層をさらに形成し、基板Ａ２を得た。
【０１３０】
（４）捕捉物質の固定
製造例３で得られたＤＮＡ水溶液１２μＬを、（３）で得られた基板Ａ２の金属層上に滴下した。つぎに、基板Ａ２の金属層の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、基板Ａ２の上方から、カバーグラスをのせ、基板Ａ２とシリコーンゴムとで囲まれた空間を密封した。つぎに、基板Ａ２を４℃で一晩静置して、金薄膜を構成する金と、捕捉物質としてのチオール化ＤＮＡとを共有結合させた。その後、基板Ａ２の金属層をＴＢＳ緩衝液で洗浄した。
【０１３１】
その後、金属膜および半導体層上に非特異的に吸着したプローブＤＮＡを取り除くため、ＤＮＡプローブが固定された基板の表面を以下のようにして洗浄した。まず、シリコーンゴム上にハイブリダイゼーション用のチャンバー（体積２０μＬ）を設置した。ハイブリダイゼーション用のチャンバーによって形成された空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液〔東洋紡績（株）製、商品名：ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕２０μＬを注入した。そして、基板Ａ２を恒温槽（４５℃）中に２時間静置した。その後、前記空間より液体を排出した。さらに、前記空間に、ハイブリダイゼーション用水溶液１００μＬを注入し、前記と同様に操作を行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【０１３２】
（実施例９）
実施例８において、製造例１５で得られた溶液Ｃの代わりに、製造例１６で得られた溶液Ｄを用いたことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１３３】
（比較例４）
実施例８において、製造例１５で得られた溶液Ｃの代わりに、ＴＢＳ緩衝液を用いたことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１３４】
（比較例５）
実施例８において、製造例１５で得られた溶液Ｃを用いる代わりに何も用いなかったことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、作用電極基板を得た。
【０１３５】
（試験例４）
（１）ハイブリダイゼーション処理
ハイブリダイゼーション用水溶液又は１０ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション用水溶液１００μＬを、実施例８及び９並びに比較例４及び５それぞれで得られた作用電極基板に取り付けられたハイブリダイゼーション用のチャンバー内に注入した。
【０１３６】
その後、作用電極基板を恒温槽（４５℃）中に４時間静置した。つぎに、ハイブリダイゼーション用のチャンバーを電極上から取り外した。そして、作用電極基板を、洗浄溶液〔０．０１質量％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液〕及び滅菌精製水で洗浄し、乾燥させた。
【０１３７】
（２）金属層の安定性評価
試験例１と同様の操作を行ない、実施例８及び９並びに比較例４及び５それぞれで得られた作用電極基板の作用電極上の金属層の安定性を評価した。評価基準は、以下のとおりである。評価の結果を表２に示す。
【０１３８】
〔評価基準〕
○ 金属層が完全に残っている。
× 金属層の剥離が見られる。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
表２に示された結果から、リンカー分子としてのＬ−システイン又はポリ−Ｌ−リジンからなる密着層を半導体層と金属層との間に形成した場合（実施例８及び９）、金属層の剥離が見られず、金属層は良好な状態で維持されていることがわかる。したがって、これらの結果から、リンカー分子として半導体層及び金属層の両方と結合する化合物であるＬ-システイン等のアミノ酸又はポリ−Ｌ−リジン等のポリアミノ酸が用いられた作用電極基板によれば、高い検出感度で、かつ高い再現性で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１４１】
（試験例５）
（１）ハイブリダイゼーション処理
ハイブリダイゼーション用水溶液（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの濃度：０ｎＭ）又は１０ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション用水溶液１００μＬを、実施例８及び９並びに比較例４及び５それぞれで得られた作用電極基板に取り付けられたハイブリダイゼーション用のチャンバー内に注入した。
【０１４２】
その後、作用電極基板を恒温槽（４５℃）中に４時間静置した。つぎに、ハイブリダイゼーション用のチャンバーを電極上から取り外した。そして、作用電極基板を、洗浄溶液〔０．０１質量％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液〕及び滅菌精製水で洗浄し、乾燥させた。
【０１４３】
（２）被験物質の誘引
（１）を行なった後の作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとによって囲まれた空間に、製造例１３で得られた溶解誘引電解液１２．５μＬを注入した。つぎに、作用電極基板の上方から、製造例１４で得た対極基板をのせ、溶解誘引電解液が充填された空間を密封した。これにより、作用電極本体上の金薄膜と対極と参照電極とを溶解誘引電解液に接触させ、室温で５分間静置した。つぎに、電極リードを電流計に接続した。
【０１４４】
（３）光電流の測定
作用電極に対して、参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。これと同時に、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源からレーザー光（波長約７８５ｎｍ、出力約１３ｍＷ）を照射した。このとき、レーザー光を所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。そして、レーザー光を２０回点滅させたときのレーザー光点灯時（ｏｎの時）に作用電極と対極との間を流れる光電流を測定した。試験例５において、実施例８及び９それぞれで得られた作用電極基板を用い、光電流を測定した結果を図１５に示す。図中、黒色バーはハイブリダイゼーション用水溶液（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの濃度：０ｎＭ）を用いたときの光電流値、白色バーは１０ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション用水溶液を用いたときの光電流値を示す。また、図中、エラーバーは、同一の作用電極上の３点で得られた光電流値の標準偏差を示す。さらに、図中、「ＤＮＡ」は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを示す。
【０１４５】
図１５に示された結果から、リンカー分子としてポリ−Ｌ−リジンが用いられた作用電極基板（実施例８）及びリンカー分子としてＬ−システインが用いられた作用電極基板（実施例８）のいずれを用いた場合であっても、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０に基づく光電流を良好に検出することができることがわかる。したがって、これらの結果から、リンカー分子としてＬ-システイン等のアミノ酸又はポリ−Ｌ−リジン等のポリアミノ酸が用いられた作用電極基板によれば、被検物質を良好に検出することができることが示唆される。
【０１４６】
また、図１５に示された結果から、リンカー分子としてポリ−Ｌ−リジンが用いられた作用電極基板（実施例９）を用いたときのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０に基づく光電流は、リンカー分子としてＬ−システインが用いられた作用電極基板（実施例８）を用いたときのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０に基づく光電流と比べて大きいことがわかる。しかも、リンカー分子としてポリ−Ｌ−リジンが用いられた作用電極基板（実施例９）を用いたときのシグナル−ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、リンカー分子としてＬ−システインが用いられた作用電極基板（実施例８）を用いたときのＳ／Ｎと比べて大きいことがわかる。したがって、これらの結果から、被検物質を高い検出感度で検出する観点から、リンカー分子は、Ｌ−システインよりもポリ−Ｌ−リジンが好ましいことがわかる。
【０１４７】
（実験例１）
（１）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、ガラス（ＳｉＯ2）からなる基板本体の表面に、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の薄膜（厚さ約２００ｎｍ）を形成し、さらにその上にアンチモンドープ酸化スズ（ＡＴＯ）の薄膜（厚さ約１００ｎｍ）を形成し、作用電極１を得た。また、作用電極１上に、酸化チタン（ＴｉＯ2）の薄膜（厚さ約１０ｎｍ）を形成し、作用電極２を得た。酸化チタンは、従来、半導体と金属とを密着させるために用いられている。
【０１４８】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例１３で得られた電解液１２μＬを充填した。そして、作用電極基板の上方から、製造例１４で得られた対極基板をのせ、前記電解液が充填された空間を密封した。これにより、作用電極と対極と参照電極を電解液に接触させた。つぎに、電極リードを電流計に接続した。
【０１４９】
作用電極に対して、参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。これと同時に、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源から波長４７３ｎｍのレーザー光〔出力１３ｍＷ、使用光源：フォトップ・スーテック（Ｐｈｏｔｏｐ Ｓｕｗｔｅｃｈ）社製、商品名：ＤＰＢＬ−９０５０〕、波長６４０ｎｍのレーザー光〔出力１３ｍＷ、使用光源：コヘレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社製、商品名：Ｃｕｂｅ６４０〕又は波長７８５ｎｍのレーザー光〔出力１３ｍＷ、使用光源：コヘレント（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）社製、商品名：Ｃｕｂｅ７８５〕を照射した。このとき、レーザー光を所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。そして、レーザー光を２０回点滅させたときのレーザー光点灯時（ｏｎの時）に作用電極と対極との間を流れる光電流を測定した。実験例１において、光電流を測定した結果を示すグラフを図１４に示す。実験番号１は作用電極２に対して、波長４７３ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号２は作用電極２に対して、波長６４０ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号３は作用電極２に対して、波長７８５ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号４は作用電極１に対して、波長４７３ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流、実験番号５は作用電極１に対して、波長６４０ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流及び実験番号６は作用電極１に対して、波長７８５ｎｍのレーザー光を照射したときの作用電極由来の光電流を示す。
【０１５０】
図１４に示された結果から、酸化チタンからなる薄膜を有する作用電極２（実験番号１〜３）では、酸化チタンからなる薄膜を有しない作用電極１（実験番号４〜６）と比べて、作用電極由来の光電流値が１０倍以上に増大することがわかる。この結果より、光電流の検出に用いる作用電極基板において、半導体層と金属層とを密着させる密着層として酸化チタンからなる薄膜を用いた場合、作用電極由来の光電流値が増大してしまい、結果としてＳ／Ｎの著しい低下を招くことが示唆される。したがって、従来、半導体と金属とを密着させるために用いられているチタンは、光電流の検出に用いる作用電極基板においては、金属層を安定的に維持するための密着層として使用困難であることが示唆される。
【０１５１】
以上の結果から、本発明の電極は、半導体層と金属層との間にリンカー分子からなる密着層を有しているので、かかる密着層を介して半導体層と金属層との間をより強く密着させることができることがわかる。そのため、検出物質の検出の際に、捕捉物質によって検出物質の捕捉を行なう場合や、作用電極に対して、検出感度を向上させるためのブロッキング処理を施した場合であっても、金属層が剥離しにくくなる。したがって、光化学的検出方法において、本発明の電極を用いることで、高い再現性で被検物質を検出することができることがわかる。
【符号の説明】
【０１５２】
１ 検出装置
１１ チップ受入部
１２ ディスプレイ
１３ 光源
１４ 電流計
１５ 電源
１６ Ａ／Ｄ変換部
１７ 制御部
２０ 光電流検出チップ
２０ａ 空間
３０ 上基板
３０ａ 基板本体
３０ｂ 試料注入口
３１ 上基板
３１ａ 基板本体
３１ｂ 試料注入口
３２ 上基板
３２ａ 基板本体
３２ｂ 試料注入口
４０ 下基板
４１ 下基板
４２ 下基板
４０ａ 基板本体
４１ａ 基板本体
４２ａ 基板本体
５０ 間隔保持部材
５１ 間隔保持部材
５１ａ 部材本体
６１ 作用電極
６２ 半導体層（作用電極本体）
６３ 密着層
６４ 金属層
６４ａ 非固定部
６５ ブロッキング層
６６ 対極
６９ 参照電極
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
９０ 捕捉物質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極であって、
励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体と、
前記電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層と、
前記密着層上に形成された金属からなる金属層と
を含む光電流検出用電極。
【請求項２】
前記金属層上に、検出物質を捕捉する捕捉物質がさらに固定化されてなる、請求項１に記載の電極。
【請求項３】
前記金属層上における前記捕捉物質が固定化されていない部分がブロッキング剤によってブロッキングされてなる、請求項２に記載の電極。
【請求項４】
前記リンカー分子が、シランカップリング剤、チタンカップリング剤及び式（１）：
Ｒ1−Ｘ−Ｒ2 （１）
〔式中、Ｒ1はシラノール基、リン酸基、チオール基又はカルボキシル基を示し、Ｒ2はアミノ基、チオール基、炭素数１〜４のアルキル基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、エポキシ基、メタクリロイル基、アクリロイル基、又はビニル基を示し、Ｘは式（２）：
（ＣＨ2）m （２）
（式中、ｍは１〜２０の整数を示す）又は式（３）：
【化１】
（式中、ｎは１〜１００の整数を示す）
を示し、式（１）で示される分子中にアミド結合、エステル結合、エーテル結合又はジチオール結合を有していてもよい〕で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１つである、請求項１に記載の電極。
【請求項５】
前記リンカー分子が、アミノ酸、又はアミノ酸残基を含む化合物である、請求項１に記載の電極。
【請求項６】
前記金属層が、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するに際して用いられる電解液によって溶解される金属からなる、請求項１に記載の電極。
【請求項７】
前記金属は、金及びパラジウムからなる群より選択された少なくとも１つの金属である、請求項６に記載の電極。
【請求項８】
光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するのに用いられる作用電極基板であって、
基板本体と、
光電流検出用電極と
を含み、
光電流検出用電極は、前記基板本体上に形成され、励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体、この電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層、及びこの密着層上に形成された金属からなる金属層を有する、作用電極基板。
【請求項９】
前記金属層上に、検出物質を捕捉する捕捉物質がさらに固定化されてなる、請求項８に記載の作用電極基板。
【請求項１０】
前記金属層上における前記捕捉物質が固定化されていない部分がブロッキング剤によってブロッキングされてなる、請求項９に記載の作用電極基板。
【請求項１１】
光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極の製造方法であって、
光励起により生じた電子を受容する半導体からなる電極本体上に、リンカー分子を含む密着層を形成する工程、及び
前記密着層上に、金属層を形成する工程
を含む、電極の製造方法。
【請求項１２】
前記金属層上に、検出物質を捕捉する捕捉物質を固定化する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属層上における前記捕捉物質が固定化されていない部分を、ブロッキング剤によってブロッキングする工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極であって、
励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体と、
前記電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層と、
前記密着層上に形成された金属からなる金属層と
を含む光電流検出用電極。
【請求項２】
前記金属層上に、検出物質を捕捉する捕捉物質がさらに固定化されてなる、請求項１に記載の電極。
【請求項３】
前記金属層上における前記捕捉物質が固定化されていない部分がブロッキング剤によってブロッキングされてなる、請求項２に記載の電極。
【請求項４】
前記リンカー分子が、シランカップリング剤、チタンカップリング剤及び式（１）：
Ｒ1−Ｘ−Ｒ2 （１）
〔式中、Ｒ1はシラノール基、リン酸基、チオール基又はカルボキシル基を示し、Ｒ2はアミノ基、チオール基、炭素数１〜４のアルキル基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、エポキシ基、メタクリロイル基、アクリロイル基、又はビニル基を示し、Ｘは式（２）：
（ＣＨ2）m （２）
（式中、ｍは１〜２０の整数を示す）又は式（３）：
【化１】
（式中、ｎは１〜１００の整数を示す）
を示し、式（１）で示される分子中にアミド結合、エステル結合、エーテル結合又はジチオール結合を有していてもよい〕で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１つである、請求項１に記載の電極。
【請求項５】
前記リンカー分子が、アミノ酸、又はアミノ酸残基を含む化合物である、請求項１に記載の電極。
【請求項６】
前記金属層が、光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するに際して用いられる電解液によって溶解される金属からなる、請求項１に記載の電極。
【請求項７】
前記金属は、金及びパラジウムからなる群より選択された少なくとも１つの金属である、請求項６に記載の電極。
【請求項８】
光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するのに用いられる作用電極基板であって、
基板本体と、
光電流検出用電極と
を含み、
光電流検出用電極は、前記基板本体上に形成され、励起光が照射されることにより前記検出物質から生じた電子を受容する半導体からなる電極本体、この電極本体上に形成されたリンカー分子を含む密着層、及びこの密着層上に形成された金属からなる金属層を有する、作用電極基板。
【請求項９】
前記金属層上に、検出物質を捕捉する捕捉物質がさらに固定化されてなる、請求項８に記載の作用電極基板。
【請求項１０】
前記金属層上における前記捕捉物質が固定化されていない部分がブロッキング剤によってブロッキングされてなる、請求項９に記載の作用電極基板。
【請求項１１】
光励起により電子を生じる検出物質を光電気化学的に検出するために用いられる光電流検出用電極の製造方法であって、
光励起により生じた電子を受容する半導体からなる電極本体上に、リンカー分子を含む密着層を形成する工程、及び
前記密着層上に、金属層を形成する工程
を含む、電極の製造方法。
【請求項１２】
前記金属層上に、検出物質を捕捉する捕捉物質を固定化する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属層上における前記捕捉物質が固定化されていない部分を、ブロッキング剤によってブロッキングする工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−１５００９７（Ｐ２０１２−１５００９７Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５７３３２（Ｐ２０１１−２５７３３２）
【出願日】平成２３年１１月２５日（２０１１．１１．２５）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月２５日（２０１１．１１．２５）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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