光音響イメージング用造影剤
【課題】 本発明は、発生する音響波の強度が大きい光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 ６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコールと、を有する光音響イメージング用造影剤において、前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【解決手段】 ６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコールと、を有する光音響イメージング用造影剤において、前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＲＩ用造影剤であるリゾビスト（登録商標）は、複数の酸化鉄粒子を多糖類のデキストランで被覆したものであり、音響波を発生することが知られている（非特許文献１）。したがって、リゾビスト（登録商標）は光音響イメージング用造影剤として用いることができる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ Ｔｅｃｈ２００９； ５４：ｐｐ．８３−８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、リゾビストは音響波を発生するものとして酸化鉄粒子のみを有するため、リゾビストから発生する音響波の強度は小さく、より大きい強度の音響波を発生する光音響イメージング用造影剤が求められていた。そこで本発明は、発生する音響波の強度が大きい光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコールと、を有する光音響イメージング用造影剤において、前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明者らが検討した結果、粒子にポリエチレングリコールが０．４０分子／ｎｍ２以上の密度で結合している場合、０．４０分子／ｎｍ２未満の密度で結合している場合に比べて、より大きい強度の音響波を発生することを発見した。したがって、本発明によれば、大きい強度の音響波を発生する光音響イメージング用造影剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１における、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子の光音響信号強度の測定結果を示すグラフである。
【図２】本実施例２における、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子の、ＰＥＧの結合密度と光音響信号強度の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０００９】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤（以下、造影剤と略す）は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、以下、ＰＥＧと略す）とを有する。そして、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする。本実施形態において、ＰＥＧの結合密度が０．４６分子／ｎｍ２以上であることが好ましい。なお、本実施形態において、ＰＥＧの結合密度が８．０分子／ｎｍ２以下であることが好ましい。 粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上である場合、結合密度が０．４０分子／ｎｍ２未満である場合や、粒子にＰＥＧが結合していない場合に比べて、音響波の強度が大きい。
【００１０】
さらに、本実施形態に係る造影剤は、粒子にＰＥＧが結合しているので、血中のタンパク質などの非特異的吸着を抑制することができると考えられる。
【００１１】
本実施形態に係る造影剤の粒径は、１５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。造影剤の粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの造影剤を集積させることができる。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体にパルス光を照射すると、腫瘍部位から発せられる光音響信号の強度は正常部位から発せられる光音響信号の強度よりも大きくなる。したがって、造影剤の粒径を１０００ｎｍ以下とすることにより、腫瘍部位を特異的に検出することができる。また、造影剤の粒径は５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。造影剤の粒径が２００ｎｍ以下であると、造影剤が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
【００１２】
なお、本実施形態に係る造影剤は、一次粒子でもよいし、二次粒子でもよい。
本実施形態において造影剤の粒径は以下のようにして測定することができる。動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定する。例えば、上記装置を用いて１００回の積算を５回行い、算出された５つのデータの平均をとることによって求めることができる。
【００１３】
（粒子）
本実施形態における粒子は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上であれば特に限定されない。また、本実施形態における粒子は６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０２０Ｍ−１ｃｍ−１以下であることが好ましい。
【００１４】
本実施形態に係る粒子の例として、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上を有する、金属酸化物、金属、その他の無機材料、有機色素の少なくともいずれか一種を有するものが挙げられる。
【００１５】
上記の金属酸化物としては、例えば、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）、酸化マグネシウム、酸化アルミニウム、二酸化ケイ素、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化マンガン、酸化ホウ素を挙げることが出来る。上記の金属としては、例えば、金、銀、銅、白金を挙げることが出来る。また、金、銀、銅、白金の混成によるコロイドを用いることも可能である。上記のその他の無機材料としては、例えば、硫化カドミウム、セレン化亜鉛、セレン化カドミウム、テルル化亜鉛、テルル化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉛、カーボンブラック、フラーレン、カーボンナノチューブ、シュウ酸鉄を挙げることが出来る。
【００１６】
上記の有機色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素を挙げることが出来る。上記のポルフィリン系色素としては、例えば、処方せん医薬品であるフォトフリン（ワイス株式会社製）、レザフィリン（明治製菓株式会社製）、ビスダイン（ノバルティス ファーマ株式会社製）を挙げることが出来る。上記のシアニン系色素としては、例えば、インドシアニングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（インビトロジェン社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社製）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）系色素（ピアス・バイオテクノロジー社製）、ＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｙｅ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を挙げることが出来る。上記のフタロシアニン系色素としては、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、２，１１，２０，２９−Ｔｅｔｒａ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）を挙げることが出来る。上記のＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素としては、例えば、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７５０ Ｂｉｓ − ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ， ｉｓｏｍｅｒ ＩＩ ＴＥＡ ｓａｌｔを挙げることが出来る。
【００１７】
本実施形態に係る粒子は、酸化鉄粒子を有することが好ましい。本実施形態において、酸化鉄粒子は市販のものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。合成する方法として例えば、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２５．５ｇ）とＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（１０．２ｇ）を混合、溶解した水溶液（６００ｍｌ）と、粉末状デキストラン（平均分子量１００００ Ｄａ、３６０ｇ）と、濃度３０％のアンモニア水溶液（３０ｍｌ）を用いることで、デキストランで被覆された酸化鉄粒子のコロイド溶液を調製することができる。
【００１８】
本実施形態に係る粒子は、上記の金属酸化物、金属、その他の無機材料、有機色素以外に、粒子の水中での分散性を上げるための分散剤として、あるいは、粒子を構成する材料の密度を上げるためのバインダとして、多糖類、合成高分子、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、シリカ、炭酸塩、ヒドロキシアパタイトなどの材料を有していてもよい。これらの材料は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上でなくてもよい。
【００１９】
また、本実施形態に係る粒子はこれらを、単独で有していてもよく、複数種を有していてもよい。
【００２０】
上記の多糖類としては、例えば、デキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン、キトサン、キシログルカン、ヒアルロン酸、アルギン酸、水溶性セルロース、でんぷん、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、及びこれらの誘導体を挙げることができる。
【００２１】
上記の合成高分子としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンデンドリマーなどのアミノ基を有する高分子、ポリビニルアルコールなどのヒドロキシル基を有する高分子、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸などのカルボキシル基を有する高分子、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−コーグリコリド）、ポリε−カプロラクトンからなる群より選ばれる疎水性セグメントを含む高分子を挙げることができる。
【００２２】
上記のリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンを挙げることができる。
【００２３】
上記の脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、ラウロレイン酸、フィセテリン酸、ミシストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸などの不飽和脂肪酸、イソラウリン酸、イソミリスチン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸などの分岐脂肪酸を挙げることができる。
【００２４】
上記の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキル硫化塩を挙げることができる。
【００２５】
本実施形態に係る粒子として好ましくは、カルボキシル基、アミノ基、マレイミド基、ヒドロキシル基などの官能基を有することが好ましい。本実施形態に係る粒子として、例えば、マレイミド基を有する酸化鉄粒子が挙げられる。
【００２６】
本実施形態における粒子は、公知の粒子作製法により適宜作製して使用することもできるし、市販品を使用してもよい。
【００２７】
（粒子のモル吸光係数の測定方法）
本実施形態において、粒子のモル吸光係数は例えば以下のように測定する。まず、粒子の濃度ｃを求める。粒子の濃度は、ある体積の粒子溶液を凍結乾燥させることにより、粒子の重量を求め、これと粒子の平均分子量と乾燥前の溶液体積とから算出できる。続いて既知濃度の粒子溶液を幅ｌの吸光セルに添加する。このセルに６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長の光を照射して、選択した波長における吸光度Ａを求める。吸光度Ａが１より大きい場合は、粒子溶液を適宜希釈する。最後に、ランバート・ベールの式に上記のＡ、ｃ、ｌを代入することで、モル吸光係数εを求めることができる。ｌを一定とした場合、数種類の濃度の粒子溶液を用いて、ｃに対するＡの直線性を確認することが好ましい。
【００２８】
なお、粒子のモル吸光係数の測定値は、ＰＥＧが結合した粒子のモル吸光係数の測定値としてもよい。なぜなら、ＰＥＧは６００〜１３００ｎｍの波長領域において吸収をほとんどもたず、ＰＥＧが結合した粒子のモル吸光係数の測定値は、粒子のモル吸光係数の測定値とほぼ等しいと考えられるからである。
【００２９】
（ＰＥＧ）
本実施形態におけるＰＥＧは、エチレングリコールが重合した構造を有する。ＰＥＧの平均分子量は特に限定されないが、１００以上１００００以下であることが好ましく、３００以上５０００以下であることがさらに好ましい。
【００３０】
平均分子量が１００００以下のＰＥＧは粒子への結合反応効率が高いと考えられる。一方で、平均分子量が１００以上のＰＥＧは、血中タンパク質の非特異吸着を抑制する機能が高いと考えられる。また、ＰＥＧは、音響波の強度が大きい、という本発明の効果を損なわない範囲で、任意の官能基で置換されていてもよい。ここでいう任意の官能基として、例えば、チオール基、アミノ基、マレイミド基、ヒドロキシル基、カルボキシル基などである。
【００３１】
（粒子とＰＥＧとの結合）
上記の粒子と上記のＰＥＧとは、共有結合、または水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合によって結合している。本実施形態において粒子がマレイミド基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基などの官能基を有する場合、これら官能基とＰＥＧとを、従来周知のカップリング反応によって結合させることができる。例えば、チオール基を有するＰＥＧとマレイミド基を有する粒子との結合反応が挙げられる。この反応では、ｐＨが中性の領域において効率的かつ選択的な結合反応が行えるため好ましい。
【００３２】
結合の具体例として、アミド化反応が挙げられる。アミド化反応は、例えば、カルボキシル基またはそのエステル誘導体とアミノ基の縮合反応である。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などのカルボジイミド縮合剤を用いることができるし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを用いてカルボキシル基を予め活性化エステルとしてアミド化反応をさせることもできる。
【００３３】
上記の反応により得られた光音響イメージング用造影剤は、限外ろ過法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などにより洗浄、精製することができる。
【００３４】
本実施形態において用いられるＰＥＧのうち、粒子と結合しない側の末端は、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、メトキシ基などの官能基であってもよい。これらの官能基を介してタンパク質やペプチド等を本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤に結合させることも可能である。ここでいうタンパク質やペプチドの例として、抗体、酵素が挙げられる。
【００３５】
（分散媒）
本実施形態に係る造影剤は、さらに分散媒を有していてもよい。上記の分散媒として、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。
【００３６】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る光音響イメージング方法は、本実施形態に係る造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のパルス光を照射する工程と、前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波の強度を検出する工程と、を有する。
【００３７】
本実施形態に係る光音響イメージング方法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。前記検体中もしくは検体より得られた試料として例えば、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。本実施形態に係る造影剤の投与あるいは添加後、前記検体等に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射する。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【００３８】
次に、本実施形態に係る造影剤からの音響波の強度、すなわち光音響信号の強度を音響波検出器、例えば圧電トランスデューサーで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の中の吸収体の位置や大きさ、あるいはモル吸光係数などの光学特性値分布を求めることができる。
【００３９】
（ＰＥＧの結合密度の測定方法）
粒子へのＰＥＧの結合密度は、以下の方法で測定することができる。初めに、ＰＥＧの結合密度を測定したい粒子を有する溶液（以下、測定溶液と呼ぶ）における粒子の濃度を測定する。測定溶液における粒子の濃度は、予め測定溶液の体積を計測しておき、そして、測定溶液を凍結乾燥させて粒子の重量を求めることで算出できる。また、測定溶液における粒子の濃度と測定溶液の体積とのの積から、測定溶液の有する粒子の個数を求めることができる。
【００４０】
次に、上記の測定溶液における粒子の粒径を測定する。ここで、粒子の粒径を測定する方法として例えば、動的光散乱法がある。動的光散乱法で用いる装置は、例えばＤＬＳ−８０００（大塚電子社製）である。動的光散乱法を用いて測定した粒子の粒径から、粒子１個あたりの表面積を算出する。
【００４１】
上記で求めた測定溶液の有する粒子の個数と、粒子１個あたりの表面積との積から、測定溶液の有する粒子の表面積の和を求めることができる。
【００４２】
次に、上記測定溶液における粒子へ結合しているＰＥＧの数を測定する。ここで、ＰＥＧの数の測定方法は例えば以下の方法がある。まず、上記測定溶液に対して、過剰量の抗ＰＥＧ抗体を添加する。ここで抗ＰＥＧ抗体とはＰＥＧに結合する性質を有する抗体のことである。抗ＰＥＧ抗体を添加した測定溶液から、未結合の抗ＰＥＧ抗体を洗浄除去する操作を行い、粒子に結合したＰＥＧに結合した抗ＰＥＧ抗体の数を測定する。ここで、抗ＰＥＧ抗体の数を測定する方法は、測定溶液に抗ＰＥＧ抗体を添加する前に予め、抗ＰＥＧ抗体を蛍光検出装置で検出可能な蛍光色素で標識しておき、粒子に結合したＰＥＧに結合した抗ＰＥＧ抗体に標識された蛍光色素に由来する蛍光を測定することで行う。こうして測定した、粒子に結合したＰＥＧに結合した抗ＰＥＧ抗体の数から、測定溶液における全粒子に結合しているＰＥＧの数を算出することができる。
【００４３】
このようにして求めた、測定溶液における全粒子に結合しているＰＥＧの数を、測定溶液における粒子の表面積の和で割ることによって、測定溶液における粒子に対するＰＥＧの結合密度を算出することができる。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例で光音響イメージング用造影剤の作製の際に用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００４５】
（光音響信号強度の測定方法）
光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプルに照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７１０ｎｍ、エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μＬであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。
【００４６】
（実施例１）
（平均分子量１０００のＰＥＧと酸化鉄粒子との結合）
平均分子量１０００の、チオール基を有するＰＥＧ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製、以下、単にＰＥＧと呼ぶ）を、２５℃で約２時間、マレイミド基を有する酸化鉄粒子（ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径１００ｎｍ））と反応させた。本実施例で用いたマレイミド基を有する酸化鉄粒子の７１０ｎｍの波長のモル吸光係数は、４．３×１０８（Ｍ−１ｃｍ−１）であった。ＰＥＧは、酸化鉄粒子に対してそれぞれ、（１）１×１０３、（２）５×１０３、（３）２．５×１０４、（４）１×１０５、（５）５×１０５倍量を加えた。反応後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社製）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子へ結合しなかったＰＥＧを除去して、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子を得た。
【００４７】
（粒子に対するＰＥＧの結合密度の算出）
前述した限外ろ過後のろ液中に含まれる未反応ＰＥＧを定量することで、酸化鉄粒子へのＰＥＧの結合量を算出した。具体的には、未反応ＰＥＧのチオール基を定量した。始めにチオール基検出試薬として５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）（同仁化学研究所社製）１９．８ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬに溶解させた。前記検出試薬２０μＬと、限外ろ過後のろ液、もしくは該ろ液の希釈液８０μＬとを２５℃で約１時間反応させた。反応後、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ１３００（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いて波長４１２ｎｍの吸光度を測定した。一方で、既知濃度の、チオール基を有するＰＥＧ溶液を用いて、前述した検出試薬による同様の方法で検量線を作成した。検量線を基に、ろ液中に含まれる未反応ＰＥＧを定量して、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子作製時に加えたＰＥＧ量から差し引くことで、粒子に結合しているＰＥＧの量を算出した。その結果、粒子に対するＰＥＧの結合密度が小さいものから順に、（１）０．０２５分子／ｎｍ２、（２）０．１３分子／ｎｍ２、（３）０．４６分子／ｎｍ２、（４）１．１分子／ｎｍ２、（５）２．９分子／ｎｍ２であるものが得られていることがわかった。
【００４８】
（光音響信号強度の測定）
上記で調整した、（１）から（５）のＰＥＧ修飾酸化鉄粒子にパルス光を照射して、光音響信号強度を測定した。各粒子は少なくとも３種類の濃度で光音響信号強度の測定を行った。溶媒はリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、以下ＰＢＳと略す）を用いた。なお、本実施例の光音響信号強度の測定において用いた粒子のマグネタイト含有量、及び酸化鉄粒子の粒径（平均粒径１００ｎｍ）は同じである。
【００４９】
図１に粒子に対するＰＥＧの結合密度と、光音響信号強度の大きさとの関係を示す。ただし、図１において、光音響信号強度は、圧電素子から得られる電圧を、パルスレーザー光の平均エネルギー、および測定溶液の粒子濃度で除すことで規格化し、更に、ＰＥＧを結合させていない酸化鉄粒子の光音響信号強度を１とした場合の相対信号強度として示した。図１中の横軸は、粒子に対するＰＥＧの結合密度である。光音響信号強度は、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上の場合は、０．４０分子／ｎｍ２未満の場合に比べて、大きいことが確認された。
【００５０】
（実施例２）
（分子量が異なるＰＥＧと酸化鉄粒子との結合）
平均分子量３００、１０００、２０００、５０００、２００００、のチオール基を有するＰＥＧ（平均分子量３００；アルテック社製、平均分子量１０００；Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製、分子量２０００、５０００、２００００；日油株式会社製、以下、単にＰＥＧと呼ぶ）を、２５℃で約２時間、マレイミド基を有する酸化鉄粒子（ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ））と反応させた。本実施例で用いたマレイミド基を有する酸化鉄粒子の７１０ｎｍの波長のモル吸光係数は、１．１×１０１０（Ｍ−１ｃｍ−１）であった。上記の分子量が異なるＰＥＧの各々は、酸化鉄粒子の量に対して５×１０６倍量を加えた。ＰＥＧを酸化鉄粒子に添加した後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社製）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子へ結合しなかったＰＥＧを除去して、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子を得た。以下では、平均分子量３００、１０００、２０００、５０００、２００００のＰＥＧが結合した酸化鉄粒子をそれぞれ、ＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００、ＮＰ−ＰＥＧ２００００と示す。
【００５１】
（粒子に対するＰＥＧの結合密度の算出）
前述した通り、限外ろ過後のろ液中に含まれる未反応のＰＥＧを定量することで、酸化鉄粒子へのＰＥＧの結合量を算出した。その結果、粒子に対するＰＥＧの結合密度は、ＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００、ＮＰ−ＰＥＧ２００００がそれぞれ、７．１分子／ｎｍ２、３．６分子／ｎｍ２、２．９分子／ｎｍ２、１．３分子／ｎｍ２、０．２分子／ｎｍ２であった。
【００５２】
（光音響信号強度の測定）
光音響信号強度の測定は実施例１と同じ方法で行った。サンプルは上記のＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００、ＮＰ−ＰＥＧ２００００、およびＰＥＧを結合させていない酸化鉄粒子を用いた。また、前記酸化鉄粒子の有するマレイミド基を過剰量のシステイン溶液と反応させることで結合活性を失活させた粒子に対して、系中のＰＥＧ濃度がＮＰ−ＰＥＧ２０００と等しくなるように、平均分子量２０００のＰＥＧを加えた粒子（以下、ＮＰ＋ＰＥＧ２０００と示す）、すなわち、平均分子量２０００のＰＥＧと酸化鉄粒子の光音響信号強度も測定した。各粒子は少なくとも３種類の濃度で光音響信号の測定を行った。溶媒はＰＢＳを用いた。なお、本実施例の光音響信号強度の測定において用いた粒子のマグネタイト含有量、及び酸化鉄粒子の粒径（平均粒径２００ｎｍ）は同じである。
【００５３】
図２に光音響信号強度の測定結果を示す。光音響信号強度は上述したように規格化し、ＰＥＧが結合していない酸化鉄粒子の光音響信号強度を１とした場合の相対信号強度として、図２中の縦軸に示した。図２中の横軸は、それぞれ、１がＰＥＧが結合していない酸化鉄粒子、２がＮＰ−ＰＥＧ３００、３がＮＰ−ＰＥＧ１０００、４がＮＰ−ＰＥＧ２０００、５がＮＰ−ＰＥＧ５０００、６がＮＰ−ＰＥＧ２００００、７がＮＰ＋ＰＥＧ２０００の各被検粒子を表す。ＰＥＧを結合させていない酸化鉄粒子の光音響信号強度と比較して、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上のＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００光音響信号強度は高いことがわかった。一方で、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２未満であるＮＰ−ＰＥＧ２００００は、光音響信号の増加はほとんどみられなかった。また、ＮＰ＋ＰＥＧ２０００は光音響信号強度の増加はみられなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＲＩ用造影剤であるリゾビスト（登録商標）は、複数の酸化鉄粒子を多糖類のデキストランで被覆したものであり、音響波を発生することが知られている（非特許文献１）。したがって、リゾビスト（登録商標）は光音響イメージング用造影剤として用いることができる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ Ｔｅｃｈ２００９； ５４：ｐｐ．８３−８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、リゾビストは音響波を発生するものとして酸化鉄粒子のみを有するため、リゾビストから発生する音響波の強度は小さく、より大きい強度の音響波を発生する光音響イメージング用造影剤が求められていた。そこで本発明は、発生する音響波の強度が大きい光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコールと、を有する光音響イメージング用造影剤において、前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明者らが検討した結果、粒子にポリエチレングリコールが０．４０分子／ｎｍ２以上の密度で結合している場合、０．４０分子／ｎｍ２未満の密度で結合している場合に比べて、より大きい強度の音響波を発生することを発見した。したがって、本発明によれば、大きい強度の音響波を発生する光音響イメージング用造影剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１における、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子の光音響信号強度の測定結果を示すグラフである。
【図２】本実施例２における、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子の、ＰＥＧの結合密度と光音響信号強度の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０００９】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤（以下、造影剤と略す）は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、以下、ＰＥＧと略す）とを有する。そして、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする。本実施形態において、ＰＥＧの結合密度が０．４６分子／ｎｍ２以上であることが好ましい。なお、本実施形態において、ＰＥＧの結合密度が８．０分子／ｎｍ２以下であることが好ましい。 粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上である場合、結合密度が０．４０分子／ｎｍ２未満である場合や、粒子にＰＥＧが結合していない場合に比べて、音響波の強度が大きい。
【００１０】
さらに、本実施形態に係る造影剤は、粒子にＰＥＧが結合しているので、血中のタンパク質などの非特異的吸着を抑制することができると考えられる。
【００１１】
本実施形態に係る造影剤の粒径は、１５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。造影剤の粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの造影剤を集積させることができる。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体にパルス光を照射すると、腫瘍部位から発せられる光音響信号の強度は正常部位から発せられる光音響信号の強度よりも大きくなる。したがって、造影剤の粒径を１０００ｎｍ以下とすることにより、腫瘍部位を特異的に検出することができる。また、造影剤の粒径は５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。造影剤の粒径が２００ｎｍ以下であると、造影剤が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
【００１２】
なお、本実施形態に係る造影剤は、一次粒子でもよいし、二次粒子でもよい。
本実施形態において造影剤の粒径は以下のようにして測定することができる。動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定する。例えば、上記装置を用いて１００回の積算を５回行い、算出された５つのデータの平均をとることによって求めることができる。
【００１３】
（粒子）
本実施形態における粒子は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上であれば特に限定されない。また、本実施形態における粒子は６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０２０Ｍ−１ｃｍ−１以下であることが好ましい。
【００１４】
本実施形態に係る粒子の例として、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上を有する、金属酸化物、金属、その他の無機材料、有機色素の少なくともいずれか一種を有するものが挙げられる。
【００１５】
上記の金属酸化物としては、例えば、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４）、酸化マグネシウム、酸化アルミニウム、二酸化ケイ素、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化マンガン、酸化ホウ素を挙げることが出来る。上記の金属としては、例えば、金、銀、銅、白金を挙げることが出来る。また、金、銀、銅、白金の混成によるコロイドを用いることも可能である。上記のその他の無機材料としては、例えば、硫化カドミウム、セレン化亜鉛、セレン化カドミウム、テルル化亜鉛、テルル化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉛、カーボンブラック、フラーレン、カーボンナノチューブ、シュウ酸鉄を挙げることが出来る。
【００１６】
上記の有機色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素を挙げることが出来る。上記のポルフィリン系色素としては、例えば、処方せん医薬品であるフォトフリン（ワイス株式会社製）、レザフィリン（明治製菓株式会社製）、ビスダイン（ノバルティス ファーマ株式会社製）を挙げることが出来る。上記のシアニン系色素としては、例えば、インドシアニングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（インビトロジェン社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社製）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）系色素（ピアス・バイオテクノロジー社製）、ＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｙｅ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を挙げることが出来る。上記のフタロシアニン系色素としては、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、２，１１，２０，２９−Ｔｅｔｒａ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）を挙げることが出来る。上記のＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素としては、例えば、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７５０ Ｂｉｓ − ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ， ｉｓｏｍｅｒ ＩＩ ＴＥＡ ｓａｌｔを挙げることが出来る。
【００１７】
本実施形態に係る粒子は、酸化鉄粒子を有することが好ましい。本実施形態において、酸化鉄粒子は市販のものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。合成する方法として例えば、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２５．５ｇ）とＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（１０．２ｇ）を混合、溶解した水溶液（６００ｍｌ）と、粉末状デキストラン（平均分子量１００００ Ｄａ、３６０ｇ）と、濃度３０％のアンモニア水溶液（３０ｍｌ）を用いることで、デキストランで被覆された酸化鉄粒子のコロイド溶液を調製することができる。
【００１８】
本実施形態に係る粒子は、上記の金属酸化物、金属、その他の無機材料、有機色素以外に、粒子の水中での分散性を上げるための分散剤として、あるいは、粒子を構成する材料の密度を上げるためのバインダとして、多糖類、合成高分子、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、シリカ、炭酸塩、ヒドロキシアパタイトなどの材料を有していてもよい。これらの材料は、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上でなくてもよい。
【００１９】
また、本実施形態に係る粒子はこれらを、単独で有していてもよく、複数種を有していてもよい。
【００２０】
上記の多糖類としては、例えば、デキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン、キトサン、キシログルカン、ヒアルロン酸、アルギン酸、水溶性セルロース、でんぷん、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、及びこれらの誘導体を挙げることができる。
【００２１】
上記の合成高分子としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンデンドリマーなどのアミノ基を有する高分子、ポリビニルアルコールなどのヒドロキシル基を有する高分子、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸などのカルボキシル基を有する高分子、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−コーグリコリド）、ポリε−カプロラクトンからなる群より選ばれる疎水性セグメントを含む高分子を挙げることができる。
【００２２】
上記のリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンを挙げることができる。
【００２３】
上記の脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、ラウロレイン酸、フィセテリン酸、ミシストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸などの不飽和脂肪酸、イソラウリン酸、イソミリスチン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸などの分岐脂肪酸を挙げることができる。
【００２４】
上記の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキル硫化塩を挙げることができる。
【００２５】
本実施形態に係る粒子として好ましくは、カルボキシル基、アミノ基、マレイミド基、ヒドロキシル基などの官能基を有することが好ましい。本実施形態に係る粒子として、例えば、マレイミド基を有する酸化鉄粒子が挙げられる。
【００２６】
本実施形態における粒子は、公知の粒子作製法により適宜作製して使用することもできるし、市販品を使用してもよい。
【００２７】
（粒子のモル吸光係数の測定方法）
本実施形態において、粒子のモル吸光係数は例えば以下のように測定する。まず、粒子の濃度ｃを求める。粒子の濃度は、ある体積の粒子溶液を凍結乾燥させることにより、粒子の重量を求め、これと粒子の平均分子量と乾燥前の溶液体積とから算出できる。続いて既知濃度の粒子溶液を幅ｌの吸光セルに添加する。このセルに６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長の光を照射して、選択した波長における吸光度Ａを求める。吸光度Ａが１より大きい場合は、粒子溶液を適宜希釈する。最後に、ランバート・ベールの式に上記のＡ、ｃ、ｌを代入することで、モル吸光係数εを求めることができる。ｌを一定とした場合、数種類の濃度の粒子溶液を用いて、ｃに対するＡの直線性を確認することが好ましい。
【００２８】
なお、粒子のモル吸光係数の測定値は、ＰＥＧが結合した粒子のモル吸光係数の測定値としてもよい。なぜなら、ＰＥＧは６００〜１３００ｎｍの波長領域において吸収をほとんどもたず、ＰＥＧが結合した粒子のモル吸光係数の測定値は、粒子のモル吸光係数の測定値とほぼ等しいと考えられるからである。
【００２９】
（ＰＥＧ）
本実施形態におけるＰＥＧは、エチレングリコールが重合した構造を有する。ＰＥＧの平均分子量は特に限定されないが、１００以上１００００以下であることが好ましく、３００以上５０００以下であることがさらに好ましい。
【００３０】
平均分子量が１００００以下のＰＥＧは粒子への結合反応効率が高いと考えられる。一方で、平均分子量が１００以上のＰＥＧは、血中タンパク質の非特異吸着を抑制する機能が高いと考えられる。また、ＰＥＧは、音響波の強度が大きい、という本発明の効果を損なわない範囲で、任意の官能基で置換されていてもよい。ここでいう任意の官能基として、例えば、チオール基、アミノ基、マレイミド基、ヒドロキシル基、カルボキシル基などである。
【００３１】
（粒子とＰＥＧとの結合）
上記の粒子と上記のＰＥＧとは、共有結合、または水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合によって結合している。本実施形態において粒子がマレイミド基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基などの官能基を有する場合、これら官能基とＰＥＧとを、従来周知のカップリング反応によって結合させることができる。例えば、チオール基を有するＰＥＧとマレイミド基を有する粒子との結合反応が挙げられる。この反応では、ｐＨが中性の領域において効率的かつ選択的な結合反応が行えるため好ましい。
【００３２】
結合の具体例として、アミド化反応が挙げられる。アミド化反応は、例えば、カルボキシル基またはそのエステル誘導体とアミノ基の縮合反応である。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などのカルボジイミド縮合剤を用いることができるし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを用いてカルボキシル基を予め活性化エステルとしてアミド化反応をさせることもできる。
【００３３】
上記の反応により得られた光音響イメージング用造影剤は、限外ろ過法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などにより洗浄、精製することができる。
【００３４】
本実施形態において用いられるＰＥＧのうち、粒子と結合しない側の末端は、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、メトキシ基などの官能基であってもよい。これらの官能基を介してタンパク質やペプチド等を本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤に結合させることも可能である。ここでいうタンパク質やペプチドの例として、抗体、酵素が挙げられる。
【００３５】
（分散媒）
本実施形態に係る造影剤は、さらに分散媒を有していてもよい。上記の分散媒として、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。
【００３６】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る光音響イメージング方法は、本実施形態に係る造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のパルス光を照射する工程と、前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波の強度を検出する工程と、を有する。
【００３７】
本実施形態に係る光音響イメージング方法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。前記検体中もしくは検体より得られた試料として例えば、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。本実施形態に係る造影剤の投与あるいは添加後、前記検体等に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射する。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【００３８】
次に、本実施形態に係る造影剤からの音響波の強度、すなわち光音響信号の強度を音響波検出器、例えば圧電トランスデューサーで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の中の吸収体の位置や大きさ、あるいはモル吸光係数などの光学特性値分布を求めることができる。
【００３９】
（ＰＥＧの結合密度の測定方法）
粒子へのＰＥＧの結合密度は、以下の方法で測定することができる。初めに、ＰＥＧの結合密度を測定したい粒子を有する溶液（以下、測定溶液と呼ぶ）における粒子の濃度を測定する。測定溶液における粒子の濃度は、予め測定溶液の体積を計測しておき、そして、測定溶液を凍結乾燥させて粒子の重量を求めることで算出できる。また、測定溶液における粒子の濃度と測定溶液の体積とのの積から、測定溶液の有する粒子の個数を求めることができる。
【００４０】
次に、上記の測定溶液における粒子の粒径を測定する。ここで、粒子の粒径を測定する方法として例えば、動的光散乱法がある。動的光散乱法で用いる装置は、例えばＤＬＳ−８０００（大塚電子社製）である。動的光散乱法を用いて測定した粒子の粒径から、粒子１個あたりの表面積を算出する。
【００４１】
上記で求めた測定溶液の有する粒子の個数と、粒子１個あたりの表面積との積から、測定溶液の有する粒子の表面積の和を求めることができる。
【００４２】
次に、上記測定溶液における粒子へ結合しているＰＥＧの数を測定する。ここで、ＰＥＧの数の測定方法は例えば以下の方法がある。まず、上記測定溶液に対して、過剰量の抗ＰＥＧ抗体を添加する。ここで抗ＰＥＧ抗体とはＰＥＧに結合する性質を有する抗体のことである。抗ＰＥＧ抗体を添加した測定溶液から、未結合の抗ＰＥＧ抗体を洗浄除去する操作を行い、粒子に結合したＰＥＧに結合した抗ＰＥＧ抗体の数を測定する。ここで、抗ＰＥＧ抗体の数を測定する方法は、測定溶液に抗ＰＥＧ抗体を添加する前に予め、抗ＰＥＧ抗体を蛍光検出装置で検出可能な蛍光色素で標識しておき、粒子に結合したＰＥＧに結合した抗ＰＥＧ抗体に標識された蛍光色素に由来する蛍光を測定することで行う。こうして測定した、粒子に結合したＰＥＧに結合した抗ＰＥＧ抗体の数から、測定溶液における全粒子に結合しているＰＥＧの数を算出することができる。
【００４３】
このようにして求めた、測定溶液における全粒子に結合しているＰＥＧの数を、測定溶液における粒子の表面積の和で割ることによって、測定溶液における粒子に対するＰＥＧの結合密度を算出することができる。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例で光音響イメージング用造影剤の作製の際に用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００４５】
（光音響信号強度の測定方法）
光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプルに照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７１０ｎｍ、エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μＬであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。
【００４６】
（実施例１）
（平均分子量１０００のＰＥＧと酸化鉄粒子との結合）
平均分子量１０００の、チオール基を有するＰＥＧ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製、以下、単にＰＥＧと呼ぶ）を、２５℃で約２時間、マレイミド基を有する酸化鉄粒子（ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径１００ｎｍ））と反応させた。本実施例で用いたマレイミド基を有する酸化鉄粒子の７１０ｎｍの波長のモル吸光係数は、４．３×１０８（Ｍ−１ｃｍ−１）であった。ＰＥＧは、酸化鉄粒子に対してそれぞれ、（１）１×１０３、（２）５×１０３、（３）２．５×１０４、（４）１×１０５、（５）５×１０５倍量を加えた。反応後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社製）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子へ結合しなかったＰＥＧを除去して、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子を得た。
【００４７】
（粒子に対するＰＥＧの結合密度の算出）
前述した限外ろ過後のろ液中に含まれる未反応ＰＥＧを定量することで、酸化鉄粒子へのＰＥＧの結合量を算出した。具体的には、未反応ＰＥＧのチオール基を定量した。始めにチオール基検出試薬として５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）（同仁化学研究所社製）１９．８ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬに溶解させた。前記検出試薬２０μＬと、限外ろ過後のろ液、もしくは該ろ液の希釈液８０μＬとを２５℃で約１時間反応させた。反応後、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ１３００（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いて波長４１２ｎｍの吸光度を測定した。一方で、既知濃度の、チオール基を有するＰＥＧ溶液を用いて、前述した検出試薬による同様の方法で検量線を作成した。検量線を基に、ろ液中に含まれる未反応ＰＥＧを定量して、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子作製時に加えたＰＥＧ量から差し引くことで、粒子に結合しているＰＥＧの量を算出した。その結果、粒子に対するＰＥＧの結合密度が小さいものから順に、（１）０．０２５分子／ｎｍ２、（２）０．１３分子／ｎｍ２、（３）０．４６分子／ｎｍ２、（４）１．１分子／ｎｍ２、（５）２．９分子／ｎｍ２であるものが得られていることがわかった。
【００４８】
（光音響信号強度の測定）
上記で調整した、（１）から（５）のＰＥＧ修飾酸化鉄粒子にパルス光を照射して、光音響信号強度を測定した。各粒子は少なくとも３種類の濃度で光音響信号強度の測定を行った。溶媒はリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、以下ＰＢＳと略す）を用いた。なお、本実施例の光音響信号強度の測定において用いた粒子のマグネタイト含有量、及び酸化鉄粒子の粒径（平均粒径１００ｎｍ）は同じである。
【００４９】
図１に粒子に対するＰＥＧの結合密度と、光音響信号強度の大きさとの関係を示す。ただし、図１において、光音響信号強度は、圧電素子から得られる電圧を、パルスレーザー光の平均エネルギー、および測定溶液の粒子濃度で除すことで規格化し、更に、ＰＥＧを結合させていない酸化鉄粒子の光音響信号強度を１とした場合の相対信号強度として示した。図１中の横軸は、粒子に対するＰＥＧの結合密度である。光音響信号強度は、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上の場合は、０．４０分子／ｎｍ２未満の場合に比べて、大きいことが確認された。
【００５０】
（実施例２）
（分子量が異なるＰＥＧと酸化鉄粒子との結合）
平均分子量３００、１０００、２０００、５０００、２００００、のチオール基を有するＰＥＧ（平均分子量３００；アルテック社製、平均分子量１０００；Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製、分子量２０００、５０００、２００００；日油株式会社製、以下、単にＰＥＧと呼ぶ）を、２５℃で約２時間、マレイミド基を有する酸化鉄粒子（ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、平均粒径２００ｎｍ））と反応させた。本実施例で用いたマレイミド基を有する酸化鉄粒子の７１０ｎｍの波長のモル吸光係数は、１．１×１０１０（Ｍ−１ｃｍ−１）であった。上記の分子量が異なるＰＥＧの各々は、酸化鉄粒子の量に対して５×１０６倍量を加えた。ＰＥＧを酸化鉄粒子に添加した後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社製）を用いた限外ろ過により酸化鉄粒子へ結合しなかったＰＥＧを除去して、ＰＥＧ修飾酸化鉄粒子を得た。以下では、平均分子量３００、１０００、２０００、５０００、２００００のＰＥＧが結合した酸化鉄粒子をそれぞれ、ＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００、ＮＰ−ＰＥＧ２００００と示す。
【００５１】
（粒子に対するＰＥＧの結合密度の算出）
前述した通り、限外ろ過後のろ液中に含まれる未反応のＰＥＧを定量することで、酸化鉄粒子へのＰＥＧの結合量を算出した。その結果、粒子に対するＰＥＧの結合密度は、ＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００、ＮＰ−ＰＥＧ２００００がそれぞれ、７．１分子／ｎｍ２、３．６分子／ｎｍ２、２．９分子／ｎｍ２、１．３分子／ｎｍ２、０．２分子／ｎｍ２であった。
【００５２】
（光音響信号強度の測定）
光音響信号強度の測定は実施例１と同じ方法で行った。サンプルは上記のＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００、ＮＰ−ＰＥＧ２００００、およびＰＥＧを結合させていない酸化鉄粒子を用いた。また、前記酸化鉄粒子の有するマレイミド基を過剰量のシステイン溶液と反応させることで結合活性を失活させた粒子に対して、系中のＰＥＧ濃度がＮＰ−ＰＥＧ２０００と等しくなるように、平均分子量２０００のＰＥＧを加えた粒子（以下、ＮＰ＋ＰＥＧ２０００と示す）、すなわち、平均分子量２０００のＰＥＧと酸化鉄粒子の光音響信号強度も測定した。各粒子は少なくとも３種類の濃度で光音響信号の測定を行った。溶媒はＰＢＳを用いた。なお、本実施例の光音響信号強度の測定において用いた粒子のマグネタイト含有量、及び酸化鉄粒子の粒径（平均粒径２００ｎｍ）は同じである。
【００５３】
図２に光音響信号強度の測定結果を示す。光音響信号強度は上述したように規格化し、ＰＥＧが結合していない酸化鉄粒子の光音響信号強度を１とした場合の相対信号強度として、図２中の縦軸に示した。図２中の横軸は、それぞれ、１がＰＥＧが結合していない酸化鉄粒子、２がＮＰ−ＰＥＧ３００、３がＮＰ−ＰＥＧ１０００、４がＮＰ−ＰＥＧ２０００、５がＮＰ−ＰＥＧ５０００、６がＮＰ−ＰＥＧ２００００、７がＮＰ＋ＰＥＧ２０００の各被検粒子を表す。ＰＥＧを結合させていない酸化鉄粒子の光音響信号強度と比較して、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上のＮＰ−ＰＥＧ３００、ＮＰ−ＰＥＧ１０００、ＮＰ−ＰＥＧ２０００、ＮＰ−ＰＥＧ５０００光音響信号強度は高いことがわかった。一方で、粒子に対するＰＥＧの結合密度が０．４０分子／ｎｍ２未満であるＮＰ−ＰＥＧ２００００は、光音響信号の増加はほとんどみられなかった。また、ＮＰ＋ＰＥＧ２０００は光音響信号強度の増加はみられなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコールと、を有する光音響イメージング用造影剤において、前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４６分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールの平均分子量が３００以上５０００以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項４】
前記粒子が酸化鉄粒子を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項１】
６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長におけるモル吸光係数が１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子と、前記粒子に結合したポリエチレングリコールと、を有する光音響イメージング用造影剤において、前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４０分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールの、前記粒子に対する結合密度が０．４６分子／ｎｍ２以上であることを特徴とする請求項１に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールの平均分子量が３００以上５０００以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項４】
前記粒子が酸化鉄粒子を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光音響イメージング用造影剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１８０２８６（Ｐ２０１２−１８０２８６Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４２０７９（Ｐ２０１１−４２０７９）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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