免疫促進方法
【課題】炎症状態に苦しみ、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能であり、そしてステロイド抗炎症治療中である患者の免疫を促進する方法の提供。
【解決手段】ステロイド依存性患者において、ステロイドの効果を増強するための薬剤を製造するための、下記配列：５'−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３'（ここで、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない）を有するオリゴヌクレオチドの使用により、前記患者におけるステロイドの効果を増強する方法。
【解決手段】ステロイド依存性患者において、ステロイドの効果を増強するための薬剤を製造するための、下記配列：５'−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３'（ここで、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない）を有するオリゴヌクレオチドの使用により、前記患者におけるステロイドの効果を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫促進方法に関する。更に詳しくは、本発明は、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを、炎症状態に苦しんでいるステロイド難治性又は依存性患者に投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、多くの因子や細胞型に関与する複雑な疾患である。疾患の観点から、長年の研究は、我々に、喘息、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、及びクローン病その他のような炎症性疾患は、独特な炎症性サイトカインの特性を有していることを教えている。これらの特性は、応答するリンパ球の性質の結果である。言い換えれば、炎症は、単に炎症として考えられるものではなく、むしろ、Ｔヘルパー細胞のある種の亜母集団の増殖及び分化を増強する、別の分泌されたサイトカインに関連する異なった炎症性疾患と考えられる。
【０００３】
免疫応答の性質及び規模は、免疫系が曝された外来抗原の特性によって大部分指図される。この事象は、液性免疫及び細胞性免疫の発生を究極的に導く一連の事象を動かし始める。これらの二つのエフェクター機能は、ヘルパーＴ細胞の２つの亜母集団の存在によってもたらされる（図１を参照）。更に指示されたように、異なった炎症性疾患は、認められるサイトカイン特性に応じてＴｈ１かＴｈ２のいずれかに分けることができる。
【０００４】
「正常な」健康状態下では、Ｔｈ１に特有である前炎症性サイトカインとＴｈ２に特有である抗炎症性サイトカインの間のデリケートなバランスがある。もしこのバランスが失われると、主にＴｈ１又はＴｈ２型の炎症をもたらす分極がおこり、疾患の臨床的徴候が始まる。
【０００５】
Ｔｈ１のサイトカイン特性が減少することによる、例えば、Ｔｈ１型疾患における「不均衡」を元に戻し、それによりＴｈ２特性をもっと起こさせる、いくつかの新しい治療形態が、今や試みられている（Neurath等, 1995; Mannon et al, 2004）。最近５年位にわたって、多くの研究者が免疫療法への応用において免疫促進剤として、オリゴヌクレオチドの使用の有効性をインビトロ及びインビボの両者で実証している。リン酸ジエステル及び修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでも免疫を促進することができるという観察は、治療ツールとしてこの効果を発展させる関心の高まりを作り出した。
【０００６】
細菌のＤＮＡは、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞を活性化することができる免疫促進効果を有するが、脊椎動物のＤＮＡは有していない（総説：Krieg, 1998, Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp.431-448）。細菌ＤＮＡのこれらの免疫促進効果は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドの存在の結果であること、特に、細菌ＤＮＡには普通であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化されているか、不十分にしか表示されていない塩基状況（ＣｐＧモチーフ）の存在の結果であることが判明している（Krieg et al, 1995）。細菌ＤＮＡの免疫促進効果は、これらＣｐＧモチーフを含有したオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）で模倣することができる。そのようなＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｂ細胞を含むヒト及びネズミ白血球に対する高度な促進効果；サイトカイン及び免疫グロブリン分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性及びＩＦＮ−γ分泌；及び樹枝状細胞（ＤＣ）及び他の抗原提示細胞の活性化で副刺激分子を発現し、サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の進展を促進するのに重要であるＴｈ１様サイトカインを分泌する作用を有する。天然のリン酸ジエステル骨格ＣｐＧ−ＯＤＮのこれらの免疫促進効果は、ＣｐＧモチーフがメチル化されるとこれらの効果は劇的に減少し、ＧｐＣに変化するか、除去されるか又は変化するという、高度にＣｐＧ特異的である（Krieg等, 1995 and Hartmann 等, 1999）。
【０００７】
初期の研究では、免疫促進ＣｐＧモチーフは、式、プリン−プリン−ＣｐＧ−ピリミジン−ピリミジンに従うと考えられていた（Krieg et al, 1995; Pisetsky, 1996 and Hacker等, 1998）。
【０００８】
現在、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドが、ある種のサイトカインを誘導する、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）（Iho等, 1999: Cowdery等, 1996）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２（Stacey等, 1996; Jakob等, 1998 and Sparwasser等, 1998）の分泌を増強することによって、ヒト及びマウス細胞がＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチドに応答することを示す、かなりの量の公表されたデータがある。
【０００９】
誘導されたサイトカインの性質によって、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、大部分インビトロ及びインビボの両方でＴｈ１特性を誘導すると考えられている（Zimmermann等, 1998; Kline, 2000）。
【００１０】
ＣｐＧモチーフの存在に加えて、研究者は、又、完全ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオアート（ＰＳ）骨格を有する合成オリゴヌクレオチドは、これらのオリゴヌクレオチドがＢ細胞を促進するという点でより強力であるが天然のリン酸ジエステル骨格を有する同じ配列は効果がないという点で、オリゴヌクレオチドの促進効果を増強することができることに気付いている（Zhao等, 1996）。
【００１１】
オリゴヌクレオチドの配列内のＣｐＧモチーフの存在は、強力なＴｈ１サイトカイン応答を誘導することができるが、この応答は、化合物の化学修飾の状態及び一般的な配列構造の全体像を考慮すべきである。
【００１２】
既に炎症の背景技術の紹介で指摘したように、種々の型の炎症性疾患で優勢となる特異的サイトカイン特性がある。例えば、喘息患者において、ＩＬ−４が高値で、ＩＦＮ−γが低値である。このサイトカイン像は、喘息がＴｈ２型の疾患であることを示唆しているであろう。対照的に関節リウマチは、高値のＩＦＮ−γと低値のＩＬ−４が見られることを特徴とするＴｈ１型の疾患に、より関連している。
【００１３】
コルチコステロイド耐性の現象は、リウマチ患者で最も広範に研究されており、そして長年の証拠が蓄積されている潰瘍性大腸炎では余り研究されていないが、多くのサイトカイン異常が指摘されている。両疾患は、Ｔｈ２型に分類されており、インターフェロン及びＩＬ−１０が、コルチコステロイド耐性の発症機序に重要な因子であるとされている。
【００１４】
インターフェロン及びＩＬ−１０のようなサイトカインの内因性産生を誘導することができる免疫増強性オリゴヌクレオチドは、ステロイド抵抗性又はステロイド依存性患者の炎症状態に、有利な態様で影響することができる可能性がある。
【００１５】
ある種のサイトカインが、ステロイド応答性に影響することができるという証拠は、全てコルチコステロイド療法をうけている、コルチコステロイド耐性喘息及び潰瘍性大腸炎患者において行われた臨床治験から集められている。事実、この型の患者の亜集団特性は、以下に記載する臨床治験間の唯一共通の特徴であった。
【００１６】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、多種の先天性免疫応答及び適応的免疫応答の制御に重要な役割を演じている。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）は、ウイルスのような病原に対して宿主防御の中心であるのに対して、II型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）は、免疫応答のＴ細胞仲介制御に主として寄与している（Taniguchi and Takaoka, 2001）。インターフェロンは、又、良性腫瘍性疾患（Gill等, 1995）及びウイルス性疾患（Niederau等, 1996; Zeuzem等, 2000）のような種々のヒトの疾患の成功裡の治療にその地位が見出されている。
【００１７】
或る治験（Simon等, 2003）において、１０名のコルチコステロイド耐性喘息患者に、全員へのプレドニゾン投与に加えてＩＦＮ−α（３×１０6ＩＵ／日）（RoferonA(登録商標)、Roche）を投与した。この治験は、これらの患者において高い有効性を示し、サイトカイン療法後１〜２週間に改善の臨床的徴候が起こり、コルチコステロイドの投与を減らすことが可能となった。著者らは更に、ＩＦＮ−α治療は、ＩＦＮ−γを産生する末梢血Ｔ細胞の能力が増加し、Ｔｈ２型応答（喘息及びアレルギー性疾患に典型的）からＴｈ１型応答にシフトしたことを示唆していることを指摘している。
【００１８】
その上更に、著者らは、サイトカイン療法を受けたこれら患者においてＩＬ−１０を分泌する血液Ｔ細胞が増加したことを示した。コルチコステロイドは、部分的にＩＬ−１０のレベルを増加することによって、それらの抗炎症効果を仲介するので、著者らは、外因性のＩＦＮ−αの投与がこれらの患者におけるコルチコステロイド耐性を破ったと結論している。
【００１９】
Muschら（２００２）は、コルチコステロイド難治性潰瘍性大腸炎患者において、ＩＦＮ−βを静脈投与した場合、高い応答率を実証した。２５名の重症潰瘍性大腸炎患者で行った予備的研究で、難治性薬物療法が基礎的な薬物療法になったことを証明した。全ての患者は、サイトカイン治療時に、コルチコステロイド治療を受けていた。治療に続いて、２５名中２２名（８８％）が、治療開始後１週間に臨床活性指数（ＣＡＩ）の強い減少に気付くとともに、３週間以内に小康状態に入った。応答の平均長さは１３ヵ月であった。
【００２０】
別の試験において、Sumer等（１９９５）は、コルチコステロイド耐性潰瘍性大腸炎患者における皮下投与ＩＦＮ−αサイトカイン治療に対して８２％の改善率を報告した。彼らは、更に、２３名の患者がサイトカイン療法に迅速改善（１５日以内）で応答し、治療６ヵ月後に完全な臨床的及び内視鏡的寛解であったことに言及した。３名の患者は、長い療法後に寛解に入ったが、しかし、２６名の患者全てが、追加的療法を受けることなく２年を越えて観察され、この期間完全な臨床的及び内視鏡的寛解を維持した。
【００２１】
コルチコステロイド耐性の発症機序において関心を集めた別のサイトカインは、ＩＬ−１０である。このサイトカインは、炎症性サイトカインの産生を抑制することができるという点で強力な抗炎症効果を有していると信じられている。それは、又、ある種の炎症性疾患、最も顕著にはアレルギー及び喘息（Hawrylowicz等, 2005）の発症に広範な関わり
合い有しており、そして免疫応答の制御に中心的役割を演じている。コルチコステロイドは、部分的にＩＬ−１０産生を増強することによって、それらの抗炎症効果を発揮していると信じられている（Richards等, 2005）。
【００２２】
多くの臨床研究が、より強い炎症に潜在的に寄与しているであろう喘息患者において、ＩＬ−１０の充分なレベルが一般的に欠損していることを示唆している。中等度のアトピー性喘息の小児で行われた無作為二重盲検臨床治験において、Stelmach等（２００２）は、コルチコステロイドの１種であるトリアムシノロン、及び抗ロイコトリエンであるモンテルカストを用いた治療は、血清中のＩＬ−１０のレベルを有意に増加させ、更に加えて、臨床症状を有意に改善したことを明らかにした。
【００２３】
別の臨床試験において、ＩＬ−１０及びＩＬ−１０産生細胞のレベルが、中等度の喘息と比較下場合、重症持続性喘息の患者において有意に減少していることが示された（Tomitai等, 2002）。これらの観察は、喘息患者においてＩＬ−１０を産生することができる細胞の生産が欠損しているという以前の発見（Tormey等, 1998）に一致した。
【００２４】
この欠損は、又、コルチコステロイド耐性喘息患者においても存在することが示された。正常な状態下で、コルチコステロイドは、コルチコステロイド感受性患者ではＩＬ−１０の産生が増加する原因となるであろう。しかしながら、Hawrylowicz等（２００２）は、コルチコステロイド耐性喘息患者においては、コルチコステロイドはＩＬ−１０合成を誘導することができなかったことを確認することができた。これらの観察は、ＩＬ−１０合成の誘導とコルチコステロイドの有効性の間に強い関係があることを示している。
【００２５】
最近発行された研究（Xystrakis等、2006）において、著者らは、コルチコステロイド
耐性喘息患者からＰＢＭＣを単離し、ビタミンＤ３とデキサメタゾンをこれらの培養に加えると、デキサメタゾン単独で培養したコルチコステロイド感受性患者からの細胞において観察されるレベルまでＩＬ−１０合成が増強されることを明らかにした。更に、そして多分最も顕著に、ＩＬ−１０での前処理は、デキサメタゾンに応答してこれら細胞において、ＩＬ−１０合成を完全に回復させた。
【００２６】
消化管（ＧＩ）障害を治療するためにヒトの細菌叢を使用することは新規な概念ではなく、４０年間以上にわたって周期的に実施されている（Eiseman等、1958）。顕著な臨床
的改善が、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）を含む多くのＧＩ障害において観察されている（Bennet and Brinkman 1989）。Borody等は、２００３年に、ヒトの細菌療法を重症コルチコステロイド耐性潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療に使用することができると報告した。
【００２７】
小試験において、全ての患者が最大忍容性標準コルチコステロイド療法に以前に失敗している６名の慢性ＵＣ患者に、彼らが現在行っているコルチコステロイド療法と同時に、単回注便療法を行った。直腸注入に続いてＵＣの完全な逆転が、６名の患者において達成された。著者らは、又、全ての患者が、６週間以内に抗炎症療法を停止し、１例においては、１３年まで寛解を維持したことを述べている。抵抗性潰瘍性大腸炎患者における細菌療法の明らかな成功は、「健康な」細菌叢の大腸での再増殖によるのであろうが、しかし著者らが同様に示唆しているように、疾患の完全な逆転をもたらす有益な免疫調節効果を誘導する、ＣｐＧモチーフを豊富に含有する大量の細菌ＤＮＡの注入によるのであろう。
【００２８】
喘息患者における試験で、ステロイド耐性患者及びステロイド感受性患者の両者において、ステロイド（プレドニゾン）への応答性を比較した。患者には、最初、ステロイドの投与前１週間の「ウオッシュアウト」期間を与えた。投与前及び１週間後のサイトカイン特性は、ステロイドに応答した患者については、Ｔｈ２型からよりＴｈ１様の状態へと移動した。対照的に、投与したステロイドへの応答ができなかった患者については、Ｔｈ２型のまま残っていた（Nasser等、1997）。
【００２９】
喘息患者におけるステロイド耐性の理由は完全には明らかではないが、ヒトでの多くの試験は、ステロイド耐性の患者が、ステロイドの作用によって抑制されないＩＬ−２／４の高い持続するレベルを有することを示している。その上更に、インビトロ試験は、ＩＬ−２／４を培地に置くと、細胞はステロイドの作用に耐性を持つようになることを示す（Sousa AR等、2000；Hamid QA等、1999）。
【００３０】
関節リウマチにおいて、ステロイド耐性患者は、ステロイドで攻撃しても減少することができない高いレベルのＩＬ−４をはっきり示すという、類似のシナリオが示唆されている（Chikanza等、2004）。興味深いことは、ＩＮＦ−γは、転写のレベルで、ＩＬ−４応答をダウンレギュレートすることができるという発見である（Eui-Young等、2000；Smelt
z等、2002）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
ステロイド耐性又は依存性は、重篤な副作用を誘発することができる強力な免疫調節剤の使用を頼りにする現在の療法として、炎症性疾患に苦しめられている多くの患者にとって、未だに主要な関心事である。望ましからぬ副作用のリスクが殆どないステロイド非応答性の個体で、ステロイドの有効性を増強する単純で直接的な方法は、抗炎症治療を本質的に改善することであり、それ故、問題の疾患を改善して、多くの患者に対して生活の質及び長さを増すことである。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しんでいる、或いは抗炎症治療の投与レベルを下げることから離れることが不可能な、ステロイド難治性又はステロイド依存性の患者におけるステロイドの効果を増強する方法の驚くべき発見に関する。配列、５’−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３’（ここで、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、そして、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない）を有するオリゴヌクレオチドの有効量が、前記患者に対して投与される。
【００３３】
本発明は、又、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しむステロイド難治性の患者における、ステロイドの効果を増強するための薬剤の製造用の、上記のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
添付の特許請求の範囲は、本明細書にその全文が取り込まれている。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、配列番号１によって例示され、大腸の炎症状態（即ち、潰瘍性大腸炎及びクローン病）に罹患した患者であって、等しくステロイド非応答性であり、ステロイド療法を併用していた患者に投与した場合、そのような患者の急速かつ顕著な改善があった。この驚くべき観察は、未だ知られていない作用機序を通して、ステロイド耐性の状況で本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドが、ステロイド耐性でない患者においては現れない疾患の改善を誘導したことを明らかに示した。
【００３５】
図面の説明
図１は、ＥＬＩＳｐｏｔによって分析した５名（ｎ＝５）の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣにおける、ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＬ−１０産生細胞の数を示すグラフである。ＰＢＭＣは、ＩＬ−１０陽性スポットの検出前に、培地（基礎培地）中で、又は濃度を増加したＣｐＧ含有ＤＩＭＳ０１５０若しくはそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、１００、１５０又は２００μＭ）と、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０．１又は１０μＭ）及びＩＤＸ０９００（３μＭ）と、４８時間インキュベートした。柱状グラフの各柱は、５名の異なる血液ドナーからの平均した結果を表す。試料は、各実験／血液ドナーについて３回実施及び分析した。ＩＤＸ０９００は、３人の個人（ｎ＝３）について試験したものであることに注意すること。
【００３６】
図２は、ＥＬＩＳｐｏｔによって分析した５名（ｎ＝５）の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣの、ＤＩＭＳ０１５０促進７２時間に対応するＩＦＮ−γ産生細胞の数を示すグラフである。ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−γ陽性スポットの検出前に、培地（基礎培地）中で、又は濃度を増加したＣｐＧ含有ＤＩＭＳ０１５０若しくはそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、１００、１５０又は２００μＭ）と、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ）及びＩＤＸ０９００（３μＭ）と、７２時間インキュベートした。柱状グラフの各柱は、５名の異なる血液ドナーからの平均した結果を表す。試料は、各実験／血液ドナーについて３回実施及び分析した。ＩＤＸ０９００は、３人の個人（ｎ＝３）について試験したものであることに注意すること。
【００３７】
図３は、ＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイした１０名（ｎ＝１０）の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣの、ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＦＮ−α産生細胞の数を示すグラフである。ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−α陽性スポットの検出前に、培地（基礎培地）中で、又は濃度を増加したＣｐＧ含有ＤＩＭＳ０１５０若しくはそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（ｎ＝９）（０.１、１、５、１０、２５、１００、１５０又は２００μＭ）と、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ又は１０μＭ）と、４８時間インキュベートした。柱状グラフの各柱は、１０名の異なる血液ドナーからの平均した結果を表す。試料は、各実験／血液ドナーについて３回実施及び分析した。ＩＤＸ０９１０の０.１μＭのものは８人のドナーについて、そして同１０μＭのものは４名の個人について、試験したものであることに注意すること。
【００３８】
図４Ａは、ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＬ−１０産生を示すグラフである。ＰＢＭＣは、濃度を増加したＤＩＭＳ０１５０又はそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０又
は２００μＭ）と、インキュベートした。対照として、細胞は、培地（基礎培地）中に置かれたもの、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ）及びＩＤＸ０９００（
３μＭ）で処理したものであった。このグラフは、各２回実施し分析した２人のドナーのうちの１人からのＰＢＭＣの実験の結果を示す。
【００３９】
図４Ｂは、ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。ＰＢＭＣは、濃度を増加したＤＩＭＳ０１５０又はそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０、
２００又は３００μＭ）と、インキュベートした。対照として、細胞は、培地（基礎培地）中に置かれたもの、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ及び１μＭ）、又はＩＤＸ０９００（３μＭ）で処理したものであった。この実験は、１名の血液ドナーからの細胞で実施し、各試料は各２回実施し分析した。
【００４０】
図４Ｃは、ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−α産生を示すグラフである。ＰＢＭＣは、異なる濃度のＤＩＭＳ０１５０又はそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００又は３００μＭ）と、インキュベートした。対照として、細胞は、培地（基礎培地）中に置かれたもの、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ及び１μＭ）及びＩＤＸ０９００（３μＭ）で処理したものであった。このグラフは、各２回実施し分析した２人のドナーのうちの１人からのＰＢＭＣの実験の結果を示す。
【００４１】
図５は、ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣ及びそれらの逆対照での、ＩＬ−１０産生の比較を示すグラフである。ＰＢＭＣは、上清を採取し続いて分析する前に、ＣｐＧ非含有ＯＤＮのＩＤＸ０３０４と共に、ＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０及びＩＤＸ０９１０のＯＤＮ、並びにそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は１００μＭ）、４８時間処理した。培地に処理せずに残った細胞は、ＰＢＭＣ中基準値のＩＬ−１０を表した。４８時間後、上清を集め、続いて次の分析を行った。この実験は、１名の血液ドナーからの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析した。
【００４２】
図６は、ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生の比較を示すグラフである。ＰＢＭＣは、上清を採取し続いて分析する前に、ＣｐＧ非含有ＯＤＮのＩＤＸ０３０４と共にＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０及びＩＤＸ０９１０のＯＤＮ、並びにそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は
１００μＭ）、４８時間処理した。培地に処理せずに残った細胞は、ＰＢＭＣ中基準値のＩＦＮ−γを表した。４８時間後、上清を集め、続いて次の分析を行った。この実験は、１名の血液ドナーからの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析した。
【００４３】
図７は、ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。マウス脾細胞は、上清を採取し続いて分析する前に、ＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０、ＩＤＸ０９１０のＯＤＮ及びそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、ＣｐＧ非含有ＯＤＮの対照ＩＤＸ０３０４と比較しながら、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は１００μＭ）、４８時間処理した。培地中に処理せずに残った細胞は、脾細胞中の基準値のＩＦＮ−γを表す。上清を、促進４８時間後に集め、引き続いて次の分析を行った。この実験は、１頭のマウス脾臓からの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析したものであることに注意すること。
【００４４】
図８は、ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＬ−１０産生を示すグラフである。マウス脾細胞は、上清を採取し続いて分析する前に、ＣｐＧ非含有ＯＤＮのＩＤＸ０３０４と共に、ＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０及びＩＤＸ０９１０のＯＤＮ、並びにそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は１００μＭ）、４８時間処理した。培地中に処理せずに残った細胞は、脾細胞中の基準値のＩＬ−１０を表した。上清を、４８時間後に集め、引き続いて次の分析を行った。この実験は、１頭のマウス脾臓からの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書で使用されるように、用語「ステロイド耐性」及び「ステロイド難治性」は、典型的にはそのような疾患を有する患者に有効である、ステロイド治療での投与が炎症性疾患の患者に効果がないことをいう。これに関連して、「ステロイド耐性」及び「ステロイド難治性」患者は、以下に限定はされないが、全身又は局所に投与されたステロイドに対して、普通の適切な生理学的パラメーターによって判定されるように、非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の患者を含む。２つの型のステロイド耐性、即ち、後天性ステロイド耐性（Ｉ型）及び原発性ステロイド耐性（II型）、の患者が記載されており、両者とも本発明に含まれる。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「ステロイド依存性」は、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能である患者をいう。
【００４７】
ポリヌクレオチドの免疫促進活性を記載する文献としては、以下に限定はされないが、Krug 等 (2001); Bauer 等 (2001); Klinman 等 (1999); Jahn-Schmid 等 (1999) and Tighe 等 (2000) が挙げられる。
【００４８】
免疫促進配列を記載する更なる文献としては、Tokunaga 等 (1992); Yamamoto 等 (1992) and EP 468,520; WO 96/02555; WO 97/28259; WO 98/16247; US Pat. Nos. 6,339,068, 6,406,705, 6,426,334及び6,426,336が挙げられる。
【００４９】
本明細書に引用されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照することにより
それらの全文が本明細書に取り入れられている。
【００５０】
本発明の目的のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結した個々のヌクレオチド単位から形成されたポリヌクレオシドをいう。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノム又はｃＤＮＡを含む、現存する核酸源から得ることができるが、好ましくは合成法によって生産される。ヌクレオシド残基は、多くの公知のヌクレオシド間結合のいずれかによって互いに連結することができる。そのようなヌクレオシド間結合は、限定されることなく、天然のヌクレオシド間リン酸ジエステル結合を含み、或いは実際、これらに限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、及びスルホンヌクレオシド間結合のような、修飾ヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチド」は、又、１つ又はそれ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−又は（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、又はホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書で使用されるものとして、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含んでいるか否かにかかわらず、いずれのヌクレオシド間結合でも有しているポリヌクレオシド及びジヌクレオシドを含むことを明白に意図している。ある種の好ましい実施態様において、これらのヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエート結合、或いはこれらの組み合わせであってもよい。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、又、限定することなく、タンパク質基、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロール及びアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」は、又、限定することなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、及びアルキルリンカー又はアミノリンカーを有する骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含むポリマーを含有する核酸塩基のいずれをも包含する。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、又はこれらの混合物を包含することもできる。本明細書で使用されるように、用語「修飾ヌクレオシド」は、修飾複素環塩基、修飾糖部分、又はこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載するように、非天然ピリミジン又はプリンヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシド又は２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００５３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッド及びキメラオリゴヌクレオチドを包含する。「キメラオリゴヌクレオチド」は、その配列構造内に１つの型以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい例は、ホスホロチオエート、リン酸ジエステル又はホスホロジチオエート領域及びアルキルホスホネート、又はアルキルホスホノチオエート結合のような非イオン性結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（Pedersonら、米国特許第５,６３５,３７７号及び同第５,３６６,８７８号）。
【００５４】
「ハイブリッド・オリゴヌクレオチド」は、１つ以上の型のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリッド・オリゴヌクレオチドの好ましい一例は、リボヌクレオチド又は２’−置換リボヌクレオチド領域、及びデオキシリボヌクレオチド領域を含む（Metelev and Agrawal、米国特許第５,６５２,３５５号；同第６,３４６,６１４号及び同第６,１４３,８８１号）。
【００５５】
本発明の目的のために、用語「免疫調節オリゴヌクレオチド」は、哺乳類のような脊椎動物に投与した場合、生体において免疫系を促進する又は免疫系を抑制するのいずれかの免疫応答、又はこれら両者を誘導する上記のようなオリゴヌクレオチドをいう。本明細書で使用するように、用語「哺乳類」は、限定することなしに、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトを包含する。
【００５６】
好ましくは、免疫調節オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの天然に存在するリン酸ジエステル、又は１つの修飾ホスホロチオエート若しくはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含み、しかし好ましい結合又は実際に骨格修飾は、限定することなく、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、リン酸トリエステル、リン酸チオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、フォルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデート、特に一級アミノホスホルアミデート、Ｎ３ホスホルアミデート及びＮ５ホスホルアミデート、及び立体特異的結合（例えば、（Ｒｐ）−又は（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、又はリン酸トリエステル結合）を包含する。
【００５７】
用語「免疫調節応答」は、免疫調節オリゴヌクレオチドで攻撃した場合に免疫応答の変化を記載する。この変化は、インターフェロンのようなある種のサイトカイン及び増殖のようなその他の生理学的パラメーターの放出を通じてしばしば測定され得るものである。この応答は、免疫系を促進するよう作用するもの、及び問題となっている免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるサイトカインに依存して免疫系を抑制するものと同じであり得る。
【００５８】
ある種の実施態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、式、５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’、式中、Ｐｙｒは天然又は合成ピリミジンヌクレオシド及びＰｕｒは天然又は合成プリンヌクレオシドである、の免疫調節ジヌクレオチドを含む。ある種の好ましい実施態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、式、５’−Ｐｕｒ*−Ｐｕｒ−３’（ここで、Ｐｕｒ*は合成プリンヌクレオシド及びＰｕｒは天然又は合成プリンヌクレオシドである）の免疫調節ジヌクレオチドを含む。種々の場合において、ジヌクレオチドは、ＲｐＧ、Ｃ*ｐＧ又はＹＺとして表され、この場合、それぞれ、Ｒ、Ｃ*又はＹは合成プリンを表す。特に好ましい合成プリンは、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである。この合成プリンがジヌクレオチドのＰｕｒ*位置にある場合、免疫促進効果の種特異
性（配列依存性）が克服され、そしてサイトカイン特性が改善される。本明細書で使用されるように、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分が単環核酸塩基であるヌクレオシドをいう。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分が二環核酸塩基であるヌクレオシドをいう。本発明の目的のために、「合成」ピリミジン又はプリンヌクレオシドは、非天然のピリミジン又はプリン塩基、非天然の糖部分、又はこれらの組み合わせを包含する。
【００５９】
ある種の実施態様において、ヌクレオシドの糖部分は、非天然の糖部分であり得る。本発明の目的のために、「天然の糖部分」は、核酸の一部分、例えば、リボース及び２’−デオキシリボースとして天然に存在する糖部分であり、そして、「非天然の糖部分」は、核酸の一部分として天然には存在しないが、オリゴヌクレオチド用の骨格において使用することができる、どのような糖、例えば、限定されないがヘキソースでもよい。アラビノース及びアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００６０】
本発明による好ましい免疫調節部分は、更に、限定されないが、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−メトキシエチル−リボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボース及び２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを包含する２’−置換ペントース糖類；限定されないが、３’−Ｏ−メチルリボースを包含する３’−置換ペントース糖類；１’，２’−ジデオキシリボース；アラビノース；限定されないが、１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノース、３’−ヒドロキシアラビノース及び２’−置換アラビノース糖類を包含する置換アラビノース糖類；限定されないが、１，５−アンヒドロヘキシトールを包含するヘキソース糖類；及び限定されないが、α−アノマーを包含する糖修飾を有するヌクレオシドを包含する。
【００６１】
別の実施態様において、本発明の好ましい免疫促進部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドを含む別の炭水化物骨格修飾及び置換を有するオリゴヌクレオチド、及び、限定されないが、アルキルリンカー又はアミノリンカーを含む、約２オングストロームから約２００オングストロームの長さを有する骨格リンカーセクションを有するオリゴヌクレオチドを更に包含する。アルキルリンカーは、分枝状又は非分枝状、置換又は非置換、及び純粋なキラル又はラセミ混合物であってもよい。最も好ましくは、そのようなアルキルリンカーは、約２から約１８個の炭素原子を有する。ある種の好ましい実施態様において、そのようなアルキルリンカーは、約３から約９個の炭素原子を有する。ある種のアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、及びチオエーテルからなる群から選択された１つ又は２つ以上の官能基を包含する。ある種の官能性アルキルリンカーは、式−Ｏ−(ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−)n（ｎ＝１〜９）のポリ（エチレングリコール）リンカーである。ある種の別の官能性アルキルリンカーは、ペプチド又はアミノ酸である。
【００６２】
更なる実施態様において、本発明の好ましい免疫促進部分は、限定されないが、−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド及びａ−デオキシリボヌクレオシドを含むＤＮＡイソ型を包含する。本発明による好ましい免疫促進部分は、３’−修飾体を取り入れ、更に、限定されないが、２’−５’、２’−２’、３’−３’及び５’−５’結合を含む、非天然ヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシドを包含する。
【００６３】
本発明による免疫調節オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を経由する少なくとも５つのヌクレオシド、又は非ヌクレオチド結合を経由する官能化核酸塩基又は糖を含む。本発明の目的のために、「非ヌクレオチドリンカー」は、共有結合又は非共有結合を経由してオリゴヌクレオチドに結合することができる、いずれかの部分である。
【００６４】
非共有結合は、限定されないが、静電相互作用、疎水性相互作用、スタッキング相互作用、及び水素結合を包含する。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上に記載したように、ヌクレオシド間結合、例えば２つのヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を直接結ぶリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートをいうことを意味しない。本発明の目的のために、そのような直接の３’−３’結合（リンカーは含まれない）は、「ヌクレオチド結合」であると考えられている。
【００６５】
ある種の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されないが、金粒子を含む金属である。ある種の別の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、可溶性又は不溶性生分解性ポリマービーズである。
【００６６】
なお別の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに結合できる官能基を有する有機部分である。そのような結合は、好ましくは、安定した共有結合によるものである。
【００６７】
ある種の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定なしに、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン及びオリゴ糖を含む生体分子である。別の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、小分子である。本発明の目的のために、小分子は、分子量１,０００Ｄａ未満を有する有機部分である。
【００６８】
ある種の実施態様において、小分子は脂肪族又は芳香族炭化水素であり、そのいずれかは、場合によって、オリゴヌクレオチドに接続した直鎖又はそれに付属したもののいずれかであり、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、及びチオ尿素からなる群から選択された１つ又はそれ以上の官能基である。小分子は、環式又は非環式であり得る。小分子リンカーの例としては、限定されないが、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン及び抗生物質を包含する。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを記載する目的のために、用語「小分子」はヌクレオシドを包含することを意図していない。
【００６９】
ある種の実施態様において、小分子リンカーは、グリセロール、又は式、ＨＯ−(ＣＨ2)o−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ2)p−ＯＨ、式中、ｏ及びｐは独立に、１から約６、１から約４、又は１から約３の整数である。ある種の別の実施態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。ある種のそのような誘導体は、式、ＨＯ−(ＣＨ2)m−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−ＮＨＣ(Ｏ)−ｍ−ＯＨ、式中、ｍは０から約１０、０から約６、２から約６、又は２から約４の整数である。
【００７０】
修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増大のために、しばしば、天然の形態より大きいことが好ましい。オリゴヌクレオチドは、通常、２つを超える、及び典型的には、１０を超える、及び１００に至るまでのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、好ましくは約８と約４０の間、最も好ましくは約８と約２０の間である。正確な大きさは、多くの因子に依存するであろうし、言い換えると、オリゴヌクレオチドの究極の機能又は用途に依存している。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はこれらの組み合わせを含む、如何なる様式で生成してもよい。
【００７１】
本発明の方法において、オリゴヌクレオチドは、限定なしに、吸入、眼投与、鼻腔内、非経口、経口、皮内及び直腸投与のような、いずれの適切な投与経路によっても投与することができる。もし患者が、ステロイド治療又は免疫調節剤の使用のような抗炎症治療中である場合は、ステロイド及び免疫調節剤は、オリゴヌクレオチドと一緒に又は別々に投与することができる。オリゴヌクレオチドの投与経路は、ステロイドの投与経路に依存する。
【００７２】
本明細書で使用される慣用句「治療的有効量」は、ある程度の有益な程度まで、好ましくは少なくとも３０パーセントまで、より好ましくは少なくとも５０パーセントまで、そしてなおより好ましくは少なくとも９０パーセントまで増強するのに十分な量に関する。最も好ましくは、ステロイド耐性が治療されることである。
【００７３】
用語「ステロイド」は、コルチコステロイド及びグルココルチコステロイドの両者を包含するように使用される。用語「ＣＧ含有オリゴヌクレオチド」は、全配列長内に、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、そして好ましくは長さで８から１００核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを包含するように使用される。
【００７４】
表現「ステロイドの有効性を増強する」は、本明細書では、ＣＧ含有オリゴヌクレオチドを用いた同時又は逐次治療、好ましくは前治療、が炎症を管理するのに必要なステロイド投与量の減少を示す、臨床像として明らかなステロイド節約効果を包含する。表現「ステロイドの有効性を増強する」は、又、同時に若しくは実質的に同時に、又は逐次に若しくは実質的に同時にのいずれであれ、炎症を管理するのに必要なステロイド投与量の減少を示す、ＣＧ含有オリゴヌクレオチド及びステロイドの相乗的使用を包含することを意図している。表現「ステロイド耐性」又は「ステロイド難治性」は、問題の疾患を治療するのに通常有効且つ十分であると見なされる現在の治療処置に、適切に応答することができない患者を包含して使用される。表現「ステロイド依存性」は、患者の状態を悪化することなく、又は問題の疾患の症状の重症度が増加することなく、現在の療法を取り止めることができないと観察される患者を含めて使用される。
【００７５】
１つの態様において、本発明は、本発明による免疫調節オリゴヌクレオチド及び生理学的に許容される担体を含む医薬処方を提供する。本明細書で使用されるように、用語「生理学的に許容される」は、免疫調節オリゴヌクレオチドの有効性を阻害せず、そして細胞、細胞培養、組織又は生体のような生物系に適合する材料をいう。好ましくは、生物系は、脊椎動物のような生命体である。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「担体」は、いかなる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、脂質又は医薬処方に使用するための、当業者に周知のその他の材料を包含する。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の適用のための投与経路に依存するであろうことは理解されるであろう。これらの材料を含有する医薬として許容される処方の製造は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００７７】
薬学的に許容される混合物における免疫調節オリゴヌクレオチドの濃度は、投与される化合物の投与量、採用された化合物の薬動力学的特性、患者の年齢、性別及び状態、並びに投与経路を包含する、いくつかの因子に依存して変化するであろう。ステロイド耐性又はステロイド依存性患者においてステロイドの有効性を増強するための免疫調節オリゴヌクレオチドの有効量は、受容者である哺乳動物の約０.０１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.１μｇから約１０ｍｇ、最も好ましくは約１μｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重の間の広範な範囲である。
【００７８】
ある種の好ましい実施態様において、本発明による免疫調節オリゴヌクレオチドは、限定されないが、ＴＮＦ抗体のような抗炎症薬、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリンその他のサリチル酸類のような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、セレコキシブ（Celebrex(登録商標)）のようなｃｏｘ−２阻害剤、コルチコステロイド（吸入、経口、経直腸）、肥満細胞安定化剤、及びロイコトリエン調節薬と併用して投与される。
【００７９】
本発明のこの態様の目的のために、用語「併用して」は、同じ患者における同じ疾患を治療する過程で、同時投与、及び数ヶ月まで離れた一次的間隔の順序を包含する、いずれかの順序で免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを、意味し包含する。そのような併用治療は、又、免疫調節オリゴヌクレオチドの単回を超える投与も包含する。より好ましくは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、患者がステロイド療法を開始した後のステロイド耐性又はステロイド依存性患者に投与され、そしてそれは安定した投与方式である。
【００８０】
１つの実施態様において、本発明は、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しむステロイド難治性の患者における、ステロイドの効果を増強する方法であって、下記配列：
５’−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３’
式中、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない；
を有するオリゴヌクレオチドの有効量を、前記患者に投与する方法に関する。本発明の方法の別の実施態様において、ｍは１〜８０でありそしてｎは１〜８０、ｍは１〜６０でありそしてｎは１〜６０、ｍは１〜４０でありそしてｎは１〜４０、ｍは１〜２０でありそしてｎは１〜２０、ｍは１〜１２でありそしてｎは１〜１２、ｍは１〜１０でありそしてｎは１〜１０、ｍは１〜８でありそしてｎは１〜８、ｍは１〜６でありそしてｎは１〜６、ｍは１〜４でありそしてｎは１〜４、又はｍは１〜２でありそしてｎは１〜２である。
【００８１】
本発明により使用されるオリゴヌクレオチドは、又、表１に例示されている。
【００８２】
本発明による方法において、患者は、現在コルチコステロイド治療にあるものであり、患者は、ステロイド依存性であり、現在コルチコステロイド治療を受けている、又は患者は、現在抗炎症治療を受けている。
【００８３】
本発明方法の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ステロイドと併用して投与される。
【００８４】
本発明による方法は、炎症状態に苦しめられている患者におけるステロイドの有効性を増強するためのものである。炎症状態は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ、乾癬、肺気腫、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択されたものである。１つの実施態様において、炎症状態は潰瘍性大腸炎であり、そして別の実施態様において、炎症状態はクローン病である。
【００８５】
本発明方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の、そして前記にて定義された方法に従って修飾することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を有し、リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である。修飾は、オリゴヌクレオチドの全長に沿った如何なる位置における１つ又はそれ以上のヌクレオチドで生じてもよい。１つの実施態様において、核酸骨格は、５’ヌクレオチド結合間でのリン酸骨格修飾を包含する。或いは又、核酸骨格は、３’ヌクレオチド結合間でのリン酸骨格修飾を包含する。
【００８６】
ＤＮＡに加えて、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの類縁体又は模倣体からなるものでもよく、限定されないが、以下を包含する：メチルホスホネート、Ｎ３’→Ｐ５’−ホスホロアミデート、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、アラビノシル核酸（ＡＮＡ）、フルオロアラビノシル核酸（ＦＡＮＡ）、メトキシエチル核酸（ＭＯＥ）。
【００８７】
更に、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、上に定義されたように、少なくとも１つの修飾糖部分核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖部分は、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である。
【００８８】
本発明は、又、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しむステロイド難治性の患者における、ステロイドの効果を増強するための薬剤を製造するための、下記配列：
５’−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３’
式中、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない；
を有するオリゴヌクレオチドの使用に関する。別の実施態様において、ｍは１〜８０でありそしてｎは１〜８０、ｍは１〜６０でありそしてｎは１〜６０、ｍは１〜４０でありそしてｎは１〜４０、ｍは１〜２０でありそしてｎは１〜２０、ｍは１〜１２でありそしてｎは１〜１２、ｍは１〜１０でありそしてｎは１〜１０、ｍは１〜８でありそしてｎは１〜８、ｍは１〜６でありそしてｎは１〜６、ｍは１〜４でありそしてｎは１〜４、又はｍは１〜２でありそしてｎは１〜２である。
【００８９】
上記で定義した方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、医薬の製造に使用することもできる。
【００９０】
本発明による使用において、患者は、現在ステロイド治療下にあり、患者はステロイド依存性であって、現在ステロイド治療下にあり、又は患者は現在抗炎症治療下にある。１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ステロイドと併用して投与される。
【００９１】
炎症状態は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ、乾癬、肺気腫、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択されたものである。１つの実施態様において、炎症状態は潰瘍性大腸炎であり、別の実施態様において、炎症状態はクローン病である
【００９２】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、配列番号１によって例示され、ＣｐＧモチーフを含有する免疫調節ＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチドの例として作用する。本発明は、配列番号１によって表される免疫調節オリゴヌクレオチドを、大腸の炎症状態（即ち、潰瘍性大腸炎及びクローン病）に罹患した患者であって、等しくステロイド非応答性であり、ステロイド療法を併用していた患者に投与した場合、そのような患者の急速かつ顕著な改善があって、投与するステロイドの投与量を減少することができる、という驚くべき発見を開示した。契約によって、前記免疫調節オリゴヌクレオチドを、ステロイドを除外し、患者がステロイド応答性である、潰瘍性大腸炎に罹患した患者に投与した場合、彼らの疾患の改善は見られなかった。この驚くべき観察は、未だ知られていない作用機作を通して、ステロイド耐性の状況でＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫調節効果が、ステロイド耐性でない患者においては明らかでない疾患の改善を誘導したことを明らかに示した。
【００９３】
以下の実施例では、先ず、配列番号１が免疫調節オリゴヌクレオチドとして機能すること、及び種々の長さの配列番号１が活性を保持することを確認する。後の実施例は、配列番号１の単回直腸投与を受けた、潰瘍性大腸炎及びクローン病の患者における、臨床データの要約である。
【実施例】
【００９４】
材料及び方法
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）
本発明において、多くのＯＤＮが、ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）又はマウス脾細胞を用いた促進実験に使用された。使用されたＯＤＮを表１に列挙する。オリゴヌクレオチドのいくつかにおいて、ジヌクレオチドモチーフを「逆転」させ、対照として機能させた。
【００９５】
【表１】
【００９６】
処方
Aveciaにより合成されたＤＩＭＳ０１５０及びＩＤＸ０２５０を除き、全てのＯＤＮはBiomers. net, Germanyによって合成され、供給された。
【００９７】
使用した凍結乾燥ＯＤＮ（表１参照）（ヒトＤＩＭＳ０１５０を除き全て）を、先ず、少量の蒸留水で希釈した。完全に混合した後、各ＯＤＮを、更に一連の異なった希釈度に水で希釈した。各希釈について、少なくとも５回以上、分光光度計（SmartSpec 3000, BioRad）を使用して、光学濃度（ＯＤ）Ａ２６０／Ａ２８０を測定した。原液の濃度を決定するために、全ての希釈について、全ての読みの平均濃度を計算した。これらの原液を、全て−２０℃で貯蔵した。全てのＯＤＮについて、濃縮原液の一部を更に希釈し、１つの高濃度及び１つの低濃度の原液を得た（それぞれ、１μｇ／μｌ及び２０μｇ／μｌ）。上に記載したようにして、分光光度計を使用してＯＤを測定し、同じ手順で濃度を決定した。
【００９８】
実験で使用した異なる希釈標準溶液：０.１μＭ、１μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ及び３００μＭを、高濃度原液（２０μｇ／μｌ）及び低濃度の原液（１μｇ／μｌ）を使用して、ＰＢＳで更にＯＤＮを希釈することにより調製した。
【００９９】
ＤＩＭＳ０１５０を蒸留水で希釈し、凍結乾燥ＯＤＮについて述べたのと同様にして濃度を決定した。
【０１００】
生物系
細胞の調製
血液試料は、健常ボランティアから得た。ＰＢＭＣをFicoll-Paque Plus（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用して密度勾配遠心分離法により単離し、生理食塩リン酸バッファー（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Life
Technologies）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Life Technologies）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma）、ゲンタマイシン（Sigma
）及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Gibco, Life Technologies）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Sigma）に再懸濁した。細胞は０.４％トリパンブルー溶液（Sigma Aldrich）を使用して計数した。
【０１０１】
マウス脾細胞の調製
各実験用に、脾臓をＣ５７ＢＬ／６マウスから摘出した（マウスは、MTC animal unit,
Karolinska Institutetから入手し、ナイロン細胞濾過器を使用して滅菌条件下に単個細胞浮遊液を調製した（細胞濾過器１００μＭ、BD Falcon）。次いで、細胞を完全ＲＰＭ
Ｉ１６４０（５％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０）中、１,２００ｒｐｍ、７〜１０分間で１回洗浄した。上清を静かにデカントし、細胞を赤血球細胞溶解バッファー（Sigma）（１ｍｌ）に再懸濁し、室温で、最大２分間インキュベートした。別の完全培地（５ｍｌ）を、既に記載したようにして遠心する前に加えた。上清を静かにデカントした後、細胞ペレットを完全培地に再懸濁し、細胞数を０.４％トリパンブルー溶液で測定した。
【０１０２】
技術
ＥＬＩＳｐｏｔ
既に記載したように、プレコートしたＰＶＤＦ系の、ＥＬＩＳｐｏｔ（MABTech AB, Sweden）用膜プレートにＰＢＭＣを播種した。細胞を加える前に、ＰＤＶＦプレートを、それぞれＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０（ＥＬＩＳｐｏｔキットに含まれる；ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０は、MABTech AB, Swedenから入手）に対する特異的被覆抗体で一夜、＋４℃で被覆した。ＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩｃに５００,０００細胞／ウエルで播種した。播種後に直接、細胞をそれぞれのオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）で処理した。最終ＯＤＮ濃度が、１００μｌ／ウエルの総容積中、０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０及び２００μＭになるように、各ＯＤＮを特定のウエルに加えた。試料は、３通り作成した。処理後、細胞を５％炭酸ガス、３７℃、加湿インキュベーターで、インキュベートした。ＩＦＮ−αを、２４、４８及び７２時間に、それぞれ２、１０及び３ドナーにつき分析した。ＩＦＮ−γは、２、７及び５ドナーについて、それぞれ２４、４８及び７２時間に分析した。ＩＬ−１０は５及び４ドナーにつき、２４、４８及び７２時間に分析した。サイトカイン産生細胞の検出及び計数は、生産者のマニュアルに従って実施した。ＥＬＩＳｐｏｔリーダーソフトウエアは、Center for Molecular Medicine, CMM, Karolinska Hospital, Solna, SwedenにあるＡＩＤ２.３.３であった。
【０１０３】
酵素免疫測定法ＥＬＩＳＡ
既に記載したようにして調製したＰＢＭＣを、ＰＲＭＩｃ中５００,０００細胞／ウエルで、９６ウエルフラット底面細胞培養プレートに播種した。播種後に直接、細胞をそれぞれのＯＤＮで処理した。最終ＯＤＮ濃度を１００μｌ／ウエルの総容積中、０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、２００及び３００μＭとなるように、特定のウエルに各ＯＤＮを加えた。試料は２重に調製した。処理後、細胞を５％炭酸ガスで、３７℃、４８時間、加湿インキュベーターでインキュベートした。上清を集め、製造者のプロトコールに従って−２０℃で貯蔵した後、特定のQuantikine ELISAを使用して、サイトカインレベルを決定した（ヒトＰＢＭＣ実験には、以下のＥＬＩＳＡキットを使用した：ヒトＩＬ−１０及びヒトＩＦＮ−α。マウス脾細胞実験用には、ネズミＩＬ−１０及びネズミＩＦＮ−α、R&D Systems, Abingdon, UK、を使用した）。
【０１０４】
〔実施例１〕
ＤＩＭＳ０１５０で促進したＰＢＭのサイトカイン産生の評価
ＣｐＧ含有ＯＤＮ、ＤＩＭＳ０１５０の免疫促進活性を、ヒトＰＢＭＣで評価した。仮説は、異なった濃度のＤＩＭＳ０１５０で、異なった時間インキュベートしたＰＢＭＣは、ＣｐＧに依存する様式でサイトカイン産生を促進するであろう、というものであった。そのため、ＣｐＧ−ＤＮＡに応答してＰＢＭＣによって産生されることが知られている３つのサイトカイン、即ち、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを選択した。実際、別々の健常なドナー由来のＰＢＭＣは、ＥＬＩＳｐｏｔによって分析されたように、ＤＩＭＳ０１５０に応答して、全て時間に依存して（データは示していない）及び投与量に依存して、サイトカイン産生を示した。試験した３つのサイトカインの中では、ＩＬ−１０が、ＤＩＭＳ０１５０で促進４８時間後、最も応答したサイトカインであった（図１）。ＩＬ−１０に対照的に、ＤＩＭＳ０１５０は、試験した全ての濃度及び時間点において、ＰＢＭＣにおいてＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γを誘導するのが、ＩＦＮ−γの７２時間（図２参照）及びＩＦＮ−αの４８時間（図３を参照）に代表されるように、より弱かった。ＤＩＭＳ０１５０のＣｐＧ逆転型であるＩＤＸ０５２６も、又、潜在的なサイトカイン産生のＣｐＧ依存性を評価するために、全ての実験に含めた。ＩＤＸ０５２６で処理したＰＢＭＣは、ＤＩＭＳ０１５０での促進と比較して、試験した３つの全てのサイトカインの産生はないか、又は、減少を示した（図１、２及び３を参照）。
【０１０５】
〔実施例２〕
ＤＩＭＳ０１５０に反応したＰＢＭＣのサイトカイン産生の定量
ＥＬＩＳｐｏｔにより観察された陽性細胞からのサイトカイン産生量を定量するため、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。ＰＢＭＣをＤＩＭＳ０１５０の濃度を増加してインキュベートし、上清を、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γのレベルにつき分析した。ＥＬＩＳｐｏｔのデータによって得られたこれらの結果に一致して、０.１μＭと２００μＭの間（又はＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γについては３００μＭ）の濃度を用いて、インキュベーション４８時間後に、全てのサイトカインのＣｐＧ依存性用量応答が得られた（図４Ａ、Ｂ及びＣを参照）。ＥＬＩＳｐｏｔとＥＬＩＳＡは異なったパラメーター（即ち、特定のサイトカインを分泌する細胞数に対して、分泌されたサイトカイン量）を測定するので、ＥＬＩＳＡ測定は、注目するサイトカインを分泌する細胞数にかかわらず、特定の濃度で産生される実際の量に関する補足的情報として考慮すべきである。それ故、用量応答パターンは、これらの異なった技術から得られたものを比較する場合相異が表れるであろう。定量ＥＬＩＳＡにより分析されたＤＩＭＳ０１５０に対応する個々の相異について、ＥＬＩＳｐｏｔと比較して、広範に調べた（１〜３ドナー）。
【０１０６】
〔実施例３〕
ＰＢＭＣにおける別々のＣｐＧ−ＯＤＮｓとのＤＩＭＳ０１５０の比較
ＤＩＭＳ０１５０促進の用量応答を、公知のヒト及びネズミＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０及びＩＤＸ０９２０とそれぞれ比較した。加えて、このＯＤＮ配列も、又、ＣｐＧジヌクレオチドを含有しており、ＣｐＧ−ＤＮＡとして作用するであろうから、ＩＤＸ０２５０も、又、この実験に組入れた。ＩＤＸ０２５０のＣｐＧ側面塩基は、ＤＩＭＳ０１５０と少し異なっており、このことは、促進に際して、ＰＢＭＣでのサイトカイン応答のレベルに影響するであろう。この研究において、ＰＢＭＣは、ＣｐＧ−ＯＤＮで４８時間処理され、表面に浮かぶ前のそれら個々の逆転ＧｐＣ対照を、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γＤＩＭＳ０１５０についての定量ＥＬＩＳＡアッセイを用いて２重に分析し、ＩＤＸ０２５０は１００μＭで同様のＩＬ−１０応答を引き起こしたが（図５）、しかし最低濃度（０.１μＭから１μＭ）では、これらＯＤＮはＰＢＭＣのＩＬ−１０産生を促進しなかった。相対的に、ＰＢＭＣとＩＤＸ０９１０又はＩＤＸ０９２０とのインキュベーションでは、使用した低濃度で最高のＩＬ−１０産生に達した。上清のＩＦＮ−γ分析では、ＩＬ−１０と比較して、このサイトカインは低分泌となった（図６）。ＧｐＣの逆転対照又はＩＤＸ０３０４のいずれも、ＩＦＮ−γを誘導しなかったが、ＰＢＭＣにおいて幾分かのレベルでＩＬ−１０分泌が、２つの対照ＧｐＣ−ＯＤＮ、ＩＤｘ０９１５及びＩＤＸ０９２５、で観察された。このことは、これらＯＤＮに完全なホスホロチオエート骨格が存在するからであろう。
【０１０７】
〔実施例４〕
マウス脾細胞におけるＤＩＭＳ０１５０と異なったＣｐＧ−ＯＤＮｓとの比較
ヒト及びマウスは、異なるＣｐＧ−ＯＤＮに応答する。ＤＩＭＳ０１５０の免疫促進効果を、マウス脾細胞系で、ＰＢＭＣにおいて実施されたＣｐＧ−ＯＤＮと同じセットと比較した（図６参照）。脾細胞をＣｐＧ−ＯＤＮ及びそれらの個々の逆転陰性ＧｐＣ対照と、上清をＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０について分析する４８時間前に、定量的ＥＬＩＳＡアッセイを使って２重に処理した。脾細胞をＤＩＭＳ０１５０と処理した場合、使用した最高濃度で強いＩＦＮ−γ応答がもたらされた。しかし、このアッセイで、ＩＤＸ０２５０はＤＩＭＳ０１５０よりもより強力であって、このことは、ＣｐＧの周囲の配列が応答のレベルにインパクトを有することを示唆した（図７）。最も顕著なＩＦＮ−γレベルは、使用した低濃度でＣｐＧ−ＯＤＮ、ＩＤＸ０９２０で促進した細胞からの上清で見出された。最後に、ＩＬ−１０のレベル（図８）について上清を分析すると、ＩＦＮ−γを測定した場合に観察されたのと類似のパターンが示された。ＧｐＣは逆転ＯＤＮ対照のいずれもＩＦＮ−γを誘導しなかったが、しかしＩＤＸ０９２５は、ネズミの系でＩＬ−１０のいくらかのレベルを誘導した。
【０１０８】
〔実施例５〕
研究コンセプトの予備試験
研究コンセプトの予備試験については、付録Ｉに全てを記載する。
試験目標
第１目標：
潰瘍性大腸炎及びクローン病患者における、配列番号１と表示されるＤＮＡを基礎とするオリゴヌクレオチドの使用に関する安全性の問題を評価すること。
第２目標：
内視鏡的及び臨床的寛解／改善率、組織学的改善及び臨床検査パラメーターにおける変化によって定量された、臨床的有効性を探究する。
【０１０９】
試験は、プラセボ対照、二重盲検単回投与であり、コルチコステロイドに非応答性か、又はコルチコステロイド依存性の患者で、同時にステロイド療法を受けている患者を考慮する。
使用された投与レベルは、３ｍｇ及び３０ｍｇ投与で、単回直腸投与であった。
【０１１０】
第１周での臨床応答
ｉ）配列番号１ ５／７（７１％）の応答者
ii）プラセボ １／４（２５％）の応答者
全体として、この予備試験は、単回直腸投与後の両投与群において、良好な有効性を示唆した。多分もっと驚くべきことは、全ての応答した患者が試験薬を受けてから１週間以内に応答したように、応答の速さであった。興味あることは、配列番号１を受けた７患者中２名は、今日同様に寛解状態にあり、ステロイドなしであることである。更に、重篤な有害事象は記録されなかった。
【０１１１】
〔実施例６〕
臨床第II相試験
試験目標
第１目標：
軽度から中等度の活性の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の患者における臨床的寛解を導く抗炎症療法として、オリゴヌクレオチド配列番号１の４投与水準（０.３ｍｇ、３ｍｇ、３０ｍｇ及び１００ｍｇ）の各作用能力を、プラセボと比較しながら評価すること。
第２目標：
プラセボと比較しながら、配列番号１のオリゴヌクレオチドの単回直腸投与の忍容性を評価すること、及び配列番号１のオリゴヌクレオチドの有効性及び安全性を４投与水準で更に評価すること、及び直腸投与後の配列番号１のオリゴヌクレオチドの薬物動態を評価すること。
【０１１２】
試験結果
【表２】
【０１１３】
表から、有効薬物を投与されたものの応答率は、２２％（２６／１１９）であり、プラセボは３８％（１１／２９）であった。この試験では、限られた数の患者に、０.３から１００ｍｇの投与量で、配列番号１のオリゴヌクレオチドを単回投与すると、臨床的、内視鏡的若しくは組織病理学的寛解、又は１２週間にわたる応答を誘導することができるということは、確認することができなかったが、しかし、この試験では、薬物の良好な安全特性が実証された。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
この予備試験の患者は、第II相試験におけるよりも、よりよい応答率を得たことは明らかである。予備試験の患者は併用薬としてステロイドの使用が許され、コルチコステロイドに対して耐性又は依存性であったが、第II相試験においては、それは除外基準であったことも明らかである。第II相試験の期間には、ステロイドは禁忌であり、患者はステロイド療法に対して耐性でなく依存性でもなかった。
【０１１６】
予備試験と大規模第II相試験の間の不一致は、コルチコステロイドに対して耐性又は依存性、及びコルチコステロイド併用療法に対して耐性又は依存性である患者は、配列番号１の単回直腸投与に対して、そうでない患者よりもより良好に応答することを示唆している。臨床結果におけるこの驚くべき相異の理由は、明らかでない。しかし、オリゴヌクレオチドを含有するＣｐＧの免疫調節作用は、ステロイド耐性又はステロイド依存性の患者が、再びステロイドに応答することができた程度に、患者の免疫系に有益な変化を誘導することができた。言い換えると、免疫調節オリゴヌクレオチドは、患者の再感受性化をステロイドの抗炎症効果へと誘導するであろう。
【０１１７】
配列番号１の例のように、配列内にＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドはある種のサイトカインを誘導することができ、背景技術おいて述べたように、そのサイトカインについては、ステロイド応答性を調節する役割を有するという証拠が存在するということを、提供された実施例は支持している。そのような観点から、例えばインターフェロンやＩＬ−１０の産生を誘導する免疫調節オリゴヌクレオチドは、有益性を証明しているであろう。
【０１１８】
本明細書において、特定の実施態様が詳細に開示されているが、これは説明の目的だけのための例として行われたものであり、以下に続く付随する特許請求の範囲に関して限定することを意図するものではない。特に、種々の置換、変更、及び修飾が、特許請求の範囲によって定義されたような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行われ得ることは、本発明者によって予期されている。
【０１１９】
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＬ−１０産生細胞の数を示すグラフである。
【図２】ＤＩＭＳ０１５０促進７２時間に対応するＩＦＮ−γ産生細胞の数を示すグラフである。
【図３】ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＦＮ−α産生細胞の数を示すグラフである。
【図４Ａ】ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＬ−１０産生を示すグラフである。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
【図４Ｃ】ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−α産生を示すグラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣ及びそれらの逆対照での、ＩＬ−１０産生の比較を示すグラフである。
【図６】ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生の比較を示すグラフである。
【図７】ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
【図８】ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＬ−１０産生を示すグラフである。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、炎症状態に苦しみ、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能であり、そしてステロイド抗炎症治療中である患者（ステロイド依存性）の抗炎症治療に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫促進方法に関する。更に詳しくは、本発明は、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを、炎症状態に苦しんでいるステロイド難治性又は依存性患者に投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、多くの因子や細胞型に関与する複雑な疾患である。疾患の観点から、長年の研究は、我々に、喘息、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、及びクローン病その他のような炎症性疾患は、独特な炎症性サイトカインの特性を有していることを教えている。これらの特性は、応答するリンパ球の性質の結果である。言い換えれば、炎症は、単に炎症として考えられるものではなく、むしろ、Ｔヘルパー細胞のある種の亜母集団の増殖及び分化を増強する、別の分泌されたサイトカインに関連する異なった炎症性疾患と考えられる。
【０００３】
免疫応答の性質及び規模は、免疫系が曝された外来抗原の特性によって大部分指図される。この事象は、液性免疫及び細胞性免疫の発生を究極的に導く一連の事象を動かし始める。これらの二つのエフェクター機能は、ヘルパーＴ細胞の２つの亜母集団の存在によってもたらされる（図１を参照）。更に指示されたように、異なった炎症性疾患は、認められるサイトカイン特性に応じてＴｈ１かＴｈ２のいずれかに分けることができる。
【０００４】
「正常な」健康状態下では、Ｔｈ１に特有である前炎症性サイトカインとＴｈ２に特有である抗炎症性サイトカインの間のデリケートなバランスがある。もしこのバランスが失われると、主にＴｈ１又はＴｈ２型の炎症をもたらす分極がおこり、疾患の臨床的徴候が始まる。
【０００５】
Ｔｈ１のサイトカイン特性が減少することによる、例えば、Ｔｈ１型疾患における「不均衡」を元に戻し、それによりＴｈ２特性をもっと起こさせる、いくつかの新しい治療形態が、今や試みられている（Neurath等, 1995; Mannon et al, 2004）。最近５年位にわたって、多くの研究者が免疫療法への応用において免疫促進剤として、オリゴヌクレオチドの使用の有効性をインビトロ及びインビボの両者で実証している。リン酸ジエステル及び修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでも免疫を促進することができるという観察は、治療ツールとしてこの効果を発展させる関心の高まりを作り出した。
【０００６】
細菌のＤＮＡは、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞を活性化することができる免疫促進効果を有するが、脊椎動物のＤＮＡは有していない（総説：Krieg, 1998, Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp.431-448）。細菌ＤＮＡのこれらの免疫促進効果は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドの存在の結果であること、特に、細菌ＤＮＡには普通であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化されているか、不十分にしか表示されていない塩基状況（ＣｐＧモチーフ）の存在の結果であることが判明している（Krieg et al, 1995）。細菌ＤＮＡの免疫促進効果は、これらＣｐＧモチーフを含有したオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）で模倣することができる。そのようなＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｂ細胞を含むヒト及びネズミ白血球に対する高度な促進効果；サイトカイン及び免疫グロブリン分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性及びＩＦＮ−γ分泌；及び樹枝状細胞（ＤＣ）及び他の抗原提示細胞の活性化で副刺激分子を発現し、サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の進展を促進するのに重要であるＴｈ１様サイトカインを分泌する作用を有する。天然のリン酸ジエステル骨格ＣｐＧ−ＯＤＮのこれらの免疫促進効果は、ＣｐＧモチーフがメチル化されるとこれらの効果は劇的に減少し、ＧｐＣに変化するか、除去されるか又は変化するという、高度にＣｐＧ特異的である（Krieg等, 1995 and Hartmann 等, 1999）。
【０００７】
初期の研究では、免疫促進ＣｐＧモチーフは、式、プリン−プリン−ＣｐＧ−ピリミジン−ピリミジンに従うと考えられていた（Krieg et al, 1995; Pisetsky, 1996 and Hacker等, 1998）。
【０００８】
現在、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドが、ある種のサイトカインを誘導する、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）（Iho等, 1999: Cowdery等, 1996）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２（Stacey等, 1996; Jakob等, 1998 and Sparwasser等, 1998）の分泌を増強することによって、ヒト及びマウス細胞がＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチドに応答することを示す、かなりの量の公表されたデータがある。
【０００９】
誘導されたサイトカインの性質によって、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、大部分インビトロ及びインビボの両方でＴｈ１特性を誘導すると考えられている（Zimmermann等, 1998; Kline, 2000）。
【００１０】
ＣｐＧモチーフの存在に加えて、研究者は、又、完全ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオアート（ＰＳ）骨格を有する合成オリゴヌクレオチドは、これらのオリゴヌクレオチドがＢ細胞を促進するという点でより強力であるが天然のリン酸ジエステル骨格を有する同じ配列は効果がないという点で、オリゴヌクレオチドの促進効果を増強することができることに気付いている（Zhao等, 1996）。
【００１１】
オリゴヌクレオチドの配列内のＣｐＧモチーフの存在は、強力なＴｈ１サイトカイン応答を誘導することができるが、この応答は、化合物の化学修飾の状態及び一般的な配列構造の全体像を考慮すべきである。
【００１２】
既に炎症の背景技術の紹介で指摘したように、種々の型の炎症性疾患で優勢となる特異的サイトカイン特性がある。例えば、喘息患者において、ＩＬ−４が高値で、ＩＦＮ−γが低値である。このサイトカイン像は、喘息がＴｈ２型の疾患であることを示唆しているであろう。対照的に関節リウマチは、高値のＩＦＮ−γと低値のＩＬ−４が見られることを特徴とするＴｈ１型の疾患に、より関連している。
【００１３】
コルチコステロイド耐性の現象は、リウマチ患者で最も広範に研究されており、そして長年の証拠が蓄積されている潰瘍性大腸炎では余り研究されていないが、多くのサイトカイン異常が指摘されている。両疾患は、Ｔｈ２型に分類されており、インターフェロン及びＩＬ−１０が、コルチコステロイド耐性の発症機序に重要な因子であるとされている。
【００１４】
インターフェロン及びＩＬ−１０のようなサイトカインの内因性産生を誘導することができる免疫増強性オリゴヌクレオチドは、ステロイド抵抗性又はステロイド依存性患者の炎症状態に、有利な態様で影響することができる可能性がある。
【００１５】
ある種のサイトカインが、ステロイド応答性に影響することができるという証拠は、全てコルチコステロイド療法をうけている、コルチコステロイド耐性喘息及び潰瘍性大腸炎患者において行われた臨床治験から集められている。事実、この型の患者の亜集団特性は、以下に記載する臨床治験間の唯一共通の特徴であった。
【００１６】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、多種の先天性免疫応答及び適応的免疫応答の制御に重要な役割を演じている。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）は、ウイルスのような病原に対して宿主防御の中心であるのに対して、II型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）は、免疫応答のＴ細胞仲介制御に主として寄与している（Taniguchi and Takaoka, 2001）。インターフェロンは、又、良性腫瘍性疾患（Gill等, 1995）及びウイルス性疾患（Niederau等, 1996; Zeuzem等, 2000）のような種々のヒトの疾患の成功裡の治療にその地位が見出されている。
【００１７】
或る治験（Simon等, 2003）において、１０名のコルチコステロイド耐性喘息患者に、全員へのプレドニゾン投与に加えてＩＦＮ−α（３×１０6ＩＵ／日）（RoferonA(登録商標)、Roche）を投与した。この治験は、これらの患者において高い有効性を示し、サイトカイン療法後１〜２週間に改善の臨床的徴候が起こり、コルチコステロイドの投与を減らすことが可能となった。著者らは更に、ＩＦＮ−α治療は、ＩＦＮ−γを産生する末梢血Ｔ細胞の能力が増加し、Ｔｈ２型応答（喘息及びアレルギー性疾患に典型的）からＴｈ１型応答にシフトしたことを示唆していることを指摘している。
【００１８】
その上更に、著者らは、サイトカイン療法を受けたこれら患者においてＩＬ−１０を分泌する血液Ｔ細胞が増加したことを示した。コルチコステロイドは、部分的にＩＬ−１０のレベルを増加することによって、それらの抗炎症効果を仲介するので、著者らは、外因性のＩＦＮ−αの投与がこれらの患者におけるコルチコステロイド耐性を破ったと結論している。
【００１９】
Muschら（２００２）は、コルチコステロイド難治性潰瘍性大腸炎患者において、ＩＦＮ−βを静脈投与した場合、高い応答率を実証した。２５名の重症潰瘍性大腸炎患者で行った予備的研究で、難治性薬物療法が基礎的な薬物療法になったことを証明した。全ての患者は、サイトカイン治療時に、コルチコステロイド治療を受けていた。治療に続いて、２５名中２２名（８８％）が、治療開始後１週間に臨床活性指数（ＣＡＩ）の強い減少に気付くとともに、３週間以内に小康状態に入った。応答の平均長さは１３ヵ月であった。
【００２０】
別の試験において、Sumer等（１９９５）は、コルチコステロイド耐性潰瘍性大腸炎患者における皮下投与ＩＦＮ−αサイトカイン治療に対して８２％の改善率を報告した。彼らは、更に、２３名の患者がサイトカイン療法に迅速改善（１５日以内）で応答し、治療６ヵ月後に完全な臨床的及び内視鏡的寛解であったことに言及した。３名の患者は、長い療法後に寛解に入ったが、しかし、２６名の患者全てが、追加的療法を受けることなく２年を越えて観察され、この期間完全な臨床的及び内視鏡的寛解を維持した。
【００２１】
コルチコステロイド耐性の発症機序において関心を集めた別のサイトカインは、ＩＬ−１０である。このサイトカインは、炎症性サイトカインの産生を抑制することができるという点で強力な抗炎症効果を有していると信じられている。それは、又、ある種の炎症性疾患、最も顕著にはアレルギー及び喘息（Hawrylowicz等, 2005）の発症に広範な関わり
合い有しており、そして免疫応答の制御に中心的役割を演じている。コルチコステロイドは、部分的にＩＬ−１０産生を増強することによって、それらの抗炎症効果を発揮していると信じられている（Richards等, 2005）。
【００２２】
多くの臨床研究が、より強い炎症に潜在的に寄与しているであろう喘息患者において、ＩＬ−１０の充分なレベルが一般的に欠損していることを示唆している。中等度のアトピー性喘息の小児で行われた無作為二重盲検臨床治験において、Stelmach等（２００２）は、コルチコステロイドの１種であるトリアムシノロン、及び抗ロイコトリエンであるモンテルカストを用いた治療は、血清中のＩＬ−１０のレベルを有意に増加させ、更に加えて、臨床症状を有意に改善したことを明らかにした。
【００２３】
別の臨床試験において、ＩＬ−１０及びＩＬ−１０産生細胞のレベルが、中等度の喘息と比較下場合、重症持続性喘息の患者において有意に減少していることが示された（Tomitai等, 2002）。これらの観察は、喘息患者においてＩＬ−１０を産生することができる細胞の生産が欠損しているという以前の発見（Tormey等, 1998）に一致した。
【００２４】
この欠損は、又、コルチコステロイド耐性喘息患者においても存在することが示された。正常な状態下で、コルチコステロイドは、コルチコステロイド感受性患者ではＩＬ−１０の産生が増加する原因となるであろう。しかしながら、Hawrylowicz等（２００２）は、コルチコステロイド耐性喘息患者においては、コルチコステロイドはＩＬ−１０合成を誘導することができなかったことを確認することができた。これらの観察は、ＩＬ−１０合成の誘導とコルチコステロイドの有効性の間に強い関係があることを示している。
【００２５】
最近発行された研究（Xystrakis等、2006）において、著者らは、コルチコステロイド
耐性喘息患者からＰＢＭＣを単離し、ビタミンＤ３とデキサメタゾンをこれらの培養に加えると、デキサメタゾン単独で培養したコルチコステロイド感受性患者からの細胞において観察されるレベルまでＩＬ−１０合成が増強されることを明らかにした。更に、そして多分最も顕著に、ＩＬ−１０での前処理は、デキサメタゾンに応答してこれら細胞において、ＩＬ−１０合成を完全に回復させた。
【００２６】
消化管（ＧＩ）障害を治療するためにヒトの細菌叢を使用することは新規な概念ではなく、４０年間以上にわたって周期的に実施されている（Eiseman等、1958）。顕著な臨床
的改善が、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）を含む多くのＧＩ障害において観察されている（Bennet and Brinkman 1989）。Borody等は、２００３年に、ヒトの細菌療法を重症コルチコステロイド耐性潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療に使用することができると報告した。
【００２７】
小試験において、全ての患者が最大忍容性標準コルチコステロイド療法に以前に失敗している６名の慢性ＵＣ患者に、彼らが現在行っているコルチコステロイド療法と同時に、単回注便療法を行った。直腸注入に続いてＵＣの完全な逆転が、６名の患者において達成された。著者らは、又、全ての患者が、６週間以内に抗炎症療法を停止し、１例においては、１３年まで寛解を維持したことを述べている。抵抗性潰瘍性大腸炎患者における細菌療法の明らかな成功は、「健康な」細菌叢の大腸での再増殖によるのであろうが、しかし著者らが同様に示唆しているように、疾患の完全な逆転をもたらす有益な免疫調節効果を誘導する、ＣｐＧモチーフを豊富に含有する大量の細菌ＤＮＡの注入によるのであろう。
【００２８】
喘息患者における試験で、ステロイド耐性患者及びステロイド感受性患者の両者において、ステロイド（プレドニゾン）への応答性を比較した。患者には、最初、ステロイドの投与前１週間の「ウオッシュアウト」期間を与えた。投与前及び１週間後のサイトカイン特性は、ステロイドに応答した患者については、Ｔｈ２型からよりＴｈ１様の状態へと移動した。対照的に、投与したステロイドへの応答ができなかった患者については、Ｔｈ２型のまま残っていた（Nasser等、1997）。
【００２９】
喘息患者におけるステロイド耐性の理由は完全には明らかではないが、ヒトでの多くの試験は、ステロイド耐性の患者が、ステロイドの作用によって抑制されないＩＬ−２／４の高い持続するレベルを有することを示している。その上更に、インビトロ試験は、ＩＬ−２／４を培地に置くと、細胞はステロイドの作用に耐性を持つようになることを示す（Sousa AR等、2000；Hamid QA等、1999）。
【００３０】
関節リウマチにおいて、ステロイド耐性患者は、ステロイドで攻撃しても減少することができない高いレベルのＩＬ−４をはっきり示すという、類似のシナリオが示唆されている（Chikanza等、2004）。興味深いことは、ＩＮＦ−γは、転写のレベルで、ＩＬ−４応答をダウンレギュレートすることができるという発見である（Eui-Young等、2000；Smelt
z等、2002）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
ステロイド耐性又は依存性は、重篤な副作用を誘発することができる強力な免疫調節剤の使用を頼りにする現在の療法として、炎症性疾患に苦しめられている多くの患者にとって、未だに主要な関心事である。望ましからぬ副作用のリスクが殆どないステロイド非応答性の個体で、ステロイドの有効性を増強する単純で直接的な方法は、抗炎症治療を本質的に改善することであり、それ故、問題の疾患を改善して、多くの患者に対して生活の質及び長さを増すことである。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しんでいる、或いは抗炎症治療の投与レベルを下げることから離れることが不可能な、ステロイド難治性又はステロイド依存性の患者におけるステロイドの効果を増強する方法の驚くべき発見に関する。配列、５’−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３’（ここで、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、そして、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない）を有するオリゴヌクレオチドの有効量が、前記患者に対して投与される。
【００３３】
本発明は、又、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しむステロイド難治性の患者における、ステロイドの効果を増強するための薬剤の製造用の、上記のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
添付の特許請求の範囲は、本明細書にその全文が取り込まれている。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、配列番号１によって例示され、大腸の炎症状態（即ち、潰瘍性大腸炎及びクローン病）に罹患した患者であって、等しくステロイド非応答性であり、ステロイド療法を併用していた患者に投与した場合、そのような患者の急速かつ顕著な改善があった。この驚くべき観察は、未だ知られていない作用機序を通して、ステロイド耐性の状況で本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドが、ステロイド耐性でない患者においては現れない疾患の改善を誘導したことを明らかに示した。
【００３５】
図面の説明
図１は、ＥＬＩＳｐｏｔによって分析した５名（ｎ＝５）の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣにおける、ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＬ−１０産生細胞の数を示すグラフである。ＰＢＭＣは、ＩＬ−１０陽性スポットの検出前に、培地（基礎培地）中で、又は濃度を増加したＣｐＧ含有ＤＩＭＳ０１５０若しくはそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、１００、１５０又は２００μＭ）と、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０．１又は１０μＭ）及びＩＤＸ０９００（３μＭ）と、４８時間インキュベートした。柱状グラフの各柱は、５名の異なる血液ドナーからの平均した結果を表す。試料は、各実験／血液ドナーについて３回実施及び分析した。ＩＤＸ０９００は、３人の個人（ｎ＝３）について試験したものであることに注意すること。
【００３６】
図２は、ＥＬＩＳｐｏｔによって分析した５名（ｎ＝５）の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣの、ＤＩＭＳ０１５０促進７２時間に対応するＩＦＮ−γ産生細胞の数を示すグラフである。ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−γ陽性スポットの検出前に、培地（基礎培地）中で、又は濃度を増加したＣｐＧ含有ＤＩＭＳ０１５０若しくはそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、１００、１５０又は２００μＭ）と、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ）及びＩＤＸ０９００（３μＭ）と、７２時間インキュベートした。柱状グラフの各柱は、５名の異なる血液ドナーからの平均した結果を表す。試料は、各実験／血液ドナーについて３回実施及び分析した。ＩＤＸ０９００は、３人の個人（ｎ＝３）について試験したものであることに注意すること。
【００３７】
図３は、ＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイした１０名（ｎ＝１０）の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣの、ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＦＮ−α産生細胞の数を示すグラフである。ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−α陽性スポットの検出前に、培地（基礎培地）中で、又は濃度を増加したＣｐＧ含有ＤＩＭＳ０１５０若しくはそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（ｎ＝９）（０.１、１、５、１０、２５、１００、１５０又は２００μＭ）と、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ又は１０μＭ）と、４８時間インキュベートした。柱状グラフの各柱は、１０名の異なる血液ドナーからの平均した結果を表す。試料は、各実験／血液ドナーについて３回実施及び分析した。ＩＤＸ０９１０の０.１μＭのものは８人のドナーについて、そして同１０μＭのものは４名の個人について、試験したものであることに注意すること。
【００３８】
図４Ａは、ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＬ−１０産生を示すグラフである。ＰＢＭＣは、濃度を増加したＤＩＭＳ０１５０又はそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０又
は２００μＭ）と、インキュベートした。対照として、細胞は、培地（基礎培地）中に置かれたもの、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ）及びＩＤＸ０９００（
３μＭ）で処理したものであった。このグラフは、各２回実施し分析した２人のドナーのうちの１人からのＰＢＭＣの実験の結果を示す。
【００３９】
図４Ｂは、ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。ＰＢＭＣは、濃度を増加したＤＩＭＳ０１５０又はそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０、
２００又は３００μＭ）と、インキュベートした。対照として、細胞は、培地（基礎培地）中に置かれたもの、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ及び１μＭ）、又はＩＤＸ０９００（３μＭ）で処理したものであった。この実験は、１名の血液ドナーからの細胞で実施し、各試料は各２回実施し分析した。
【００４０】
図４Ｃは、ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−α産生を示すグラフである。ＰＢＭＣは、異なる濃度のＤＩＭＳ０１５０又はそのＧｐＣ対照ＩＤＸ０５２６（０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００又は３００μＭ）と、インキュベートした。対照として、細胞は、培地（基礎培地）中に置かれたもの、又はＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０（０.１μＭ及び１μＭ）及びＩＤＸ０９００（３μＭ）で処理したものであった。このグラフは、各２回実施し分析した２人のドナーのうちの１人からのＰＢＭＣの実験の結果を示す。
【００４１】
図５は、ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣ及びそれらの逆対照での、ＩＬ−１０産生の比較を示すグラフである。ＰＢＭＣは、上清を採取し続いて分析する前に、ＣｐＧ非含有ＯＤＮのＩＤＸ０３０４と共に、ＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０及びＩＤＸ０９１０のＯＤＮ、並びにそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は１００μＭ）、４８時間処理した。培地に処理せずに残った細胞は、ＰＢＭＣ中基準値のＩＬ−１０を表した。４８時間後、上清を集め、続いて次の分析を行った。この実験は、１名の血液ドナーからの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析した。
【００４２】
図６は、ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生の比較を示すグラフである。ＰＢＭＣは、上清を採取し続いて分析する前に、ＣｐＧ非含有ＯＤＮのＩＤＸ０３０４と共にＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０及びＩＤＸ０９１０のＯＤＮ、並びにそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は
１００μＭ）、４８時間処理した。培地に処理せずに残った細胞は、ＰＢＭＣ中基準値のＩＦＮ−γを表した。４８時間後、上清を集め、続いて次の分析を行った。この実験は、１名の血液ドナーからの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析した。
【００４３】
図７は、ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。マウス脾細胞は、上清を採取し続いて分析する前に、ＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０、ＩＤＸ０９１０のＯＤＮ及びそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、ＣｐＧ非含有ＯＤＮの対照ＩＤＸ０３０４と比較しながら、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は１００μＭ）、４８時間処理した。培地中に処理せずに残った細胞は、脾細胞中の基準値のＩＦＮ−γを表す。上清を、促進４８時間後に集め、引き続いて次の分析を行った。この実験は、１頭のマウス脾臓からの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析したものであることに注意すること。
【００４４】
図８は、ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＬ−１０産生を示すグラフである。マウス脾細胞は、上清を採取し続いて分析する前に、ＣｐＧ非含有ＯＤＮのＩＤＸ０３０４と共に、ＤＩＭＳ０１５０、ＩＤＸ０２５０、ＩＤＸ０９２０及びＩＤＸ０９１０のＯＤＮ、並びにそれらのそれぞれの陰性対照ＧｐＣ−ＯＤＮと、濃度を増加させて（三角形で示したように左から右へ：０.１、１、１０又は１００μＭ）、４８時間処理した。培地中に処理せずに残った細胞は、脾細胞中の基準値のＩＬ−１０を表した。上清を、４８時間後に集め、引き続いて次の分析を行った。この実験は、１頭のマウス脾臓からの細胞で実施し、全ての試料は各２回実施し分析したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書で使用されるように、用語「ステロイド耐性」及び「ステロイド難治性」は、典型的にはそのような疾患を有する患者に有効である、ステロイド治療での投与が炎症性疾患の患者に効果がないことをいう。これに関連して、「ステロイド耐性」及び「ステロイド難治性」患者は、以下に限定はされないが、全身又は局所に投与されたステロイドに対して、普通の適切な生理学的パラメーターによって判定されるように、非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の患者を含む。２つの型のステロイド耐性、即ち、後天性ステロイド耐性（Ｉ型）及び原発性ステロイド耐性（II型）、の患者が記載されており、両者とも本発明に含まれる。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「ステロイド依存性」は、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能である患者をいう。
【００４７】
ポリヌクレオチドの免疫促進活性を記載する文献としては、以下に限定はされないが、Krug 等 (2001); Bauer 等 (2001); Klinman 等 (1999); Jahn-Schmid 等 (1999) and Tighe 等 (2000) が挙げられる。
【００４８】
免疫促進配列を記載する更なる文献としては、Tokunaga 等 (1992); Yamamoto 等 (1992) and EP 468,520; WO 96/02555; WO 97/28259; WO 98/16247; US Pat. Nos. 6,339,068, 6,406,705, 6,426,334及び6,426,336が挙げられる。
【００４９】
本明細書に引用されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照することにより
それらの全文が本明細書に取り入れられている。
【００５０】
本発明の目的のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結した個々のヌクレオチド単位から形成されたポリヌクレオシドをいう。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノム又はｃＤＮＡを含む、現存する核酸源から得ることができるが、好ましくは合成法によって生産される。ヌクレオシド残基は、多くの公知のヌクレオシド間結合のいずれかによって互いに連結することができる。そのようなヌクレオシド間結合は、限定されることなく、天然のヌクレオシド間リン酸ジエステル結合を含み、或いは実際、これらに限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、及びスルホンヌクレオシド間結合のような、修飾ヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチド」は、又、１つ又はそれ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−又は（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、又はホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書で使用されるものとして、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含んでいるか否かにかかわらず、いずれのヌクレオシド間結合でも有しているポリヌクレオシド及びジヌクレオシドを含むことを明白に意図している。ある種の好ましい実施態様において、これらのヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエート結合、或いはこれらの組み合わせであってもよい。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、又、限定することなく、タンパク質基、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロール及びアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」は、又、限定することなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、及びアルキルリンカー又はアミノリンカーを有する骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含むポリマーを含有する核酸塩基のいずれをも包含する。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、又はこれらの混合物を包含することもできる。本明細書で使用されるように、用語「修飾ヌクレオシド」は、修飾複素環塩基、修飾糖部分、又はこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載するように、非天然ピリミジン又はプリンヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシド又は２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００５３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッド及びキメラオリゴヌクレオチドを包含する。「キメラオリゴヌクレオチド」は、その配列構造内に１つの型以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい例は、ホスホロチオエート、リン酸ジエステル又はホスホロジチオエート領域及びアルキルホスホネート、又はアルキルホスホノチオエート結合のような非イオン性結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（Pedersonら、米国特許第５,６３５,３７７号及び同第５,３６６,８７８号）。
【００５４】
「ハイブリッド・オリゴヌクレオチド」は、１つ以上の型のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリッド・オリゴヌクレオチドの好ましい一例は、リボヌクレオチド又は２’−置換リボヌクレオチド領域、及びデオキシリボヌクレオチド領域を含む（Metelev and Agrawal、米国特許第５,６５２,３５５号；同第６,３４６,６１４号及び同第６,１４３,８８１号）。
【００５５】
本発明の目的のために、用語「免疫調節オリゴヌクレオチド」は、哺乳類のような脊椎動物に投与した場合、生体において免疫系を促進する又は免疫系を抑制するのいずれかの免疫応答、又はこれら両者を誘導する上記のようなオリゴヌクレオチドをいう。本明細書で使用するように、用語「哺乳類」は、限定することなしに、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトを包含する。
【００５６】
好ましくは、免疫調節オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの天然に存在するリン酸ジエステル、又は１つの修飾ホスホロチオエート若しくはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含み、しかし好ましい結合又は実際に骨格修飾は、限定することなく、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、リン酸トリエステル、リン酸チオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、フォルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデート、特に一級アミノホスホルアミデート、Ｎ３ホスホルアミデート及びＮ５ホスホルアミデート、及び立体特異的結合（例えば、（Ｒｐ）−又は（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、又はリン酸トリエステル結合）を包含する。
【００５７】
用語「免疫調節応答」は、免疫調節オリゴヌクレオチドで攻撃した場合に免疫応答の変化を記載する。この変化は、インターフェロンのようなある種のサイトカイン及び増殖のようなその他の生理学的パラメーターの放出を通じてしばしば測定され得るものである。この応答は、免疫系を促進するよう作用するもの、及び問題となっている免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるサイトカインに依存して免疫系を抑制するものと同じであり得る。
【００５８】
ある種の実施態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、式、５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’、式中、Ｐｙｒは天然又は合成ピリミジンヌクレオシド及びＰｕｒは天然又は合成プリンヌクレオシドである、の免疫調節ジヌクレオチドを含む。ある種の好ましい実施態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、式、５’−Ｐｕｒ*−Ｐｕｒ−３’（ここで、Ｐｕｒ*は合成プリンヌクレオシド及びＰｕｒは天然又は合成プリンヌクレオシドである）の免疫調節ジヌクレオチドを含む。種々の場合において、ジヌクレオチドは、ＲｐＧ、Ｃ*ｐＧ又はＹＺとして表され、この場合、それぞれ、Ｒ、Ｃ*又はＹは合成プリンを表す。特に好ましい合成プリンは、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである。この合成プリンがジヌクレオチドのＰｕｒ*位置にある場合、免疫促進効果の種特異
性（配列依存性）が克服され、そしてサイトカイン特性が改善される。本明細書で使用されるように、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分が単環核酸塩基であるヌクレオシドをいう。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分が二環核酸塩基であるヌクレオシドをいう。本発明の目的のために、「合成」ピリミジン又はプリンヌクレオシドは、非天然のピリミジン又はプリン塩基、非天然の糖部分、又はこれらの組み合わせを包含する。
【００５９】
ある種の実施態様において、ヌクレオシドの糖部分は、非天然の糖部分であり得る。本発明の目的のために、「天然の糖部分」は、核酸の一部分、例えば、リボース及び２’−デオキシリボースとして天然に存在する糖部分であり、そして、「非天然の糖部分」は、核酸の一部分として天然には存在しないが、オリゴヌクレオチド用の骨格において使用することができる、どのような糖、例えば、限定されないがヘキソースでもよい。アラビノース及びアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００６０】
本発明による好ましい免疫調節部分は、更に、限定されないが、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−メトキシエチル−リボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボース及び２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを包含する２’−置換ペントース糖類；限定されないが、３’−Ｏ−メチルリボースを包含する３’−置換ペントース糖類；１’，２’−ジデオキシリボース；アラビノース；限定されないが、１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノース、３’−ヒドロキシアラビノース及び２’−置換アラビノース糖類を包含する置換アラビノース糖類；限定されないが、１，５−アンヒドロヘキシトールを包含するヘキソース糖類；及び限定されないが、α−アノマーを包含する糖修飾を有するヌクレオシドを包含する。
【００６１】
別の実施態様において、本発明の好ましい免疫促進部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドを含む別の炭水化物骨格修飾及び置換を有するオリゴヌクレオチド、及び、限定されないが、アルキルリンカー又はアミノリンカーを含む、約２オングストロームから約２００オングストロームの長さを有する骨格リンカーセクションを有するオリゴヌクレオチドを更に包含する。アルキルリンカーは、分枝状又は非分枝状、置換又は非置換、及び純粋なキラル又はラセミ混合物であってもよい。最も好ましくは、そのようなアルキルリンカーは、約２から約１８個の炭素原子を有する。ある種の好ましい実施態様において、そのようなアルキルリンカーは、約３から約９個の炭素原子を有する。ある種のアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、及びチオエーテルからなる群から選択された１つ又は２つ以上の官能基を包含する。ある種の官能性アルキルリンカーは、式−Ｏ−(ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−)n（ｎ＝１〜９）のポリ（エチレングリコール）リンカーである。ある種の別の官能性アルキルリンカーは、ペプチド又はアミノ酸である。
【００６２】
更なる実施態様において、本発明の好ましい免疫促進部分は、限定されないが、−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド及びａ−デオキシリボヌクレオシドを含むＤＮＡイソ型を包含する。本発明による好ましい免疫促進部分は、３’−修飾体を取り入れ、更に、限定されないが、２’−５’、２’−２’、３’−３’及び５’−５’結合を含む、非天然ヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシドを包含する。
【００６３】
本発明による免疫調節オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を経由する少なくとも５つのヌクレオシド、又は非ヌクレオチド結合を経由する官能化核酸塩基又は糖を含む。本発明の目的のために、「非ヌクレオチドリンカー」は、共有結合又は非共有結合を経由してオリゴヌクレオチドに結合することができる、いずれかの部分である。
【００６４】
非共有結合は、限定されないが、静電相互作用、疎水性相互作用、スタッキング相互作用、及び水素結合を包含する。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上に記載したように、ヌクレオシド間結合、例えば２つのヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を直接結ぶリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートをいうことを意味しない。本発明の目的のために、そのような直接の３’−３’結合（リンカーは含まれない）は、「ヌクレオチド結合」であると考えられている。
【００６５】
ある種の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されないが、金粒子を含む金属である。ある種の別の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、可溶性又は不溶性生分解性ポリマービーズである。
【００６６】
なお別の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに結合できる官能基を有する有機部分である。そのような結合は、好ましくは、安定した共有結合によるものである。
【００６７】
ある種の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定なしに、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン及びオリゴ糖を含む生体分子である。別の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、小分子である。本発明の目的のために、小分子は、分子量１,０００Ｄａ未満を有する有機部分である。
【００６８】
ある種の実施態様において、小分子は脂肪族又は芳香族炭化水素であり、そのいずれかは、場合によって、オリゴヌクレオチドに接続した直鎖又はそれに付属したもののいずれかであり、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、及びチオ尿素からなる群から選択された１つ又はそれ以上の官能基である。小分子は、環式又は非環式であり得る。小分子リンカーの例としては、限定されないが、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン及び抗生物質を包含する。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを記載する目的のために、用語「小分子」はヌクレオシドを包含することを意図していない。
【００６９】
ある種の実施態様において、小分子リンカーは、グリセロール、又は式、ＨＯ−(ＣＨ2)o−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ2)p−ＯＨ、式中、ｏ及びｐは独立に、１から約６、１から約４、又は１から約３の整数である。ある種の別の実施態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。ある種のそのような誘導体は、式、ＨＯ−(ＣＨ2)m−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−ＮＨＣ(Ｏ)−ｍ−ＯＨ、式中、ｍは０から約１０、０から約６、２から約６、又は２から約４の整数である。
【００７０】
修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増大のために、しばしば、天然の形態より大きいことが好ましい。オリゴヌクレオチドは、通常、２つを超える、及び典型的には、１０を超える、及び１００に至るまでのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、好ましくは約８と約４０の間、最も好ましくは約８と約２０の間である。正確な大きさは、多くの因子に依存するであろうし、言い換えると、オリゴヌクレオチドの究極の機能又は用途に依存している。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はこれらの組み合わせを含む、如何なる様式で生成してもよい。
【００７１】
本発明の方法において、オリゴヌクレオチドは、限定なしに、吸入、眼投与、鼻腔内、非経口、経口、皮内及び直腸投与のような、いずれの適切な投与経路によっても投与することができる。もし患者が、ステロイド治療又は免疫調節剤の使用のような抗炎症治療中である場合は、ステロイド及び免疫調節剤は、オリゴヌクレオチドと一緒に又は別々に投与することができる。オリゴヌクレオチドの投与経路は、ステロイドの投与経路に依存する。
【００７２】
本明細書で使用される慣用句「治療的有効量」は、ある程度の有益な程度まで、好ましくは少なくとも３０パーセントまで、より好ましくは少なくとも５０パーセントまで、そしてなおより好ましくは少なくとも９０パーセントまで増強するのに十分な量に関する。最も好ましくは、ステロイド耐性が治療されることである。
【００７３】
用語「ステロイド」は、コルチコステロイド及びグルココルチコステロイドの両者を包含するように使用される。用語「ＣＧ含有オリゴヌクレオチド」は、全配列長内に、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、そして好ましくは長さで８から１００核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを包含するように使用される。
【００７４】
表現「ステロイドの有効性を増強する」は、本明細書では、ＣＧ含有オリゴヌクレオチドを用いた同時又は逐次治療、好ましくは前治療、が炎症を管理するのに必要なステロイド投与量の減少を示す、臨床像として明らかなステロイド節約効果を包含する。表現「ステロイドの有効性を増強する」は、又、同時に若しくは実質的に同時に、又は逐次に若しくは実質的に同時にのいずれであれ、炎症を管理するのに必要なステロイド投与量の減少を示す、ＣＧ含有オリゴヌクレオチド及びステロイドの相乗的使用を包含することを意図している。表現「ステロイド耐性」又は「ステロイド難治性」は、問題の疾患を治療するのに通常有効且つ十分であると見なされる現在の治療処置に、適切に応答することができない患者を包含して使用される。表現「ステロイド依存性」は、患者の状態を悪化することなく、又は問題の疾患の症状の重症度が増加することなく、現在の療法を取り止めることができないと観察される患者を含めて使用される。
【００７５】
１つの態様において、本発明は、本発明による免疫調節オリゴヌクレオチド及び生理学的に許容される担体を含む医薬処方を提供する。本明細書で使用されるように、用語「生理学的に許容される」は、免疫調節オリゴヌクレオチドの有効性を阻害せず、そして細胞、細胞培養、組織又は生体のような生物系に適合する材料をいう。好ましくは、生物系は、脊椎動物のような生命体である。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「担体」は、いかなる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、脂質又は医薬処方に使用するための、当業者に周知のその他の材料を包含する。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の適用のための投与経路に依存するであろうことは理解されるであろう。これらの材料を含有する医薬として許容される処方の製造は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００７７】
薬学的に許容される混合物における免疫調節オリゴヌクレオチドの濃度は、投与される化合物の投与量、採用された化合物の薬動力学的特性、患者の年齢、性別及び状態、並びに投与経路を包含する、いくつかの因子に依存して変化するであろう。ステロイド耐性又はステロイド依存性患者においてステロイドの有効性を増強するための免疫調節オリゴヌクレオチドの有効量は、受容者である哺乳動物の約０.０１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.１μｇから約１０ｍｇ、最も好ましくは約１μｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重の間の広範な範囲である。
【００７８】
ある種の好ましい実施態様において、本発明による免疫調節オリゴヌクレオチドは、限定されないが、ＴＮＦ抗体のような抗炎症薬、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリンその他のサリチル酸類のような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、セレコキシブ（Celebrex(登録商標)）のようなｃｏｘ−２阻害剤、コルチコステロイド（吸入、経口、経直腸）、肥満細胞安定化剤、及びロイコトリエン調節薬と併用して投与される。
【００７９】
本発明のこの態様の目的のために、用語「併用して」は、同じ患者における同じ疾患を治療する過程で、同時投与、及び数ヶ月まで離れた一次的間隔の順序を包含する、いずれかの順序で免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを、意味し包含する。そのような併用治療は、又、免疫調節オリゴヌクレオチドの単回を超える投与も包含する。より好ましくは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、患者がステロイド療法を開始した後のステロイド耐性又はステロイド依存性患者に投与され、そしてそれは安定した投与方式である。
【００８０】
１つの実施態様において、本発明は、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しむステロイド難治性の患者における、ステロイドの効果を増強する方法であって、下記配列：
５’−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３’
式中、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない；
を有するオリゴヌクレオチドの有効量を、前記患者に投与する方法に関する。本発明の方法の別の実施態様において、ｍは１〜８０でありそしてｎは１〜８０、ｍは１〜６０でありそしてｎは１〜６０、ｍは１〜４０でありそしてｎは１〜４０、ｍは１〜２０でありそしてｎは１〜２０、ｍは１〜１２でありそしてｎは１〜１２、ｍは１〜１０でありそしてｎは１〜１０、ｍは１〜８でありそしてｎは１〜８、ｍは１〜６でありそしてｎは１〜６、ｍは１〜４でありそしてｎは１〜４、又はｍは１〜２でありそしてｎは１〜２である。
【００８１】
本発明により使用されるオリゴヌクレオチドは、又、表１に例示されている。
【００８２】
本発明による方法において、患者は、現在コルチコステロイド治療にあるものであり、患者は、ステロイド依存性であり、現在コルチコステロイド治療を受けている、又は患者は、現在抗炎症治療を受けている。
【００８３】
本発明方法の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ステロイドと併用して投与される。
【００８４】
本発明による方法は、炎症状態に苦しめられている患者におけるステロイドの有効性を増強するためのものである。炎症状態は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ、乾癬、肺気腫、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択されたものである。１つの実施態様において、炎症状態は潰瘍性大腸炎であり、そして別の実施態様において、炎症状態はクローン病である。
【００８５】
本発明方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の、そして前記にて定義された方法に従って修飾することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を有し、リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である。修飾は、オリゴヌクレオチドの全長に沿った如何なる位置における１つ又はそれ以上のヌクレオチドで生じてもよい。１つの実施態様において、核酸骨格は、５’ヌクレオチド結合間でのリン酸骨格修飾を包含する。或いは又、核酸骨格は、３’ヌクレオチド結合間でのリン酸骨格修飾を包含する。
【００８６】
ＤＮＡに加えて、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの類縁体又は模倣体からなるものでもよく、限定されないが、以下を包含する：メチルホスホネート、Ｎ３’→Ｐ５’−ホスホロアミデート、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、アラビノシル核酸（ＡＮＡ）、フルオロアラビノシル核酸（ＦＡＮＡ）、メトキシエチル核酸（ＭＯＥ）。
【００８７】
更に、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、上に定義されたように、少なくとも１つの修飾糖部分核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖部分は、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である。
【００８８】
本発明は、又、抗炎症治療に非応答性の又は不十分な若しくは不適切な応答性の炎症状態に苦しむステロイド難治性の患者における、ステロイドの効果を増強するための薬剤を製造するための、下記配列：
５’−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３’
式中、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない；
を有するオリゴヌクレオチドの使用に関する。別の実施態様において、ｍは１〜８０でありそしてｎは１〜８０、ｍは１〜６０でありそしてｎは１〜６０、ｍは１〜４０でありそしてｎは１〜４０、ｍは１〜２０でありそしてｎは１〜２０、ｍは１〜１２でありそしてｎは１〜１２、ｍは１〜１０でありそしてｎは１〜１０、ｍは１〜８でありそしてｎは１〜８、ｍは１〜６でありそしてｎは１〜６、ｍは１〜４でありそしてｎは１〜４、又はｍは１〜２でありそしてｎは１〜２である。
【００８９】
上記で定義した方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、医薬の製造に使用することもできる。
【００９０】
本発明による使用において、患者は、現在ステロイド治療下にあり、患者はステロイド依存性であって、現在ステロイド治療下にあり、又は患者は現在抗炎症治療下にある。１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ステロイドと併用して投与される。
【００９１】
炎症状態は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ、乾癬、肺気腫、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択されたものである。１つの実施態様において、炎症状態は潰瘍性大腸炎であり、別の実施態様において、炎症状態はクローン病である
【００９２】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、配列番号１によって例示され、ＣｐＧモチーフを含有する免疫調節ＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチドの例として作用する。本発明は、配列番号１によって表される免疫調節オリゴヌクレオチドを、大腸の炎症状態（即ち、潰瘍性大腸炎及びクローン病）に罹患した患者であって、等しくステロイド非応答性であり、ステロイド療法を併用していた患者に投与した場合、そのような患者の急速かつ顕著な改善があって、投与するステロイドの投与量を減少することができる、という驚くべき発見を開示した。契約によって、前記免疫調節オリゴヌクレオチドを、ステロイドを除外し、患者がステロイド応答性である、潰瘍性大腸炎に罹患した患者に投与した場合、彼らの疾患の改善は見られなかった。この驚くべき観察は、未だ知られていない作用機作を通して、ステロイド耐性の状況でＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫調節効果が、ステロイド耐性でない患者においては明らかでない疾患の改善を誘導したことを明らかに示した。
【００９３】
以下の実施例では、先ず、配列番号１が免疫調節オリゴヌクレオチドとして機能すること、及び種々の長さの配列番号１が活性を保持することを確認する。後の実施例は、配列番号１の単回直腸投与を受けた、潰瘍性大腸炎及びクローン病の患者における、臨床データの要約である。
【実施例】
【００９４】
材料及び方法
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）
本発明において、多くのＯＤＮが、ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）又はマウス脾細胞を用いた促進実験に使用された。使用されたＯＤＮを表１に列挙する。オリゴヌクレオチドのいくつかにおいて、ジヌクレオチドモチーフを「逆転」させ、対照として機能させた。
【００９５】
【表１】
【００９６】
処方
Aveciaにより合成されたＤＩＭＳ０１５０及びＩＤＸ０２５０を除き、全てのＯＤＮはBiomers. net, Germanyによって合成され、供給された。
【００９７】
使用した凍結乾燥ＯＤＮ（表１参照）（ヒトＤＩＭＳ０１５０を除き全て）を、先ず、少量の蒸留水で希釈した。完全に混合した後、各ＯＤＮを、更に一連の異なった希釈度に水で希釈した。各希釈について、少なくとも５回以上、分光光度計（SmartSpec 3000, BioRad）を使用して、光学濃度（ＯＤ）Ａ２６０／Ａ２８０を測定した。原液の濃度を決定するために、全ての希釈について、全ての読みの平均濃度を計算した。これらの原液を、全て−２０℃で貯蔵した。全てのＯＤＮについて、濃縮原液の一部を更に希釈し、１つの高濃度及び１つの低濃度の原液を得た（それぞれ、１μｇ／μｌ及び２０μｇ／μｌ）。上に記載したようにして、分光光度計を使用してＯＤを測定し、同じ手順で濃度を決定した。
【００９８】
実験で使用した異なる希釈標準溶液：０.１μＭ、１μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ及び３００μＭを、高濃度原液（２０μｇ／μｌ）及び低濃度の原液（１μｇ／μｌ）を使用して、ＰＢＳで更にＯＤＮを希釈することにより調製した。
【００９９】
ＤＩＭＳ０１５０を蒸留水で希釈し、凍結乾燥ＯＤＮについて述べたのと同様にして濃度を決定した。
【０１００】
生物系
細胞の調製
血液試料は、健常ボランティアから得た。ＰＢＭＣをFicoll-Paque Plus（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用して密度勾配遠心分離法により単離し、生理食塩リン酸バッファー（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Life
Technologies）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Life Technologies）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma）、ゲンタマイシン（Sigma
）及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Gibco, Life Technologies）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Sigma）に再懸濁した。細胞は０.４％トリパンブルー溶液（Sigma Aldrich）を使用して計数した。
【０１０１】
マウス脾細胞の調製
各実験用に、脾臓をＣ５７ＢＬ／６マウスから摘出した（マウスは、MTC animal unit,
Karolinska Institutetから入手し、ナイロン細胞濾過器を使用して滅菌条件下に単個細胞浮遊液を調製した（細胞濾過器１００μＭ、BD Falcon）。次いで、細胞を完全ＲＰＭ
Ｉ１６４０（５％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０）中、１,２００ｒｐｍ、７〜１０分間で１回洗浄した。上清を静かにデカントし、細胞を赤血球細胞溶解バッファー（Sigma）（１ｍｌ）に再懸濁し、室温で、最大２分間インキュベートした。別の完全培地（５ｍｌ）を、既に記載したようにして遠心する前に加えた。上清を静かにデカントした後、細胞ペレットを完全培地に再懸濁し、細胞数を０.４％トリパンブルー溶液で測定した。
【０１０２】
技術
ＥＬＩＳｐｏｔ
既に記載したように、プレコートしたＰＶＤＦ系の、ＥＬＩＳｐｏｔ（MABTech AB, Sweden）用膜プレートにＰＢＭＣを播種した。細胞を加える前に、ＰＤＶＦプレートを、それぞれＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０（ＥＬＩＳｐｏｔキットに含まれる；ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０は、MABTech AB, Swedenから入手）に対する特異的被覆抗体で一夜、＋４℃で被覆した。ＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩｃに５００,０００細胞／ウエルで播種した。播種後に直接、細胞をそれぞれのオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）で処理した。最終ＯＤＮ濃度が、１００μｌ／ウエルの総容積中、０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０及び２００μＭになるように、各ＯＤＮを特定のウエルに加えた。試料は、３通り作成した。処理後、細胞を５％炭酸ガス、３７℃、加湿インキュベーターで、インキュベートした。ＩＦＮ−αを、２４、４８及び７２時間に、それぞれ２、１０及び３ドナーにつき分析した。ＩＦＮ−γは、２、７及び５ドナーについて、それぞれ２４、４８及び７２時間に分析した。ＩＬ−１０は５及び４ドナーにつき、２４、４８及び７２時間に分析した。サイトカイン産生細胞の検出及び計数は、生産者のマニュアルに従って実施した。ＥＬＩＳｐｏｔリーダーソフトウエアは、Center for Molecular Medicine, CMM, Karolinska Hospital, Solna, SwedenにあるＡＩＤ２.３.３であった。
【０１０３】
酵素免疫測定法ＥＬＩＳＡ
既に記載したようにして調製したＰＢＭＣを、ＰＲＭＩｃ中５００,０００細胞／ウエルで、９６ウエルフラット底面細胞培養プレートに播種した。播種後に直接、細胞をそれぞれのＯＤＮで処理した。最終ＯＤＮ濃度を１００μｌ／ウエルの総容積中、０.１、１、５、１０、２５、５０、１００、２００及び３００μＭとなるように、特定のウエルに各ＯＤＮを加えた。試料は２重に調製した。処理後、細胞を５％炭酸ガスで、３７℃、４８時間、加湿インキュベーターでインキュベートした。上清を集め、製造者のプロトコールに従って−２０℃で貯蔵した後、特定のQuantikine ELISAを使用して、サイトカインレベルを決定した（ヒトＰＢＭＣ実験には、以下のＥＬＩＳＡキットを使用した：ヒトＩＬ−１０及びヒトＩＦＮ−α。マウス脾細胞実験用には、ネズミＩＬ−１０及びネズミＩＦＮ−α、R&D Systems, Abingdon, UK、を使用した）。
【０１０４】
〔実施例１〕
ＤＩＭＳ０１５０で促進したＰＢＭのサイトカイン産生の評価
ＣｐＧ含有ＯＤＮ、ＤＩＭＳ０１５０の免疫促進活性を、ヒトＰＢＭＣで評価した。仮説は、異なった濃度のＤＩＭＳ０１５０で、異なった時間インキュベートしたＰＢＭＣは、ＣｐＧに依存する様式でサイトカイン産生を促進するであろう、というものであった。そのため、ＣｐＧ−ＤＮＡに応答してＰＢＭＣによって産生されることが知られている３つのサイトカイン、即ち、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを選択した。実際、別々の健常なドナー由来のＰＢＭＣは、ＥＬＩＳｐｏｔによって分析されたように、ＤＩＭＳ０１５０に応答して、全て時間に依存して（データは示していない）及び投与量に依存して、サイトカイン産生を示した。試験した３つのサイトカインの中では、ＩＬ−１０が、ＤＩＭＳ０１５０で促進４８時間後、最も応答したサイトカインであった（図１）。ＩＬ−１０に対照的に、ＤＩＭＳ０１５０は、試験した全ての濃度及び時間点において、ＰＢＭＣにおいてＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γを誘導するのが、ＩＦＮ−γの７２時間（図２参照）及びＩＦＮ−αの４８時間（図３を参照）に代表されるように、より弱かった。ＤＩＭＳ０１５０のＣｐＧ逆転型であるＩＤＸ０５２６も、又、潜在的なサイトカイン産生のＣｐＧ依存性を評価するために、全ての実験に含めた。ＩＤＸ０５２６で処理したＰＢＭＣは、ＤＩＭＳ０１５０での促進と比較して、試験した３つの全てのサイトカインの産生はないか、又は、減少を示した（図１、２及び３を参照）。
【０１０５】
〔実施例２〕
ＤＩＭＳ０１５０に反応したＰＢＭＣのサイトカイン産生の定量
ＥＬＩＳｐｏｔにより観察された陽性細胞からのサイトカイン産生量を定量するため、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。ＰＢＭＣをＤＩＭＳ０１５０の濃度を増加してインキュベートし、上清を、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γのレベルにつき分析した。ＥＬＩＳｐｏｔのデータによって得られたこれらの結果に一致して、０.１μＭと２００μＭの間（又はＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γについては３００μＭ）の濃度を用いて、インキュベーション４８時間後に、全てのサイトカインのＣｐＧ依存性用量応答が得られた（図４Ａ、Ｂ及びＣを参照）。ＥＬＩＳｐｏｔとＥＬＩＳＡは異なったパラメーター（即ち、特定のサイトカインを分泌する細胞数に対して、分泌されたサイトカイン量）を測定するので、ＥＬＩＳＡ測定は、注目するサイトカインを分泌する細胞数にかかわらず、特定の濃度で産生される実際の量に関する補足的情報として考慮すべきである。それ故、用量応答パターンは、これらの異なった技術から得られたものを比較する場合相異が表れるであろう。定量ＥＬＩＳＡにより分析されたＤＩＭＳ０１５０に対応する個々の相異について、ＥＬＩＳｐｏｔと比較して、広範に調べた（１〜３ドナー）。
【０１０６】
〔実施例３〕
ＰＢＭＣにおける別々のＣｐＧ−ＯＤＮｓとのＤＩＭＳ０１５０の比較
ＤＩＭＳ０１５０促進の用量応答を、公知のヒト及びネズミＣｐＧ−ＯＤＮのＩＤＸ０９１０及びＩＤＸ０９２０とそれぞれ比較した。加えて、このＯＤＮ配列も、又、ＣｐＧジヌクレオチドを含有しており、ＣｐＧ−ＤＮＡとして作用するであろうから、ＩＤＸ０２５０も、又、この実験に組入れた。ＩＤＸ０２５０のＣｐＧ側面塩基は、ＤＩＭＳ０１５０と少し異なっており、このことは、促進に際して、ＰＢＭＣでのサイトカイン応答のレベルに影響するであろう。この研究において、ＰＢＭＣは、ＣｐＧ−ＯＤＮで４８時間処理され、表面に浮かぶ前のそれら個々の逆転ＧｐＣ対照を、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γＤＩＭＳ０１５０についての定量ＥＬＩＳＡアッセイを用いて２重に分析し、ＩＤＸ０２５０は１００μＭで同様のＩＬ−１０応答を引き起こしたが（図５）、しかし最低濃度（０.１μＭから１μＭ）では、これらＯＤＮはＰＢＭＣのＩＬ−１０産生を促進しなかった。相対的に、ＰＢＭＣとＩＤＸ０９１０又はＩＤＸ０９２０とのインキュベーションでは、使用した低濃度で最高のＩＬ−１０産生に達した。上清のＩＦＮ−γ分析では、ＩＬ−１０と比較して、このサイトカインは低分泌となった（図６）。ＧｐＣの逆転対照又はＩＤＸ０３０４のいずれも、ＩＦＮ−γを誘導しなかったが、ＰＢＭＣにおいて幾分かのレベルでＩＬ−１０分泌が、２つの対照ＧｐＣ−ＯＤＮ、ＩＤｘ０９１５及びＩＤＸ０９２５、で観察された。このことは、これらＯＤＮに完全なホスホロチオエート骨格が存在するからであろう。
【０１０７】
〔実施例４〕
マウス脾細胞におけるＤＩＭＳ０１５０と異なったＣｐＧ−ＯＤＮｓとの比較
ヒト及びマウスは、異なるＣｐＧ−ＯＤＮに応答する。ＤＩＭＳ０１５０の免疫促進効果を、マウス脾細胞系で、ＰＢＭＣにおいて実施されたＣｐＧ−ＯＤＮと同じセットと比較した（図６参照）。脾細胞をＣｐＧ−ＯＤＮ及びそれらの個々の逆転陰性ＧｐＣ対照と、上清をＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０について分析する４８時間前に、定量的ＥＬＩＳＡアッセイを使って２重に処理した。脾細胞をＤＩＭＳ０１５０と処理した場合、使用した最高濃度で強いＩＦＮ−γ応答がもたらされた。しかし、このアッセイで、ＩＤＸ０２５０はＤＩＭＳ０１５０よりもより強力であって、このことは、ＣｐＧの周囲の配列が応答のレベルにインパクトを有することを示唆した（図７）。最も顕著なＩＦＮ−γレベルは、使用した低濃度でＣｐＧ−ＯＤＮ、ＩＤＸ０９２０で促進した細胞からの上清で見出された。最後に、ＩＬ−１０のレベル（図８）について上清を分析すると、ＩＦＮ−γを測定した場合に観察されたのと類似のパターンが示された。ＧｐＣは逆転ＯＤＮ対照のいずれもＩＦＮ−γを誘導しなかったが、しかしＩＤＸ０９２５は、ネズミの系でＩＬ−１０のいくらかのレベルを誘導した。
【０１０８】
〔実施例５〕
研究コンセプトの予備試験
研究コンセプトの予備試験については、付録Ｉに全てを記載する。
試験目標
第１目標：
潰瘍性大腸炎及びクローン病患者における、配列番号１と表示されるＤＮＡを基礎とするオリゴヌクレオチドの使用に関する安全性の問題を評価すること。
第２目標：
内視鏡的及び臨床的寛解／改善率、組織学的改善及び臨床検査パラメーターにおける変化によって定量された、臨床的有効性を探究する。
【０１０９】
試験は、プラセボ対照、二重盲検単回投与であり、コルチコステロイドに非応答性か、又はコルチコステロイド依存性の患者で、同時にステロイド療法を受けている患者を考慮する。
使用された投与レベルは、３ｍｇ及び３０ｍｇ投与で、単回直腸投与であった。
【０１１０】
第１周での臨床応答
ｉ）配列番号１ ５／７（７１％）の応答者
ii）プラセボ １／４（２５％）の応答者
全体として、この予備試験は、単回直腸投与後の両投与群において、良好な有効性を示唆した。多分もっと驚くべきことは、全ての応答した患者が試験薬を受けてから１週間以内に応答したように、応答の速さであった。興味あることは、配列番号１を受けた７患者中２名は、今日同様に寛解状態にあり、ステロイドなしであることである。更に、重篤な有害事象は記録されなかった。
【０１１１】
〔実施例６〕
臨床第II相試験
試験目標
第１目標：
軽度から中等度の活性の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の患者における臨床的寛解を導く抗炎症療法として、オリゴヌクレオチド配列番号１の４投与水準（０.３ｍｇ、３ｍｇ、３０ｍｇ及び１００ｍｇ）の各作用能力を、プラセボと比較しながら評価すること。
第２目標：
プラセボと比較しながら、配列番号１のオリゴヌクレオチドの単回直腸投与の忍容性を評価すること、及び配列番号１のオリゴヌクレオチドの有効性及び安全性を４投与水準で更に評価すること、及び直腸投与後の配列番号１のオリゴヌクレオチドの薬物動態を評価すること。
【０１１２】
試験結果
【表２】
【０１１３】
表から、有効薬物を投与されたものの応答率は、２２％（２６／１１９）であり、プラセボは３８％（１１／２９）であった。この試験では、限られた数の患者に、０.３から１００ｍｇの投与量で、配列番号１のオリゴヌクレオチドを単回投与すると、臨床的、内視鏡的若しくは組織病理学的寛解、又は１２週間にわたる応答を誘導することができるということは、確認することができなかったが、しかし、この試験では、薬物の良好な安全特性が実証された。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
この予備試験の患者は、第II相試験におけるよりも、よりよい応答率を得たことは明らかである。予備試験の患者は併用薬としてステロイドの使用が許され、コルチコステロイドに対して耐性又は依存性であったが、第II相試験においては、それは除外基準であったことも明らかである。第II相試験の期間には、ステロイドは禁忌であり、患者はステロイド療法に対して耐性でなく依存性でもなかった。
【０１１６】
予備試験と大規模第II相試験の間の不一致は、コルチコステロイドに対して耐性又は依存性、及びコルチコステロイド併用療法に対して耐性又は依存性である患者は、配列番号１の単回直腸投与に対して、そうでない患者よりもより良好に応答することを示唆している。臨床結果におけるこの驚くべき相異の理由は、明らかでない。しかし、オリゴヌクレオチドを含有するＣｐＧの免疫調節作用は、ステロイド耐性又はステロイド依存性の患者が、再びステロイドに応答することができた程度に、患者の免疫系に有益な変化を誘導することができた。言い換えると、免疫調節オリゴヌクレオチドは、患者の再感受性化をステロイドの抗炎症効果へと誘導するであろう。
【０１１７】
配列番号１の例のように、配列内にＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドはある種のサイトカインを誘導することができ、背景技術おいて述べたように、そのサイトカインについては、ステロイド応答性を調節する役割を有するという証拠が存在するということを、提供された実施例は支持している。そのような観点から、例えばインターフェロンやＩＬ−１０の産生を誘導する免疫調節オリゴヌクレオチドは、有益性を証明しているであろう。
【０１１８】
本明細書において、特定の実施態様が詳細に開示されているが、これは説明の目的だけのための例として行われたものであり、以下に続く付随する特許請求の範囲に関して限定することを意図するものではない。特に、種々の置換、変更、及び修飾が、特許請求の範囲によって定義されたような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行われ得ることは、本発明者によって予期されている。
【０１１９】
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【０１２９】
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＬ−１０産生細胞の数を示すグラフである。
【図２】ＤＩＭＳ０１５０促進７２時間に対応するＩＦＮ−γ産生細胞の数を示すグラフである。
【図３】ＤＩＭＳ０１５０促進４８時間に対応するＩＦＮ−α産生細胞の数を示すグラフである。
【図４Ａ】ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＬ−１０産生を示すグラフである。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
【図４Ｃ】ＥＬＩＳＡによって定量した、ＤＩＭＳ０１５０で４８時間促進に対応したＩＦＮ−α産生を示すグラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣ及びそれらの逆対照での、ＩＬ−１０産生の比較を示すグラフである。
【図６】ＥＬＩＳＡにより定量した、種々のＣｐＧ−ＯＤＮで促進したヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生の比較を示すグラフである。
【図７】ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
【図８】ＥＬＩＳＡにより定量した、ＣｐＧ促進４８時間に対応したマウス脾細胞からのＩＬ−１０産生を示すグラフである。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、炎症状態に苦しみ、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能であり、そしてステロイド抗炎症治療中である患者（ステロイド依存性）の抗炎症治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症状態に苦しみ、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能であり、そしてステロイド抗炎症治療中である患者において、ステロイドの効果を増強するための薬剤を製造するための、下記配列：
５'−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３'
（ここで、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない）
を有するオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２】
ｍが１〜８０であり、そしてｎが１〜８０である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｍが１〜６０であり、そしてｎが１〜６０である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ｍが１〜４０であり、そしてｎが１〜４０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ｍが１〜２０であり、そしてｎが１〜２０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ｍが１〜１２であり、そしてｎが１〜１２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ｍが１〜１０であり、そしてｎが１〜１０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ｍが１〜８であり、そしてｎが１〜８である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
ｍが１〜６であり、そしてｎが１〜６である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ｍが１〜４であり、そしてｎが１〜４である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが長さで８と１００の間の核酸塩基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが長さで８と４０の間の核酸塩基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
患者が非ステロイド性抗炎症薬で治療中である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
炎症状態が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ、乾癬、肺気腫、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
炎症状態が潰瘍性大腸炎である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
炎症状態がクローン病である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、骨格修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
骨格修飾がリン酸骨格修飾である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
リン酸骨格修飾がホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
リン酸骨格修飾が５'ヌクレオチド間結合および又は３'ヌクレオチド間結合に包含される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート、Ｎ３'→Ｐ５'−ホスホルアミデート、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、アラビノシル核酸（ＡＮＡ）、フルオロアラビノシル核酸（ＦＡＮＡ）及びメトキシエチル核酸（ＭＯＥ）からなる群から選択される、ＤＮＡ又はＤＮＡの類縁体若しくは模倣体から成るオリゴヌクレオチドである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾糖部分核酸塩基を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
修飾糖部分が２'−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドが単回投与される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが単回を超えて投与される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
患者に対するオリゴヌクレオチドの投与量が約０.０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
患者に対するオリゴヌクレオチドの投与量が約０.１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
患者に対するオリゴヌクレオチドの投与量が約１μｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドが吸入投与、眼投与、鼻腔内投与、非経口投与、経口投与、皮膚内投与又は直腸投与される請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１】
炎症状態に苦しみ、全身又は局所投与ステロイド治療を止めさせることが不可能であり、そしてステロイド抗炎症治療中である患者において、ステロイドの効果を増強するための薬剤を製造するための、下記配列：
５'−Ｘm−ＣＧ−Ｙn−３'
（ここで、ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ＹはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ｍ＝１〜１００、ｎ＝１〜１００であり、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドはメチル化されていない）
を有するオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２】
ｍが１〜８０であり、そしてｎが１〜８０である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｍが１〜６０であり、そしてｎが１〜６０である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ｍが１〜４０であり、そしてｎが１〜４０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ｍが１〜２０であり、そしてｎが１〜２０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ｍが１〜１２であり、そしてｎが１〜１２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ｍが１〜１０であり、そしてｎが１〜１０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ｍが１〜８であり、そしてｎが１〜８である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
ｍが１〜６であり、そしてｎが１〜６である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ｍが１〜４であり、そしてｎが１〜４である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが長さで８と１００の間の核酸塩基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが長さで８と４０の間の核酸塩基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
患者が非ステロイド性抗炎症薬で治療中である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
炎症状態が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ、乾癬、肺気腫、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
炎症状態が潰瘍性大腸炎である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
炎症状態がクローン病である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、骨格修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
骨格修飾がリン酸骨格修飾である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
リン酸骨格修飾がホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
リン酸骨格修飾が５'ヌクレオチド間結合および又は３'ヌクレオチド間結合に包含される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート、Ｎ３'→Ｐ５'−ホスホルアミデート、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、アラビノシル核酸（ＡＮＡ）、フルオロアラビノシル核酸（ＦＡＮＡ）及びメトキシエチル核酸（ＭＯＥ）からなる群から選択される、ＤＮＡ又はＤＮＡの類縁体若しくは模倣体から成るオリゴヌクレオチドである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾糖部分核酸塩基を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
修飾糖部分が２'−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドが単回投与される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが単回を超えて投与される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
患者に対するオリゴヌクレオチドの投与量が約０.０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
患者に対するオリゴヌクレオチドの投与量が約０.１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
患者に対するオリゴヌクレオチドの投与量が約１μｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドが吸入投与、眼投与、鼻腔内投与、非経口投与、経口投与、皮膚内投与又は直腸投与される請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２３２９８９（Ｐ２０１２−２３２９８９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１４９３７９（Ｐ２０１２−１４９３７９）
【出願日】平成２４年７月３日（２０１２．７．３）
【分割の表示】特願２００８−５１９２３４（Ｐ２００８−５１９２３４）の分割
【原出願日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月３日（２０１２．７．３）
【分割の表示】特願２００８−５１９２３４（Ｐ２００８−５１９２３４）の分割
【原出願日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
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